JP2009047578A - Cholesterol binding agent using anti-DNP antibody - Google Patents
Cholesterol binding agent using anti-DNP antibody Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009047578A JP2009047578A JP2007214640A JP2007214640A JP2009047578A JP 2009047578 A JP2009047578 A JP 2009047578A JP 2007214640 A JP2007214640 A JP 2007214640A JP 2007214640 A JP2007214640 A JP 2007214640A JP 2009047578 A JP2009047578 A JP 2009047578A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cholesterol
- antibody
- dnp
- binding agent
- bsa
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 title claims abstract description 136
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 title claims abstract description 68
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 15
- -1 dinitrophenyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 9
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 4
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 3
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 3
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 2
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 108010067755 dinitrophenyl-bovine serum albumin Proteins 0.000 description 2
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 125000001917 2,4-dinitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C(=C1*)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 238000003347 ECL western blotting detection kit Methods 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010062497 VLDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
【課題】 新規なコレステロール結合剤およびコレステロール検出キットを提供する。
【解決手段】 ジニトロフェニル基を認識する抗体（抗ＤＮＰ抗体）をコレステロール結合剤として用い、抗ＤＮＰ抗体のコレステロール結合性を利用して細胞や組織中のコレステロールを検出する。
【選択図】 図１PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a novel cholesterol binding agent and a cholesterol detection kit.
SOLUTION: An antibody that recognizes a dinitrophenyl group (anti-DNP antibody) is used as a cholesterol binding agent, and cholesterol in cells and tissues is detected using the cholesterol binding property of the anti-DNP antibody.
[Selection] Figure 1
Description
本発明は、コレステロール結合剤及びそれを用いたコレステロール検出キットに関する。 The present invention relates to a cholesterol binding agent and a cholesterol detection kit using the same.
コレステロールは肝臓で低密度リポタンパク質LDLとして産生され、末梢組織に運ばれ、取り込まれる。コレステロールは末梢組織で生体膜の構成要素として、またステロイドホルモンの原料として使われる。生体膜からは高密度リポタンパク質HDLによってコレステロールが取り除かれ、肝臓に運ばれて再利用される。しかし、細胞内でのコレステロールの分布は簡便な染色法がないために容易には調べられない。実際には、細胞内のコレステロール動態評価は血流中のLDL、VLDL、HDLコレステロールの測定から推察しているのが現状である。
生体組織のコレステロール分布は蛍光を発する抗生物質フィリピン（Fillipin）で観察できる。しかしフィリピンの蛍光は弱く、すぐに消退してしまう。またフィリピンは細胞膜のコレステロールとは反応するが、細胞内の脂肪滴コレステロールとは反応せず、細胞内全体のコレステロール分布の観察には適していない。
ジニトロフェニル基（ＤＮＰ）を認識する抗体はいくつか知られており、市販もされている（特許文献１など）。しかしながら、ジニトロフェニル基を認識する抗体がコレステロールの検出に使用できることは全く知られていなかった。
The cholesterol distribution in living tissues can be observed with the fluorescent antibiotic Philippines (Fillipin). However, the fluorescence in the Philippines is weak and will disappear soon. The Philippines reacts with cholesterol in cell membranes, but does not react with intracellular lipid cholesterol, making it unsuitable for observing cholesterol distribution throughout the cell.
Several antibodies that recognize dinitrophenyl groups (DNP) are known and commercially available (
本発明は、コレステロールと特異的に結合してコレステロールを効率よく検出することができる試薬を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a reagent capable of specifically detecting cholesterol by binding specifically to cholesterol.
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、ジニトロフェニル基を認識する抗体（抗ＤＮＰ抗体）がコレステロールに特異的に結合することを見出した。そこで、抗ＤＮＰ抗体とコレステロールの結合を利用することで、コレステロールを効率よく検出できることを見出して本発明を完成するに至った。 The present inventor has intensively studied to solve the above problems. As a result, it was found that an antibody that recognizes a dinitrophenyl group (anti-DNP antibody) specifically binds to cholesterol. Thus, the present inventors have found that cholesterol can be efficiently detected by utilizing the binding between an anti-DNP antibody and cholesterol, thereby completing the present invention.
