[go: up one dir, main page]

JP2008504010A - 新規のプロスタグランジン受容体タンパク質をコードする核酸およびその使用方法 - Google Patents

新規のプロスタグランジン受容体タンパク質をコードする核酸およびその使用方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2008504010A
JP2008504010A JP2006547050A JP2006547050A JP2008504010A JP 2008504010 A JP2008504010 A JP 2008504010A JP 2006547050 A JP2006547050 A JP 2006547050A JP 2006547050 A JP2006547050 A JP 2006547050A JP 2008504010 A JP2008504010 A JP 2008504010A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
protein
seq
sequence
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2006547050A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4700620B2 (ja
Inventor
アシュファク・パーカー
ポール・オーガスト
テリーザ・クンツワイラー
モハマド・アリ・アルダティ
ナマデヴ・バスカラン
Original Assignee
アベンティス・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテツド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アベンティス・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテツド filed Critical アベンティス・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテツド
Publication of JP2008504010A publication Critical patent/JP2008504010A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4700620B2 publication Critical patent/JP4700620B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、プロスタノイド受容体ファミリー、モルモットプロスタグランジンＤ２受容体の新規な構成要素を説明する。上記受容体、それらをコードする核酸、および、それら両方の様々な使用も説明する。
【選択図】 図２

Description

本発明は、概して、プロスタノイド受容体ファミリーのこれまで知られていない構成要素をコードする核酸分子に関する。
プロスタグランジン（ＰＧ）、プロスタサイクリンおよびトロンボキサンなどのプロスタノイドは、中枢および末梢の生理的作用の重要な媒介物質である。プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）は、脳、脾臓、肺、骨髄、胃、皮膚などの多種多様な組織で形成され、さらに、肥満細胞でも形成される（Ｌｅｗｉｓ等，１９８２年）。ＰＧＤ２は、中枢神経系および末梢組織の両方における多くの生理学的な事象に関与してきた。中枢神経系では、ＰＧＤ２は、睡眠の誘導、体温、嗅覚機能、ホルモン放出および痛覚に影響を与えることが示されている。末梢において、ＰＧＤ２は、免疫学的攻撃の後に肥満細胞から生産されたアラキドン酸の主要なシクロオキシゲナーゼ産物である。アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アレルギー性結膜炎、およびアトピー性皮膚炎を有する患者が局所的なアレルゲン攻撃を受けると、鼻および気管支の洗浄液、涙液および皮膚チャンバー液（ｓｋｉｎ ｃｈａｍｂｅｒ ｆｌｕｉｄ）におけるＰＧＤ２レベルの迅速な上昇を引き起こすことが示されている。ＰＧＤ２の主要な源である活性化された肥満細胞は、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性皮膚炎、およびその他の病気のような状態においてアレルギー性応答を引き起こす重要な要素の１つである（Ｂｒｉｇｈｔｌｉｎｇ等，２００３年）。同様に、ＰＧＤ２は、多くの炎症性の作用を有し、例えば、結膜および皮膚の血管透過性を高めたり、鼻の気道抵抗、気道狭窄、および結膜および気管への好酸球の浸潤を高めたりする。それゆえに、ＰＧＤ２は、炎症性の反応を引き起こす重要な要素の１つと考えられる。
初期の努力は、５種の天然に存在する生物活性プロスタノイド、ＰＧＤ2、ＰＧＥ2、ＰＧＦ2α、ＰＧＩ2およびＴＸＡ2に関するそれぞれの受容体を同定することに焦点が当てられ、それにより、それぞれプロスタノイド受容体の５種の基本型の分類：ＤＰ、ＥＰ、ＦＰ、プロスタサイクリン（ＩＰ）およびトロンボキサン（ＴＰ）受容体が得られた（Ｃｏｌｅｍａｎ等，１９９４年）。プロスタグランジンＤ２の作用の多くは、それらの、Ｄ型のプロスタグランジン受容体（ＤＰ）、Ｇタンパク質共役受容体に対する作用が介在する。元々、それぞれのプロスタノイドが選択的に個々の受容体に作用すると考えられていたなかで、プロスタノイドの生物学を研究する研究者は、これらのリガンドは異なる受容体ファミリーの種類とも相互作用するという無差別性を評価し始めた。従って、プロスタノイドのシグナル伝達を理解するためには、プロスタノイド受容体活性化の生物学的な結果を解明しなければならないことが、より一層はっきりとなりつつある。
ＤＰ受容体が特に興味深く、なぜなら、中枢および末梢細胞の両方に見出されるためであり、これは、様々な生物学的な経路の媒介に関与すること、その結果として、多くの病態において可能性のある治療上の重要性があることを示唆している。ＤＰ受容体は、脳で同定されており、ＰＧＤ2は、睡眠の誘導、体温、嗅覚機能およびホルモン放出に作用を有する（Ｎｅｇｉｓｈｉ等，１９９３年；Ｗｒｉｇｈｔ等，１９９９年、およびそこに記載されている参考文献）。また、ＤＰ受容体は、脊髄とは別個の細胞群にも局在している。この観察から、ＰＧＤ2により誘導された、痛覚過敏や異痛症（無害な触覚的な刺激による不快感）の一致しない作用を説明することも可能である。また、ＤＰ受容体は消化管にも存在し、消化管の収縮反応に関与している（Ｗｒｉｇｈｔ等，１９９９年；Ｉｔｏ等，１９８９年）。加えて、ＤＰ受容体のリガンドは、腸細胞の粘液分泌、および細
胞増殖を誘導することが示されている。また、肝臓での糖原形成も、ＤＰ受容体で調節される可能性がある（Ｉｔｏ等，１９８９年）。ＤＰ受容体は眼内に見出され、アゴニストが眼圧を減少させることから、緑内障における役割が示唆されている。血小板はＤＰ受容体を含み、さらに、ＰＧＤ2は、血小板凝集を阻害することが示されており、これは、血栓症のような血液疾患の調節におけるＤＰ受容体に関する役割を支持している（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，１９９６年）。従って、異なる臓器および組織における様々なＤＰ受容体の発現は、ＤＰ受容体は、様々な治療分野にとって魅力的な標的となり得ることを示唆している。
特に興味深いことに、ＤＰ受容体は、様々な炎症性疾患に関与しており、このような疾患としては、これらに限定されないが、喘息、アレルギー性鼻炎、気道の活動亢進、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、および慢性閉塞性肺疾患が挙げられる。これは、ＰＧＤ2が、免疫学的に攻撃された肥満細胞によって放出される主要なプロスタノイドであるという観察によって裏付けられる（Ｒｏｂｅｒｔｓ，等，１９８０年）。喘息において、気道上皮は、病気の進行を促進する炎症性サイトカインおよびケモカインの重要な源と認識されてきた（Ｈｏｌｇａｔｅ等，２０００年）。喘息の実験マウスモデルにおいて、ＤＰ受容体は、抗原での攻撃の際に気道上皮上で劇的にアップレギュレートされる（Ｍａｔｓｕｏｋａ等，２０００年）。逆に言えば、ＤＰ受容体欠失ノックアウトマウスでは、気道の活動亢進と慢性炎症が著しく減少しており（Ｍａｔｓｕｏｋａ等，２０００年）；これは、ヒト喘息の基本的な特徴のうちの２つである。同様に、ＤＰ受容体のアンタゴニストは、モルモット実験喘息モデルにおいて気道の炎症を減少させることが示されている（Ａｒｉｍｕｒａ等，２００１年）。また、ＤＰ受容体は、ヒトのアレルギー性鼻炎（くしゃみ、痒み、鼻漏および鼻のうっ血の症状を特徴とする頻繁に起こるアレルギー性の病気）に関与するとも考えられている。ＰＧＤ2の鼻への局所投与は、鼻のうっ血の用量依存的な増加を引き起こす（Ｄｏｙｌｅ等，１９９０年）。ＤＰアンタゴニストは、多数の種においてアレルギー性鼻炎の症状を緩和する点で有効であることが示されており、より具体的には、最も顕著なアレルギー性鼻炎の症状である抗原により誘導された鼻のうっ血を阻害することが示されている。また、ＤＰアンタゴニストは、アレルギー性結膜炎とアレルギー性皮膚炎の実験モデルにおいても有効である（Ａｒｉｍｕｒａ等，２００１年）。従って、ＤＰアンタゴニストは、多種多様なＰＧＤ２が介在する障害（例えば、これらに限定されないが、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、全身性肥満細胞症、および虚血再潅流傷害など）の治療において有用である可能性がある。
これまで、ＤＰ受容体は、ヒト（Ｂｏｉｅ等，１９９５年）、ラット（Ｗｒｉｇｈｔ等，１９９９年）、およびマウス（Ｈｉｒａｔａ等，１９９４年）からクローニングされている。これらのＤＰ受容体は、アミノ酸レベルで、ヒト、マウスおよびラット間で７３〜９０％の相同性を有しており、いずれの場合も、組換え受容体の活性化により、細胞内ｃＡＭＰの蓄積が起こる。一般的に、Ｇタンパク質共役受容体間で、化合物が、オルソログ受容体の種類に応じて様々な効力を示すことが観察されている。
本発明において初めて、モルモット由来のＤＰ受容体が開示される。本発明は、現在この技術分野で既知の利点を上回る数々の利点を提供する。ここでは、マウス、ラット、ヒトおよびモルモット間の種の差を、さらに十分に決定および特徴付けすることができる。天然型の組織において、ＤＰ受容体の発現レベルは低いため、化合物の、ＤＰ受容体のモジュレーター、エフェクター、アゴニストまたはアンタゴニストとしての活性の評価を困難にしている。ここで、本発明は、単離された状態、および精製された状態の受容体を試験する機会を提供し、それにより、化合物を試験し、続いてインビトロでの研究をインビボで同じ種に相互に関連付ける能力を提供することができる。モルモットは、大きさが大きいため、それより小さい齧歯類より好ましい動物モデルであり、例えば、皮膚病学や胃腸の研究についてより大きい表面領域を提供することができる。より重要なことには、モルモットは、いくつかのアレルギーモデル（例えば鼻のうっ血）での使用に最も適した小動物モデルであり、気道の活動亢進のマニピュレーションに対してはさらに感度が高い。モルモットは、上記の概略のような多数の疾患モデルにおけるＤＰ受容体のモジュレーターを評価するための理想的な前臨床モデルの代表であるにもかかわらず、モルモットＤＰ受容体のクローニングはこれまで報告されておらず、従って、このオルソログに対する化合物の親和性を予測することは難しい。
添付図面において：
図１は、本発明の受容体の核酸配列を示す（配列番号１）。
図２は、本発明の受容体のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。
図３は、多数の種間のＤＰ受容体のコード配列のアライメントを示す。網掛けをつけた残基は、正確に、モルモットの残基に相当する。Ｈｓ＝ヒト；Ｒｎ＝ラット；Ｍｍ＝マウス；および Ｃｐ＝モルモット。
図４は、多数の種間のＤＰ受容体のアミノ酸配列のアライメントを示す。網掛けをつけた残基は、正確に、モルモットの残基に相当する。Ｈｓ＝ヒト；Ｒｎ＝ラット；Ｍｍ＝マウス；Ｃｐ＝モルモット。
図５は、モルモット（Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）のＤＰ受容体のゲノムＤＮＡフラグメントの、ノーザンブロット解析を示す。レーン１：インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の０.２４〜９.５ＫｂのＲＮＡラダー；レーン２：攻撃されていないモルモット由来の肺トータルＲＮＡ；レーン３：オボアルブミンで攻撃されたモルモット由来の肺トータルＲＮＡ。
図６は、安定してトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３−Ｇα１６細胞で発現された組換えモルモットＤＰ受容体の、マウスのＤＰ受容体を用いて作製された同等の細胞系および親細胞系と比較したＰＧＤ２で誘導されたカルシウム動員の例を示す。
図７は、ＳＰＡｃＡＭＰ分析を用いた、安定してトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３−Ｇα１６細胞で発現された組換えモルモットＤＰ受容体のＰＧＤ２の用量反応曲線の例を示す。マウスのＤＰ受容体を用いて作製された同等の細胞系および親細胞系との比較を含む。
本発明は、プロスタノイド受容体ファミリー（ただし、必ずしもこれらに限定されない）に相当する、単離された核酸およびタンパク質の形態に関する。好ましい実施形態において、単離された核酸およびタンパク質は、モルモットＤＰ受容体に相当する。以下の節で、様々な本発明の形態をさらに詳細に説明する。
定義
本明細書で用いられる「核酸分子」は、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ」）、またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ」）、またはそれらのあらゆるリン酸エステル類似体、例えばホスホロチオエート、およびチオエステルのリン酸エステルの多量体型を意味し、一本鎖型または二本鎖へリックス型のいずれかである。このような核酸分子としては、デオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）、例えばゲノムＤＮＡ、および相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）（これらは、コードまたは非コード一本鎖または二本鎖である）、合成ＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）分子（これらは、一本鎖でもよいし、または二本鎖でもよい）、およびヌクレオチド類似体を用いて作製されたＤＮＡおよびＲＮＡの類似体が挙げられる。二本鎖ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、およびＲＮＡ：ＲＮＡヘリックスが考えられる。
本明細書で用いられる「単離された」または「精製された」核酸分子は、核酸の自然源中に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、「単離された」核酸は、核酸が誘導される生物のゲノムＤＮＡ中で、もともと上記核酸の端にある配列（すなわち、核酸の５’ および３’末端に位置する配列）（好ましくはタンパク質コード配列）を含まない。様々な実施形態において、単離された核酸分子は、本発明のヌクレオチド分子の端にあるヌクレオチド配列を、約５ｋｂ未満、４ｋｂ未満、３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０.５ｋｂ未満、または０.１ｋｂ未満で含んでいてもよい。例えば、これらの端にあるヌクレオチド配列とは、核酸が単離された細胞のゲノムＤＮＡ中で、もともとヌクレオチド分子の端にある配列であり得る。核酸は、その内因性の環境から実質的に分離された場合、単離されたと考えることができ、これらに限定されないが、ヌクレオチド配列解析、制限消化、部位特異的変異誘発、および発現ベクターへのサブクローニングのような当業者による操作を容易にすることができる。本核酸は、細胞全体で存在しているか、または細胞溶解産物中に存在していてもよいし、または部分的に精製された、または実質的に精製された形態で存在していてもよい。細胞から精製された核酸は、その他の細胞物質または培地を実質的に含まない。化学合成された核酸は、化学前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない場合、精製されている。
用語「組換え」は、ポリペプチドに関して用いられる場合、組換えポリヌクレオチド、すなわち、単離もしくは精製されたポリヌクレオチド（上記で定義したような）またはその天然型の状態ではない別の状態のポリヌクレオチドの、翻訳物から誘導されたポリペプチドを意味する。この用語は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターのいずれかを含む細胞内で発現されるポリペプチド、またはそのような細胞内に包含されるポリペプチドを含み、同様に、合成ポリペプチドも含む。
本明細書で用いられる用語「モジュレーター」は、本発明の受容体タンパク質の活性を調節する成分を意味する（例えば、ただしこれらに限定されないが、リガンドおよび候補化合物）。本発明のモジュレーターは、アゴニスト、パーシャルアゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニストであり得る。
本明細書で用いられる用語「アゴニスト」は、受容体に結合した場合、細胞内の反応を活性化する成分、または膜へのＧＴＰ結合を強化する成分を意味する（例えば、ただしこれらに限定されないが、リガンド、および候補化合物）。
本明細書で用いられる用語「パーシャルアゴニスト」は、受容体に結合した場合、アゴニストより低い度合い／程度に細胞内の反応を活性化する成分、またはアゴニストより低い度合い／程度に膜へのＧＴＰの結合を強化する成分を意味する（例えば、ただしこれらに限定されないが、リガンド、および候補化合物）。
本明細書で用いられる用語「アンタゴニスト」は、受容体にアゴニストと同じ部位で競合的に結合する成分を意味する（例えば、ただしこれらに限定されないが、リガンド、および候補化合物）。しかしながら、アンタゴニストは、受容体の活性型によって開始された細胞内の反応を活性化しないので、アゴニストまたはパーシャルアゴニストによる細胞内の反応を阻害することができる。関連する形態において、アンタゴニストは、アゴニストまたはパーシャルアゴニストの非存在下で、基準の細胞内の反応を減少させない。
本明細書で用いられる用語「インバースアゴニスト」は、構成的活性化受容体に結合し、細胞内の基準の反応を阻害する成分を意味する（例えば、ただしこれらに限定されないが、リガンド、および候補化合物）。この基準の反応は、受容体の活性型によって、アゴニストまたはパーシャルアゴニストの非存在下で観察される活性の正常な基準レベル
より低く開始されるか、または膜へのＧＴＰの結合を減少させる。
本明細書で用いられる用語「候補化合物」は、スクリーニング技術で処理することができる成分を意味する（例えば、ただしこれらに限定されないが、化学物質）。一実施形態において、この用語は、アゴニスト、パーシャルアゴニスト、インバースアゴニストまたはアンタゴニストからなる群より選択される化合物であることが公知の化合物を含まない。このような化合物は、受容体に特異的な内因性のリガンドの同定、および／または受容体に対する候補化合物のスクリーニング（このようなスクリーニングは、有効性を評価するために競合分析を必要とする）を含む従来の創薬法により同定されている。
本明細書で用いられる用語「構成的活性化受容体」または「自律的に活性な受容体」は、本明細書では同義的に用いられ、リガンドの非存在下で活性化される受容体を意味する。このような構成的活性化受容体は、内因性でもよいし、または内因性でなくてもよい（すなわち、ＧＰＣＲを組換え法によって改変し、野生型ＧＰＣＲの突然変異した構成的な形態を生産させることができる；例えば、ＥＰ１０７１７０１；ＷＯ００／２２１２９；ＷＯ００／２２１３１；および 米国特許第６,１５０,３９３号、および第６,１４０,５０９号を参照。これらは、参照によりそれらの全体を本明細書に加入する）。
本明細書で用いられる用語「構成的な受容体活性化」は、受容体と、内因性のリガンドまたはそれらの化学的な等価体との結合以外の手段による、活性状態での受容体の安定化を意味する。
本明細書で用いられる用語「リガンド」は、他方の分子に結合する成分を意味し、このような成分としては、これらに必ずしも限定されないが、ホルモンまたは神経伝達物質が挙げられ、さらに、受容体に立体選択的に結合する成分も挙げられる。
本明細書で用いられる用語「ファミリー」は、本発明のタンパク質または核酸分子について言われる場合、外見的に共通する構造ドメインを有し、さらに、本明細書で定義されるような十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列の同一性を有する２種またはそれ以上のタンパク質または核酸分子を意味するものとする。このようなファミリーを構成するものは、天然に存在するものでもよいし、同一または異なる種のいずれに由来していてもよい。例えば、ファミリーは、ヒト由来の第一のタンパク質、およびそのタンパク質のマウス由来の相同体、同様に、ヒト由来の第二の別個のタンパク質、およびその第二のタンパク質のマウスの相同体を含んでいてもよい。ファミリーを構成するものはまた、共通の機能的な特徴を有する場合もある。
本明細書で同義的に用いられる用語「活性」、「生物活性」および「機能的活性」は、標準的な技術に従ってインビボまたはインビトロで決定して応答細胞において本発明のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸分子によってもたらされる活性を意味する。活性は、直接的な活性、例えば第二のタンパク質との結合もしくは第二のタンパク質への酵素活性、または間接的な活性、例えば本発明のタンパク質と第二のタンパク質との相互作用が介在する細胞性のシグナル伝達活性、であり得る。特定の実施形態において、活性としては、これらに限定されないが、以下に示す少なくとも１つの、またはそれ以上の活性が挙げられる：（ｉ）シグナル伝達経路において、タンパク質と相互作用する能力；（ｉｉ）リガンドと相互作用する能力；および （ｉｉｉ）細胞内の標的タンパク質と相互作用する能力。
その上、本発明によれば、この技術分野の技術の範囲で、従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を用いることができる。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版（１９８９年）コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），コールドスプリングハーバー，ニューヨーク（本明細書では「Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９年」）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編．１９８５年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編．１９８４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５年）］；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）］；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６年）］；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬプレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ），（１９８６年）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）（１９９４年）を参照。
「ベクター」は、レプリコンであり、いくつか例を挙げれば、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドであり、これらにその他のＤＮＡセグメントを結合させ、結合されたセグメントの複製を起こすことができる。「レプリコン」は、インビボでＤＮＡ複製の自律的な単位として機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製できるあらゆる遺伝学的要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。以下に、ベクターの具体例を説明する。
「カセット」は、特異的な制限部位でベクターに挿入することができるＤＮＡのセグメントを意味する。このようなＤＮＡのセグメントは、対象のポリペプチドをコードしており、転写および翻訳に適したリーディングフレーム中にカセットが確実に挿入されるようにカセットと制限部位が設計される。
外因性または異種ＤＮＡが細胞の内部に導入されている場合、その細胞は、外因性または異種ＤＮＡで「トランスフェクション」されている。トランスフェクションされた外因性または異種ＤＮＡが表現型の変化に影響を与える場合、その細胞は、外因性または異種ＤＮＡで「形質転換」されている。好ましくは、形質転換されるＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに（共有結合で）統合される必要がある。
「異種」ＤＮＡは、もともとその細胞または細胞の染色体部位に存在しないＤＮＡを意味する。好ましくは、異種ＤＮＡは、細胞にとって外来の遺伝子を含む。
「相同組換え」は、ベクターの外来ＤＮＡ配列の染色体への挿入を意味する。特に、ベクターは、相同組換えに特異的な染色体部位を標的とする。特異的な相同組換えのために、ベクターは、相補的な結合やベクターの染色体への取り込みが可能になるように、染色体配列に対して相同な十分に長い領域を含むと予想される。相同な領域が長く、さらに配列類似性の程度が大きければ、相同組換え効率が高まる可能性もある。
単離された核酸分子
本発明の一形態は、本発明の受容体タンパク質、またはそれらの一部をコードする単離または精製された核酸分子に関する。本発明の核酸分子、またはその核酸配列の相補物は、標準的な分子生物学的な技術や、本発明で示される配列情報を用いて単離することができる。配列番号１の核酸配列の全部または一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を用いて本発明の核酸分子を単離することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９年）。配列番号１に対応するオリゴヌクレオチド、またはそれらの一部は、標準的な合成技術によって、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーを用いて製造することができる。本発明の核酸分子、またはその一部は、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、さらに適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することができる。
本発明の核酸分子は、配列番号１の一部を含んでいてもよい。本核酸フラグメントは、プローブまたはプライマーとして用いることができ、または本フラグメントは、タンパク質フラグメントをコードすることができ、このようなフラグメントは、受容体の生物学的に活性な部分（例えばリガンド結合ドメイン）でもよいし、そうでなくてもよい。例えば、７回膜貫通ドメイン中のアルギニンが、プロスタノイド分子のカルボキシル基の結合部位であり（Ｎａｒｕｍｉｙａ等，１９９３年）、さらに、マウスにおける２回膜貫通ドメインのＬｙｓ−７５およびＬｅｕ−８３は、リガンド結合特異性を付与することが提唱されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等，２０００年）。これらの２種の配列ストレッチは、プロスタノイドファミリーのＧＰＣＲのなかで特徴的に保存されていることがこれまでに報告されており（Ｈｉｒａｔａ等，１９９４年）、さらに、モルモットＤＰタンパク質：第二の細胞外ループ中のＱＹＣＰＧＴＷＣＲ、および７回膜貫通ドメイン中のＲＦＬＳＶＩＳＩＶＤＰＷＩＦＩ（全てのＤＰオルソログ間で同一）にも存在する。配列番号１のヌクレオチドの配列により、細胞、組織および器官における本発明の受容体または相同体の同定および／またはクローニングに使用するためのプローブおよびプライマーの作製が可能である。本オリゴヌクレオチドは、典型的には、配列番号１のセンスもしくはアンチセンス配列、または配列番号１の天然に存在する突然変異体もしくは人工の突然変異体の、少なくとも１０、好ましくは約１２、より好ましくは２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、または４００個の連続するヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列の領域を含む。プローブは、それらに結合された標識基、例えば、放射線同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子を含んでいてもよい。プローブは、本核酸をコードする細胞または組織を同定するため、ｍＲＮＡレベルを検出するため、またはゲノム遺伝子が突然変異または欠失しているかどうかを決定するためのキットの一部であってもよい。
本発明はさらに、配列番号１に９０％相同な単離された核酸分子も包含する。実質的に相同な配列は、配列データバンクで利用可能な標準的なソフトウェアをデフォルトパラメーターで用いて配列を比較すること、またはサザンハイブリダイゼーション実験で、例えばその特定のシステムに応じて定義されるようなストリンジェントな条件下で配列を比較することによって同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、この技術分野の技術の範囲である。例えば、上記のＭａｎｉａｔｉｓ等；上記のＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻；上記のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを参照。
個体群内に、天然の対立遺伝子変異によるＤＮＡ配列の多型が存在する可能性がある。対立遺伝子は、所与の遺伝子座でオルタナティブに発生する１つの遺伝子群である。本明細書で用いられる用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、本発明の受容体タンパク質、好ましくはモルモット受容体タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を意味する。本明細書で用いられる語句「対立遺伝子変異体」は、その遺伝子の遺伝子座に存在するヌクレオチド配列、またはそのヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドを意味する。オルタナティブな対立遺伝子は、多数の様々な個体における対象の遺伝子を配列解析することによって同定することができる。このようなヌクレオチドの変異およびその結果生ずるアミノ酸の多型または変異のあらゆる全てのものは天然の対立遺伝子変異の結果であり、本発明の受容体の機能的な活性を変化させないあらゆる全てのものは本発明の範囲内であるものとする。
「生物学的に活性な」または「生物学的に関連する」部分をコードする核酸フラグメントは、配列番号１の本発明の受容体の生物活性を有するポリペプチドをコードする部分を単離することによって製造することができる。例えば、リガンド−結合ドメインまたはシグナル伝達ドメインの受容体タンパク質のコードされた部分を発現させ（例えば、インビトロでの組換え発現で）、次に、その受容体のコードされた部分の活性を評価すること、である。本発明はさらに、遺伝子コードの縮重により配列番号１のヌクレオチドの配列とは異なる核酸分子も包含し、従ってこれは、配列番号１のヌクレオチドの配列によってコードされたタンパク質と同じタンパク質をコードする。例えば、発明者等は、２種の可能性のあるＮ−グリコシル化部位、アミノ末端中のＡｓｎ−７、および第一の細胞外ループ中のＡｓｎ−８６を同定している。加えて、２種の可能性のあるプロテインキナーゼＣリン酸化部位で、それぞれ第一および第三の細胞質内ループに位置するＳｅｒ−４６およびＴｈｒ−１４０も存在する。
天然に発生する対立遺伝子変異体に加えて、特定のアミノ酸をコードする様々なコドンに相当な量の重複があることは、当業者既知である。従って、本発明は、配列番号２と同一のアミノ酸配列またはそれらの一部のアミノ酸配列の最終的な翻訳物をコードする、オルタナティブなコドンを含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列またはそのようなオルタナティブなコドンをコードするＲＮＡ配列に向けられる。この技術分野で周知であるが、以下のコドンは、同じ意味で用いられ、それぞれの特定のアミノ酸をコードすることができる：
フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ） ＵＵＵまたはＵＵＣ
ロイシン（ＬｅｕまたはＬ） ＵＵＡまたはＵＵＧまたはＣＵＵまたはＣＵＣまたはＣＵＡまたはＣＵＧ
イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ） ＡＵＵまたはＡＵＣまたはＡＵＡ
メチオニン（ＭｅｔまたはＭ） ＡＵＧ
バリン（ＶａｌまたはＶ） ＧＵＵまたはＧＵＣまたはＧＵＡまたはＧＵＧ
セリン（ＳｅｒまたはＳ） ＵＣＵまたはＵＣＣまたはＵＣＡまたはＵＣＧまたはＡＧＵまたはＡＧＣ
プロリン（ＰｒｏまたはＰ） ＣＣＵまたはＣＣＣまたはＣＣＡまたはＣＣＧ
スレオニン（ＴｈｒまたはＴ） ＡＣＵまたはＡＣＣまたはＡＣＡまたはＡＣＧ
アラニン（ＡｌａまたはＡ） ＧＣＵまたはＧＣＧまたはＧＣＡまたはＧＣＧ
チロシン（ＴｙｒまたはＹ） ＵＡＵまたはＵＡＣ
ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ） ＣＡＵまたはＣＡＣ
グルタミン（ＧｌｎまたはＱ） ＣＡＡまたはＣＡＧ
アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ） ＡＡＵまたはＡＡＣ
リシン（ＬｙｓまたはＫ） ＡＡＡまたはＡＡＧ
アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ） ＧＡＵまたはＧＡＣ
グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ） ＧＡＡまたはＧＡＧ
システイン（ＣｙｓまたはＣ） ＵＧＵまたはＵＧＣ
アルギニン（ＡｒｇまたはＲ） ＣＧＵまたはＣＧＣまたはＣＧＡまたはＣＧＧまたはＡＧＡ、またはＡＧＧ
グリシン（ＧｌｙまたはＧ） ＧＧＵまたはＧＧＣまたはＧＧＡまたはＧＧＧ
トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ） ＵＧＧ
終止コドン ＵＡＡまたはＵＡＧまたはＵＧＡ。
当然ながら、上記で特定されたコドンは、ＲＮＡ配列に関する。それに対応するＤＮＡのコドンは、ＵをＴで置換したものである。
さらに当業者であれば当然と思われるが、コードされたタンパク質の生物活性を変化させることなく、配列番号１に突然変異によって変化を導入してもよい。「非必須」アミノ酸残基は、生物活性を変化させることなく野生型配列（例えば配列番号２の配列）から変更することができる残基であり、それに対して「必須」アミノ酸残基は、生物活性に必要である。従って、数種の種間で保存されていないアミノ酸残基、または一部しか保存されていないアミノ酸残基は、非必須の可能性があり、変更の有望な標的である。本発明のその他の形態は、活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含む本発明のタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列の点では異なるが、生物活性を保持している。配列番号２の配列とは異なる配列を有するタンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号１のヌクレオチドの配列に１またはそれ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することによって作製することができる。
突然変異は、標準的な技術（例えば、部位特異的変異誘発、およびＰＣＲによって媒介される変異誘発）によって導入することができる。好ましくは、同類アミノ酸置換は、１またはそれ以上の推定の非必須のアミノ酸残基で作製される。「同類アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、この技術分野で定義されている。例えば、ファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐した側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。下記の「実施例３」で示される、モルモットの配列をヒト、ラットおよびマウスと比較したモルモット受容体の配列解析により、非必須アミノ酸の選択の指針が示される。従って、推定の非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーのその他のアミノ酸残基で置換されると予測される。あるいは、突然変異は、コード領域、またはそれらの一部に、例えば飽和突然変異誘発によってランダムに導入し、それにより生じた突然変異体を生物活性に関してスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定することができる。変異誘発に続いて、コードされたタンパク質を組換えによって発現させ、タンパク質の活性を決定することができる。好ましい実施形態において、このような突然変異タンパク質は、タンパク質：タンパク質の（例えばプロスタノイドシグナル伝達経路中のタンパク質との）相互作用を形成する能力；リガンド（例えば、プロスタノイド受容体に結合するリガンド）に結合する能力；または細胞内の標的タンパク質に結合する能力に関して分析することができる。本発明はまた、診断、治療または予防的用途のための天然型もしくは突然変異タンパク質、またはタンパク質フラグメントに関し、さらに、アゴニスト、アンタゴニスト、または受容体の機能のモジュレーターをスクリーニングするのに有用であると予測される。
ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するペプチドの特性と異なる特性（例えば、リガンド結合ドメインの親和性が変化していること、またはシグナル伝達経路が調節されていること）を有するタンパク質がコードされるように改変されていてもよい。本発明はまた、配列番号１の核酸配列、またはそれらの一部の、タンパク質の生物活性を改変させる変更に関する。
単離された核酸分子のハイブリダイゼーション
適切な温度および溶液のイオン強度の条件下で、核酸分子の一本鎖型が、その他の核酸分子にアニールできる場合、その核酸分子は、その他の核酸分子（例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ）に「ハイブリダイゼーション可能」である（上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等を参照）。温度およびイオン強度条件により、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決定される。低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、Ｔmが５５℃（例えば、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０.１％ＳＤＳ、０.２５％ミルク、およびホルムアミドなし；または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳ）に相当する。中度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いＴm（例えば、４０％ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣで）に相当する。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴm（例えば、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣで）に相当する。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補配列を含むことが必要だが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが存在してもよい。核酸のハイブリダイゼーションに適切なストリンジェンシーは、核酸の長さ、および相補性の程度依存し、これらはこの技術分野で周知の可変値である。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きければ大きいほど、その配列を有する核酸のハイブリッドに関するＴm値もますます大きくなる。核酸のハイブリダイゼーションの、相対的な安定性（より高いＴmに相当する）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順で減少する。長さが１００個より大きいヌクレオチドのハイブリッドについて、Ｔmを計算するための方程式が、得られている（上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等，９.５０〜９.５１を参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションについて、ミスマッチの位置がより重要なり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等，１１.７〜１１.８を参照）。ハイブリダイゼーション可能な核酸分子の最小限の長さは、少なくとも約２０個のヌクレオチド；具体的には少なくとも約３０個のヌクレオチド；より具体的には少なくとも約４０個のヌクレオチド、さらにより具体的には約５０個のヌクレオチド、およびさらにより具体的には少なくとも約６０個のヌクレオチドである。
特定の実施形態において、用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、５５℃のＴmを意味し、さらに、上述の条件を利用する。好ましい実施形態において、Ｔmは６０℃であり；より好ましい実施形態において、Ｔmは、６５℃である。
本発明の特定の実施形態において、ハイブリダイゼーション可能な本発明の核酸分子は、長さが、少なくとも３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、または１０００個のヌクレオチドであり、さらに、ストリンジェントな条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列、好ましくはコード配列、それらの相補物、またはそれらのフラグメントを含む核酸分子にハイブリダイゼーションする。用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件であって、その条件下で、互いに、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、および好ましくは７５％、またはそれ以上相補的なヌクレオチド配列が、典型的にはハイブリダイゼーションしたままであることをいうものとする。このようなストリンジェントな条件は当業者既知であり、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，ジョン・ワイリー＆サンズ，ニューヨーク（１９８９年），６．３．１〜６．３．６に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の、好ましいが非限定的な例は、６×ＳＳＣ中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１回またはそれ以上の洗浄である。好ま
しくは、配列番号１の配列、またはそれらの相補物にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に相当する。本明細書で用いられる「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列（例えば、天然タンパク質をコードする）を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を意味する。当業者であれば当然と思われるが、このような条件は、配列特異的な可変値（例えば、長さ、Ｇ−Ｃの豊富さなど）に応じて改変されていてもよい。その他の実施形態において、配列番号１の配列の一部にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする本発明の単離された核酸分子は、プローブまたはプライマーとして用いることができる。このようなプローブ／プライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このようなオリゴヌクレオチドは、典型的には、配列番号１のセンスまたはアンチセンス配列、または配列番号１の天然に存在する突然変異体の、少なくとも約１２、好ましくは約２５、より好ましくは約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、または４００個の連続するヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列の領域を含む。
アンチセンス核酸分子
本発明は、アンチセンス核酸分子を包含し、すなわち、タンパク質をコードするセンス核酸に相補的な（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的な、またはｍＲＮＡ配列に相補的な）分子を包含する。アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合できる。アンチセンス核酸は、配列番号１の核酸配列全体に相補的でもよいし、またはそれらの部分に相補的でもよい。本明細書で開示されたコード鎖配列（例えば、配列番号１）の場合、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソンとクリックの塩基対形成の規則に従って設計することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個のヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、この技術分野で既知の手法を用いた化学合成、および酵素によるライゲーション反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的な安定性を高める、またはアンチセンスとセンス核酸とで形成された二重鎖の物理的な安定性を高めるように設計された様々な化学的に修飾されたヌクレオチドを用いて化学合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体、ホスホン酸誘導体、およびアクリジンで置換されたヌクレオチドを用いることができる。
アンチセンス核酸を生成するのに用いることができる修飾ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ6−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ6−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸は、本核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされている発現ベクター（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、対象の標的核酸に対してアンチセンス方向であると予想される）を用いることによって、生物学的に生産することができる。
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、対象に投与されるか、またはインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で生成させ、その結果、本発明のタンパク質をコードする細胞性のｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイゼーションさせるかまたはそれらに結合させることによって、転写および／または翻訳を阻害しタンパク質の発現を阻害することができる。ハイブリダイゼーションは、従来のヌクレオチド相補性によるものが可能であり、それにより、安定な二重鎖を形成することができ、または例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主溝におけるまたは調節領域への特異的相互作用を介するものが可能である。
本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的とするように改変してから全身投与することができる。例えば、全身投与のためには、アンチセンス分子は、選択された細胞表面で発現される受容体または抗原に特異的に結合するように改変することができ、これは、例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結させることによってなされる。また、アンチセンス核酸分子は、本明細書で説明されているベクターを用いて細胞に送達することもできる。十分なアンチセンス分子の細胞内濃度を達成するためには、アンチセンス核酸分子が強いｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクターコンストラクトが好ましい。
本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー性の核酸分子であり得る。α−アノマー性の核酸分子は、相補的ＲＮＡとの特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、そこで、鎖が互いに平行に配置される（Ｇａｕｌｔｉｅｒ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８７年）１５：６６２５〜６６４１）。また、アンチセンス核酸分子は、メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８７年）１５：６１３１〜６１４８）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ（１９８７年）２１５：３２７〜３３０）を含んでいてもよい。
リボザイム
本発明はまた、リボザイムも包含する。リボザイムは、リボザイムにハイブリダイゼーションする一本鎖の核酸（例えばｍＲＮＡ）を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性のＲＮＡ分子である。従って、リボザイム（例えばハンマーヘッド型リボザイム（Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ等，Ｎａｔｕｒｅ（１９８８年）３３４：５８５〜５９１）で説明されている）を用いて、核酸転写物を触媒的に切断することによって配列番号１に対応するｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。配列番号１の核酸への特異性を有するリボザイムを、配列番号１のヌクレオチドの配列に基づいて設計することができる。例えば、テトラヒメナＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体は、報告されている配列番号１の核酸配列（米国特許第４,９８７,０７１号、および５,１１６,７４２号、この開示は、参照により開示に加入させる）に基づき、活性部位のヌクレオチド配列が切断しようとするヌクレオチド配列に相補的になるように構築することができる。あるいは、配列番号１の核酸配列を用いて、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性のＲＮＡを選択することができる。（Ｂａｒｔｅｌ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３年）２６１：１４１１〜１４１８。
三重らせん核酸分子およびペプチド核酸
本発明はまた、三重らせん構造を形成する核酸分子も包含する。例えば、配列番号１の調節領域（例えば、プロモーター、および／またはエンハンサー領域）に相補的なヌク
レオチド配列を標的にして、標的細胞における遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を形成することによって、遺伝子発現を阻害することができ、一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ（１９９１年）６（６）：５６９；Ｈｅｌｅｎｅ Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（１９９２年）６６０：２７；および Ｍａｈｅｒ，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ（１９９２年）１４（１２）：８０７を参照。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、塩基成分、糖成分またはリン酸主鎖において改変することができ、例えば、安定性、ハイブリダイゼーション、または分子の溶解性を改善することができる。例えば、本核酸のデオキシリボースリン酸主鎖は、ペプチド核酸を生成するように改変することができる（Ｈｙｒｕｐ等，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６年）４：５を参照）。本明細書で用いられる用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、核酸ミミック、例えばＤＮＡミミックを意味しており、これは、デオキシリボースリン酸主鎖がプソイドペプチド主鎖で置換され、４種の天然の核酸塩基だけが残存したものである。ＰＮＡの中性主鎖は、低いイオン強度の条件下で、ＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、上記のＨｙｒｕｐ等（１９９６年）；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９６年）９３：１４６７０で説明されているような標準的な固相ペプチド合成プロトコールを用いて行うことができる。
ＰＮＡは、治療的および診断的な用途で用いることができる。例えばＰＮＡは、例えば転写もしくは翻訳の停止を誘導したり、または複製を阻害したりすることによって、遺伝子発現を配列特異的に調節するためのアンチセンスまたはアンチジーン物質として用いることができる。また、本発明のＰＮＡも用いることができる。例えば、ＰＮＡは、例えばＰＮＡに向けられたＰＣＲクランピングによる遺伝子中の一塩基対突然変異解析で；その他の酵素、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼと併用される場合、人工制限酵素として（上記のＨｙｒｕｐ等（１９９６年））、またはＤＮＡ配列やハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして（上記のＨｙｒｕｐ等（１９９６年）；上記のＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ等（１９９６年））用いることができる。
その他の実施形態において、本発明のＰＮＡは、例えば、親油性またはその他の補助的な基をＰＮＡに結合させることによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームもしくはこの技術分野で既知のその他のドラッグデリバリー技術の使用によって、安定性、特異性または細胞取込みを強化するように改変してもよい。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、上記のＨｙｒｕｐ等（１９９６年），Ｆｉｎｎ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９９６年）２４（１７）：３３５７〜６３，Ｍａｇ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８９年）１７：５９７３；およびＰｅｔｅｒｓｅｒ等，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ（１９７５年）５：１１１９で説明されているように行うことができる。
ＲＮＡ／核酸干渉
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）または核酸干渉（ＮＡｉ）は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）が介在する配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。このプロセスは、進化上保存された防御メカニズムと考えられており、それによって、例えばウイルス感染の結果として、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）が生産され、ダイサーと称されるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を刺激する（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ等，２００１年，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。例えば、ダイサーは、ｄｓＲＮＡをｓｉＲＮＡに加工する。ダイサーは、翻訳の制御に関与する２１および２２ヌクレオチドからなる低分子の一時的なＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切り出しに関与する可能性もある。また、ＲＮＡｉ応答は、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的な配列を有する標的の一本鎖ＲＮＡを切断する、エンドヌクレアーゼ複合体、ＲＮＡで誘導されたサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にも関与する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ等，２００１年，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５：１８８）。効率的なＲＮＡｉまたはＮａｉに関する長さ、構造、化学組成および配列に基づく、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡまたはｄｓＮＡの最適な設計は当業者既知である（例えば、以下を参照：ＣｈｉｕおよびＲａｎａ等，２００３年，ＲＮＡ ９：１０３４〜４８；Ｅｌｂａｓｈｉｒ等，２００１年；Ｐａｒｉｓｈ等，２０００年；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０７０７４４、ＷＯ０１／７５１６４、ＷＯ０１／６８８３６、ＷＯ０１／４９８４４、ＷＯ０１／３６６４６、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ００／４４９１４、ＷＯ００／０１８４６、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ９９／０７４０９、ＷＯ９９／５３０５０；カナダ国特許出願第２,３５９,１８０号、この開示は、参照により開示に加入させる）。活性を改善するための、ｓｉＮＡまたはｄｓＮＡへの可能性のある改変のいくつかとしては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：３’末端ジヌクレオチドのオーバーハング、ｓｉＮＡ鎖の一方または両方の２’−デオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）での置換、ｓｉＮＡ二重鎖の３’末端ヌクレオチドのオーバーハングしたセグメントのデオキシリボヌクレオチドでの置換、リン酸−糖主鎖、またはヌクレオシドのいずれかを修飾して、ｄｓＲＮＡコンストラクト中に、窒素または硫黄ヘテロ原子、２’−アミノまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、および２’−Ｏまたは４’−Ｃメチレン架橋を含むヌクレオチドを少なくとも１つを含ませること、センスおよびアンチセンス鎖中の５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、および３−（アミノアリル）ウラシルを置換すること。ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６８８３６では、内因的に誘導されたｄｓＲＮＡを用いて遺伝子発現を弱める方法が説明されている。さらに、ＲＮＡｉを目的としたｍＲＮＡは、１つの細胞型における遺伝子を標的とする新しいｄｓＲＮＡの５’から３’への合成のためのテンプレートとして作用し、別個の細胞型で発現された第二の遺伝子のＲＮＡｉ介在サイレンシング（二次的な（ｔｒａｎｓｉｔｉｖｅ）ＲＮＡｉという現象）を引き起こす可能性があることが示唆されている（Ａｌｄｅｒ等，２００３年 ｒｎａ ９：２５）。
タンパク質
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、それらの変異体、それらのフラグメント、またはそれらの類似体もしくは誘導体も包含する。
配列番号２の配列とは異なる配列を有する、本発明のタンパク質をコードする単離された核酸分子（例えば変異体）は、配列番号１のヌクレオチドの配列に、１またはそれ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を、１またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされたタンパク質に導入されるように導入することによって作製することができる。例えば、第一および第三の細胞内ループのアミノ酸は、モルモットＤＰタンパク質において、それぞれ３個および５個短いが、それに対して、マウス、ヒトおよびラットのＤＰタンパク質において、これらの細胞内ループはいずれも、同一の大きさである。配列番号２の変異体は、その他のオルソログのいずれかに見出される１またはそれ以上のヌクレオチドを挿入することによって作製することができる。
特定の実施形態において、本発明の突然変異タンパク質は：（１）シグナル伝達経路中のタンパク質とのタンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力；（２）リガンドと結合する能力；（３）細胞内の標的タンパク質に結合する能力、または（４）細胞の増殖、細胞分化または細胞の反応を調節する能力、に関して分析することができる。
本発明の天然タンパク質は、細胞または組織源から、標準的なタンパク質精製技術を用いた適切な精製スキームによって単離することができる。あるいは、本発明のタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって容易に生産することができる。さらにその他の代わりの実施形態は、標準的なペプチド合成技術を用いた本発明のタンパク質またはポリペプチドの化学合成である。
本発明のタンパク質の生物学的に活性な部分またはフラグメントは、配列番号２のアミノ酸配列に十分に同一のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列を含むペプチドを含み、これは、本発明の全長タンパク質より少ないアミノ酸を含み、本発明のタンパク質の少なくとも１つの活性を示す。典型的には、生物学的に活性な部分は、本発明のタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。例えば、本発明のタンパク質の生物学的に活性なフラグメントは、プロスタノイドファミリーのＧＰＣＲのなかで特徴的に保存されていることがこれまで報告されており（Ｈｉｒａｔａ等，１９９４年）、さらに、モルモットＤＰタンパク質にも存在する２つの配列ストレッチ：第二の細胞外ループ中のＱＹＣＰＧＴＷＣＲ、および７回膜貫通ドメイン中のＲＦＬＳＶＩＳＩＶＤＰＷＩＦＩを含んでいてもよい。本発明のタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００個またはそれ以上のアミノ酸からなるポリペプチドであってもよい。特定の生物学的に活性なポリペプチドは、本発明のタンパク質の同定された構造ドメインの１またはそれ以上を含む。さらに、その他の生物学的に活性な部分（ここにおいて、タンパク質のその他の領域が欠失している）は、組換え技術によって製造することができ、本発明のタンパク質の機能的な活性の１種またはそれ以上について評価することができる。本発明の生物学的に関連する部分に対するさらなる指針は、下記の「実施例３」に示す。
その他の有用なタンパク質は、配列番号２に実質的に同一であり、配列番号２のタンパク質の機能的な活性を保持するが、天然の対立遺伝子変異または変異誘発によってアミノ酸配列が異なるものである。例えば、このようなタンパク質およびポリペプチドは、本明細書で説明されている生物活性の少なくとも１つを有する。従って、本発明の有用なタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも約６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一であり、配列番号２タンパク質の機能的な活性を保持するアミノ酸配列を含むタンパク質である。
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の同一性パーセントを決定するために、それらの配列は、最適な比較のために並べられる（例えば、第一のアミノ酸または核酸配列の配列に、第二のアミノまたは核酸配列とを最適に並べるためにギャップを導入することができる）。次に、それぞれ対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列における位置が、第二の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、その分子は、その位置では同一であるとされる。２つの配列間の同一性パーセントは、配列が共有する同一な位置の数の関数である（すなわち、同一性パーセント＝同一な位置の数／位置総数（例えば、オーバーラップする位置）×１００）。一実施形態において、２つの配列は、同じ長さである。
２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的なアルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学的なアルゴリズムの具体的な非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９０年）８７：２２６４であって、Ｋａｒｌｉｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９３年）９０：５８７３〜５８７７に記載のように改変されたアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏ（１９９０年）２１５：４０３）に組み込まれている。比較のためのギャップ有りアライメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９９７年）２５：３３８９で説明されているようなギャップ有りＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、分子間の距離関係を検出する繰り返しのサーチを行うためには、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いることができる。上記のＡｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９７年）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ有りＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ、およびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる（http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照）。配列の比較のために利用される数学的なアルゴリズムのその他の具体的な非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ等，ＣＡＢＩＯＳ（１９８８年）４：１１〜１７に記載のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティー（ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）、および４のギャップペナルティーを用いてもよい。
２つの配列間の同一性パーセントは、上記で説明されているものと類似した技術を用いて、ギャップ有り、または無しで決定することができる。同一性パーセントの計算においては、正確なマッチのみをカウントする。
本発明はさらに、本発明のキメラまたは融合タンパク質も包含する。本明細書で用いられる、本発明の「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、「本発明のポリペプチド以外のポリペプチド」に機能するように連結した配列番号２のポリペプチドを含む。「本発明のポリペプチド」は、配列番号２に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。「本発明のポリペプチド以外のポリペプチド」は、配列番号２に実質的に同一ではないタンパク質、例えば、本発明のタンパク質とは異なり、同じ生物または異なる生物から誘導されるタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。本発明の融合タンパク質中で、本発明のポリペプチドは、配列番号２の全部または一部、好ましくは配列番号２の生物学的に活性な部分の少なくとも１つに相当するものでよい。融合タンパク質中で、用語「機能するように連結した」とは、本発明のポリペプチドと、本発明のポリペプチド以外のポリペプチドとがインフレームで互いに融合していることを意味するものとする。本発明のポリペプチド以外のポリペプチドは、本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合していてもよい。有用な融合タンパク質の一つは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を利用しており、ここにおいて、本発明のポリペプチドは、ＧＳＴのＣ末端に融合している。このような融合タンパク質は、本発明の組換えポリペプチドの精製を容易にすることができる。
その他の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、免疫グロブリン融合タンパク質も包含し、これは、配列番号２の全部または一部が免疫グロブリンタンパク質ファミリーの構成要素から誘導された配列に融合している。本発明の免疫グロブリン−融合タンパク質を医薬組成物に包含させ、これを対象に投与することによって、細胞表面上でのリガンドと本発明の受容体タンパク質との相互作用を阻害し、それによって、生体内で受容体介在シグナル伝達を抑制することができる。本発明の免疫グロブリン−融合タンパク質を用いて、本発明の受容体と同源のリガンドの生物学的利用率に影響を与えることができる。リガンド−受容体相互作用の阻害は、例えば、これらに限定されないが、睡眠、体温、嗅覚機能、ホルモン放出、痛み、消化管の障害、肝臓病、眼病、例えば緑内障、血液疾患、例えば血栓症、炎症性疾患、例えば、これらに限定されないが、喘息、アレルギー性鼻炎、気道の活動亢進、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、および慢性閉塞性肺疾患などの治療または調節において治療上有用な可能性がある。その上、本発明の免疫グロブリン−ポリペプチド融合タンパク質は、免疫原として用いることができ、それにより、対象中で抗体を産生させたり、リガンドを精製したりでき、本発明の受容体とリガンドとの相互作用を阻害する分子を同定するためのスクリーニング分析で用いることもできる。
特定の実施形態において、本発明のキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術で生産される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来技術に従ってインフレームで一緒にライゲーションさせるが、これは例えば、ライゲーションのために平滑末端化された、またはジグザグ状の（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ）末端を用いて、制限酵素消化によって適切な末端を得て、必要に応じて付着末端を充填し、望ましくない結合を防ぐためにアルカリホスファターゼで処理し、酵素的ライゲーションすることによってなされる。その他の実施形態において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡシンセサイザーなどの従来技術によって合成することができる。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２個の連続する遺伝子フラグメント間の相補的なオーバーハングを発生させるアンカープライマーを用いて行うことができ、このアンカープライマーは、その後、アニールして、再び増幅してキメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ等を参照）。その上、融合成分（例えばＧＳＴポリペプチド）をすでにコードしてある多くの発現ベクターが市販されている。本発明のポリペプチドまたはそれらの部分をコードする核酸は、融合成分がインフレームで本発明のタンパク質に連結されるように、このような発現ベクターにクローニングすることができる。
核酸およびタンパク質変異体
上述したように、本発明はさらに、配列番号１および配列番号２の変異体も包含する。例えば、突然変異は、標準的な技術（例えば部位特異的変異誘発、およびＰＣＲによって媒介される変異誘発）を用いて、配列番号１のアミノ酸配列に導入することができる。その上、保存的アミノ酸置換は、１またはそれ以上の推定の非必須のアミノ酸残基で作製することができる。「同類アミノ酸置換」の一つは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている置換である。例えば、１またはそれ以上のアミノ酸が、機能的な等価体として作用し、サイレントな変化を生じる類似の極性を有するその他のアミノ酸で置換されていてもよい。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内でのアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスのその他のものから選択されてもよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。芳香環構造を含むアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンである。極性で中性のアミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正電荷を有する（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが挙げられる。負電荷を有する（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が挙げられる。このような変更は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点で決定されるような見かけの分子量に影響を与えないと思われる。
特に好ましい置換は以下の通りである：
−Ａｒｇの代わりにＬｙｓ（逆もまた同様）、これは、正電荷を維持することができる；−Ａｓｐの代わりにＧｌｕ（逆もまた同様）、これは、負電荷を維持することができる；−Ｔｈｒの代わりにＳｅｒ、これは、遊離の−ＯＨを維持することができる；および
−Ａｓｎの代わりにＧｌｎ、これは、遊離のＮＨ2を維持することができる。
合成（すなわち天然に存在しない）アミノ酸を用いてさらに置換してもよい。
また、アミノ酸置換は、特に好ましい特性を有するアミノ酸で置換するために導入してもよい。例えば、Ｃｙｓは、その他のＣｙｓとのジスルフィド架橋の可能性のある部位に導入してもよい。Ｈｉｓは、特定の「触媒」部位として導入してもよい（すなわち、Ｈｉｓは、酸または塩基として作用することができ、生化学的な触媒作用において最も一般的なアミノ酸である）。Ｐｒｏは、その特に平面的な構造を有するため導入してもよく、それにより、タンパク質の構造にβ−ターンが誘導される。
また、突然変異は、例えば飽和突然変異誘発によって、配列番号１コードの配列の全部または一部にランダムに導入してもよく、得られた突然変異体は、生物活性に関してスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定することができる。変異誘発に続いて、コードされたタンパク質を組換えによって発現させることができ、そのタンパク質の活性を決定することができる。
本発明の変異体は、アゴニスト（模倣剤）として、またはアンタゴニストとして機能することができる。本発明のタンパク質の変異体は、変異誘発によって、例えば、個々の点変異、または本発明のタンパク質のトランケーションによって作製できる。本発明のタンパク質のアゴニストは、本発明の天然に存在するタンパク質の実質的に同じ生物活性、またはそれらの部分的な生物活性を保持させることができる。アンタゴニストは、本発明のタンパク質を含む細胞性のシグナル伝達カスケードの下流または上流の構成要素に競合的に結合することができ、従って、本発明のタンパク質の天然に存在する形態の活性の１またはそれ以上を阻害することができる。従って、機能が限定された変異体で処理することによって特異的な生物学的作用を誘発することができる。本発明のタンパク質の天然に存在する形態の部分的な生物活性を有する変異体での対象の治療は、このタンパク質の天然に存在する形態での治療に比べて、対象における副作用をより少なくできる。
アゴニスト（模倣剤）またはアンタゴニストのいずれかとして機能する本発明のタンパク質の変異体は、突然変異体（例えば本発明のタンパク質のトランケーション突然変異体）のコンビナトリアルライブラリーを、アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関してスクリーニングすることによって同定することができる。一実施形態において、本発明のタンパク質の変異体の多彩なライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によって作製され、それらは、多彩な遺伝子ライブラリーによってコードされる。変異体の多彩なライブラリーは、例えば、本発明の可能性のある核酸配列の縮重群が、個々のポリペプチドとして、あるいは、本発明の配列群を含むより大きい融合タンパク質群（例えば、ファージディスプレイ用）として発現されるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列に酵素でライゲーションすることによって生産することができる。ディジェネレート（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）オリゴヌクレオチド配列から本発明の可能性のある変異体のライブラリーを生産するのに用いることができる多種多様な方法がある。ディジェネレート遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡシンセサイザーで行うことができ、次に、その合成遺伝子は、適切な発現ベクターにライゲーションされる。遺伝子のディジェネレート群の使用は、１つの混合物で、本発明の可能性のある核酸配列の望ましい群をコードする配列の全てを提供することを可能にする。ディジェネレートオリゴヌクレオチドを合成する方法は、この技術分野で既知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９８３年）３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ等，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８４年）５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４年）１９８：１０５６；Ｉｋｅ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ（１９８３年）１１：４７７を参照）。
加えて、タンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、スクリーニング、それに続く本発明のタンパク質の変異体の選択のための多彩なフラグメント群を生成することができる。一実施形態において、コード配列フラグメントのライブラリーは、本発明のコードの配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、１分子あたり約１回のみの割合でニックが生じる条件下でヌクレアーゼで処理し、その二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを再生させて、二本鎖ＤＮＡを形成し（この二本鎖ＤＮＡは、異なるニックの入った産物からのセンス／アンチセンス対を含む可能性がある）、再形成された二重鎖からＳ１ヌクレアーゼ処理によって一本鎖部分を除去し、およびそれにより生じたフラグメントライブラリーを発現ベクターにライゲーションさせることによって作製することができる。この方法により、本発明のタンパク質のＮ末端と様々なサイズの内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを得ることができる。
点突然変異またはトランケーションによって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物に関するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための数種の技術がこの技術分野で既知である。このような技術は、本発明のタンパク質のコンビナトリアル変異誘発によって作製された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。最も広く用いられている大規模遺伝子ライブラリーのスクリーニングのためのハイスループット解析で処理することができる技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングすること、適切な細胞をそれにより生じたベクターのライブラリーで形質転換すること、および望ましい活性の検出によって、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。反復組み合わせ変異誘発（Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；ＲＥＭ）は、ライブラリー中の機能的な突然変異体の頻度を高める技術であり、これをスクリーニング分析と併用して、本発明の変異タンパク質を同定することができる（Ａｒｋｉｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９２年）８９：７８１１〜７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ等，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９３年）６（３）：３２７〜３３１）。
本発明のタンパク質の類似体および誘導体
さらに本発明は、化学修飾によって生産された本発明のタンパク質の誘導体または類似体も含む。本発明のタンパク質は、１またはそれ以上の化学成分をタンパク質成分に結合させることによって誘導体化されてもよい。
誘導体化に適した化学成分は、水性の環境（例えば生理学的な環境）で類似体または誘導体が沈殿しないような水溶性ポリマーから選択されてもよい。場合により、このようなポリマーは、製薬上許容できるものであろう。当業者であれば、ポリマー／成分結合体が治療に用いられるかどうかという考察、さらに、用いられる場合、望ましい用量、循環時間、タンパク質分解への耐性、およびその他の考察に基づき望ましいポリマーを選択することができると思われる。本発明のタンパク質について、これらは、本明細書で示された分析を用いて確認してもよい。本発明で適切な水溶性ポリマーの例としては、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／マレイン酸無水物コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー、またはランダムコポリマーのいずれか）、デキストラン、ポリ（−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールまたはポリビニルアルコールが挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中における安定性のために、製造において利点を有する場合がある。
このようなポリマーは、あらゆる分子量のものでよく、分岐状でもよいし、または非分岐状でもよい。ポリエチレングリコールに関して、好ましい分子量は、取り扱いや製造を容易にするために、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａである（用語「約」は、ポリエチレングリコールの製造において、いくつかの分子は、指定された分子量よりも大きくなったりいくらか小さくなったりすることを示す）。望ましい治療上のプロフィル（例えば、望ましい持続放出の持続時間、もしあれば生物活性に対する作用、取り扱いの容易さ、抗原性の程度またはそれらがないこと、および治療用タンパク質または類似体に対するその他の既知のポリエチレングリコールの作用）に応じて、その他の大きさのものを用いてもよい。
そのようにして本発明のタンパク質に結合したポリマー分子の数は、様々であってよく、当業者であれば、機能に対する作用を確認することができると予想される。一種類で誘導体化されていてもよいし、または同一または異なる化学成分で二種類、三種類、四種類またはそれ以上の組み合わせでの誘導体化を提供してもよい（例えば、様々な質量のポリエチレングリコールのようなポリマー）。ポリマー分子の本発明のタンパク質分子に対する比率、同様に、それらの反応混合物中の濃度は、様々であると予想される。一般的に、最適な比率（過量の未反応成分およびポリマーが存在しないような反応効率の観点で）は、望ましい誘導体化の程度（例えば、一種類、二種類、三種類での誘導体化など）、選択されたポリマーの分子量、ポリマーが分岐状か、または非分岐状か、および反応条件のような要素によって決定することになる。
このようなポリエチレングリコール分子（またはその他の化学成分）は、機能的なドメインまたは抗原性ドメインに対する作用を考慮して、本発明のタンパク質に結合させることになる。当業者が利用可能な多数の結合方法があり、例えば、ＥＰ０４０１３８４（参照により本明細書に加入する）（ＰＥＧをＧ−ＣＳＦにカップリングすること）であり、また、Ｍａｌｉｋ等，１９９２年，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８〜１０３５（塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告している）も参照できる。例えば、ポリエチレングリコールは、反応性基（例えば遊離のアミノまたはカルボキシル基）を介してアミノ酸残基に共有結合していてもよい。反応性基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合することができる基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては、リシン残基、およびＮ末端のアミノ酸残基が挙げられる；遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ末端のアミノ酸残基が挙げられる。また、ポリエチレングリコール分子を結合させるための反応性基として、スルフヒドリル基を用いてもよい。アミノ基での結合、例えばＮ末端またはリシン基での結合が、治療目的として好ましい。
Ｎ末端で化学修飾された本発明のタンパク質が特に要求される場合がある。本発明の組成物の説明として、ポリエチレングリコールを使えば、多種多様なポリエチレングリコール分子（分子量、分岐などによって）、反応混合物中のポリエチレングリコール分子の本発明のタンパク質分子に対する比率、実施しようとするペグ化反応のタイプ、および選択されたＮ末端がペグ化されたタンパク質を得る方法から選択することができる。Ｎ末端がペグ化された調製物を得る方法（すなわち、必要に応じて、この成分を、その他のモノペグ化された成分から分離すること）は、ペグ化したタンパク質分子群からＮ末端がペグ化された材料を精製することによってなされ得る。選択的なＮ末端化学修飾は、誘導体化に利用可能な異なるタイプの第一級アミノ基（リシン対Ｎ末端）の差分の反応性を利用する還元的アルキル化によって達成してもよい。適切な反応条件下で、カルボニル基を含むポリマーを用いたＮ末端での実質的に選択的な誘導体化が達成される。例えば、リシン残基のε−アミノ基のｐＫaとＮ末端残基のα−アミノ基のｐＫaとの差分の利点が得られるようなｐＨで反応を行うことによって、本発明のタンパク質を選択的にＮ末端でペグ化することもできる。このような選択的な誘導体化によって、水溶性ポリマーの本発明のタンパク質への結合は制御される：ポリマーとの結合がＮ末端で優勢に起こり、その他の反応性基（例えばリシン側鎖のアミノ基）の顕著な修飾は起こらない。還元的アルキル化を用いると、水溶性ポリマーは上述のタイプのものであってもよく、本発明のタンパク質へのカップリングのための単一の反応性アルデヒドを有することになる。単一の反応性アルデヒドを含むポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを用いてもよい。
抗体
本発明の単離されたタンパク質、またはそれらの部分もしくはフラグメントを免疫原として用いて、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体製造のための標準的な技術を用いて本発明のタンパク質に結合する抗体を生成することができる。用語「抗体」は、本明細書で用いられる場合、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に
活性な部分、すなわち、本発明のタンパク質またはそれらのフラグメントのような抗原に特異的な（すなわちそれらに結合する）抗原−結合部位を含む分子を意味する。本発明のタンパク質に特異的に結合する分子とは、サンプル中で、例えばもともと本発明のタンパク質を含む生物学的サンプル中で、本発明のタンパク質には結合するが、実質的にその他の分子とは結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、Ｆ(ab)、およびＦ(ab')2フラグメントが挙げられ、これらは、抗体をペプシンのよ
うな酵素で処理することによって生成させることができる。本発明は、免疫原として、本発明のタンパク質、それらの変異体、それらのフラグメント、またはそれらの類似体もしくは誘導体を有する、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびキメラ抗体を提供する。ヒトの病気または障害の治療に使用するためには、キメラ抗体が好ましく、これは、ヒト抗体またはヒト化抗体は、異種抗体に比べて、免疫反応（特にアレルギー性応答）をそれ自身極めて誘導しにくいためである。
本発明の全長タンパク質を用いることができ、あるいは、本発明は、免疫原として使用するための、本発明の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。本発明の抗原性ペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の少なくとも８個（好ましくは１０、１５、２０、３０個、またはそれ以上）のアミノ酸残基を含み、さらに、本発明の抗原性ペプチドは、このペプチドに対して生産された抗体が本発明のタンパク質との特異的な免疫複合体を形成するようにエピトープを包含する。
免疫原は、典型的には、適切な対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、またはその他の哺乳動物）を免疫原で免疫化することによって抗体を製造するのに用いられる。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換えによって発現された本発明のタンパク質、または本発明の化学合成されたポリペプチドを含んでいてもよい。このような調製物はさらに、アジュバント、例えばフロイント完全または不完全アジュバント、または類似の免疫刺激剤を含んでいてもよい。免疫原性調製物を用いた適切な対象の免疫化は、本発明のタンパク質に対して向けられたポリクローナル抗体反応を誘導する。
本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはキメラ抗体であり得る。用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書で用いられるように、本発明のタンパク質の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原−結合部位を１種のみ含む抗体分子群を意味する。従って、モノクローナル抗体組成物は、典型的には、本発明のタンパク質の特定のエピトープに対して単一の結合親和性を提示する。
ポリクローナル抗体は、上述のように適切な対象を本発明の免疫原で免疫化することによって製造することができる。免疫化された対象における抗体のタイターは、標準的な技術によって、例えば固定された本発明のタンパク質を用いた酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって長期にわたってモニターすることができる。必要に応じて、本発明のタンパク質に対して向けられた抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離することができ、周知の技術、例えばプロテインＡクロマトグラフィーでさらに精製することもでき、それにより、ＩｇＧ分画を得ることができる。免疫化後の適切な時点で、例えば、抗体のタイターが最高になった時点で、対象から抗体生産細胞を得ることができ、標準的な技術によってモノクローナル抗体を製造するのに用いられ、このような技術としては、例えば、最初にＫｏｈｌｅｒ等により説明されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ（１９７５年）２５６：４９５〜４９７）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ等，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ（１９８３年）４：７２）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ等，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９８５年），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７〜９６頁）、またはトリオーマ技術が挙げられる。ハイブリドーマを生産するテクノロジーは周知である（一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４年）Ｃｏｌｉｇａｎ等編，ジョン・ワイリー＆サンズ社，ニューヨーク，ニューヨーク州を参照）。簡単に言えば、不死化細胞系（典型的には骨髄腫）を上述のような本発明の免疫原で免疫化された哺乳動物由来のリンパ球（典型的には脾細胞）に融合させ、それにより生じたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、本発明のタンパク質と結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを同定することができる。
リンパ球および不死化細胞系を融合させるのに用いられる多くの周知のプロトコールのいずれかが、モノクローナル抗体を作製する目的で適用可能である（例えば、上記のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇａｌｆｒｅ等，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７年）２６６：５５０〜５５２；Ｋｅｎｎｅｔｈ，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，プレナム・パブリッシング社（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．），ニューヨーク，ニューヨーク州（１９８０年）；およびＬｅｒｎｅｒ，Ｙａｌｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ（１９８１年）５４：３８７〜４０２を参照）。その上、通常の熟練者には当然と思われるが、このような方法の多くの変法があり、これらもまた、有用と予測される。典型的には、不死化細胞系（例えば、骨髄腫細胞系）は、リンパ球と同じ哺乳動物種から誘導される。例えば、マウスのハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫化されたマウス由来のリンパ球と、不死化したマウス細胞系、例えばヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性のある骨髄腫細胞系とを融合させることによって作製できる。多数の骨髄腫細胞系のいずれかを、標準的な技術に従って融合パートナーとして用いることができ、例えば、Ｐ３−ＮＳ１／ｌ−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３、またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇｌ４骨髄腫系が挙げられる。このような骨髄腫系はＡＴＣＣより入手可能である。典型的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いてマウス脾細胞に融合される。次に、融合していない、および非生産的にしか融合していない骨髄腫細胞を死滅させるＨＡＴ培地を用いて、この融合により生じたハイブリドーマ細胞を選択する（融合していない脾細胞は形質転換されていないため、数日後に死滅する）。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なＥＬＩＳＡ分析を用いて、ハイブリドーマの培養上清を、本発明のタンパク質に結合した抗体についてスクリーニングすることによって検出される。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを製造する代わりに、モノクローナル抗体を同定し、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）を、本発明のタンパク質でスクリーニングすることによって単離してもよく、それによって、免疫グロブリンライブラリーのうち本発明のタンパク質に結合する種類を単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを作製しスクリーニングするためのキットが市販されている（例えば、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の組換えファージ抗体システム，カタログ番号２７−９４００−０１；およびストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の「ＳＵＲＦＺＡＰ」ファージディスプレイキット，カタログ番号２４０６１２）。
加えて、抗体ディスプレイライブラリーを作製しスクリーニングするのに特に使用しやすい方法および試薬の例が当業者既知である。（例えば、Ｆｕｃｈｓ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１年）９：１３７０ １３７２；Ｈａｙ等，Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（１９９２年）３：８１ ８５；Ｈｕｓｅ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９年）２４６：１２７５〜１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等，ＥＭＢＯ Ｊ（１９９３年）２５（１２）：７２５〜７３４；米国特許第５,２２３,４０９号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１７２７１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２０７９１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１５６７９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０１２８８；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０１０４７；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０９６９０；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０２８０９、この開示は、参照により本明細書に加入する）。
その上、ヒト部分および非ヒト部分の両方を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗体は、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、この技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術によって生産することができる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０２６７１；欧州特許出願第１８４,１８７号；欧州特許出願第１７１,４９６号；欧州特許出願第１７３,４９４号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４,８１６,５６７号；欧州特許出願第１２５,０２３号；Ｂｅｔｔｅｒ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８年）２４０：１０４１〜１０４３；Ｌｉｕ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８７年）８４：３４３９〜３４４３；Ｌｉｎ等，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８７年）１３９：３５２１〜３５２６；Ｓｕｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８７年）８４：２１４〜２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ等，Ｃａｎｃ Ｒｅｓ（１９８７年）４７：９９９〜１００５；Ｗｏｏｄ等，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５年）３１４：４４６〜４４９；Ｓｈａｗ等，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（１９８８年）８０：１５５３〜１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５年）２２９：１２０２〜１２０７；Ｏｉ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８６年）４：２１４；米国特許第５,２２５,５３９号；Ｊｏｎｅｓ等，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６年）３２１：５５２〜５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８年）２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒ等，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８８年）１４１：４０５３〜４０６０；で説明されている方法を用いて生産され、この開示は、参照により開示に加入させる）。
ヒト患者の治療的処置には、完全ヒト抗体が特に望ましい。このような抗体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現することはできないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて生産することができる。このようなトランスジェニックマウスは、一般的な方式で、選択された抗原、例えば本発明のタンパク質の全部または一部で免疫化される。このような抗原に対して向けられたモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスによって保持されているヒト免疫グロブリントランスジーンは、Ｂ細胞の分化の際に再編成され、その後クラススイッチおよび体細胞変異を受ける。従って、このようなエピトープを用いて、例えば本発明のタンパク質の活性を阻害する抗体は同定される。非ヒト抗体の重鎖および軽鎖は、クローニングされ、ファージディスプレイＦabフラグメントを作製するのに用いる。例えば、重鎖遺伝子は、重鎖が細菌から分泌されるようにプラスミドベクターにクローニングすることができる。軽鎖遺伝子は、軽鎖がファージ表面で発現されるように、ファージコートタンパク質遺伝子にクローニングすることができる。ファージに融合したヒト軽鎖のレパートリー（ランダムなコレクション）を用いて、非ヒト重鎖を発現する細菌を感染させることができる。それにより生じた後代のファージは、ハイブリッド抗体（ヒト軽鎖／非ヒト重鎖）を提示する。選択された抗原は、パンニングによるスクリーニングで用いられ、選択された抗原に結合するファージを選択することができる。このようなファージを同定するために数回の選択が必要な場合もある。
ヒト軽鎖遺伝子は、選択された抗原に結合する選択されたファージから単離される。次に、選択されたヒト軽鎖遺伝子は、以下のようにヒト重鎖遺伝子の選択を先導するのに用いられる。細菌による発現のために、選択されたヒト軽鎖遺伝子をベクターに入れる。選択されたヒト軽鎖を発現する細菌を、ファージに融合したヒト重鎖のレパートリーで感染させる。それにより生じた後代のファージは、ヒト抗体（ヒト軽鎖／ヒト重鎖）を提示する。
次に、選択された抗原は、選択された抗原に結合するファージを選択するために、パンニングによるスクリーニングで用いられる。選択されたファージは、もともと選択された非ヒトモノクローナル抗体によって認識された同じエピトープを認識する、完全ヒト抗体を提示する。重鎖および軽鎖の両方をコードする遺伝子を単離し、ヒト抗体の生産ために、さらに操作することができる。このようなテクノロジーは、Ｊｅｓｐｅｒｓ等によって説明されている（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４年）１２：８９９〜９０３）。
抗体（例えば、モノクローナル抗体）を用いて、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術によって本発明のタンパク質を単離することができる。本発明のタンパク質に対して向けられた抗体は、細胞からの天然タンパク質の精製、および宿主細胞で発現された組換えによって生産されたタンパク質の精製を容易にすることができる。その上、抗体を用いて、本発明のタンパク質（例えば、細胞の溶解産物または細胞上清中の）を検出し、タンパク質の存在量やそれらの発現パターンを評価することができる。例えば、所与の治療計画の有効性を決定するために、抗体を用いて、臨床試験手法の一環として、組織中のタンパク質レベルを診断的にモニターすることができる。抗体を検出可能な物質（以下に説明される）にカップリングすることによって、検出を容易にすることができる。
検出可能な標識
場合により、本発明の単離された核酸分子、本発明のポリペプチド、および本発明の抗体、同様に、このような成分のフラグメントは、検出可能に標識されていてもよい。適切な標識としては、酵素、発蛍光団（極く一部の発蛍光団であるが例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）、ローダミン、遊離の、またはキレート化ランタニド系の塩、特にＥｕ3+）、発色団、放射性同位体、キレート剤、色素、コロイド金、ラテックス粒子、リガンド（例えばビオチン）、生物発光物質、および化学発光物質が挙げられる。コントロールマーカーが用られる場合、受容体とコントロールマーカーに同一または異なる標識を用いてもよい。
放射標識、例えば同位体3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、36Ｃｌ、51Ｃｒ、57Ｃｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ、90Ｙ、125Ｉ、131Ｉ、および186Ｒｅが用いられる例において、既知の現在利用可能なカウント法を利用してもよい。標識が酵素の例において、検出は、現在利用されているこの技術分野で既知の比色、分光光度技術、蛍光分光光度技術、電流滴定技術またはガス定量技術のいずれかによって達成してもよい。
直接的な標識は、本発明に従って用いることができる検出可能な標識の一例である。直接的な標識とは、ある存在がその天然状態で、肉眼で、または光学フィルターおよび／もしくは加えられた刺激（例えば、蛍光を発生させる紫外線光）の補助を用いてのいずれかで容易に確認できるものと定義されている。本発明に従って用いることができる着色標識の例としては、金属製のゾル粒子、例えば、金ゾル粒子、例えば、Ｌｅｕｖｅｒｉｎｇ（米国特許第４,３１３,７３４号）で説明されているもの；色素ゾル粒子、例えば、Ｇｒｉｂｎａｕ等（米国特許第４,３７３,９３２号）、およびＭａｙ等（ＷＯ８８／０８５３４）で説明されているもの；着色されたラテックス、例えば、上記のＳｎｙｄｅｒ（ＥＰ−Ａ０ ２８０ ５５９、および０ ２８１ ３２７）で説明されているものであり得る；またはリポソームにカプセル封入された色素、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ等（米国特許第４,７０３,０１７号）で説明されているもの、が挙げられる。その他の直接的な標識としては、放射性ヌクレオチド、蛍光成分、または発光成分が挙げられる。これらの直接的な標識手段に加えて、酵素を含む間接的な標識も、本発明に従って用いることができる。様々なタイプの酵素結合イムノアッセイがこの技術分野で周知であり、例えば、アルカリホスファターゼ、およびホースラディッシュペルオキシダーゼ、リゾチーム、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼが挙げられ、これら、およびその他のものは、Ｅｖａ ＥｎｇｖａｌｌのＥｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ＥＬＩＳＡ ａｎｄ ＥＭＩＴ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７０．４１９〜４３９，１９８０年）、および米国特許第４,８５７,４５３号で詳細に考察されている。
本発明で使用するためのその他の検出可能な標識としては、磁気ビーズ、または磁気共鳴イメージング標識が挙げられる。
その他の実施形態において、本発明の単離されたポリペプチド、本発明の抗体、またはそれらのフラグメントに、32Ｐで標識するためのリン酸化部位を、例えば、欧州特許第０３７２７０７号で説明されているように作製することができる。
本明細書で例示されたように、抗体などのタンパク質は、代謝標識で検出可能に標識することができる。代謝標識は、代謝標識（例えば［35Ｓ］−メチオニン、または［32Ｐ］−オルトリン酸塩）が追加された培地の存在下で、タンパク質を発現する細胞をインビトロでインキュベートする際に発生する。［35Ｓ］−メチオニンでの代謝（または生合成）標識に加えて、本発明はさらに、［14Ｃ］−アミノ酸および［3Ｈ］−アミノ酸での（非不安定性の位置で置換されたトリチウムで）標識も考慮する。
抗体は、上記で列挙した標識に加えて、抗体によって認識可能な抗原性ペプチドタグを用いてさらに検出してもよい。例えば、ＨＡタグ、およびＦＬＡＧ(R)タグが挙げられる。
組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のその他の形態は、配列番号１をコードする核酸またはその部分を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。上述したように、一つのタイプのベクターは、「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーション可能な環状の二本鎖ＤＮＡループを意味する。その他のタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーション可能なウイルスベクターである。ある種のベクターは、宿主細胞中で自律的な複製が可能である（例えば、細菌性の複製起点を有する細菌性ベクター、およびエピソームの哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソームの哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに統合され、それによって、宿主ゲノムと同調して複製される。さらに、発現ベクターは、それらに機能するように連結した遺伝子の発現を指示することができる。一般的に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、プラスミド（ベクター）の形態であることが多い。しかしながら、本発明は、このような発現ベクターの、同等の機能を提供するその他の形態、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損型レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含むものとする。
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸分子を、宿主細胞中での本核酸の発現に適した形態で含む。これは、本発明の組換え発現ベクターが、発現に用いられる宿主細胞に基づき選択された、発現される核酸に機能するように連結した１またはそれ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターのなかでも、「機能するように連結した」は、対象のヌクレオチド配列の発現が可能になるような方式で（例えば、インビトロでの転写／翻訳システム中に、またはベクターが宿主細胞に導入される場合、宿主細胞中に）、対象のヌクレオチド配列が調節配列に連結していることを意味するものとする。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、およびその他の発現調節因子（例えば、ポリアデニル化シグナル）などを含むものとする。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第１８５巻，アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），サンディエゴ，カリフォルニア州（１９９０年）で説明されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的な発現を指示するものが挙げられる（例えば、組織特異的な調節配列）。当業者には当然と思われるが、発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現レベルなどのような要因に応じて様々であってよい。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、本明細書で説明されたような核酸によってコードされたタンパク質またはペプチドを生産させることができる。
本発明の組換え発現ベクターは、原核または真核細胞、例えば細菌細胞、例えばＥ．コリ、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いて）、酵母細胞、または哺乳動物細胞中で、配列番号１またはそれらの部分を発現させるために設計することができる。適切な宿主細胞は、上記のＧｏｅｄｄｅｌでさらに考察されている。あるいは、組換え発現ベクターは、インビトロで、例えば、ファージ調節因子、およびタンパク質、例えばＴ７プロモーター、および／またはＴ７ポリメラーゼを用いて、転写および翻訳することができる。
原核生物中でのタンパク質の発現は、ほとんどの場合、Ｅ．コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）中で、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターを用いて行われる。融合ベクターは、そこでコードされたタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、典型的には、以下の３つの目的に役立つ：１）組換えタンパク質の発現を増加させる；２）組換えタンパク質の溶解性を増加させる；および３）親和性による精製でリガンドとして作用することによって、組換えタンパク質の精製を促進する。しばしば、融合発現ベクターに、タンパク質分解的切断部位が融合成分の継ぎ目に導入されることがあり、それにより、組換えタンパク質は、融合成分からの組換えタンパク質の分離、それに続く融合タンパク質精製を可能にする。このような酵素、および同源の認識配列としては、Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが挙げられる。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（ファルマシア・バイオテク社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ）；Ｓｍｉｔｈ等，Ｇｅｎｅ（１９８８年）６７：３１〜４０）、ｐＭＡＬ（ニューイングランドバイオラボ，ビバリー，マサチューセッツ州）、およびｐＲＩＴＳ（ファルマシア，ピスカタウェイ，ニュージャージー州，これは、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合する）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡ（それぞれ標的の組換えタンパク質に対する）が挙げられる。
適切な誘導型の非融合性Ｅ．コリ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ等，Ｇｅｎｅ（１９８８年）６９：３０１〜３１５）、およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ等，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，アカデミック・プレス，サンディエゴ，カリフォルニア州（１９９０年）１８５：６０〜８９）が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主のＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。
Ｅ．コリにおける組換えタンパク質発現を最大にする方策の一つは、タンパク質分解によって組換えタンパク質を切断する機能が損なわれた宿主中でタンパク質を発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，アカデミック・プレス，サンディエゴ，カリフォルニア州（１９９０年）１８５：１１９〜１２８）。その他の方策は、各アミノ酸に関する個々のコドンがＥ．コリで選択的に利用されるものになるように、発現ベクターに挿入しようとする核酸分子の核酸配列を改変することである（Ｗａｄａ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９９２年）２０：２１１１〜２１１８）。このような本発明の核酸配列の変更は、標準的なＤＮＡ合成技術で行うことができる。
その他の実施形態において、本発明の発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母、例えばＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉ等，ＥＭＢＯ Ｊ（１９８７年）６：２２９〜２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ等，Ｃｅｌｌ（１９８２年）３０：９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ等，Ｇｅｎｅ（１９８７年）５４：１１３〜１２３）、ｐＹＥＳ２（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、サンディエゴ，カリフォルニア州）、およびｐＰｉｃＺ（インビトロジェン社，サンディエゴ，カリフォルニア州）が挙げられる。
あるいは、配列番号１またはその部分は、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞で発現させることができる。培養した昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）中でのタンパク質発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ等，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８３年）３：２１５６〜２１６５）、およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９年）１７０：３１〜３９）が挙げられる。
さらにその他の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物細胞中で、哺乳動物発現ベクターを用いて発現される。ここで適切な哺乳動物発現ベクターの例としては、これらに必ずしも限定されないが、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７年）３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ等，ＥＭＢＯ Ｊ（１９８７年）６：１８７〜１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞で用いられる場合、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節因子によって提供されることが多い。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０から誘導される。原核および真核細胞の両方に適したその他の発現系については、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等の第１６章および１７章を参照。
その他の実施形態において、本発明の組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において選択的に本核酸の発現を指示することができる（例えば、組織特異的な調節因子が、本核酸を発現させるのに用いられる）。組織特異的な調節因子はこの技術分野で既知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ等，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ（１９８７年）１：２６８〜２７７）、リンパ球特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ等，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８８年）４３：２３５〜２７５）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ等，ＥＭＢＯ Ｊ（１９８９年）８：７２９〜７３３）、および免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉ等，Ｃｅｌｌ（１９８３年）３３：７２９〜７４０；Ｑｕｅｅｎ等，Ｃｅｌｌ（１９８３年）３３：７４１〜７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８９年）８６：５４７３〜５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５年）２３０：９１２〜９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、ミルクホエイプロモーター；米国特許第４,８７３,３１６号、および欧州特許出願番号２６４,１６６）が挙げられる。また、発生学的に調節されたプロモーターも包含され、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０年）２４９：３７４〜３７９）、およびα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ等，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ（１９８９年）３：５３７〜５４６）が挙げられる。前述の参考文献のそれぞれの開示は、この参照により本明細書に加入する。
本発明はさらに、発現ベクターにアンチセンス方向でクローニングした本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、このＤＮＡ分子は、本発明のｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現を可能にする方式で（ＤＮＡ分子の転写によって）調節配列に機能するように連結している。アンチセンス方向でクローニングされた核酸に機能するように連結した調節配列は、多種多様な細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を指示するものを選択することができる。例えば、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー、または調節配列は、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的または細胞型特異的な発現を指示するものを選択することができる。このようなアンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化ウイルスの形態が可能であり、それにおいて、高効率の調節領域の制御下でアンチセンス核酸が生産され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定することができる。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節に関する考察については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ等（Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第１巻（１）１９８６年）を参照。
本発明のその他の形態は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書において同じ意味で用いられる。当然ながら、このような用語は、特定の対象の細胞だけでなく、このような細胞の後代または可能性のある後代も意味する。連続的な生殖中に、ある種の改変が突然変異または環境の影響のいずれかによって起こり得るため、このような後代は、実際には親細胞と同一でない可能性があるが、それでもなお、本明細書で用いられる用語の範囲内に含まれる。
宿主細胞は、あらゆる原核または真核細胞であり得る。例えば、本発明のタンパク質は、細菌細胞、例えばＥ．コリ、昆虫細胞、酵母、または哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、２９３細胞、またはＣＯＳ細胞）で発現させることができる。その他の適切な宿主細胞は当業者既知である。ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって、原核または真核細胞に導入することができる。本明細書で用いられる用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための、多種多様なこの技術分野で認められている技術を意味するものとし、例えば、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウムの共沈殿、形質導入、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションなどが挙げられる。
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションに関して、用いられる発現ベクターおよびトランスフェクション技術によるが、ごくわずかの細胞の分画しか、外来ＤＮＡをゲノムに統合できないことが既知である。その成分を同定し選択するために、一般的に、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性について）をコードする遺伝子が、対象の遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好ましい選択マーカーとしては、薬物耐性を与えるものが挙げられ、例えばＧ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキセートである。選択マーカーをコードする核酸は、配列番号１またはそれらの部分をコードするベクターと同じベクターで、宿主細胞に導入してもよいし、または選択マーカーをコードする核酸は、別個のベクターで導入してもよい。例えば、導入された核酸で安定してトランスフェクションされた細胞は、薬物による選択によって同定することができる（例えば、選択マーカー遺伝子を包含する細胞は、その他の細胞が死滅する一方で生き残ると予想される）。
培養中の本発明の宿主細胞、例えば原核または真核宿主細胞を用いて、本発明のタンパク質を生産（すなわち発現）させることができる。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いることによって配列番号２またはそれらの部分を生産する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、本発明の宿主細胞（そこに、配列番号１をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を、本発明のタンパク質が生産されるような適切な培地中で培養することを含む。その他の実施形態において、本方法は、本発明のタンパク質を培地または宿主細胞から単離することをさらに含む。
その他の実施形態において、本発明は、改変された発現ベクターにサブクローニングされたその他のタンパク質の組換え発現のための誘導型の発現系を含む。例えば、突然変異Ｇタンパク質を含む宿主細胞（例えば、酵母細胞、Ｙ２副腎皮質の細胞、およびｃｙｃ-Ｓ４９、米国特許第６,１６８,９２７号Ｂ１、５,７３９,０２９号、および５,４８２,８３５号；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９２年）８９（１９）：８９３３〜３７、およびＫａｔａｄａ等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８４年）２５９（６）：３５８６〜９５を参照）は、配列番号１をコードする核酸配列を含む第一の発現ベクターで形質導入され、ここで、配列番号２が、宿主細胞中で機能的に発現される。発現された本発明のタンパク質が構成的に活性だとしても、突然変異によってシグナル伝達が不可能になる；すなわち、Ｇタンパク質下流のカスケードに向けられた活性化が起こらない（例えば、アデニリルシクラーゼ活性化が起こらない）。その後、第二の発現ベクターを用いて、配列番号１を含む宿主細胞を形質導入することができる。第二のベクターは、誘導型システムによって発現される対象の遺伝子に加えて、宿主細胞のＧタンパク質の突然変異を補う構造遺伝子を含む（すなわち、機能的な哺乳動物または酵母Ｇs、Ｇi、ＧoもしくはＧq、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／４８８２０；米国特許第６,１６８,９２７号Ｂ１、５,７３９,０２９号および５,４８２,８３５号を参照、これらは、参照によりそれらの全体を本明細書に加入する）。このような第二のベクターの相補的構造遺伝子は、誘導型である；すなわち、外から加えられた成分（例えば、テトラサイクリン、ＩＰＴＧ、低分子物質など、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等を参照）の制御下相補的構造遺伝子に機能するように連結したプロモーターを活性化する。誘導物質が添加されると、相補的構造遺伝子によってコードされたタンパク質が機能的に発現され、そこで本発明の構成的に活性なタンパク質が複合体を形成することによって適切な下流の経路の活性化（例えば、第２メッセンジャー形成）が起こるようになる。第二のベクターを含む対象の遺伝子は、適切な第２メッセンジャー（例えば、ＣＲＥＢ、ＡＰ１要素）によって活性化される機能するように連結したプロモーターを有する。従って、第２メッセンジャーが蓄積されるにつれて、対象の遺伝子から上流のプロモーターが活性化され、前記遺伝子の産物を発現する。誘導物質が存在しない場合、対象の遺伝子の発現は起こらなくなる。
特定の実施形態において、誘導型の発現系のための宿主細胞としては、これらに限定されないが、Ｓ４９（ｃｙｃ-）細胞が挙げられる。Ｇタンパク質突然変異を含む細胞系も考慮されるが、適切な突然変異体は、人工的に生産／構築されてもよい（酵母細胞については、米国特許第６,１６８,９２７号Ｂ１、５,７３９,０２９号、および５,４８２,８３５号を参照）。
関連する形態において、上記細胞は、配列番号２に記載のタンパク質をコードする配列を含むｃＤＮＡに機能するように連結したベクターでトランスフェクションされる。前記システムを含む第一および第二のベクターが考慮され、例えば、これらに限定されないが、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７年）３２９：８４０）、並びにｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ等，ＥＭＢＯ Ｊ（１９８７年）６：１８７〜１９５）、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉ等，ＥＭＢＯ Ｊ（１９８７年）６：２２９〜２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ等，Ｃｅｌｌ（１９８２年）３０：９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ等，Ｇｅｎｅ（１９８７年）５４：１１３〜１２３）、ｐＹＥＳ２（インビトロジェン社，サンディエゴ，カリフォルニア州）およびｐＰｉｃＺ（インビトロジェン社，サンディエゴ，カリフォルニア州）が挙げられる。
関連する形態において、上記宿主細胞は、このような適切な手段でトランスフェクションされてもよく、ここにおいて、トランスフェクションにより、機能的なタンパク質の発現が起こる（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ストックトン・プレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク，ニューヨーク州，１９９０年）。このような「機能的なタンパク質」としては、これらに限定されないが、発現するとＧタンパク質と複合体を形成するタンパク質（この場合、Ｇタンパク質は第２メッセンジャーの形成を調節する）が挙げられる。本発明において、宿主細胞をトランスフェクトするためのその他の方法も適用され、例えば、これらに必ずしも限定されないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、ジーンガンの使用、またはＤＮＡベクター輸送体が挙げられる（例えば、Ｗｕ等，１９９２年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３〜９６７；ＷｕおよびＷｕ，１９８８年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１〜１４６２４；１９９０年３月１５日付けで出願されたＨａｒｔｍｕｔ等のカナダ国特許出願第２,０１２,３１１号を参照）。
本発明において、多種多様なプロモーターが適用される。実際に、本発明のポリペプチドの発現は、この技術分野で既知のあらゆるプロモーター／エンハンサー構成要素によって制御可能であるが、これらの調節因子は、発現のために選択された宿主中で機能的でなければならない。発現を制御するために用いることができるプロモーターとしては、これらに限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１年，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４〜３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，等，１９８０年，Ｃｅｌｌ ２２：７８７〜７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ等，１９８１年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１〜１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ等，１９８２年，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９〜４２）；原核性の発現ベクター、例えば、β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ，等，１９７８年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７〜３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ，等，１９８３年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１〜２５）；また、“Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎより，１９８０年，２４２：７４〜９４も参照；酵母、またはその他の菌類由来のプロモーター要素、例えば、Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；および動物の転写制御領域、これは、組織特異性を示し、トランスジェニック動物に利用されている：膵臓の腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子の制御領域（Ｓｗｉｆｔ等，１９８４年，Ｃｅｌｌ ３８：６３９〜６４６；Ｏｒｎｉｔｚ等，１９８６年，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９〜４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７年，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５〜５１５）；膵臓のβ細胞で活性なインスリン遺伝子の制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５年，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５〜１２２）、リンパ系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子の制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ等，１９８４年，Ｃｅｌｌ ３８：６４７〜６５８；Ａｄａｍｅｓ等，１９８５年，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３〜５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ等，１９８７年，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６〜１４４４）、精巣、乳房、リンパ球および肥満細胞で活性なマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ等，１９８６年，Ｃｅｌｌ ４５：４８５〜４９５）、肝臓で活性なアルブミン遺伝子の制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ等，１９８７年，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８〜２７６）、肝臓で活性なα−フェトプロテイン遺伝子の制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ等，１９８５年，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９〜１６４８；Ｈａｍｍｅｒ等，１９８７年，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３〜５８）、肝臓で活性なα１−アンチトリプシン遺伝子の制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ等，１９８７年，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１〜１７１）、骨髄細胞で活性なβ−グロビン遺伝子の制御領域（Ｍｏｇｒａｍ等，１９８５年，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８〜３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ等，１９８６年，Ｃｅｌｌ ４６：８９〜９４）、脳の希突起膠細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子の制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ等，１９８７年，Ｃｅｌｌ ４８：７０３〜７１２）、骨格筋で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子の制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５年，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３〜２８６）、および視床下部で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子の制御領域（Ｍａｓｏｎ等，１９８６年，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２〜１３７８）、が挙げられる。
本発明の核酸分子を含む発現ベクターは、４つの一般的なアプローチによって同定することができる：（ａ）望ましいプラスミドＤＮＡまたは特異的ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｃ）選択マーカー遺伝子の機能の存在または非存在、および（ｄ）挿入された配列の発現。第一のアプローチにおいて、本核酸をＰＣＲで増幅して、増幅された産物の検出を実行することができる。第二のアプローチにおいて、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在は、挿入されたマーカー遺伝子に相同な配列を含むプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションによって検出することができる。第三のアプローチにおいて、組換えベクター／宿主系は、ベクターへの外来遺伝子挿入によって引き起こされる所定の「選択マーカー」遺伝子の機能（例えば、β−ガラクトシダーゼ活性、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルス中での封入体形成など）の存在または非存在に基づき、同定および選択することができる。その他の実施例において、本発明のタンパク質、それらの変異体またはそれらの類似体もしくは誘導体をコードする核酸が、ベクターの「選択マーカー」遺伝子配列内に挿入される場合、挿入物を含む組換え体は、遺伝子の機能非存在によって同定することができる。第四のアプローチにおいて、組換え発現ベクターは、組換えベクターによって発現される遺伝子産物の活性、生化学または免疫学的な特徴に関して分析することによって同定することができる（ただし、発現されたタンパク質が、機能的に活性なコンフォメーションであると仮定した条件で）。
多種多様の宿主／発現ベクターの組み合わせが、本発明のＤＮＡ配列を発現することに用いることもできる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体の配列、非染色体の配列、および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなるものでもよい。適切なベクターとしては、ＳＶ４０の誘導体、および既知の細菌のプラスミド、例えば、Ｅ．コリのプラスミドｃｏｌ Ｅｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈ等，１９８８年，Ｇｅｎｅ ６７：３１〜４０）、ｐＭＢ９、およびそれらの誘導体、ＲＰ４のようなプラスミド；ファージＤＮＡＳ、例えば、ファージλの多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、およびその他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３、および線維状一本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド、例えば２μプラスミド、またはそれらの誘導体；真核細胞において有用なベクター、例えば、昆虫または哺乳動物細胞において有用なベクター；プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせから誘導されたベクター、例えば、ファージＤＮＡ、またはその他の発現制御配列を用いるように改変されたプラスミド；などが挙げられる。
例えば、バキュロウイルス発現系において、非融合トランスファーベクター、例えば、ただしこれらに限定されないが、ｐＶＬ９４１（ＢａｍＨ１クローニング部位；サマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ））、ｐＶＬ１３９３（ＢａｍＨ１、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲ１、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＰｓｔＩクローニング部位；インビトロジェン）、ｐＶＬ１３９２（ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、およびＢａｍＨ１クローニング部位；サマーズおよびインビトロジェン）、およびｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ＢａｍＨ１、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、青／白組換えスクリーニングが可能；インビトロジェン）、および融合トランスファーベクター、例えば、ただしこれらに限定されないが、ｐＡｃ７００（ＢａｍＨ１、およびＫｐｎＩクローニング部位、ここにおいて、ＢａｍＨ１認識部位は開始コドンで始まっている；サマーズ）、ｐＡｃ７０１およびｐＡｃ７０２（ｐＡｃ７００と同じ、異なるリーディングフレームを有する）、ｐＡｃ３６０（ポリヘドリン開始コドンの下流の、ＢａｍＨ１クローニング部位の３６塩基対；インビトロジェン（１９５））、およびｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（３種の異なるリーディングフレーム、ＢａｍＨ１、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、プロボンド（ＰｒｏＢｏｎｄ）精製およびプラークの青／白組換えスクリーニングのためのＮ末端ペプチドを含む；インビトロジェン（２２０）の両方を用いることができる。
本発明で使用するために考慮された哺乳動物発現ベクターとしては、誘導性プロモーター、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーターを含むベクター、例えばＤＨＦＲ発現ベクターを含むあらゆる発現ベクター、またはＤＨＦＲ／メトトレキセート共増幅ベクター、例えばｐＥＤ（ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＳｂａＩ、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩクローニング部位、クローニングされた遺伝子とＤＨＦＲとの両方を発現するベクターを含む）が挙げられる；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６．１２（１９９１年）を参照。あるいは、グルタミンシンセターゼ／メチオニンスルホキシミン共増幅ベクター、例えばｐＥＥ１４（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、ＳｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＢｃｌＩクローニング部位、ここにおいて、ベクターは、グルタミンシンターゼとクローニングされた遺伝子とを発現する；セルテック（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ））。その他の実施形態において、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の制御下でエピソームの発現を指示するベクターを用いることができ、例えばｐＲＥＰ４（ＢａｍＨ１、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、構成的 ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー；インビトロジェン）、ｐＣＥＰ４（ＢａｍＨ１、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、構成的 ｈＣＭＶ 前初期遺伝子、ハイグロマイシン選択マーカー；インビトロジェン）、ｐＭＥＰ４（ＫｐｎＩ、ＰｖｕＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｆｉＩ、ＢａｍＨ１クローニング部位、誘導型メタロチオネインＩｉａ遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー：インビトロジェン）、ｐＲＥＰ８（ＢａｍＨ１、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ヒスチジノール選択マーカー；インビトロジェン）、ｐＲＥＰ９（ＫｐｎＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｆｉＩ、およびＢａｍＨＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、Ｇ４１８選択マーカー；インビトロジェン）、およびｐＥＢＶＨｉｓ（ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー、Ｎ末端ペプチド、これは、プロボンド樹脂で精製可能であり、エンテロキナーゼで切断される；インビトロジェン）である。本発明で使用するための選択可能な哺乳動物発現ベクターとしては、ｐＲｃ／ＣＭＶ（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＳｂａＩ、およびＡｐａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択；インビトロジェン）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択；インビトロジェン）などが挙げられる。本発明に従って使用するためのワクシニアウイルス哺乳動物発現ベクター（上記のＫａｕｆｍａｎ，１９９１年を参照）としては、これらに限定されないが、ｐＳＣ１１（ＳｍａＩクローニング部位、ＴＫ−およびβ−ｇａｌ選択）、ｐＭＪ６０１（ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＡｆｌＩ、ＮａｒＩ、ＢｓｐＭＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｐａＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；ＴＫ−およびβ−ｇａｌ選択）、およびｐＴＫｇｐｔＦ１Ｓ（ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＳｂａＩ、ＢａｍＨＩ、およびＨｐａクローニング部位、ＴＫ、またはＸＰＲＴ選択）が挙げられる。
酵母発現系も、本発明に従って、本発明のタンパク質、それらの変異体、またはそれらの類似体もしくは誘導体を発現させるために用いることができる。例えば、単に２つ例を挙げると、非融合 ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、Ｋｐｎ１、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；インビトロジェン）または融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、Ｎ末端ペプチド、これは、プロボンド樹脂で精製され、エンテロキナーゼで切断される；インビトロジェン）は、本発明に従って用いることができる。
特定の組換えＤＮＡ分子が同定および単離されれば、この技術分野で既知の数種の方法を用いて、それを増殖させることができる。適切な宿主系および成長条件が確立されれば、組換え発現ベクターを多量に増殖および製造することができる。これまで説明したように、用いることができる発現ベクターとしては、これらに限定されないが、いくつか例を挙げると、以下のベクター、またはそれらの誘導体が挙げられる：ヒトまたは動物ウイルス、例えばワクシニアウイルス、またはアデノウイルス；昆虫ウイルス、例えばバキュロウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、およびプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクター。
加えて、望ましい特定の様式で挿入された配列の発現を調節したり、または遺伝子産物を改変および加工したりする宿主細胞株を選択してもよい。それぞれの宿主細胞が、翻訳プロセシングおよびタンパク質の翻訳後プロセシング、ならびに修飾（例えば、グリコシル化、切断［例えば、シグナル配列の］）に関して、異なる特徴および特定のメカニズムを有する。発現される外来タンパク質の望ましい修飾およびプロセシングを確実にするのに適した細胞系または宿主系を選択することができる。例えば、非グリコシル化されたコアタンパク質産物を生産するためには、細菌系における発現を用いることができる。
トランスジェニック動物
本発明の宿主細胞を用いて、非ヒトトランスジェニック動物を生産することもできる。例えば、一実施形態において、本発明の宿主細胞は、配列番号１に対応する配列が導入された受精させた卵母細胞または胚幹細胞である。次に、このような宿主細胞を用いて、ゲノムに外因性の配列が導入された非ヒトトランスジェニック動物、または内因性配列が改変された相同組換え動物を作製することができる。このような動物は、本発明のタンパク質の機能および／または活性を研究すること、および本発明のタンパク質の活性のモジュレーターを同定および／または評価するのに有用である。本明細書で用いられる「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはげっ歯類、例えばラットまたはマウスであり、これらは、動物の細胞の１個またはそれ以上にトランスジーンを含む。トランスジェニック動物のその他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。本発明の特定の実施形態は、本発明の受容体を過剰発現するモルモットであり、これは、アレルギー性鼻炎、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の動物モデルとして有用性を有すると予測される。
本明細書で用いられる用語「トランスジーン」は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに統合された外因性のＤＮＡを意味し、さらにそれらは、成熟した動物のゲノムに残存する。トランスジーンは、トランスジェニック動物の１またはそれ以上の細胞型または組織における、コードされた遺伝子産物の発現を指示する。本明細書で用いられる「相同組換え動物」は、配列番号１に対応する内因性遺伝子が相同組換えによって改変されている、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスである。これは、動物が発生する前に動物の細胞（例えば動物の胎児細胞）に導入された内因性遺伝子と外因性ＤＮＡ分子との間で達成される。
本発明のトランスジェニック動物は、上述のトランスフェクション方法のいずれか１つを用いて、配列番号１またはそれらの部分をコードする核酸分子を、受精させた卵母細胞の雄性前核に導入することによって作製することができる。次に、その卵母細胞を偽妊娠のメスフォスター動物で発生させる。ｃＤＮＡ配列［例えば（配列番号１）の配列］は、例えば、トランスジーンとして非ヒト動物のゲノムに導入することができる。あるいは、ヒト遺伝子非ヒト相同体（例えばマウス遺伝子）は、配列番号１に対応するｃＤＮＡへのハイブリダイゼーションに基づき単離し、トランスジーンとして用いることができる。また、トランスジーンの発現効率を高めるために、イントロンの配列やポリアデニル化シグナルも、トランスジーンに含ませることができる。組織特異的な調節配列を本発明のトランスジーンに機能するように連結させて、特定の細胞で本発明のタンパク質の発現を指示することができる。胚操作およびマイクロインジェクションによるトランスジェニック動物（特にマウスのような動物）の作製方法はこの技術分野において一般的であり、これらは、例えば、米国特許第４,７３６,８６６号および４,８７０,００９号、米国特許第４,８７３,１９１号およびｉｎ Ｈｏｇａｎ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク，１９８６年）で説明されており、これらそれぞれの開示は、参照により本明細書に加入する。ゲノム中にトランスジーンを有するおよび／またはその動物の組織または細胞において本発明のｍＲＮＡを発現するその他のトランスジェニック動物を製造するために、類似の方法が用いられる。次に、トランスジェニックファウンダー動物を用いて、トランスジーンを有するさらなる動物を育成することができる。その上、配列番号１をコードするトランスジーンを有するトランスジェニック動物を、さらに、その他のトランスジーンを有するその他のトランスジェニック動物に育成することもできる。
相同組換え動物を作製するために、本発明の遺伝子が改変される（例えば機能的に崩壊させる）ように欠失、添加または置換が導入された本発明の遺伝子（例えば、本発明の遺伝子のヒトまたは非ヒト同族体、例えば、マウス遺伝子）の少なくとも一部を含むベクターを製造する。特定の実施形態において、このようなベクターは、相同組換えの際、内因性遺伝子が機能的に破壊されるように設計される（すなわち、機能的なタンパク質がコードされなくなる；また、「ノックアウト」ベクターとも称される）。
あるいは、このようなベクターは、相同組換えの際に、内因性遺伝子が突然変異する、または別の方法で改変されるが、それでもなお機能的なタンパク質をコードするように（例えば、上流の調節領域を改変し、それによって内因性タンパク質の発現を改変することができる）設計することができる。
相同組換えベクターにおいて、改変された遺伝子の一部は、その遺伝子の追加の核酸配列によって５’および３’末端に配置され、それにより、ベクターが有する外因性遺伝子と、胚幹細胞の内因性遺伝子との間で相同組換えを起こすことが可能になる。このような両端にある追加の核酸配列は、内因性遺伝子との相同組換えがうまくいくような十分な長さを有する。典型的には、数キロ塩基の両端にあるＤＮＡ（５’および３’末端の両方）が、ベクターに含まれる（例えば、相同組換えベクターの説明に関するＴｈｏｍａｓ等，Ｃｅｌｌ（１９８７年）５１：５０３を参照）。
このようなベクターを胚幹細胞系に導入し（例えば、エレクトロポレーションによって）、導入された本発明の遺伝子が内因性遺伝子と相同組換えを起こした細胞を選択する（例えば、Ｌｉ等，Ｃｅｌｌ（１９９２年）６９：９１５を参照）。次に、選択された細胞を動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注入し、凝集キメラを形成させる（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ ｉｎ Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編，ＩＲＬ，オックスフォード，（１９８７年）１１３〜１５２頁を参照）。次に、キメラ胚を適切な偽妊娠のメスフォスター動物に移植し、その胚を発生させることができる。生殖細胞中で相同組換えされたＤＮＡを含む後代を用いて、動物の全ての細胞が、トランスジーンの生殖細胞系伝達によって相同組換えされたＤＮＡを含む動物を育成することができる。
相同組換えベクター、および相同組換え動物を構築する法は、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１年）２：８２３〜８２９およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１３５４、ＷＯ９１／０１１４０、ＷＯ９２／０９６８およびＷＯ９３／０４１６９でさらに説明されており、この開示は、参照により開示に加入する。
その他の実施形態において、トランスジーンの調節された発現を可能にする選択されたシステムを含むトランスジェニック非ヒト動物を生産することができる。このようなシステムの一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムの説明としては、例えば、Ｌａｋｓｏ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９２年）８９：６２３２〜６２３６を参照。リコンビナーゼシステムのその他の例は、Ｓ．セレビジエのＦＬＰリコンビナーゼシステムである（Ｏ’Ｇｏｒｒｎａｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１年）２５１：１３５１〜１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムを用いて、トランスジーンの発現を調節する場合、ｃｒｅリコンビナーゼと選択されたタンパク質との両方をコードするトランスジーンを含む動物が必要である。このような動物は、例えば、２種のトランスジェニック動物（一方は、選択されたタンパク質をコードするトランスジーンを含み、他方は、リコンビナーゼをコードするトランスジーンを含む）を交配させて「ダブル」トランスジェニック動物を構築することによって提供することができる。
また、本明細書で説明されている非ヒトトランスジェニック動物のクローンも、Ｗｉｌｍｕｔ等，Ｎａｔｕｒｅ（１９９７年）３８５：８１０〜８１３、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／０７６６８、およびＷＯ９７／０７６６９（参照によりそれらの全体を本明細書に加入する）で説明されている方法に従って生産することができる。簡単に言えば、トランスジェニック動物由来の細胞（例えば体細胞）を単離し、成長周期を脱してＧ0期に入るように誘導することができる。次に、例えば電気パルスの使用によって、静止細胞が単離されたのと同じ種の動物からの除核卵母細胞に、静止細胞を融合することができる。次に、再構築された卵母細胞を桑実胚または胚盤細胞に発達するように培養し、次に、それらを偽妊娠のメスフォスター動物に移す。メスフォスター動物から産まれた子孫は、細胞（例えば体細胞）が単離された動物のクローンと予想される。
本発明のさらなる用途および方法
本発明の核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体、抗体およびこのような成分のフラグメントは、以下の方法の１またはそれ以上で用いてもよい：ａ）スクリーニング分析；ｂ）検出分析（例えば、染色体マッピング、組織型別、法生物学）；ｃ）予測医学（例えば、診断分析、予後分析、モニタリング臨床試験、および薬理ゲノム学）；およびｄ）治療方法（例えば、治療的および予防的な）。本発明のタンパク質は、その他の細胞タンパク質と相互作用するため、（ｉ）細胞増殖の調節；（ｉｉ）細胞分化の調節；（ｉｉｉ）細胞生存の調節、および（ｉｖ）細胞機能の調節のために用いることができる。本発明の単離された核酸分子を用いて、本発明のタンパク質を発現させることができ（例えば、遺伝子治療用途において、宿主細胞中組換え発現ベクターを介して）、本発明のｍＲＮＡを検出することができ（例えば、生物学的サンプル中で）、または本発明の遺伝子中の遺伝的損傷を検出することができ、さらに、内因性ｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の活性を調節することもできる。加えて、本発明のタンパク質を用いて、タンパク質活性または発現を調節する薬物または化合物、同様に、内因性タンパク質の不十分な、または過剰な生産を特徴とする障害を治療する薬物または化合物をスクリーニングすることができる。また、野生型タンパク質と比較して少ない活性または異常な活性を有するタンパク質型の生産をスクリーニングすることも本発明によって行うことができる。加えて、本発明の抗体を用いて、タンパク質を検出および単離し、さらに、タンパク質活性を調節することができる。本発明はさらに、上述のスクリーニング分析で同定された新規の作用物質、および本明細書で説明されるような治療のためのそれらの使用に関する。
１．検出およびスクリーニング分析
内因性のリガンドの存在下でＧタンパク質受容体が活性化されることによって、Ｇタンパク質受容体複合体が形成され、それにより、ＧＴＰをＧタンパク質に結合させる。Ｇタンパク質のＧＴＰアーゼドメインは、ＧＴＰをＧＤＰにゆっくり加水分解し、正常な状態で、受容体の非活性化が起こる。しかしながら、構成的に活性化された受容体は、ＧＤＰをＧＴＰに加水分解し続ける。
Ｇタンパク質の非加水分解性の基質、［35Ｓ］ＧＴＰγＳを用いて、構成的に活性化された受容体を発現する膜への強化された結合をモニターすることができる。ＴｒａｙｎｏｒおよびＮａｈｏｒｓｋｉが、［35Ｓ］ＧＴＰγＳを用いて、リガンドの非存在および存在下でのＧタンパク質の膜へのカップリングをモニターすることができると報告している（Ｔｒａｙｎｏｒ等，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９９５年）４７（４）：８４８〜５４）。このような分析システムの好ましい使用は、候補化合物の最初のスクリーニングに関してであり、なぜなら、このようなシステムは一般的に、受容体に結合する具体的なＧタンパク質に関係なく全てのＧタンパク質共役受容体に適用可能であるためである。
Ｇsは、酵素アデニリルシクラーゼを刺激し、一方で、ＧiおよびＧoは、その酵素を阻害する。この技術分野で周知のように、アデニリルシクラーゼは、ＡＴＰからｃＡＭＰの変換を触媒する；従って、Ｇsタンパク質にカップリングしている構成的に活性化されたＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの細胞レベルの増加に関連する。あるいは、Ｇi（またはＧo）タンパク質にカップリングする可能性のある構成的に活性化されたＧＣＰＲは、ｃＡＭＰの細胞レベルの減少に関連する。“Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ”，第８章，Ｎｅｕｒｏｎ ｔｏ Ｂｒａｉｎ（第三版）より，Ｎｉｃｈｏｌｓ等編，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，１９９２年を参照。従って、ｃＡＭＰを検出する分析を用いて、候補化合物が受容体に対するインバースアゴニストであるかどうかを決定することができる。この技術分野で既知のｃＡＭＰを測定するための多種多様なアプローチを利用することができる。一実施形態において、ＥＬＩＳＡベースの様式では、抗ｃＡＭＰ 抗体が用いられる。その他の実施形態において、細胞全体の第２メッセンジャーレポーターシステム分析が考慮される（ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２２１３１を参照，参照によりそれらの全体を本明細書に加入する）。特定の実施形態は、以下の「実施例５」で説明されているＳＰＡ分析である。
関連する形態において、サイクリックＡＭＰは、ｃＡＭＰ応答性のＤＮＡ結合タンパク質または転写因子（ＣＲＥＢ）の結合を促進し、次に、ｃＡＭＰ応答要素と呼ばれる特異的部位でプロモーターに結合し、遺伝子の発現を進行させることによって、遺伝子発現を進行させる。従って、レポーター遺伝子（例えばβ−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ）の前に複数のｃＡＭＰ応答要素を含むプロモーターを有するレポーターシステムを構築することができる。さらに、構成的に活性化されたＧs共役受容体がｃＡＭＰの蓄積を引き起こすため、続いてｃＡＭＰが、レポータータンパク質の遺伝子とそれらの発現を活性化する。次に、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼのようなレポータータンパク質は、標準的な生化学分析を用いて検出することができる（ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２２１３１、参照により本発明に加入させる）。
ＧoおよびＧqのようなその他のＧタンパク質が酵素、ホスホリパーゼＣの活性化に関連しており、これらは順に、リン脂質、ＰＩＰ２を加水分解し、２種の細胞内メッセンジャー：ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、およびイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）を放出する。ＩＰ３の蓄積の増加は、Ｇq共役受容体、およびＧo共役受容体の活性化に関連している（ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２２１３１、参照により本明細書に加入する）。ＩＰ３の蓄積を検出する分析を用いて、候補化合物が、Ｇq共役受容体またはＧo共役受容体に対するインバースアゴニストであるかどうかを決定することができる。また、Ｇq共役受容体は、Ｇq依存性ホスホリパーゼＣがＡＰ１要素を含む遺伝子の活性化を引き起こすかどうかを測定するＡＰ１レポーター分析を用いて試験することもできる。従って、活性化されたＧq共役受容体によって、インバースアゴニストによって発現の減少が示されると予想される遺伝子の発現の増加が示されると予想される。
また、モジュレーター、すなわち、本発明のタンパク質に結合する、または例えばタンパク質の発現または活性に刺激作用または阻害作用を有する候補もしくは試験化合物または作用物質（例えば、ペプチド、ペプチド模倣薬、低分子薬物、またはその他の薬物）を同定する方法（また、本明細書では、「スクリーニング分析」ともいう）も本発明により提供される。例えば、本明細書で説明されているスクリーニング分析を用いて、気管支喘息の治療に有用と予測される受容体においてアンタゴニストとして作用する化合物を同定することができる。
一実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質、ポリペプチドまたは生物学的に活性なそれらの部分の膜結合型に結合する、またはそれらの活性を調節する候補または試験化合物をスクリーニングするための分析を提供する。本発明の試験化合物は、この技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができ、このようなライブラリー法としては：生物学的なライブラリー；立体的に処理可能なパラレル固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１−ビーズ１−化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法、が挙げられる。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、それ以外の４種のアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子物質の化合物ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ（１９９７年）１２：１４５）。
分子ライブラリーの合成方法の例は、この技術分野で見出すことができ、例えば：ＤｅＷｉｔｔ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９３年）９０：６９０９；Ｅｒｂ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９４年）９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ等，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（１９９４年）３７：２６７８；Ｃｈｏ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３年）２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ等，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ（１９９４年）３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ等，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ（１９９４年）３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐ等，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（１９９４年）３７：１２３３で見出すことができる。
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２年）１３：４１２〜４２１）またはビーズ上（Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９１年）３５４：８２〜８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３年）３６４：５５５〜５５６）、細菌（米国特許第５,２２３,４０９号）、胞子（米国特許第５,５７１,６９８号；５,４０３,４８４号；および５,２２３,４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９２年）８９：１８６５〜１８６９）またはファージ（Ｓｃｏｔｔ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０年）２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０年）２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９０年）８７：６３７８〜６３８２；およびＦｅｌｉｃｉ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９１年）２２２：３０１〜３１０）に存在していてもよい；前述の参考文献のそれぞれの開示は、参照により本明細書に加入する。
本発明の特定の実施形態において、分析は、細胞に基づく分析であって、ここにおいて、細胞表面上で本発明のタンパク質または生物学的に活性なそれらの部分の膜結合型を発現する細胞と、試験化合物とを接触させ、この試験化合物の上記タンパク質に結合する能力が決定される。このような細胞は、例えば、酵母細胞または哺乳動物由来の細胞が可能である。試験化合物の上記タンパク質に結合する能力を決定することは、例えば、試験化合物と放射線同位体または酵素標識とをカップリングすることにより達成でき、その結果試験化合物の本発明のタンパク質または生物学的に活性なそれらの部分への結合が、複合体中の標識された化合物を検出することによって決定できる。例えば、試験化合物は、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、または3Ｈで直接的または間接的に標識することができ、放射性同位体は、放射線放出の直接的な計数、またはシンチレーション計数によって検出される。あるいは、試験化合物は、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識することができ、酵素標識は、適切な基質の生成物への変換を測定することによって検出される。特定の実施形態において、このような分析は、細胞表面上で本発明のタンパク質または生物学的に活性なそれらの部分の膜結合型を発現する細胞と、上記タンパク質と結合する既知の化合物とを接触させ、分析混合物を形成させることを含む。次に、分析混合物と、試験化合物とを接触させること、および試験化合物の、上記タンパク質と相互作用する能力を決定すること、であり、ここにおいて、上記試験化合物の、上記タンパク質と相互作用する能力を決定することは、試験化合物の、本発明のタンパク質または生物学的に活性なそれらの部分へ選択的に結合する能力を、既知の化合物と比較して決定することを含む。
その他の実施形態において、分析は、細胞に基づく分析であり、本分析は、細胞表面上で本発明のタンパク質または生物学的に活性なそれらの部分の膜結合型を発現する細胞と、試験化合物とを接触させること、および上記試験化合物の、上記タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分の活性を調節する（例えば、刺激するまたは阻害する）能力を決定することを含む。上記試験化合物の、本発明のタンパク質または生物学的に活性なそれらの部分の活性を調節する能力を決定することは、例えば、上記タンパク質の、標的分子に結合する、または標的分子と相互作用する能力を決定することによって達成することができる。本明細書で用いられる「標的分子」は、天然状態で、本発明のタンパク質が結合するまたは相互作用する分子であり、例えば、本発明のタンパク質を発現する細胞の表面上の分子、第二の細胞の表面上の分子、細胞外の環境の分子、細胞膜の内部表面と共役する分子、または細胞質内の分子である。標的分子は、本発明のその他の分子、またはタンパク質、またはポリペプチドであり得る。一実施形態において、標的分子は、細胞膜を貫通して、細胞への、細胞外シグナル（例えば、膜結合型の本発明のタンパク質への化合物の結合によって生成したシグナル）の形質導入を容易にするシグナル伝達経路の成分である。このような標的としては、例えば、触媒活性を有する第二の細胞間タンパク質、または下流のシグナル伝達分子との共役を容易にするタンパク質が挙げられる。
本願のタンパク質の、標的分子と相互作用する能力を決定することは、直接的な結合を決定することに関して上述された方法の１つによって達成することができる。特定の実施形態において、本発明のタンパク質の、標的分子に結合する、または標的分子と相互作用する能力を決定することは、標的分子の活性を決定することによって達成することができる。例えば、標的分子の活性は、標的の細胞性の第２メッセンジャー（例えば、細胞内Ｃａ2+、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子の誘導を検出すること（例えば、検出可能なマーカー、例えばルシフェラーゼをコードする核酸に機能するように連結した反応性の調節要素）、または細胞の反応（例えば、細胞分化、増殖または機能）を検出することによって決定することができる。以下の「実施例４」で、特定の実施形態が説明されており、そこでは、本発明の受容体をＧα１６にカップリングさせ、カルシウム応答を惹起することができる。
本発明はさらに、細胞非含有分析も包含し、本分析は、本発明のタンパク質または生物学的に活性なそれらの部分と、試験化合物とを接触させること、および試験化合物の、上記タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分に結合する能力を決定することを含む。試験化合物の上記タンパク質への結合は、上述のように直接的または間接的のいずれかによって決定することができる。好ましい実施形態において、本分析は、本発明のタンパク質または生物学的に活性なそれらの部分と、上記タンパク質と結合して分析混合物を形成することが既知の化合物とを接触させること、を含む。次に、この分析混合物と、試験化合物とを接触させること、および試験化合物の、上記タンパク質と相互作用する能力を決定すること、である。ここにおいて、試験化合物の、本発明のタンパク質と相互作用する能力を決定することは、試験化合物の、既知の化合物と比較して選択的に上記タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分に結合する能力を決定することを含む。
本発明のその他の細胞非含有分析は、本発明のタンパク質または生物学的に活性なそれらの部分と、試験化合物とを接触させること、および試験化合物の、上記タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分の活性を調節する（例えば、刺激する、または阻害する）能力を決定することを含む。試験化合物の、上記タンパク質の活性を調節する能力を決定することは、例えば、直接的な結合を決定することに関して上述された方法の１つによって、上記タンパク質の、標的分子に結合する能力を決定することによって達成することができる。その代わりの実施形態において、試験化合物の、上記タンパク質の活性を調節する能力を決定することは、上記タンパク質の、標的分子をさらに調節する能力を決定することによって達成することができる。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒／酵素活性は、前述したようにして決定することができる。
本発明のさらにその他の細胞非含有分析は、本発明のタンパク質または生物学的に活性なそれらの部分と、上記タンパク質と結合して分析混合物を形成することが既知の化合物とを接触させること、この分析混合物と、試験化合物とを接触させること、および試験化合物の、上記タンパク質と相互作用する能力を決定すること、を含む。試験化合物の、上記タンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、上記タンパク質の、標的分子に選択的に結合する能力またはその活性を調節する能力を決定することを含む。
受容体は、リガンド結合を必ずしも阻害しないが受容体における構造変化を引き起こす非リガンド分子によって活性化することができ、それにより、Ｇタンパク質結合、または恐らく受容体凝集、二量体化、または活性化を起こすことができるクラスター化を可能にする。例えば、抗体を、細胞表面で接触する本発明の受容体の様々な部位に発生させることができる。このような抗体は、ＣＡＭＰレベル、または細胞内 ＣＡ+2レベルのモニタリングのような標準的な分析によって決定されるように、Ｇタンパク質カスケードを介して細胞を活性化する。分子マッピング、特にエピトープマッピングが含まれるため、モノクローナル抗体が好ましい場合がある。このようなモノクローナル抗体は、細胞表面で発現されるインタクト受容体、および細胞表面で形成することが既知のペプチドの両方に対して発生させることができる。複数の関連ペプチドを得るために、Ｇｅｙｓｅｎ等の方法（米国特許第５,９９８,５７７号）を実施することができる。
本発明の受容体を活性化することが見出された抗体は、受容体活性化とは無関係の活性（例えば補体結合）を最小化するために改変されていてもよい。従って、抗体分子は、受容体活性化以外の活性を最小化または除去するためにトランケーションまたは突然変異させることができる。例えば、所定の抗体に関して、抗原結合部分だけが必要である。従って、その抗体のＦc部分を除去することができる。
本発明の受容体を発現する細胞を抗体と接触させて、受容体を活性化する。次に、受容体活性を調節する分子を同定するために、活性化された細胞を様々な分子と接触させ、それにより、より高い活性化レベル、またはより低い活性化レベルになる。次に、これらの目的を達成する分子は、抗体を用いないで本発明の受容体を発現する細胞で試験することができ、活性化されていない細胞での作用を観察することができる。次に、既知の技術を用いて、変化した代謝に関連する障害を治療するための候補薬物として、標的分子を試験し改変することができる。
本発明の細胞非含有分析は、本発明のタンパク質の可溶性の形態、および膜結合の形態の両方の使用を許容することができる。膜結合の形態を含む細胞非含有分析の場合、膜結合の形態が溶液中に維持されるように可溶化剤を利用することが望ましい場合がある。このような可溶化剤の例としては、非イオン性界面活性剤、例えばｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）Ｘ−１００、トリトンＸ−１１４、ＴＨＥＳＩＴ、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）n、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンミノ］−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンミノ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナートが挙げられる。
上記の本発明の分析方法２以上の実施形態において、本発明のタンパク質またはそれらの標的分子のいずれかを固定化して、タンパク質の一方または両方の複合体化していない形態から複合体化した形態を分離を容易にすること、同様に、分析のオートメーションを提供することが望ましい場合がある。反応物を入れるのに適したあらゆる容器中で、試験化合物の本発明のタンパク質に対する結合、または候補化合物の存在下および非存在下でのタンパク質と標的分子との相互作用を行うことができる。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管およびマイクロ遠沈管が挙げられる。一実施形態において、タンパク質の一方または両方をマトリックスに結合させることができるドメインが付加された融合タンパク質を提供できる。例えば、本発明の融合タンパク質のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ），セントルイス，ミズーリ州）に吸着できる。あるいは、次に、グルタチオンで誘導体化されたマイクロタイタープレートと、試験化合物とを連結させる。その後、吸着しなかった標的タンパク質または本発明のタンパク質のいずれか、およびそれらの混合物は、複合体の形成を促進する条件下で（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件下で）インキュベートされる。インキュベート後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、あらゆる未結合の成分を除去し、複合体形成の存在が直接的または間接的のいずれかで測定される。あるいは、このような複合体は、マトリックスから解離させてもよく、標準的な技術を用いて、結合または活性のレベルを決定することができる。
また、タンパク質をマトリックスに固定するその他の技術も、本発明のスクリーニング分析で用いることができる。例えば、本発明のタンパク質またはそれらの標的分子のいずれかは、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定することができる。本発明のビオチン化タンパク質または標的分子は、この技術分野で周知の技術（例えば、ビオチン化キット、ピアース・ケミカルズ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ），ロックフォード，イリノイ州）を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から製造することができ、さらに、ストレプトアビジンで被覆した９６ウェルプレート（ピアース・ケミカルズ）のウェルに固定することができる。あるいは、本発明のタンパク質または標的分子と反応性を有するが、本発明のタンパク質の標的分子への結合には干渉しない抗体を、プレートのウェルに誘導体化することができる。インキュベートの際、未結合の標的または本発明のタンパク質は、抗体結合によってウェルで捕捉することができる。このような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴに固定された複合体に関して上述したものに加えて、本発明のタンパク質または標的分子と反応性を有する抗体を用いた複合体の免疫検出、同様に、本発明のタンパク質または標的分子に関連する酵素活性を検出することによる酵素結合分析が挙げられる。
その他の実施形態において、タンパク質発現のモジュレーターが、細胞と候補化合物とを接触させ、細胞中のｍＲＮＡまたは本発明のタンパク質の発現を決定する方法で同定される。候補化合物の存在下におけるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物の非存在下におけるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。次に、その比較に基づき、発現のモジュレーターとして候補化合物を同定することができる。例えば、候補化合物の存在下におけるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、それらの非存在下より大きい（統計学的に有意に大きい）場合、その候補化合物は、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激物質またはアゴニストと同定される。あるいは、候補化合物の存在下におけるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、それらの非存在下より少ない（統計学的に有意に少ない）場合、その候補化合物は、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の阻害剤またはアンタゴニストと同定される。活性が、リガンドまたはアゴニストの存在下で減少する、または構成的に発現する細胞中で基準未満である場合、その候補化合物は、インバースアゴニストと同定される。細胞中のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、本明細書でｍＲＮＡまたはタンパク質の検出に関して説明されている方法によって決定することができる。
本発明のさらにその他の形態において、本発明のタンパク質は、２−ハイブリッド分析または３−ハイブリッド分析で「ベイトタンパク質」として用いることができ（例えば、米国特許第５,２８３,３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ等，Ｃｅｌｌ（１９９３年）７２：２２３〜２３２；Ｍａｄｕｒａ等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９３年）２６８：１２０４６〜１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９３年）１４：９２０〜９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９３年）８：１６９３〜１６９６；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１０３００を参照、これらそれぞれの開示は、参照により本明細書に加入する）、それにより、本発明のタンパク質に結合するか、またはそれらと相互作用し、本発明のタンパク質の活性を調節するその他のタンパク質を同定することができる。また、このような結合タンパク質は、本発明のタンパク質による、シグナル（例えばシグナル伝達経路の上流または下流の要素）の増殖に関与する可能性も高い。
本発明により本願の純粋なタンパク質の大量生産が可能になるため、合理的な薬物設計のために、機能を有すると考えられる領域のコンフォメーションの物理的な特徴付けを解明することができる。例えば、特に興味深い領域は、細胞内および細胞外ドメインである。領域の形状およびイオン配置が識別されれば、その領域と相互作用すると予想される候補薬物を構築することができ、次に、インタクト細胞、動物および患者で試験することができる。このような三次元構造の情報を得ることができると思われる方法としては、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ 分光分析、分子モデリングなどが挙げられる。また、その三次元構造により、その他の既知のタンパク質中で類似の立体配座の部位（その部位で相互作用する既知の薬物が存在する）を同定することもできる。これらの薬物またはそれらの誘導体は、本発明のタンパク質との使用を見出す可能性もある。
上述のスクリーニング分析は、本発明の受容体のアゴニスト、パーシャルアゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト、またはモジュレーターとして作用する化合物を同定することにおいて特定の有用性があると予測され、それにより、これらに限定されないが、気管支喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、全身性肥満細胞症、および虚血再潅流傷害などの病気を治療するための化合物を同定する手段を提供することができる。
本発明はさらに、上述のスクリーニング分析で同定された新規な作用物質、および本明細書で説明されたような治療のためのそれらの使用に関する。
本発明のＤＮＡ配列の一部またはフラグメントは、ポリヌクレオチド試薬として多数の方法で用いることができる。例えば、このような配列は：（ｉ）それぞれの遺伝子を染色体上にマッピングし、それにより、遺伝病に関連する遺伝子領域を位置付けること；（ｉｉ）わずかな生物学的サンプルから個体を同定すること（組織型別）；および（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的な同定において補助すること、に用いることができる。以下の節で、これらの用途を説明する。
２．染色体マッピング
遺伝子の配列（またはその配列の一部）が単離されたら、その配列を用いて、染色体上での本発明の遺伝子の位置をマッピングすることができる。従って、本明細書で説明されている核酸分子またはそれらのフラグメントは、ゲノムにおける位置をマッピングするのに用いることができる。ゲノム（特にヒトゲノム）中の配列の位置のマッピングは、その配列を病気に関連する遺伝子に関連付けることにおける重要な第一工程である。
簡単に言えば、遺伝子は、配列番号１で開示された配列から、ＰＣＲプライマー（好ましくは長さが１５〜２５ｂｐ）を製造することによって、ゲノム中でマッピングすることができる。このようなプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに用いられる。これらの本発明の配列に対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドだけが、増幅したフラグメントを生産する。
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物（例えば、ヒトおよびマウス細胞）由来の体細胞を融合させることによって製造される。ヒトとマウス細胞のハイブリッドが成長し分裂するにつれて、一般的に、ヒト染色体はランダムな順番で失われるが、マウス染色体は残存する。マウス細胞は成長できないがヒト細胞は成長できる培地（特定の酵素が欠失しているため）を用いることによって、必要とされる酵素をコードする遺伝子を含む所定のヒト染色体が残存することになる。様々な培地を用いることによって、ハイブリッド細胞系のパネルが確立される。パネル中の各細胞系は、一種のヒト染色体またはいくつかの種類のヒト染色体のいずれか、および一式のマウス染色体を含み、個々の遺伝子を特定のヒト染色体に簡単にマッピングすることを可能にする。（Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３年）２２０：９１９〜９２４）。また、ヒト染色体のフラグメントのみを含む体細胞ハイブリッドも、転移および欠失を含むヒト染色体を用いることによって生産することができる。
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に割り当てるための迅速な手法である。一つのサーモサイクラーを用いると、１日で、３またはそれ以上配列を割り当てることができる。
配列をゲノム中の特定の染色体にマッピングするのに同様に用いることができるその他のマッピングの方策としては、インサイチュハイブリダイゼーション（Ｆａｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９０年）８７：６２２３〜２７で説明されている）、標識されたフローソーティングされた染色体を用いたプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーへのハイブリダイゼーションによる予備選択が挙げられる。
また、ＤＮＡ配列の分裂中期染色体の伸展標本への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、一工程で正確な染色体位置を提供することもできる。染色体伸展標本は、有糸分裂紡錘体を崩壊させる化学物質（例えばコルセミド）によって、分裂中期で分裂がブロックされている細胞を用いて作製できる。染色体をトリプシンで短時間処理し、次に、ギムザ染色してもよい。各染色体で明暗バンドのパターンが展開し、染色体を個々に同定することができるようになる。ＦＩＳＨ技術は、５００または６００塩基ほどの短さのＤＮＡ配列と用いることができる。しかしながら、１,０００塩基より大きいクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で特有の染色体位置へ結合する可能性がより高い。好ましくは１,０００塩基、より好ましくは２,０００塩基が、適度な時間で優れた結果を得るのに十分であると予想される。このような技術の総論としては、Ｖｅｒｍａ等（Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ペルガモン・プレス（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク，１９８８年））を参照。染色体マッピングは、コンピューターの使用によって、さらに、統計的考察、例えばロッドスコアまたは単なる近接を用いて推測できる。
染色体マッピングのための試薬は、染色体上の一つの部位を位置づけるためにそれぞれ用いることができる。その上、多数の部位および／または多数の染色体をマーキングするために、試薬のパネルを用いることができる。実際には、マッピングのためには、遺伝子のフランキング領域に対応する試薬が好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリーのなかでも保存されている可能性が高いため、染色体マッピングの際にクロスハイブリダイゼーションの機会が高くなる。
配列が正確な染色体の位置にマッピングされると、その配列の染色体上の物理的な位置を、遺伝子地図データと相関させることができる。（このようなデータは、例えば、ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎで見出され、これは、ジョン・ホプキンス・ユニバーシティ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のウェルチ・メディカル・ライブラリー（Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ）を介してオンラインで利用可能）。次に、遺伝子と、同じ染色体領域にマッピングされた病気との関係は、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子が共に遺伝すること）によって同定することができ、これは、例えば、Ｅｇｅｌａｎｄ等，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７年）３２５：７８３〜７８７で説明されている。
さらに、本発明のタンパク質に関連する病気に罹患した個体と、罹患していない個体との間のＤＮＡ配列における差を決定することができる。突然変異が、罹患した個体の一部または全部で観察されるが、罹患していない個体ではまったく観察されない場合、この突然変異は、特定の病気の原因因子である可能性が高い。一般的に、罹患した個体と罹患していない個体との比較は、まず、染色体伸展標本から見てわかる、またはそのＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを用いて検出できる、染色体における構造的な変化（例えば欠失または転移）を探すことを含む。最終的には、いくつかの個体からの遺伝子の全体の配列解析を行い、突然変異の存在を確かめ、さらに、突然変異と多型とを区別することができる。
３．診断分析
生物学的サンプルで本発明の核酸またはタンパク質の存在または非存在を検出する典型的な方法は、試験対象から生物学的サンプルを得ること、および生物学的サンプル中でそれらの存在が検出されるように、その生物学的サンプルと、タンパク質または核酸（例えばｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を検出することができる化合物または作用物質とを接触させることを含む。ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するのに好ましい作用物質は、本発明のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイゼーション可能な標識された核酸プローブである。このような核酸プローブは、例えば全長核酸、例えば配列番号１の核酸またはそれらの部分が可能であり、例えば、長さが少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０、または５００個またはそれ以上のヌクレオチドからなり、さらに、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイゼーションするのに十分なオリゴヌクレオチドである。本発明の診断分析で使用するのに適したその他のプローブは、本明細書で説明されている。
本発明のタンパク質を検出するための特定の作用物質は、上記タンパク質に結合することができる抗体であり、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体、キメラ抗体が可能であり、またはより好ましくは、モノクローナル抗体である。インタクト抗体またはそれらのフラグメント（例えば、ＦabまたはＦ(ab')2）を用いてもよい。用語「生物学的サンプル」は、対象から単離された組織、細胞および生体液、同様に、対象内に存在する組織、細胞および体液を含むものとする。すなわち、本発明の検出方法を用いて、インビトロ、同様に、インビボで、生物学的サンプル中でｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを検出することができる。例えば、ｍＲＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。タンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光法が挙げられる。ゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。その上、タンパク質を検出するためのインビボ技術としては、対象に本発明のタンパク質に対する標識抗体を導入することが挙げられる。例えば、このような抗体は、放射性マーカーで標識することができ、対象におけるこのような放射性マーカーの存在および位置は、標準的なイメージング技術によって検出することができる。
一実施形態において、生物学的サンプルは、試験対象由来のタンパク質分子を含む。あるいは、生物学的サンプルは、試験対象由来のｍＲＮＡ分子、または試験対象由来のゲノムＤＮＡ分子を含んでいてもよい。ここで適切な具体的な生物学的サンプルは、従来の手段によって対象から単離された好中球サンプルである。
従って、キャリアーまたは罹患した対象に関する、病気との関連および核酸またはタンパク質の多型の診断剤の同定は、予後分析または診断分析を展開させるのに有益である可能性がある。例えば、リウマチ様関節炎、喘息、クローン病等に関して、予後分析または診断分析を行なうことは有益であると予測される。活性化状態または炎症性の状態に関連する細胞において、本発明の核酸またはタンパク質の発現は上昇する。炎症に関連する障害としては、アナフィラキシーの状態、大腸炎、クローン病、水腫状の状態、接触過敏症、アレルギー、その他の形態の関節炎、髄膜炎、および膨潤が発生した部位における血管拡張、熱、細胞の集合、体液などによる傷害に免疫系が反応しているその他の状態などが挙げられる。従って、代謝における障害は、リウマチ様関節炎のための診断剤であり得る。さらに、リウマチ様関節炎の分子メカニズムを、検出することが可能であり、例えば、診断用ＳＮＰ、ＲＦＬＰ、発現レベルの変動、機能の変動などが存在する可能性があり、これらが、組織サンプル（例えば血液サンプル）で検出可能にし得る。
その他の実施形態において、本方法はさらに、コントロール対象から生物学的サンプルを得ること、生物学的サンプル中でタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在および量が検出されるように、コントロールサンプルと、本発明のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出することができる化合物または作用物質とを接触させること、次に、コントロールサンプル中のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在および量と、試験サンプル中のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在および量とを比較すること、を含む。
４．化学物質ライブラリーのハイスループット分析
本発明の核酸またはタンパク質の活性を調節することができる化合物のためのいずれの分析も、ハイスループットスクリーニングで処理することができる。ハイスループットスクリーニングシステムは市販されている（例えば、ザイマーク社（Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐ．），ホプキントン，マサチューセッツ州；エアー・テクニカル・インダストリーズ（Ａｉｒ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ），メンター，オハイオ州；ベックマン・インスツルメンツ社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．），フラトン，カリフォルニア州；プレジション・システムズ社（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．），ナティック，マサチューセッツ州などを参照）。これらのシステムは、典型的には、分析に適した検出器における、全てのサンプルおよび試薬のピペッティング、液体の分配、時間測定されたインキュベーション、および最終的なマイクロプレートの測定値などの全手順を自動化している。これらの設定可能なシステムは、ハイスループットで迅速なスタートアップ、同様に、高度なフレキシビリティーおよびカスタマイゼーションを提供する。このようなシステムの製造元は、様々なハイスループットプロトコールの詳細なプロトコールを提供している。従って、例えばザイマーク社は、遺伝子転写物の修飾、リガンド結合などを検出するためのスクリーニングシステムを説明する技術報告を提供している。
５．キット
本発明はまた、生物学的サンプル（試験サンプル）中で本発明の核酸またはタンパク質の存在を検出するためのキットも包含する。このようなキットを用いて、対象が、異常な発現に関連する障害（例えば免疫疾患）に罹患しているかどうかまたはそれを発症させる危険が高いかどうか、を決定することができる。例えば、本キットは、生物学的サンプル中で本発明のタンパク質またはｍＲＮＡを検出することができる標識された化合物または作用物質、およびサンプル中の核酸またはタンパク質の量を決定するための手段（例えば、抗体またはオリゴヌクレオチドプローブ）を含んでいてもよい。また、キットを用いて、タンパク質またはｍＲＮＡの量が正常なレベルより高いか、または低い場合に、試験される対象が、本発明の核酸またはタンパク質の異常な発現に関連する障害に罹患しているかどうか、またはそれらを発症させる危険性があるかどうかを示す結果を得ることもできる。
抗体ベースのキットについて、本キットは、例えば：（１）本発明のタンパク質に結合する第一の抗体（例えば、固体支持体に結合した）；および場合により、（２）本発明のタンパク質、または第一の抗体に結合し、検出可能な作用物質に連結された第二の異なる抗体、を含んでいてもよい。第二の抗体が存在しない場合、第一の抗体のいずれかを検出可能に標識してもよく、あるいは、第一の抗体と結合するその他の分子を検出可能に標識してもよい。あらゆる事象において、標識された結合成分が含まれ、これらは、この技術分野で既知のように、検出可能なレポーター分子として役立つ。
オリゴヌクレオチドベースのキットについて、本発明のキットは、例えば：（１）オリゴヌクレオチド、例えば、本発明の核酸配列にハイブリダイゼーションする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドまたは（２）本発明の核酸分子を増幅するのに有用なプライマー対、を含んでいてもよい。
また、本キットは、例えば、緩衝剤、保存剤またはタンパク質安定剤を含んでいてもよい。また、本キットは、検出可能な作用物質を検出するのに必要な成分（例えば酵素または基質）を含んでいてもよい。その上、本キットはまた、分析して、試験サンプルと比較することができる、コントロールサンプルまたは一連のコントロールサンプルを含んでもよい。本キットのそれぞれの成分は通常、別個のコンテナーに封入され、様々なコンテナーは全て、一つのパッケージ内に含められる。また、説明書および参考資料が封入されていてもよい。
６．臨床試験の際の作用のモニタリング
本発明の核酸またはタンパク質の発現または活性に対する作用物質（例えば薬物または化合物）の影響（例えば、異常な細胞増殖、分化および／または機能を調節する能力）のモニタリングは、基本的な薬物スクリーニングだけでなく、臨床試験においても適用することができる。例えば、本明細書で説明されたようなスクリーニング分析によって決定されるような、遺伝子発現、タンパク質レベル、またはタンパク質活性を高める作用物質の有効性は、遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性の減少を示す被験者の臨床試験でモニターすることができる。あるいは、スクリーニング分析によって決定されるような、遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性を減少させる作用物質の有効性は、遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性の増加を示す被験者の臨床試験でモニターすることができる。このような臨床試験において、発現または活性、好ましくは、例えば細胞の増殖障害に関与しているその他の遺伝子の発現または活性は、特定の細胞の免疫反応性を示すマーカーとして用いることができる。例えば、これらに限定されないが、本発明の核酸またはタンパク質の活性を調節する（例えば、本明細書で説明されているスクリーニング分析で同定されたような）作用物質（例えば、化合物、薬物または低分子物質）で処理することによって細胞中で調節される本発明の遺伝子などの遺伝子を同定することができる。従って、例えば臨床試験において、細胞の増殖障害に対する作用物質の作用を研究するために、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、本発明の核酸および上記障害に関与するその他の遺伝子の発現レベルについて解析することができる。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書で説明されたようなノーザンブロット解析またはＲＴ−ＰＣＲによって、あるいは本明細書で説明された方法のいずれか１つによって生産されたタンパク質の量を測定することによって、または本発明の遺伝子、またはその他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって定量することができる。このようにして、遺伝子発現パターンは、上記作用物質に対する細胞の生理学的な応答の指標となるマーカーとして役立たせることができる。従って、その応答状態は、上記物質で個体を治療する前、および治療中の様々な時点で決定することができる。
特定の実施形態において、本発明は、作用物質（例えば、本明細書で説明されているスクリーニング分析によって同定された、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模擬薬、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子物質、またはその他の薬物候補）での対象の治療の有効性をモニタリングする方法を提供し、本方法は、（ｉ）上記作用物質を投与する前に、対象から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）上記投与前サンプル中の、本発明のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出する工程；（ｉｉｉ）対象からの１またはそれ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）投与後サンプル中の、本発明のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）投与前サンプル中の本発明のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと、投与後サンプル中の上記タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとを比較する工程；および（ｖｉ）対象への上記作用物質の投与をそれに従って変更する工程、を含む。例えば、本発明のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性を、検出されたレベルよりより高いレベルに増加させるために、すなわち、上記作用物質の有効性を高めるために、この作用物質の投与を増加させることが、望ましい場合がある。あるいは、本発明のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性を、検出されたレベルよりより低いレベルに減少させるために、すなわち、上記作用物質の有効性を減少させるために、この作用物質の投与を減少させることが、望ましい場合がある。
以下の実施例により、本発明をより詳細に説明する。
〔実施例〕
実施例１
モルモットＤＰ受容体の初期のエキソンを有するＤＮＡフラグメントのクローニング
モルモット（Ｃａｖｉａｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）ＤＰ受容体のｃＤＮＡのクローニングを、ＰＣＲを用いてＤＰ受容体のエキソンを有するフラグメントをゲノムＤＮＡからクローニングすることによって開始した。各種のＰＣＲプライマーは、プログラムシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）（ジーン・コード（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ），アナーバー，ミシガン州）を用いて並べられたヒト（Ｕ３１３３２）、マウス（ＮＭ＿００８９６２）およびラット（ＮＭ＿０２２２４１）ＤＰ受容体配列の保存された領域を用いて設計された。モルモットゲノムＤＮＡを、ＣｅＭｉｎｅｓ（エバークリーン社）から購入した。モルモットのゲノムＤＮＡの４２０ｂｐのフラグメントを増幅するのに用いられたプライマーを、プライマー６７５＿Ｔｏｐｏ＿Ｆ３（配列番号３：ＧＧＧＡＣＡＣＣＣＴＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＡ）、および６７５＿Ｔｏｐｏ＿Ｒ２（配列番号４：ＧＡＡＣＡＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧＡＧＣＡＣＴＧ）を用いて行った。ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニング（インビトロジェン，カールスバッド，カリフォルニア州）を用いてクローニングし、インサートを、ＡＢＩ ３１００ ＤＮＡシーケンサーで製造元の説明書に従って配列解析した。
３’および５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲクローニング
得られたＤＮＡ配列を、ヒト、マウスおよびラットＤＰ配列に並べた。このアライメントから、ＰＣＲ産物の配列が、試験された種由来のＤＰ受容体コンセンサスに相同であるが、それらとは別個のものであることが明らかになった（図３）。モルモットＤＰ受容体のコンセンサスを用いて、ＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）法を用いてクローニングされた配列を包含するように追加のプライマーを設計した。ＤＰ受容体転写物の３’末端を得るために、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＢＤバイオサイエンシズの子会社），パロアルト，カリフォルニア州）製のＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥシステムを用いた。モルモットの肺のｍＲＮＡを、モルモットＤＰ受容体のｍＲＮＡ配列を含むようにｃＤＮＡテンプレートに変換されたプライマー６７５＿ＧＰ＿３’ＲＡＣＥ＿Ｆ（配列番号５：ＧＴＧＣＴＣＧＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＴＧ）を用いた。ＤＰ受容体のコード配列の完全な３’伸長を解明するために、ＲＡＣＥ産物を、ＰＣＲ４−Ｔｏｐｏ（インビトロジェン，カールスバッド，カリフォルニア州）にクローニングし、配列解析し、上述のように並べた。モルモットＤＰ受容体のｃＤＮＡの５’末端を単離するために、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥを、プライマー６７５＿Ｒｅｖ＿Ｐ２（配列番号６：ＣＡＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧＡＧＣＡＣＧＧＴＣＡＴＧＡ）を用いて行い、１ｋｂのＰＣＲ産物を得た。精製されたＰＣＲ産物を、プライマー６７５＿ＲＡＣＥ＿Ｒ９（配列番号７：ＴＣＡＣＣＡＧＧＣＡＣＴＴＧＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＣＴＧＴ）を用いる５’ネステッドＲＡＣＥのためのテンプレートとして用いた。ＤＰ受容体のコード配列の完全な５’伸長を解明するために、このＲＡＣＥ産物を、上述のようにＰＣＲ４−Ｔｏｐｏ（インビトロジェン）にクローニングし、配列解析し、並べた。
モルモットＤＰ受容体をコードするｃＤＮＡの構築
プログラム遺伝子構築キット（テクストコ（Ｔｅｘｔｃｏ），キーン，ニューハンプシャー州）を用いて、ＤＰ受容体のコード配列を同定した。ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）クローニングに適合するプライマーを、コード配列の両端に合わせて設計し（ＧＷ６７５，フォワードプライマー配列番号８：ＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＡＧＧＡＡＴＧＴＣＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＴＧＣＡＡＣＡＣ；ＧＷ６７５，リバースプライマー配列番号９：ＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＣＴＧＧＡＴＴＣＣＡＣＧＴＴＡＧ）、モルモットのオボアルブミンで刺激された肺細胞から得られたｃＤＮＡを用いたＰＣＲ反応で利用した。ＰＦＵ Ｔｕｒｂｏ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ラホヤ，カリフォルニア州）熱安定性ポリメラーゼ１０ユニットおよびテンプレートｃＤＮＡ１００ｎｇを用いてＰＣＲを行った。１.１ｋｂのＤＮＡフラグメントを得て、キアクイック（ＱｉａＱｕｉｃｋ）プロトコール（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））によるゲル電気泳動クロマトグラフィーによって精製し、ゲートウェイＢＰリコンビナーゼクローニング法（インビトロジェン）を用いてｐＤＯＮＲ２０１ベクターにクローニングした。クローニング反応物を、Ｅ．コリＤＨ５−アルファに形質転換し、得られたコロニー由来のミニプレップＤＮＡを、ＤＮＡ配列解析で処理し、完全なＤＰ受容体コード配列のクローニングを確認した。
実施例２
ノーザンブロット解析
ノーザンブロット解析を、モルモットＤＰ受容体の最初のゲノムＤＮＡフラグメントを用いて行った（図５）。オボアルブミンで攻撃されたまたはオボアルブミン処理を受けていない雄性ハートレーモルモットから、肺を単離した。攻撃されていないモルモット由来の肺トータルＲＮＡ発現（レーン２）を、オボアルブミンで攻撃されたモルモット由来の肺トータルＲＮＡ発現（レーン３）と比較した。ローディングされたＲＮＡは、分光分析と１８ＳＲＮＡバンドの強度で測定されたものと同等であった。ＤＰ受容体に関するノーザンブロッティングで、モルモット肺中の３〜４ｋｂのｍＲＮＡが同定され、サイズは、マウスおよびヒトＤＰについて報告されている転写物と一致していた（Ｈｉｒａｔａ等，１９９４年；Ｂｏｉｅ等，１９９５年）。このｍＲＮＡは、オボアルブミンで感作され攻撃されたモルモットの肺で著しくアップレギュレートされており、この結果は、ＤＰ受容体は抗原で攻撃されたマウス肺でアップレギュレートされるというこれまで報告されている結果と同等であった（Ｍａｔｓｕｏｋａ等，２０００年）。これらのデータは、モルモット肺における喘息反応におけるＤＰの重要性を裏付けている。
実施例３
オルソログＤＰ受容体に対するモルモットの配列解析
モルモットＤＰ受容体に関するヌクレオチド配列（図１）および推定アミノ酸配列（図２）を示す。モルモットＤＰのｃＤＮＡは、３４５個のアミノ酸タンパク質（計算された分子量３８,２５０）をコードする１,０３２ｂｐのオープンリーディングフレームを含む。
モルモットＤＰタンパク質は、２種の可能性のあるＮ−グリコシル化部位、アミノ末端中のＡｓｎ−７および第一の細胞外ループ中のＡｓｎ−８６を含む。また、２種の可能性のあるプロテインキナーゼＣリン酸化部位も存在し、それぞれ第一および第三の細胞質内ループに位置するＳｅｒ−４６およびＴｈｒ−１４０である。
ヒト、ラットおよびマウスのＤＰの対応するの配列と比較した、モルモットＤＰ受容体のヌクレオチドの配列を図１に示す。同様に、タンパク質レベルで、モルモットＤＰ受容体に対する配列同一性は、ヒトＤＰでは６６％、マウスのＤＰでは６３％およびラッ
トＤＰでは６５％であった（図２）。
ヒドロパシー分析により、これまでにマウス、ラットおよびヒトＤＰの配列で定義された保存された領域に同様にマッピングされた推定の７回膜貫通ドメインの存在を確認した。配列の保存は、ＤＰオルソログ間の膜貫通ドメインで最大であった。プロスタノイドファミリーのＧＰＣＲのなかで特徴的に保存されていることがこれまで報告されている２つの配列ストレッチ（Ｈｉｒａｔａ等，１９９４年）もまた、モルモットＤＰタンパク質に存在していた：第二の細胞外ループ中のＱＹＣＰＧＴＷＣＲおよび７回膜貫通ドメイン中のＲＦＬＳＶＩＳＩＶＤＰＷＩＦＩは、全てのＤＰオルソログ間で同一であった。
ＴＭＤＶＩとＶＩＩとの間の細胞外ループもまた、種間での差を示した。このループは、オルソログ間で様々であり、長さは、ヒト、ラット、マウス、およびモルモットＤＰにおいてそれぞれ２４、２１、２１および１８個のアミノ酸であった。特に留意すべきことには、ヒトＤＰ受容体と比較して、モルモットＤＰにおいてＴＭＤＶＩとＶＩＩとの間に６個のアミノ酸の損失があった。その上、マウスおよびラットＤＰ受容体の両方において、この領域で３個のアミノ酸も除去されていた。Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等（２０００年）は、一連のキメラＩＰ−ＤＰ受容体を作製し、ＤＰのリガンド結合選択性を与える領域を定義した。興味深いことに、選択的かつ強力なＰＧＤ２の結合において重要であると結論づけた領域の１つは膜貫通ＶＩ〜ＶＩＩ領域であり、この新たにクローニングされたモルモットＤＰ受容体において、まったく同じ領域がアミノ酸６個分短いことが示された。リガンド親和性、または化合物の効力におけるオルソログの差は、ＴＭＤＶＩ〜ＶＩＩループ内での相互作用およびモルモット受容体でのこのループにおける変化による可能性がある。
第一および第三の細胞内ループは、モルモットＤＰタンパク質では３個およびアミノ酸５個分短く、それに対して、マウス、ヒトおよびラットＤＰタンパク質では、これらの細胞内ループは全て同一な大きさを有していた。また、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等も、ＰＧＤ２結合に関する第一の細胞外ループ領域に対する膜貫通ドメイン１の重要性を強調表示している。第一の細胞内ループは、モルモットＤＰにおいて、ヒト、マウスまたはラットＤＰと比較してアミノ酸３個分短いため、この領域は、受容体の結合親和性に寄与する追加の領域の可能性がある。加えて、受容体のこの領域は、化合物のヒトおよびモルモットＤＰに対する親和性で観察された差に寄与する可能性がある。第三の細胞内ループ（ＴＭＤＶとＶＩとの間）は、モルモットＤＰにおいてアミノ酸５個分短く、この受容体のその他の領域が、ＰＧＤ２の機能的な関連に寄与することを示す。
実施例４
ｐＥＡＫ１０−ｇｐＤＰおよびｐＥＡＫ１０−ｍＤＰ哺乳動物発現ベクターの構築
マウスのＤＰ受容体に関する全長ｃＤＮＡをＰＣＲにより得て、ゲートウェイＢＰリコンビナーゼクローニング方法を用いてｐＤＯＮＲ２０１ベクターにクローニングした。これにより、上述のモルモットＤＰベクターに類似したマウスのＤＰベクターが得られた。ＤＮＡ配列解析により、このマウスのＤＰのｃＤＮＡが、これまで説明されたマウスのＤＰ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ 登録番号ＮＭ＿００８９６２で定義される）に同一であることを確認した。発現の研究のために、マウスおよびモルモットＤＰ受容体を、ＬＲ反応によって、予めゲートウェイに適合させたｐＥＡＫ１０発現ベクター（エッジ・バイオシステムズ（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））にサブクローニングした。ｐＥＡＫ１０ベクターのゲートウェイへの適合は、ＥｃｏＲＩで消化し、続いてベクターへゲートウェイカセットをクローニングするためにクレノーで充填することによって行われた。得られたベクターｐＥＡＫ１０−ｇｐＤＰおよびｐＥＡＫ１０−ｍＤＰを、以下で説明するような安定な細胞系の生産のために用いた。
ＨＥＫ２９３−Ｇα１６細胞系の生成
ヒトＧα１６をコードするｃＤＮＡを、説明されているようにしてクローニングした（Ａｍａｔｒｕｄａ等，１９９１年）。簡単に言えば、ＨＬ−６０ヒト前骨髄球性白血病細胞由来のトータルＲＮＡを単離し、Ｇα１６をコードするｃＤＮＡのＰＣＲが介在する合成のためのテンプレートとして用いた。それにより生じたＰＣＲ産物を、単鎖抗体（ｓＦｖ）も共発現する発現ベクターｐＨｏｏｋ−３（インビトロジェン）にクローニングし、ハプテンで被覆した磁気ビーズ（Ｃｈｅｓｎｕｔ等，１９９６年）を用いたパンニングプロトコールを用いてトランスフェクションされた細胞を適度に濃縮させた。ＨＥＫ２９３細胞を、構築されたプラスミド（ｐＧα１６）でトランスフェクションし、ゼオシンで選択し、磁気ビーズを販売元が提供するプロトコールに従って用いてポジティブクローンを濃縮した。最終的な精製および選択のために、シングルクローンを個々に成長させ、元来Ｇαｓにカップリングされる任意選択されたＧＰＣＲ（ＧＩＰ受容体）のための発現ベクターでアリコートをさらにトランスフェクションすることによってＧα１６の機能的な発現に関して分析し、続いて、モレキュラーデバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ）製のＦＬＩＰＲ装置を用いて、トランスフェクションされた細胞をカルシウムシグナル伝達に関して試験した。
ＨＥＫ２９３−Ｇα１６細胞におけるｐＥＡＫ１０−ｇｐＤＰおよびｐＥＡＫ１０−ｍＤＰの発現
ｐＥＡＫ１０−ｇｐＤＰおよびｐＥＡＫ１０−ｍＤＰベクターを、リポフェクトアミン２０００（ギブコ）を製造元によって説明されているように用いて、ＨＥＫ２９３−Ｇα１６細胞系にトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を、１μｇ／ｍｌピューロマイシンおよび２５０μｇ／ｍｌゼオシンを用いた選択下で５週間培養した。トランスフェクションされた細胞個体群で、ＰＧＤ２刺激に応答した細胞内のカルシウムの放出を測定することによってＤＰ受容体の発現をモニターした。
細胞内カルシウム分析
機能的な特徴付けのために、新たにクローニングされたモルモットＤＰ受容体を、ＨＥＫ２９３−Ｇα１６細胞に安定してトランスフェクションさせ、比較のために、同等の細胞系を、マウスのＤＰ受容体を用いて作製した。ＤＰ受容体を発現する細胞系、同様に、トランスフェクションされたＤＰ受容体をまったく発現しない親細胞系の両方を、受容体をＧα１６へカップリングする力を用いてカルシウム応答を惹起させる第２メッセンジャー分析で評価した。細胞内カルシウム測定は、トランスフェクションされていないＨＥＫ２９３−Ｇα１６細胞、またはｐＥＡＫ１０−ｇｐＤＰもしくはｐＥＡＫ１０−ｍＤＰ発現ベクターのいずれかでトランスフェクションされた細胞を用いて行われた。トランスフェクションされた細胞とトランスフェクションされていない細胞を、３８４ウェルプレートで、１０,０００細胞／ウェルで平板培養した。細胞をカルシウム分析緩衝液で３回洗浄した。次に、細胞を、４μＭのカルシウムローディング色素Ｆｕｒａ−４／ＡＭ（モレキュラープローブス）と共に３７℃でｘ分インキュベートした。取り込まれなかったＦｕｒａ−４／ＡＭを、カルシウム分析緩衝液でさらに３回洗浄することによって除去した。Ｆｕｒａ−４／ＡＭがローディングされた細胞をＰＧＤ２または緩衝液で刺激した後、ＦＬＩＰＲ機器（モレキュラーデバイス社）を用いて細胞内カルシウムを測定した。図６に示すように、ＰＧＤ２の刺激により、モルモットおよびマウスのＤＰを発現する細胞系の両方で細胞内カルシウム動員の強い増加が引き起こされた（ＥＣ５０値はそれぞれ、１.４ｎＭ、および１８ｎＭ）。両方の細胞系における最大カルシウム放出は同等であった。それに対して、親のＨＥＫ２９３−Ｇα１６細胞系のみが、極めて高いＰＧＤ２濃度（すなわち、１０μＭを超えるＰＧＤ２）でカルシウム応答を示した。
実施例５
ＳＰＡｃＡＭＰ分析
新たにクローニングされたモルモットＤＰ受容体の追加の機能的な特徴付けは、天然のＤＰに関するシグナル伝達経路、アデニレートシクラーゼによるｃＡＭＰ生産の刺激を用いた。トランスフェクションされた細胞、またはトランスフェクションされていない細胞を、９６ウェルプレートのウェルあたり４０,０００細胞で平板培養した。３７℃で一晩インキュベートした後に、培地を換え、細胞をＰＧＤ２の定義された濃度で１５分間刺激した。刺激された細胞におけるｃＡＭＰの蓄積を、ｃＡＭＰ ＳＰＡダイレクトスクリーニング分析システム（アマシャム）を製造元によって特定された手法に従って用いて測定した。図７に示すように、モルモットＤＰ細胞系は、ＰＧＤ２の刺激に対して優れたｃＡＭＰ応答を示し、これは、マウスのＤＰ受容体の応答と同等であった。ＥＣ50値は、モルモット、およびマウスのＤＰ細胞系でそれぞれ、０.８ｎＭおよび０.５ｎＭであり、最大の応答は両方の受容体で同等であった。それに対して、親のＨＥＫ２９３−Ｇα１６細胞系は、ＰＧＤ２の刺激に応答した細胞内ｃＡＭＰの増加を示さなかった。
参考文献
Arimura A, Yasui K, Kishino J, Asanuma F, Hasegawa H, Kakudo S, Ohtani M, Arita H (2001). Prevention of allergic inflammation by a novel prostaglandin receptor antagonist, S-5751. J Pharmacol Exp Ther. 298(2), 411-9
Armstrong, R. A. 1996 Platelet prostanoid receptors. Pharmacol. Ther. 72:171-191.
Boie, Y., Sawyer, N., Slipetz, D.M., Metters, K.M., Abramovitz, M. 1995 Molecular cloning and characterization of the human prostanoid DP receptor. J. Biol. Chem. 270:18910-18916.
Brightling CE, Bradding P, Pavord ID, Wardlaw AJ (2003). New Insights into the role of the mast cell in asthma. Clin Exp Allergy 33, 550-556
Coleman, R.A., Smith, W.L., Narumiya, S. 1994 VIII. International union of pharmacology classification of prostanoid receptors: properties, distribution, and structure of the receptors and their subtypes. Pharmacol. Rev. 46:205-229.
Doyle WJ, Boehm S, Skoner DP (1990) Physiologic responses to intranasal dose-response challenges with histamine, methacholine, bradykinin, and prostaglandin in adult volunteers with and without nasal allergy. J Allergy Clin Immunol. 86(6 Pt 1), 924-35
Hirata, M., Kakizuka, A., Aizawa, M., Ushikubi, F., Narumiya, S. 1994 Molecular characterization of a mouse prostaglandin D receptor and functional expression of the cloned gene. 91:11192-11196.
Holgate S, Lackie P, Wilson S, Roche W, Davies D. (2000) Bronchial Epithelium as a key Regulator of Airway Allergen Sensisitzation and Remodelling in Asthma. Am J Respir Crit Care Med. 162, 113-117
Ito, S., Narumiya, S. and Hayaishi, O. 1989 Prostaglandin D2: a biochemical perspective Pros. Leuko. Essent. Fatty Acids 37:219-234.
Lewis, RA, Soter NA, Diamond PT, Austen KF, Oates JA, Roberts LJ II (1982). Prostaglandin D2 generation after activation of rat and human mast cells with anti-IgE. J. Immunol 129, 1627-1631.
Matsuoka, T., Hirata, M., Tanaka, H., Takahashi, Y., Murata, T., Kabashima, K,
Sugimoto, Y., Kobayashi, T., Ushikubi, F., Aze, Y., Eguchi, N., Urade, Y., Yoshida, N., Kimura, K, Mizoguchi, A., Honda, Y., Nagai, H., Narumiya, S. 2000 Prostaglandin D2 as a mediator of allergic asthma. Science 287:2013-2017.
Sambrook, et al., eds. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
Roberts, L.J. II, Sweetman, B.J., Lewis, R.A., Austin, K.F., Oates, J.A. 1980 Increased production of prostaglandin D2 in patients with systemic mastocytosis.
N. Eng. J. Med. 303:1400-1404.
Wright, D.H., Nantel, F., Metters, K.M., Ford-Hutchinson, A.W. 1999 A novel biological role for prostaglandin D2 is suggested by distribution studies of the rat DP prostanoid receptor. Eur. J. Pharmacol. 377:101-115.
本発明の受容体の核酸配列を示す（配列番号１）。 本発明の受容体のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。 多数の種間のＤＰ受容体のコード配列のアライメントを示す。 多数の種間のＤＰ受容体のアミノ酸配列のアライメントを示す。 モルモット（Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）のＤＰ受容体のゲノムＤＮＡフラグメントの、ノーザンブロット解析を示す。 安定してトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３−Ｇα１６細胞で発現された組換えモルモットＤＰ受容体の、マウスのＤＰ受容体を用いて作製された同等の細胞系および親細胞系と比較したＰＧＤ２で誘導されたカルシウム動員の例を示す。 ＳＰＡｃＡＭＰ分析を用いた、安定してトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３−Ｇα１６細胞で発現された組換えモルモットＤＰ受容体のＰＧＤ２の用量反応曲線の例を示す。

