JP2008521891A

JP2008521891A - 排卵の調節

Info

Publication number: JP2008521891A
Application number: JP2007544297A
Authority: JP
Inventors: ジェニファー・リー・ジューンゲル; ケネス・パトリック・マクナッティー; ロイド・ゲイリー・ムーア; ロバート・シンデクーム・バウアー
Original assignee: AgResearch Ltd
Current assignee: New Zealand Institute for Bioeconomy Science Ltd
Priority date: 2004-12-02
Filing date: 2005-12-02
Publication date: 2008-06-26
Also published as: EP1819722A4; EP1819722A1; WO2006059913A9; CA2589898A1; BRPI0518809A2; AU2005310356A1; WO2006059913A1

Abstract

本発明は、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ分子において機能的に重要な新規ドメインの同定、ならびにそのドメインと相互作用し、これらの分子の生物学的活性を調節することで哺乳動物の卵巣機能および排卵率を変化させるためのペプチドおよび抗体に関する。

Description

本発明は、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ分子上の機能的に重要な新規ドメインの同定、ならびにそれらと相互作用し、これらの分子の生物学的活性を調節することで哺乳動物卵巣機能および排卵率を変化させるための作動薬および拮抗薬に関する。

ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ（ＢＭＰ１５としても知られる）は、発達中の卵胞の卵母細胞内で発現され、哺乳動物の受精能（ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）に関与する（フィッツパトリック（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ）ら、１９９８年）。ＧＤＦ−９は形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのメンバーであり（マクヘロン（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ）およびリー（Ｌｅｅ）、１９９３年）、卵胞発達の初級段階から排卵に至るまで卵母細胞内で発現される（マクグラス（ＭｃＧｒａｔｈ）ら、１９９５年；ライティネン（Ｌａｉｔｉｎｅｎ）ら、１９９８年）。ＧＤＦ−９ＢはＧＤＦ−９と密接な関連があり（デュベ（Ｄｕｂｅ）ら、１９９８年；ライティネン（Ｌａｉｔｉｎｅｎ）ら、１９９８年）、マウス卵母細胞内ではＧＤＦ−９と同時に発現されるが、ヒト一次卵胞内ではＧＤＦ−９よりもやや遅れて発現される。今では卵巣内でのＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂは、ヒト（アールトーネン（Ａａｌｔｏｎｅｎ）ら、１９９９年）、齧歯動物（ライティネン（Ｌａｉｔｉｎｅｎ）ら、１９９８年；デュベ（Ｄｕｂｅ）ら、１９９８年；ヤーティネン（Ｊａａｔｉｎｅｎ）ら、１９９９年）、反芻動物（ボーデンスタイナー（Ｂｏｄｅｎｓｔｅｉｎｅｒ）ら、１９９９年；ボーデンスタイナー（Ｂｏｄｅｎｓｔｅｉｎｅｒ）ら、２０００年；ギャロウェイ（Ｇａｌｌｏｗａｙ）ら、２０００年）および有袋動物（エッケリー（Ｅｃｋｅｒｙ）ら、２００２年）における発達中の卵母細胞内で発現されることが判明している。ヒツジでは、ＧＤＦ−９の発現が原始卵胞内で見られる一方、ＧＤＦ−９Ｂは一次卵胞内で発現される（ボーデンスタイナー（Ｂｏｄｅｎｓｔｅｉｎｅｒ）ら、１９９９年；ギャロウェイ（Ｇａｌｌｏｗａｙ）ら、２０００年）。

ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂは、ＴＧＦβファミリーの大部分の他のメンバーのように、シグナルペプチド、プロ領域および生物活性ペプチドであるＣ末端成熟領域を含むプレプロペプチドとしてコードされる。成熟領域のプロ領域からの切断が、細胞内フリン様プロテアーゼによって行われ、かつ保存されたフリンプロテアーゼ切断部位で生じる。ＴＧＦβスーパーファミリーの大部分のメンバーは二量体として生物活性を示し、またＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂはほぼすべてのファミリーメンバー内に見られる鎖間のジスルフィド共有結合を担うシステイン分子を含有しないが、これらの分子は二量体として生物活性を示すと考えられる（ギャロウェイ（Ｇａｌｌｏｗａｙ）ら、２０００年；ヤン（Ｙａｎ）ら、２００１年）。しかし、生理活性を示す二量体がホモ二量体（ＧＤＦ９−ＧＤＦ９およびＧＤＦ９Ｂ−ＧＤＦ９Ｂ）であるかまたはヘテロ二量体（ＧＤＦ９−ＧＤＦ９Ｂ）であるか、あるいは３種の二量体形態がすべて関与するか否かについては定かではない。上記モデルに基づき、ＧＤＦ−９ホモ二量体がマウスにおいてより重要な役割を果たすがヒツジではＧＤＦ−９Ｂホモ二量体が最も生物活性が高いと仮定されている（ヤン（Ｙａｎ）ら、２００１年）。かかる差異のいずれもが、ヒツジが（通常、１周期当たり卵１個のみを成熟させる）単一排卵動物である一方、マウスは多排卵動物であるという事実に関係するか否かは定かではない。明らかに、ＧＤＦ−９とＧＤＦ−９Ｂの双方は哺乳動物における受精能の制御および維持に重要な役割を果たし、それらの作用の性質を理解することは治療の発展にとって不可欠である。

ジェフリー（Ｊｅｆｆｅｒｙ）ら、２００３年では、バイオインフォマティクスツール（ＧｏＣｏｒｅ）が使用され、機能的に重要な領域の同定を意図して、多種のＴＧＦ−βファミリーメンバー間および異なる種間のＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂにおける保存領域について分析した。しかし、この試験は、インビボでの排卵の調節に対する効果を有する機能的に重要であり得る部位として同定された領域と相関がなかった。

ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂ分子に対して機能的に重要なドメインを同定し、かつかかるドメインまたはかかるドメインの模倣体と相互作用し、それらの生物学的活性を調節することによりインビボで哺乳動物の卵巣機能および排卵率を調節する作動薬および拮抗薬を同定し、かつ／あるいは公共に有用な選択肢を与えることが本発明の目的である。

本明細書および特許請求の範囲において用いられる「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「少なくとも部分的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇａｔｌｅａｓｔｉｎｐａｒｔｏｆ）」、すなわち、この用語を含む独立請求項を解釈する場合、各請求項中のこの用語によって前置きされた特徴がすべて存在する必要があるが、他の特徴も存在しうることを意味する。

発明の概要
本発明は、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ分子上の機能的に重要な新規ドメインの同定に基づき、それらと相互作用する作動薬および拮抗薬に関する。

より詳細には、本発明は、成熟ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ分子のＮ末端付近の機能的に重要なドメインの同定および特徴づけに基づき、ＧＤＦ−９のＮ末端ドメインは、アミノ酸配列：
ＤＱＥＳＡＳＳＥＬＫＫＰＬＶＰＡＳＶＮＬＳＥＹＦＫＱＦＬＦＰＱＮＥＣ（配列番号１）；を含み、そして
ＧＤＦ−９ＢのＮ末端ドメインは、アミノ酸配列：
ＱＡＧＳＩＡＳＥＶＰＧＰＳＲＥＨＤＧＰＥＳＮＱＣ（配列番号２）；を含む。

