JP2008512351A

JP2008512351A - アルツハイマー病を処置するためのサイクロスポリン

Info

Publication number: JP2008512351A
Application number: JP2007520737A
Authority: JP
Inventors: ダリア・コーエン; ラリー・アレクサンダー・ゲイザー
Original assignee: ノバルティスアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 2004-07-13
Filing date: 2005-07-12
Publication date: 2008-04-24
Also published as: CN1984670A; MX2007000502A; CA2573400A1; AU2005261838A1; AU2009210375A1; WO2006005580A1; EP1893226A1; KR20070036127A; RU2007105141A; BRPI0513317A

Abstract

非免疫抑制性、シクロフィリン結合性サイクロスポリンは神経保護剤として、例えばＡβ分泌および／または産生と関連する病状の予防または処置において有用である。

Description

本発明は、サイクロスポリンの新規使用、および特に非免疫抑制性、シクロフィリン結合性サイクロスポリンの新規医薬使用に関する。(本明細書中、cyclosporinをサイクロスポリンと、そしてCicrosporinをシクロスポリンとそれぞれ音訳する。)

サイクロスポリンＡ(ＣｓＡ)は、シクロフィリン(ＣｙＰ)のようなイムノフィリンタンパク質に結合するが、ＦＫ５０６およびラパマイシンは、両方ともイムノフィリン結合性化合物であるが、ＦＫ５０６結合性タンパク質(ＦＫＢＰ)に結合する。これらの薬剤の免疫抑制性活性にイムノフィリン結合性は必要であるが、充分ではない。生物学的効果は、薬剤／イムノフィリン複合体と第三のエフェクタータンパク質の相互作用により観察される。例えば、ＣｙＰ−ＣｓＡおよびＦＫＢＰ−ＦＫ５０６複合体はカルシニューリンのセリン／スレオニンホスファターゼ活性を阻害し、それにより、インターロイキン−２のようなサイトカインの産生を遮断する^４。他方、ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体は、ＦＲＡＰと呼ばれるキナーゼ(別名ＲＡＦＴまたはｍＴＯＲ)^５を阻害し、それはインターロイキン−２受容体介在Ｔ細胞増殖に関与する。

サングリフェリンと呼ばれる新規クラスの化合物が、ストレプトミセス属Ａ９２−３０８１１０から単離されている。今日までに単離された２０種の異なるサングリフェリンの中で、サングリフェリンＡ(ＳＦＡ)が最も多い化合物であり、強い免疫抑制性活性を示す。ＳＦＡは、その作用機序が、他の既知の全てのイムノフィリン結合性化合物、すなわちＣｓＡ、ＦＫ５０６、およびラパマイシンと異なる、新規タイプの免疫抑制剤を代表する。ＳｆＡはイムノフィリンタンパク質、シクロフィリンＤ(ＣｙＤ)に他のイムノフィリン、シクロフィリンＡ(ＣｐＡ)と異なる部位で、ミトコンドリア遷移孔(ＭＴＰ)複合体に直接結合し、ＭＴＰ開孔を阻害することが示されている。

ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連障害の処置および予防における非免疫抑制性、シクロフィリン結合性サイクロスポリンおよびそれらの使用は、欧州特許４８４２８１に記載され、それは、サイクロスポリンクラスの化合物、それらの命名法および作用機構の一般的な開示を含む。ＥＰ０,４８４,２８１Ｂの開示、特に上記に言及した一般的開示および下記に言及する他の部分の開示を、本発明の教示において引用により包含する。

驚くべきことに、シクロフィリンに結合するが、免疫抑制性ではないサイクロスポリンが、アルツハイマー病(“ＡＤ”)を含むが、これに限定されないＡβ産生および／または分泌と関連する病的状態を処置するための、神経保護剤として有用であることが判明した。ＡＤは、主にＡβ４０または４２アミノ酸ペプチドから成る脳におけるアミロイドプラークの細胞外蓄積により特徴付けられる。これらのペプチドの細胞外蓄積は、この疾患の特徴的病理である(Selkoe 1999)。Ａβペプチドは、遍在的に発現されるＩ型膜貫通型タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質(ＡＰＰ)の細胞内タンパク質分解により産生される(Selkoe 1999; Sisodia 2000)。ＡＰＰをアミロイド合成経路(amylogenic pathway)において開裂する２種の酵素はβ−およびγ−セクレターゼと呼ばれ、これらは、ＡＰＰを各々Ｎ−およびＣ−末端から開裂する。この経路において、β−セクレターゼ(ＢＡＣＥ１)はＡＰＰを開裂し、分泌型ｓＡＰＰβフラグメントおよび膜結合型Ｃ−末端フラグメント(ＣＴＦ、Ｃ９９)を産生する最初の酵素である(Vassar, Bennett et al. 1999)。Ｃ９９フラグメントは、γ−セクレターゼ複合体(ＧＡＣＥ)の基質であり、それはＣ９９を開裂してＡβおよびＡＩＣＤ(ＡＰＰ細胞内ドメイン(APP IntraCellular Domain))を産生する。ＡＩＣＤは、Ｔｉｐ６０とＦｅ６５の複合体と結合し、ＮＦκ−Ｂ経路中の遺伝子である、ＫＡＩ１(テトラスパニン細胞表面分子)を抑制解除する(Baek, Ohgi et al. 2002)。ＧＡＣＥ複合体は、４種の主要成分、プレセニリン１(ＰＳ１)、ニカストリン(ＮＣＳＴＮ)、Ａｐｈ１、およびＰｅｎ２から成る(Edbauer, Winkler et al. 2003; Kimberly, LaVoie et al. 2003)。ＰＳ１機能的相同体、プレセニリン２(ＰＳ２)は、細胞で産生されるＡβの〜２０％に関与する(Kimberly, Xia et al. 2000)。これらの４成分はＧＡＣＥ活性の再構成に必要かつ十分であるが、ＡＰＰの非ＧＡＣＥ介在開裂が、Ａβ産生をもたらすとの証拠がある(Tesco, Koh et al. 2003; Nunan, Shearman et al. 2001)。

発明の詳細な記載
ＡＰＰ経路に含まれる新規遺伝子の解明は、疾患の完全な病因の決定ならびにＡβ産生を駆動する複雑な機構の良好な理解の発展に重要な工程である。Ａβを制御する新規遺伝子および経路の決定は、疾患の進行を処置するための新規治療戦略の開発を助ける。数種の遺伝的連関および染色体領域が、特に晩発性アルツハイマー病(Late Onset Alzheimer's Disease)(ＬＯＡＤ)(６５歳を超えてからの発症)と特に関連している(Ertekin-Taner, Graff-Radford et al. 2000; Bertram, Blacker et al. 2000; Scott, Hauser et al. 2003)。ＬＯＡＤ関連遺伝子のサブセット、ならびにＡＰＰプロセッシングに含まれる新規遺伝子が、同時係属出願ＵＳＳＮ＿＿に記載され、それは、ＣＨＯＫ１細胞におけるＡβ産生を調節する能力についてｃＤＮＡクローンを試験するための大規模機能的スクリーニングの開示を含む。ＵＳＳＮ＿＿の開示、特にＡβ分泌を調節する遺伝子の同定および下記で言及する他の部分の開示は、本発明の教示において引用により包含する。

細胞内のＡβ産生の重要なレギュレーターとして働くイムノフィリン経路において発見された遺伝子の発見は、アルツハイマー病における薬剤標的を提供する。イムノフィリン経路に関与する、機能的スクリーニングにおいて発見された数個のｃＤＮＡは、Ｍａｐキナーゼ４、カルモジュリン、酸セラミダーゼ、およびＴＯＢ３、ＡＡＡ−ＡＴＰａｓｅを含む。

細胞外シグナル抑制キナーゼ(ＥＲＫ)としても知られるマイトージェン−活性タンパク質キナーゼ(ＭＡＰＫ)は、シグナル伝達カスケード事象を開始する標的基質をリン酸化し、正にまたは負に制御するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼのファミリーである。ＥＲＫは、広範囲の刺激に応答して、細胞膜からのシグナルを核に伝達し、遺伝子発現、有糸分裂、増殖、運動性、代謝、およびアポトーシスの制御において重要な役割を有する(Wada and Penninger 2004)。ＭＥＫおよびＥＲＫ活性の阻害剤は、ＡＰＰ異化反応を阻害することが示されている。加えて、ＭＡＰＫは、ＪＮＫを活性化し、アポトーシスの引き金を引くことができ、Ａβ産生を増加させることが既知の経路である(Tesco, Koh et al. 2003)。理論に縛られることを望まないが、ＭＡＰＫ４ｃＤＮＡはＡＰＰ異化反応またはアポトーシスの活性化を介して働き得るであろう。

