JP2009042032A - 電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 切り出し器具による支持体からの生体高分子の抽出回収作業が正常に終了したか検証することができる電気泳動装置を提供する。
【解決手段】 生体高分子を電気泳動により移動させるための電気泳動用ゲル１０１を配置した電気泳動槽１０と、ゲル中を電気泳動させた後の生体高分子を撮影する画像撮影手段６１と、撮影された画像に基づいて指定された位置の生体高分子を、ゲルとともに切り出してその内部に留置する切り出し器具２０を備えるとともに、切り出し器具２０をゲルに対して相対的に移動させる切り出し手段６２とを備える。画像撮影手段６１は、切り出し器具２０によって切り出しの行われたゲルの領域を撮影するものであり、この領域の撮影画像に基づき切り出し作業の良否を確認する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、生体高分子、とりわけ核酸を分析するための電気泳動装置に関するものであり、より詳細には、電気泳動装置により核酸を分子量毎に分離し、電気泳動の支持体より核酸の切り出し及び回収する技術に関する。

従来、電気泳動装置を用い、生体高分子とりわけ核酸の分子量に基づいた分離、解析を行う技術は、簡便かつ安価であると共に分析精度も高いため、広範囲に利用されている。以下、核酸の電気泳動に関して述べる。

従来の電気泳動装置は、緩衝液の入れられた電気泳動槽の両端に電圧を印加する電極を配置し、さらにこの電気泳動槽内に、核酸試料が移動する支持体を設置して構成されている。この電気泳動の支持体としては、アガロースあるいはポリアクリルアミドなどのゲル状物質が使用されている。また装置の形態としては、直方体形状の支持体の取り扱いを容易にするため、電気泳動が行われる平面が水平になるように支持体を設置する水平方式の電気泳動装置が汎用されている。

電気泳動の動作は、支持体の一端に形成した溝に核酸試料を滴下し、支持体の両端に電圧を印加させ、支持体中の核酸試料を電気的に移動させる。この時に支持体の網目構造により核酸試料の移動が制約を受け、分子量が大きい程、移動度が遅くなることにより、核酸の分子量に基づいた分離が可能となる。

さらにこのようにして分離した核酸を支持体より核酸画分毎に切り出し、ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎとＧｉｌｌｅｓｐｉｅの方法（非特許文献１）あるいはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載の方法（非特許文献２）などの適当な方法で核酸を抽出回収することにより、核酸試料からの不純物質の分離除去、ベクターへの組み込み、配列マッピングなどへ利用されている。

なお、この核酸分画を抽出回収する方法としては、電気泳動装置を利用する方法以外にも高速液体クロマトグラフィーに代表されるカラムクロマトグラフィーを利用する方法などがあるが、核酸の分離精度に対する装置の簡便性、融通性、装置価格、維持費用などを勘案した場合、電気泳動装置による方法は極めて高効率であるため、専ら核酸画分の抽出回収には電気泳動による方法が利用されている。

次に電気泳動により分離した核酸の検出方法については、臭化エチジウム等の核酸結合性蛍光試薬を電気泳動前に予め支持体中に混合しておくか、あるいは電気泳動後、支持体をこれらの溶液中に浸漬し、支持体中に浸潤させておくことで、支持体中の核酸試料とこの蛍光試薬を結合させた後、蛍光試薬を紫外線により励起し、蛍光発色させて、支持体中の分離した核酸試料を可視化させる（この紫外線を照射する装置はトランスイルミネーターと呼ばれている）。

この紫外線照射により可視化した核酸試料の結果は、従来、フィルム式カメラを利用した画像撮影によりデータを取得していたが、近年の電子デバイスの進歩と共に電荷結合素子（ＣＣＤ）式カメラを採用した画像撮影装置により、画像をデジタル化することが可能となる。ＣＣＤ式のものはフィルム式に比べ、撮影の簡便性、データの保存性およびコンピュータ等のデジタルデバイスとの親和性が高く、電気泳動の短時間化と共に一連の電気泳動手技の作業効率向上に貢献している。

さらに近年、電気泳動装置と画像撮影装置を一体化させて、電気泳動のリアルタイムモニタリングが提案されており、電気泳動による最適な核酸分離分析及び画像の取得を可能にしている。

電気泳動により分離した核酸の支持体からの抽出回収については、従来、鋭利な刃物を利用して支持体より目的の核酸画分を切り出し、上述した適当な方法により核酸を抽出回収していたが、近年、機械的に支持体より核酸分画を切り出す装置および抽出回収装置（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３参照）が提案され、従来の手動による方法に比べ、作業効率を大幅に向上している。
特開平９−１５２０６号公報 特開２０００−８８８０４号公報 特開平７−１３２０７９号公報 ヴォーゲルステイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ．Ｂ．），ギレスピー（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ．Ｄ．）、「 米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」、７６巻、６１５−６１９頁、１９７９年 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（モレキュラークローニング）第２版、６．２２−６．３５頁、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｊ．），フリッチ（Ｆｒｉｔｓｃｈ．Ｅ．Ｆ．），マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ．Ｔ．）編、コールドスプリングハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）刊、１９８９年

しかしながら、上記従来の電気泳動装置、特に、電気泳動後の支持体からの核酸画分の切り出しを作業者によるマニュアル操作で行う装置の場合、作業者は専ら鋭利なナイフを利用して切り出すため、紫外線を直視しながら操作する必要がある。このとき、紫外線の暴露から作業者を保護する保護具を着用するが、通常、紫外線ランプには、紫外光以外にも紫色可視光を混合させているため、高光量の紫色可視光を直視しなければならず、作業者に重篤な眼性疲労を誘引する原因となっている。また、作業中は紫外線を照射し続ける必要があるため、核酸分子の部分断絶、核酸分子に存在する塩基であるチミン同士の重合（チミンダイマー）形成を回避できない。このため、支持体からの核酸の抽出回収に不適であるという課題を有していた。

また、支持体からの核酸画分の切り出しから、回収までの一連の作業を自動化した上記従来の電気泳動装置では、切り出し器具を自動的にチャッキングし、支持体から目的とする画分の切り出し作業を行った後、切り出された画分を定められた経路に基づいて移送し、切り出し器具のチャッキングを解除し回収容器に納めることになる。

しかしながら、切り出し器具を用いて支持体からの切り出しを行うにあたり、目的とする画分の切り出しが正常に行われず、支持体に回収しようとした画分の一部もしくは全体が残留してしまいうことがあった。このような場合には後の分析作業を正確に行えないという課題を有していた。

また、切り出し器具を回収容器まで移送させる途中において画分が落下し、回収容器に正しく納められないということがあり、このような場合においても後の分析作業を正確に行えないという課題を有していた。ここで用いられる試料は微少かつ貴重な場合がほとんどであり、確実な回収作業が要求される。そのため、回収作業にあたり課題が発生した場合には、直ちにその作業を中断し、作業者による復帰作業を要求するようにしなければならない。

本発明は、上記従来の課題を解決するものであり、電気泳動後の支持体から核酸画分を抽出回収する際に、支持体への画分の残留がないかどうかや、回収容器へ収納された切り出し器具内にきちんと生体高分子が回収されたかどうかを検証するようにした電気泳動装置を提供することを目的とする。

前記従来の課題を解決するために、本発明の電気泳動装置は、生体高分子を電気泳動により移動させるための支持体が配置される電気泳動槽と、この支持体中を電気泳動させた後の生体高分子を撮影する画像撮影手段と、この画像撮影手段により撮影された画像に基づいて指定された位置の生体高分子を、支持体とともに切り出してその内部に留置する切り出し器具を備えるとともに、切り出し器具を支持体に対して相対的に移動させる切り出し手段と、を備え、前記画像撮影手段はさらに、切り出し手段の切り出し器具によって切り出しの行われた支持体の領域を撮影するものであり、この領域の撮影画像に基づき切り出し作業の良否を確認するようにしたことを特徴とするものである。

本発明の電気泳動装置によれば、抽出回収作業が正常に終了したかを、切り出しの行われた支持体の画像を確認することで検証することができ、正常に回収が行われていない場合には、後の分析作業を中止し、再度、回収作業を行うようにすることができる。また切り出しを行った領域の画像の撮影は、切り出し位置を指定するために支持体を撮影する画像撮影手段を共用することができるので、コストも抑え、また、小型の装置を実現することができる。

以下に、本発明の電気泳動装置の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。

（実施の形態１）
図１は、本発明の電気泳動装置の概略構成を示した図である。この装置は、Ｙ軸方向に駆動可能なテーブル機構４０と、Ｘ軸方向に駆動可能なキャリッジ機構６０とを備えている。テーブル機構４０の上部には、電気泳動槽１０及び切り出し器具ホルダー３０が設置される。これら電気泳動槽１０と切り出し器具ホルダー３０とは、テーブル機構４０と一体となりＹ軸方向に移動される。

電気泳動槽１０の両端には白金線等の電極１０６，１０７（図２参照）を備えており、電気泳動槽１０に設置された支持体に対し、電極１０６，１０７を通じて電圧を印加することにより、電気泳動を実施する。切り出し器具ホルダー３０には、複数の切り出し器具２０が収容可能である。キャリッジ機構６０は、画像撮影手段６１と、電気泳動槽１０の支持体を設置する面に対して垂直なＺ軸方向に駆動可能な切り出し手段６２とを一体として有し、テーブル機構４０の直上に位置する。切り出し手段６２には、切り出し器具２０が着脱可能な状態で取り付けられ、切り出し手段６２をＺ軸方向に駆動させることで、電気泳動によって分離された核酸試料を支持体と共に切出すことが可能である。

以上のように構成された電気泳動装置について、以下その動作を説明する。図２は、本実施の形態の電気泳動装置のテーブル機構４０の斜視図である。

まず、電気泳動槽１０内に支持体として電気泳動用ゲル１０１を設置する。電気泳動用ゲル１０１の一端に設けた注入口１０２に核酸試料を注入した後、ゲルの両端に設置された１対の電極１０６，１０７間に規定の電圧を印加する。電圧を印加することで負に帯電している核酸試料は陰極から陽極方向に向かって移動を開始する。

ゲル内部は微細な網目状となっており、ゲル内部を移動する核酸試料はその分子量の大きさによって移動する速度が異なるため、一定時間の電圧を加えたゲル内部では分子量に基づいてゲルの注入口とほぼ同じ幅の帯状に分離される。

このとき核酸試料に紫外線を照射すると、核酸試料に予め混合しておいた臭化エチジウムなどの核酸結合性蛍光試薬が蛍光発色する。この蛍光を画像撮影手段６１にて撮影することで核酸試料が分子量に基づいて帯状に分離している電気泳動パターンの画像を得ることが出来る。なお、ここでは電気泳動パターンを得るために、電気泳動を実施する一例を示したが、予め電気泳動を実施したゲルを電気泳動槽１０に設置しても、紫外線を照射し撮影することで、電気泳動パターンを得ることができる。

撮影を実施した核酸試料を更に後の分析にて使用する際には、ゲルの切り出しによる核酸試料の抽出が必要となる。本実施例の電気泳動装置においては、撮影された電気泳動パターン画像を元に、目的とする核酸試料が含まれる核酸画分を判断するようになる。その方法として、画像処理による自動検出、もしくは、表示手段に表示された電気泳動パターンの画像を元に作業者がマニュアル操作で指定するといった方法が提供される。

次に、切り出し作業を図３に示すフロー図を用いて説明する。切り出し作業は、キャリッジ機構６０が切り出し器具ホルダー３０に予め収納された切り出し器具２０の直上まで移動し（Ｓ１）、切り出し手段６２により切り出し器具２０を把持する（Ｓ２）。

そしてテーブル機構４０とキャリッジ機構６０を駆動して、上述したような画像処理による自動検出、もしくは作業者のマニュアル操作によって指定された場所に切り出し器具２０が位置するように切り出し手段６２を移動させる（Ｓ３）。

この位置において、切り出し手段６２を作動させ、把持している切り出し器具２０をゲルに押し付け、ゲルの切り出しを行う（Ｓ４）。切り出し器具２０の下端の開口より、その内部に切り出されたゲルが留まった状態となった後、切り出し器具ホルダー３０の直上の位置に切り出し器具２０を移動させる（Ｓ５）。ゲルを内部に留置した状態の切り出し器具２０のチャッキングを解除することで切り出し手段６２から取り外して、切り出し器具ホルダー３０に切り出し器具２０を回収させる（Ｓ６）。

ここで切り出し器具２０内部にゲルの抽出回収作業が正常に行われない場合が生じるが、その場合には、電気泳動用ゲル１０１に回収すべき核酸試料が残留したり、もしくは移送している最中にゲルが切り出し器具２０から脱落したりする。そこで、抽出回収作業が正常に行われたのか検証する工程を実施する（Ｓ７）。回収作業に問題がなければ、さらに別の部分のゲルを切り出すか判断する（Ｓ８）。全ての切り出し作業が終了していなければ、処理Ｓ１に戻り、同様の切り出し動作を繰り返し行うようにする。

しかし処理Ｓ７において、回収作業に問題が発生していることを検知した場合、ただちに切り出し作業を停止する（Ｓ９）。なお、処理Ｓ９により作業を中断した場合には、作業者による支援を要求するようにすることで、貴重な検体の損失を防止することができる。

処理Ｓ７において、ゲルの抽出回収作業が正常に行われているかの判断は、具体的には、ゲルの抽出回収作業後に紫外線を照射し、画像撮影手段６１にて画像撮影を実施する。このとき、撮影対象として電気泳動用ゲル１０１とする。図４は、電気泳動用ゲル１０１を撮影することにより得られる画像を示す。切り出し作業が行われると、切り出された後の領域は、矩形形状をした空隙１０４が電気泳動用ゲル１０１上に形成される。作業が正常に行われると、抽出作業を行った領域の核酸試料を含む支持体が全て回収されるため、図４（ａ）に示すように、空隙１０４中に蛍光発光するものは確認されない。

しかしながら、作業が正常に行われず電気泳動用ゲル１０１に核酸試料が残留した場合、図４（ｂ）に示すように、空隙１０４中に蛍光発光する残留画分１０５が確認される。従って、抽出回収作業を行った領域の蛍光発色を確認することで、核酸試料が残留していないか検証することができる。これにより、作業の異常を検知可能となり、自動作業を中断して作業者による支援を要請することが可能となる。なお、このとき紫外線を照射する範囲を、ゲルの切り出しを実施した個所を中心とした領域に限定することにより、他の核酸試料の核酸分子の部分断絶や、チミンダイマー形成は抑えることができる。そこで、画像撮影を行うために、紫外線光源及び画像撮影手段をキャリッジ機構６０上に備えるようにし、画像撮影手段が撮影可能な範囲に限定して紫外線を照射するようにすることで、電気泳動用ゲル１０１上の限定した範囲に紫外線を照射することが可能となる。この場合、電気泳動用ゲル１０１の全範囲を一度に撮影することが困難となるが、キャリッジ機構６０により紫外線光源及び画像撮影手段も駆動可能な構成となっているため、電気泳動用ゲル１０１の異なった範囲の撮影が可能であり、また、それら複数の画像を合成処理することにより、電気泳動用ゲル１０１の全範囲の画像とすることができる。

以上のように、本実施の形態においては、ゲルの抽出回収作業後に電気泳動用ゲルを画像撮影することで、ゲルに必要とする画分が残留していないかを確認し、これに基づき画分を正常に抽出回収できたかどうか、その回収作業の良否を検証可能とすることができる。

（実施の形態２）
切り出したゲルの回収がきちんと行われたか、回収作業の良否を確認する別の実施の形態を以下に示す。

図５は、切り出し作業が終わった後に、切り出し器具２０を収納した切り出し器具ホルダー３０を撮影することにより得られる画像を示す。実施例２は抽出回収作業の確認工程を、実施例１とは異なる方式で提供するものである。なお、主たる構成は実施例１において、図１から図２により示したものと同様である。また、切り出し作業も図３に示したフロー図と同様の処理を行う。本実施例では図３で示した処理Ｓ７の確認工程で実施する確認手段として、切り出し器具２０が収納されている切り出し器具ホルダー３０を画像撮影し、蛍光発色の有無を検証する。

回収作業は切り出し器具２０が切り出し器具ホルダー３０に収納されることで終了するが、移送している最中にゲルの切り出し器具２０からの脱落が発生してなければ、図５（ａ）に示すように、抽出画分１０６の蛍光発色が確認される。しかしながら、ゲルの脱落が発生した場合には、蛍光発色する核酸試料が切り出し器具２０中に含まれないため、図５（ｂ）に示すように切り出し器具ホルダー３０中での蛍光発色は確認されない。従って、切り出し器具ホルダー３０内の画分の蛍光発色を確認することで、核酸試料の有無を判別できるため、ゲルの移送途中での脱落を検知することができる。これにより、作業の異常を検知可能となり、自動作業を中断して作業者による支援を要請することが可能となる。

このとき、画像撮影を行うために、紫外線光源及び画像撮影手段６１をキャリッジ機構６０上に備えるようにすることで、電気泳動用ゲル１０１のみならず、切り出し器具ホルダー３０上での撮影も可能となる。

以上のように、本実施の形態においては、ゲルの抽出回収作業後に切り出し器具ホルダー３０を画像撮影することで、移送途中にゲルの脱落がないか検証することができ、画分を正常に抽出回収できたか検証可能とすることができる。

本発明にかかる電気泳動装置は、ゲル電気泳動および電気移動パターンの撮影、電気泳動後の核酸試料の切り出し作業を自動的に一括して実施可能で作業者の安全と労力の低減を図り、さらに必要とする核酸試料を余すことなく回収したかどうかの確認を可能とする装置を提供でき、生体高分子の分析で一般的に利用される電気泳動に関連する技術分野で有用である。

本発明の一実施の形態における電気泳動装置の斜視図 同電気泳動装置のテーブル機構部の斜視図 同電気泳動装置の切り出し作業のフローチャート 同電気泳動装置の回収作業を説明する図 本発明の他の実施の形態における電気泳動装置の回収作業を説明するための図

符号の説明

１０ 電気泳動槽
２０ 切り出し器具
３０ 切り出し器具ホルダー
４０ テーブル機構
６０ キャリッジ機構
６１ 画像撮影手段
６２ 切り出し手段
１０１ 電気泳動用ゲル
１０２ 注入口
１０４ 空隙
１０５ 残留画分
１０６ 抽出画分

Claims (4)

1. 生体高分子を電気泳動により移動させるための支持体が配置される電気泳動槽と、
   前記支持体中を電気泳動させた後の生体高分子を撮影する画像撮影手段と、
   前記画像撮影手段により撮影された画像に基づいて指定された位置の生体高分子を、前記支持体とともに切り出してその内部に留置する切り出し器具を備えるとともに、前記切り出し器具を前記支持体に対して相対的に移動させる切り出し手段と、を備え、
   前記画像撮影手段はさらに、前記切り出し手段の切り出し器具によって切り出しの行われた支持体の領域を撮影するものであり、この領域の撮影画像に基づき切り出し作業の良否を確認するようにしたことを特徴とする電気泳動装置。
2. 切り出し作業を行った後の領域における生体高分子の有無に基づき、切り出し作業の良否を確認することを特徴とする請求項１に記載の電気泳動装置。
3. 生体高分子を電気泳動により移動させるための支持体が配置される電気泳動槽と、
   前記支持体中を電気泳動させた後の生体高分子を撮影する画像撮影手段と、
   前記画像撮影手段により撮影された画像に基づいて指定された位置の生体高分子を、前記支持体とともに切り出してその内部に留置する切り出し器具と、
   前記切り出し器具が着脱自在に取り付けられるとともに、取り付けられた切り出し器具を前記支持体に対して相対的に移動させる切り出し手段と、
   前記切り出し手段から取り外された切り出し器具を収納する切り出し器具ホルダーと、を備え、
   前記画像撮影手段はさらに、前記切り出し器具によって切り出しが行われた後、前記切り出し手段により前記切り出し器具ホルダーに収納された切り出し器具を撮影するものであり、この影画像に基づき切り出し作業の良否を確認するようにしたことを特徴とする電気泳動装置。
4. 切り出し器具内における生体高分子の有無に基づき、切り出し作業の良否を確認することを特徴とする請求項３に記載の電気泳動装置。

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