したがって、本発明は、雌哺乳動物の排卵を調節することができるＧＤＦ−９のＮ末端ドメインの単離断片に関し、前記ＧＤＦ−９のＮ末端ドメインは、アミノ酸配列ＤＱＥＳＡＳＳＥＬＫＫＰＬＶＰＡＳＶＮＬＳＥＹＦＫＱＦＬＦＰＱＮＥＣ（配列番号１）またはその機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体からなる。

好ましくは、ペプチド断片は、配列番号１の１〜９位または２５〜３４位から少なくとも１個のアミノ酸を含む。

本発明はまた、雌哺乳動物の排卵を調節することができるＧＤＦ−９ＢのＮ末端ドメインの単離ペプチド断片に関し、前記ＧＤＦ−９ＢのＮ末端ドメインは、アミノ酸配列ＱＡＧＳＩＡＳＥＶＰＧＰＳＲＥＨＤＧＰＥＳＮＱＣ（配列番号２）またはその機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体からなる。

好ましくは、ペプチド断片は、配列番号２の１〜５位または２１〜２３位から少なくとも１個のアミノ酸を含む。

アミノ酸記号は、下記の表１に示される一文字コードに対応する。

本発明の単離ペプチド断片は、好ましくは、配列番号１または配列番号２の少なくとも５個の隣接アミノ酸またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体を含む。より好ましくは、ペプチド断片は、配列番号１または配列番号２の少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個もしくは少なくとも２０個の隣接アミノ酸またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体を含む。

最も好ましくは、本発明のペプチド断片は、
ＤＱＥＳＡＳＳＥＬＫＫＰＬＶ（Ｃ）（配列番号３）、
ＳＥＹＦＫＱＦＬＦＰＱＮＥＣ（配列番号４）、
ＱＡＧＳＩＡＳＥＶＰＧＰＳＲ（Ｃ）（配列番号５）、および
ＳＲＥＨＤＧＰＥＳＮＱＣ（配列番号６）、
またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体を含む群から選択される。

括弧内のアミノ酸は、場合によって結合目的に添加されるアミノ酸を示す。

本発明はまた、１種または複数種の本発明のペプチド断片に結合する抗体または抗体断片に関する。

さらなる態様では、本発明は、雌哺乳動物の排卵率を調節する方法を提供し、前記方法は、上で定義された、ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９ＢのＮ末端ドメインと相互作用し、かつそれらの生物学的活性を変化させることが可能な１種または複数種の単離ペプチド断片および／または本発明の抗体もしくは抗体断片の有効量を前記哺乳動物に投与するステップを含む。

好ましくは、本発明は、雌哺乳動物に、配列番号３〜６もしくはそれらの機能的変異体および／またはそれらに結合する抗体もしくは抗体断片から選択される１種または複数種のペプチドの有効量を投与するステップを含む、前記哺乳動物の排卵率を調節する方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、雌哺乳動物の排卵率を調節するための薬剤の製造における、本発明の１種もしくは複数種の単離ペプチド断片および／またはそれらに結合する抗体もしくは抗体断片の使用を提供する。

好ましくは、本発明は、雌哺乳動物の排卵率を調節する薬剤の製造における、配列番号３〜６を含む群から選択される１種もしくは複数種のペプチドまたはそれらの機能的変異体および／あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片の使用を提供する。

さらに他の態様では、本発明は、医薬的に許容される担体または賦形剤とともに上で定義されたＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９ＢのＮ末端ドメインと相互作用可能な本発明の１種もしくは複数種の単離ペプチド断片を含む医薬組成物を提供する。

好ましくは、該組成物は、医薬的に許容される担体または賦形剤とともに、配列番号３〜６またはそれらの機能的変異体を含む群から選択される１種または複数種のペプチドを含む。該組成物は、医薬的に許容される担体または賦形剤とともに、１種もしくは複数種の前記ペプチドに結合する抗体または抗体断片を付加的または代替的に含み得る。

図面の説明
ここで、本発明を、以下の添付図面における図面を参照して詳細に説明する：
図１は、ＧＤＦ−９上の配列番号３および４のペプチドの位置を示す；
図２は、ＧＤＦ−９Ｂ上の配列番号５および６のペプチドの位置を示す；
図３ａおよび図３ｂは、多数の異なる種とＮ末端ドメインのコンセンサス配列とのＧＤＦ９の配列相同性を示す；
図４は、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂペプチドでの処理のウシの胞状卵胞発達に対する効果を示す（Ａ＝対照、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）のみ；Ｂ＝ＫＬＨ−ＧＤＦ−９（配列番号７）；Ｃ＝ＫＬＨ−ＧＤＦ−９Ｂ（配列番号５）；Ｄ＝ＫＬＨ−ＧＤＦ−９およびＫＬＨ−ＧＤＦ−９Ｂ（配列番号５および７）；
図５は、ヒツジＧＤＦ−９ペプチド（配列番号３または配列番号４）またはＧＤＦ−９Ｂペプチド（配列番号５）に対して免疫されたヒツジ由来のポリクローナル抗体の、バイオアッセイに直接添加される場合でのヒツジ（ｏ）ＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで刺激されたラット顆粒膜細胞の^３Ｈ−チミジン取り込みに対する効果を示す。横線は、対照培地（すなわちｏＧＤＦ−９またはｏＧＤＦ−９Ｂを含まない培地）で処理された顆粒膜細胞の応答レベルを示す。示されるデータは、４回の繰り返し実験の平均値および平均値の標準誤差である。対照培地で処理された細胞に対しては^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、抗体を受けていない、ｏＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで処理された細胞に対しては^ａＰ＜０．０５、^ｂＰ＜０．０１；
図６は、ヒツジＧＤＦ−９ペプチド（配列番号４）に対して免疫されたヒツジ由来のポリクローナル抗体の、バイオアッセイに直接添加される場合でのマウス（ｍ）ＧＤＰ−９およびヒツジ（ｏ）ＧＤＦ−９Ｂで刺激されたラット顆粒膜細胞の^３Ｈ−チミジン取り込みに対する効果を示す。横線は、対照培地（すなわちｍＧＤＦ−９またはｏＧＤＦ−９Ｂを含まない培地）で処理された顆粒膜細胞の応答レベルを示す。示されるデータは、３回の繰り返し実験の平均値および平均値の標準誤差である。対照培地で処理された細胞に対しては^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、抗体を受けていない、ｍＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで処理された細胞に対しては^ｂＰ＜０．０１。
図７は、ヒツジＧＤＦ−９ペプチド（配列番号４）に対して免疫されたヒツジ由来のポリクローナル抗体の、バイオアッセイに直接添加される場合でのヒツジ（ｏ）ＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで刺激されたラット顆粒膜細胞の^３Ｈ−チミジン取り込みに対する異なる用量の効果を示す。示されるデータは、顆粒膜細胞の１つのプールからの４個の繰り返しウェルの平均値および平均値の標準誤差である。
図８は、ヒツジＧＤＦ−９Ｂペプチド（配列番号５）に対して免疫されたヒツジ由来のポリクローナル抗体の、バイオアッセイに直接添加される場合でのヒツジ（ｏ）ＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで刺激されたラット顆粒膜細胞の^３Ｈ−チミジン取り込みに対する異なる用量の効果を示す。示されるデータは、顆粒膜細胞の１つのプールからの４個の繰り返しウェルの平均値および平均値の標準誤差である。