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ジニトロフェニル基を認識する抗体からなるコレステロール結合剤。
（２）（１）のコレステロール結合剤を含む、コレステロール検出キット。
（３）コレステロールを含む試料にジニトロフェニル基を認識する抗体を添加して試料中に含まれるコレステロールを検出することを特徴とする、コレステロール検出方法。
That is, the present invention is as follows.
(1) A cholesterol binding agent comprising an antibody that recognizes a dinitrophenyl group.
(2) A cholesterol detection kit comprising the cholesterol binder of (1).
(3) A method for detecting cholesterol, comprising adding an antibody recognizing a dinitrophenyl group to a sample containing cholesterol to detect cholesterol contained in the sample.
本発明によれば、コレステロールを簡便かつ特異的に検出することができる。特に、細胞内コレステロールを簡便に検出することができ、血液などを利用して細胞内のコレステロール分布を判定できるため、高コレステロール血症などの検査にも適している。
According to the present invention, cholesterol can be detected easily and specifically. In particular, intracellular cholesterol can be easily detected, and the distribution of intracellular cholesterol can be determined using blood or the like, so that it is also suitable for tests such as hypercholesterolemia.
以下に本発明を詳しく説明する。 The present invention is described in detail below.
ジニトロフェニル基を認識する抗体（抗ＤＮＰ抗体）は、例えば、ジニトロフェニル基を化学的にＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）やＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）などのペプチドと結合させたもの（ＤＮＰ−ＫＬＨコンジュゲートまたはＤＮＰ−ＢＳＡコンジュゲート）を抗原に用いて作製することができる。これらのＤＮＰコンジュゲートをウサギやマウスなどの哺乳動物に注入して免疫感作させ、その血清を回収し、得られた抗血清からＤＮＰカラムなどで精製することにより抗体を得ることができる。
なお、ジニトロフェニル基としては２，４−ジニトロフェニル基が好ましい。
An antibody that recognizes a dinitrophenyl group (anti-DNP antibody) is, for example, a dinitrophenyl group chemically bound to a peptide such as KLH (keyhole limpet hemocyanin) or BSA (bovine serum albumin) (DNP-KLH). Conjugates or DNP-BSA conjugates) can be used for the antigen. These DNP conjugates are injected into mammals such as rabbits and mice for immunization, the serum is collected, and the antibody can be obtained by purifying the obtained antiserum with a DNP column or the like.
The dinitrophenyl group is preferably a 2,4-dinitrophenyl group.
また、モノクローナル抗体を作製する場合は、例えば、上記のようにして得られたＤＮＰ−ＫＬＨコンジュゲートまたはＤＮＰ−ＢＳＡコンジュゲートでマウスなどの非ヒト哺乳動物を免疫し、非ヒト哺乳動物から単離したリンパ球をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、得られたハイブリドーマが産生する抗体の中から、ＤＮＰを特異的に認識する抗体を選択することによって得ることができる。抗体がＤＮＰを認識するかどうかは、ウエスタンブロットやＥＬＩＳＡなどによって確認することができる。
なお、本発明において、モノクローナル抗体とは、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、F(ab')2化抗体、F（ab'）化抗体、短鎖抗体（scFv）、ダイアボディ（Diabodies）およびミニボディ（Minibodies）を含むものとする。
When producing a monoclonal antibody, for example, a non-human mammal such as a mouse is immunized with the DNP-KLH conjugate or DNP-BSA conjugate obtained as described above and isolated from the non-human mammal. The obtained lymphocytes are fused with myeloma cells to produce a hybridoma, and an antibody that specifically recognizes DNP can be selected from the antibodies produced by the obtained hybridoma. Whether an antibody recognizes DNP can be confirmed by Western blot, ELISA, or the like.
In the present invention, a monoclonal antibody refers to a monoclonal antibody, a fragment of a monoclonal antibody, an F (ab ′) 2 antibody, an F (ab ′) antibody, a short chain antibody (scFv), a diabody and a minibodies. Includes body (Minibodies).