同様に、ＡＰＰ細胞内ドメイン(ＡＩＣＤ)フラグメントは、ｃＪｕｎＮ−末端キナーゼ(ＪＮＫ)と相互作用し、ＭＡＰキナーゼ経路をＡＰＰプロセッシングに連結させる(Scheinfeld, Roncarati et al. 2002)。ＭＡＰＫ４は、ＪＮＫを活性化するＥＲＫであり、故にＭＡＰＫ４の過剰発現がＪＮＫの過活性化に至り、それはＡβ産生の増加に至るＪＮＫ−ＡＩＣＤ相互作用を増加し得る。ＪＮＫの活性化がアポトーシスを誘発することも可能である。あるいは、ＭＡＰＫ４はＡＰＰのリン酸化状態を変え、それはＡＰＰ輸送に作用し、ＰＳ１／β−カテニン相互作用を妨害することにより、β−およびα−セクレターゼによるその優先的なプロセッシングに影響することが示されている(Hung and Selkoe 1994; Walter, Capell et al. 1997)。さらに、細胞のリン酸化状態もＰＳ１活性に重要であることが示されている(Seeger, Nordstedt et al. 1997)。ＪＮＫ活性化およびタンパク質リン酸化もまた、ＭＡＰＫ４がＡβ産生を増加するために働き得るいくつかの他の経路である。

本スクリーニングで同定された他の遺伝子はカルモジュリンである。カルモジュリンは、Ｃａ^２＋シグナルを、ＣａＭＫＩＩ、ＣａＭＫＩＶ、カルシニューリン、スペクトリンＡ２、ｐ２１、および神経の一酸化窒素合成酵素を含む特異的標的タンパク質と相互作用することにより伝達する、ループ−へリックス−ループＣａ^２＋結合性タンパク質である(Means 1981)。Ｃａ^２＋がカルモジュリンと結合したとき、それは立体構造変化を受け、標的タンパク質と結合し、それらの活性を刺激または阻害することが可能になる。カルモジュリンは、カルモジュリンアンタゴニストＷ−７およびトリフロペラジンを使用して、無細胞調製物および完全(intact)細胞におけるＡβ産生を制御することが示されている。カルモジュリン活性のこれらの既知の阻害剤はまたＡβ産生を阻害する(Desdouits, Buxbaum et al. 1996)。故に、細胞内Ｃａ^２＋濃度および／またはカルモジュリン標的タンパク質が、ＡＰＰプロセッシングに影響し得る。この化合物データは、Ａβ産生の増加が、カルモジュリンが過剰発現されたときに観察されるとの事実を確認する。

Ｃａ^２＋調節不全、特に細胞質Ｃａ^２＋レベルの低下は、ＰＳ１ＦＡＤ変異と関連するＡβ産生の増加と同時に起こる(Yoo, Cheng et al. 2000)。ＰＳ１ＦＡＤ変異は、容量性カルシウム流入(ＣＣＥ)を著しく減弱させ、涸渇活性化電流を貯蔵させ得て、低下したＣＣＥがＡβ産生を増加し得ることを示唆する(Yoo, Cheng et al. 2000)。本スクリーニングで見られたカルモジュリン遺伝子の過剰発現はまた細胞内カルシウムレベル低下の原因であり、適切なＣＣＥを阻止し得る。細胞内Ｃａ^２＋の減少が、直接的または間接的にＰＳ１活性を増加させ、細胞からのより多いＡβ分泌をもたらす可能性がある。下記に詳述するデータは、ＳｆＡが有効にＡβ４０およびＡβ４２産生ならびにＣ９９およびNotch開裂を阻害することを示唆し、ガンマセクレターゼ活性がイムノフィリンタンパク質ＣｙＤを介してＣａ^２＋ホメオスタシスに連結することを示唆する。

他の遺伝子、ヒト酸セラミダーゼは、セラミドのスフィンゴシンおよび脂肪酸への加水分解を触媒する(Ferlinz, Kopal et al. 2001)。セラミドは、ほとんどのスフィンゴ脂質の前駆体として働き、多くの異なる細胞型のアポトーシスを、典型的にカスパーゼ−３活性化を介して誘発するシグナル伝達分子である。セラミドレベルの増大は、アルツハイマー病と関連し、高齢ＡＤ脳における酸化的神経毒性経路の一部と考えられている。セラミドの過剰発現はＡβ産生を増加させ、セラミダーゼ開裂とＡβを連結させる。セラミドがアポトーシスを介して働くと考えられるため、酸セラミダーゼが同様にアポトーシスを増加させることは可能性がある。

細胞のセラミド状態は、ＢＡＣＥ安定性およびＡβ生合成両方を制御することが示されている(Puglielli, Ellis et al. 2003)。以前の研究は、高レベルのセラミドが、アポトーシス非依存的形態でＡβ分泌を増加できることを証明している(Puglielli, Ellis et al. 2003)。セラミダーゼ過剰発現は、タウリン酸化およびＡβ重合化を変えることが既知の経路であるセラミドレベルを減少させ、スフィンゴシンおよび遊離脂肪酸レベル(ＦＦＡ)を増加させ、おそらく膜流動性を変える(Wilson and Binder 1997)。機構は明らかではないが、セラミダーゼがＦＦＡレベルに影響し、ＡＰＰプロセッシングの改変ならびにより多いＡβ産生および／または分泌に至り得ることはありそうである。

ＴＯＢ３は、タンパク質分泌を含む、タンパク質複合体の会合、作動、または脱会合を助けるシャペロン様機能を実行するＡＡＡ−ＡＴＰａｓｅである(Strausberg, Feingold et al. 2002)。このクラスのタンパク質は、タンパク質が連続的に処理されるため、小胞体(ＥＲ)の完全性の維持を助ける。ＡＡＡ−ＡＴＰａｓｅ活性なしでは、ミスフォールドされたタンパク質の過剰な蓄積が起こり、ＥＲ伸張および細胞死の原因となる(Kobayashi, Tanaka et al. 2002)。ＴＯＢ３過剰発現がＡβ分泌を増加することの最も考えられる説明は、ＥＲにおけるタンパク質折りたたみおよび輸送を行うその能力と関連する。ＴＯＢ３過剰発現と共にこの過程が刺激されたとき、ＡＰＰプロセッシングが増加する可能性がある。

我々のスクリーニングデータは、ＴＯＢ３過剰発現がＡＰＰプロセッシングを変え、より多いＡβ産生およびより少ないＣ９９およびＣ８３Ｃ−末端フラグメントに至ることを示している。ＴＯＢ３発現はまたＮ２Ａ細胞におけるＡＰＰおよびｓＡＰＰαレベルを、ＨＥＫ２９３細胞よりも多く減少させる(データは示していない)。これは、ＴＯＢ３が、ＡＰＰプロセッシング機構の１種以上の成分に影響し、増加したＡＰＰおよびＣ９９開裂をもたらすことを示唆する。ＴＯＢ３がタンパク質の輸送およびプロセッシングに関与するため、ＡＰＰプロセッシングに対するＴＯＢ３の正確な機構および特性は、現在測定中である。

機能的スクリーニングから同定された別のｃＤＮＡであるカルボキシペプチダーゼＺ(ＣＰＺ)は、ＣＰＥおよびＣＰＤと共にメタロカルボキシペプチダーゼ遺伝子ファミリーのメンバーであり、それは生物活性ペプチドおよびタンパク質の、それらの分泌前の細胞内プロセッシングにおいて機能すると考えられている。ＣＰＺは、それがＷｎｔシグナル伝達に重要な成分であるＷｎｔおよびウィングレスタンパク質に結合する機能的Ｎ−末端システイン−リッチ frizzledドメインを含むため、独特なカルボキシペプチダーゼである(Moeller, Swindell et al. 2003)。

他の興味深いｃＤＮＡはシクロフィリンＤ(ＣｙＤ、別名ＣｙＦ。命名法の引用は、Current Medicinal Chemistry, 2003, 10, 1485-1506 1485 Cyclophilin D as a Drug Target, Waldmeier, et alに見ることができる)である。ＣｙＤはＡβ産生に関与することが発見されている。ＣｙＤのようなシクロフィリンタンパク質は、タンパク質輸送および成熟に関与するペプチジル・プロリル・イソメラーゼである。シクロフィリンは、ミトコンドリアのマトリックスに排他的に局在するＣｙＤ以外、主に細胞質に局在する(Waldmeier, Zimmermann et al. 2003)。ＣｙＤが過剰発現されたとき、内因性ＰＳ１Ｎ−末端フラグメント(ＮＴＦ)を安定化できる。ＡＤ脳の一般的病巣は、異常にリン酸化されたタウ、微小管関連タンパク質から成る細胞内神経原線維変化の存在である(Johnson and Bailey 2002)。ＡＰＰと共に過剰発現されたとき、ＣｙＤはカスパーゼ−３活性を活性化でき、それによりＡβ分泌が調節される機構である可能性を示唆する。これらの結果は、過剰発現されたとき、ＣｙＤがγ−セクレターゼ経路を介したＡＰＰおよびＣ９９の開裂に必要な重要な因子であることを示唆する。