発明の詳細な説明
本発明は、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９ＢのＮ末端の機能的に重要な新規ドメインを提供する。このドメインと相互作用する作動薬または拮抗薬によるこのドメインの刺激または阻害が雌哺乳動物の排卵率の調節において有効であることが仮定される。

Ｎ末端ドメインの配列について、多数の異なる種におけるＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂタンパク質の対応する配列とＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂについてそれぞれ図３ａおよび３ｂに示される判定されたコンセンサス配列とを比較した。

次いで、Ｎ末端ドメイン内の配列と対応し、かつインビボで投与される場合、ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの生物学的活性に対してアゴニスト効果またはアンタゴニスト効果を有すると予想される多数のペプチドを合成した。特に、ペプチドの三次元構造に従って分子の外側に存在し；分子の可動領域内に存在し；少なくとも９個のアミノ酸の長さを有し；他のＴＧＦベータファミリーメンバーと非相同性であり；他の既知のタンパク質とは非収束性であり；グリコシル化部位を含まない領域内にあり；かつ担体タンパク質に結合可能であるように、ペプチドが設計された。これらの要素を組み合わせる結果、種を超えて高度に特異的であり、かつ交差反応の問題を有することのないペプチドが生成されると考えられた。

したがって、第１の実施形態では、本発明は、雌哺乳動物の排卵を調節することができるＧＤＦ−９のＮ末端ドメインの単離断片に関し、前記ＧＤＦ−９のＮ末端ドメインは、アミノ酸配列ＤＱＥＳＡＳＳＥＬＫＫＰＬＶＰＡＳＶＮＬＳＥＹＦＫＱＦＬＦＰＱＮＥＣ（配列番号１）からなる。アミノ酸記号は、下記の表１に示される一文字コードに対応する。

好ましくは、単離ペプチド断片は、配列番号１の１〜９位または２５〜３４位の少なくとも１個のアミノ酸を含む。

好ましくは、該ペプチドは、配列番号１の少なくとも５個の隣接アミノ酸またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体を含む。より好ましくは、ペプチドは、配列番号１の少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個または少なくとも２０個の隣接アミノ酸またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体を含む。

最も好ましくは、該ペプチドは、
ＤＱＥＳＡＳＳＥＬＫＫＰＬＶ（Ｃ）（配列番号３）、および
ＳＥＹＦＫＱＦＬＦＰＱＮＥＣ（配列番号４）
またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体を含む群から選択される。括弧内のアミノ酸は、場合によって結合目的に添加されるアミノ酸を示す。

本発明はまた、本発明の１種もしくは複数種のＧＤＦ−９ペプチドに結合する抗体または抗体断片に関する。

第２の実施形態では、本発明は、雌哺乳動物の排卵を調節することができるＧＤＦ−９ＢのＮ末端ドメインの単離ペプチド断片に関し、前記ＧＤＦ−９ＢのＮ末端ドメインは、アミノ酸配列：
ＱＡＧＳＩＡＳＥＶＰＧＰＳＲＥＨＤＧＰＥＳＮＱＣ（配列番号２）
またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体からなる。アミノ酸記号は、下記の表１に示される一文字コードに対応する。

好ましくは、単離ペプチド断片は、配列番号２の１〜５位または２１〜２３位の少なくとも１個のアミノ酸を含む。

好ましくは、該ペプチドは、配列番号２の少なくとも５個の隣接アミノ酸またはそれらの機能的誘導体、類似体、相同体もしくは模倣体を含む。より好ましくは、該ペプチドは、配列番号２の少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個または少なくとも２０個の隣接アミノ酸またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体を含む。

最も好ましくは、該ペプチドは、
ＱＡＧＳＩＡＳＥＶＰＧＰＳＲ（Ｃ）（配列番号５）、および
ＳＲＥＨＤＧＰＥＳＮＱＣ（配列番号６）、
またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体を含む群から選択される。

本発明はまた、本発明の１種または複数種のＧＤＦ−９Ｂペプチドに結合する抗体または抗体断片を提供する。

本発明のペプチドは、既知の技術を用いて合成されうる。

本発明のペプチドの類似体、誘導体または変異体は、配列修飾または非配列修飾（ｎｏｎ−ｓｅｑｕｅｎｃｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）を含みうる。非配列修飾は、アセチル化、メチル化、ホスホメチレーション（ｐｈｏｓｐｈｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、カルボキシル化またはグリコシル化を含みうる。

本発明において例示される特異的Ｎ末端ペプチドは、図１および図２中のそれらのＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９ＢのＮ末端部分上の位置に関連してそれぞれ示される。

好ましい類似体は、本発明の配列に対し、ペプチドの生物学的活性に作用しない１つもしくは複数の保存的アミノ酸の置換、欠失または挿入の分だけ異なる配列を有するペプチドを含む。保存的置換は、典型的には１個のアミノ酸と類似する特徴を有する別のアミノ酸との置換、例えば、バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシンの群の中での置換を含む。保存的置換の例を図３ａおよび３ｂ中のＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの配列内に見出すこともでき、それにより、異なる哺乳動物種における置換が、コンセンサス配列と比較して示される。下記表１から他の保存的置換を得ることができる。

他の類似体は、ペプチドの安定性に作用する修飾を有するペプチドを含む。かかる類似体は、例えばペプチド配列内で（ペプチド結合を置換する）１つもしくは複数の非ペプチド結合を含みうる。自然発生Ｌ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸、または非自然発生合成アミノ酸、例えばβもしくはγアミノ酸および環状類似体を含む類似体も含まれる。

さらなる態様では、本発明は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む雌哺乳動物の排卵率を調節する方法における本発明の作動薬および拮抗薬の使用を提供する。かかる非ヒト哺乳動物は、ヒツジ、ウシ、ヤギ、シカ、ブタ、ウマ、ラクダ科哺乳類、フクロネズミ、マーモセット、ネコ、イヌおよび他の商業的に重要な種などの非ヒト霊長類を含む。

本方法は、１種もしくは複数種の作動薬または拮抗薬、あるいはそれらの機能的変異体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片の有効量を該哺乳動物に投与するステップを含みうる。

治療される特定の哺乳動物のＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂに対応するＮ末端ドメインペプチドが本発明の方法において使用されることになると考えられる。配列番号３〜６の特異的なＮ末端ペプチドに対応する異なる種由来のＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂペプチドの例が下記の表１ａに示される。

多数の種の成熟ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂのアミノ酸アラインメントが図３ａおよび３ｂに示される。これらのアラインメント配列は、ベクターＮＴＩの複数のアラインメントプログラムを用いて生成された。このプログラムは、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用している（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、１９９４年）。タンパク質の成熟領域をコードする領域が同定され、ヌクレオチド配列が予測されるタンパク質配列を生成するために使用された。アラインメントのために使用される配列（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号）は、以下のとおりである。ＧＤＦ−９：ウシ（ＮＭ＿１７４６８１）、ヤギ（ＡＨ０１４１１２）、ヒツジ（ＡＦ０７８５４５）、ブタ（ＮＭ＿００１００１９０９）、イヌ（ＸＭ＿５３８６２４）、ネコ（社内データベース）、フクロネズミ（ＡＹ０３３８２６）、ウサギ（社内データベース）、マウス（ＮＭ＿００８１１０）、ラット（ＮＭ＿０２１６７２）、チンパンジー（ＸＭ＿５２７００８）およびヒト（ＮＭ＿００５２６０）。ＧＤＦ−９Ｂ：ウシ（ＡＹ５７２４１２）、シカ（社内データベース）、イヌ（ＸＭ＿５４９００５）、ネコ（社内データベース）、フクロネズミ（ＡＨ０１２３７８）、チンパンジー（ＸＭ＿５２９２４７）、ヒト（ＡＦ０８２３５０）、マウス（ＮＭ＿０２１６７０）、ウサギ（社内データベース）、ブタ（ＡＦ４５８０７０）、ヤギ（社内データベース）およびヒツジ（ＡＦ２３６０７９）。

排卵率の調節は、本発明の作動薬または拮抗薬の雌哺乳動物への投与の結果、抗体がインビボで該作動薬または拮抗薬に対して産生され、次いでＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９ＢのＮ末端ドメインに結合してそれらの生物学的活性に作用することによる、該動物の排卵率の増減を含みうる。

理論に縛られずに、作動薬／拮抗薬ならびに特に配列番号３〜６を含む群から選択される１種もしくは複数種のペプチドに対して産生された１種もしくは複数種の抗体による、ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９ＢにおけるＮ末端ドメインの結合により、生物活性を示すＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの循環濃度の変化がもたらされると考えられる。かかる低下がＧＤＦ−９Ｂ活性における約５０％の低下を含む場合、排卵率の増加がこれまで観察されており、特にＨａｎｎａヒツジの場合、ＧＤＦ−９Ｂ遺伝子において単一の点突然変異が生じた結果、ヘテロ接合体動物における活性のあるＧＤＦ−９Ｂの量が半分になり、排卵率や双子出産が増加したはずである。ホモ接合体動物では、活性のあるＧＤＦ−９Ｂの循環が全くないかまたは極めて少ない場合、動物は不妊であった（ギャロウェイ（Ｇａｌｌｏｗａｙ）ら、２０００年）。同様に、ＧＤＦ−９遺伝子における点突然変異およびそれに伴う排卵率における調節がヒツジにおいて観察されている（国際公開第０３／１０２１９９号パンフレット；ハンラハン（Ｈａｎｒａｈａｎ）ら、２００３年）。

したがって、活性のあるＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの循環濃度において約５０％の低下をもたらす本発明の作動薬または拮抗薬によって排卵率の増加がもたらされる一方、活性のあるＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの循環濃度において約ゼロに至る低下をもたらす作動薬または拮抗薬により、雌哺乳動物における排卵および滅菌の低下がもたらされると仮定されている。

好ましくは、本発明の作動薬または拮抗薬は、配列番号１および２のＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９ＢのコンセンサスＮ末端ドメインに結合する抗体である。「抗体」という用語は、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ）_２断片、ＳｃＦｖ分子などを含むがこれらに限定されない、本明細書において定義されるコンセンサス結合ドメインに対する結合能を保持する抗体の断片または類似体を包含することは理解される必要がある。抗体はポリクローナルまたはモノクローナルでありうるが、好ましくはモノクローナルである。かかる抗体は、動物への投与、すなわち受動免疫における使用を意図した当該技術で既知の任意の技術（例えば、ジュエンゲル（Ｊｕｅｎｇｅｌ）ら、２００２年）によって調製されうる。あるいは、かかる抗体は、適切なアジュバント中での、すなわち能動免疫における使用を意図した抗原の投与によってインビボで産生されうる。適切なアジュバントには、フロイント完全または不完全アジュバントあるいは類似の免疫賦活剤が含まれる。本発明の抗体を、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製可能な、ヒト部分と非ヒト部分の双方を含む、キメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体などの遺伝子工学的方法によって産生することが可能である。

本発明では、本発明の１種もしくは複数種の作動薬および／または拮抗薬と、排卵率を調節して排卵に対する効果を高めることで知られる１種もしくは複数種の活性成分との併用についてさらに検討される。活性成分は、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−９Ｂ、ＢＭＰＲＩＩ、ＢＭＰＩＢ受容体（ＡＬＫ６）、ＡＬＫ５およびＢＭＰ６を含む群、あるいはそれらの機能的断片または変異体から選択されうる。特に本発明では、雌哺乳動物での排卵の調節における、ＢＭＰ１Ｂ受容体と配列番号５または６のペプチドに結合する抗体または抗体断片（Ｆｃ）との併用について検討される。

本発明は、本発明の少なくとも１種の作動薬または拮抗薬を、排卵率の調節に対して有用な医薬的に許容される担体とともに含む医薬組成物をさらに提供する。

本発明の作動薬または拮抗薬における生物学的活性が動物モデルまたはインビトロモデルにおいて試験され、かつ適切に活性を示す化合物が医薬組成物中に調合されることが検討される。本発明の医薬組成物は、本発明の１種もしくは複数種の作動薬または拮抗薬に加え、医薬的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤または当該技術で周知の他の物質を含みうる。かかる物質は、毒性がなく、活性成分の有効性と干渉しない必要がある。担体または他の物質の正確な性質は、医薬組成物の望ましい性質、および経口、静脈内、皮膚、皮下、皮内、筋肉内または腹腔内を例とする投与経路に依存することになる。

経口投与用の医薬組成物は、錠剤、ロゼンジ剤、カプセル剤、粉剤、散剤または液体形態でありうる。錠剤または他の固体経口剤形は、通常、一般に医薬品製造において使用される、ゼラチン、澱粉、マンニトール、結晶セルロース、または他の不活性物質などの固体担体を含むことになる。同様に、シロップ剤または乳剤などの液体医薬組成物は、一般に、水、石油、動物もしくは植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含むことになる。

静脈内、皮膚、皮下、皮内または腹腔内注射において、活性成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態で存在することになる。

さらなる実施形態では、本発明では、本発明の医薬組成物との同時投与によって治療計画（ｔｒｅａｔｍｅｎｔｒｅｇｉｍｅ）に対する相加または相乗効果が得られる、１種もしくは複数種のさらなる排卵調節剤（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓｏｆｏｖｕｌａｔｉｏｎ）の使用について検討する。排卵のかかるさらなる調節剤の例として、卵胞刺激ホルモン、Ａｎｄｒｏｖａｘ（アンドロステンジオンタンパク質の結合体ワクチン）、およびステロイドホルモンが挙げられる。かかる調節剤は、当業者によって理解されるように、排卵が促進されるべきかまたは抑制されるべきかに応じ、本発明の少なくとも１種の作動薬または拮抗薬とともに分割投与、連続投与または同時投与されうる。

本発明の医薬組成物の投与は、好ましくは、個人に対して所望の利益を示すのに十分な「治療有効量」で行われる。実際の投与量、ならびに投与の頻度および時間推移は、雌哺乳動物の基礎症状における性質および重症度に依存することになる。例えば、用量に関する決定などの治療処方は、一般医師および他の医師の責任の範囲内にあり、典型的には、治療を要する疾患、個別患者の症状、送達部位、投与方法および医師に既知の他の要素が考慮されている。上記の技術およびプロトコルの例が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、オスロＡ．（ＯｓｌｏＡ．）（編）、１９８０年の中に見出されうる。

ここで本発明は、特定の実施例を参照することによってより詳細に記載され、本発明の範囲を限定する任意の方法などで解釈されるべきではない。

実施例１
ヒツジの排卵を操作するためのＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９ＢのＮ末端ドメイン対するペプチドおよび抗体の使用
ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂタンパク質配列のＮ末端ドメインに対応し、かつ必要に応じてスカシガイヘモシアニン（ＫｅｙｈｏｌｅＬｉｍｐｅｔＨａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）に対する結合を促進して抗原を生成するための付加残基を含む、４個の１２〜１５ｍｅｒペプチドを合成した。ペプチド配列は、
ＤＱＥＳＡＳＳＥＬＫＫＰＬＶ（Ｃ）（配列番号３）、
ＳＥＹＦＫＱＦＬＦＰＱＮＥＣ（配列番号４）、
ＱＡＧＳＩＡＳＥＶＰＧＰＳＲ（Ｃ）（配列番号５）、および
ＳＲＥＨＤＧＰＥＳＮＱＣ（配列番号６）、
であった。

本試験では、無発情期のロムニー雌ヒツジ（Ｒｏｍｎｅｙｅｗｅｓ）１０頭の群にフロイント完全アジュバント中の０．４ｍｇ／雌ヒツジの各ペプチド−ＫＬＨ抗原結合体を注射し、対照群として１０頭の無発情期のロムニー雌ヒツジに０．４ｍｇ／雌ヒツジのＫＬＨ抗原を注射した。次いで１か月間隔で４回、スパン（Ｓｐａｎ）／トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）／油混合物中のさらなる抗原（各回、０．２ｍｇ／雌ヒツジ）で動物を追加免疫し（皮下）、精管切除術がなされた雄ヒツジを用いて繁殖期間にわたり発情活性（ｏｅｓｔｒｏｕｓａｃｔｉｖｉｔｙ）を監視した。４回の連続する発情周期にわたり、かつ約２０〜３０日後の実験完了時に再度、腹腔鏡によって排卵率を評価した。各雌ヒツジについてこれら５回の観察を平均することによって平均排卵率を決定した。

すべての対照雌ヒツジは周期的な発情活性を示した。排卵率についての配列番号３〜６のペプチドの効果の結果は、下記の表２に示されるように、対照雌ヒツジの場合と比べてペプチド処理された雌ヒツジの排卵率の低下を示し、この結果は、抗ＧＤＦ−９血清抗体および抗ＧＤＦ−９Ｂ血清抗体のレベルの有意な増加と相関する。過去に示された（ユンゲル（Ｊｕｅｎｇｅｌ）ら、２００２年）ようにヒツジ血漿を１：２０，０００に希釈後、抗体レベルを、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。

配列番号３〜５のペプチドは、最初の追加免疫注射後の２週間以内に大部分の動物の排卵率の低下をもたらした。排卵率の低下は、実験が終了するまで維持された。配列番号６のペプチドは、３回目の観察時（３回の追加免疫注射後）までそれほど排卵率は低下せず、動物の５０％が低下しただけであった。しかし、最後の追加免疫注射までには、１０頭中９頭が排卵率の低下を示した（表３）。排卵の減少は、卵巣が外側に認識可能な黄体を有しないという卵巣の観察によって評価した。子宮の観察によって評価して発情期であるとみなされた雌ヒツジは、表３の結果から除外した。

これらのデータは、ＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９ＢのＮ末端ドメインに特異的なペプチド抗原の投与によって排卵率の顕著な低下を誘導することができることを明確に示す。この特定の実施例では、この効果は、能動免疫（すなわち、インビボで抗体を産生する抗原の投与）によって引き起こされた。しかし、類似の効果が、受動免疫、すなわち抗体自体の投与によって見られることが予測される。

実施例２
ウシの排卵を操作するためのＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９ＢのＮ末端ドメインに対するペプチドおよび抗体の使用

ウシＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂタンパク質配列のＮ末端ドメインに対応し、かつ必要に応じてＫＬＨに対する結合を促進して抗原を生成するための付加残基を含む、２個の１５ｍｅｒペプチドを合成した。ペプチド配列は、
ＤＱＥＳＶＳＳＥＬＫＫＰＬＶ（Ｃ）（配列番号７）、および
ＱＡＧＳＩＡＳＥＶＰＧＰＳＲ（Ｃ）（配列番号５）
であった。

配列番号７は、１個のアミノ酸の変更（５位のアミノ酸がＡ→Ｖ）を含む配列番号３の機能的変異体であることに留意されたい。

本試験では、フリージャン交雑種雌ウシ（Ｆｒｉｅｓｉａｎ−ｃｒｏｓｓｈｅｉｆｅｒ）１０頭の群に０．５ｍｌの注射を４回投与して２ｍｌのフロイント完全アジュバント中の０．４ｍｇ／雌ウシの各ペプチド−ＫＬＨ抗原結合体を注射し；１０頭に０．４ｍｇ／雌ウシの両方のペプチド−ＫＬＨ抗原結合体を注射し、対照群として１０頭にＫＬＨ抗原を注射した。次いで１か月間隔で２回、スパン（Ｓｐａｎ）／トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）／マーコル（Ｍａｒｃｏｌ）混合物中のさらなる抗原（各回、０．２ｍｇ／雌ウシ）で動物を追加免疫した（皮下）。２回目の追加免疫の約２週間後に動物を屠殺し、その卵巣を回収した。卵巣の目視検査によって卵巣活動を評価した。卵巣の表面上に確認できる黄体の数に基づいて排卵率を決定した。さらなる機能的な黄体が存在しているが、黄体が形態学的基準（小型、血管新生の欠如、蒼白色）によって機能していないと見られる場合または形態学的基準（小型、血管新生の欠如、蒼白色）および内分泌学的基準（卵巣回収時および回収の２週間前の血液サンプル中のプロゲステロンが低レベルであること）によって機能していない場合、黄体は消失したと判断した（従って排卵率スコアは計算していない）。卵胞の発達は、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色された５μｍの組織切片で評価した。

末梢静脈血サンプルを、最初の時点ならびに１回目および２回目の追加免疫時ならびに１回目の追加免疫の１２日後および屠殺の直前に再度、（ヘパリン処理したヴァキュテーナー（ｖａｃｃｕｔａｉｎｅｒ）によって１０ｍｌ）回収した。その血漿サンプルを抗体価およびプロゲステロン濃度について解析した。

すべての雌ウシが免疫前は正常な卵巣活動であったとみられる。単独または配列番号７のペプチドとともに配列番号５のペプチドで処理すると、排卵率によって判断されるように卵巣活動の顕著な変化が見られた。配列番号７のペプチドのみでの処理は、３０％の２個の排卵を示し、これは、検査された動物の数に対して統計的に有意ではなかったが、異常に高い割合である。配列番号５のペプチドのみによる処理によって３頭の動物において卵巣が活動停止した、すなわち、ヒツジにおいて見られた結果と同様に排卵率が顕著に減少したことを示したことは興味深い（下記の表４を参照）。

