JP2009000063A - 改良されたノロウイルスｒｎａ検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ノロウイルスＲＮＡの広範囲な遺伝子型に対して高感度に検出する方法の提供。
【解決手段】ノロウイルスのそれぞれの遺伝子型のＲＮＡの相同あるいは相補的な核酸配列に対して、ハイブリダイゼーション効率の高い第一のプライマーおよび第二のプライマー（該プライマーのいずれか一方はその５’末端にプロモーター配列が付加されている）からなるプライマーセット少なくとも二種用い、逆転写酵素により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記逆転写酵素によるＤＮＡ合成の鋳型となって前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程からなるＲＮＡ増幅工程において増幅されたＲＮＡ転写産物量をインターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブにて測定する方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、簡便、迅速にノロウイルスを測定する方法に関する。本発明は、臨床検査、公衆衛生、食品検査、食中毒検査の分野に有用である。

ノロウイルスはヒトカリシウイルス科に属するウイルスで、約７０００塩基の１本鎖ＲＮＡをゲノムにもつ。ノロウイルスは、小型球形ウイルス（Ｓｍａｌｌ Ｒｏｕｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＳＲＳＶ）とも呼ばれている。

我が国で届け出されている食中毒の約２０％はウイルスが原因と推定されている。これらのウイルス性食中毒例の約８０％以上からノロウイルスが検出される。おもな感染源は食品で、しばしば生カキが問題となっている。また、乳幼児の（散発性の）急性胃腸炎からもノロウイルスが検出され、ヒトからヒトへの感染例も報告されている。以上から、ノロウイルスの検査は、公衆衛生上および食品の品質管理上大きな課題となっており、遺伝子増幅法を用いた、高感度かつ迅速でしかもあらゆる遺伝子型の検出が可能もしくは検出率の高い検査法の開発が望まれている。従来、ノロウイルスの検出は、電子顕微鏡による観察が基本であった。この方法では、あらゆる遺伝子型の検出か可能であるが、検出するには１０^６個／ｍＬ以上のウイルス量が必要と感度が低いため、検体は患者糞便に限られている。また、ウイルスを観察できても同定することはできなかった。

また、ヒトカリシウイルスのウイルス様中空粒子を用いた特異抗体検出ＥＬＩＳＡの試薬も開発されている（特許文献１）。しかし、検出感度は電子顕微鏡と同程度で決して高感度とはいえない。

ノロウイルスを高感度に測定する手段としてノロウイルスＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅する方法があげられる（特許文献２）が、該方法の場合、一般的には逆転写（ＲＴ）工程およびＰＣＲ工程の二段階の工程が必要である。このことは、操作を煩雑にして再現性を悪化させる要因となるだけでなく、二次汚染の危険性をも増加させることにもなる。また、前記ＲＴ工程およびＰＣＲ工程を合わせると通例２時間以上の時間を要し、多数検体処理や検査コストの低減には不向きであった。

標的ＲＮＡの定量法としては、ＲＴ工程に引き続いて実施されるＰＣＲ工程をインターカレーター性蛍光色素存在下で実施して蛍光増加を測定するＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法が汎用されている（非特許文献１）が、該方法ではプライマーダイマーなどの非特異増幅産物も検出してしまうという問題もあった。さらに、ＰＣＲは急激に反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。

一方、一定温度でＲＮＡのみを増幅する方法としては、ＮＡＳＢＡ法（特許文献３および４）、およびＴＭＡ法（特許文献５）などが報告されている。該ＲＮＡ増幅方法は、標的となるＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素および必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、ＲＮＡポリメラーゼによって標的となるＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行なうものである。そして、ＲＮＡ増幅後、電気泳動または検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法などにより増幅されたＲＮＡを検出する。

以上のように前記ＲＮＡ増幅方法は一定温度、一段階でＲＮＡのみを増幅することから簡便なＲＮＡ測定に適しているが、ハイブリダイゼーション法などによる検出は煩雑な操作を必要とし、再現性良く定量できないという課題がある。

簡便にＲＮＡを増幅および測定する方法としては、Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（特許文献６および非特許文献２）の方法があげられる。該方法は、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、前記ＲＮＡ増幅方法を実施し、蛍光特性の変化を測定するもので、簡便、一定温度、一段階かつ密閉容器内でＲＮＡ増幅および測定を同時に実施することが可能である。