一つの局面において、ＣｙＤは、アデニンヌクレオチド輸送体と結合し、開孔を調節すると考えられる、ミトコンドリアの透過性遷移孔の必須の構成要素である(Waldmeier, Zimmermann et al. 2003)。ミトコンドリア膜の透過化は、細胞ストレスの結果であり、ミトコンドリアの膜電位消失、アポトーシスタンパク質の遊離、および最終的にアポトーシス細胞死に至る(Waldmeier 2002)。

ミトコンドリアの不全は、異常なβ−ＡＰＰプロセッシングおよびＡβの細胞内蓄積を促進することにより、ダウン症候群患者におけるＡＤ神経病理学において重要な役割を有することが示唆されている(Busciglio 2002)。細胞内カルシウムレベルの増加はまた細胞内Ａβの蓄積を顕在化させることが示されている(LaFerla 2002)。驚くべきことに、ＡＤのトランスジェニックマウスモデルの脳において、完全長ＡＰＰは分泌経路に沿って輸送されるだけでなく、培養皮質神経細胞のミトコンドリアに標的化される。ミトコンドリアの膜におけるβ−ＡＰＰの不完全な転座および進行性の蓄積は、ミトコンドリアの機能不全に至り得て、ＡＤの病因において重要な役割を有し得る(Anandatheerthavarada, Biswas et al. 2003)。ミトコンドリアのタンパク質の過剰発現がマトリックス内の不溶性凝集体(例えば脱共役タンパク質−３、ＵＣＰ３)の形成に至り得ることは知られている。これらの凝集体は、ミトコンドリアの正常機能を混乱させ、内膜の受動的透過性を増加の両方を行い得る。ＣｙＤは、過剰なＡＰＰまたはＣ−末端フラグメントプロセッシングを処理するミトコンドリアにおいて重要な役割を有し得る。

ＣｙＤは、サイクロスポリンのような免疫抑制剤の既知の標的である。これらの化合物は、ミトコンドリアの透過性遷移(ＭＰＴ)を遮断し、アポトーシスを阻止する(Samantha J. Clarke 2002; Waldmeier 2002)。ＦＫ５０６化合物はまたイムノフィリンタンパク質に結合するが、ＣｙＤには結合しないことが既知である(Uchino 2003)。

サイクロスポリンは、それが、Quesniaux in Eur. J. Immunol. 1987, 17, 1359-1365により記載の競合的ＥＬＩＳＡ試験において、ヒト組み換えシクロフィリンにシクロスポリン(別名サイクロスポリンＡ)の少なくとも１／５結合するとき、シクロフィリンであると見なす。この試験において、試験すべきサイクロスポリンを、シクロフィリンと被覆ＢＳＡ−シクロスポリンとのインキュベーション中に添加し、競合剤なしでのコントロール反応の５０％阻害をもたらすのに必要な濃度(ＩＣ_５０)を計算する。結果を結合比(ＢＲ)として示し、これは試験化合物のＩＣ_５０と試験サイクロスポリンの代わりにシクロスポリンを使用した同様の試験におけるＩＣ_５０の比率の、底１０の対数である。故に、１.０のＢＲは、試験化合物がシクロフィリンにシクロスポリンの１０分の１少なく結合することを示し、負の値はシクロスポリンより強く結合することを示す。

神経保護剤として活性なサイクロスポリンは、０.７(ｌｏｇ_１Ｏ５＝約０.７であるため)より低い、好ましくは０またはそれ以下のＢＲを有する。

サイクロスポリンは、混合リンパ球反応(ＭＬＲ)においてシクロスポリンの５％を超えない、好ましくは２％を超えない活性を有するとき、非免疫抑制性と見なす。混合リンパ球反応は、T. Meo in “Immunological Methods”, L. Lefkovits and B. Peris, Eds., Academic Press, N.Y. pp. 227-239(1979)により記載されている。Ｂａｌｂ／ｃマウス(雌、８−１０週)からの脾臓細胞(０.５×１０^６)を、５日間、ＣＢＡマウス(雌、８−１０週)からの照射した(２０００ラド)またはマイトマイシンＣ処理した０.５×１０^６の脾臓細胞と共インキュベートする。照射した同種細胞は、Ｂａｌｂｃ脾臓細胞において増殖応答を誘発し、これはＤＮＡへの標識前駆体の取り込みにより測定できる。スティミュレーター細胞を照射(またはマイトマイシンＣ処理)したため、それらはＢａｌｂ／ｃ細胞に対して増殖応答はしないが、その抗原性は維持する。ＭＬＲにおいて試験化合物で見られたＩＣ_５０を、平行実験でシクロスポリンにおいて見られたものと比較する。

上記ＭＬＲにおいて非免疫抑制性と判断された化合物が、しばしば、ＩＬ−２レポーター遺伝子アッセイにおいて不活性であることが判明しており、故にＩＬ−２レポーター遺伝子アッセイを、本発明に使用するための非免疫抑制性、シクロフィリン結合性サイクロスポリン化合物の選択の、例えば一次スクリーニングとして使用できる。

Ａβ分泌と関連する病状を処置するための薬剤として、例えばＡＤにおけるアミロイドプラークの細胞外蓄積の阻害剤として活性な非免疫抑制性、シクロフィリン結合性サイクロスポリン化合物を、以後活性化合物と呼ぶ。

本活性化合物は、故にＡβペプチド分泌、内因性ＰＳ１Ｎ−末端フラグメント(ＮＴＦ)発現または増加したガンマ−セクレターゼ活性が関与する何らかの臨床状態の処置に有用である。さらに、本活性化合物は、Ａβ分泌を増加させるアポトーシスが関与する状態の処置に有用である。Ａβペプチド形成およびその後の凝集はＡＤの特徴であるだけでなく、パーキンソン、ハンチングトン、および他の全身性アミロイド症のような他の神経学的疾患の必須要素でもある(Selkoe 1989; Price, Borchelt et al. 1993; Citron, Vigo-Pelfrey et al. 1994)。これらの結果から、アポトーシスおよびＡβ産生が完全に連結していることが明らかである。

本活性化合物はまた脳では発現しない“末梢Ａβモディファイアー”を調節するための利用性を有する。末梢アミロイド症は、心臓および皮膚科学的アミロイド症のような表現型をもたらし得る(Yamaguchi, Yamazaki et al. 1992), (Selkoe 1989)。末梢Ａβのキー・レギュレーターが発見されたならば、新規治療剤をこのような標的に送達させることも可能であり、血液脳関門を通過する必要を無くす。末梢Ａβレベルの低下が、トランスジェニックマウス脳においてＡβレベルを減少させ、プラーク形成が少なくなることが示されている(Bohrmann, Tjernberg et al. 1999; DeMattos, Bales et al. 2002)。

本活性化合物の多くが、シクロスポリンと特に４位および／または５位で異なる構造を有することが判明した。本活性化合物の構造がシクロスポリンと異なり得る他の位置は、６位および７位である。

活性化合物の一つのグループは、４位のＭｅＬｅｕ基が異なるＮ−メチル化アミノ酸、例えばγ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＩｌｅ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＡｌａ、ＭｅＴｙｒまたはＭｅＴｙｒ(Ｏ−ＰＯ(ＯＨ)_２)、またはＰｒｏで置換されているサイクロスポリンである。ＭｅＩｌｅおよびＭｅＴｈｒに加えて、異形態(allo-form)ＭｅａＩｌｅおよびＭｅａＴｈｒも使用できる。異形態において、β位の立体化学は、天然アミノ酸のものと逆の立体配置を有し、その結果、通常の形態と異形態がジアステレオ異性体の対を構成する。

活性化合物のさらなるグループは、５位のＶａｌが、Ｎ−アルキル−アミノ酸、好ましくはＮ−メチル−アミノ酸で置換されているものである。好ましくは、Ｎ−アルキル化されているアミノ酸がＶａｌまたはＬｅｕである。好ましくは、[Ｖａｌ]^５のイミノ基の水素が非分枝Ｃ_ｌ−６アルキル基、好ましくはメチル、エチルまたはｎ−プロピル、特にメチルで置換されている。活性化合物の後者の好ましい群は、全て新規である。

さらにまたはあるいは、ある種の活性化合物は、シクロスポリンと、１位、２位、３位、および／または６位で異なり得る。

本発明において使用するための特定のクラスの活性化合物は、式Ａ

〔式中、Ｂは式Ｂ

[式中、ａは２位のαＡｂｕ残基への結合を意味し；
ｂは、４位の残基Ｃへの結合を意味し；
Ａｌｋは２〜６個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖アルキレンまたは３〜６個の炭素原子を含むシクロアルキレンを意味し、そして
Ｒは
カルボキシまたはアルキルオキシカルボニルラジカル；
ラジカル−ＮＲ_１Ｒ_２(ここで、Ｒ_１およびＲ_２は同一または異なって、水素、アルキル、Ｃ_２−４アルケニル、Ｃ_３−６シクロアルキル、フェニル(所望によりハロゲン、アルコキシ、アルコキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノまたはジアルキルアミノで置換されていてよい)またはベンジル、または５または６環原子および１〜３個のヘテロ原子を含む飽和もしくは不飽和ヘテロシクリルラジカルであるか、またはＲ_１およびＲ_２は、それらが結合している窒素原子と一体となって、４〜６環原子を含み、そして窒素、酸素または硫黄から選択されるヘテロ原子をさらに含んでいてよく、かつアルキル、フェニルまたはベンジルで置換されていてよい飽和または不飽和ヘテロ環を形成する)；
式

(式中、Ｒ_１およびＲ_２は上記で定義の通りであり、Ｒ_３は水素またはアルキルラジカルであり、そしてｎは２〜４の整数であり、
そして、アルキルは１〜４個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖アルキルである。)
のラジカルである。]
のアミノ酸残基であり；
ＣはＭｅＬｅｕまたは４−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕである。〕
のシクロスポリン誘導体およびその薬学的に許容される塩である。

このクラスのシクロスポリン誘導体は、さらに公開国際特許ＷＯ９８／２８３２８、ＷＯ９８／２８３２９およびＷＯ９８／２８３３０に記載されている。このクラスの特に好ましい化合物は、Ｂがアミノ酸残基Ｂ'

であり、そしてＣがアミノ酸残基４−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕである、式Ａの化合物である。

活性化合物の特に好ましいグループは、式Ｉ：

〔式中、
ＷはＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔまたは８'−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔであり；
ＸはαＡｂｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＮｖａまたはＯ−メチルスレオニン(ＭｅＯＴｈｒ)であり；
ＲはＳａｒまたは(Ｄ)−ＭｅＡｌａであり；
ＹはＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＩｌｅ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＡｌａ、ＭｅＴｙｒ、ＭｅＴｙｒ(Ｏ−ＰＯ(ＯＨ)_２)、ＭｅａＩｌｅまたはＭｅａＴｈｒ、またはＰｒｏであり；
ＺはＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｎ−Ａｌｋ−ＶａｌまたはＮ−Ａｌｋ−Ｌｅｕであり、
ここで、Ａｌｋは、Ｍｅまたビニル(これは所望によりフェニル、または６環員を含むＮ、ＳもしくはＯヘテロアリールで置換されていてよい)もしくはフェニル(これは所望によりハロゲンで置換されていてよい)で置換されたＭｅを意味し、そして
ＱはＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕまたはＭｅＡｌａである。〕
の化合物およびその薬学的に許容される塩から成る。

基Ｗ、Ｘ、Ｙ、ＺおよびＱは、独立して下記の好ましい意味を有する：
Ｗが、好ましくはＷ'であり、ここでＷ'はＭｅＢｍｔまたはジヒドロ−ＭｅＢｍｔであり；
Ｘが好ましくはＸ'であり、ここでＸ'はαＡｂｕまたはＮｖａ、より好ましくはＸ”であり、ここでＸ”はαＡｂｕであり；
Ｙが好ましくはＹ'であり、ここでＹ'はγ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＡｌａまたはＭｅＴｙｒ(Ｏ−ＰＯ(ＯＨ)_２)であり；
Ｚが好ましくはＺ'であり、ここでＺ'はＶａｌまたはＭｅＶａｌであり；そして
Ｑが好ましくはＱ'であり、ここでＱ'はＭｅＬｅｕである。

活性化合物の一つのとりわけ好ましいグループは、ＷがＷ'であり、ＸがＸ'であり、ＹがＹ'であり、ＺがＺ'であり、そしてＱがＱ'である式Ｉの化合物である。

特に好ましい式Ｉの活性化合物は：
ａ)[ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ]^１−[γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ]^４−シクロスポリン、
ｂ)[ＭｅＶａｌ]^４−シクロスポリン、
ｃ)[ＭｅＩｌｅ]^４−シクロスポリン、
ｄ)[ＭｅＴｈｒ]^４−シクロスポリン、
ｅ)[γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ]^４−シクロスポリン、
ｆ)[Ｎｖａ]^２−[γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ]^４−シクロスポリン、
ｇ)[γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ]^４−[γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ]^６−シクロスポリン、
ｈ)[ＭｅＶａｌ]^５−シクロスポリン、
ｉ)[ＭｅＯＴｈｒ]^２−[(Ｄ)ＭｅＡｌａ]^３−[ＭｅＶａｌ]^５−シクロスポリン、
ｊ)[８'−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔ]^１−シクロスポリン、
ｋ)[ＭｅＡｌａ]^６−シクロスポリン、
ｌ)[ＤＭｅＡｌａ]^３−[ＭｅＴｙｒ(ＯＰＯ(ＯＨ)_２)]^４−シクロスポリン、
ｍ)[Ｎ−ベンジル−Ｖａｌ]^５−シクロスポリン、
ｎ)[Ｎ−５−フルオロ−ベンジル−Ｖａｌ]^５−シクロスポリン、
ｏ)[Ｎ−アリル−Ｖａｌ]^５−シクロスポリン、
ｐ)[Ｎ−３−フェニル−アリル−Ｖａｌ]^５−シクロスポリン、
ｑ)[Ｐｒｏ]^４−シクロスポリン
である。

とりわけ好ましい活性化合物は、[ＭｅＩｌｅ]^４−シクロスポリンおよび[γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ]^４−シクロスポリン、最もとりわけ[ＭｅＩｌｅ]^４−シクロスポリンである。

式Ｉの化合物に加えて、好ましい活性化合物は、例えば
ｒ)[γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ]^９−シクロスポリンを含む。

本活性化合物は：
１)発酵
２)生体内変化
３)誘導体化
４)部分合成
５)全合成
を含む方法により得ることができる。

これらの方法は、一般的にそしてより具体的に、ＥＰ０４８４２８１Ｂおよび米国特許５７６７０６９の実施例１から１０に記載されている。この一般的な記載およびこれらの実施例の教示は、本明細書に引用により包含する。ＥＰ０４８４２８１Ｂの実施例１１は、シクロスポリンに対する各々の活性化合物の免疫抑制性およびシクロフィリン結合性活性の測定を記載し、そしてこの実施例の教示もまた本明細書の開示の範囲内に含まれる。

故に、本発明はアルツハイマー病、パーキンソン病、タウオパチー、プリオン病、前頭側頭骨性認知症、線条体黒質変性症、レヴィー小体認知症、ハンチントン病、ピック病、アミロイド症、および過剰なＡβ産生と関連する他の神経変性障害のようなＡβ分泌が関連する病状の処置または予防用医薬の製造における、非免疫抑制性、シクロフィリン結合性サイクロスポリンの使用を提供する。

本発明は、さらに、アルツハイマー病、パーキンソン病、タウオパチー、プリオン病、前頭側頭骨性認知症、線条体黒質変性症、レヴィー小体認知症、ハンチントン病、ピック病、アミロイド症、および他の神経変性障害のようなＡβ分泌と関連する病状の処置法であって、該患者に有効量の本発明の活性化合物を投与することを含む、方法を提供する。

本活性化合物は、任意の慣用の経路で、特に経腸的に、例えば経口で、例えば飲用液、錠剤もしくはカプセルの形で、または非経腸的、例えば注射可能溶液または懸濁液の形で投与できる。指示される一日量は、静脈内経路では１〜２０mg／kg、好ましくは３〜１０mg／kgであり、経口経路では１〜５０mg／kg、好ましくは１０〜３０mg／kgであり得る。

本活性化合物の毒性は、シクロスポリンよりも少ないと考えられる。本活性化合物が免疫抑制性ではないため、免疫抑制に関連するシクロスポリンのある種の副作用が避けられる。他のシクロスポリンに関連する副作用、特に長期使用における腎毒性および中枢神経系毒性は、簡便にはシクロスポリンのものより少ない。

本活性化合物のための好ましいガレヌス製剤は、局所ならびに経口形態を含む英国特許出願２２２２７７０Ａに記載の通りのマイクロエマルジョンに基づくもの；また英国特許出願２２０９６７１Ａに記載の通りの、脂肪酸サッカライドモノエステル、例えばサッカロースモノラウレートを含む固溶体を含む。経口投与用の適当な単位投与形態は、例えば投与量あたり２５〜２００mg活性化合物を含む。

ＥＰ０４８４２８１Ｂの製剤実施例Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、本明細書に引用により包含する：
これらの製剤のここの成分、ならびにそれらの製造法は、英国特許出願２２２２７７０に完全に記載されており、その内容を引用により本明細書に包含する。