回収時の、ＫＬＨに結合されたＧＤＦ−９Ｂペプチド（配列番号５）、ＫＬＨに結合されたＧＤＦ−９ペプチド（配列番号７）またはＫＬＨに結合されたＧＤＦ−９ペプチド（配列番号７）とＫＬＨに結合されたＧＤＦ−９Ｂペプチド（配列番号５）との併用で免疫された雌ウシ由来の卵巣は、ＫＬＨで免疫された対照雌ウシ由来の卵巣と形態学的に異なっていたことが示された。ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂで免疫された雌ウシの卵巣には、表面に認識できる胞状卵胞が少ししかなかった。卵巣の組織切片（図４を参照）と比較して同様の観察を行った。この観察において、ヘモトキシリン（ｈｅｍｏｔｏｘｙｌｉｎ）およびエオシンで染色した５μｍ組織切片上で定量化することによって、卵胞腔（ａｎｔｒａｌｓｐａｃｅ）によって占められる切片の総面積のパーセンテージ、単位面積あたりの胞状卵胞の数および卵胞の平均サイズ（面積）を計測した（下記の表５を参照）。配列番号５、配列番号７またはその両方のペプチドでの処理によって、卵胞腔によって占められる切片の総面積、単位面積あたりの胞状卵胞の数および卵胞の平均サイズが減少した（Ｐ＜０．０１）（下記の表５を参照）。したがって、本発明のペプチド断片による免疫が長時間にわたって持続した場合、排卵率が低下し得るということが、これらの結果から明らかになった。実際のところ、配列番号５（ＧＤＦ−９Ｂ）のペプチドで処理した一部の動物において、対照と比べて卵巣の活動停止の発生率が増加することが示された（上記の表４を参照）。

これらの結果は、Ｎ末端ペプチドがウシの排卵率および卵胞発達生を調節する活性があることを証明している。投与された用量は、ヒツジの場合と同じであるが、ウシではすべての結果で排卵は減少するのではなく増加していた。これは、活性なＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの約５０％という低い循環レベルをもたらす不十分な免疫化をもたらす「ヒツジ用量」に起因する可能性があり、その結果、上述したように排卵率が増加する。

このことは、少し改変を加えた、過去に示されたＥＬＩＳＡ（ユンゲル（Ｊｕｅｎｇｅｌ）ら、２００２年）を用いて抗体価のデータによって確かめられた。以下の表６を参照。マイクロタイタープレート上に被覆された抗原は、２００ｎｇのヒツジＧＤＦ−９成熟タンパク質または１００ｎｇヒツジＧＤＦ−９Ｂ成熟タンパク質であった。抗体は、ウサギ抗ウシＩｇＧの１：２０，０００希釈を使用して検出した。雌ウシ由来の血清を１：５００に希釈した。これは、上記の実験１におけるヒツジ血清で必要であった希釈よりも４０倍濃い希釈であり、このことから、ウシに投与されたＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂペプチドの用量が「不十分な」用量であったことが示唆される。

しかし、上述したように、免疫化レジメンを長期間にわたって継続することによってウシの所定の卵胞発生の減少、排卵率の低下を誘導し得る可能性がある。

ウシの場合よりも多い用量、すなわち、活性なＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの循環レベルを約０にまで減少するのに十分な用量または長期間にわたる免疫化が、ウシの排卵率を顕著に減少することになることが予想される。

これらのデータは、排卵率の重要な調節および胞状卵胞発達がＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９ＢのＮ末端ドメインに特異的なペプチド抗原の投与によって誘導され得ることを明白に示す。これによって、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９ＢのＮ末端の成熟領域がウシの生物学的活性に重要であることが示唆される。この特定の実施例において、この効果は、能動免疫（すなわち、インビボで抗体を産生する抗原の投与）によって引き起こされた。しかし、類似の効果が、受動免疫、すなわち抗体自体の投与によって見られることが予測される。

実施例３
ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂペプチド断片に対して産生された抗体のインビトロでのラット顆粒膜細胞による３^Ｈ−チミジンの取り込みに対する効果
様々な抗体製剤が過去に示された方法（マクナッティ（ＭｃＮａｔｔｙ）ら、２００５年）を用いて顆粒膜細胞培養物に直接添加される場合、ラット顆粒膜細胞に対するヒツジまたはネズミのＧＤＦ−９およびヒツジのＧＤＦ−９Ｂの効果に対するそれらの中和能について試験した。ＫＬＨで免疫したヒツジから精製したＩｇＧの均衡下でＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂペプチド断片で免疫したヒツジから精製したＩｇＧからなる全部で１００μｇ／ｍｌのＩｇＧを各処理において添加した。抗体は、それらに対して特異的な成長因子の効果を中和させることができた（図５および６を参照）。さらに、この応答は、ヒツジＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂに対して試験された２抗体サンプルにおいて用量依存的であることが示された（Ｐ＜０．００１、図７および８を参照）。

ヒツジ（実施例１を参照）およびウシ（実施例２を参照）におけるこれらのペプチドでの能動免疫の効果とともにラット顆粒膜細胞によるチミジンの取り込みに対するタンパク質（例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号５）のＮ末端領域のペプチド断片に対して産生された抗体によるヒツジおよびマウスのＧＤＦ−９ならびにヒツジＧＤＦ−９Ｂの効果の中和は、該タンパク質のこの領域が複数の種の生物学的活性に重要であることを示唆する。これらの結果は、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの成熟領域のＮ末端ドメインに対する抗体がＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂを受動的に中和するときに有効であることも示唆する。

本発明が明確さおよび理解を意図してある程度詳細に記載されている一方、本明細書に記載の実施形態および方法に対する様々な改良および変更を、添付の特許請求の範囲において定義されるような本発明の範囲から逸脱することなく行うことが可能であることは当業者にとって明らかであろう。

本発明は、ヒトを含む雌哺乳動物における排卵率およびそれによる受精能を調節するための組成物および方法を提供する。

参考文献

1. McPherron AC, Lee SJ: GDF-3 and GDF-9: two new members of the transforming growth factor-beta superfamily containing a novel pattern of cysteines. J Biol Chem 268:3444-3449, 1993.

2. McGrath SA, Esquela AF, Lee SJ : Oocyte-specific expression of growth differentiation factor-9. Mol Endocrinol 9:131-136, 1995.

3. Laitinen M, Vuojolainen K, Jaatinen R, Ketola I, Aaltonen J, Lehtonen E, Heikinheimo M, Ritvos O: A novel growth differentiation factor-9 (GDF-9) related factor is co-expressed with GDF-9 in mouse oocytes during folliculogenesis. Mech Dev 78:135-140, 1998.

4. Dube JL, Wang P, Elvin J, Lyons KM, Celeste AJ, Matzuk MM: The bone morphogenetic protein 15 gene is X-linked and expressed in oocytes. Mol Endocrinol 12:1809-1817, 1998.

5. Jaatinen, R., Laitinen, M.P., Vuojolainen, K., Aaltonen, J., Louhio, H., Heikinheimo, K., Lehtonen, E. and Ritvos, O: Localisation of growth differentiation factor-9 (Gdf-9) mRNA and protein in rat ovaries and cDNA cloning of rat GDF-9 and its novel homolog GDF-9B.Mol Cell Endocrinol 156: 189-193, 1999.

6. Aaltonen J, Laitinen M, Vuojolainen K, Jaatinen R, Horelli-Kuitunen N, Seppa L, Louhio H, Tuuri T, Sjoberg J, Butzow R, Hovatta O, Dale L, Ritvos O: Human growth differentiation factor- 9 (GDF-9) and its novel homolog GDF-9B are expressed during early folliculogenesis. J Clin Endocrinol Metab 84: 2744-2750, 1999.

7. Bodensteiner, K.J., Clay, C.M., Moeller, C.L. and Sawyer, H.R.: Molecular cloning of the ovine growth/differentiation factor-9 gene and expression of growth/differentiation factor-9 in ovine and bovine ovaries. Biology of Reproduction 60, 381-386, 1999.

8. Bodensteiner, K.J., McNatty, K.P., Clay, C.M., Moeller, C.L. and Sawyer, H.R.: Expression of growth and differentiation factor-9 in the ovaries of fetal sheep homozygous or heterozygous for the Inverdale prolificacy gene (FecX^I). Biology of Reproduction 62: 1479-1485, 2000.

9. Galloway SM, McNatty KP, Cambridge LM, Laitinen MPE, Juengel JL, Jokiranta TS, McLaren RJ, Luiro K, Dodds KG, Montgomery GW, Beattie AE, Davis GH, Ritvos O: Mutations in an oocyte-derived growth factor gene (BMP15) cause increased ovulation rate and infertility in a dosage-sensitive manner. Nature Genetics 25:279-283, 2000.

10. Eckery, D.C., Whale, L.J., Lawrence, S.B., Wilde, K.A., McNatty, K.P. & Juengel, J.L.: Expression of mRNA encoding growth differentiation factor 9 and bone morphogenetic protein 15 during follicular formation and growth in a marsupial, the brushtail possum (Trichasurus vulpecula). Molecular & Cellular Endocrinology; 2002.

11. Yan, C., Wang, P., DeMayo, J., DeMayo, F.J., Elvin, J., Carino, C., Prasad, S.V., Skinner, S.S., Dunbar, B.S., Dube, J.L., Celeste, A.J. and Matzuk, M.M: Synergistic roles of bone morphogenetic protein 15 and growth differentiation factor 9 in ovarian function. Molecular Endocrinology 15: 854-866, 2001.

12. Fitzpatrick , S.L., Sindon, D.M., Shughue, P.J., Lane M.V., Merchenthaler, I.J., and Frail, D.F.: Expression of growth differntiating factor-9 messenger ribnucleic acid in ovarian and non-ovarian rodent and human tissue. Endocrinology, 139 (5), 2577-2578, 1998.

13. Hanrahan, J.P., Gregan, S.M., Mulsant, P., Mullen, M., Davis, G.M., Powell, R., Galloway, S.M.,: Mutations in the genes for oocyte-derived growth factor GDF-9 and BMP-15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belcare sheep (Ovis aeries). Biol. Reprod, 2003.

14. Juengel, J.L., Hudson, N.L., Heath, D.L., Smith, P., Reader, K.L., Lawrence, S.B., O'Connell, A.R., Laitinen, M.P., Cranfield, M., Groome, N.P., Ritvos, O., McNatty, K.P.,: Growth differentiation factor 9 and bone morphogenic protein 15 are essential for ovarian follicular development in sheep. Biol. Reprod. 67(b), 1777-1789, 2002.

15. Jeffery, L., Mottershead, D.G., Myllymaa, S., Gilchrist, R., Groome, N., and Ritvos, O.,: Grouping of conserved regions (GoCore): Better prediction of function from sequences. Poster ESHRE Campus April, 2003.

16. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 1994 22:4673-4680.

17. McNatty, K.P., Juengel, J.L., Reader, K.L., Lun, S., Myllymaa, S., Lawrence, S.B., Western, A., Meerasahib, M.F., Mottershead, D.G., Groome, N.P., Ritvos, O., Laitinen, M.P.E. (2005). Bone morphogenetic protein 15 and growth differentiation factor 9 co-operate to regulate granulosa cell function. Reproduction 129:473-480.

全ての参考文献は、引用により、その全体が本明細書に組み込まれる。

ＧＤＦ−９上の配列番号３および４のペプチドの位置を示す。ＧＤＦ−９Ｂ上の配列番号５および６のペプチドの位置を示す。多数の異なる種とＮ末端ドメインのコンセンサス配列とのＧＤＦ９の配列相同性を示す。多数の異なる種とＮ末端ドメインのコンセンサス配列とのＧＤＦ−９Ｂの配列相同性を示す。ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂペプチドでの処理のウシの胞状卵胞発達に対する効果を示す（Ａ＝対照、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）のみ；Ｂ＝ＫＬＨ−ＧＤＦ−９（配列番号７）；Ｃ＝ＫＬＨ−ＧＤＦ−９Ｂ（配列番号５）；Ｄ＝ＫＬＨ−ＧＤＦ−９およびＫＬＨ−ＧＤＦ−９Ｂ（配列番号５および７）。ヒツジＧＤＦ−９ペプチド（配列番号３または配列番号４）またはＧＤＦ−９Ｂペプチド（配列番号５）に対して免疫されたヒツジ由来のポリクローナル抗体の、バイオアッセイに直接添加される場合でのヒツジ（ｏ）ＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで刺激されたラット顆粒膜細胞の^３Ｈ−チミジン取り込みに対する効果を示す。横線は、対照培地（すなわちｏＧＤＦ−９またはｏＧＤＦ−９Ｂを含まない培地）で処理された顆粒膜細胞の応答レベルを示す。示されるデータは、４回の繰り返し実験の平均値および平均値の標準誤差である。対照培地で処理された細胞に対しては^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、抗体を受けていない、ｏＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで処理された細胞に対しては^ａＰ＜０．０５、^ｂＰ＜０．０１。ヒツジＧＤＦ−９ペプチド（配列番号４）に対して免疫されたヒツジ由来のポリクローナル抗体の、バイオアッセイに直接添加される場合でのマウス（ｍ）ＧＤＰ−９およびヒツジ（ｏ）ＧＤＦ−９Ｂで刺激されたラット顆粒膜細胞の^３Ｈ−チミジン取り込みに対する効果を示す。横線は、対照培地（すなわちｍＧＤＦ−９またはｏＧＤＦ−９Ｂを含まない培地）で処理された顆粒膜細胞の応答レベルを示す。示されるデータは、３回の繰り返し実験の平均値および平均値の標準誤差である。対照培地で処理された細胞に対しては^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、抗体を受けていない、ｍＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで処理された細胞に対しては^ｂＰ＜０．０１。ヒツジＧＤＦ−９ペプチド（配列番号４）に対して免疫されたヒツジ由来のポリクローナル抗体の、バイオアッセイに直接添加される場合でのヒツジ（ｏ）ＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで刺激されたラット顆粒膜細胞の^３Ｈ−チミジン取り込みに対する異なる用量の効果を示す。示されるデータは、顆粒膜細胞の１つのプールからの４個の繰り返しウェルの平均値および平均値の標準誤差である。ヒツジＧＤＦ−９Ｂペプチド（配列番号５）に対して免疫されたヒツジ由来のポリクローナル抗体の、バイオアッセイに直接添加される場合でのヒツジ（ｏ）ＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで刺激されたラット顆粒膜細胞の^３Ｈ−チミジン取り込みに対する異なる用量の効果を示す。示されるデータは、顆粒膜細胞の１つのプールからの４個の繰り返しウェルの平均値および平均値の標準誤差である。

Claims

雌哺乳動物の排卵を調節することができるＧＤＦ−９のＮ末端ドメインの単離断片であって、前記ＧＤＦ−９のＮ末端ドメインは、アミノ酸配列ＤＱＥＳＡＳＳＥＬＫＫＰＬＶＰＡＳＶＮＬＳＥＹＦＫＱＦＬＦＰＱＮＥＣ（配列番号１）またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体からなる、単離断片。
配列番号１の１〜９位または２５〜３４位の少なくとも１個のアミノ酸を含む、請求項１に記載の単離ペプチド断片。
雌哺乳動物の排卵を調節することができるＧＤＦ−９ＢのＮ末端ドメインの単離ペプチド断片であって、前記ＧＤＦ−９ＢのＮ末端ドメインは、アミノ酸配列ＱＡＧＳＩＡＳＥＶＰＧＰＳＲＥＨＤＧＰＥＳＮＱＣ（配列番号２）またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体からなる、単離ペプチド断片。
配列番号２の１〜５位または２１〜２３位の少なくとも１個のアミノ酸を含む請求項３に記載の単離ペプチド断片。
雌哺乳動物の排卵を調節することができるＧＤＦ−９のＮ末端ドメインの単離ペプチド断片であって、前記断片は、配列番号１の１〜９位または２５〜３４位の少なくとも１個のアミノ酸またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体を含む、単離ペプチド断片。
雌哺乳動物の排卵を調節することができるＧＤＦ−９ＢのＮ末端ドメインの単離ペプチド断片であって、前記断片は、配列番号２の１〜５位または２１〜２３位の少なくとも１個のアミノ酸またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体を含む、単離ペプチド断片。
配列番号１または配列番号２の少なくとも５個の隣接アミノ酸またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離ペプチド断片。
配列番号１または配列番号２の少なくとも８個の隣接アミノ酸またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体を含む、請求項７に記載の単離ペプチド断片。
配列番号１または配列番号２の少なくとも１０個の隣接アミノ酸またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体を含む、請求項７に記載の単離ペプチド断片。
配列番号１または配列番号２の少なくとも１２個の隣接アミノ酸またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体を含む、請求項７に記載の単離ペプチド断片。
配列番号１または配列番号２の少なくとも１４個の隣接アミノ酸またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体を含む、請求項７に記載の単離ペプチド断片。
配列番号１または配列番号２の少なくとも１６個の隣接アミノ酸またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体を含む、請求項７に記載の単離ペプチド断片。
配列番号１または配列番号２の少なくとも１８個の隣接アミノ酸またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体を含む、請求項７に記載の単離ペプチド断片。
配列番号１または配列番号２の少なくとも２０個の隣接アミノ酸またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体を含む、請求項７に記載の単離ペプチド断片。
ＤＱＥＳＡＳＳＥＬＫＫＰＬＶ（Ｃ）（配列番号３）、
ＳＥＹＦＫＱＦＬＦＰＱＮＥＣ（配列番号４）、
ＱＡＧＳＩＡＳＥＶＰＧＰＳＲ（Ｃ）（配列番号５）、および
ＳＲＥＨＤＧＰＥＳＮＱＣ（配列番号６）、
を含む群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離ペプチド断片またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体。
請求項１〜１５のいずれか一項の１種もしくは複数種のペプチド断片に結合する、抗体または抗体断片。
雌哺乳動物の排卵率を調節する方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の１種もしくは複数種の単離ペプチド断片の有効量を前記哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
雌哺乳動物の排卵率を調節する方法であって、請求項１６の１種もしくは複数種の抗体または抗体断片の有効量を前記哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
雌哺乳動物の排卵率を調節する方法であって、請求項１６に記載の１種もしくは複数種の抗体または抗体断片とともに請求項１〜１５のいずれか一項に記載の１種もしくは複数種の単離ペプチド断片の有効量を前記哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
雌哺乳動物の排卵率を調節する方法であって、配列番号３〜６から選択される１種もしくは複数種のペプチド断片またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体および／またはそれらに結合する抗体もしくは抗体断片の有効量を前記哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
雌哺乳動物の排卵率を調節するための薬剤の製造における、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の１種もしくは複数種の単離ペプチド断片の使用。
雌哺乳動物の排卵率を調節するための薬剤の製造における、請求項１６に記載の１種もしくは複数種の抗体または抗体断片の使用。
雌哺乳動物の排卵率を調節するための薬剤の製造における、ａ）請求項１〜１５のいずれか一項に記載の１種もしくは複数種の単離ペプチド断片およびｂ）請求項１６に記載の１種もしくは複数種の抗体または抗体断片の使用であって、前記薬剤がａ）およびｂ）の分割、連続または同時投与を意図して調合される、使用。
前記単離ペプチド断片が配列番号３〜６またはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体もしくは模倣体を含む群から選択される、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の使用。
医薬的に許容される担体または賦形剤とともに請求項１〜１５のいずれか一項に記載の１種もしくは複数種の単離ペプチド断片を含む医薬組成物。
医薬的に許容される担体または賦形剤とともに請求項１６に記載の１種もしくは複数種の抗体または抗体断片を含む医薬組成物。
医薬的に許容される担体または賦形剤とともに請求項１〜１５のいずれか一項に記載の１種もしくは複数種の単離ペプチド断片および請求項１６に記載の１種もしくは複数種の抗体または抗体断片を含む医薬組成物。
医薬的に許容される担体または賦形剤とともに配列番号３〜６またはそれらの機能的変異体を含む群から選択される１種もしくは複数種のペプチドおよび／またはそれらに結合する抗体もしくは抗体断片を含む医薬組成物。
雌哺乳動物の排卵率を調節する方法であって、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の組成物の有効量を、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−９Ｂ、ＢＭＰＲＩＩ、ＢＭＰＩＢ受容体（ＡＬＫ６）、ＡＬＫ５およびＢＭＰ６またはそれらの機能的断片もしくは変異体を含む群から選択される１種または複数種の化合物と併用して前記哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
雌哺乳動物の排卵率を調節する方法であって、配列番号３〜６のいずれか１種のペプチドに結合する抗体または抗体断片（Ｆｃ）の有効量を、ＢＭＰ１Ｂ受容体（ＡＬＫ６）と併用して前記哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
雌哺乳動物の排卵率を調節する方法であって、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の組成物の有効量を、ＦＳＨ、ａｎｄｒｏｖａｘおよびステロイドホルモンからなる群から選択される排卵調節剤と併用して前記哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
雌哺乳動物の排卵率を調節するための薬剤の製造における、ａ）請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の組成物およびｂ）ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−９Ｂ、ＢＭＰＲＩＩ、ＢＭＰＩＢ受容体（ＡＬＫ６）、ＡＬＫ５およびＢＭＰ６またはそれらの機能的断片もしくは変異体を含む群から選択される１種または複数種の化合物の使用であって、前記薬剤がａ）およびｂ）の分割、連続または同時投与を意図して調合される、使用。
雌哺乳動物の排卵率を調節するための薬剤の製造における、ａ）配列番号３〜６のいずれか１種のペプチドに結合する抗体または抗体断片（Ｆｃ）およびｂ）ＢＭＰ１Ｂ受容体（ＡＬＫ６）の使用であって、前記薬剤がａ）およびｂ）の分割、連続または同時投与を意図して調合される、使用。
雌哺乳動物の排卵率を調節するための薬剤の製造における、ａ）請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の組成物およびｂ）ＦＳＨ、ａｎｄｒｏｖａｘおよびステロイドホルモンからなる群から選択される排卵調節剤の使用であって、前記薬剤がａ）およびｂ）の分割、連続または同時投与を意図して調合される、使用。