前記の各核酸増幅方法は、いずれもセンスプライマー（第一のプライマー）およびアンチセンスプライマー（第二のプライマー）からなるプライマーセットにより標的ＲＮＡを増幅する方法であり、該プライマーセットを構成するプライマー配列の組み合わせが前記核酸増幅の効率および特異性に重要な意義を持つことは周知である。しかし、ノロウイルスはきわめて多様な遺伝子型を有するため、全ての遺伝子型を一様かつ高効率に増幅するプライマーセットの構築はきわめて困難であった。

ＷＯ２０００／０７９２８０号公報 特許３７５２１０２号公報 特許２６５０１５９号公報 特許３１５２９２７号公報 特許３２４１７１７号公報 特開２０００−１４４００号公報 特開２００５−２４５４３４号公報 特開平８−２１１０５０号公報 特開２００１−１３１４７号公報 Ｋａｇｅｙａｍａ Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４１，１５４８−１５５７（２００３） Ｉｓｈｉｇｕｒｏ Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３） 感染症発生動向調査週報、６（１１）、１４−１９（２００４） Ｉｓｈｉｇｕｒｏ Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４，４９９２−４９９７（１９９６）

ノロウイルスは遺伝子配列の違いによりジェノグループＩ（ＧＩ）とジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）の２種の遺伝子群に大別される。さらに各遺伝子群についても、現時点でＧＩは１４の遺伝子型に、ＧＩＩは１７の遺伝子型に区別される（非特許文献３参照）。ＧＩに属する遺伝子型間、およびＧＩＩに属する遺伝子型間の塩基配列の相同性は約７０％である。また、ＧＩとＧＩＩの塩基配列の相同性は４０〜５０％である。

前記遺伝子増幅法を用いたノロウイルス検出試薬で高い検出率をあげるためには、プライマー結合領域として、各種遺伝子型間で塩基配列が高度に保存された２０塩基以上の領域が、少なくとも２箇所は必要である。しかしながら、ＧｅｎＢａｎｋ上のノロウイルスの配列として、以下の６配列（Ｃｈｉｂａ（Ｎｏ．ＡＢ０４２８０８）、Ｎｏｒｗａｌｋ（Ｎｏ．Ｍ８７６６１）、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ（Ｎｏ．Ｌ０７４１８）、Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌ（Ｎｏ．ＡＦ１４５８９６）、Ｈａｗａｉｉ（Ｎｏ．Ｕ０７６１１）、ＨｕＣＶ（Ｎｏ．ＡＹ０３２６０５））の相同性を調べただけでも、遺伝子型間で塩基配列が同じである２０塩基以上の領域は存在しない。

このような背景のもと、本発明者らは、既に、ＧＩ、あるいはＧＩＩの幅広い遺伝子型で高い検出率を有する検出方法を提供している（特開２００５−２４５４３４号公報、特許文献７）。しかし、該方法をもってしてもノロウイルスの全ての遺伝子型に対する高感度かつ一様な検出が達成されたとはいえず、より広範囲の遺伝子型をより高感度に検出するノロウイルスＲＮＡの検出方法が望まれている。

本発明者は上記課題を解決するべく鋭意研究を重ねた結果、ノロウイルスＲＮＡの広範囲な遺伝子型に対して高感度に簡便、迅速に測定することが可能となった。

請求項１に記載の発明は試料中のノロウイルスＲＮＡを検出する方法であって、
（１）ノロウイルスＲＮＡ内の特定核酸配列を鋳型とし、いずれか一方の５'末端にプロモーター配列を付加した第一のプライマー及び第二のプライマー、さらに、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、前記特定塩基配列よりなるＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（３）該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物を増幅する工程、
（４）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなり、前記第一のプライマーが、配列番号１から４に記載の配列に対してそれぞれ十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドからなり、前記第二のプライマーが、配列番号５から９に記載の配列に対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。

請求項２に記載の発明は請求項１に係り、前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、第一のプライマーが配列番号１の部分配列である配列番号１０、配列番号２の部分配列である配列番号１１、および配列番号３の部分配列である配列番号１２に記載のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドからなり、第二のプライマーが配列番号５の相補鎖である配列番号１３、配列番号７の相補鎖である配列番号１４、配列番号８の相補鎖である配列番号１５、および配列番号９の相補鎖である配列番号１６に記載のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。

請求項３に記載の発明は請求項１に係り、前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、第一のプライマーが配列番号１から４に記載の配列に対して相同な配列の連続する１４ヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。

請求項４に記載の発明は請求項１から３に係り、前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、ノロウイルスＲＮＡ中の特定核酸配列を鋳型とし、前記特定塩基配列中の第一プライマーとの相同領域の５'末端部位と重複して該部位から５'方向に隣接する領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドとＲＮａｓｅ Ｈにより前記特定塩基配列の５'末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程を、５'末端にプロモーター配列を付加した前記第一のプライマー、前記第二のプライマー、さらにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ Ｈ、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程の前に行なうことを特徴とし、前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１７から２１に対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。

請求項５に記載の発明は請求項１から４に係り、前記ノロウイルスＲＮＡを検出する工程において、前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程（４）が、標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブ共存下で該シグナル変化を測定することによってなされ、前記核酸プローブが配列番号２２に対して十分に相補的な配列からなることを特徴とする。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明中の特定塩基配列とは、ノロウイルスＲＮＡ上で、第一のプライマーと相同領域の５’末端から第二のプライマーと相補領域の３’末端までの塩基配列に相同なＲＮＡまたはＤＮＡの塩基配列を示す。すなわち、本発明では前記特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物が増幅されることになる。本発明中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位とは、特定塩基配列内で該相同領域の５’末端を含む部分配列からなり、該部位は切断用オリゴヌクレオチドとの相補領域と第一のプライマーとの相同領域が重複する部位である。本発明中のプロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始する部位で種々のＲＮＡポリメラーゼに特異的なプロモーター配列が既知であり、本発明の使用において特に限定するものではないが、分子生物学的実験等で汎用されているＴ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターなどが好適である。

本発明中の十分に相補的な配列とは、最適化された核酸増幅反応条件（塩濃度、オリゴヌクレオチド濃度、反応温度等）において特定塩基配列に対して特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能な配列をいう。また、本発明中の十分に相同的な配列とは、最適化された核酸増幅反応条件（塩濃度、オリゴヌクレオチド濃度、反応温度等）において特定塩基配列の完全相補配列に対して特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能な配列をいう。したがって、本発明でいう十分に相補的あるいは十分に相同な配列は、ハイブリダイゼーションの特異性および効率に影響を与えない範囲内であれば長さなどを任意に設定することが可能である。

前述したように、現時点でノロウイルス ＧＩ ＲＮＡには１４種の、ノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡには１７種の遺伝子型がそれぞれ存在し、さらに、塩基配列が高度に保存された領域は十分に長くない。そのため、一種類の第一のプライマーおよび第二のプライマーからなるプライマーの組み合わせによりすべての遺伝子型を高感度に検出することは困難であった。そこで、本発明では、より広範囲の遺伝子型を高感度に検出するために、複数の遺伝子型に対して十分に相同または相補的な配列を有する二種以上の第一のプライマーおよび第二のプライマーからなるプライマーの組み合わせを用いた検出方法を構築した。

すなわち、本発明においてノロウイルスＲＮＡ検出のための第一のプライマーは配列番号１から４に記載の配列に対してそれぞれ十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドからなり、かつ第二のプライマーが配列番号５から９に記載の配列に対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドからなる配列を有する。

より好ましくは第一のプライマーが配列番号１０から１２に記載のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドからなり、かつ第二のプライマーが配列番号１３から１６に記載のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドからなる配列を有する。

本発明の一態様として、第一のプライマーが配列番号３１、３２および３３に記載の配列のオリゴヌクレオチドからなり、かつ第二のプライマーが配列番号３４および３５に記載の配列のオリゴヌクレオチドからなる配列を有する。

本発明において、ノロウイルスＲＮＡはｃＤＮＡ合成の鋳型となる前に該ＲＮＡ内の特定核酸配列の前記５’末端部位で切断される。特定核酸配列の５’末端部位で切断されることで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一プライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、前記ｃＤＮＡの３’末端を伸長することにより効率的に合成することができ、結果として機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を形成する。このような切断方法として、ノロウイルスＲＮＡ内の特定塩基配列の５’末端部位（該特定塩基配列内で５’末端を含む部分配列）に重複して５’方向に隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、切断用オリゴヌクレオチドとする）を添加することによって形成されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素等により切断する方法があげられる。該切断用オリゴヌクレオチドの３’末端にある水酸基は伸長反応を防止するために適当な修飾を施されたもの、例えばアミノ化等されているものを使用することが好ましい。

高効率に前記５’末端部位を切断するためには切断用オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率を上げる必要がある。しかし、ノロウイルスＲＮＡには多様な遺伝子型が存在するため、１種類の切断用オリゴヌクレオチドで種々の遺伝子型に対して高効率にハイブリダイゼーションさせることは困難である。

そこで、本発明では、切断用オリゴヌクレオチドとして、配列番号１７から２１に記載の配列に対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種の切断用オリゴヌクレオチドからなる混合物、より好ましくは配列番号１７の相補鎖の部分配列である配列番号２３、配列番号１８の相補鎖の部分配列である配列番号２４、配列番号１９の相補鎖の部分配列である配列番号２５、および配列番号２０の相補鎖の部分配列である配列番号２６に記載の配列に対してそれぞれ相同な配列の少なくとも連続した２４オリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種の切断用オリゴヌクレオチドからなる混合物を使用することにより、ノロウイルスＲＮＡのより広範囲な遺伝子型に対して切断用オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率を向上させ、結果として、より広範囲な遺伝子型に対する高感度化が可能となった。

本発明中の標的ＲＮＡとは、ＲＮＡ転写産物上の特定塩基配列のうち、前記プライマーとの相同あるいは相補領域以外の配列を示し、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブとの相補的結合が可能な配列を有する。よって、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブは、本発明中の特定塩基配列の一部と相補的な配列となる。そのため、たとえば本発明の一態様として、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブとして配列番号２６に対して十分に相補的な配列を有する核酸プローブが利用できる。

本発明のひとつの態様として、切断用オリゴヌクレオチドは、配列番号１７から２１に対してそれぞれ十分に相補的な配列を含む配列を有し、かつノロウイルスＲＮＡ（該当する遺伝子型）に対し十分に相補的である。また、第一のプライマーは、その５’末端にプロモーター配列を有しており、配列番号１から４に記載の配列に対してそれぞれ十分に相同な配列を含むオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドからなり、かつノロウイルスＲＮＡ（該当する遺伝子型）の完全相補配列に対して十分に相補的なオリゴヌクレオチドである。また、第二のプライマーが、配列番号５から９に記載の配列に対してそれぞれ十分に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチド配列を有し、かつノロウイルスＲＮＡ（該当する遺伝子型）に対して十分に相補的な配列であり、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは配列番号２２に対して十分に相補的な配列を含む配列を有し、かつ標的核酸に対して、十分に相補的であることが好ましい。

より好ましくは本発明の前記切断用オリゴヌクレオチドとして配列番号２８から３０に記載のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチド配列、前記第一のプライマーが配列番号１０から１２に記載のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチド配列、前記第二のプライマーが配列番号１３から１６に記載のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチド配列を有し、前記インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブは配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド配列を有することが好ましい。

本発明のノロウイルスＲＮＡの検出方法において、各酵素（１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素、１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素）が必要となる。各酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよいし、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。また、たとえば、１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ Ｈ活性、および１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を合わせ持つ逆転写酵素に、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を添加するだけでなく、必要に応じてＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素をさらに添加して補足すること等も可能である。前記逆転写酵素は、分子生物学的実験等で汎用されているＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、あるいはこれらの誘導体などが好適であり、ＡＭＶ逆転写酵素とその誘導体が最も好ましい。また、前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学的実験等で汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、およびこれらの誘導体が使用可能である。

本発明の一態様では、試料中のノロウイルスＲＮＡに前記切断用オリゴヌクレオチドを添加し、前記逆転写酵素のＲＮａｓｅ Ｈ活性により前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する。切断された前記ＲＮＡを鋳型として前記第一のプライマーおよび第二のプライマーの存在下で前記逆転写酵素による逆転写反応を実施すると、第二のプライマーがノロウイルスＲＮＡ内の特定塩基配列に結合し、前記逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によりｃＤＮＡ合成が行われる。得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは前記逆転写酵素のＲＮａｓｅ Ｈ活性によってＲＮＡ部分が分解され、解離することによって第一のプライマーが前記ｃＤＮＡに結合する。引き続いて、前記逆転写酵素のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により特定塩基配列由来で５’末端にプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡが生成される。該２本鎖ＤＮＡは、プロモーター配列下流に特定塩基配列を含み、前記ＲＮＡポリメラーゼにより特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物を生産する。該ＲＮＡ転写産物は、前記第一および第二のプライマーによる前記２本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型となって、一連の反応が連鎖的に進行し、前記ＲＮＡ転写産物が増幅されていく。

このような連鎖反応を進行させるために、前記各酵素に必須な既知の要素として、少なくとも、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸を含むことはいうまでもない。また、反応効率を調節するための添加剤として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、糖などを添加することも可能である。

たとえば、ＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合は３５から６５℃の範囲で反応温度を設定することが好ましく、４０から４４℃の範囲で設定することが特に好ましい。前記ＲＮＡ増幅工程は一定温度で進行し、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼが活性を示す任意の温度に反応温度を設定することが可能である。

増幅されたＲＮＡ転写産物量は、既知の核酸測定法により測定することが可能である。このような測定法としては、電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、検出可能な標識で標識された核酸プローブによるハイブリダイゼーション法などが利用できる。しかし、これらは操作が多工程であり、また増幅産物を系外に取り出して分析するため二次汚染の原因となる増幅産物の環境への飛散の危険性が大きい。これらの課題を克服するためには標的核酸と相補結合することによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブを用いることが好ましい。さらに好適な方法として、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、前記核酸増幅工程を実施し、蛍光特性の変化を測定する方法があげられる（特許文献６および非特許文献２参照）。

前記インターカレーター性蛍光色素としては特に限定されないが汎用されているオキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、およびこれらの誘導体などが利用できる。前記蛍光特性の変化としては蛍光強度の変化があげられる。たとえばオキサゾールイエローの場合、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４９０ｎｍ）が顕著に増加することが既知である。前記インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは、前記ＲＮＡ転写産物上の標的ＲＮＡに対して十分に相補的なオリゴヌクレオチドで、末端あるいはリン酸ジエステル部あるいは塩基部分に適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素が結合され、さらに、３’末端の水酸基からの伸長を防止する目的で該３’末端の水酸基が適当な修飾をなされている構造を有する（特許文献８および非特許文献４参照）。

オリゴヌクレオチドへのインターカレーター性蛍光色素の標識は、既知の方法でオリゴヌクレオチドに官能基を導入し、インターカレーター性蛍光色素を結合させることが可能である（特許文献９および非特許文献４参照）。また、前記官能基の導入方法としては、汎用されているＬａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を用いることも可能である。

本発明の一態様として、試料に少なくとも、５’末端にＴ７プロモーター配列を有する第一のプライマー（配列番号１０に記載の配列の５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号５８）を付加した配列、配列番号１１に記載の配列の５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号５８）を付加した配列、および配列番号１２に記載の配列の５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号５８）を付加した配列）、第二のプライマー（配列番号１５および配列番号１６に示す配列）、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（配列番号２７に示す配列）、切断用オリゴヌクレオチド（それぞれ配列番号２８、２９および３０に示す配列）、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む増幅試薬を添加し、反応温度３５から６５℃（好ましくは４０から４４℃）の一定温度で反応させると同時に反応液の蛍光強度を経時的に測定する方法を提供する。

別の一態様として、試料に、少なくとも、５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号５８）を有する第一のプライマー（配列番号３１、３２および３３に示す配列）、第二のプライマー（配列番号３４および配列番号３５に示す配列）、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（配列番号２７に示す配列）、切断用オリゴヌクレオチド（それぞれ配列番号３６、３７および３８に示す配列）、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む増幅試薬を添加し、反応温度３５から６５℃（好ましくは４０から４４℃）の一定温度で反応させると同時に反応液の蛍光強度を経時的に測定する方法を提供する。

前記態様においては、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例１時間以内で終了することが可能である。

また、前記測定試薬に含まれる全ての試料を単一の容器に封入可能な点は特筆すべきである。即ち、一定量の試料を単一容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的にノロウイルスＲＮＡを増幅し検出することができる。この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいれば良く、試料を分注した後に密閉することが可能なものはコンタミネーションを防止する上で特に好ましい。

前記態様のＲＮＡ増幅・測定方法は、一段階、一定温度で実施可能であるため、ＲＴ−ＰＣＲに比べて簡便で自動化に適した方法であるといえる。本発明によりノロウイルスＲＮＡの広範囲な遺伝子型に対して高特異性、高感度、迅速、簡便、一定温度かつ一段階の測定が可能となった。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
実施例１
本願実施例で使用したノロウイルスＲＮＡ（以降、標準ＲＮＡと表記）は（１）から（２）に示す方法で調製した。
（１）ＧｅｎＢａｎｋに登録されているノロウイルスｃＤＮＡ塩基配列のうち、表１に示す遺伝子型、及び塩基配列領域の２本鎖ＤＮＡを調製した（なお、当該ＤＮＡの５’末端側にはＳＰ６プロモーターを付加している）。
（２）（１）で調製したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写を実施し、引き続きＤＮａｓｅ Ｉ処理により前記２本鎖ＤＮＡを完全消化した後、ＲＮＡを精製して調製した。該ＲＮＡは２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。

なお、標準ＲＮＡの全長は５３３塩基（該ＲＮＡの５’末端にはＳＰ６プロモーターに由来する８塩基が付加されている）と、ノロウイルスＲＮＡの全長（約７０００塩基）の一部ではあるが、本発明の測定対象であるノロウイルスＲＮＡの測定には十分適用可能である。また、今回標準ＲＮＡを調製した遺伝子型はノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの遺伝子型全１４種のうちの８種と一部ではあるが、
（Ａ）ＧＩ／１、ＧＩ／６、およびＧＩ／８との間、
（Ｂ）ＧＩ／４、ＧＩ／５、およびＧＩ／９との間
（Ｃ）ＧＩ／３、ＧＩ／１０、ＧＩ／１１、ＧＩ／１２、ＧＩ／１３、およびＧＩ／１４との間
はそれぞれ相同性が高い（非特許文献３）ことから、今回調製した遺伝子型の標準ＲＮＡを全て検出できれば、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの全ての遺伝子型を検出可能であることが予想される。
実施例２
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製した。非特許文献４に記載の方法で、配列番号２７に記載の配列の５’末端から１２番目のＣと１３番目のＡの間、配列番号５７に記載の配列の５’末端から１２番目のＣと１３番目のＡの間のリン酸ジエステル部分にリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させたオキサゾールイエロー標識核酸プローブを調製した（図１）。
実施例３
本願発明の方法において、表２に示す組み合わせの第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（以降、ＩＮＡＦプローブと表記）、切断用オリゴヌクレオチドを用いて、（１）から（４）に示す方法で、標準ＲＮＡの測定を行なった。なお、表２の組み合わせのうち、組み合わせＡに記載の第一のプライマー、第二のプライマーおよび切断用オリゴヌクレオチドは特開２００５−２４５４３４（特許文献７）の実施例２に開示した配列と同一である。また、配列番号１０、３１、４０、４３および４５はそれぞれ配列番号１の部分配列、配列番号１１、３２、４１および４６はそれぞれ配列番号２の部分配列、配列番号１２、３３および４７のそれぞれは配列番号３の部分配列、配列番号４２および４４のそれぞれは配列番号４の部分配列、配列番号３４は配列番号５の相補鎖の部分配列、配列番号４８は配列番号６の相補鎖の配列、配列番号３５は配列番号７の相補鎖の部分配列、配列番号１５は配列番号８の相補鎖の配列、配列番号１６は配列番号９の相補鎖の配列、配列番号２８、３６、５１および５４はそれぞれ配列番号１７の相補鎖の部分配列、配列番号２９、５２および５５はそれぞれ配列番号１８の相補鎖の部分配列、配列番号３７は配列番号１９の相補鎖の部分配列、配列番号３０、３８および５６はそれぞれ配列番号２０の相補鎖の部分配列、配列番号５３は配列番号２１の相補鎖の部分配列、配列番号２７および５７のそれぞれは配列番号２２の相補鎖の部分配列である。

（１）前記各標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μＬ リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用いて１０^３コピー／５μＬとなるよう希釈し、これをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、アプライドバイオシステムズ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。

反応液の組成：酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度または量
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．６）
１８ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
０．７５μＭ 第一のプライマー：該プライマーは、各配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号５８）が付加されている
１μＭ 第二のプライマー
２０ｎＭ インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（ＩＮＡＦプローブ）：該プローブは実施例２において調製したもの
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド：該オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基はアミノ基で修飾されている
６Ｕ リボヌクレアーゼインヒビター（タカラバイオ製）
１３％ ＤＭＳＯ
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。

酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度または量
２％ ソルビトール
６.４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素 （ライフサイエンス製）
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （インビトロジェン製）
３．６μｇ 牛血清アルブミン
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に６０分間測定した。

酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度値で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表３に示した。なお、表３においてＮ．Ｄ．とは酵素を添加して６０分後の蛍光強度比が１．２未満（陰性判定）であった試料を意味する。

ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの主要な遺伝子型であるＧＩ／１（Ｎｏｒｗａｌｋ）の標準ＲＮＡに対して迅速に検出したオリゴヌクレオチドの組み合わせは、組み合わせＡ、Ｂ、Ｇ、ＩおよびＬであった。一方、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの広範囲な遺伝子型の標準ＲＮＡに対して迅速に検出したオリゴヌクレオチドの組み合わせは、組み合わせＱ、Ｒ、ＴおよびＵであり、特に、組み合わせＴが最も好ましい組み合わせであった。

また、第一のプライマー、第二のプライマー、および切断用オリゴヌクレオチドがそれぞれ一種類であるオリゴヌクレオチドの組み合わせ（組み合わせＡからＤ）を使用したときよりも、第一のプライマー、第二のプライマー、および切断用オリゴヌクレオチドがそれぞれ二種以上であるオリゴヌクレオチドの組み合わせ（組み合わせＥからＬ）を使用したときの方が、より広範囲の遺伝子型の標準ＲＮＡに対して検出していた。このことから、ノロウイルスの広範囲な遺伝子型に対して高感度に検出するためには該プライマー類をそれぞれ二種以上使用したほうが好ましいことがわかる。

さらに、組み合わせＱ、Ｒ、ＴおよびＵとの比較で、第一のプライマーの長さが２０オリゴヌクレオチドのとき（組み合わせＱおよびＲ）と、１４オリゴヌクレオチドのとき（組み合わせＴおよびＵ）とで、各遺伝子型の標準ＲＮＡの検出には殆ど差がみられなかったことから、第一プライマーの長さは１４ヌクレオチドあれば十分であることがわかる。

以上から、本発明に記載の第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ、切断用オリゴヌクレオチドを用いたＲＮＡ増幅・測定法により、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの広範囲な遺伝子型に対して高感度に検出可能であることが示された。

実施例２で調製したインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの構造。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４は塩基を示す。Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（非特許文献４）の方法に従いリン酸ジエステル部分にリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素（オキサゾールイエロー）を結合させたプローブ。なお、３’末端の水酸基からの伸長反応を防止するために３’末端の水酸基はグリコール酸修飾がなされている。

Claims (5)

1. 試料中のノロウイルスＲＮＡを検出する方法であって、
   （１）ノロウイルスＲＮＡ内の特定核酸配列を鋳型とし、いずれか一方の５’末端にプロモーター配列を付加した第一のプライマー及び第二のプライマー、さらに、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
   （２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、前記特定塩基配列よりなるＲＮＡ転写産物を生成する工程、
   （３）該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物を増幅する工程、
   （４）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
   からなり、前記第一のプライマーが、配列番号１から４に記載の配列に対してそれぞれ十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドからなり、前記第二のプライマーが、配列番号５から９に記載の配列に対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とするノロウイルスＲＮＡの検出方法。
2. 前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、第一のプライマーが配列番号１の部分配列である配列番号１０、配列番号２の部分配列である配列番号１１、および配列番号３の部分配列である配列番号１２に記載のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドからなり、第二のプライマーが配列番号５の相補鎖である配列番号１３、配列番号７の相補鎖である配列番号１４、配列番号８の相補鎖である配列番号１５、および配列番号９の相補鎖である配列番号１６に記載のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
3. 前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、第一のプライマーが配列番号１から４に記載の配列に対して相同な配列の連続する１４ヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
4. 前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、ノロウイルスＲＮＡ中の特定核酸配列を鋳型とし、前記特定塩基配列中の第一プライマーとの相同領域の５’末端部位と重複して該部位から５’方向に隣接する領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドとＲＮａｓｅ Ｈにより前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程を、５’末端にプロモーター配列を付加した前記第一のプライマー、前記第二のプライマー、さらにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ Ｈ、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程の前に行なうことを特徴とし、前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１７から２１に記載の配列に対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも二種のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項１から３に記載の検出方法。
5. 前記ノロウイルスＲＮＡを検出する工程において、前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程（４）が、標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブ共存下で該シグナル変化を測定することによってなされ、前記核酸プローブが配列番号２２に対して十分に相補的な配列からなることを特徴とする、請求項１から４に記載の検出方法。

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