抗ＤＮＰ抗体として市販の抗体を使用することもできる。例えば、市販の抗DNP-BSAウサギポリクローナル抗体（SIGMA D-9656）、抗DNP-BSAヤギポリクローナル抗体（Biogenesis 3599-9594）、抗DNP-KLHウサギポリクローナル抗体（Molecular Probes A-6430）などが挙げられるが、これらには限定されない。 A commercially available antibody can also be used as the anti-DNP antibody. For example, commercially available anti-DNP-BSA rabbit polyclonal antibody (SIGMA D-9656), anti-DNP-BSA goat polyclonal antibody (Biogenesis 3599-9594), anti-DNP-KLH rabbit polyclonal antibody (Molecular Probes A-6430), etc. However, it is not limited to these.
本発明者らにより、抗ＤＮＰ抗体がコレステロールに特異的に直接結合するという性質が明らかになったため、抗ＤＮＰ抗体をコレステロール結合剤として使用することができる。
コレステロール結合剤の用途としては、コレステロールの回収、検出などが挙げられる。コレステロールの回収方法としては、例えば、抗ＤＮＰ抗体を適当な担体などに結合させて対象試料と接触させ、抗ＤＮＰ抗体を介して担体に結合したコレステロールを回収する方法が挙げられる。
また、コレステロールを検出する方法としては、コレステロールを含む試料に抗ＤＮＰ抗体を添加して抗ＤＮＰ抗体と試料中のコレステロールとの複合体を形成させ、複合体中のコレステロールを標識された２次抗体などを用いて検出する方法などが挙げられる。
検出の対象はコレステロールを含有しうる試料であれば特に制限されないが、コレステロールを含有しうる生体試料が好ましく、コレステロールを含有しうる細胞や組織切片がより好ましい。
特に、コレステロールが高濃度に集積した形質膜、内分泌顆粒膜を効率よく検出することができる。
コレステロールを含有しうる細胞や組織切片におけるコレステロールの量や分布を検出する具体的方法としては、例えば、以下のような方法が挙げられる。
ホルマリン等で固定化された細胞または組織切片に抗ＤＮＰ抗体を反応させる。洗浄後、標識された２次抗体を反応させ、その標識に基づいて検出する。抗ＤＮＰ抗体の添加量は抗体の検出感度（力価）によって調整される。
標識された２次抗体としては、蛍光標識抗体や酵素標識抗体を使用することができる。蛍光標識抗体を用いた場合、蛍光顕微鏡などを用いて検出することができる。一方、酵素標識抗体を用いたときは、酵素の基質を添加して基質分解反応によって生じる発光や発色に基づいて検出することができる。
Since the present inventors have clarified the property that an anti-DNP antibody directly binds to cholesterol, the anti-DNP antibody can be used as a cholesterol binding agent.
Examples of uses of the cholesterol binder include recovery and detection of cholesterol. Examples of the method for recovering cholesterol include a method in which an anti-DNP antibody is bound to an appropriate carrier and brought into contact with a target sample, and cholesterol bound to the carrier is recovered via the anti-DNP antibody.
Further, as a method for detecting cholesterol, a secondary antibody labeled with cholesterol in the complex is prepared by adding an anti-DNP antibody to a sample containing cholesterol to form a complex of the anti-DNP antibody and cholesterol in the sample. For example, the detection method may be used.
The detection target is not particularly limited as long as it is a sample that can contain cholesterol, but a biological sample that can contain cholesterol is preferable, and cells and tissue sections that can contain cholesterol are more preferable.
In particular, plasma membranes and endocrine granule membranes in which cholesterol is accumulated at high concentrations can be efficiently detected.
Specific methods for detecting the amount and distribution of cholesterol in cells and tissue slices that can contain cholesterol include, for example, the following methods.
An anti-DNP antibody is reacted with a cell or tissue section fixed with formalin or the like. After washing, the labeled secondary antibody is reacted and detected based on the label. The addition amount of the anti-DNP antibody is adjusted by the detection sensitivity (titer) of the antibody.
As the labeled secondary antibody, a fluorescent labeled antibody or an enzyme labeled antibody can be used. When a fluorescently labeled antibody is used, it can be detected using a fluorescent microscope or the like. On the other hand, when an enzyme-labeled antibody is used, it can be detected based on light emission or color development caused by a substrate decomposition reaction by adding an enzyme substrate.
また、抗ＤＮＰ抗体自身が標識されていてもよい。例えば、細胞に蛍光物質などで標識された抗ＤＮＰ抗体を添加し、蛍光顕微鏡等で蛍光を測定することにより細胞内のコレステロールの分布を調べることもできる。
あらかじめ既知量のコレステロールで検量線を作成しておくことにより、コレステロールの定量も可能である。
Further, the anti-DNP antibody itself may be labeled. For example, the distribution of cholesterol in cells can be examined by adding an anti-DNP antibody labeled with a fluorescent substance to the cells and measuring the fluorescence with a fluorescence microscope or the like.
Cholesterol can be quantified by preparing a calibration curve with a known amount of cholesterol in advance.
本発明は、また、抗ＤＮＰ抗体を含むコレステロール検出キットを提供する。該キットは、それがコレステロールの検出に使用するためのものである旨、及びその検出方法に関するプロトコルを記載した使用説明書を含むキットであることが好ましい。また、本発明のキットは２次抗体などのその他の試薬を含むものであってもよい。
本発明のコレステロール検出キットは研究目的のみならず、高コレステロール血症などの診断目的に使用することもできる。例えば、抗ＤＮＰ抗体を用いたＥＬＩＳＡによって血中のコレステロール濃度を測定することができる。
The present invention also provides a cholesterol detection kit comprising an anti-DNP antibody. The kit is preferably a kit comprising instructions for use that describe its use for cholesterol detection and a protocol for the detection method. The kit of the present invention may contain other reagents such as secondary antibodies.
The cholesterol detection kit of the present invention can be used not only for research purposes but also for diagnostic purposes such as hypercholesterolemia. For example, the cholesterol concentration in blood can be measured by ELISA using an anti-DNP antibody.
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 The following examples illustrate the present invention more specifically. However, the present invention is not limited to the following examples.
[実施例１]
０、０．０２、０．２、２．０、および２０μｇのコレステロールの溶液を、それぞれ膜（Protoran:Schleicher & Schuell BioScience Inc）にドットブロットした。また、比較対照として、それぞれ２０μｇのフォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリンを膜にブロットした。得られた膜に１%BSA（ウシ血清アルブミン）/PBSを加えて30分間ブロッキングを行った。次に、1%BSA/PBSで1000倍に希釈した10μg/mlの抗ＤＮＰ抗体（抗DNP-BSAウサギポリクローナル抗体（SIGMA D-9656）、抗DNP-BSAヤギポリクローナル抗体（Biogenesis 3599-9594）、抗DNP-KLHウサギポリクローナル抗体（Molecular Probes A-6430）のそれぞれ）を加えて4℃で一晩インキュベートした。次に、PBSで5分間洗浄する操作を3回繰り返した後、１%BSA/PBSで1：500に希釈したペルオキシダーゼ標識2次抗体（抗ウサギ二次抗体：Jackson社、または抗ヤギ二次抗体：Jackson社）を添加して室温で2時間インキュベートした。PBSで5分間洗浄する操作を3回繰り返した後、発光基質（ECL Western Blotting Detection kit; Amersham Biosciences社）を加えて検出を行った。結果を図１に示した。それによると、いずれの抗ＤＮＰ抗体もコレステロールに濃度依存的に結合することがわかった。一方、抗ＤＮＰ抗体は比較対照の脂質のいずれにも反応せず、抗ＤＮＰ抗体が特異的にコレステロールに結合することがわかった。
[Example 1]
Solutions of 0, 0.02, 0.2, 2.0, and 20 μg of cholesterol were dot blotted onto membranes (Protoran: Schleicher & Schuell BioScience Inc), respectively. As comparative controls, 20 μg of phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, and sphingomyelin were blotted on the membrane, respectively. 1% BSA (bovine serum albumin) / PBS was added to the obtained membrane and blocked for 30 minutes. Next, 10 μg / ml anti-DNP antibody (anti-DNP-BSA rabbit polyclonal antibody (SIGMA D-9656), anti-DNP-BSA goat polyclonal antibody (Biogenesis 3599-9594) diluted 1000 times with 1% BSA / PBS), Anti-DNP-KLH rabbit polyclonal antibody (each of Molecular Probes A-6430)) was added and incubated overnight at 4 ° C. Next, after washing 3 times with PBS for 3 minutes, a peroxidase-labeled secondary antibody (anti-rabbit secondary antibody: Jackson, or anti-goat secondary antibody diluted 1: 500 with 1% BSA / PBS) : Jackson) was added and incubated at room temperature for 2 hours. The operation of washing with PBS for 5 minutes was repeated three times, and then detection was performed by adding a luminescent substrate (ECL Western Blotting Detection kit; Amersham Biosciences). The results are shown in FIG. It was found that all anti-DNP antibodies bind to cholesterol in a concentration-dependent manner. On the other hand, it was found that the anti-DNP antibody did not react with any of the comparative lipids, and the anti-DNP antibody specifically bound to cholesterol.
[実施例２]
次に、抗ＤＮＰ抗体を用いて蛍光組織染色を行い、インスリンの蛍光パターンと比較した。
ＭＩＮ６細胞（マウス膵β細胞由来）を2日間培養後、ホルムアミドを用いて固定化し、１%BSA/PBSを加えて30分間ブロッキングを行った。次に、1%BSA/PBSで1000倍に希釈した抗ＤＮＰ抗体（抗DNP-BSAウサギポリクローナル抗体（SIGMA D-9656）、もしくは抗DNP-KLHウサギポリクローナル抗体（Molecular Probes A-6430））、または1%BSA/PBSで500倍に希釈した抗インスリン抗体（SIGMA社）を加えて4℃で一晩インキュベートした。次に、PBSで5分間洗浄し、これを3回繰り返した。次に、１%BSA/PBSで1：500に希釈したDNPに対する2次抗体（Redx anti-rabbit IgG：Jackson社）、1：1000に希釈したインスリンに対する2次抗体（Alexa488 anti-guinea pig IgG: Molecular Probes社）を添加して室温で2時間インキュベートした後、蛍光顕微鏡で蛍光を観察した。結果を図２に示した。
それによると、抗ＤＮＰ抗体による染色パターンはインスリンの染色パターンと類似し
ており、コレステロールが細胞内の内分泌小胞に存在していることが確認できた。
[Example 2]
Next, fluorescent tissue staining was performed using an anti-DNP antibody and compared with the fluorescence pattern of insulin.
MIN6 cells (derived from mouse pancreatic β cells) were cultured for 2 days, fixed with formamide, and blocked by adding 1% BSA / PBS for 30 minutes. Next, anti-DNP antibody (anti-DNP-BSA rabbit polyclonal antibody (SIGMA D-9656) or anti-DNP-KLH rabbit polyclonal antibody (Molecular Probes A-6430)) diluted 1000 times with 1% BSA / PBS, or Anti-insulin antibody (SIGMA) diluted 1: 500 with 1% BSA / PBS was added and incubated overnight at 4 ° C. Next, it was washed with PBS for 5 minutes, and this was repeated 3 times. Next, secondary antibody against DNP diluted 1: 500 with 1% BSA / PBS (Redx anti-rabbit IgG: Jackson), secondary antibody against insulin diluted 1: 1000 (Alexa488 anti-guinea pig IgG: Molecular Probes) was added and incubated at room temperature for 2 hours, and fluorescence was observed with a fluorescence microscope. The results are shown in FIG.
According to this, the staining pattern with the anti-DNP antibody was similar to that of insulin, and it was confirmed that cholesterol was present in intracellular endocrine vesicles.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007214640A JP4854088B2 (en) | 2007-08-21 | 2007-08-21 | Cholesterol binding agent using anti-DNP antibody |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007214640A JP4854088B2 (en) | 2007-08-21 | 2007-08-21 | Cholesterol binding agent using anti-DNP antibody |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009047578A true JP2009047578A (en) | 2009-03-05 |
| JP4854088B2 JP4854088B2 (en) | 2012-01-11 |
Family
ID=40499935
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007214640A Expired - Fee Related JP4854088B2 (en) | 2007-08-21 | 2007-08-21 | Cholesterol binding agent using anti-DNP antibody |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4854088B2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116735854A (en) * | 2023-06-14 | 2023-09-12 | 之江实验室 | A method of coupling 2,4-dinitrophenol with antibodies |
| CN116754760A (en) * | 2023-06-14 | 2023-09-15 | 之江实验室 | Method for controlled cleavage coupling of 2,4-dinitrophenol (DNP) and antibodies |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003302401A (en) * | 2002-04-05 | 2003-10-24 | Internatl Reagents Corp | Rapid and sensitive assay using a high-performance monoclonal anti-hapten antibody |
| JP2003344419A (en) * | 2002-05-31 | 2003-12-03 | Inst Of Physical & Chemical Res | Cholesterol detection reagent |
| US20070059242A1 (en) * | 2005-08-15 | 2007-03-15 | Paul Wentworth | Methods to identify therapeutic agents |
| JP2007327920A (en) * | 2006-06-09 | 2007-12-20 | Gunma Univ | Cholesterol binding agent and cholesterol detection kit |
-
2007
- 2007-08-21 JP JP2007214640A patent/JP4854088B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003302401A (en) * | 2002-04-05 | 2003-10-24 | Internatl Reagents Corp | Rapid and sensitive assay using a high-performance monoclonal anti-hapten antibody |
| JP2003344419A (en) * | 2002-05-31 | 2003-12-03 | Inst Of Physical & Chemical Res | Cholesterol detection reagent |
| US20070059242A1 (en) * | 2005-08-15 | 2007-03-15 | Paul Wentworth | Methods to identify therapeutic agents |
| JP2007327920A (en) * | 2006-06-09 | 2007-12-20 | Gunma Univ | Cholesterol binding agent and cholesterol detection kit |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116735854A (en) * | 2023-06-14 | 2023-09-12 | 之江实验室 | A method of coupling 2,4-dinitrophenol with antibodies |
| CN116754760A (en) * | 2023-06-14 | 2023-09-15 | 之江实验室 | Method for controlled cleavage coupling of 2,4-dinitrophenol (DNP) and antibodies |
| CN116735854B (en) * | 2023-06-14 | 2024-01-26 | 之江实验室 | Method for coupling 2, 4-dinitrophenol with antibody |
| CN116754760B (en) * | 2023-06-14 | 2024-01-26 | 之江实验室 | Method for coupling 2, 4-Dinitrophenol (DNP) with controlled cleavage of antibody |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4854088B2 (en) | 2012-01-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11016107B2 (en) | Method for diagnosing or monitoring kidney function or diagnosing kidney dysfunction | |
| TR201806292T4 (en) | IMMUNOLOGICAL TEST FOR DETERMINATION OF PROCALCITONIN | |
| EP4357780A1 (en) | Sars-cov-2 immunoassay method and immunoassay kit, and monoclonal antibody or antibody fragment thereof | |
| US10954298B2 (en) | Method of obtaining a binder to prepro-vasopressin or fragments thereof | |
| EP3919509B1 (en) | Method for immunological analysis of free aim in biological sample | |
| EP1078266B1 (en) | HUMAN CHROMOGRANIN A (GgA) IMMUNOLOGIC ASSAY, ANTIBODIES, REAGENTS AND KITS FOR SAID ASSAY | |
| JP4854088B2 (en) | Cholesterol binding agent using anti-DNP antibody | |
| WO2020197786A1 (en) | Immunoassay for mitragynine | |
| CA2835068C (en) | Method for immunologically measuring soluble lr11 | |
| US9612237B2 (en) | Ritalinic acid immunoassay | |
| EP3531129B1 (en) | Immunoassay method using anti-human bnp fragment (4-32) antibody | |
| JP2016504590A (en) | A sensitive multiplex immunoassay for soluble fibroblast growth factor receptor. | |
| EP2698383B1 (en) | Detection of synthetic Cannabinoids | |
| KR20150133196A (en) | Specific detection of rat antibodies in mouse serum | |
| EP4317172A1 (en) | Immunological analysis method for type-i collagen c-terminal telopeptide | |
| CN105474016B (en) | AUGURIN immunity tests | |
| Cernoch et al. | Production and analytical characterization of neopterin immunoreagents for biosensor developments | |
| CN112074738A (en) | Heart failure detection method, instrument for heart failure detection, sandwich immunoassay, and combination of antibodies | |
| KR20240051109A (en) | Methods, compositions and kits for assay signal amplification | |
| AU2008217978A1 (en) | Kit for immunoassay of BSH, and method for measurement of BSH | |
| WO2011052380A1 (en) | 5.9 kDa PEPTIDE IMMUNOASSAY METHOD | |
| HK1220763B (en) | Augurin immunoassay |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100714 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20110915 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110927 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20111024 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141104 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |