JP2008505321A - 蛍光体微小環境の探索 - Google Patents

Abstract

【課題】１つ以上の試料の特定の対象領域中の１つ以上のターゲット分析物の存在を検出する技術を実現および使用する方法、装置、およびシステムを提供する。
【解決手段】複数の物質および１つ以上のターゲット分析物を含む１つ以上の試料が提供される。ターゲット分析物のうちの少なくとも一部は蛍光体でラベルが付けられ、１つ以上の試料中の物質の少なくとも一部に結合される。蛍光誘起光で１つ以上の試料が照射され、１つ以上の試料の１つ以上の領域から蛍光光が集められる。１つ以上の試料の少なくとも１回の異方性計測が行われることによって、１つ以上のターゲット分析物が物質に結合される１つ以上の対象領域を特定される。対象領域からの集められた蛍光光を分析することによって、１つ以上の試料中の物質に結合されたターゲット分析物の存在が決定される。
【選択図】図２

Description

本発明は、蛍光および材料中の蛍光から導かれる特性を計測することに関する。

蛍光とは、特定の波長において光を吸収し、その後、蛍光寿命と呼ばれる短い期間の後、より長い波長の光を放出する、ある種の原子および分子の特性を指す。蛍光照射および観測は、今日、医療および生物科学の両方において急速に広がっている技術である。これは、蛍光信号を分析するのにふさわしいさまざまな種類の高度な顕微鏡および他の装置の発展に拍車をかけた。

生物学的応用例において用いられる蛍光プローブは、生物学的巨大分子と結合するよう設計された合成芳香族有機薬品の周りに典型的には構築される。蛍光ダイは、細胞の完全性（例えば、生対死およびアポトーシス）、エンドサイトーシス、エキソサイトーシス、膜流動性、タンパク質輸送、信号伝達、酵素活性などをモニタするのにも有用である。加えて、蛍光プローブは、分子遺伝学の分野において遺伝子マッピングおよび染色体分析に広く適用されている。

生物学的応用例において用いられてきた蛍光信号のいくつかの特性は、蛍光強度、蛍光偏光／異方性、および蛍光寿命を含む。蛍光寿命は、サンプル中の特定の蛍光体の存在（およびおそらくはその量も）の指標を提供するのに用いられ得る。蛍光異方性は、蛍光放射が非ランダムに偏光されている程度、すなわち、ある偏光の向きがその直交する偏光の向きに対して優勢な程度の測定を提供し得る。高度に異方性を持つ信号は、高度に偏光されている（例えば直線偏光されている）。高度に等方性の信号は、ランダム偏光に近づく。ある従来のアプローチにおいて、異方性（ｒ）は以下の式を用いて計算される。

ここでＶＨおよびＶＶは、水平および鉛直偏光（鉛直に偏光された励起光に対して）であり、ｇは、蛍光を検出するのに用いられる光学機器の偏光バイアスを補正する。蛍光寿命は、例えば、サンプル中の特定の分析物の微小環境を分類するのに用いられ得る。

今日の蛍光分析システムの多くは研究室のセッティングではうまく機能する。しかし、化学および生物工学産業において、多数のサンプルを時間およびコスト効率のよいやり方で分析する必要がしばしばある。これら環境の異なる必要条件のために、多くの蛍光分析システムは、用いるのが適当または可能ではなく、その結果、産業的なセッティングにおいて実行され得る分析の範囲は、研究室のセッティングのそれよりもより限られている。

一般に、ある局面において、本発明は、１つ以上の試料の特定の対象領域中の１つ以上のターゲット分析物の存在を検出する技術を実現および使用する方法、装置、およびシステムを提供する。複数の物質および１つ以上のターゲット分析物を含む１つ以上の試料が提供される。前記ターゲット分析物のうちの少なくとも一部は蛍光体でラベルが付けられ、前記１つ以上の試料中の前記物質の少なくとも一部に結合される。蛍光誘起光で前記１つ以上の試料を照射され、前記１つ以上の試料の１つ以上の領域から蛍光光が集められる。 前記１つ以上の試料の少なくとも１回の異方性計測が行われることによって、１つ以上のターゲット分析物が前記物質に結合される１つ以上の対象領域を特定される。前記対象領域からの前記集められた蛍光光を分析することによって、前記１つ以上の試料中の前記物質に結合されたターゲット分析物の存在が決定される。

優位性を持つ実現例は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。前記対象領域は、所定のスレッショルド値を超える計測された異方性値を有する前記試料の領域として特定され得、前記特定された対象領域内の閉じ込められた検出領域からの蛍光光だけが集められ得る。前記蛍光光を分析することは、前記特定された対象領域から集められた蛍光光だけを分析することを含み得る。前記物質は、スポット、マイクロビーズ、セル、およびマイクロアレイであり得る。前記複数の物質の少なくとも一部は、蛍光体、量子ドットまたは励起光に対して異なる応答を持つ他の材料によって、光学的にエンコードされ得る。

試料を提供することは、複数の光学的にエンコードされた物質を提供することであって、それぞれの光学的にエンコードされた物質は、分析物に対して親和性を有し、前記分析物に対応する光学的シグネチャを有すること、前記物質を、少なくとも１つのターゲット分析物に対して第１親和性を、前記複数の光学的にエンコードされた物質中の前記光学的にエンコードされた物質のうちの少なくとも一部に対して第２親和性を有する１つ以上の分析物を含む資料に接触させることによって、前記試料中の少なくとも一部の分析物の前記第１親和性部位が前記光学的にエンコードされた物質に結合させること、および前記光学的にエンコードされた物質およびそれらの結合された分析物を、前記ターゲット分析物が前記試料中の前記分析物の前記第２親和性部位と結合することを可能にする環境のもとで１つ以上のターゲット分析物を含むターゲット試料に接触させることを含み得る。

分析することは、前記物質の１つ以上において起こる結合反応を検出すること、前記物質の１つ以上においてターゲット分析物を分類すること、および前記１つ以上の物質を定量化することのうちの少なくとも１つを含み得る。前記提供することは、洗浄ステップを伴わないホモジニアスな環境のもとで実行され得る。前記第２親和性部位は、抗体、抗原、レセプター、リガンド、核酸、酵素、基質、インヒビター、および類似部位であり得る。前記ターゲット分析物は、抗体、抗原、レセプター、リガンド、タンパク質、ペプチド、酵素、核酸、薬物、ホルモン、化学物質、病原体、毒素、バクテリア、またはウイルスであり得る。前記集めることおよび分析することのステップは、約毎秒２０，０００物質に達するまで実行され得る。それぞれの光学的にエンコードされた物質は、その放出した蛍光光に基づいて個別に分類可能であり得る。

前記集めるステップは、蛍光強度値、蛍光偏光値、蛍光異方性値、回転相関時間、および蛍光寿命のうち１つ以上を集めることを含み得る。前記照射すること、集めることおよび分析することのステップは、複数の蛍光波長領域において実行され得る。分析することは、前記集められた蛍光光の時間についての変化を計測することによって反応情報を提供することをさらに含み得る。前記集められた蛍光光の強度値における時間に対しての計測された変化に基づいて、前記１つ以上のターゲット分析物についての濃度が決定され得る。前記集められた蛍光光の異方性値における時間に対しての計測された変化に基づいて、前記１つ以上のターゲット分析物についての濃度が決定され得る。前記集められた蛍光光の異方性値における時間に対しての計測された変化に基づいて、結合したターゲット分析物を含む前記複数の物質中の個別の物質が決定され得る。それぞれの物質が既知の異方性を有する物質が提供され得、内部異方性レファレンスが形成され、前記計測された異方性は、既知の異方性を持つ前記物質の異方性と比較されることによって前記結合されたターゲット分析物の改善された異方性計測を得られ得る。

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明において述べられる。本発明の他の特徴および優位性はこの記載および図面および特許請求の範囲から明らかであろう。

さまざまな図面における同様の参照番号は同様の要素を示す。

以下において、本発明の具体的な実施形態が説明される。この実施形態の例は、添付の図面においても示される。本発明はこの具体的な実施形態について説明されるが、この説明は本発明を単一の実施形態に限定するようには意図されないことが理解されよう。以下の説明において、多くの具体的な詳細が本発明の完全な理解を図るために述べられる。本発明はこれら特定の詳細の一部または全てがなくても実施され得る。あるいは、よく知られたプロセス操作は、本発明を不必要にぼかさないために詳細には記載されていない。

一般に、ある局面において、本発明は、異方性および反応速度によって蛍光体微小環境を探る技術、特に異方性および反応速度を用いて結合反応を計測する技術を実現および使用する方法および装置を提供する。本発明の装置および方法のさまざまな実施形態によって実行される異方性計測は、試料溶液中の自由蛍光体を、試料中の固定化蛍光体から区別することを可能にする。後述のように、本発明のシステムおよび方法は、スポット、ビーズ、および細胞の分類および定量化のためのロバストなリアルタイム技術を提供する。反応速度計測は、記録されたトータルの蛍光信号とは独立である定量化のための改良された方法を提供する。サンプルの異方性計測は、計測された異方性値をゲーティング機能として使用し、例えば特定のスレッショルド値を超える異方性値を有するサンプルの対象領域からの蛍光光だけを集めることも可能にする。代替として、蛍光光は、全体のサンプルから集められ得るが、スレッショルド値を超える異方性値を有する試料の対象領域についてだけ分析され得る。

ある実施形態において、本発明による計測を実行するのに用いられるレーザ走査システムは、マイクロアレイスポット、ビーズ、またはセルを用いた高度に小型化されたエンドポイントかつキネティック結合アッセイのために設計される。このシステムは、均質な結合反応をリアルタイムで簡単なマイクロスケールフォーマットでモニタできる。本システムの技術およびデータ処理方法は、ホモジニアスなアッセイを可能にし、すなわち従来のアッセイにおいては典型的には必要だった洗浄ステップを全く必要としないか、または最小限しか必要としないin-situなアッセイを可能にする。このアッセイは、抗体、ビオチンまたはストレプタビジンなどのような、さまざまな結合部位を伴う多くの異なるフォーマットのin vitroのアッセイのようなマルチステップおよびマルチ分子イベントを同定、特徴付け、および分析するのに用いられ得る。多くの「サンドイッチ」構造が、ターゲット分析物、基板などのタイプに依存してアッセイにおいて作られ得る。具体的な例として、抗体アレイは、９６ウェルプレートにおいて採用され得る。ターゲット分析物は、基板との接触（および結合）の前にまたは後で検出部位（例えば蛍光体）で予めラベルが付けられ得る。いずれの場合も、結果として生じるマルチレベルの構造は、例えば緑色５３２ｎｍレーザ励起波長を用いて上述のシステムで走査される。検出はリアルタイムで数秒以内に起こり、結合された蛍光体は、試料溶液中に自由なままである蛍光体よりも高い、区別できる異方性を示す。

異方性計測を用いて結合された蛍光体から自由な蛍光体を区別するために蛍光寿命のあいだ、その移動度が充分であるように、ビオチン化蛍光体のサイズは比較的小さいことに注意されたい。もしビオチン化蛍光体が大きければ、それらはゆっくり移動するため、結合された蛍光体から自由な蛍光体を蛍光寿命のあいだに区別するためことが難しくなり、よって異方性の使用を通じて結合を検出することが非実用的になるだろう。しかし、もしより長い寿命を持つ蛍光体が用いられるなら、より大きい分子が調べられ得るだろうが、これは、それらが結合されているか自由であるかを検出するために、それらが充分な期間のあいだに、すなわち蛍光寿命が終わる前に調べられ得ることに注意されたい。

一般に、ここで説明される技術は、例えば、基板に結合された「捕捉タンパク質」を与え、溶液中に「ターゲットタンパク質」を導入し、それらが「捕捉タンパク質」に結合することを可能にすることによって、タンパク質ータンパク質相互作用を検出するためにも用いられ得る。実行される実験のタイプに依存して、蛍光体は、ターゲット分析物が導入されたあとに導入され得、またはターゲット分析物は、導入の前に蛍光体で前標識され得る。

本発明の分析を実行するのに用いられ得る例示的システムは、「Time dependent fluorescence measurements」と題された同時係属中の米国特許出願第10/927,748号、および「Measuring time dependent fluorescence」と題された同時係属中の米国特許出願第10/928,484号にさらに説明される。レーザ走査システムの簡単な概観がこれから示される。記載される実施形態において、本システムは、試料を含む基板上にフォーカスが合わさられ得る、バックグラウンドノイズまたは信号に対し弁別でき、画像コントラストメカニズムを利用する能力を持つ走査光源を用いる。このシステムは、どの種類の試料データが集められるべきかに依存して、いくつかの別個のモードまたはそれらの組み合わせにおいて動作され得る。

第１モードにおいて、システムからの出力信号は、生物細胞（例えば細胞中のさまざまな分子の局在化の研究を可能にする）または蛍光光を発する他の物質の中の離散位置の数、信号源の相対位置、および試料のさまざまな位置において発せられる光の色（例えば波長または波長帯）のような情報を含む。第２モードにおいて、平面偏光されたレーザビームが光学系を通って試料へと伝搬され、偏光された光で生物材料の調査を可能にする。励起源の偏光された性質は、放出の異方性の特性、または偏光の緩和の時間依存性が生物部位についての空間的または物理的情報を生じ得る場合に、生物学的材料の特性の計測を可能にする。

第３モードにおいて、いくつかのレーザビームは、光学系を通って試料上へ伝搬され得、これは、光の異なる波長を用いて、または異なる時刻において同じ波長を用いて生物材料の調査を可能にする。このモードにおいて、レーザは同時に、またはパルス間で固定されたまたは可変された遅延を伴ってパルス化され得る。パルス間の遅延は、励起された状態において生物学的材料の特性の計測を可能にし、ここで第１レーザパルスが生物学的部分の励起を引き起こし、第２または追加のレーザパルスが励起状態においてその部位に質問を行う。レーザビームは、それらが走査のあいだ同じ試料領域上にフォーカスするよう共伝搬され得、または代替として、それらが走査のあいだレーザビームが順次、同じ試料領域にわたって移動するようにある相対的角度において伝搬され得る。

第４モードにおいて、単一の変調されたレーザビームが光学系を通して試料上に伝搬され得ることによって、生物学的材料における蛍光の寿命のあいだの計測を可能にする。第５モードにおいて、１つの集光光学構成と共にいくつかの検出器が用いられ得、これは、分析のための複数の閉じ込め領域を作り、その利点は以下にさらに詳細に説明される。閉じ込め領域は、例えば、約１００〜２００ミクロンの厚さを持ち、蛍光が集められる試料ウェルまたは基板の底部に配置される、典型的には鉛直領域である。閉じ込め領域は、上で参照された特許出願において詳細に記載され、以下では簡単に説明される。アッセイ環境内の正確な深さにおいてだけ信号を集めることによって、信号品質は、大きく向上され得る。閉じ込め領域は、蛍光体（または他の信号発生部位）が基板に結合する深さに好ましくは設定される。第６モードにおいて、いくつかの集光光学構成が、単一の集光光学系に対してユニークな幾何学形状で改善された閉じ込めを提供するために用いられ得、またはそれぞれの集光光学系にユニークに特定されるいくつかの特性を持つ閉じ込め領域からの放射を集めるために用いられ得、その利点は以下に説明される。

図１に示されるように、本システムのある実施形態において、励起光源（１０１）は、励起光（１０４）を、調べられるべき試料を含む基板（１０２）の上に投射されるように放射する。基板（１０２）は以下にさらに詳細に説明される。典型的には、励起光源（１０１）は、励起線４８８、５１４、５６８および６４７ｎｍを持つＡｒまたはＡｒ／Ｋｒ混合ガスレーザのようなレーザである。ある実施形態においては、カリフォルニア州、Mountain ViewのSpectraphysics Inc.からのCompass 315 Mレーザのような連続波（ＣＷ）レーザが励起源として用いられる。レーザ（１０１）およびシステムで用いられる具体的な光学系に依存して、励起光の波長は、可視範囲内（すなわち４００〜７００ｎｍ）、または可視範囲外のいずれかであり得る。４００ｎｍ未満の励起波長については、写真退色（photobleaching）によるもののような光化学的反応速度は、かなりの大きさになる傾向がある。ある実施形態において、レーザ（１０１）からの出力は変調され得、周波数変調検出スキームを用いることによって、蛍光信号の時間依存応答についての情報を与える。他の実施形態においては、ほぼ１２ｎｓの間隔を持つ、ほぼ１２ｐｓのＦＷＨＭ（全幅半値）のパルスレーザが励起光源（１０１）として用いられる。基板（１０２）上の試料におけるレーザ（１０１）の平均電力は、典型的には１ｍＷ〜１Ｗの範囲にある。１２ｎｓの間隔は、蛍光寿命検出のためには便利であるが、例えば、レーザ（１０１）のキャビティ長を変化させることによって、必要に応じて変化され得る。両方の実施形態に共通するのは、コントラスト作成因子としての時間分解画像化の使用である。

レーザ（１０１）を離れた後、励起光（１０４）は、１つ以上の照射光学要素を通って基板（１０２）に達する。照射光学要素は、電気光学変調器（１０８）、ビーム整形レンズ（１０３）、走査装置（１０５）、およびマルチエレメントレンズ（１０９）を含む。電気光学変調器（１０８）は、もし基板（１０２）上の試料上で行われるべき調査によって要求されるなら、励起光（１０４）を偏光変調するために用いられ得る。ビーム整形レンズ（１０３）は、走査レンズの入力開口を整合させ、基板（１０２）上の試料ウェルにおいて所望の照射領域サイズを提供するためにレーザビームを拡張する。走査装置（１０５）は、ビームがマルチエレメントレンズ（１０９）によってフォーカスされた後に、基板（１０２）上でラインスキャンにおいて拡張されたレーザビームを前後に移動させる。走査装置（１０５）は、検流計によって駆動されるミラーのような、光学要素に結合された電気機械的装置であり得る。ある実施形態において、走査装置（１０５）は、基板（１０２）にわたってレーザビームを走査させるために複数の反射表面を持つポリゴンを用いる。

マルチエレメントレンズ（１０９）は、レーザ光をレーザ（１０１）の動作波長においてフォーカスさせるよう設計される。マルチエレメントレンズ（１０９）は例えば、その動作波長のために設計された顕微鏡対物レンズ、またはテレセントリックレンズのような、例えば長い動作距離および低い第１次および第２次収差を持ち、それによって広い範囲の位置にわたって（走査ラインのような）同じスポットサイズおよび形状を作る、フラットなフォーカス面を達成するために適切なパラメータを有する特別に設計された走査レンズであり得る。テレセントリックレンズは、広い視野をカバーするために特に有用である。マルチエレメントレンズ（１０９）を通った後、ビーム（１１０）は、画像化されるべき試料を含む基板（１０２）の領域上にフォーカスされる。フォーカス領域は、例えば、マイクロアレイプレートの基台上に位置付けられる。基板（１０２）上の試料は、蛍光によって精査されるべき、例えば、液体、スポット、ビーズ、またはセルであり得る。

試料によって放射された蛍光光は、１つ以上の集光光学要素（１１９）によって集光される。基板上の試料の大きなアレイの走査を可能にする集光光学要素（１１９）を構成するためにはいくつかのやり方がある。ある実施形態においては、集光光学要素（１１９）は、基板（１０２）の１次元にわたってビーム（１１０）のスイープの全範囲をキャプチャするよう設計されたロッドレンズである。集光光学要素（１１９）は、放射から要求される特定の情報によって決定されるように、他のタイプのレンズ、またはレンズの集合体も含み得る。集光光学要素（１１９）は、閉じ込め検出領域を作り、これは関連付けられた検出器が、集光光学要素（１１９）の焦点面の付近の比較的狭い領域からの光だけを集めることを可能にする。ある実施形態においては、閉じ込め領域をそれぞれの光学集光要素（１１９）についての焦点平面の交差部にさらに限定することによって、集光光学要素（１１９）の複数のセットアップが集光効率を改善するために用いられ得る。

集光光学要素（１１９）によって集光された光は、集光光学要素（１１９）から便利な距離に位置する検出器（１２１）に伝送される。蛍光光の伝搬は、例えば光ファイバまたは光ファイバ群の束（１２０）によって達成され得る。ある実施形態において、検出器（１２１）は、電気的出力信号を作る光増倍管のような高利得の検出器である。具体的には、図１に示される実施形態は、２つの検出器（１２１）を有し、これらのそれぞれは、光学要素（１１９）のそれぞれのセットによって選択された、特定の偏光の光を集める。示される実施形態において、それぞれの検出器（１２１）は、偏光について２つの異なるチャネルを有し、これは、試料上で２チャネル異方性計測が実行されるのを可能にし、以下にさらに詳細に説明される、試料内での内部異方性標準の使用を可能にする。電気出力信号は、さらにコンピュータ（１２４）に接続されたデータアクイジションシステム（１１４）によって処理され、これは信号強調、平均化、または集積化検出システムを利用することによって、利得および信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）の最適化のような動作を実行する。

本システムは、ディジタル電子回路、またはコンピュータハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、またはそれらの組み合わせを例えばコントローラ（１１５）、データ取得システム（１１４）およびコンピュータ（１２４）中に含むように典型的には実現される。そのような特徴は、基板の使用（試料を搬送すること、および基板のウェル中に設けられた試料を調べることの両方のために）を制御するために共通して採用される。本発明のシステムは、プログラム可能なプロセッサによって実行されるために機械で読み取り可能な記憶装置中に有形的に実現されたコンピュータプログラム製造物を含むように実現され得、本発明の方法ステップは、入力データに対して操作し、出力を発生することによって本発明の機能を実行する命令のプログラムを実行するプログラム可能なプロセッサによって実行され得る。プロセッサはオプションとして、ネットワーク接続を用いて、例えばインターネットまたはイントラネットネットワークであるコンピュータまたは遠隔通信ネットワークに結合され得、これを通じてプロセッサはネットワークから情報を受け取り、または方法ステップの実行の過程でネットワークに情報を出力し得る。次に、本発明のある実施形態によるターゲット試料中の分析物を検出するプロセスが図２を参照して説明される。

図２に示されるように、ある実施形態において、ターゲット試料中の分析物を検出するプロセス（２００）は、そのそれぞれが特定の分析物に対して特定の親和性を有する、いくつかの光学的にエンコードされたマイクロビーズを含む第１試料を提供することから始まる（２０２）。この実施形態において、光学的にエンコードされたマイクロビーズは、典型的には約０．１から２０ミクロンのサイズであり、より典型的には約１から１０ミクロンのサイズであるが、他の応用例においてはマイクロビーズは約２０ミクロンより大きいサイズを有し得る。所定の計測可能で、異なる光学的にエンコードされたマイクロビーズの特性は、ユニークなサイズであり、および／または光に対するユニークな応答を有する。マイクロビーズはそれぞれ、特定の分析物に対応する光学的シグネチャを有し、単一の蛍光体またはさまざまな比率の蛍光体の組み合わせ、量子ドット、または燐光性材料のような光に応答を有する他の材料を用いて光学的にエンコードされ得る。マイクロビーズは、サイズ、形状、位置、または当業者に知られる他の方法のような他の特性によってエンコードされてもよいことに注意されたい。この光学的エンコードは、マイクロビーズのそれぞれについて「バーコード」として働き、ビーズが分析物または分析物の結合に依存するラベルに結合されるかにかかわらず、常にビーズと常駐する。マイクロビーズの光学的エンコードは、複数のターゲット分析物が検出されるべきときには、ある試料から他を区別するなんらかのメカニズムが典型的には採用されるが、本発明を実施するのに必要ではないことにも注意されたい。位置エンコードの例は、タンパク質スポットのアレイを置くことであり、ここであるスポットがあるタンパク質を含むことがわかっている。例えば、タンパク質スポットの４×４のアレイが採用され得、ここでマトリクスの４つのメンバのそれぞれは、異なるタンパク質であり、その他者に対して所定の既知の空間的関係を有する。

第１試料中のマイクロビーズは、それから、ターゲット分析物に対して所定の特定の親和性の少なくとも１つの親和性部位を有する、またはいくつかのターゲット分析物群に対していくつかの所定の特定の親和性群を有する第２試料に接触される（ステップ２０４）。これは、第２試料の親和性部位が、第１試料のマイクロビーズに結合されるようにする。特定の親和性部位は、光学的にエンコードされたマイクロビーズの表面上に吸収され得、または共有結合性または非共有結合性で光学的にエンコードされたマイクロビーズにリンクされ得る。それぞれの光学的にエンコードされたマイクロビーズの特定の親和性およびそれぞれの親和性部位の特定の親和性は、例えば、抗体、抗原、レセプター、リガンド、核酸、酵素、基質およびインヒビター、または類似の部位であり得る。熟練した読者ならわかるように、これら親和性部位は例に過ぎず、他の親和性部位も可能である。

マイクロビーズおよびそれらの結合親和性部位は、それから、ターゲット分析物が親和性部位に結合し得るような環境のもとで、いくつかのターゲット分析物を持つターゲット試料に接触される（ステップ２０６）。記載される実施形態において、ターゲット分析物試料に接触させることは、ホモジニアスなアッセイ条件のもとで起こり得、すなわち、アッセイは、従来のアッセイにおいては結合していない分析物を除去することによって、結合していない分析物が結合した分析物の蛍光計測の邪魔をしないようにするために典型的には必要である洗浄ステップを全く伴わない、または最小限しか伴わないことに注意されたい。よって、本発明による方法およびシステムは、洗浄ステップをなくし、またはその数を減少させることによって、より簡単でより高速な実験プロシージャを提供する。ターゲット分析物は、典型的には溶液中に溶解または懸濁される。ターゲット分析物は、例えば、抗体、抗原、レセプター、リガンド、タンパク質、ペプチド、酵素、核酸、薬物、ホルモン、化学物質、病原体、毒素、およびそれらの組み合わせであり得る。代替として、ターゲット分析物は、例えば、バクテリア、ウイルスおよびそれらの組み合わせであり得る。しかし、これらのターゲット分析物は単に例に過ぎず、他のターゲット分析物も可能であることに注意されたい。さらに、後に続く洗浄などを伴うヘテロジニアスなアッセイも本発明の実施においては除外されない。

その後、マイクロビーズは、結合された親和性部位および親和性部位に結合されたターゲット分析物と共に、蛍光を誘起するよう照射され（ステップ２０８）、蛍光光が上述の分析システムを用いて集められる（ステップ２１０）。上述のシステムは、いくつかの光学的信号をそれぞれの光学的にエンコードされたマイクロビーズのｘ−ｙ位置について、同時または順次検出されることを可能にする。蛍光情報は、閉じ込め検出領域から集められ、これはホモジニアスなアッセイフォーマットを可能にし、高速走査を提供する。ある実施形態において、検出システムは、平面アレイ中のそれぞれの光学的にエンコードされたマイクロビーズを、１秒当たり20,000マイクロビーズ、またはそれ以上に達するレートで走査および分析し得、蛍光色および／またはサイズシグネチャを含む、その放出された光学信号に基づいてそれぞれの光学的にエンコードされたマイクロビーズを分類する。他の実施形態において、検出システムは、平面アレイ中のそれぞれの光学的にエンコードされたマイクロビーズを、１秒当たり20,000マイクロビーズ、またはそれ以上に達するレートで走査および分析し、ターゲット試料中の分析物群のうちの特定の分析物の存在を決定するのに用いられるいくつかの光学信号を検出するために用いられ得る。このシステムは、例えば、試料を特定するバーコードを読むために、２次元プラットフォームの定義された領域を走査するのにも用いられ得る。

集められた蛍光信号に基づいて、ターゲット試料中のターゲット分析物の不存在、存在および／または量が決定され（ステップ２１２）、プロセスを終える。それぞれの光学的にエンコードされたマイクロビーズについての決定は、例えば、蛍光強度値、蛍光偏光／異方性状態値、回転相関時間、および／または蛍光寿命値を有するいくつかの光学的信号を生む。蛍光強度値は、試料中のターゲット分析物群のうちの特定の分析物の存在および／または量を決定するために用いられ得る。蛍光偏光／異方性状態値および／または回転相関時間は、存在および／または量と共に、特定のターゲット分析物の微小環境を分類するために用いられ得る。微小環境の分類は、例えば、局所的粘性、ターゲット分析物（群）が結合されているか、非結合であるか、寿命に変化があるかどうか、クエンチングイベント、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）イベントなどであり得る。また、蛍光寿命値は、試料中のターゲット分析物群の中で特定の分析物の微小環境を分類するために用いられ得る。例えば、ＦＲＥＴが２つの部位で起こる場合、ドナー部位の寿命が減る。蛍光寿命信号を決定することは、分子結合の計測を行う簡単な方法を提供するが、これは非結合分析物はＦＲＥＴ計測をじゃましないからである。ＦＲＥＴは、ターゲット生体分子のそれぞれのタイプに結合する少なくとも２つの異なる蛍光体、または第２生体分子の少なくとも２つの異なるタイプを含む。アッセイは、ＦＲＥＴ計測のために最適にペアが作られた蛍光ドナーおよび蛍光アクセプターを含む蛍光体を用いて構築され得る。蛍光ドナーは、典型的には放出スペクトルを有するドナー分子である。蛍光アクセプターは、ドナースペクトルと同じ波長領域の実質的に中において吸収スペクトルを有するアクセプター分子である。エネルギーは、互いに１から５ナノメートルの距離にある最適にペアが作られた蛍光体間で転移される。

本システムはまた、時間に対する上の信号における変化が計測されることを可能にすることで、ターゲットおよび試料分析物についての反応速度情報を提供する。多くの場合、反応速度は、試料中の特定の分析物の量または濃度の定量化のためにはより優れた方法である。本システムは、いくつかのレーザ励起および蛍光放出波長を用いて、この方法の能力を向上させることができる。

熟練した読者はわかるように、図２のプロセスは、多くのやり方で変化され得る。例えば、ある実施形態においては、光学的にエンコードされないマイクロビーズおよびそれらの対応する分析物が、走査される試料の離散容量要素中に含まれ得、これは、分析物およびマイクロビーズが含まれるターゲット試料の離散容量要素に基づいて分析物についての情報を集めることを可能にする。空間的に差分がとられた蛍光情報は、特定の領域にある特定のターゲット分析物の存在を決定するために用いられ得る。空間的に差分された蛍光情報は、それぞれのターゲット分析物からの特定の色の蛍光光を含み得る。

他の実施形態において、光学的にエンコードされたマイクロビーズは、硬い基板表面、マルチウェルプレート、または他の試料容器のような、２次元プラットフォームまたは基板上の所定の空間的ｘ−ｙ位置（典型的にはサンプルウェル）にわたってランダムに分配され得る。さらに他の実施形態において、マイクロビーズおよび結合された親和性部位は、ターゲット分析物が親和性部位に何回か結合するような環境のもとで、分析物を持つターゲット試料に繰り返し接触させられ、それぞれの回は２次元プラットフォームまたは基板の異なるｘ−ｙ位置上である。

図３および図４は、上述のシステムおよびプロセスによって得られたある実験結果を示す。図３に図示された実験において、２０ミクロンのストレプタビジンでコートされたビーズが、共役化されたビオチンーアレクサ蛍光５６４ダイの４０ｎＭ溶液と結合され、異方性が計測された。図３は、溶液中の蛍光ダイ（図３の下部における菱形のデータ点）およびマイクロビーズと結合した蛍光ダイ（図３の上部における四角形のデータ点）についての、時間の関数としての計測された蛍光異方性のグラフを示す。図３のそれぞれのデータ点は、３つのマイクロビーズにわたって計測された平均値に対応する。図３からわかるように、異方性は、マイクロビーズに結合した分析物について明らかにより高い。よって、異方性値は、溶液中のマイクロビーズまたは他の物質を、溶液中の自由蛍光体から区別するために用いられ得る。図３からわかるように、平均異方性は、初期の結合のあいだに増加もする。初期の結合段階のあいだの曲線の傾きは、試料に存在するターゲット分析物の初期濃度を定量化するために用いられ得る。

図４は、図３に示されるデータを得るのに用いられたのと同じシステムで計測された、溶液中の蛍光ダイ（図４の下部における菱形のデータ点）およびマイクロビーズと結合した蛍光ダイ（図４の上部における四角形のデータ点）についての、時間の関数としての蛍光強度のグラフを示す。図４からわかるように、ビーズまたは物質と結合したダイについての蛍光強度は、マイクロビーズまたは物質が分析物によって飽和するまで時間の関数として増加する。またここでは、この曲線の初期段階の傾きは、試料中の分析物の濃度を定量化するために用いられ得る。異方性および蛍光強度の組み合わせは、ホモジニアスな、つまり洗浄不要のアッセイを可能にするために用いられ得る。図３および図４のグラフを比較することによってわかるように、異方性は、蛍光強度よりもずっと初期に飽和する。よって、異方性は、マイクロビーズ、スポット、セル、または他の物質のような対象領域を規定するために用いられ得、ここで蛍光強度信号は後で計測される。対象領域の外から発する任意の蛍光は、無視されるか、またはバックグラウンドまたは他の参照信号として用いられ得る。すなわち、異方性計測は、蛍光強度計測がなされるべき試料上の対象領域を特定するためのゲーティングまたは分類パラメータとして用いられる。ある実施形態において、異方性および強度計測は、上述のシステムを用いて試料全体を走査すること、および試料の走査された画像中のそれぞれの画素について異方性値を計算してから、強度値が対象試料領域、すなわち高い異方性値を有する試料の領域についてだけ後で計測されるようにスレッショルド操作をすることによって実行され得る。

他の実施形態において、２つの異なる色についての異方性を同時に検出する分析システムの能力は、異方性計測を改善するのに用いられる。この実施形態において、マイクロビーズ（または他の物質）は、第１波長または色の既知の異方性を持つ蛍光信号を放出する。ターゲット分析物は、上述のように未知の異方性を持つ異なる蛍光信号を放出する。ターゲット分析物信号についての未知の異方性のための内部レファレンスとして既知の異方性を用いることによって、ターゲット分析物信号について改善された異方性値が獲得され得る。この技術は、上述の異方性数式における「ｇファクタ」、すなわち機器および環境に特有の特性を知らなければならないという問題を避け、よって、異方性計測をより信頼性の高いものにする。

反応速度から分析物濃度を決定することは、以下のようにさらに理解されよう。マイクロビーズが分析物の種で飽和されるまで、蛍光強度は、マイクロビーズが飽和するまでマイクロビーズと結合する分析物の量と共に増加する。これは図４のビーズの曲線において見られ、これは初めの期間のあいだ増加していく強度を見せ、これはある時間が経った後ではほとんど水平の曲線へとその後、平坦になる。もし分析物の濃度が低いなら、飽和点に達するのに要求される時間はより長くなり、すなわち蛍光強度曲線はよりゆったりした傾きを有することになる。もし分析物の濃度が高いなら、終点に達するのに要求される時間はより短くなり、すなわち蛍光強度の曲線はより急になるだろう。よって、時間の関数としてのビーズについての蛍光強度曲線の傾きを調べること、および計測された値を既知の分析物濃度と比較することによって、試料中の分析物の濃度についての情報が導かれ得る。熟練した読者ならわかるように、分析物濃度を決定するこの方法の詳細は、結合反応の次数および相対結合速度（順方向および逆方向）に依存することになる。

本発明の多くの実現例が説明されてきた。しかしながらさまざまな改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなく、なされ得ることが理解されよう。例えば、本分析方法およびシステムは、上では光学的にエンコードされたマイクロビーズと共に上で参照された特許出願の検出システムを用いる実施形態の例によって説明されてきたが、部位親和性のための任意のタイプの適切な物質または物質群の組み合わせが用いられ得る。物質群またはそれらの組み合わせのそのような例は、ビーズ、スポット、スポット上のスポット、ビーズと組み合わされたスライド上のスポット、セル、毛細管、微小流体チャネルなどを含み得る。多くの実施形態に共通の本発明の局面は、試料をよく規定された領域に閉じ込めることを可能にする物質を用いること、その領域内で分析物を試料に結合させることであり、それによってターゲット領域中の分析物の存在、不存在および／または量の検出を可能にする。ホモジニアスなアッセイについて本方法およびシステムは説明されてきたが、熟練した読者にはわかるように、それらはヘテロジニアスなアッセイにも同じように応用可能であり、水平フロー、毛細管フロー、およびＭＥＭＳシステムを含むフローベースのアッセイにも応用可能である。したがって、他の実施形態も添付の特許請求の範囲の範囲内である。

本発明の第１実施形態による光学的データを集める装置の概略図である。 本発明のある実施形態によってターゲット試料中の分析物を計測するプロセスを示す図である。 図１のシステムによって求められた、自由な蛍光ダイおよびマイクロビーズと結合した蛍光ダイについての、時間の関数としての蛍光異方性と共にマイクロビーズ蛍光異方性への反応速度の当てはめを示すグラフである。 図１のシステムによって求められた、自由な蛍光ダイおよびマイクロビーズと結合した蛍光ダイについての、時間の関数としての蛍光強度と共にマイクロビーズ蛍光強度への反応速度の当てはめを示すグラフである。

Claims (19)

1. １つ以上の試料の特定の対象領域中の１つ以上のターゲット分析物の存在を検出する方法であって、
   複数の物質および１つ以上のターゲット分析物を含む１つ以上の試料を提供することであって、前記ターゲット分析物のうちの少なくとも一部は蛍光体でラベルが付けられ、前記１つ以上の試料中の前記物質の少なくとも一部に結合すること、
   蛍光誘起光で前記１つ以上の試料を照射すること、
   前記１つ以上の試料の１つ以上の領域から蛍光光を集めること、
   前記１つ以上の試料の少なくとも１回の異方性計測を行うことによって、１つ以上のターゲット分析物が前記物質に結合される１つ以上の対象領域を特定すること、および
   前記対象領域からの前記集められた蛍光光を分析することによって、前記１つ以上の試料中の前記物質に結合されたターゲット分析物の存在を決定すること
   を含む方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、
   前記対象領域は、所定のスレッショルド値を超える計測された異方性値を有する前記試料の領域として特定され、
   蛍光光を集めることは、前記特定された対象領域内の閉じ込められた検出領域からの蛍光光だけを集めることを含む方法。
3. 請求項１または２のいずれかに記載の方法であって、
   前記対象領域は、所定のスレッショルド値を超える計測された異方性値を有する前記試料の領域として特定され、
   前記蛍光光を分析することは、前記特定された対象領域から集められた蛍光光だけを分析することを含む方法。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載の方法であって、前記物質は、スポット、マイクロビーズ、セル、およびマイクロアレイからなるグループから選択される方法。
5. 請求項１〜４のいずれかに記載の方法であって、前記複数の物質の少なくとも一部は、蛍光体、量子ドットまたは励起光に対して異なる応答を持つ他の材料によって、光学的にエンコードされる方法。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の方法であって、
   試料を提供することは、
   複数の光学的にエンコードされた物質を提供することであって、それぞれの光学的にエンコードされた物質は、分析物に対して親和性を有し、前記分析物に対応する光学的シグネチャを有すること、
   前記物質を、少なくとも１つのターゲット分析物に対して第１親和性を、前記複数の光学的にエンコードされた物質中の前記光学的にエンコードされた物質のうちの少なくとも一部に対して第２親和性を有する１つ以上の分析物を含む資料に接触させることによって、前記試料中の少なくとも一部の分析物の前記第１親和性部位が前記光学的にエンコードされた物質に結合させること、および
   前記光学的にエンコードされた物質およびそれらの結合された分析物を、前記ターゲット分析物が前記試料中の前記分析物の前記第２親和性部位と結合することを可能にする環境のもとで１つ以上のターゲット分析物を含むターゲット試料に接触させること
   を含む方法。
7. 請求項１〜６のいずれかに記載の方法であって、分析することは、前記物質の１つ以上において起こる結合反応を検出すること、前記物質の１つ以上においてターゲット分析物を分類すること、および前記１つ以上の物質を定量化することのうちの少なくとも１つを含む方法。
8. 請求項１〜７のいずれかに記載の方法であって、前記提供することは、洗浄ステップを伴わないホモジニアスな環境のもとで実行される方法。
9. 請求項６に記載の方法であって、前記第２親和性部位は、抗体、抗原、レセプター、リガンド、核酸、酵素、基質、インヒビター、および類似部位からなるグループから選択される方法。
10. 請求項１〜９のいずれかに記載の方法であって、前記ターゲット分析物は、抗体、抗原、レセプター、リガンド、タンパク質、ペプチド、酵素、核酸、薬物、ホルモン、化学物質、病原体、毒素、バクテリア、またはウイルスの少なくとも１つを含む方法。
11. 請求項１〜１０のいずれかに記載の方法であって、前記集めることおよび分析することのステップは、約毎秒２０，０００物質に達するまで実行される方法。
12. 請求項５に記載の方法であって、それぞれの光学的にエンコードされた物質は、その放出した蛍光光に基づいて個別に分類可能である方法。
13. 請求項１〜１２のいずれかに記載の方法であって、前記集めるステップは、蛍光強度値、蛍光偏光値、蛍光異方性値、回転相関時間、および蛍光寿命のうち１つ以上を集めることを含む方法。
14. 請求項１〜１３のいずれかに記載の方法であって、前記照射すること、集めることおよび分析することのステップは、複数の蛍光波長領域において実行される方法。
15. 請求項１〜１４に記載の方法であって、分析することは、前記集められた蛍光光の時間についての変化を計測することによって反応情報を提供することをさらに含む方法。
16. 請求項１５に記載の方法であって、前記集められた蛍光光の強度値における時間に対しての計測された変化に基づいて、前記１つ以上のターゲット分析物についての濃度を決定することをさらに含む方法。
17. 請求項１５に記載の方法であって、前記集められた蛍光光の異方性値における時間に対しての計測された変化に基づいて、前記１つ以上のターゲット分析物についての濃度を決定することをさらに含む方法。
18. 請求項１５に記載の方法であって、前記集められた蛍光光の異方性値における時間に対しての計測された変化に基づいて、結合したターゲット分析物を含む前記複数の物質中の個別の物質を決定することをさらに含む方法。
19. 請求項１〜１８のいずれかに記載の方法であって、
    複数の物質を提供することであって、それぞれの物質は既知の異方性を有することによって、内部異方性レファレンスが形成されることをさらに含み、
    少なくとも１つの異方性計測を行うことは、前記計測された異方性を、既知の異方性を持つ前記物質の異方性と比較することによって前記結合されたターゲット分析物の改善された異方性計測を得ることを含む方法。

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