神経保護剤としての本活性化合物の有用性は、インビボまたはインビトロ試験において証明でき、例えば：
本発明の活性化合物を単独で、または他の薬剤との組合せ剤で、または連続的な組合せで提供できる。例えば、本発明の活性化合物を、卒中または脊髄傷害後に、さらなる神経障害をブロックし、そして軸索再生を阻害するために、コルチコステロイドのような、しかしこれに限定されない抗炎症剤と、ＮＧＦ、ＢＤＮＦのような神経栄養因子またはExelon^TMまたはレボドパのような神経変性疾患用の他の薬剤と組み合わせて投与できる。本明細書で使用する２剤は、２剤を同時に投与するとき、または薬剤が同時に作用する形態で独立して投与するとき、組み合わせて投与すると言う。

コード番号、一般名または商品名により同定した活性成分の構造は、標準概論“The Merck Index”の現行版またはデータベース、例えばPatents International(例えばIMS World Publications)から取り得る。それらの対応する内容は、本明細書に引用により包含する。当業者は、活性成分の同定が十分に可能であり、同様に、製造でき、医薬適応症および特性を、標準試験モデルにおいて、インビトロおよびインビボ両方で試験できる。

上記の適応症において、適切な投与量は、もちろん、例えば、用いる本発明の特定の分子、投与形態および処置する状態の性質および重症度に依存して変化する。

下記方法は、下に記載の実施例を実行するために行う：
トランスフェクション。ＣＨＯＫ１細胞(ATCC, Manassas, VA)をＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、５％ペニシリン／ストレプトマイシン(Penn/Strep)、および２２mgのＬ−プロリン(Sigma Chemical, St. Louis, MO)と平板培養する。プレートを、一晩、３７℃で、水ジャケット付きＣＯ_２細胞培養チャンバー中でインキュベートする。目的のｃＤＮＡを、完全長ＡＰＰと１：１５比(ｃＤＮＡ：ＡＰＰｗｔ(６９５))で、Qiagen(登録商標) SuperFect試薬を、製造業者の指示の通りに使用して共トランスフェクトする。６ウェル皿中、５×１０^５細胞をＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、５％ペニシリン／ストレプトマイシン(Sigma Chemical, St. Louis, MO)と共に平板培養し、２４時間増殖させる。SuperFect混合物を、１００μlの無血清培地(ＤＭＥＭ)、３μgの全ＤＮＡ、および２０μlのSuperFectで製造する。培地を細胞から除き、１mLの新鮮培地を添加する。全SuperFect混合物を培地に添加し、３７℃で２時間インキュベートする。本混合物を次いで除去し、細胞を１回３mLのＰＢＳで洗浄する。新鮮培地を細胞に再び添加(added back)し、それらを２４または４８時間インキュベートする。

免疫細胞化学 − ＣＨＯ細胞を、OPTIMEM(無血清培地)中、リポフェクタミンを製造業者(Life Technologies)により記載の通り使用して、適当な構築物でトランスフェクトする。ＣＨＯ細胞を免疫染色し、免疫活性をDev et al 1999, Neuropharmacol., (1999) 38, 635-644に記載の通り観察する。Flag−タンパク質発現を、抗Flag M2モノクローナルマウス抗体(Sigma)を使用して検出し、二次抗体はTexas Red-Xヤギ抗ウサギＩｇＧ(Molecular Probes)である。

カスパーゼ−３のフローサイトメトリー分析。ＨＥＫ細胞を、ＣｙＤまたはＣＰＺで、ＡＰＰｗｔと共に２４時間一過性にトランスフェクトする。BD Biosciences(#550914)からのカスパーゼ−３アポトーシスキットを使用して細胞を固定し、透過化し、そして染色する。ＦＩＴＣ染色した細胞を＞１０^１のゲートを通らせ、活性カスパーゼ−３について陽性な細胞として測定する。前方および側面光散乱もまた細胞集団の健康状態の確認のために試験する。

化合物処置。ＡＰＰｓｗｅ変異体を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、２４時間、サイクロスポリンＡ、サングリフェリンＡ、ＦＫ５０６(引用によりその全体を包含するSedrani, et al., J. Am. Chem. Soc. 125, pp 3849-3859(2003)に記載の通り)およびＮ−メチル−４−バリン−サイクロスポリン濃縮物で処理する。細胞生存能を、PromegaのCellTiter-Glo Kit(#G7573)を使用して測定する。Ａβ４０および４２レベルを、細胞上清中、社内２サンドイッチＥＬＩＳＡ(社内ＥＬＩＳＡは、Novartisで開発の抗体をBiosource抗体の代わりに使用する以外、記載のものと同じ形態)を使用して測定する。５ｘＧａｌ４応答エレメント−ルシフェラーゼレポーターおよびＣ９９−Ｇａｌ４−ＶＰ１６またはNotch−Ｇａｌ４−ＶＰ１６構築物を安定に発現する細胞系を使用して、Ｃ９９またはNotch開裂を測定する(Maltese, Wilson et al. 2001に記載の通り)。γ−セクレターゼで開裂されたとき、Ｇａｌ４−ＶＰ１６は遊離し、そしてレポーターに結合し、ルシフェラーゼ活性を増加させる。安定な細胞を本化合物で処理し、ＩＣ_５０値を決定する。

ＡβＥＬＩＳＡ。ＡβペプチドのＮＨ_２末端に対する市販のマウスモノクローナル抗体を、予めコートした９６ウェルプレート(Ａβ４０についてはBiosource Cat#KBH3481/PPO81およびＡβ４２についてはCat#KBH3441/PPO81)における捕獲抗体として使用する。ポリクローナル検出抗体をBiosource(抗ｈＡβ４０ Cat#44-348および抗ｈＡβ４２ Cat#44-344)から得、１５mM ナトリウムアジド中１／２２０に希釈する。二次抗体(Ａβ４０についてはBiosource Cat#KBH3481およびＡβ４２についてはCat#KBH3441)は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧである。二次抗体を３.３mM チモール中１／１００に希釈する。抗体コートしたプレートを、使用前に４回ＰＢＳ−ＴＥ(１mM ＥＤＴＡおよび０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０、洗浄緩衝液)で、マイクロプレート洗浄機(Bioteck Instruments, Inc, Winooski, VT)で洗浄する。１００μlのトランスフェクトした細胞の馴化培地を取り、１mM ＡＥＢＳＦ含有サンプル希釈剤(Biosource, Camarillo, CA)中、１：２に希釈する。１００μlのこの混合物を、洗浄した、抗体コートした９６ウェルプレートに添加し、テープでカバーし、４℃で一晩インキュベートする。サンプルを除去し、プレートを４回洗浄緩衝液で洗浄する。検出抗体溶液を１００μl／ウェルで添加し、室温で２時間、振盪させながらインキュベートする。プレートを再び４回洗浄緩衝液で洗浄し、二次抗体溶液を１００μl／ウェルで添加し、２時間、振盪させながらインキュベートする。プレートを５回洗浄緩衝液で洗浄し、ペーパータオル上に、軽くたたきつけて乾燥させる。１００μlの安定化した色素原(テトラメチルベンジジン)を各ウェルに添加し、プレートを３０分暗所でインキュベートする。１００μlの停止溶液(１ＮＨ_２Ｓ)をプレートに添加し、反応を停止させる。プレートをマイクロプレートリーダーで、４５０nM(Molecular Devices)で１時間読み取る。

抗体およびウェスタンブロット分析。ＡＰＰ野生型およびＡＰＰＳｗｅｄｉｓｈ変異体のｃＤＮＡをｐＣｌプラスミド発現ベクターのサイトメガロウイルスプロモーターの下流に、先に記載の通り挿入する(Promega, Madison, WI)(Bodendorf, U., Fischer, F., Bodian, D., Multhaup, G., Paganetti, P. 2001 J. Biol. Chem. 276:12019 12023)。

ＰＳ１ＮＴＦ抗体はＰＳ１のＮ−末端を認識する(Thinakaran, Borchelt et al. 1996)。培養したＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクション２４時間後に、プロテアーゼ阻害剤(Complete(登録商標) Roche Molecular Biochemicals)含有ＲＩＰＡ緩衝液(１０mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ７.５、１５０mM 塩化ナトリウム、１mM ＥＤＴＡ、１％Nonidet P-40、０.５％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＳＤＳ)に抽出し、４℃で１０分、１０,０００×ｇで遠心分離する。上清を回収し、ペレットを廃棄する。続いて、細胞抽出物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、PVDF Immobilon-P(登録商標)膜(Millipore)に移し、指示される通り一次抗体でプローブする。免疫学的検出を、先に記載(Manni, M., et al., 1998. FEBS. 427:367-370)の通り、ＥＣＬ検出システム(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)で行う。

免疫細胞化学 − ＣＨＯ細胞を、OPTIMEM(無血清培地)中、リポフェクタミンを製造業者(Life Technologies)により記載の通り使用して、適当な構築物でトランスフェクトする。ＣＨＯ細胞を免疫染色し、免疫活性を先に(Dev et al 1999, Neuropharmacol., (1999) 38, 635-644)記載の通り観察する。Flag−タンパク質発現を、抗Flag M2モノクローナルマウス抗体(Sigma)を使用して検出し、二次抗体はTexas Red-Xヤギ抗ウサギＩｇＧ(Molecular Probes)である。

ＣＰＺ構築物− 野生型ヒトカルボキシペプチダーゼ(ｈＣＰＺ)を、Life Technologies, Inc(LTI, Catalog Number: 11315-017, Lot Number: 81027-242)から購入した、純粋ヒトＤＲＧ(L0001)の標準化ｃＤＮＡライブラリーから得る。ｃＤＮＡ挿入断片を５'から３'方向で、Gateway適合性ベクター、ｐＣＭＶ・ＳＰＯＲＴ６中のＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩ部位にクローン化する。アミノ酸４２−１６１に対応するfrizzled(ＦＺ)ドメイン、アミノ酸１７９−５６８の触媒(Ｃａｔ)ドメインの欠失、点変異(アミノ酸Ｅ２５１Ａ)、およびアミノ酸２９後のＮ−末端FLAG標識(ＤＹＫＤＤＤＤＫ配列番号１)を、下記プライマーを使用した部位特異的変異誘発により行う：
frizzledドメイン除去のために
５' ＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣＴＣＣＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＧＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＴＧＴＧＧ−３'(配列番号２)および
５' ＣＣＡＣＡＧＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＣＧＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧ−３'(配列番号３)、
触媒ドメイン除去のために
５' ＣＣＡＣＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＴＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＣＣＴＣＧＴＣＡＧＣ−３'(配列番号４)および
５' ＧＣＴＧＡＣＧＡＧＧＣＡＣＴＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧＴＧＧ３'(配列番号５)
点変異Ｅ２５１Ａのために
５' ＧＣＡＴＣＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＧＴＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴＧＴＴＧＣ−３'(配列番号６)および
５' ＧＣＡＡＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡＣＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＣＣＧＧＧＡＧＡＴＧＣ−３'(配列番号７)、
ならびにFLAG標識挿入のために
５'ＧＧＴＧＧＣＣＴＧＴＧＧＣＡＴＴＣＡＣＣＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＴＣＡＡＡＣＴＣＧ−３'(配列番号８)および５'ＣＧＡＧＴＴＴＧＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＧＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＴＧＡＡＴＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＡＣＣ−３'(配列番号９)。形質転換大腸菌からの全ＤＮＡの単離を、Qiagenプラスミドキットを使用して行う。全オープンリーディングフレームの配列を、ABI Prism 3700 DNA Analyzerシステムを使用したＤＮＡ配列決定により行う。

インサイチュ・ハイブリダイゼーション− ５'でＳＰ６−およびＴ７−プロモーター認識配列が側面にある自己プライミングオリゴヌクレオチドプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を使用して、リボプローブ鋳型を、クローニング工程を何ら行うことなく任意の既知遺伝子配列から産生することが可能である。ＰＣＲ反応を、９５℃で４５秒の変性工程、５８℃で３０秒のアニーリング相および７０℃で１分の抽出相の、４０サイクルで行う。４％アガロースゲル上に分離後、ＰＣＲ産物を製造業者(Qiagen, Switzerland)の指示に従い、QiAQuick精製キットで浄化する。浄化したＰＣＲ産物を、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ(アンチセンス)およびＳＰ６−ＲＮＡポリメラーゼ(センス)を使用して、３７℃で２時間、ジゴキシゲニン−ＵＴＰ含有ｄＮＴＰを使用して転写する。取り込まれていないヌクレオチドを除き、プローブをエタノール沈殿させ、５０μl 水に溶解し、その後−２０℃で貯蔵する。ＤＩＧプローブおよび標識したコントロールＲＮＡ(既知濃度)の連続希釈を、ナイロン膜にスポットする。アルカリホスファターゼ接合抗ＤＩＧ抗体とのインキュベーションは、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ(７０％ジメチルホルムアミドおよび３０％水中の７５mg／ml ニトロブルーテトラゾリウムおよび１００％ジメチルホルムアミド中の５０mg／ml ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェート)を、アルカリホスファターゼの基質として使用する発色相に続く。ＣＰＺプローブ濃度は、標識したコントロールＲＮＡのスポット強度との比較により概算する。ＩＳＨを、完全自動化装置Discovery^TM(Ventana Medical Systems, Strasbourg)をインサイチュ・ハイブリダイゼーションおよび免疫化学のために使用して行う。パラフィン包埋組織切片を使用したこの遺伝子を局在化させるために行うプロトコールは、ＲＮＡアナリティクス・ラボラトリー内で開発され、下記であり、組織切片の脱パラフィン化および再水和は、無溶媒条件で、EZprep溶液(Ventana Medical Systems SA, Strasbourg)を使用して８分、７５℃で、続いてさらに８分、４２℃で行う。全前処理工程は、RiboMap^TMキット(Ventana Medical Systems SA, Strasbourg)で、製造業者の指示に従い、酵素消化を使用した透過化１工程を追加して行った：最良の結果を、１２μg／mlのプロテイナーゼＫで３７℃で１６分で得る。ＣＰＺプローブハイブリダイゼーションを、４５℃で６時間で、RiboHybe溶液(Ventana Medical Systems SA, Strasbourg)に希釈した適合させた量のＤＩＧリボプローブ(ＣＰＺプローブ＝５ng／スライド)と共に行う。ハイブリダイゼーション後洗浄を、５０℃で８分、高ストリンジェンシー条件(０.１×ＳＳＣ)で３回行う。ＤＩＧ標識検出のために、抗体希釈剤中１／２０００希釈後、ビオチン接合マウス抗ジゴキシン抗体(Jackson Immunoresearch Inc.)を３０分、３７℃で適用し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ色素生産性検出を、BlueMap^TMキット(Ventana Medical Systems SA, Strasbourg)を使用して、製造業者の指示に従い行う。最適シグナル／ノイズ比のための基質インキュベーション時間は４時間である。ＩＳＨヌクリアー・ファスト・レッドを１０分行う。切片をCrystalマウント中にマウントし、Permountを使用してポスト−マウントする(post-mounted)。

実施例１
プレセニリンプロセッシング：ｃＤＮＡの過剰発現がＡβレベルとＣ９９基質を増加させたとの観察は、ＡＰＰのＧＡＣＥ介在開裂の増加を示唆する。ＣＰＺおよびＣｙＤが有意にＣ９９のプロセッシングを増加させ、Ａβ４２分泌を増加させたため、それらをさらなる試験のために選択する。ＰＳ１Ｎ−末端フラグメント(ＮＴＦ)レベルを、ＣＰＺまたはＣｙＤでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞で試験する。ＰＳ１で安定にトランスフェクトした細胞において、完全長ＰＳ１およびＮＴＦの両方が容易に検出可能である。対照的に、トランスフェクトしていないＨＥＫ細胞において、内因性完全長ＰＳ１およびＮＴＦレベルは低い。ＣＰＺまたはＣｙＤを過剰発現する細胞において、ＰＳ１ＮＴＦレベルの明らかな上昇があり、これらのフラグメントが４８時間のトランスフェクション期間中に高い割合で産生されるか、または内因性ＮＴＦが安定されることを示唆する。

ＣＰＺの分析：ＣＰＺは、生物活性神経ペプチドを処理することが既知の、ＣＰＥサブファミリーの中の、カルボキシペプチダーゼ(ＣＰ)遺伝子ファミリーのメンバーである(Song and Fricker 1997)。ＣＰＥ関連酵素は、プロセッシング中間体のＣ−末端からの塩基性残基の選択的除去により、一般的に選択的プロセッシング反応に関与する。ＣＰＺの触媒活性、発現、または細胞内局在化がＡβ分泌誘発に必要であるか否かを決定するために、ＣＰＺの３種の変異体構築物を産生する。第一の構築物において、触媒ドメインを完全に除去し(Δｃａｔ)、シグナルペプチド、frizzledドメイン、およびＣ−末端を残す。第二の構築物において、frizzledドメイン(Δｆｚ)を除去し、そして第三の構築物において、ＣＰＺの触媒活性を損なうであろう単一点変異(Ｇｌｕ２５１Ａｌａ)を触媒ドメインに挿入する。各ＣＰＺ変異体をＨＥＫ２９３細胞に、ＡＰＰｗｔまたはＣ９９基質のいずれかと共トランスフェクトする。３種の変異体構築物のいずれも、野生型ＣＰＺまたはFlag標識ＣＰＺと比較して活性がない。結果はＡＰＰｗｔおよびＣ９９基質の両方で同様である。

ＣＰＺ変異体の活性欠如の考えられる説明は、細胞内のタンパク質の発現の欠失または誤局在化である。この疑問を解決するために、ＣＰＺ変異体を、Flag標識し、ＣＨＯ細胞内で過剰発現させる。透過化細胞において、ＣＰＺ野生型は明らかな血漿膜または遅発分泌小胞(late secretory vesicle)局在化を示す。この結果は、ＣＰＺの細胞内分布を調べた以前の試験と一致する(Novikova, Reznik et al. 2000)。細胞内分布はＣＰＺ変異体構築物；Δｃａｔ、Δｆｚ、およびＧｌｕ２５１Ａｌａで変化しないままである。これらの発見は、ＣＰＺの、その細胞内局在化または発現のレベルではなく、触媒活性が、ＣＨＯ細胞におけるＡβレベルの誘導に必要であることを示唆する。

ＣＰＺ触媒活性の崩壊は、発現または細胞内分布に影響することなくＡβ産生を無くす。ＣＰＺの過剰発現は、少ないβ−カテニン活性化に帰着する、内因性frizzled受容体へのＷｎｔ結合と競合し得る(Tesco, Kim et al. 1998)。β−カテニン活性の低下は、増加したＡβ産生と関連しており、ＰＳ１がＧＳＫ３βとのβ−カテニンの会合を増加させる能力により介在されると考えられている(Kang, Soriano et al. 1999)。ＣＰＺがカスパーゼ−３のＰＳ１開裂の活性化によりＡβ産生を誘導でき、より少ないＰＳ１／β−カテニン複合体に至ることは可能である(Tesco, Kim et al. 1998)。ＰＳ１がβ−カテニンにより結合されないならば、それはＧＡＣＥ複合体とより容易に会合できる。frizzledドメインがタンパク質相互作用ドメインとして特徴付けられるため、ＣＰＺ内のfrizzledドメインが、γ−セクレターゼ複合体の成分、すなわち−ＰＳ１、またはＡＰＰ自体と相互作用することは可能である。これらの相互作用は現在調査中である。

興味深いことに、ＣＰＺのＣ−末端は、推定フューリン開裂部位を含み、ＣＰＺを血漿膜から細胞外環境に遊離させると考えられている(Novikova, Reznik et al. 2000)。フューリンはまた細胞表面のNotchでの、NotchリガンドDeltaの遊離に関与する(Ikeuchi and Sisodia 2003)。ＣＰＺ中のフューリン部位がフューリン基質として確認されていないが、ＣＰＺが細胞から分泌できることは証明されている(Novikova, Reznik et al. 2000)。これは、ＣＰＺがNotchと同じプロセッシング経路にあるが、どのようにＣＰＺのフューリン開裂がＡβ産生に関連しているかは、現在不明である(Kim, Wang et al. 1999)。しかしながら、ＣＰＺが、ＣｙＤ過剰発現と同様、細胞をアポトーシスに誘導できるとの観察は、Ａβ産生に影響するこの２種のタンパク質の共通機構を示唆する。

以前の発見(Novikova and Fricker 1999)は、ＣＰＺがラット脳軟髄膜細胞で発現されることを示唆するが、ＣＰＺがアルツハイマー病により影響を受けることが既知の脳の領域においては発現されないことが示されている(Novikova and Fricker 1999)。ＣＰＺがどこで発現されるかを決定するために、マウス脳切片をインサイチュ・ハイブリダイゼーションにより分析する。野生型Ｃ７ＢＬ−６マウス(Jackson Laboratories)において、ＣＰＺアンチセンスプローブは、脳内の広範な分布として結合を示し、小脳および前頭葉が最高レベルのシグナルを有する。より詳細な実験により、ＣＰＺはまたＣＡ１およびＣＡ３領域に近い海馬において、最も可能性があるのは錐体細胞において発現されることが判明して。小脳において、ＣＰＺはプルキンエ(Perkinje)および顆粒細胞層における分子領域に近接して発現される。前頭葉におけるＣＰＺ分布は特異的細胞型に局在しているようには見えなかったが、その代わり、全領域にわたり均一に発現された。マウス海馬、小脳、および前頭葉におけるＣＰＺ局在化は、ヒトにおけるアルツハイマー病により影響を受けることが既知の脳の領域におけるその発現を証明する。

ＣｙＤの特徴付け：これらのイムノフィリン結合性化合物がＡＰＰプロセッシングを調節できるか否かを試験するために、ＨＥＫ／ＡＰＰｓｗｅ安定細胞を一定濃度範囲のサイクロスポリンＡ、サングリフェリンＡ、ＦＫ５０６またはＮ−メチル−４−バリン−サイクロスポリン濃縮物で処置する。各濃度に関して、生存能を、製造業者(Promega Cat# G5421)の指示に従いＭＴＳアッセイで測定し、分泌されたＡβ４０およびＡβ４２を、ここに記載のＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定する。化合物全ての生存能ＩＣ_５０は＞４０μMである。サイクロスポリンＡ、サングリフェリンＡのＡβ４０およびＡβ４２についての阻害ＩＣ_５０は＜３μMであり、Ａβ分泌の強い阻害を示す。Ｎ−メチル−４−バリン−サイクロスポリンのＡβ４０およびＡβ４２分泌に関するＩＣ_５０は＜１０μMであり、一方ＦＫ５０６はＡβ４０分泌に作用を有しない。対照的に、ＦＫ５０６処置は、３−２０μMでＡβ４２の濃度依存的増加をもたらす。

サイクロスポリンＡのような免疫抑制剤が、数種の動物モデルにおいて神経変性およびアポトーシスを阻害でき、単離マウスミトコンドリアにおいてＡβ誘発ミトコンドリア障害を阻害できることが証明されている(Kim 2002)。ＣｙＤがサイクロスポリンＡの標的であり、ミトコンドリアに局在化しているため、それはこの部位でＡβプロセッシングに重要な役割を有し得、ＣｙＤがヒトにおけるＡＤ発症に重要である可能性を示唆する。他のアイソフォームを試験していないが、ＣｙＤは、おそらく、それがミトコンドリアに局在化することが知られている唯一のシクロフィリンアイソフォームであるため、Ａβプロセッシングに対する独特な効果を有するはずである。ＨＥＫ細胞におけるＣｙＤ過剰発現がカスパーゼ−３活性を増加でき、ＰＳ１ＮＴＦを安定化できることが判明しており、それが直接ＰＳ１活性を修飾し得ることを示唆する。さらに、ＣｙＤ活性と結合し、阻害できる化合物は、Ａβ分泌およびＣ９９開裂の両方を強く阻害する。

特に、サングリフェリンＡはＡβを３μMで強く阻害し、２０μMまで細胞に対して無毒である。サングリフェリンＡは、ＣｙＤがアデニンヌクレオチド輸送体(ＡＮＴ)に結合する能力に影響することなく、そしてＣｓＡのようなカルシニューリン活性を阻害せずに、ＣｙＤのＰＰＩａｓｅ活性と結合し、阻害することが既知である(Samantha J. Clarke 2002)。サングリフェリンＡの急勾配の用量応答は、いくつかの方法で説明できるであろう。サングリフェリンＡは、ＣｙＤのかなりの部分が結合したときにのみ開孔を阻害し得、その活性がＭＰＴで中断されるのに十分である(Clarke 2002)。ＡＮＴが二量体として存在するため、ＣｙＤが、立体配置変化を誘導するために、ＡＮＴに１分子より多く結合すべきであることはありそうである。サングリフェリンＡが、ＭＰＴ複合体上でのその活性を阻害するために複数ＣｙＤ分子に結合しなければならないため、これは３μM閾値でのＡβ分泌の急激な阻害を説明する。この閾値に到達したら、ＭＰＴ複合体は完全に阻害され、開孔が阻止され得る。ＭＰＴ阻害のこの閾値は、Ａβプロセッシングおよび／または分泌の重要なレギュレーターであると見なされる。あるいは、サングリフェリンＡは、ＣｙＤ以外のまたはそれに加えて複数標的を有するかもしれない。ＣｙＤがＭＰＴ複合体を直接ＰＰＩａｓｅ活性を介して、またはＭＰＴにおける立体配置変化により、どちらで制御するかはまた明らかではない。いずれの場合も、ここにおよび他の者により提示のデータは、ＣｙＤおよびＭＰＴ孔がＡβプロセッシングにおいて重要な役割を有することで一致する。

これらの化合物はＡβ分泌を劇的に低下させ、Ｃ９９開裂を阻害できるが、それらはまたNotch開裂を阻害できる。これは、データがＣｙＤおよびＣＰＺ過剰発現がＧＡＣＥ活性に影響することを示唆していたため、驚きではなかった。このデータは、イムノフィリン化合物がＧＡＣＥ活性を阻害し、細胞内でＡβおよびNotchプロセッシングに影響し得る新規経路を規定する初めての示唆である。

興味深いことに、ＦＫ５０６処置は、用量応答形式で、Ａβ４２分泌を劇的に増加させる。ＦＫ５０６はイムノフィリンタンパク質に結合するが、ＣｙＤには結合しないことが既知である。Ａβ４２の特異的増加は、ＦＫ５０６標的タンパク質がＡβ４２代謝または産生を制御することを示唆する。ＦＫ５０６およびＣｓＡの両方ともカルシニューリンを阻害できるが、Ａβ分泌に対して異なる影響を有し、故にカルシニューリンはおそらくＡβレベルに影響しない。ＦＫ５０６のこの独特な影響は、イムノフィリン経路がＡβプロセッシングを制御することをさらに指示する。

実施例２
Ｃ９９およびNotch開裂
ＨＥＫ２９３安定細胞系を、Maltrese, Wilson, et al. 2001により記載された通り、修飾Ｃ９９またはNotch膜貫通型配列と、シグナルペプチド、ＴＧＮ保持配列、およびＱ５６／Ｙ５７に挿入されたＧＡＬ４−ＮＬＳ−ＶＰ１６配列を使用して産生する。本細胞はまた５ｘＧＡＬ４ＲＥ−ルシフェラーゼレポーター構築物(ＲＤ−２００２−０１４３７およびＲＤ−２００１−０２４１９)を安定に発現する。これらの細胞は、Ｃ９９トランスジーンが開裂され、それがＧａｌ４ルシフェラーゼレポーターを活性化させるとき、ＧＡＣＥ活性の指標である。これらのＨＥＫ安定細胞をサイクロスポリンＡ、サングリフェリンＡ、ＦＫ５０６またはＮ−メチル−４−バリン−サイクロスポリンで処理し、Ｃ９９開裂に関するＩＣ_５０を決定する。ＧＡＬＶＰ単独はおそらくネガティブコントロールであり得る。サイクロスポリンＡ、Ｎ−メチル−４−バリン−サイクロスポリンサングリフェリンＡ、およびＦＫ５０６に対するＧＡＬＶＰのＩＣ_５０は各々６.９、９.９、＞２０、および＞２０μMであり、これらの化合物が＞４０μMまで毒性ではないため、Ｃ９９開裂と細胞生存能の間の明らかな幅を示す。しかしながら、サイクロスポリンＡ、Ｎ−メチル−４−バリン−サイクロスポリンサングリフェリンＡは、全てＣ９９開裂を各々０.７１、０.８７、および０.８５μMで阻害し、Notch開裂を各々１.７、２.７および３.２μMで阻害する。ＦＫ５０６はＣ９９またはNotch開裂に対して効果はない。故にＣｙＤを強く結合できるリガンドは、Ｃ９９およびNotch開裂を強く阻害し、ＧＡＣＥ活性が阻害されることを示唆する。

実施例３
カスパーゼ−３活性化
近年の試験は、カスパーゼ−３活性化がＡβ分泌の増加および本タンパク質のＧＡＣＥ複合体における安定化をもたらし得ることを示唆する(Tesco, Koh et al. 2003)。ＣｙＤおよびＣＰＺの両方がＡβ分泌を増加させ、ＰＳ１ＮＴＦを安定化させるため、カスパーゼ−３活性化レベルをＣｙＤおよびＣＰＺ過剰発現細胞において分析する。ＨＥＫ２９３細胞を、ＣｙＤおよびＣＰＺでＡＰＰｗｔと共に２４時間一過性にトランスフェクトし、サポニン透過化し、固定化し、活性カスパーゼ−３に対するＦＩＴＣ接合モノクローナル抗体でプローブする。ネガティブコントロール細胞は、空ベクターおよびＡＰＰｗｔでトランスフェクトし、ポジティブコントロール細胞は分析前に１μM スタウロスポリンで６時間処理する。ＣｙＤ発現細胞では、５２％の試験した細胞が活性カスパーゼ−３に対して陽性であり、一方ＣＰＺ発現細胞では、４８％の細胞がカスパーゼ−３が陽性である。これらの結果は、これらのタンパク質の過剰発現がカスパーゼ−３の活性化を誘導し、これが、ＰＳ１ＮＴＦが安定化され、そしてＡβ分泌が分泌される機構の可能性があることを示唆する。

Claims

アルツハイマー病、パーキンソン病、タウオパチー、プリオン病、前頭側頭骨性認知症、線条体黒質変性症、レヴィー小体認知症、ハンチントン病、ピック病、アミロイド症、および過剰なＡβ産生と関連する他の神経変性障害のようなＡβ産生および／または分泌と関連する病的状態の処置用医薬の製造における、非免疫抑制性、シクロフィリン結合性サイクロスポリンの使用。
Ａβ産生および／または分泌と関連する病的状態を処置または予防する方法であって、該患者に有効量の非免疫抑制性、シクロフィリン結合性サイクロスポリンを投与することを含む、方法。
非免疫抑制性、シクロフィリン結合性サイクロスポリンが、式Ａ

〔式中、Ｂは式Ｂ

[式中、ａは２位のαＡｂｕ残基への結合を意味し；
ｂは、４位の残基Ｃへの結合を意味し；
Ａｌｋは２〜６個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖アルキレンまたは３〜６個の炭素原子を含むシクロアルキレンを意味し、そして
Ｒは
カルボキシまたはアルキルオキシカルボニルラジカル；
ラジカル−ＮＲ_１Ｒ_２(ここで、Ｒ_１およびＲ_２は同一または異なって、水素、アルキル、Ｃ_２−４アルケニル、Ｃ_３−６シクロアルキル、フェニル(所望によりハロゲン、アルコキシ、アルコキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノまたはジアルキルアミノで置換されていてよい)またはベンジル、または５または６環原子および１〜３個のヘテロ原子を含む飽和もしくは不飽和ヘテロシクリルラジカルであるか、またはＲ_１およびＲ_２は、それらが結合している窒素原子と一体となって、４〜６環原子を含み、そして窒素、酸素または硫黄から選択されるヘテロ原子をさらに含んでいてよく、かつアルキル、フェニルまたはベンジルで置換されていてよい飽和または不飽和ヘテロ環を形成する)；
式

(式中、Ｒ_１およびＲ_２は上記で定義の通りであり、Ｒ_３は水素またはアルキルラジカルであり、そしてｎは２〜４の整数であり、
そして、アルキルは１〜４個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖アルキルである。)
のラジカルである。]
のアミノ酸残基であり；
ＣはＭｅＬｅｕまたは４−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕである。〕
の化合物およびその薬学的に許容される塩である、請求項１記載の使用または請求項２記載の方法。
非免疫抑制性、シクロフィリン結合性サイクロスポリンが、式Ｉ：

〔式中、
ＷはＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔまたは８'−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔであり；
ＸはαＡｂｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＮｖａまたはＯ−メチルスレオニン(ＭｅＯＴｈｒ)であり；
ＲはＳａｒまたは(Ｄ)−ＭｅＡｌａであり；
ＹはＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＩｌｅ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＡｌａ、ＭｅＴｙｒ、ＭｅＴｙｒ(Ｏ−ＰＯ(ＯＨ)_２)、ＭｅａＩｌｅまたはＭｅａＴｈｒ、またはＰｒｏであり；
ＺはＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｎ−Ａｌｋ−ＶａｌまたはＮ−Ａｌｋ−Ｌｅｕであり、
ここで、ＡｌｋはＭｅまたは、ビニル(これは所望によりフェニル、または６環員を含むＮ、ＳもしくはＯヘテロアリールで置換されていてよい)もしくはフェニル(これは所望によりハロゲンで置換されていてよい)で置換されたＭｅを意味し、
ＱはＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕまたはＭｅＡｌａである。〕
の化合物である、請求項１記載の使用または請求項２記載の方法。
非免疫抑制性、シクロフィリン結合性サイクロスポリンが：
ａ)[ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ]^１−[γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ]^４−シクロスポリン；
ｂ)[ＭｅＶａｌ]^４−シクロスポリン；
ｃ)[ＭｅＩｌｅ]^４−シクロスポリン；
ｄ)[ＭｅＴｈｒ]^４−シクロスポリン；
ｅ)[γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ]^４−シクロスポリン；
ｆ)[Ｎｖａ]^２−[γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ]^４−シクロスポリン；
ｇ)[γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ]^４−[γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ]^６−シクロスポリン；
ｈ)[ＭｅＶａｌ]^５−シクロスポリン；
ｉ)[ＭｅＯＴｈｒ]^２−[(Ｄ)ＭｅＡｌａ]^３−[ＭｅＶａｌ]^５−シクロスポリン、または
ｊ)[８'−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔ]^１−シクロスポリン。
ｍ)[Ｎ−ベンジル−Ｖａｌ]^５−シクロスポリン、
ｎ)[Ｎ−５−フルオロ−ベンジル−Ｖａｌ]^５−シクロスポリン、
ｏ)[Ｎ−アリル−Ｖａｌ]^５−シクロスポリン、
ｐ)[Ｎ−３−フェニル−アリル−Ｖａｌ]^５−シクロスポリン、
ｑ)[Ｐｒｏ]^４−シクロスポリン、または
ｒ)[γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ]^９−シクロスポリン
から選択される、請求項１記載の使用または請求項２記載の方法。
非免疫抑制性、シクロフィリン結合性サイクロスポリンが[ＭｅＶａｌ]^４−シクロスポリンである、請求項１記載の使用または請求項２記載の方法。