Claims (46)

  1. 配列番号１の核酸配列を含む、単離された核酸分子。
  2. 核酸は、配列番号２のポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  3. 検出可能な標識をさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  4. 検出可能な標識は、酵素、放射性同位体、または蛍光を発する化学物質を含む、請求項３に記載の単離された核酸分子。
  5. 核酸配列は、ＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびｃＤＮＡからなる群より選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  6. 配列番号１の核酸配列にハイブリダイゼーションする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
  7. 核酸配列は、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする、請求項６に記載の単離された核酸分子。
  8. ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ中で約４５℃で起こり、続いて、０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で、約５０〜６５℃で少なくとも１回洗浄する、請求項７に記載の単離された核酸分子。
  9. 配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸を含む、単離された核酸分子。
  10. 遺伝子コードの縮重の結果として、配列番号１の核酸とは異なる、請求項９に記載の核酸分子。
  11. 配列番号１の核酸に少なくとも６５％同一な核酸を含む、単離された核酸分子。
  12. 核酸は、配列番号１の核酸に少なくとも７５％同一である、請求項１１に記載の単離された核酸分子。
  13. 核酸は、配列番号１の核酸に少なくとも８５％同一である、請求項１１に記載の単離された核酸分子。
  14. 核酸は、配列番号１の核酸に少なくとも９５％同一である、請求項１１に記載の単離された核酸分子。
  15. 配列番号２のアミノ酸配列を含む、組換えポリペプチド。
  16. 検出可能な標識をさらに含む、請求項１５に記載の組換えポリペプチド。
  17. 検出可能な標識は、酵素、放射性同位体、または蛍光を発する化学物質を含む、請求項１６に記載の組換えポリペプチド。
  18. 配列番号２の配列に少なくとも６５％同一なアミノ酸配列を含み、そして配列番号２のポリペプチドの機能を保持する、組換えポリペプチド。
  19. アミノ酸配列は、配列番号２の配列に少なくとも７５％同一である、請求項１８に記載の組換えポリペプチド。
  20. アミノ酸配列は、配列番号２の配列に少なくとも８５％同一である、請求項１８に記載の組換えポリペプチド。
  21. アミノ酸配列は、配列番号２の配列に少なくとも９５％同一である、請求項１８に記載の組換えポリペプチド。
  22. 請求項１８に記載の組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
  23. 請求項１９に記載の組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
  24. 請求項２０に記載の組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
  25. 請求項２１に記載の組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
  26. 請求項１５に記載の組換えポリペプチドに特異的な抗体。
  27. 抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびキメラ抗体からなる群より選択される、請求項２６に記載の抗体。
  28. 検出可能な標識をさらに含む、請求項２６に記載の抗体。
  29. 検出可能な標識は、酵素、放射性同位体、蛍光を発する化学物質、または抗体によって認識可能な抗原性ペプチドタグを含む、請求項２８に記載の抗体。
  30. 発現調節因子と機能するように結合されている請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
  31. 発現調節因子は、構成的な調節配列、細胞特異的な調節配列、および誘導性の調節配列からなる群より選択される、請求項３０に記載の発現ベクター。
  32. 発現調節因子は、プロモーターであり、該プロモーターは、ｈＣＭＶの前初期プロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、アデノウイルスの初期プロモーター、ワクシニアの初期プロモーター、ポリオーマの初期プロモーター、ＳＶ４０の後期プロモーター、アデノウイルスの後期プロモーター、ワクシニアの後期プロモーター、ポリオーマの後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣシステム、ＴＲＣシステム、ファージラムダの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、酸性ホスファターゼプロモーター、または酵母α交配因子のプロモーターを含む、請求項３０に記載の発現ベクター。
  33. 請求項３０に記載の発現ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞。
  34. 宿主細胞は、原核細胞または真核細胞を含む、請求項３３に記載の宿主細胞。
  35. 宿主細胞は、Ｅ．コリ、シュードモナス属、バチルス属、ストレプトミセス属、酵母、ＣＨＯ、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、またはＳｆ９細胞を含む、請求項３４に記載の宿主細胞。
  36. 発現調節因子と機能するように結合されている請求項６に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
  37. 請求項３６に記載の発現ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞。
  38. 発現調節因子と機能するように結合されている請求項１１に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
  39. 請求項３８に記載の発現ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞。
  40. ａ）配列番号１の核酸；
    ｂ）配列番号２のアミノ酸をコードする核酸、
    からなる群より選択される核酸に相補的なアンチセンスＲＮＡを含む、単離された核酸分子。
  41. 配列番号１の単離された核酸を含むトランスジーンを含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物。
  42. ａ）請求項１９に記載の宿主細胞を、該組換えポリペプチドの発現をもたらす条件下で培養する工程；および
    ｂ）該組換えポリペプチドを回収する工程、
    を含む、請求項１５に記載の組換えポリペプチドを生産する方法。
  43. ａ）タンパク質と、請求項２６に記載の抗体とを接触させる工程；および
    ｂ）該抗体と該タンパク質との相互作用を評価する工程、
    を含む、タンパク質を検出する方法。
  44. ａ）アゴニスト候補と、配列番号２を発現する細胞とを接触させる工程；および
    ｂ）該アゴニスト候補の存在下において、配列番号２のシグナル伝達活性が、該アゴニスト候補の非存在下における配列番号２の活性に比べて増加しているかどうかを決定する工程、
    を含む、配列番号２のアゴニストを同定する方法。
  45. ａ）インバースアゴニスト候補と、配列番号２を発現する細胞とを接触させる工程；および
    ｂ）該インバースアゴニスト候補の存在下において、配列番号２の活性が、該インバースアゴニスト候補の非存在下における配列番号２の活性に比べて減少しているかどうか、および内因性のリガンドまたはアゴニストの存在下において減少しているかどうか、を決定する工程、
    を含む、配列番号２のインバースアゴニストを同定する方法。
  46. ａ）アンタゴニスト候補と、配列番号２を発現する細胞とを接触させる工程；および
    ｂ）該アンタゴニスト候補の存在下において、配列番号２のシグナル伝達活性が、内因性のリガンドまたはアゴニストの存在下における配列番号２の活性に比べて減少しているかどうかを決定する工程、
    を含む、配列番号２のアンタゴニストを同定する方法。
JP2006547050A 2003-12-30 2004-12-07 新規のプロスタグランジン受容体タンパク質をコードする核酸およびその使用方法 Expired - Fee Related JP4700620B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/747,994 2003-12-30
US10/747,994 US7183062B2 (en) 2003-12-30 2003-12-30 Prostaglandin receptor protein and methods of use thereof
PCT/US2004/040853 WO2005066209A1 (en) 2003-12-30 2004-12-07 Nucleic acid encoding a novel prostaglandin receptor protein and methods of use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2008504010A true JP2008504010A (ja) 2008-02-14
JP4700620B2 JP4700620B2 (ja) 2011-06-15

Family

ID=34700825

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006547050A Expired - Fee Related JP4700620B2 (ja) 2003-12-30 2004-12-07 新規のプロスタグランジン受容体タンパク質をコードする核酸およびその使用方法

Country Status (12)

Country Link
US (4) US7183062B2 (ja)
EP (1) EP1706422A1 (ja)
JP (1) JP4700620B2 (ja)
KR (1) KR20060105877A (ja)
CN (1) CN1898263B (ja)
AR (1) AR047356A1 (ja)
AU (1) AU2004312332B2 (ja)
BR (1) BRPI0418335A (ja)
CA (1) CA2551905C (ja)
IL (2) IL176445A0 (ja)
TW (1) TW200532019A (ja)
WO (1) WO2005066209A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030133592A1 (en) * 1996-05-07 2003-07-17 Rhoads Geoffrey B. Content objects with computer instructions steganographically encoded therein, and associated methods
US7329725B1 (en) 2003-10-29 2008-02-12 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Phage displayed Trp cage ligands
US7704953B2 (en) * 2006-02-17 2010-04-27 Mdrna, Inc. Phage displayed cell binding peptides
CN111951887B (zh) * 2020-07-27 2024-06-28 深圳市新合生物医疗科技有限公司 基于深度学习的白细胞抗原与多肽结合亲和力预测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07258295A (ja) * 1994-03-22 1995-10-09 Ono Pharmaceut Co Ltd プロスタグランジンｄ受容体、その製造方法、その受容体をコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクターおよびそのベクターで形質転換された宿主細胞
JPH10507930A (ja) * 1995-01-26 1998-08-04 メルク フロスト カナダ インコーポレーテツド プロスタグランジンレセプターｄｐ
WO2000028032A2 (en) * 1998-11-12 2000-05-18 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human cell surface receptor proteins

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07258295A (ja) * 1994-03-22 1995-10-09 Ono Pharmaceut Co Ltd プロスタグランジンｄ受容体、その製造方法、その受容体をコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクターおよびそのベクターで形質転換された宿主細胞
JPH10507930A (ja) * 1995-01-26 1998-08-04 メルク フロスト カナダ インコーポレーテツド プロスタグランジンレセプターｄｐ
WO2000028032A2 (en) * 1998-11-12 2000-05-18 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human cell surface receptor proteins

Also Published As

Publication number Publication date
CN1898263A (zh) 2007-01-17
CN1898263B (zh) 2012-05-16
AU2004312332A1 (en) 2005-07-21
US20090178151A1 (en) 2009-07-09
US20050142558A1 (en) 2005-06-30
US7183062B2 (en) 2007-02-27
EP1706422A1 (en) 2006-10-04
AR047356A1 (es) 2006-01-18
BRPI0418335A (pt) 2007-05-02
JP4700620B2 (ja) 2011-06-15
US20100152427A1 (en) 2010-06-17
IL201026A0 (en) 2011-07-31
CA2551905A1 (en) 2005-07-21
US7488799B2 (en) 2009-02-10
CA2551905C (en) 2013-03-19
AU2004312332B2 (en) 2010-05-20
US7723074B2 (en) 2010-05-25
IL176445A0 (en) 2006-10-05
TW200532019A (en) 2005-10-01
WO2005066209A1 (en) 2005-07-21
KR20060105877A (ko) 2006-10-11
US20080020403A1 (en) 2008-01-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7723074B2 (en) Nucleic acid molecules encoding prostaglandin receptor proteins
JP2005517398A (ja) Ｇタンパク質共役型受容体をコードする核酸及びその使用
US7517960B2 (en) Rat KCNQ5 voltage-gated potassium channel
MXPA06007364A (en) Nucleic acid encoding a novel prostaglandin receptor protein and methods of use thereof
US20030186873A1 (en) Nucleic acid encoding a G-protein-coupled receptor, and uses thereof
US20030166008A1 (en) Nucleic acid encoding a G-protein-coupled receptor, and uses thereof
US20070190554A1 (en) Novel binding site for retigabine on KCNQ5
US20030138418A1 (en) Nucleic acid encoding a G-protein-coupled receptor, and uses thereof
EP1470420A2 (en) A nucleic acid encoding a g-protein-coupled receptor, and uses thereof
AU2003214861A1 (en) A nucleic acid encoding a G-protein-coupled receptor, and uses thereof
WO2003042399A9 (en) A nucleic acid encoding a g-protein-coupled receptor, and uses thereof
AU2002363792A1 (en) A nucleic acid encoding a G-protein-coupled receptor, and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100706

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101005

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20101109

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110124

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20110222

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20110304

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees