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JP2008500013A - Ｔｉｍ−３ポリペプチド - Google Patents

Ｔｉｍ−３ポリペプチド Download PDF

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テリー ストロム，
ユージーン ケイ． チャ，
スモネ チャクラバルティ，
キャサリーン サバトス，
チェン チュー，
シン シャオ チェン，
アルバート サンチェス−フエゴ，
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Beth lsrael Deaconess Medical Center
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Abstract

本発明は、ｔｉｍ−３ ＩｇＶドメインおよびｔｉｍ−３細胞内ドメインを含み、ｔｉｍ−３ムチンドメインまたはｔｉｍ−３膜貫通ドメインを含まない単離ポリペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸に関する。さらに、本発明は、治療有効量のｔｉｍ−３活性を調整する薬剤を被験体に投与する工程を含む、被験体の免疫応答を調整する方法に関する。免疫応答には、免疫寛容、移植免疫寛容、Ｔｈ１応答、およびＴｈ２応答が含まれるが、これらに限定されない。

Description

（関連出願）
本出願は、「ＴＩＭ−３ ＬＩＧＡＮＤＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ」と題された、２００３年１０月３日に出願された米国特許出願番号６０／５０８，３１９の出願日の利益を主張する。参照した出願のその全体の教示は、本明細書中に参考として援用される。
（政府支援）
本明細書中に記載の研究は、国立衛生研究所の助成金番号１ＲＯ１ＮＳ０４５９３７−０１、２Ｒ０１ＮＳ３５６８５−０６、２Ｒ３７ＮＳ３０８４３−１１、１ＲＯ１ＡＩ４４８８０−０３、２Ｐ０１ＡＩ３９６７１−０７、１ＰＯ１ＮＳ３８０３７−０４、および１Ｆ３１ＧＭ２０９２７−Ｏ１によって資金提供を受けた。したがって、合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
（発明の背景）
抗原による刺激の際、ナイーブＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、そのサイトカインプロフィールによって定義される１つの主なエフェクター経路（Ｔｈ１およびＴｈ２細胞）に達する（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。
Ｔｈ１細胞は、細胞内病原体に対する細胞性免疫応答に最も頻繁に関連するサイトカイン（インターフェロン（ＩＦＮ−γ、インターロイキン（ＩＬ）−２、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α、およびリンホトキシン）を産生する。不適切なＴｈ１応答の病理学的結果は、遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応（非特許文献４）、臓器特異的自己免疫疾患の誘導（非特許文献５）、関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、および同種移植片拒絶である。
Ｔｈ２細胞は細胞外蠕虫感染の除去に必要なサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３）を産生し、適切なＴｈ２細胞の活性化によりアトピー性疾患およびアレルギー性喘息などのアレルギー性疾患の発症が促進される（非特許文献３、非特許文献４）。
疾患におけるその異なる役割に加えて、２つのＴヘルパーサブセットはまた、相互の拡大および機能を相互制御する。したがって、Ｔｈ２細胞の優先的誘導により自己免疫疾患が阻害され（非特許文献６、非特許文献７）、Ｔｈ１細胞の支配的誘導により喘息、アトピー、およびアレルギーを制御することができる（非特許文献８；非特許文献９）。
出願人は、最近、Ｔｈ１上で発現するが、Ｔｈ２細胞上では発現されない新規の細胞表面タンパク質Ｔｉｍ−３を同定した。Ｔｉｍ−３（Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有分子）は、その細胞外ドメインがＩｇＶ様ドメインおよびその後にムチン様領域から構成される２８１個のアミノ酸のＩ型膜タンパク質である。Ｔｉｍ−３のヒトオルソログは、マウスＴｉｍ−３と６３％のアミノ酸が同一である。Ｔｉｍ−３は多型であり、他のＴｉｍファミリーと共に、マウス喘息に関連している（非特許文献１０）。さらに、Ｔｉｍ−３遺伝子ファミリー領域は、ヒトにおける主な喘息感受性遺伝子座とシンテニーである（非特許文献１０）。これらの研究は、免疫媒介性疾患の制御におけるＴｉｍ−３およびＴｉｍ遺伝子ファミリーの重要性を過小評価している。
免疫応答の継続中におけるインビボでの抗Ｔｉｍ−３抗体の投与により、マクロファージの活性化および拡大が増加した（非特許文献１１）。抗Ｔｉｍ−３抗体治療はまた、自己免疫疾患である実験的自己免疫性能脊髄炎（ＥＡＥ）も悪化させ、死亡率を有意に増加させ、脱髄および活性化マクロファージの中枢神経系（ＣＮＳ）への浸潤を増加化させる。
Ｍｏｓｍａｎｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８６年、１３６巻、ｐ．２３４８−２３５７ Ｍｏｓｍａｎｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ、１９９６年、１９巻、ｐ．１３８−１４６ Ａｂｂａｓら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６年、３８３巻、ｐ．７８７−７９３ Ｓｈｅｒら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２年、１０巻、ｐ．３８５−４０９ Ｌｉｂｌａｕら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ、１９９５年、１６巻、ｐ．３４−３８ Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｌ．，ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９５年、３巻、ｐ．３９７−４０５ Ｋｕｃｈｒｏｏ，ら、Ｃｅｌｌ、１９９５年、８０巻、ｐ．７０７−７１８ Ｌａｃｋ，ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９４年、１５２巻、ｐ．２５４６−２５５４ Ｈｏｆｓｔｒａ，ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８年、１６１巻、ｐ．５０５４−５０６０ ＭｃＩｎｔｉｒｅ，Ｊ．ら、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００１年、２巻、ｐ．１１０９−１１１６ Ｍｏｎｎｅｙ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、４１５巻、ｐ．５３６−５４１
したがって、ｔｉｍ−３機能を調整し、それによって免疫応答を調整する薬剤を同定することが依然として必要とされている。本発明のいくつかの態様は、このような薬剤、このような薬剤の同定方法、およびこのような薬剤を使用した免疫応答の調整方法を提供する。
（発明の要旨）
本発明は、新規のポリペプチド、核酸、および組成物を提供し、免疫応答の調整で有用なものが含まれる。本発明は、必要とする被験体の免疫応答の調整方法および免疫応答を調整するために使用することができる薬剤の同定方法をさらに提供する。
本発明は、ｔｉｍ−３ ＩｇＶドメインおよびｔｉｍ−３細胞内ドメインを含む単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、ｔｉｍ−３ムチンドメインまたはｔｉｍ−３膜貫通ドメインを含まない、単離ポリペプチドを提供する。本発明はまた、このようなポリペプチドをコードする核酸を提供する。
本発明はまた、高ストリンジェンシー条件下で可溶性ｔｉｍ−３をコードする核酸とハイブリダイズするが、高ストリンジェンシー条件下で全長ｔｉｍ−３をコードする核酸とハイブリダイズしない単離核酸を提供する。このような核酸は、特に、免疫応答の調整に有利である。
さらに、本発明は、（ｉ）ｔｉｍ−３のＩｇＶドメインを含むポリペプチドと、（ｉｉ）増殖性状態の治療のための被験体への組成物の投与についての説明書とを含む薬学的パッケージを提供する。
本発明は、さらに、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合するが、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合しない単離抗体またはそのフラグメントを提供する。同様に、本発明は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合するが、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合しない単離抗体またはそのフラグメントを提供する。
本発明は、被験体に治療有効量のｔｉｍ−３活性を調整する薬剤を投与する工程を含む、被験体の免疫寛容などの被験体の免疫応答を調整する方法を提供する。本発明はまた、被験体のＴｈ１応答およびＴｈ２応答などの免疫応答の調整方法を提供する。
本発明は、さらに、免疫応答を調整する薬剤の同定方法およびｔｉｍ−３とガレクチン−９などのそのリガンドとの間の結合相互作用を調整する薬剤の同定方法を提供する。
本発明は、さらに、本明細書中に記載の任意の障害の治療薬の製造のための薬剤を提供する。被験体への薬剤の投与による障害の治療または防止のための本明細書中に開示の任意の方法を、これらの障害の治療薬の製造における薬剤の使用に適用することができる。例えば、１つの特定の実施形態では、Ｔｈ２媒介性障害の治療薬の製造にｔｉｍ−３ ＩｇＶ−ＨＳＡ融合タンパク質を使用することができるのに対して、Ｔｈ２媒介性障害の治療薬の製造にペグ化ガレクチン−９ポリペプチドを使用することができる。
（発明の詳細な説明）
（ｉ）概説
本発明は、Ｔｈ１細胞活性の調整および免疫応答（免疫寛容および移植免疫寛容が含まれるが、これらに限定されない）の調整のための試薬、組成物、および方法に関する。
本発明は、マウスおよびヒトにおけるｔｉｍ−３のＩｇＶドメインおよび細胞内ドメインを含むがムチンおよび膜貫通ドメインを欠くｔｉｍ−３の可溶型をコードするｔｉｍ−３の新規のスプライスイソ型の発見に一部由来する。本発明は、ｔｉｍ−３可溶性イソ型またはそのフラグメントをコードする単離核酸を提供する。本発明は、さらに、可溶性ｔｉｍ−３および免疫グロブリンのＩｇＦｃなどの他のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。さらに、本発明は、可溶性ｔｉｍ−３タンパク質の発現および／または機能を調整するが全長ｔｉｍ−３の発現および／または機能を調整しない試薬を提供する。
本発明はまた、リガンドによるｔｉｍ−３の活性化の遮断によってＴｈ１細胞の活性化（１細胞の増殖が含まれるが、これらに限定されない）ならびにサイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ−γの産生が増加するという発見に一部由来する。さらに、本発明は、マウスモデルで免疫寛容および移植免疫寛容を確立するためにリガンドとのｔｉｍ−３相互作用などのｔｉｍ−３活性が必要であるという発見に由来する。さらに、本発明はまた、ガレクチン−９がｔｉｍ−３リガンドであるという発見に由来する。ガレクチン−９は、種々の細胞型上の至るところに発現し、且つβ−ガラクトシドに結合するガレクチンファミリーのメンバーである。２つのガレクチン−９形態（長鎖（ｌｏｎｇ）型および単鎖（ｓｈｏｒｔ）型）がヒトで説明されている。ヒト単鎖イソ型は、長鎖イソ型中のＮ末端炭水化物結合ドメインと連結ペプチドとの間に存在する３１アミノ酸（ヒト長鎖イソ型の残基１４９〜１８０）を欠く。ヒトおよびマウスの単鎖ガレクチン−９アミノ酸配列をそれぞれ配列番号１０および１７に列挙し、その対応するＤＮＡコード配列を配列番号９および１６に列挙する。マウスおよびヒトの長鎖ガレクチン−９アミノ酸配列を、それぞれ配列番号１８および１９に列挙する。
ヒト単鎖ガレクチン−９イソ型では、Ｎ末端およびＣ末端炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）は、それぞれ１６〜１４６および１９５〜３２２にわたる。これらは、１４９〜１７４にわたるリンカーペプチド（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２２９９を参照のこと）によって連結されている。ヒト長鎖イソ型中の２つのＣＤＲは、それぞれ残基１６〜１４６および２２７〜３５４にわたる。
ガレクチン−９アミノ酸およびＤＮＡコード配列は、米国特許第６，４６８，７６８号および同第６，０２７，９１６号（本明細書中で参考として援用される）にも記載されている。したがって、本発明は、Ｔｈ１および／またはＴｈ２応答の増加または減少などの免疫応答の調整方法を提供し、免疫寛容および移植免疫寛容の増加または減少方法も提供する。
本発明の１つの態様は、ｔｉｍ−３ ＩｇＶドメインおよびｔｉｍ−３細胞内ドメインを含み、ｔｉｍ−３ムチンドメインまたはｔｉｍ−３膜貫通度面を含まない単離ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ヒトまたはマウスポリペプチドなどの哺乳動物ポリペプチドである。１つの実施形態では、ｔｉｍ−３ＩｇＶドメインは、配列番号１３のアミノ酸２２〜１３１または配列番号１４のアミノ酸２２〜１３２を含む。１つの実施形態では、ｔｉｍ−３細胞内ドメインは、配列番号１３のアミノ酸２２６〜３０１または配列番号１４のアミノ酸２１７〜２８１を含む。いくつかの実施形態では、単離ポリペプチドは、免疫グロブリンまたは他のキャリアタンパク質のＦｃドメインをさらに含む。
本発明は、さらに、本明細書中に記載の単離ポリペプチドを含む組成物を提供する。１つの実施形態では、組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む。本発明はまた、本明細書中に記載のポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明はまた、高ストリンジェンシー条件下で可溶性ｔｉｍ−３をコードする核酸とハイブリダイズするが、高ストリンジェンシー条件下で全長ｔｉｍ−３をコードする核酸とハイブリダイズしない単離核酸（配列番号５に記載の配列を含む核酸など）を提供する。
本発明の別の態様は、薬学的パッケージを提供する。特定の態様は、（ｉ）ｔｉｍ−３のＩｇＶドメインを含むポリペプチドと、（ｉｉ）増殖性状態の治療またはＴｈ２媒介病態の治療のための被験体への組成物の投与についての説明書とを含む薬学的パッケージを提供する。特定の実施形態では、増殖性状態は、腎細胞癌、カポジ肉腫、慢性白血病、前立腺癌、乳癌、肉腫、膵臓癌、白血病、卵巣癌、直腸癌、咽頭癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、リンパ腫、肥満細胞腫、肺癌、乳腺癌、咽頭扁平上皮細胞癌、精巣癌、ホジキンリンパ腫、消化管癌、または胃癌である。
特定の実施形態では、（ｉ）ガレクチン−９ポリペプチドを含むポリペプチドと、（ｉｉ）自己免疫障害の治療のための被験体への組成物の投与についての説明書とを含む薬学的パッケージを提供する。
本発明は、さらに、免疫試薬を提供する。特定の態様では、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合するが、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合しないか、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合するが、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合しない単離抗体またはそのフラグメント（配列番号６または８に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する抗体など）を提供する。好ましい実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。本発明は、さらに、前記モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を提供する。
本発明の１つの態様は、被験体の免疫応答の調整方法を提供する。本発明の１つの態様は、被験体に治療有効量のｔｉｍ−３活性を調整する薬剤を投与する工程を含む、必要とする被験体の免疫応答を調整する方法を提供する。１つの好ましい実施形態では、免疫応答の調整は、Ｔｈ１応答を増加させるかＴｈ２応答を減少させる工程を含み、薬剤はｔｉｍ−３活性を減少させる。
ｔｉｍ−３活性の減少によってＴｈ１応答を増加させるかＴｈ２応答を減少させる本明細書中に記載の方法の１つの実施形態では、被験体は、増殖性状態または喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、消化管アレルギー、食物アレルギー、好酸球増加症、結膜炎、もしくは糸球体腎炎などのＴｈ２媒介性障害を罹患している。別の特定の実施形態では、薬剤は可溶性ｔｉｍ−３の発現を阻害する。ｔｉｍ−３活性を減少させる薬剤は、ｔｉｍ−３に結合する抗体、ｔｉｍ−３の細胞外ドメインに結合する抗体、配列番号１３のアミノ酸３０〜１２８に結合する抗体などの抗体またはそのフラグメントであり得る。
ｔｉｍ−３活性の減少によってＴｈ１応答を増加させるかＴｈ２応答を減少させる本明細書中に記載の方法の１つの実施形態では、薬剤は、ｔｉｍ−３へのガレクチン−９の結合を減少させる。特定の実施形態では、薬剤は、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸３０〜１２８；または（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸３０〜１２８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド薬は、ペグ化またはヒト血清アルブミンもしくは免疫グロブリンのＦｃドメインなどの血漿タンパク質への融合などによってそのインビボでの安定性を増加させるように修飾されている。特定の実施形態では、薬剤は、ｔｉｍ−３のＩｇＶドメイン、ｔｉｍ−３の細胞内ドメイン、および免疫グロブリンのＦｃドメインを含むが、ｔｉｍ−３のムチンドメインまたはｔｉｍ−３の膜貫通ドメインを含まないポリペプチドを含む。特定の実施形態では、薬剤は、ｔｉｍ−３ポリペプチドまたはガレクチン−９ポリペプチドの発現レベルを減少させる。特定の実施形態では、薬剤は、二本鎖ＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、薬剤は、ガレクチン−９への全長ｔｉｍ−３の結合を阻害する（（ｉ）配列番号１３のアミノ酸３０〜１２８を含むポリペプチドの（ｉｉ）ガレクチン−９（配列番号１０または配列番号１９中など）への結合を阻害する薬剤など）。別の実施形態では、ｔｉｍ−３／ガレクチン−９結合を減少させる薬剤は、炭水化物（ラクトース、β−ガラクトシドなど）、グリコシル化ポリペプチド、ペクチン、または修飾ペクチンを含む。
被験体の免疫応答を調整する方法の１つの好ましい実施形態では、免疫応答の調整はＴｈ１応答を増加させるかＴｈ２応答を減少させる工程を含み、薬剤はｔｉｍ−３活性を減少させる。特定の実施形態では、被験体は、自己免疫障害、移植片対宿主病（ＨＶＧＤ）を罹患しているか、被験体は器官移植レシピエントである。
ｔｉｍ−３活性の増加によってＴｈ１応答を減少させるかＴｈ２応答を増加させる本明細書中に記載の方法の１つの実施形態では、薬剤は、抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドである。特定の実施形態では、抗体は、ｔｉｍ−３およびガレクチン−９に特異的な二重特異性抗体である。別の特定の実施形態では、ｔｉｍ−３への薬剤の結合により、ｔｉｍ−３の細胞内ドメインのリン酸化が増加する。別の特定の実施形態では、薬剤は、天然に存在するリガンドの組換えバージョンなどのｔｉｍ−３リガンドである。別の特定の実施形態では、全長ｔｉｍ−３へのｔｉｍ−３リガンドの結合により、ｔｉｍ−３の細胞内ドメインのリン酸化が増加する。別の特定の実施形態では、ｔｉｍ−３リガンドはガレクチン−９ポリペプチドを含む。別の特定の実施形態では、薬剤は、ガレクチン−９の２つの炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）の少なくとも１つを含む。別の特定の実施形態では、ポリペプチドはガレクチン−９の２つのＣＲＤドメインを含む。別の特定の実施形態では、薬剤は、配列番号１０または配列番号１８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、または９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
本発明の１つの態様は、ｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとの間の結合を調整する薬剤の同定方法を提供する。１つの特定の態様は、（ａ）試験薬（ｔｅｓｔ ａｇｅｎｔ）の存在下でｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとを接触させる工程と、（ｂ）ｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとの結合に対する試験薬の効果を決定する工程と、それにより、ｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとの間の結合を調整する薬剤が同定されることとを含む、ｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとの間の結合を調整する薬剤の同定方法を提供する。
別の態様は、（ａ）試験薬の存在下でｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとを接触させる工程と、（ｂ）ｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとの結合に対する試験薬の効果を決定する工程とを含む、免疫応答を調整する薬剤の同定方法を提供する。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）が、試験薬の存在下でのｔｉｍ−３／ガレクチン−９複合体の形成を適切なコントロールと比較することを含む。適切なコントロールが、試験薬の非存在下での第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の複合体の形成を含む。免疫応答を調整する薬剤の同定方法のいくつかの実施形態では、免疫応答は、Ｔｈ１免疫応答またはＴｈ２免疫応答である。
免疫応答を調整する薬剤またはｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとの間の結合を調整する薬剤を同定する方法を、インビトロまたはインビボで行うことができる。特定の実施形態では、ｔｉｍ−３ポリペプチド、ガレクチン−９ポリペプチド、またはその両方が細胞内で発現する。特定の実施形態では、複合体形成の検出がレポーター遺伝子発現の検出を含み、レポーター遺伝子の発現が前記複合体の形成に依存する。別の特定の実施形態では、ｔｉｍ−３ポリペプチド、ガレクチン−９ポリペプチド、またはその両方が蛍光分子で標識されている。別の特定の実施形態では、上記方法におけるガレクチン−９ポリペプチドが、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸１〜３２３、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸１〜３５５、（ｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸１〜３２３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸１〜３５５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。別の特定の実施形態では、上記方法のｔｉｍ−３ポリペプチドが、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸３０〜１２８、または（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸３０〜１２８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
本発明は、さらに、（ａ）ｔｉｍ−３とガレクチン−９との間の結合に影響を及ぼす化合物を同定する工程と、（ｂ）動物における有効性および毒性について工程（ａ）で同定された化合物またはそのさらなるアナログの治療プロファイリング（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）を行う工程と、（ｃ）許容可能な治療プロフィールを有すると工程（ｂ）で同定された１つまたは複数の化合物を含む薬学的調製物を処方する工程とを含む、薬物発見ビジネスの実施方法を提供する。本発明は、さらに、（ａ）ｔｉｍ−３とガレクチン−９との間の結合に影響を及ぼす化合物を同定する工程と、（ｂ）任意選択的に動物における有効性および毒性について工程（ａ）で同定された化合物またはそのさらなるアナログの治療プロファイリングを行う工程と、（ｃ）工程（ａ）で同定された化合物またはそのアナログに関する薬物の開発および／または販売権利を第三者に供与する工程とを含む、薬物発見ビジネスの実施方法を提供する。特定の実施形態は、工程（ａ）で同定された化合物またはそのアナログの販売に基づいて特許権使用料を徴収する工程をさらに含む。
本発明は、さらに、可溶性ｔｉｍ−３を発現する細胞を可溶性ｔｉｍ−３の発現を減少させるのに十分な量の二本鎖ＲＮＡを接触させる工程と、前記二本鎖ＲＮＡが細胞中の全長ｔｉｍ−３の発現を阻害せず、それによりｔｉｍ−３活性が増加することとを含む、ｔｉｍ−３活性を増加させる方法を提供する。特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡが高ストリンジェンシー条件下で配列番号１を含む核酸とハイブリダイズするが、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１１を含む核酸とハイブリダイズしない。別の特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡは、配列番号１５に記載の核酸配列を含む。別の特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡはｓｉＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡである。別の特定の実施形態では、被験体への二本鎖ＲＮＡの投与によって接触させる。
本発明は、さらに、可溶性ｔｉｍ−３をコードする核酸の存在を検出する工程と、前記可溶性ｔｉｍ−３をコードする核酸の検出が可溶性ｔｉｍ−３遺伝子発現を示すこととを含む、可溶性ｔｉｍ−３遺伝子発現の検出方法を提供する。
本発明の実施は、他で示さない限り、当業者の範囲内の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を使用する。このような技術は、文献に記載されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔｅｄ．，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ：４，６８３，１９５；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｎｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照のこと。これらの引例の内容全体が本明細書中で参考として援用される。
（（２）定義）
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される一定の用語をここに集めている。他で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書中で、１つまたは１つを超える冠詞の文法上の対照物をいうために使用される。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つのエレメントまたは１つを超えるエレメントを意味する。
用語「〜が含まれる」は、句「〜が含まれるが、これらに限定されない」を意味するように使用され、これと交換可能に使用される。
用語「または」は、本明細書中で、他で明確に示されない限り、用語「および／または」を意味するように使用され、これと交換可能に使用される。
用語「〜など」は、本明細書中で、句「〜などであるが、これらに限定されない」を意味する用に使用され、これと交換可能に使用される。
用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などのポリヌクレオチド、適切な場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）をいう。この用語はまた、等価物として、ヌクレオチドアナログから作製されたＲＮＡまたはＤＮＡのアナログ、記載の実施形態に適用可能な場合、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドが含まれると理解すべきである。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で交換可能に使用される。用語「防止する」は、当該分野で認識されており、局所再発（例えば、痛み）などの病態、癌などの疾患、心不全などの症候群の合併症（ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）、または任意の他の病状に関して使用される場合、当該分野で十分に理解されており、疾患発症前に、組成物を投与していない被験体と比較して被験体の病状の頻度を減少させるか、重症度を軽減させるか、症状の発症を遅延させる組成物を投与する工程を含む。したがって、癌の防止には、例えば、未処置コントロール集団と比較した予防的治療を受けた患者集団における検出可能な癌成長の減少および／または未処置コントロール集団と比較した処置集団で検出可能な癌成長の出現の遅延（例えば、統計的および／または臨床的に有意な量）が含まれる。感染の防止には、例えば、未処置コントロール集団と比較した処置集団での感染症の診断数の減少および／または未処置コントロール集団と比較した処置集団での感染症の症状の発症の遅延が含まれる。痛みの防止には、例えば、未処置コントロール集団と比較した処置集団での被験体が経験した痛みの頻度の減少、重症度の軽減、または遅延が含まれる。
本明細書中で使用される、用語「有効量」は、所望の結果を得るために必要な投薬量および期間で有効な量を定義する。本発明の化合物の有効量は、動物の病状、年齢、性別、および体重などの要因によって変化し得る。最適な治療応答を得るために投薬計画を調整することができる。例えば、いくつかに分割した用量を毎日投与することができるか、治療状況の要件で示されるように、用量を比例的に減少させることができる。
本明細書中で使用される、「被験体」は、任意の脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトをいう。被験体の例には、非ヒト霊長類、げっ歯類、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ、および魚類が含まれる。
本明細書中で使用される、目的のタンパク質の「変異型」は、１つまたは複数のアミノ酸が変化したアミノ酸配列をいう。変異型は、置換されたアミノ酸が類似の構造または化学的性質を有する「保存的」変化（例えば、ロイシンのイソロイシンへの置換）を有し得る。より稀には、変異型は、「非保存的」変化（例えば、グリシンのトリプトファンへの置換）を有し得る。類似のわずかな変異には、アミノ酸の欠失、挿入、またはその両方も含まれ得る。生物学的または免疫学的活性を消失することなくアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失することができるかどうかの決定のガイダンスを、当該分野で周知のコンピュータプログラム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア）を使用して見出すことができる。
本明細書中で使用される、「Ｔｈ１関連障害」は、基準（例えば、正常なコントロール）と比較して、例えば、異常な、例えば、Ｔｈ１細胞の活性（例えば、Ｔｈ１細胞応答）またはＴｈ１細胞数の増加に関連する疾患または病態である。Ｔｈ１関連障害の例には、例えば、自己免疫障害（多発性硬化症、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、およびクローン病）が含まれる。
本明細書中で使用される、「Ｔｈ２関連障害」は、基準（例えば、正常なコントロール）と比較して、例えば、異常な、例えば、Ｔｈ２細胞の活性（例えば、Ｔｈ２細胞応答）またはＴｈ２細胞数の増加に関連する疾患または病態である。Ｔｈ２関連障害の例には、例えば、喘息、アレルギー、および抗体成分に関連する障害（例えば、関節リウマチ）が含まれる。
本明細書中で使用される、用語「アナログ」には、基準配列に対して１つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を含むアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。アミノ酸置換は、保存的または非保存的性質を示し得る。保存アミノ酸置換は、本発明のタンパク質の１つまたは複数のアミノ酸の類似の電荷、サイズ、および／または疎水性のアミノ酸への置換を含む。保存的置換のみが行われた場合、得られたアナログは機能的に等価なはずである。非保存的置換は、アミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸の異なる電荷、サイズ、および／または疎水性を有する１つまたは複数のアミノ酸への置換を含む。アミノ酸挿入は、１アミノ酸残基または２〜１５アミノ酸長の範囲の連続的アミノ酸からなり得る。欠失は、アミノ酸配列からの１つまたは複数のアミノ酸または不連続部分の除去からなり得る。欠失アミノ酸は、連続していても連続していなくてもよい。
用語「組換え」は、天然に隣接しない配列を含む任意の核酸を意味するために本明細書中で使用される。組換え核酸を、例えば、分子生物学的方法の使用によってインビトロで生成するか、相同組換えまたは非相同組換えによる新規の染色体位置での核酸の挿入によってインビボで生成することができる。
用語「アゴニスト」は、タンパク質（例えば、ポリペプチドＸ）の生物活性を模倣または上方制御する（例えば、増強または捕捉する）薬剤をいう。アゴニストは、野生型タンパク質または野生型タンパク質の少なくとも１つの生物活性を有するその誘導体であり得る。アゴニストは、遺伝子発現を上方制御するかタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増加させる化合物であり得る。アゴニストはまた、ポリペプチドの別の分子（例えば、標的ペプチドまたは核酸）との相互作用を増加させる化合物であり得る。
用語「アンタゴニスト」は、タンパク質の少なくとも１つの生物活性を下方制御する（例えば、抑制または阻害する）薬剤をいう。アンタゴニストは、タンパク質と別の分子（例えば、標的ペプチドまたは酵素基質）との間の相互作用を阻害または減少させる化合物であり得る。アンタゴニストはまた、遺伝子発現を下方制御するかタンパク質発現の存在量を減少させる化合物であり得る。
用語「治療効果」は、薬理学的に活性な物質によって生じる、動物、詳細には哺乳動物、より詳細にはヒトにおける局所的または全身的効果をいう。したがって、この用語は、動物またはヒトにおける疾患の診断、治癒、緩和、治療、もしくは防止、または所望の身体的もしくは精神的発達および状態の強化における使用を意図する任意の物質を意味する。句「治療有効量」は、任意の治療に適用可能な妥当な利益／リスク比でいくつかの所望の局所的または全身的効果が得られるような物質の量を意味する。一定の実施形態では、化合物の治療有効量は、その治療指標および溶解性などに依存する。例えば、本発明の方法によって発見された一定の化合物を、このような治療に適用可能な妥当な利益／リスク比を得るのに十分な量で投与することができる。
用語「障害の治療を必要とする被験体」は、このような障害を有すると診断されたかこのような障害を有する疑いのある被験体である。
本明細書中で使用される他の技術用語は、これらが使用される分野で通常の意味を有し、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＴｅｒｍｓおよびＳｔｅｄｍａｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙなどの種々の技術用語辞典によって例示されている。
（（３）核酸）
一定の態様では、本発明は、ヒト可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする単離および／または組換え核酸（例えば、配列番号１および５など）を提供する。本発明の１つの態様は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供する。配列番号１は、ヒト可溶性ｔｉｍ−３イソ型のＤＮＡコード配列である。ヒト可溶性ｔｉｍ−３は、ヒト全長ｔｉｍ−３の細胞内ドメイン（配列番号１３の残基２２６〜３０１）に融合したＩｇＶドメイン（配列番号１３の残基２２〜１３１）を含む。１つの実施形態では、本発明によって提供された可溶性ヒトｔｉｍ−３核酸は、さらに、翻訳ポリペプチドのＮ末端で全長ｔｉｍ−３のシグナル配列（配列番号１３のアミノ酸残基１〜２１）をコードする。本発明の別の態様は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むヒト可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。
同様に、本発明の別の態様は、マウス可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする単離および／または組換え核酸（例えば、配列番号３および７など）を提供する。本発明の１つの態様は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供する。配列番号３は、マウス可溶性ｔｉｍ−３イソ型のＤＮＡコード配列である。マウス可溶性ｔｉｍ−３は、マウス全長ｔｉｍ−３の細胞内ドメイン（配列番号１４の残基２１７〜２８１）に融合したＩｇＶドメイン（配列番号１４の残基２２〜１３２）を含む。１つの実施形態では、本発明によって提供されたマウス可溶性ｔｉｍ−３核酸は、さらに、翻訳ポリペプチドのＮ末端で全長ｔｉｍ−３のシグナル配列（配列番号１４のアミノ酸残基１〜２１）をコードする。本発明の別の態様は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むマウス可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。
本発明の核酸は、配列番号１、３、５、および７の変異型を含む核酸を含むとさらに理解される。変異ヌクレオチド配列には、置換、付加、または欠失などによって１つまたは複数のヌクレオチドが異なる配列（対立遺伝子変異型など）が含まれ、したがって、（例えば、遺伝コードの縮重によって）配列番号１、３、５、および７に示すコード配列のヌクレオチド配列と異なるコード配列が含まれる。例えば、可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号１および３の配列または配列番号２および４のポリペプチドをコードする配列と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％同一の配列を含む核酸であり得る。
２配列の間の配列の比較および同一率および類似率の決定を、数学アルゴリズムを使用して行うことができる。（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）。
１つの好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一率を、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれかを使用してＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４− ４５３（１９７０））アルゴリズムを使用して決定する。
さらに別の実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一率を、ＮＷＳｇａｐｄｎａ−ＣＭＰ行列を使用したＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）のＧＡＰプログラムを使用して決定する。別の実施形態では、２つのアミノ酸配列間またはヌクレオチド配列間の同一率を、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：ｌｌ−１７（１９８９））のアルゴリズムを使用して決定する。
他の実施形態では、変異型はまた、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１および３に示す核酸配列のコード配列とハイブリダイズする配列が含まれる。１つの実施形態では、変異ヌクレオチド配列は、ムチンおよび膜貫通ドメインを欠く可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドをコードする。別の実施形態では、変異ヌクレオチド配列は、ｔｉｍ−３リガンド（例えば、ガレクチン−９）に結合することができる可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドをコードする。
当業者は、ＤＮＡハイブリッド形成を促進する適切なストリンジェンシー条件を変更することができることを容易に理解する。例えば、約４５℃での６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリッド形成およびその後の５０℃での２．０×ＳＳＣの洗浄を行うことができる。例えば、洗浄工程中の塩濃度を、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃で約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を、室温（約２２℃）の低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで増加させることができる。温度および塩の両方を変化させるか、温度または塩濃度を一定に保持して他の変量を変更することができる。１つの実施形態では、本発明は、室温で６×ＳＳＣおよびその後の室温での２×ＳＳＣの洗浄を行う低ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする核酸を提供する。
遺伝コードの縮重のために配列番号１および３と異なる単離核酸も本発明の範囲内である。例えば、１つを超えるトリプレットによって多数のアミノ酸が指定される。同一アミノ酸を特定するコドン（すなわち、同義語（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンの同義語である））により、タンパク質のアミノ酸配列に影響を与えない「サイレント」変異が起こり得る。当業者は、特定のタンパク質をコードする核酸の１つまたは複数ヌクレオチドのこれらの変動が天然の対立遺伝子の変動によって所与の種の個体間で存在し得ることを認識する。任意および全てのこのようなヌクレオチドの変動および得られたアミノ酸多型は本発明の範囲内である。
本発明はまた、高ストリンジェンシー条件下で可溶性ｔｉｍ−３をコードする核酸とハイブリダイズするが、ｔｉｍ−３膜貫通ドメインまたはｔｉｍ−３ムチンドメインをコードしない核酸を提供する。１つの実施形態では、これらの核酸は、少なくともｔｉｍ−３のＩｇＶドメインをコードする。これらの核酸は、ＩｇＶまたは細胞内ドメイン内に変異、欠失、または挿入を有する可溶性ｔｉｍ−３タンパク質をコードし得る。１つの実施形態では、核酸は、ガレクチン−９などのｔｉｍ−３リガンドに結合することができるポリペプチドをコードする。１つの実施形態では、これらの核酸は、変異しているか変異していない可溶性ｔｉｍ−３および血清アルブミンまたは免疫グロブリンのＦｃドメインなどの別のタンパク質由来の１つまたは複数のドメインを含む融合タンパク質をコードする。
本発明はまた、高ストリンジェンシー条件下または生理学的条件下で可溶性ｔｉｍ−３をコードする核酸とハイブリダイズするが、高ストリンジェンシー条件下または生理学的条件下で全長ｔｉｍ−３をコードする核酸とハイブリダイズしない核酸を提供する。１つの実施形態では、本発明は、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１に記載の核酸（ヒト可溶性ｔｉｍ−３をコードする）とハイブリダイズするが、配列番号１１に記載の核酸（全長ヒトｔｉｍ−３をコードする）とハイブリダイズしない単離核酸を提供する。別の実施形態では、本発明は、高ストリンジェンシー条件下で配列番号３に記載の核酸（マウス可溶性ｔｉｍ−３をコードする）とハイブリダイズするが、配列番号１２に記載の核酸（全長マウスｔｉｍ−３をコードする）とハイブリダイズしない単離核酸を提供する。好ましい実施形態では、このような単離核酸は、ヒトおよびマウスｔｉｍ−３のＩｇＶおよび細胞内ドメインコード配列を連結する可溶性ｔｉｍ−３ｃＤＮＡ中で見出される新規のスプライス部位にわたる。別の好ましい実施形態では、核酸は、配列番号５および７に記載のヌクレオチド配列を有する。これらの核酸を、可溶性ｔｉｍ−３をコードする核酸を検出するために（Ｔｈ１細胞中のｔｉｍ−３をコードする核酸の存在の検出）、本明細書中に記載の方法で使用することができる。
一定の態様では、可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドをコードする核酸およびその変異型を使用して、直接送達などの核酸送達によって生物または細胞中の可溶性ｔｉｍ−３発現を増加させることができる。本発明の核酸治療構築物を、例えば、細胞中で転写された場合に可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドをコードするＲＮＡを産生する発現プラスミドとして送達することができる。
本発明はまた、可溶性ｔｉｍ−３をコードする核酸の存在を検出する工程と、前記可溶性ｔｉｍ−３をコードする核酸の検出が可溶性ｔｉｍ−３遺伝子発現を示すこととを含む、可溶性ｔｉｍ−３遺伝子発現の検出方法を提供する。好ましい実施形態では、核酸はｍＲＮＡである。可溶性ｔｉｍ−３をコードするｍＲＮＡの検出を、当該分野で一般的に公知のｍＲＮＡ分子検出方法（ノーザンブロット、逆転写ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、ＤＮＡマイクロアレイが含まれる）を使用して行うことができる。別の実施形態では、可溶性ｔｉｍ−３遺伝子発現を、抗体、好ましくは、可溶性ｔｉｍ−３に結合するが全長ｔｉｍ−３に結合しない抗体を使用して検出する。
（（４）ＲＮＡ干渉、リボザイム、およびアンチセンス）
一定の態様では、本発明は、全長ｔｉｍ−３、可溶性ｔｉｍ−３、またはｔｉｍ−３リガンドの操作（典型的には、遺伝子発現の減少）のためのＲＮＡｉ、リボザイム、アンチセンス、および他の核酸に関連する方法および組成物に関する。本発明の１つの態様では、方法および組成物は、ｔｉｍ−３のたった１つの形態（全長または可溶性形態のいずれか）に特異的である。本発明の別の態様では、操作されるｔｉｍ−３リガンドはガレクチン−９である。
本発明の一定の実施形態は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によってｔｉｍ−３またはガレクチン−９などのそのリガンドの１つの形態のノックダウンのための材料および方法を使用する。ＲＮＡｉは、真核生物中で起こり得る配列特異的転写後遺伝子発現の過程である。一般に、この過程は、特定の配列に相同な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘導される特定の配列のｍＲＮＡの分解を含む。例えば、特定の一本鎖ｍＲＮＡ（ｓｓｍＲＮＡ）の配列に対応する長いｄｓＲＮＡの発現がそのメッセージを不安定にし、それによって対応する遺伝子の発現を「干渉する」。したがって、任意の選択された遺伝子を、その遺伝子のｍＲＮＡの全部または実質的部分に対応するｄｓＲＮＡの移入によって抑制することができる。長いｄｓＲＮＡが発現される場合、最初に、リボヌクレアーゼＩＩＩによっていくつかの例では２１〜２２塩基対長ほどのより短いｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドにプロセシングされるようである。さらに、比較的短い相同ｄｓＲＮＡの移入または発現によってＲＮＡｉを行うことができる。実際、比較的短い相同ｄｓＲＮＡの使用は、以下に考察する一定の利点を有し得る。
哺乳動物細胞は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって影響を受ける少なくとも２つの経路を有する。ＲＮＡｉ（配列特異的）経路では、上記のように、最初のｄｓＲＮＡが短い干渉（ｓｉ）ＲＮＡに分解される。ｓｉＲＮＡは、各３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する約１９ヌクレオチドのｓｉＲＮＡを形成する約２１個のヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する。短い干渉ＲＮＡは、分解のために特定の伝令ＲＮＡをターゲティングすることが可能な配列情報を提供すると考えられている。対照的に、非特異的経路は、少なくとも３０塩基対長である限り、任意の配列のｄｓＲＮＡによって誘発される。ｄｓＲＮＡは２つの酵素（ＰＫＲ（その活性形態で翻訳開始因子ｅＩＦ２のリン酸塩を形成して全てのタンパク質合成を遮断する）およびＲＮＡアーゼＬ（全ｍＲＮＡをターゲティングする非特異的酵素）を合成する２’，５’オリゴアデニル酸合成酵素（２’，５’−ＡＳ））を活性化するので、非特異的効果が生じ得る。非特異的経路は、ストレスまたはウイルス感染に対する宿主応答を示すことができ、一般に、本発明の好ましい方法において非特異的経路の効果を最小にすることが好ましい。注目すべきなのは、より長いｄｓＲＮＡは、非特異的経路の誘導に必要なようであり、したがって、ＲＮＡｉによる遺伝子抑制を行うためには約３０塩基対より短いｄｓＲＮＡが好ましい（Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５０：４０９−１７；Ｍａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２：５２３９−４８；Ｍｉｎｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５４：１０１８０−３；およびＥｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ４１１：４９４−８を参照のこと）。
ＲＮＡｉは、多数の異なる生物（エレガンス線虫（例えば、Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−１１）、マウスの卵および胚（Ｗｉａｎｎｙ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ＣｅｌｌＢｉｏｌ２：７０−５；Ｓｖｏｂｏｄａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２７：４１４７−５６）、ならびに培養ＲＡＴ−１線維芽細胞（Ｂａｈｒａｍｉｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９：２７４−８３）が含まれる）における遺伝子発現の減少または消失で有効であることが示されており、真核植物および動物で利用可能な古代に進化した経路のようである（Ｓｈａｒｐ（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５−９０）。ＲＮＡｉは、種々の細胞型（ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＢＨＫ−２１細胞が含まれる）における遺伝子発現の有効な減少手段であることが証明されており、典型的には、アンチセンス技術を使用して達成されるレベルよりも低いレベルに遺伝子発現を減少させ、実際はしばしば発現全体が消失する（Ｂａｓｓ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４２８−９を参照のこと）。哺乳動物細胞では、ｓｉＲＮＡは、アンチセンス実験で典型的に使用される濃度よりもはるかに低い濃度で有効である（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−８）。
ＲＮＡｉを行うために使用される二本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは３０塩基対未満であり、より好ましくは、約２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、または１７塩基対のリボ核酸を含む。任意選択的に、本発明のｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、３’オーバーハング末端を含み得る。例示的２−ヌクレオチドの３’オーバーハングは、任意の型のリボヌクレオチド残基から構成され、細胞培養培地中およびトランスフェクトされた細胞内でｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を増強することができる（Ｅｌｂａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−８を参照のこと）。５０、７５、１００、またはさらに５００塩基対またはそれ以上のより長いｄｓＲＮＡを、本発明の一定の実施形態で使用することもできる。ＲＮＡｉ実施のための例示的なｄｓＲＮＡ濃度は、約０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１．０ｎＭ、１．５ｎＭ、２５ｎＭ、または１００ｎＭであるが、処置される細胞、遺伝子標的、および当業者が容易に識別可能な他の因子の性質に依存して他の濃度を使用することができる。例示的ｄｓＲＮＡを、化学合成するか、適切な発現ベクターを使用してインビトロまたはインビボで産生することができる。例示的合成ＲＮＡには、当該分野で公知の方法（例えば、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ＲＮＡホスホアミダイトおよびチミジンホスホアミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用して化学合成された２１ヌクレオチドのＲＮＡが含まれる。当該分野で公知の方法を使用して合成オリゴヌクレオチドを脱保護し、ゲル精製することが好ましい（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．Ｉ５：１８８−２００を参照のこと）。より長いＲＮＡを、当該分野で公知のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどのプロモーターから転写することができる。インビトロプロモーター下流の可能な両方向で存在する１つのＲＮＡ標的が標的の両鎖を転写して、所望の標的配列のｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドが作製される。
ｔｉｍ−３またはガレクチン−９が二本鎖ＲＮＡの標的である場合、ｔｉｍ−３核酸またはガレクチン−９核酸中に示される核酸配列の一部（ストリンジェントな条件下および／または生理学的条件下で配列番号１、３、９、１０、１１、もしくは１２またはその相補物のいずれかとハイブリダイズする核酸など）を含むように上記ＲＮＡ種のいずれかをデザインする。目的が全長ｔｉｍ−３の活性を減少させることである場合、全長ｔｉｍ−３の発現を下方制御することができるが、可溶性ｔｉｍ−３の発現を下方制御することができない二本鎖ＲＮＡ試薬が好ましい。したがって、ＲＮＡ試薬は全長ｔｉｍ−３レベルを減少させることができる一方で、可溶性ｔｉｍ−３はガレクチン−９などのｔｉｍ−３リガンドを漸増して（ｔｉｔｒａｔｅ）全長ｔｉｍ−３との相互作用を防止することができる。この実施形態では、ＲＮＡ種を、全長ｔｉｍ−３中に存在するが可溶性ｔｉｍ−３に存在しないムチンドメインまたは膜貫通ドメインをコードするｍＲＮＡ領域を含むようにデザインすることができる。
本発明の関連する態様は、可溶性ｔｉｍ−３を発現する細胞を可溶性ｔｉｍ−３発現の阻害に十分な量の二本鎖ＲＮＡと接触させる工程と、二本鎖ＲＮＡが全長ｔｉｍ−３発現を阻害しないこととを含む、可溶性ｔｉｍ−３の発現の阻害によるｔｉｍ−３活性を増加させる方法を提供する。１つの実施形態では、二本鎖ＲＮＡは、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１を含む核酸とハイブリダイズするが、同一条件下で配列番号１１を含む核酸とハイブリダイズしない。別の実施形態では、二本鎖ＲＮＡは、生理学的条件下で配列番号１を含む核酸とハイブリダイズするが、同一条件下で配列番号１１を含む核酸とハイブリダイズしない。好ましい実施形態では、二本鎖ＲＮＡの一方の鎖は、配列番号１５に記載の核酸配列を含む。ｔｉｍ−３を発現する単離細胞または被験体、好ましくはヒトで本発明の方法を行うことができる。
標的がガレクチン−９である場合、ＲＮＡ種は、ガレクチン−９核酸中に示される核酸配列の一部（例えば、ストリンジェントな条件下および／または生理学的条件下で配列番号９またはその相補物とハイブリダイズする核酸など）を含み得る。
オリゴヌクレオチドデザインで使用される特定の配列は、標的の発現された遺伝子メッセージ内に含まれるヌクレオチドの任意の連続配列であり得る。当該分野で公知のプログラムおよびアルゴリズムを使用して、適切な標的配列を選択することができる。さらに、特定された一本鎖核酸配列の二次構造を予想するためにデザインされたプログラムを使用し、折り畳まれたｍＲＮＡの曝露された一本鎖領域中に生じる可能性が高い配列の選択によって最適な配列を選択することができる。適切なオリゴヌクレオチドデザインのための方法および組成物を、例えば、米国特許第６，２５１，５８８号（その内容が本明細書中で参考として援用される）で見出すことができる。伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、一般に、リボヌクレオチド配列内でのタンパク質合成を指示するための情報を含む線状分子と考えられているが、研究により、ほとんどのｍＲＮＡ中に存在する多数の二次構造および三次構造が明らかとなっている。ＲＮＡ中の二次構造エレメントは、同一ＲＮＡ分子の異なる領域間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型相互作用によって大部分が形成される。重要な二次構造エレメントには、分子内二本鎖領域、ヘアピンループ、二重鎖ＲＮＡ中のバルジ、および内部ループが含まれる。二次構造が互いに接触した場合に三次構造エレメントが形成され、一本鎖領域と接触した場合により複雑な三次元構造が産生される。多数の研究者が多数のＲＮＡ二重鎖構造の結合エネルギーを測定しており、ＲＮＡの二次構造を予想するために使用することができる規則が導かれている（例えば、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６（１９８９）；ａｎｄ Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１７：１６７を参照のこと）。規則は、ＲＮＡ構造エレメントの同定、特に、スプライシングＲＮＡｉ、リボザイム、またはアンチセンス技術のために標的にｍＲＮＡの好ましいセグメントを授与することができる一本鎖ＲＮＡ領域の同定で有用である。したがって、ｍＲＮＡ標的の好ましいセグメントを、ＲＮＡｉ媒介ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドのデザインならびに本発明の適切なリボザイムおよびハンマーヘッドリボザイムのデザインのために同定することができる。
ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを、当該分野で公知のリポソームなどのキャリア組成物（例えば、異常な細胞株の製造によって記載されたリポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用した異種標的遺伝子でのトランスフェクションによって細胞に移入することができる。内因性遺伝子のターゲティングのためのｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを、オリゴフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行うことができる。蛍光顕微鏡を使用してｈＧＦＰコードｐＡＤ３の同時トランスフェクション後の哺乳動物細胞株のトランスフェクション効率をチェックすることができる（Ｋｅｈｌｅｎｂａｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４１：８６３−７４）。ＲＮＡｉの有効性を、ｄｓＲＮＡ移入後の多数のアッセイのいずれかによって評価することができる。これらには、新規のタンパク質合成が抑制された後の内因性プールの代謝回転のための十分な時間を経た後のｔｉｍ−３ポリペプチド（可溶性形態および／または全長形態が含まれる）またはｔｉｍ−３リガンド（ガレクチン−９など）を認識する抗体を使用したウェスタンブロット分析、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、既存の標的ｍＲＮＡ（全長ｔｉｍ−３、可溶性ｔｉｍ−３、またはガレクチン−９のｍＲＮＡなど）のレベルを決定するためのノーザンブロット分析が含まれる。
さらなる組成物、方法、およびＲＮＡｉテクノロジーの適用は、米国特許第６，２７８，０３９号、同第５，７２３，７５０号、および同第５，２４４，８０５号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
ｔｉｍ−３およびガレクチン−９のｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するようにデザインしたリボザイム分子を使用して、本ｔｉｍ−３またはガレクチン−９のｍＲＮＡの翻訳を防止することもできる（例えば、１９９０年１０月１４日公開のＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４；ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２−１２２５、および米国特許第５，０９３，２４６号を参照のこと）。リボザイムは、特定のＲＮＡ切断を触媒することができる酵素ＲＮＡ分子である（概説については、Ｒｏｓｓｉ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：４６９−４７１を参照のこと）。リボザイムの作用機構は、リボジム分子の相補標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成およびその後のエンドヌクレアーゼ的切断事象を含む。リボザイム分子の組成物は、好ましくは、ｔｉｍ−３またはガレクチン−９に相補的な１つまたは複数の配列およびｍＲＮＡ切断または機能的な等価な配列を担う周知の触媒配列を含む（例えば、米国特許第５，０９３，２４６号（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムを使用して標的ｍＲＮＡを破壊することができる一方で、ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する隣接領域によって予想される位置でｍＲＮＡを切断する。好ましくは、標的ｍＲＮＡは、以下の２つの塩基配列を有する：５’−ＵＧ−３’。ハンマーヘッドリボザイムの構築および産生は、当該分野で周知であり、Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１により完全に記載されている：ＰＣＴ出願番号ＷＯ８９／０５８５２号（その内容が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。ハンマーヘッドリボザイム配列を、インビボでの切断効率を増加させるために運搬ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）などの安定なＲＮＡに埋め込むことができる（Ｐｅｒｒｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：６１７５−７９；ｄｅ Ｆｅｙｔｅｒ，ａｎｄ Ｇａｕｄｒｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７４，Ｃｈａｐｔｅｒ ４３，”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ”，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｔｕｒｎｅｒ，Ｐ．Ｃ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ）。特に、ｔＲＮＡ融合リボザイムのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ媒介発現は、当該分野で周知である（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：２８４−９；Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９６１−５；ａｎｄ Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ２：６１７−２７；Ｋｏｓｅｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：１８６８−７７；Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：１８８６−９１；Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０６：４７３−４を参照のこと）。典型的には、所与の標的ｃＤＮＡ配列内に多数の潜在的なハンマーヘッドリボザイム切断部位が存在する。好ましくは、非機能的ｍＲＮＡ転写物の有効性を増大させて細胞内蓄積を最小にするために、切断認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端付近に存在するようにリボザイムを操作する。さらに、例えば、標的の長鎖形態および単鎖形態のＣ末端アミノ酸ドメインの異なる部分をコードする標的配列中に存在する任意の切断認識部位の使用により、一方または他方の標的形態の選択的ターゲティングが可能であり、したがって、標的遺伝子産物の一方の形態に対して選択的効果を有する。
遺伝子ターゲティングリボザイムは、必ず２つの領域（それぞれ少なくとも５個、好ましくはそれぞれ６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド長の標的ｍＲＮＡ）に相補的なハイブリッド形成領域を含む。ｔｉｍ−３標的ｍＲＮＡは、配列番号１、３、５、または７のいずれかを含む。ガレクチンｍＲＮＡ配列は、配列番号９を含む。
さらに、リボザイムは、標的センスｍＲＮＡを自己触媒的に切断する高度に特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有する。本発明は、治療薬標的候補遺伝子などのｔｉｍ−３またはガレクチン−９タンパク質をコードするセンスｍＲＮＡとハイブリッド形成し、それによりもはや機能的ポリペプチド産物を合成するために翻訳されることができないようにセンスｍＲＮＡとハイブリッド形成してこれを切断するリボザイムにまで及ぶ。
本発明のリボザイムには、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以後「Ｃｅｃｈ型リボザイム」）（テトラヒメナ中に天然に存在するもの（ＩＶＳ ＲＮＡまたはＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡ）およびＴｈｏｍａｓ Ｃｅｃｈ ａｎｄ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｓ（Ｚａｕｇ，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：５７４−５７８；Ｚａｕｇ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１：４７０−４７５；Ｚａｕｇ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：４２９−４３３ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｔｅｎｔｓ Ｉｎｃ．による国際公開特許出願番号ＷＯ８８／０４３００；Ｂｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃｅｌｌ ４７：２０７−２１６によって詳細に記載のものなど）も含まれる。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、標的ＲＮＡの切断後に標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズする８塩基の活性部位を有する。本発明は、標的遺伝子または核酸配列中に存在する８塩基対の活性部位配列をターゲティングするＣｅｃｈ型リボザイムを含む。
リボザイムは、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、安定性、ターゲティングなどの改良のため）から構成され得るが、インビボで標的遺伝子を発現する細胞に送達されるべきである。好ましい送達方法は、トランスフェクトされた細胞が内因性標的メッセージを破壊して翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生するような強力構成性ｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの調節下でのリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物の使用を含む。アンチセンス分子と異なり、リボザイムは触媒性を示すので、より低い細胞内濃度で有効である。
一定の実施形態では、ＲＮＡｉによる有効なノックダウンに十分な配列部分を最初に同定することよってリボザイムをデザインすることができる。次いで、同一の配列部分を、リボザイムに組み込むことができる。本発明のこの態様では、リボザイムまたはＲＮＡｉの遺伝子ターゲティング部分は、少なくとも５個、好ましくはそれぞれ６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個またはそれ以上のｔｉｍ−３核酸またはガレクチン−９核酸の連続ヌクレオチドの実質的に同一の配列である。
長鎖標的ＲＮＡ鎖では、二次構造または三次構造内に隠れるので、有意な数の標的部位がリボザイムに接近することができない（Ｂｉｒｉｋｈ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２４５：１−１６）。標的ＲＮＡの接近可能性の問題を克服するために、典型的には、コンピュータで作製した二次構造の予想を使用して、一本鎖であるか「開いた」立体配値である可能性が最も高い標的を同定する（Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８３：２８１−３０６を参照のこと）。他のアプローチは、非常に多数の候補ハイブリッド形成オリゴヌクレオチド分子の評価を含む二次構造を予想するための体系的アプローチを使用する（Ｍｉｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５：５３７−４１；およびＰａｔｚｅｌ ａｎｄ Ｓｃｚａｋｉｅｌ（１９９８）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：６４−８を参照のこと）。さらに、米国特許第６，２５１，５８８号（その内容が本明細書中で参考として援用される）は、標的核酸配列へのハイブリッド形成の潜在性を予想するためのオリゴヌクレオチドプローブ配列の評価方法を記載している。本発明の方法は、一本鎖であると予想される標的ｍＲＮＡ配列の好ましいセグメントを選択する方法の使用、さらに、本発明のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの両方のデザインにおける標的ｍＲＮＡの約１０〜２０個の連続ヌクレオチドを含むことが好ましい同一または実質的に同一の標的ｍＲＮＡ配列の便宜的使用を提供する。
（（５）ポリペプチド）
一定の態様では、本開示により、通常はタンパク質と会合し得る他のタンパク質またはタンパク質を含む特定の複合体から単離されているか実質的に含まない可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドの単離および／または精製形態が利用可能になる。一定の実施形態では、可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドは、配列番号２、４、６、または８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。２つのポリペプチド間のアミノ酸同一性を、ＰＡＭ２５０行列に基づいたアラインメントアルゴリズムなどのアラインメントアルゴリズムを使用した２つのポリペプチド配列の最初のアラインメントによって決定することができる。
一定の実施形態では、可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドは、配列番号２、４、６、および８のいずれかと少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列の一部を含むポリペプチドであり、好ましくは、前記一部は、Ｔｈ１細胞の活性化の調整に十分であるかｔｉｍ−３リガンドに結合することができる部分などの機能的部分である。１つの実施形態では、一部は、ｔｉｍ−３のＩｇＶドメインを含む。いくつかの実施形態では、可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドは、保存的アミノ酸置換を含む。一定の実施形態では、可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドは、配列番号１、３、５、および７の核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一の核酸配列を含む核酸が細胞中に発現される場合に得られるポリペプチドである。一定の実施形態では、可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドは、精製されているか部分精製されている。
いくつかの実施形態では、可溶性ｔｉｍ−３のＩｇＶドメインは、配列番号１３のアミノ酸２２〜１３１を含む。他の実施形態では、配列番号１４のアミノ酸２２〜１３２を含む。１つの実施形態では、本発明によって提供された可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドの細胞内ドメインは配列番号１３のアミノ酸２２６〜３０１を含む一方で、別の実施形態では、配列番号１４のアミノ酸２１７〜２８１を含む。
本発明は、さらに、可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質を含む。１つの実施形態では、可溶性ｔｉｍ−３タンパク質は、ＩｇＶドメインを含むが、ムチンドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを欠く。一定の実施形態では、可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドおよび免疫グロブリンエレメントを含む融合タンパク質を提供する。１つの実施形態では、本発明は、タンパク質がｔｉｍ−３のムチンドメインまたはｔｉｍ−３の膜貫通ドメインを含まない、ｔｉｍ−３のＩｇＶドメイン、ｔｉｍ−３の細胞内ドメイン、および免疫グロブリンのＦｃドメインを含むポリペプチドを提供する。ｔｉｍ−３ポリペプチドは、マウスまたはヒトであり得る。例示的免疫グロブリンエレメントは、ヒトＩｇＧ１重鎖のＦｃドメインのような定常領域である（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４，ｐｐ．３３−４６（１９９５））。可溶性受容体−ＩｇＧ融合タンパク質は、一般的な免疫試薬であり、その構築方法は当該分野で公知である（例えば、米国特許第５，２２５，５３８号、同第５，７６６，８８３号、および同第５，８７６，９６９号（その全てが本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、本発明の可溶性ペプチドをＦｃ変異型に融合する。
関連する実施形態では、本発明の修飾タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域とのｔｉｍ−３およびガレクチン−９融合タンパク質を含む。公知のように、各免疫グロブリン重鎖定常領域は、４つまたは５つのドメインを含む。ドメインを、連続的に、以下のように命名されている：ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４）。重鎖ドメインのＤＮＡ配列は、免疫グロブリンクラス間で交差相同性（ｃｒｏｓｓ−ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有し、例えば、ＩｇＧのＣＨ２ドメインは、ＩｇＡおよびＩｇＤのＣＨ２ドメインと相同であり、ＩｇＭおよびＩｇＥのＣＨ３ドメインと相同である。本明細書中で使用される、用語「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロブリン鎖定常領域、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域のカルボキシル末端部分またはその一部を意味すると理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２つまたはそれ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域との組み合わせを含み得る。好ましい実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含み、好ましくはＣＨ１ドメインを欠く。
１つの実施形態では、重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンクラスはＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３、または４）である。他の免疫グロブリンクラスであるＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）、およびＩｇＭ（Ｉｇμ）を使用することができる。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号および同第５，７２６，０４４号で考察されている。特定の結果を得るための一定の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当業者のレベルの範囲内であると見なされる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の一部は、好ましくは、ヒンジドメインの少なくとも一部、好ましくはＦｃγのＣＨ３ドメインまたはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ中の相同ドメインの少なくとも一部を含む。
さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失は本発明の実施で有用であり得ることが意図される。１つの例は、Ｆｃ受容体に対する親和性が減少したＦｃ変異型を作製するために上部ＣＨ２領域にアミノ酸置換を導入することであろう（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１５９：３６１３）。当業者は、周知の分子生物学技術を使用してこのような構築物を調製することができる。
さらなる実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質のインビボ安定性を増大させるためか、その生物活性もしくは局在化を調整するためか、融合タンパク質の精製を容易にするための可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドおよび第２の異種ポリペプチドを含む。ｔｉｍ−３可溶性融合タンパク質を生成するために使用することができる他の例示的異種タンパク質には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）などの酵素活性、または血球凝集素（ＨＡ）などのエピトープタグが含まれるが、これらに限定されない。
好ましくは、典型的には循環時に２０時間を超える半減期を有する安定な血漿タンパク質を使用して、ｔｉｍ−３またはガレクチン−９との融合タンパク質を構築する。このような血漿タンパク質には、免疫グロブリン、血清アルブミン、リポタンパク質、アポリポタンパク質、およびトランスフェリンが含まれるが、これらに限定されない。可溶性ｔｉｍ−３またはガレクチン−９分子を特定の細胞型または組織型にターゲティングすることができる配列を可溶性ｔｉｍ−３に結合させて特異的に局在化した可溶性ｔｉｍ−３融合タンパク質を作製することもできる。
１つの好ましい実施形態では、本発明は、アルブミンへのｔｉｍ−３またはガレクチン−９の融合物を提供する。本明細書中で使用される、「アルブミン」は、集合的に、アルブミンタンパク質もしくはアミノ酸配列または１つまたは複数のアルブミンの機能活性（例えば、生物活性）を有するアルブミンフラグメントもしくは変異型をいう。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミンもしくはそのフラグメント（欧州特許第２０１ ２３９号、同第３２２ ０９４号、ＷＯ９７／２４４４５、ＷＯ９５／２３８５７号を参照のこと）、特に、ヒトアルブミンの成熟形態または他の脊椎動物由来のアルブミンをいう。特に、本発明のアルブミン融合タンパク質には、ヒトアルブミンの天然に存在する多型性変異型およびヒトアルブミンのフラグメント（ＷＯ９５／２３８５７を参照のこと）（例えば、欧州特許第３２２ ０９４号に開示のフラグメント（すなわち、ＨＡ（Ｐｎ）（ｎは３６９〜４１９である））が含まれ得る。アルブミンは、任意の脊椎動物、特に、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ）に由来し得る。非哺乳動物アルブミンには、ニワトリおよびサケが含まれるが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、ｔｉｍ−３またはガレクチン−９タンパク質と異なる動物に由来し得る。
いくつかの実施形態では、アルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分は、血清アルブミンのフラグメントに対応する。血清アルブミンポリペプチドのフラグメントには、アミノ末端またはＣ末端から１つまたは複数の残基が欠失したポリペプチドが含まれる。一般的に言えば、ＨＡフラグメントまたはＨＡ変異型は、少なくとも１００アミノ酸長、好ましくは少なくとも１５０アミノ酸長である。ＨＡ変異型は、少なくとも１つのＨＡの全ドメインからなるかこれを含み得る。ヒトアルブミンのドメインは、米国特許出願番号２００４／０１７１１２３号に記載されている。
一定の実施形態では、本発明は、可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドをコードする核酸を含む。さらなる実施形態では、本発明はまた、可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドおよび関連誘導体を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、本発明のポリペプチドを、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用）、酵母、または哺乳動物細胞で発現することができる。１つの実施形態では、可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドを作製して哺乳動物細胞によって分泌させ、可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドを培養培地から精製する。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドの産生方法に関する。
治療有効性もしくは予防有効性または安定性（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ有効期間およびインビボでのタンパク質分解耐性）の強化などの目的のために本ｔｉｍ−３ポリペプチドの構造を調整することも可能である。このような修飾ポリペプチドは、天然に存在するタンパク質形態の少なくとも１つの活性を保持するようにデザインされた場合、本明細書中により詳細に記載されているｔｉｍ−３ポリペプチドの機能的等価物と見なされる。このような修飾ポリペプチドを、例えば、アミノ酸の置換、欠失、または付加によって産生することができる。
例えば、ロイシンからイソロイシンもしくはバリン、アスパラギン酸からグルタミン酸、トレオニンからセリンへの孤立置換（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）またはアミノ酸から構造的に関連するアミノ酸への類似の置換（すなわち、保存的変異体）が得られた分子の生物活性に大きな影響を与えないと予想することが妥当である。保存的置換は、その側鎖中で関連するアミノ酸ファミリー内で起こるものである。一般に、遺伝的にコードされたアミノ酸を、以下の４つのファミリーに分類することができる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸、（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、および（４）非荷電性で極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折、共に芳香族アミノ酸として分類される。類似の様式では、アミノ酸レパートリーを、以下のようにグループ化することができる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸、（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン、（３）脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン（セリンおよびトレオニンは、任意選択的に、脂肪族ヒドロキシルとして個別に分類される）、（４）芳香族＝フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、（５）アミド＝アスパラギン、グルタミン、ならびに（６）硫黄含有＝システインおよびメチオニン。（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｅｄ．ｂｙ Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，１９８１を参照のこと）。ポリペプチドのアミノ酸配列変化によって機能的ホモログが得られるかどうかを、変異ポリペプチドが野生型タンパク質に類似の様式で細胞中で応答する能力の評価によって容易に決定することができる。例えば、ｔｉｍ−３ポリペプチドのこのような変異形態を、例えば、Ｔｈ１細胞によるサイトカイン分泌を調整する能力またはガレクチン−９などのｔｉｍ−３リガンドに結合する能力について評価することができる。１つを超える置換が起こるポリペプチドを、同一の様式で容易に試験することができる。
一定の態様では、本可溶性ｔｉｍ−３およびガレクチン−９ポリペプチドの機能的変異型または修飾形態には、可溶性ポリペプチの少なくとも一部および１つまたは複数の融合ドメインを有する融合タンパク質が含まれる。このような融合ドメインの周知の例には、アフィニティクロマトグラフィによる融合タンパク質の単離に特に有用なポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、および免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が含まれるが、これらに限定されない。アフィニティ精製の目的のために、グルタチオン樹脂、アミラーゼ樹脂、およびニッケルまたはコバルト結合樹脂などのアフィニティクロマトグラフィ用の関連マトリクスを使用する。当該分野で周知の別の融合ドメインは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。融合ドメインには、特定の抗体が利用可能な通常は短いペプチド配列である「ペプチドタグ」も含まれる。特定のモノクローナル抗体が容易に利用可能な周知のエピトープタグには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）、およびｃ−ｍｙｃタグが含まれる。いくつかの場合、融合ドメインは、関連プロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによって組換えタンパク質が遊離する第Ｘａ因子またはトロンビンなどのプロテアーゼ結合部位を有する。次いで、その後のクロマトグラフィによる単離によって遊離タンパク質を融合ドメインから単離することができる。
本発明によって提供されるか本発明の方法で使用されるｔｉｍ−３およびガレクチン−９ポリペプチドのいくつかは、翻訳後修飾をさらに含み得る。例示的翻訳後タンパク質修飾には、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ−リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、スモイル化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）、ビオチン化、またはポリペプチド側鎖もしくは疎水性基の付加が含まれる。結果として、修飾可溶性ポリペプチドは、脂質、ポリサッカリドもしくはモノサッカリド、およびリン酸塩などの非アミノ酸エレメントを含み得る。
本発明の１つの特定の実施形態では、本ｔｉｍ−３およびガレクチン−９可溶性ポリペプチドの修飾形態は、本可溶性ポリペプチドの非タンパク質性ポリマーへの連結を含む。１つの特定の実施形態では、ポリマーは、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２、または同第４，１７９，３３７号に記載の様式のポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンである。
ＰＥＧは、市販されているか当該分野で周知の方法によるエチレングリコールの開環重合によって調製することができる周知の水溶性ポリマーである（Ｓａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｏ，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３，ｐａｇｅｓ１３８−１６１）。用語「ＰＥＧ」は、ＰＥＧのサイズまたは末端修飾と無関係に任意のポリエチレングリコール分子を含むように広範に使用され、式：Ｘ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−１ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（１）（式中、ｎは２０〜２３００であり、ＸはＨまたは末端修飾基（例えば、Ｃ１〜４アルキル）である）で示すことができる。１つの実施形態では、本発明のＰＥＧは、片端が水酸基またはメトキシである（すなわち、ＸはＨまたはＣＨ３である（「メトキシＰＥＧ」））。ＰＥＧは、結合反応に必要であるか、分子の化学合成に起因するか、分子の一部と最適な距離を得るためのスペーサーである化学基をさらに含むことができる。さらに、このようなＰＥＧは、互いに連結した１つまたは複数のＰＥＧ側鎖からなり得る。１つを超えるＰＥＧ鎖を有するＰＥＧを、多分岐ＰＥＧ（ｍｕｌｔｉａｒｍｅｄ ＰＥＧ）または分岐ＰＥＧと呼ぶ。分岐ＰＥＧを、例えば、種々のポリオール（グリセロール、ペンタエリスリオール、およびソルビトールが含まれる）へのポリエチレンオキシドの付加によって調製することができる。例えば、四分岐（ｆｏｕｒ−ａｒｍｅｄ ｂｒａｎｃｈｅｄ）ＰＥＧを、ペンタエリスリオールおよびエチレンオキシドから調製することができる。分岐ＰＥＧは、例えば、欧州特許第０ ４７３ ０８４号および米国特許第５，９３２，４６２号に記載されている。ＰＥＧの一形態には、リジンの第１級アミノ基を介して連結した２ＰＥＧ側鎖（ＰＥＧ２）が含まれる（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６（１９９５）６２−６９）。
ペプチドまたはタンパク質へのＰＥＧ抱合は、一般に、ＰＥＧの活性化および活性化ＰＥＧ−中間体の標的タンパク質／ペプチドへの直接的カップリングを含むか、リンカーに結合させ、その後の活性化して標的タンパク質／ペプチドにカップリングする（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，３５７１（１９７７）ａｎｄ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，３５８２（１９７７），Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ．ａｌ．，ｉｎ：Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；（Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ ｅｄ．）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２；Ｃｈａｐ．２１ ａｎｄ ２２）。
当業者は、例えば、ペグ化ｔｉｍ−３またはガレクチン−９ポリペプチドをどのようにして治療で使用するか、所望の投薬量、循環時間、タンパク質分解耐性、免疫原性、および他の検討材料に基づいてＰＥＧの適切な分子量を選択することができる。ＰＥＧおよびタンパク質特性を増強するためのその使用についての考察については、Ｎ．Ｖ．Ｋａｔｒｅ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １０：９１−１１４（１９９３）を参照のこと。
本発明の１つの実施形態では、リジンなどのｔｉｍ−３またはガレクチン−９ポリペプチド上のアミノ基と反応させるために、ＰＥＧ分子を活性化することができる（Ｂｅｎｃｈａｍ Ｃ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３１，２５（１９８３）；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１，１４１（１９８５）．；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ａｄｒｓ ９−１１０ ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ４６９（１９９９）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，１９，１１７７−１１８３（１９８３）；Ｄｅｌｇａｄｏ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２，１１９−１２８（１９９０））。別の実施形態では、ＰＥＧ分子を、ｔｉｍ−３またはガレクチン−９上のスルフヒドリル基にカップリングすることができる（Ｓａｒｔｏｒｅ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７，４５（１９９１）；Ｍｏｒｐｕｒｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎ．Ｃｈｅｍ．，７，３６３−３６８（１９９６）；Ｇｏｏｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）８，３４３；米国特許第５，７６６，８９７号）。米国特許第６，６１０，２８１号および同第５，７６６，８９７号は、スルフヒドリル基にカップリングすることができる例示的反応性ＰＥＧ種を記載している。いくつかの実施形態では、ペグ化ｔｉｍ−３またはガレクチン−９タンパク質は、Ｎ末端アミノ酸のαアミノ基に共有結合したＰＥＧ分子を含む。部位特異的Ｎ末端還元アミノ化は、Ｐｅｐｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＪＰＥＴ，２９７，１０５９および米国特許第５，８２４，７８４号に記載されている。他の利用可能な求核アミノ基を使用したタンパク質の還元的アミノ化のためのＰＥＧ−アルデヒドの使用は、米国特許第４，００２，５３１号、Ｗｉｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４，１２５７９、およびＣｈａｍｏｗ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５，１３３に記載されている。
（（６）免疫試薬）
本発明は、さらに、ｔｉｍ−３ポリペプチド（マウスおよびヒトポリペプチドが含まれる）に結合することができる免疫試薬、好ましい実施形態では、可溶性ｔｉｍ−３に結合するが全長ｔｉｍ−３に結合しない免疫試薬を提供する。
本発明の１つの態様は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合するが、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合しない単離抗体またはそのフラグメントを提供する。配列番号２はヒト可溶性ｔｉｍ−３タンパク質であり、配列番号１３はヒト全長ｔｉｍ−３タンパク質である。したがって、このような抗体は可溶性ヒトｔｉｍ−３に結合するが、全長ヒトｔｉｍ−３に結合しない。
本発明の別の態様は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合するが、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合しない単離抗体またはそのフラグメントを提供する。配列番号４はマウス可溶性ｔｉｍ−３タンパク質であり、配列番号１４はマウス全長ｔｉｍ−３タンパク質である。したがって、このような抗体は可溶性マウスｔｉｍ−３に結合するが、全長マウスｔｉｍ−３に結合しない。
可溶性ｔｉｍ−３に結合するが全長ｔｉｍ−３に結合しない特定の抗血清を、例えば、可溶性ｔｉｍ−３タンパク質中に含まれるが全長タンパク質に含まれないアミノ酸配列を有するペプチドに対する免疫原の生成によって生成することができる。このようなペプチドは、可溶性ｔｉｍ−３のＩｇＶドメインと細胞内ドメインとの間の連結部をつなぐことができる。この連結部は、全長ｔｉｍ−３配列中に存在せず、ＩｇＶと細胞内ドメインとの間にムチンおよび膜貫通ドメインが挿入されている。１つの実施形態では、配列番号６の１６アミノ酸のヒト可溶性ｔｉｍ−３ペプチドを、このような抗体を生成するための免疫原として使用する。マウスｔｉｍ−３と等価な抗体を生成するために、配列番号８のペプチドを使用することができる。当業者は、Ｃ末端、Ｎ末端、またはその両方のさらなる残基での伸長または免疫原性もしくは可溶性を増強するための所望の短縮によってこのペプチドを操作することができる。さらに、キャリアに抱合するかさらなる所望の性質を付与するために、システイン基または他の残基をペプチドに付加することができる。
同様に、全長ｔｉｍ−３に結合するが可溶性ｔｉｍ−３に結合しないペプチドを、その配列がｔｉｍ−３の全長形態で見出されるが可溶性形態で見出されないペプチドを使用して生成することができる。例えば、このようなペプチドは、ｔｉｍ−３膜貫通ドメインの配列、より好ましくはｔｉｍ−３ムチンドメインの配列に対応することができる。あるいは、これらのペプチドは、全長ｔｉｍ−３のＩｇＶドメインとムチンドメインとの間または全長ｔｉｍ−３の膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間の連結部をつなぐ配列を含み得る。
ニワトリ、哺乳動物（マウス、ハムスター、ヤギ、モルモット、またはウサギなど）を、記載のペプチド変異型のいずれかの免疫原性形態（例えば、抗体応答を誘発することができる免疫原性フラグメント）で免疫化することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与する技術には、キャリアへの抱合または当該分野で周知の他の技術が含まれる。例えば、１つの本タンパク質のペプチジル部分を、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行を、血漿または血清中の抗体力価の検出によってモニタリングすることができる。標準的なＥＬＩＳＡまたは免疫アッセイを抗原としての免疫原と共に使用して、抗体レベルを評価することができる。
免疫化後に抗血清を得ることができ、所望ならば、標的タンパク質に対するポリクローナル抗体を血清からさらに単離することができる。モノクローナル抗体を産生するために、免疫化動物から抗体産生細胞（リンパ球）を採取し、標準的な体細胞融合手順によって骨髄腫細胞などの不死化細胞と融合してハイブリドーマ細胞を得ることができる。このような技術は当該分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５によって最初に開発された）並びにヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２，１９８３）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６，１９８５）が含まれる。ハイブリドーマ細胞を、ｔｉｍ−３ペプチドに特異的に反応性を示す抗体および単離されたモノクローナル抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングすることができる。したがって、本発明の別の態様は、本明細書中に記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を提供する。
次いで、抗体を、全長ｔｉｍ−３および可溶性ｔｉｍ−３に対する結合特異性について試験することができる。例えば、ヒト可溶性ｔｉｍ−３のＩｇＶ細胞内ドメイン連結部に対応する配列番号６のペプチドに対して生成された抗体を膜へのｔｉｍ−３ポリペプチドの固定および抗体を使用したウェスタンブロットの実施によってｔｉｍ−３のいずれかの形態に結合する能力について試験することができる。当業者は、抗体がタンパク質に結合するかどうかを決定する任意の日常的方法を使用することができる。
他の実施形態では、全ｔｉｍ−３可溶性タンパク質に対するモノクローナル抗体を生成し、その後に可溶性ｔｉｍ−３のみに特異的な抗体を同定するためにこれらが全長ｔｉｍ−３タンパク質に結合するかどうかについてスクリーニングすることができる。
本明細書中で使用される、用語「抗体」は、本明細書中に記載のタンパク質またはこのようなタンパク質を含む複合体とも特異的に反応するフラグメントが含まれることを意図する。従来技術を使用して抗体を断片化し、フラグメントを全抗体について上記と同一の様式でスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、ペプシンでの抗体の処理によって生成することができる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントを、ジスルフィド結合を還元するように処理してＦａｂ’フラグメントを産生することができる。本発明の抗体は、二重特異性分子およびキメラ分子ならびに一本鎖（ｓｃＦｖ）抗体が含まれることがさらに意図される。
本抗体には、例えば、米国特許第５，５８５，０９８号に記載のように調製することができる三量体抗体およびヒト化抗体が含まれる。単鎖抗体も本発明の範囲内である。全てのこれらの抗体の修飾形態および抗体のフラグメントは、用語「抗体」に含まれることが意図される。
（（７）Ｔｉｍ−３／ガレクチン−９免疫調整薬の同定）
本発明の別の態様は、免疫調整応答を調整する薬剤の同定方法（例えば、Ｔｉｍ−３とガレクチン−９との間の相互作用を調整する薬剤の同定方法など）を提供する。１つの態様では、本発明は、ガレクチン−９などのｔｉｍ−３リガンドへのｔｉｍ−３の結合を遮断する薬剤の同定方法を提供する。この相互作用を遮断する薬剤は、ｔｉｍ−３の活性化を防止してＴｈ１応答を増加させ、そして／またはＴｈ２応答を減少させると予想されるであろう。別の態様では、本発明は、ガレクチン−９などのｔｉｍ−３リガンドへのｔｉｍ−３の結合を促進するか、ｔｉｍ−３へのリガンド結合を模倣する薬剤の同定方法を提供する。このような薬剤は、ｔｉｍ−３の活性化を促進してＴｈ１応答を減少させ、そして／またはＴｈ２応答を増加させると予想されるであろう。したがって、本明細書中に記載の方法を使用して同定した薬剤を使用して、必要とする被験体のＴＨ１およびＴＨ２応答を調整することができる。
１つの態様では、本発明のｔｉｍ−３／ガレクチン−９の同定により、Ｘ線結晶学、ニューロン回折、核磁気共鳴分光分析、および多の技術を使用して同定することができるｔｉｍ−３およびガレクチン−９の構造の特徴に基づいたアゴニストおよびアンタゴニストの合理的デザインが容易になる。合理的薬物デザイン方法は、当該分野で周知である（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｄａｖｉｄ Ｂ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｖ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．７１９，Ａｂｂｙ Ｌ．Ｐａｒｒｉｌｌ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ（１９９９）；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｋｌａｕｓ Ｇｕｂｅｒｎａｔｏｒ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（１９９８）を参照のこと）。本発明の関連する態様は、ｔｉｍ−３ポリペプチドおよび／またはガレクチン−９ポリペプチドを含む再構成タンパク質調製物を提供する。特定の実施形態では、再構成組成物中の少なくとも１％のタンパク質がｔｉｍ−３ポリペプチドおよびガレクチン−９ポリペプチドであり、少なくとも２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％がより好ましい。１つの実施形態では、再構成組成物中のタンパク質は、組換えタンパク質である。
本発明の別の態様は、ｔｉｍ−３とガレクチン−９との間の複合体の形成を促進または遮断する薬剤のスクリーニング方法を提供する。このような方法をインビトロまたは細胞中で行うことができ、タンパク質の一方および両方の全長タンパク質または可溶性フラグメント（すなわち、膜貫通ドメインを欠くフラグメント）などのそのフラグメントを使用して実施することができる。本明細書中に記載の方法のいくつかの実施形態では、ｔｉｍ−３のＩｇＶおよび任意選択的にムチンドメインを含む可溶性タンパク質を使用する。種々の他の試薬を、スクリーニングアッセイに含めることができる。これらには、最適なタンパク質−タンパク質結合を容易にし、そして／または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を減少させるために使用される塩、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などが含まれる。プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌薬などのアッセイ効率を改善する試薬を使用することもできる。必要な結合を得るために、成分の混合物を任意の順序で添加する。任意の適切な温度（典型的には、４℃と４０℃との間）でインキュベーションを行う。最適な活性が得られるインキュベーション期間を選択するが、高処理スクリーニングが容易になるように最適化することもできる。典型的には、インビトロアッセイには０．１時間と１時間との間で十分である。
本発明の薬剤の同定方法は、各ウェル中での異なる試験化合物または試験化合物群を使用したマルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）での化合物ラブラリーのスクリーニングに十分に適切である。特に、組み合わせライブラリーと共に本方法を使用することができる。これらの方法を、任意の許容可能な縮小方法によるアッセイ系（２４、４８、９６、または３８４ウェル／プレートなどのマルチウェルプレート、マイクロチップ、またはスライドが含まれるが、これらに限定されない）に「縮小」することができる。有利にはより少量の試薬および他の材料を含むマイクロチップ支持体上で実施するためにアッセイサイズを減少させることができる。高処理スクリーニングの一助となるプロセスの任意の縮小は、本発明の範囲内である。
本発明の１つの特定の態様は、Ｔｈ１機能を調整する治療薬の同定方法を提供する。したがって、本発明の１つの態様は、１）薬剤の非存在下でｔｉｍ−３とガレクチン−９ポリペプチドが物理的に相互作用する条件下で、ｔｉｍ−３ポリペプチドまたはそのフラグメント、ガレクチン−９ポリペプチドまたはそのフラグメント、および薬剤を組み合わせる工程と、２）薬剤が相互作用を妨害するかどうかを決定する工程と、任意選択的に、３）相互作用を妨害する薬剤について、Ｔｈ１細胞の活性化を促進する能力をさらに評価する工程とを含む、薬剤のＴｈ１活性かを調整する能力を評価する方法を提供する。
本発明の別の特定の態様は、（ａ）試験薬の存在下でｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとを接触させる工程と、（ｂ）ｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとの結合に対する試験薬の効果を決定する工程と、それにより、ｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとの間の結合を調整する薬剤が同定されることとを含む、ｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとの間の結合を調整する薬剤の同定方法を提供する。
本発明の関連する特定の態様は、（ａ）試験薬の存在下でｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとを接触させる工程と、（ｂ）ｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとの結合に対する試験薬の効果を決定する工程と、それにより、免疫応答を調整する薬剤が同定されることとを含む、免疫応答を調整する薬剤の同定方法を提供する。
本明細書中に記載のｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとの間の相互作用の検出方法の１つの実施形態では、ガレクチン−９ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸１〜３２３、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸１〜３５５、（ｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸１〜３２３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、または（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸１〜３５５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ｔｉｍ−３ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸３０〜１２８、または（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸３０〜１２８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
本発明のいくつかの態様では、インビトロアッセイによって薬剤を同定する。種々のアッセイ形式が十分であり、本開示に照らして、本明細書中に明確に記載されていないアッセイ形式でさえも当業者に把握されている。タンパク質複合体の形成などの条件に近いアッセイ形式（酵素活性）を多数の異なる形式から得ることができ、無細胞系（例えば、精製タンパク質または細胞溶解物）に基づいたアッセイおよびインタクトな細胞を使用する細胞ベースのアッセイが含まれる。簡潔な結合アッセイを使用して、ｔｉｍ−３またはガレクチン−９に結合する薬剤を検出することもできる。このような結合アッセイは、ｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとの間の相互作用の破壊によって作用する薬剤を同定することもできる。
試験すべき薬剤を、例えば、細菌、酵母、または他の生物（例えば、天然産物）によって産生することができるか、化学的に産生することができるか（例えば、ペプチド模倣物がふくまれる小分子）、組換えによって産生することができる。ｔｉｍ−３およびガレクチン−９は膜貫通タンパク質であるので、ｔｉｍ−３とガレクチン−９との間の複合体形成を調整する薬剤を同定するために記載されたアッセイおよび方法の好ましい実施形態は、全長タンパク質よりもむしろこれらのタンパク質の可溶性形態を使用する。可溶性形態には、膜貫通ドメインを欠くものおよび／またはＩｇＶドメインまたは同族結合パートナーに結合する能力を保持するそのフラグメントを含むものが含まれる。
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多数の薬物スクリーニングプログラムでは、所与の期間で調査される化合物数を最大にするための高処理アッセイが望ましい。無細胞系で実施され、精製もしくは半精製タンパク質または溶解物を使用して開発することができるアッセイを、しばしば、迅速に開発され、且つ試験化合物によって媒介される分子標的の変化を検出することが可能なように作製することができるという点で、「一次」スクリーニングとして好ましい。さらに、試験化合物の細胞毒性および／または生物学的利用能の影響を、一般に、インビトロ系で無視することができ、その代わり、アッセイは、主に、他のタンパク質との結合親和性の変化または分子標的の酵素的特性の変化として現れ得る分子標的に対する薬物の効果が注目される。
本発明のアッセイの好ましいインビトロ実施形態では、再構成ｔｉｍ−３／ガレクチン−９複合体は、少なくとも半精製タンパク質の再構成混合物を含む。半精製は、再構成混合物で使用されたタンパク質が以前に他の細胞またはウイルスタンパク質から分離されていることを意味する。例えば、細胞溶解物と対照的に、ｔｉｍ−３／ガレクチン−９複合体形成に関与するタンパク質は、混合物中の他の全てのタンパク質と比較して少なくとも純度５０％で存在し、より好ましくは、純度９０〜９５％で存在する。本方法の一定の実施形態では、再構成タンパク質混合物は、再構成混合物がｔｉｍ−３／ガレクチン−９複合体のアセンブリおよび／または分解を測定する能力を妨害するか変化させる可能性がある他のタンパク質（細胞起源またはウイルス起源など）を実質的に欠くような高度に精製されたタンパク質の混合によって誘導される。
候補薬剤の存在下または非存在下におけるｔｉｍ−３／ガレクチン−９複合体のアッセイを、反応物質の含有に適切な任意の容器中で行うことができる。例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠沈管が含まれる。スクリーニングアッセイでは、試験薬の効果を、例えば、速度、定常状態、および／または反応終点に対する試験薬の効果によって評価することができる。
本発明の１つの実施形態では、ｔｉｍ−３／ガレクチン−９複合体のアセンブリまたは安定性を妨害する能力に基づいて阻害剤を検出する薬物スクリーニングアッセイを得ることができる。例示的結合アッセイでは、目的の化合物を、ｔｉｍ−３／ガレクチン−９複合体を含む混合物と接触させる。ｔｉｍ−３／ガレクチン−９複合体の検出および定量により、２つのポリペプチド間の相互作用の阻害（または増強）に対する化合物の有効性を決定する手段が得られる。化合物の有効性を、種々の濃度の試験化合物を使用して得られたデータからの用量応答曲線の作成によって評価することができる。さらに、比較のためのベースラインを得るためのコントロールアッセイも行うことができる。コントロールアッセイでは、複合体形成を、試験化合物の非存在下で定量する。
種々の技術によって複合体形成を検出することができる。例えば、複合体形成の調整を、例えば、検出可能に標識されたタンパク質（例えば、放射性標識、蛍光標識、または酵素標識されたタンパク質）、免疫アッセイ、またはクロマトグラフィ検出を使用して、定量することができる。表面プラズモン共鳴システム（Ｂｉａｃｏｒｅ(c)Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から市販されているものなど）を使用して、タンパク質−タンパク質相互作用を検出することもできる。
本明細書中に記載のタンパク質およびペプチドを固定することができる。しばしば、タンパク質の１つの非複合体化形態からの複合体の分離を容易にし、アッセイの自動化に適応するようにペプチドおよびポリペプチドを固定することが望ましい。ペプチドおよびポリペプチドを、プレート、ビーズ、またはフィルターなどの任意の固体マトリクスに固定することができる。ペプチドまたはタンパク質を、ポリペプチドに結合する反応基を含むマトリクス上に固定することができる。あるいはまたは組み合わせて、タンパク質中のシステインなどの反応基は、マトリクスと反応して結合することができる。別の実施形態では、ポリペプチドは、高い親和性でビオチンと結合するストレプトアビジンとの融合タンパク質などのマトリクスに対する結合親和性が高い別のポリペプチドとの融合タンパク質として発現することができる。
例示的実施形態では、タンパク質が不溶性マトリクスと結合するドメインが付加された融合タンパク質を得ることができる。例えば、グルタチオントランスフェラーゼと融合したｔｉｍ−３のＩｇＶドメインを含むＧＳＴ−ＴＩＭ−３−ＩｇＶドメイン融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導マイクロタイタープレート上に吸着させ、その後、ガレクチン−９もしくはそのフラグメント（例えば、３５Ｓ標識ポリペプチド）および試験化合物と組み合わせ、複合体が形成される条件下でインキュベートすることができる。インキュベーション後、ビーズを洗浄して任意の非結合相互作用タンパク質を除去し、直接または複合体の解離後の上清中（例えば、マイクロタイタープレートを使用する場合）のマトリクスビーズ結合放射性標識を測定した。あるいは、非結合タンパク質の洗い流し後、複合体をマトリクスから分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離し、マトリクス結合画分中に見出された相互作用ポリペプチドレベルを、標準的な電気泳動技術を使用してゲルから定量することができる。
上記アッセイの種々の修正形態が本発明の範囲内に含まれると理解される。例えば、タンパク質の役割を切り替えることができる−−すなわち、ガレクチン−９タンパク質を固体支持体に固定し、ｔｉｍ−３タンパク質を含む溶液を結合したガレクチン−９タンパク質と接触させることができる。さらに、固定タンパク質または遊離タンパク質を、結合アッセイ前に試験化合物に曝露し、この前曝露効果をコントロールと比較して評価することができる。この様式で同定された化合物は、ガレクチン−９へのｔｉｍ−３の結合またはその逆も阻害する。あるいは、ｔｉｍ−３およびガレクチン−９の混合後に試験化合物を添加することができる。このようなアッセイにおいて結合レベルを減少させるのに有効な化合物は、ガレクチン−９タンパク質からｔｉｍ−３を分離するか、その逆を分離する。
ウェスタンブロットに加えて、マルチウェルＥＬＩＳＡ型アプローチなどの他のより迅速な検出スキームを使用することができる。例えば、部分的に精製された（例えば、上記のＧＳＴ法）ｔｉｍ−３タンパク質を、プレートへのタンパク質を含む溶液の導入およびプラスチックへのタンパク質の結合によってマルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）中のウェルの下部に付着させることができる。次いで、過剰なタンパク質含有溶液を洗い流し、非特異的結合部位をブロッキングするためにブロッキング溶液（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む）を導入する。次いで、プレートを数回以上洗浄し、ガレクチン−９タンパク質を含む溶液、実験（コントロールに対する）ウェルの場合は試験化合物を添加する。異なるウェルは、異なる試験化合物、異なる濃度の同一の試験物質、異なるｔｉｍ−３タンパク質もしくはガレクチン−９タンパク質、または異なる濃度のｔｉｍ−３タンパク質もしくはガレクチン−９タンパク質を含み得る。さらに、この検出スキームに対する種々の修正形態を得ることができると理解される。例えば、マルチウェルプレートのウェルをｔｉｍ−３タンパク質よりもむしろガレクチン−９タンパク質を含むポリペプチドでコーティングし、遊離ｔｉｍ−３タンパク質の添加時の結合相互作用をアッセイすることができる。ウェルを、固定すべきタンパク質の付着を増強し、そして／または非特異的結合レベルを減少させる化合物で予備コーティングすることもできる。例えば、ウェルを、グルタチオンを含むように誘導体化し、曝露された結合部位との既知の方向での固定化タンパク質の付着を促進するためにＢＳＡで予備コーティングすることができる。
このようなアッセイで有用な検出方法には、抗体ベースの方法（すなわち、「遊離」タンパク質に指向する抗体）、「遊離」タンパク質に組み込まれたレポーター部分（蛍光標識など）の直接検出、および近位（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）エネルギー移動法（固定化タンパク質または固体支持体に組み込まれた分子の蛍光またはシンチレーションが得られる放射性「遊離」タンパク質などなど）が含まれる。
本発明のガレクチン−９タンパク質へのｔｉｍ−３タンパク質の結合に影響を与えることができる化合物の同定方法のさらに別のバリエーションは、アフィニティバイオセンサー法の使用である。このような方法は、圧電効果、電気化学、または光学的方法（偏光解析法、導光板、および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）など）に基づき得る。ＳＰＲは、実時間の分子相互作用のモニタリングに特に有利であり、上記考察の方法よりも２タンパク質間の結合相互作用に対する試験化合物の効果の高感度且つ総合的な分析が可能である。しかし、この利点は、（マルチウェルプレートベースの方法と比較して）技術の処理速度の低さによって幾らか打ち消される。
上記のように、試験化合物は、化合物がガレクチン−９タンパク質へのｔｉｍ−３タンパク質の結合に対して任意の効果を有し（すなわち、化合物が結合を増減させる場合）、効果が閾値を超える場合（上記の本発明の実施者によって所望のレベルに設定されている；例えば、結合の数倍の増加または数倍の減少）、ｔｉｍ−３タンパク質とガレクチン−９タンパク質の間の結合に効果を有するということができる。好ましくは、結合に対する効果は有意な効果である。本明細書中で使用される、用語「有意な」、詳細には、「有意な効果」は、標準的な統計的検定を使用して統計的に有意な比較される２群間の定量可能なパラメータの相違をいう。本明細書中に記載の方法のいくつかの実施形態では、工程（ｂ）は、試験薬の存在下でのｔｉｍ−３／ガレクチン−９複合体の形成の適切なコントロールとの比較を含む。いくつかの実施形態では、適切なコントロールは、試験薬の非存在下での第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の複合体の形成を含む。
したがって、本発明の１つの実施形態では、（ａ）試験化合物の存在下でｔｉｍ−３タンパク質をガレクチン−９タンパク質と接触させる工程と、（ｂ）ｔｉｍ−３タンパク質およびガレクチン−９タンパク質の結合に対する試験化合物の効果を決定する工程と、（ｃ）結合範囲に対するその測定された効果が閾値レベルを超える場合に化合物が有効であると同定する工程とを含む、ｔｉｍ−３タンパク質とガレクチン−９タンパク質との間の結合に影響を与える化合物のスクリーニング方法を提供する。
用語「ｔｉｍ−３タンパク質とガレクチン−９タンパク質との間の結合に影響を与える」は、試験化合物により、その非存在下でのｔｉｍ−３タンパク質とガレクチン−９タンパク質との間の結合（コントロール）と比較してその存在下でのｔｉｍ−３タンパク質とガレクチン−９タンパク質との間の結合に相違が生じることを意味する。好ましくは、この結合の相違は、有意な相違である。特定の実施形態では、有意な相違は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、または５００％の結合の増加または減少を含む。化合物は、結合を阻害または増強することができるか、ｔｉｍ−３に対する影響の点からみて、アンタゴニスト、アゴニストとして作用することができるか、他のアゴニストまたはアンタゴニストの効果を増強する化合物として作用することができる。ｔｉｍ−３タンパク質とガレクチン−９タンパク質との間の結合に対する試験化合物の効果を定量するために使用される測定型は、アッセイおよび検出方法の型に依存し、当業者はこれを容易に決定することができる。例えば、検出手段としてウェスタンブロッティングを使用する生物学的スクリーニングを使用する場合、デンシトメトリーを使用して結合を測定することができる。デンシトメトリー値を正規化し、一連のコントロールサンプル（すなわち、試験化合物を含まない）の間のシグナルの変化量に基づいて閾値レベルを設定することができる。変化が小さいほど、正確に検出することができる試験化合物の影響が小さくなる。
本発明のアッセイのなおさらなる実施形態では、本アッセイを補助する細胞培養技術を活用して、ｔｉｍ−３／ガレクチン−９複合体をホールセルで生成する。例えば、下記のように、哺乳動物細胞または酵母細胞などの真核細胞培養系でｔｉｍ−３／ガレクチン−９複合体を構成することができる。当業者に公知の他の細胞を使用することができる。ホールセル中での本アッセイの利点には、インヒビターの治療的使用が必要であることにより密接に近い環境で機能的なインヒビターを検出する能力（薬剤の細胞への侵入を増大させる能力が含まれる）が含まれる。さらに、以下の例などのアッセイの一定のインビボでの実施形態は、試験薬を高処理で分析することができる。ｔｉｍ−３／ガレクチン−９複合体の成分は、アッセイを補助するために選択された細胞に対して内因性であり得る。あるいは、いくつかまたは全ての成分は、外因性供給源に由来し得る。例えば、組換え技術（発現ベクターの使用などによる）および融合タンパク質自体または融合タンパク質をコードするｍＲＮＡの微量注入によって、融合タンパク質を細胞に移入することができる。
さらに別の実施形態では、一方および他方へのタンパク質の結合を破壊する薬剤のその後の検出のために、ｔｉｍ−３およびガレクチン−９ポリペプチドを使用して、捕捉アッセイを得ることができる（米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；ａｎｄ Ｉｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６も参照のこと）。
酵母２ハイブリッドタンパク質相互作用アッセイを使用して、ガレクチン−９タンパク質へのｔｉｍ−３タンパク質の結合に影響を与える化合物を同定することもできる。アッセイは、ほとんどの真核生物転写アクチベーターがモジュラーである（すなわち、アクチベーターが、典型的には、転写を活性化する活性化ドメインおよびアクチベーターをＤＮＡ分子の適切な領域に局在化するＤＮＡ結合ドメインを含む）という所見に基づく。
２ハイブリッド系では、第１の融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインに融合した相互作用タンパク質対の一方を含み、第２の融合タンパク質は転写活性化ドメインに融合した相互作用タンパク質対の他方を含む。２つの融合タンパク質は、同一細胞中で独立して発現し、融合物の「相互作用タンパク質」部分の間の相互作用は、レポーター遺伝子転写の活性化によって検出される転写活性化因子の融合を再構成する。少なくとも２つの異なる細胞ベースの２ハイブリッドタンパク質−タンパク質相互作用アッセイ系を使用して、結合相互作用が評価され、そして／または相互作用タンパク質が同定されている。これらの両方は、融合ハイブリッドタンパク質対を使用し、対の一方が転写活性化因子の転写活性化ドメインに融合した２つの「相互作用」タンパク質の一方を含み、対の他方が転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインに融合した２つの「相互作用」タンパク質の他方を含む。
別の実施形態では、一方のタンパク質は、細胞表面などの細胞上で発現するのに対し、他方のタンパク質は、複合体を形成するなどのために精製または部分精製して細胞と接触させた天然または組換えタンパク質である。
いくつかの実施形態では、ｔｉｍ−３とガレクチン−９との間の結合相互作用を調整すると同定された薬剤を、実験の項に記載のアッセイなどの使用によってインビトロまたはインビボでのＴ細胞によるＴｈ１／Ｔｈ２応答の誘導に対するその効果などの機能的効果についてさらに評価することができる。いくつかの実施形態では、病態の動物モデルをさらに使用して、本明細書中に記載の方法（自己免疫性脳脊髄炎実験モデル、２型真性糖尿病モデルとしてのＫＫＡｙマウス、およびファブリー病モデル（αＧＡＬノックアウト）など）を使用して同定した薬剤を特徴づける。使用することができるヒト疾患のさらなるマウスモデルについては、Ｂｅｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９９７ Ｊａｎ １；１１（１）：１１−４３も参照のこと。
試験薬または試験化合物は、試験されることが望まれる任意の薬剤または化合物であってよく、タンパク質（抗体が含まれる）、ペプチド、核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸が含まれる）、炭水化物、有機化合物、無機化合物、天然産物、ライブラリー抽出物、体液、およびｔｉｍ−３とガレクチン−９ポリペプチドとの間の結合への影響について試験することが望ましい他のサンプルが含まれるが、これらに限定されない。特に、試験化合物は、ｔｉｍ−３タンパク質のペプチド模倣物またはそのフラグメントであり得る。いくつかの実施形態では、試験薬は精製または部分精製した薬剤であるのに対し、他の実施形態では、精製されていない。
試験薬は、多数の化学的クラスを含むが、典型的には有機分子、好ましくは、分子量が５０ダルトン以上で約２，５００ダルトン未満の小有機化合物である。試験薬は、タンパク質との構造的相互作用（水素結合が含まれる）に必要な官能基を含み、典型的には、少なくとも１つのアミン基、カルボニル基、水酸基、またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの化学的官能基が含まれる。試験薬は、しばしば、１つまたは複数の上記官能基に置換された環式炭素構造もしくは複素環式構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含む。試験薬は、生体分子（ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造アナログ、またはその組み合せが含まれるが、これらに限定されない）中に見出される。
試験薬は、広範な種々の供給源（合成化合物または天然化合物のライブラリーが含まれる）から得られる。例えば、広範な種々の有機化合物および生体分子の無作為および直接的な合成に多数の手段（無作為化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチド発現が含まれる）が利用可能である。小有機物／ペプチドのライブラリーを、Ｂｏｎｄｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１４：８３；ｔｈｅ Ａｆｆｙｍａｘ Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔｓ５，３５９，１１５ ａｎｄ ５，３６２，８９９；Ｅｌｌｍａｎの米国特許第５，２８８，５１４号；Ｓｔｉｌｌ ｅｔ ａｌ．のＰＣＴ公開ＷＯ９４／０８０５１号；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＪＡＣＳ １１６：２６６１；Ｋｅｒｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＪＡＣＳ １１５：２５２；ＰＣＴ公開Ｗ０９２／１００９２号、Ｗ０９３／０９６６８号、およびＷＯ９１／０７８７号；ならびにＬｅａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．のＰＣＴ公開Ｗ０９３／２０２４２号などに記載の組み合わせ技術を使用して生成することができる。
あるいは、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であるか、容易に産生される。あるいは、天然または化学的に産生されたライブラリーおよび化合物を、従来の化学的、物理的、および生化学的手段によって容易に修飾し、これを使用して、組み合わせライブラリーを産生することができる。公知の薬物を、直接または無作為な化学修飾（アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化など）に供して、例えば、構造アナログを生成することができる。
他の実施形態では、試験薬は、ｔｉｍ−３、ガレクチン−９、またはそのフラグメントのペプチド模倣物である。ペプチド模倣物は、ペプチドおよびタンパク質に基づくかこれらに由来する化合物である。本発明で使用することができるペプチド模倣物を、非天然アミノ酸、高次構造の制限、等比体積置換などを使用した公知のアナログペプチド配列の構造修飾によって得ることができる。本ペプチド模倣物は、ペプチド合成構造と非ペプチド合成構造との間の構造上の空間の連続体（ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）を構成する。したがって、アナログペプチド模倣物は、薬理作用団の描写および親アナログペプチド活性を有する非ペプチド化合物へのペプチドの翻訳の補助で有用であり得る。
さらに、本開示から明らかなように、本ｔｉｍ−３配列およびガレクチン−９配列のミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）を提供することができる。このようなペプチド模倣物は、非加水分解性（例えば、プロテアーゼまたは対応するペプチドを分解する他の生理学的条件に対する安定性の増加）、特異性および／または潜在性の増加、ならびにペプチド模倣物の細胞内局在化のための細胞透過性の増加などの特性を有し得る。例示を目的として、本発明のペプチドアナログを、例えば、ベンゾジアゼピン（例えば、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８を参照のこと）、置換γラクタム環（Ｇａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８，ｐａｌ２３）、Ｃ−７模倣物（Ｈｕｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌｅｄ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８，ｐ．１０５）、ケト−メチレン偽ペプチド（Ｅｗｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ２９：２９５；ａｎｄ Ｅｗｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ９ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）Ｐｉｅｒｃｅ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＩＬ，１９８５）、αターンジペプチドコア（Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２６：６４７；ａｎｄ Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １：１２３１）、α−アミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １２６：４１９；ａｎｄ Ｄａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １３４：７１）、ジアミノケトン（Ｎａｔａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １２４：１４１）、およびメチレンアミノ修飾（Ｒｏａｒｋ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｅｄ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８，ｐｌ３４）を使用して生成することができる。また、一般に、Ｓｅｓｓｉｏｎ ＩＩＩ：Ａｎａｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ，ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８）を参照のこと。
本アナログペプチド模倣物を生成するために実施することができる種々の側鎖置換に加えて、本発明は、詳細には、ペプチド二次構造の高次構造が制限された模倣物の使用を意図する。ペプチドのアミド結合の多数の代理物が開発されている。頻繁に使用されているアミド結合の代理物には、以下の基が含まれる：（ｉ）ｔｒａｎｓ−オレフィン、（ｉｉ）フルオロアルケン、（ｉｉｉ）メチレンアミノ、（ｉｖ）ホスホンアミド、および（ｖ）スルホンアミド。
いくつかの実施形態では、試験薬がｔｉｍ−３またはガレクチン−９ポリペプチドの間の結合に影響を与えることができるかどうかを決定する前にｔｉｍ−３またはガレクチン−９タンパク質に結合する能力について試験薬を予備選択する。１つの実施形態では、試験薬を、ｔｉｍ−３またはガレクチン−９ポリペプチに結合する能力について最初に選択することができる。試験薬を、ペプチドライブラリーまたはファージディスプレイライブラリーなどの試験薬のライブラリーのスクリーニングによって予備選択することができる。
（（８）組成物、処方物、およびパッケージング）
本発明のさらなる態様は、本明細書中に記載の核酸、ポリペプチド、または薬剤を含む組成物を提供する。１つの実施形態では、組成物は、薬学的組成物である。本発明で使用される薬学的組成物を１つまたは複数の生理学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を使用した従来の様式で処方することができる。したがって、化合物およびその生理学的に許容可能な塩および溶媒和物を、例えば、エアゾール、静脈内、経口、または局所経路による投与のために処方することができる。投与は、病変内、腹腔内、皮下、筋肉内、または静脈内への注射、注入、リポソーム媒介送達、局所、髄腔内、歯内嚢、直腸、気管支内、鼻腔内、経粘膜、腸内、経口、眼内、または耳内送達を含み得る。
本発明の例示的組成物は、任意選択的に許容可能な賦形剤を含むリポソーム系などの送達系と混合したＲＮＡｉを含む。好ましい実施形態では、注射のために組成物を処方する。
技術および処方を、一般に、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡで見出すことができる。全身投与のために、注射（筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下が含まれる）が好ましい。注射のために、本発明の化合物を、溶液、好ましくは、ハンクス液またはリンゲル液などの生理学的に適合する緩衝液中に処方することができる。さらに、化合物を固体形態で処方し、使用直前に再溶解するか再懸濁することができる。
経口投与のために、薬学的組成物は、例えば、結合剤（例えば、α化（ｐｒｅｇｅｌａｔｉｎｉｓｅｄ）トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に受容可能な賦形剤を使用した従来の手段によって調製された錠剤またはカプセルの形態を取ることができる。錠剤をコーティングすることができる。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態を取ることができるか、使用前に水または他の適切な賦形剤で構成するための乾燥生成物として提供することができる。このような液体調製物を、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性賦形剤（例えば、ａｔｉｏｎｄオイル、油性エステル、エチルアルコール、または分留植物油）、および防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、またはソルビン酸）などの薬学的に受容可能な添加剤を使用した従来の手段によって調製することができる。調製物はまた、必要に応じて、緩衝塩、香味物質、着色料、および甘味料を含み得る。
活性化合物を制御放出するための経口投与用調製物を適切に処方することができる。口腔投与のために、組成物は、従来の様式で処方した錠剤またはロゼンジの形態を取ることができる。吸入による投与のために、本発明の化合物を、適切な高圧ガス（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガス）を使用した圧縮パックまたはネブライザーからのエアゾールスプレーの形態で都合良く送達させる。圧縮エアゾールの場合、一定量を送達させるバルブを準備することによって投薬単位を決定することができる。例えば、吸入器または注入器で使用するための化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含むゼラチンのカプセルおよびカートリッジを処方することができる。
注射（例えば、ボーラス注射または持続注入）による非経口投与のための化合物を処方することができる。注射用処方物を、防腐剤を添加した単位投与形態（例えば、アンプルまたは複数回投与用コンテナ（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ））で示すことができる。組成物は、油性または水性賦形剤中の懸濁液、溶液、乳濁液などの形態を取ることができ、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの処方剤を含み得る。あるいは、有効成分は、使用前に適切な賦形剤（例えば、滅菌無発熱物質水）で構成するための粉末形態であり得る。
例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の座剤の基剤を含む座剤または保持浣腸剤などの直腸組成物に化合物を処方することもできる。
前記の処方物に加えて、デポー調製物として化合物を処方することもできる。このような長期作用処方物を、移植（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、化合物を、適切な高分子もしくは疎水性材料（例えば、許容可能なオイル中の乳濁液）、イオン交換樹脂、やや溶けにくい誘導体（例えば、やや溶けにくい塩）を使用して処方することができる。
経粘膜手段または経皮手段によって全身投与を行うこともできる。経粘膜投与または経皮投与のために、処方において透過すべきバリアに適切な浸透剤を使用する。このような浸透剤は当該分野で一般に公知であり、例えば、経粘膜投与のための胆汁塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。さらに、界面活性剤を使用して、透過を容易にすることができる。経粘膜投与を、鼻内噴霧または座剤によって行うことができる。局所投与のために、本発明のオリゴマーを、当該分野で一般的に公知の軟膏、蝋膏、ゲル、またはクリームに処方する。治癒を促進するために、洗浄液を局所的に使用して損傷または炎症を治療することができる。
組成物を、所望ならば、有効成分を含む１つまたは複数の単位投薬形態を含み得るパックまたは分注デバイス中に提供することができる。パックは、例えば、ブリスター包装などの金属ホイルまたはプラスチックホイルを含み得る。パックまたは分注デバイスに投与説明書を同封することができる。
核酸投与を含む治療のために、本発明のオリゴマーを、種々の投与様式（全身および局所もしくは局部投与が含まれる）のために処方することができる。技術および処方を、一般に、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出すことができる。全身投与のために、注射（筋肉内、静脈内、腹腔内、節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）、および皮下への注射が含まれる）が好ましく、本発明のオリゴマーを、溶液、好ましくは、ハンクス液またはリンゲル液などの生理学的に適合する緩衝液中に処方することができる。さらに、オリゴマーを固体形態に処方し、使用直前に再溶解または再懸濁することができる。凍結乾燥形態も含まれる。
経粘膜手段または経皮手段によって全身投与を行うこともできるか、化合物を経口投与することができる。経粘膜投与または経皮投与のために、処方において透過すべきバリアに適切な浸透剤を使用する。このような浸透剤は当該分野で一般に公知であり、例えば、経粘膜投与のための胆汁塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。さらに、界面活性剤を使用して、透過を容易にすることができる。経粘膜投与を、鼻内噴霧または座剤によって行うことができる。経口投与のために、オリゴマーを、カプセル、錠剤、およびトニックなどの従来の経口投与形態に処方する。局所投与のために、本発明のオリゴマーを、当該分野で一般的に公知の軟膏、蝋膏、ゲル、またはクリームに処方する。
本発明の薬剤および組成物の毒性および治療有効性を、例えば、ＬＤ５０（５０％の集団が死滅する用量）およびＥＤ５０（５０％の集団で治療的に有効な用量）の決定のための細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手段によって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として示すことができる。治療指数の高い化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物を使用することができるが、非感染細胞への潜在的損害を最小にし、それにより副作用を軽減するための罹患組織部位にこのような化合物をターゲティングする送達系をデザインするように注意すべきである。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトで使用するための投薬量範囲の処方で使用することができる。このような化合物の投薬量は、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内であり、ほとんど毒性がないか全く毒性がないことが好ましい。投薬量は、使用される投薬形態および使用される投与経路に依存して、この範囲内で変化し得る。本発明の方法で使用される任意の化合物について、細胞培養アッセイから治療有効用量を最初に評価することができる。細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにて用量を決定することができる。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィによって測定することができる。
本明細書中に記載の方法の１つの実施形態では、薬剤の有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ被験体体重と約５０ｍｇ／ｋｇ被験体体重との間である。１つの実施形態では、薬剤の有効量は、約２ｍｇ／ｋｇ被験体体重と約４０ｍｇ／ｋｇ被験体体重との間である。１つの実施形態では、薬剤の有効量は、約３ｍｇ／ｋｇ被験体体重と約３０ｍｇ／ｋｇ被験体体重との間である。１つの実施形態では、薬剤の有効量は、約４ｍｇ／ｋｇ被験体体重と約２０ｍｇ／ｋｇ被験体体重との間である。１つの実施形態では、薬剤の有効量は、約５ｍｇ／ｋｇ被験体体重と約１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重との間である。
本明細書中に記載の方法の１つの実施形態では、薬剤を１日に少なくとも１回投与する。１つの実施形態では、薬剤を毎日投与する。１つの実施形態では、薬剤を１日おきに投与する。１つの実施形態では、薬剤を６〜８日毎に投与する。１つの実施形態では、薬剤を毎週投与する。
化合物および／または薬剤の被験体への投与量に関して、当業者は、適量の決定方法を理解している。本明細書中で使用される、「用量」または「量」は、障害を抑制するか、障害を治療するか、被験体を治療するか、被験体が障害を罹患するのを防止するのに十分な量であろう。この量を有効量とみなすことができる。当業者は、被験体治療のための必要量を決定するために簡潔な適定実験を行うことができる。本発明の組成物の用量は、被験体および使用される特定の投与経路に依存して変化する。１つの実施形態では、投薬量は、約０．１μｇ／ｋｇ被験体体重〜約１００，０００μｇ／ｋｇ被験体体重の範囲であり得る。組成物に基づいて、連続ポンプなどによって連続的に送達させるか定期的に送達させることができる。例えば、１つまたは複数の個別の事象で送達させることができる。当業者は、過度に実験することなく特定の複数回投与の所望の間隔を決定することができる。
有効量は、特に、化合物のサイズ、化合物の生分解性、化合物の生体活性、および化合物の生物学的利用能に基づき得る。化合物が迅速に分解されない場合、生物的に利用できる場合、および活性が高い場合、少量で有効である。有効量は当業者に公知であり、化合物の形態、化合物のサイズ、および化合物の生体活性にも依存する。当業者は、バイオアッセイにおいて生体活性を決定し、それにより、有効量を決定するために、化合物に対して経験的活性試験を日常的に行うことができる。上記方法の１つの実施形態では、化合物の有効量は、約１．０ｎｇ／ｋｇ被験体体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ被験体体重である。
上記方法の別の実施形態では、化合物の有効量は、約１００ｎｇ／ｋｇ被験体体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ被験体体重である。上記方法の別の実施形態では、化合物の有効量は、約１μｇ／ｋｇ被験体体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重である。上記方法の別の実施形態では、化合物の有効量は、約１００μｇ／ｋｇ被験体体重〜約１ｍｇ／ｋｇ被験体体重である。
化合物、組成物、および／または薬剤の投与時期に関して、当業者は、このような化合物および／または薬剤をいつ投与するのかを決定することができる。投与は、一定期間連続的であるか、周期的および特定の期間投与することができる。化合物を、１時間毎、毎日、毎週、毎月、毎年（例えば、徐放形態）送達させるか、一度に送達させることができる。送達は、一定期間の連続的送達（例えば、静脈内送達）であり得る。本明細書中に記載の方法の１つの実施形態では、薬剤を、１日に少なくとも１回投与する。本明細書中に記載の方法の１つの実施形態では、薬剤を、毎日投与する。本明細書中に記載の方法の１つの実施形態では、薬剤を、１日おきに投与する。本明細書中に記載の方法の１つの実施形態では、薬剤を、６〜８日毎に投与する。本明細書中に記載の方法の１つの実施形態では、薬剤を、毎週投与する。
本発明の別の態様は、（ｉ）ｔｉｍ−３のＩｇＶドメインを含むポリペプチドと、（ｉｉ）腎細胞癌、カポジ肉腫、慢性白血病、前立腺癌、乳癌、肉腫、膵臓癌、白血病、卵巣癌、直腸癌、咽頭癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、リンパ腫、肥満細胞腫、肺癌、乳腺癌、咽頭扁平上皮細胞癌、精巣癌、消化管癌、および胃癌からなる群から選択される増殖性状態に罹患した被験体への組成物の投与についての説明書とを含む薬学的パッケージを提供する。
（（９）免疫応答の制御方法）
本発明の１つの態様は、免疫応答の調整方法（Ｔｈ１またはＴｈ２応答、免疫寛容、および移植免疫寛容の調整方法などであるが、これらに限定されない）を提供する。本明細書中で使用される、用語「調整」は、増加または減少をいう。本出願の免疫応答の制御方法は、可溶性ｔｉｍ−３を含む融合タンパク質を使用したｔｉｍ−３リガンドの判定により、Ｔｈ１応答が増強され、末梢性寛容の確立が取り消され、移植免疫寛容が減少するという発見に一部基づく。それに反して、ｔｉｍ−３リガンドとして出願人によって発見された哺乳動物へのガレクチン−９の投与により、Ｔｈ１応答が減少する。
本発明の別の態様は、治療有効量のｔｉｍ−３、ガレクチン−９、またはその両方の発現または活性を減少させる薬剤（すなわち、ｔｉｍ−３またはガレクチン−９のアゴニスト）またはガレクチン−９へのｔｉｍ−３の結合を増加させる薬剤を被験体に投与する工程を含む、必要とする被験体の免疫寛容を減少させ、Ｔｈ１媒介免疫応答を減少させ、そして／またはＴｈ２媒介免疫応答を減少させる方法を提供する。
ｔｉｍ−３活性の減少による免疫応答の減少およびＴｈ１媒介応答の増加は、癌免疫療法で有利である。免疫系は、腫瘍抗原を寛容し得るので、腫瘍が免疫監視を回避することができる。本発明の１つの態様では、ｔｉｍ−３活性を減少させる薬剤を、増殖性状態を罹患した被験体に投与する。
用語「癌」および「腫瘍」は交換可能に使用され、両用語は増殖性状態をいう。１つの実施形態では、癌は、カポジ肉腫、慢性白血病、前立腺癌、乳癌、肉腫、膵臓癌、白血病、卵巣癌、直腸癌、咽頭癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、リンパ腫、肥満細胞腫、肺癌、乳腺癌、咽頭扁平上皮細胞癌、および消化管癌または胃癌からなる群から選択される。別の実施形態では、癌は、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨の癌；脳腫瘍およびＣＮＳ癌；乳癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸直腸癌；結合組織癌；消化器管癌；子宮内膜癌；食道癌；眼球の癌；頭頸部癌；胃癌；上皮内新生物；腎臓癌；喉頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）；リンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫が含まれる）；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（例えば、唇、舌、口、および咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；気管支癌；肉腫；皮膚癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮癌；泌尿器系の癌、並びに他の癌腫および肉腫からなる群から選択される。
別の実施形態では、ｔｉｍ−３活性の阻害によってＴｈ１活性化を増加させるために使用される薬剤を使用して、被験体のワクチンに対する免疫応答を増強する。１つの特定の実施形態では、ワクチンに対する免疫応答を増強するために、ｔｉｍ−３活性を阻害する薬剤（ｔｉｍ−３ ＩｇＶドメインを含むポリペプチドまたは全長ｔｉｍ−３とｔｉｍ−３リガンドとの間の複合体形成を阻害する抗体など）をワクチンと共に投与する。ワクチンには、ウイルス感染または細菌感染の防止を意図するワクチンが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、ワクチン接種前に薬剤を投与し、他の実施形態では、ワクチンを被験体に投与した後に薬剤を投与する。
さらに別の態様では、本発明は、ｔｉｍ−３、ガレクチン−９、またはその両方の発現または活性を減少させる薬剤（すなわち、ｔｉｍ−３アンタゴニストまたはガレクチン−９アンタゴニストの投与）またはｔｉｍ−３へのガレクチン−９の結合を減少させる薬剤を被験体に投与する工程を含む、必要とする被験体のＴｈ２関連応答（例えば、アレルギー反応または喘息反応）を減少させるか、阻害するか、抑制するか、改善するか、遅延させる方法を特徴とする。
本明細書中で使用される、「Ｔｈ２媒介障害」は、Ｔｈ２免疫応答の発生に関連する疾患をいう。本明細書中で使用される、「Ｔｈ２免疫応答」は、少なくとも１つのＴｈ２−サイトカインまたはＴｈ２−抗体の誘導をいう。好ましい実施形態では、１つを超えるＴｈ２−サイトカインまたはＴｈ２−抗体が誘導される。したがって、Ｔｈ２媒介疾患は、Ｔｈ２応答の誘導に関連する疾患であり、少なくとも１つのＴｈ２−サイトカインもしくはＴｈ２−抗体の部分的もしくは完全な誘導または少なくとも１つのＴｈ２−サイトカインもしくはＴｈ２−抗体レベルの増加をいう。これらの障害は当該分野で公知であり、例えば、喘息およびアレルギー（アレルギー性鼻炎、消化管アレルギー（食物アレルギーが含まれる）が含まれる）などのアトピー性病態、好酸球増加症、結膜炎、糸球体腎炎、一定の病原体感受性（蠕虫感染症（例えば、リーシュマニア症）など）および一定のウイルス感染症（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が含まれる）、一定の細菌感染症（結核および結節性らいが含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、Ｔｈ２関連応答は、喘息またはアレルギーである。
本明細書中で定義される、「喘息」は、長期間にわたる個体の可逆的気流の制限である。喘息は、気道壁中の好酸球、肥満細胞、好塩基球、およびＣＤ２５＋Ｔリンパ球などの細胞の存在によって特徴づけられる。種々の伝達および生物学的エフェクター特性を有するサイトカイン活性のために、これらの細胞は密接に相互作用する。ケモカインは、細胞を炎症部位に誘引し、サイトカインはケモカインを活性化し、粘膜の炎症および損傷が起こる。この過程の慢性化により、基底膜の肥厚および線維形成などの二次的変化が起こる。この疾患は、種々の刺激に対する気道の過剰な反応性の増加および気道炎症によって特徴づけられる。喘息と診断された患者は、一般に、長期間複数の徴候（喘鳴、喘息性発作、およびメタコリン攻撃誘発に対する陽性反応（すなわち、約４ｍｇ／ｍｌ未満のメタコリン攻撃誘発に対するＰＣ２０）が含まれる）を示す。診断ガイドラインは、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｓｔｈｍａ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｅｘｐｅｒｔ Ｐａｎｅｌ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ａｓｔｈｍａ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，１９９１，Ｐｕｂ．Ｎｏ．９１−３０４２に見出すことができる。
本明細書中で使用される、用語「アレルギー」は、物質（アレルゲン）に対して獲得された過敏症いう。アレルギー性病態には、湿疹、アレルギー性鼻炎または鼻感冒、枯草熱、気管支喘息、皮膚の掻痒（蕁麻疹）、および食物アレルギー、ならびに他のアトピー性病態が含まれる。「アレルギーを有する被験体」は、アレルゲンに反応してアレルギー反応を示すか示すリスクのある被験体である。「アレルゲン」は、疑いのある被験体にアレルギー反応または喘息反応を誘導することができる物質をいう。アレルゲンのリストは多数存在し、花粉、昆虫毒、動物の鱗屑、埃、真菌の胞子、および薬物（例えば、ペニシリン）が含まれ得る。
目的のアレルゲンには、苺、ピーナッツ、乳タンパク質、卵白などの食品中に見出される抗原が含まれる。目的の他のアレルゲンには、花粉、動物の鱗屑、家ダニのフンなどの種々の大気中アレルゲンが含まれる。分子クローニングされたアレルゲンには、ヤケヒョウダニ（Ｄｅｒ Ｐ１）；ホソムギ花粉由来のＬｏｌ ｐｌ−Ｖ；多数の昆虫毒（キバハリアリおよびミルメシア・ピロスラ由来の毒；セイヨウミツバチのハチ毒ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）および抗原５Ｓ；ススメバチであるベスプラ・マクリフロンスおよびホワイトフェースドホーネット（ｗｈｉｔｅ ｆａｃｅｄ ｈｏｒｎｅｔ）であるドリコベスプラ・マクラタが含まれる）；多数の花粉タンパク質（カバノキ花粉、ブタクサ花粉、パロール（Ｐａｒｏｌ）（ヒカゲミズの主なアレルゲン）、および交差反応アレルゲンＰａｒｊ１（パリエタリア・ジュダイカ由来）が含まれる）、および他の大気花粉（オリーブ、アルテミシア属、イネ科など）が含まれる。目的の他のアレルゲンは、吸血節足動物（例えば、双翅目（蚊（ハマダラカ属、ヤブカ属、ハボシカ属、イエカ属）；ハエ（サシチョウバエ属、ヌカカ属）（特に、ブヨ、メクラアブ、およびヌカカ）が含まれる）；ダニ（カクマダニ属、カズキダニ属、オトビウス属）；ノミ（例えば、ノミ目）（ネズミノミ属、ヒトノミ属、およびネコノミが含まれる）に起因するアレルギー性皮膚炎を担うアレルゲンである。特定のアレルゲンは、多糖類、脂肪酸部分、タンパク質であり得る。
本発明の１つの特定の態様は、治療有効量のポリペプチドを被験体に投与する工程と、前記ポリペプチドが、（ｉ）配列番号１０、（ｉｉ）配列番号１８、（ｉｉｉ）配列番号１０と少なくとも９０％同一であるか類似するアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号１８と少なくとも９０％同一であるか類似するアミノ酸配列を含むこととを含む、被験体のアトピー性疾患を予防するか罹患する可能性を減少させる方法を提供する。
本発明によれば、ｔｉｍ−３またはガレクチン−９活性を調整するか、ｔｉｍ−３とガレクチン−９との間の複合体形成を調整する薬剤を、免疫応答の調整または障害または病態の治療のための他の組成物および手順と組み合わせて使用することができる。例えば、腫瘍を、手術、照射、または化学療法を使用して従来のように治療することができる。その後、微小転移の休止を延長して任意の残存する原発性腫瘍を安定化するために、可溶性ｔｉｍ−３−ＩｇＦｃ融合タンパク質などのｔｉｍ−３活性を減少させる薬剤を被験体に投与することができる。
いくつかの実施形態では、ｔｉｍ−３活性を減少させる薬剤は、全長ｔｉｍ−３の発現と比較して可溶性ｔｉｍ−３の発現を優先的に阻害する。いくつかの実施形態では、ガレクチン−９へのｔｉｍ−３の結合を遮断する薬剤は、抗体またはその抗原に対する高い結合親和性を保持した抗体フラグメントなどの抗体フラグメントである。このような抗体は、ガレクチン−９またはｔｉｍ−３のいずれか、特にｔｉｍ−３の細胞外ドメインへの結合によってｔｉｍ−３／ガレクチン−９結合を遮断することができる。特定の実施形態では、薬剤は、配列番号１３のアミノ酸３０〜１２８を含むポリペプチドに結合する抗体または抗体フラグメントである。
当業者は、ｔｉｍ−３細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を生成することができ、この抗体を、本発明によって提供された方法を使用して、全長ｔｉｍ−３へのｔｉｍ−３リガンド（ガレクチン−９など）の結合を遮断する能力についてさらに試験することができる。好ましい抗体は、抗体自体が全長ｔｉｍ−３活性のアクチベーターとして作用せずに全長ｔｉｍ−３とそのリガンドとの間の結合相互作用を遮断するであろう。実験手順に記載のアッセイを使用して、当業者は、免疫化マウスへの抗体の投与およびマウスの脾臓から単離したＴｈ１細胞によるインビトロ増殖およびサイトカイン産生についての試験などによって候補抗体がｔｉｍ−３活性のアクチベーターであるかどうかを決定することができる。免疫寛容を減少させるための好ましい抗体は、ｔｉｍ−３へのｔｉｍ−３リガンドの結合を遮断するが、ｔｉｍ−３の活性化を誘導しない（すなわち、Ｔｈ１細胞増殖およびサイトカイン放出を抑制しない）であろう。
１つの実施形態では、ｔｉｍ−３機能を阻害するために使用される薬剤は、抗体を含む。１つの実施形態では、抗体は、ｔｉｍ−３のＩｇＶドメイン（配列番号１３のアミノ酸３０〜１２８）に結合して全長ｔｉｍ−３へのｔｉｍ−３リガンドの結合を遮断する。１つの実施形態では、ｔｉｍ−３リガンドはガレクチン−９である。したがって、別の実施形態では、抗体はガレクチン−９に結合する。結合時、抗体は、ガレクチン−９と全長ｔｉｍ−３との間の物理的相互作用を防止することができる。
別の実施形態では、被験体におけるガレクチン−９への全長ｔｉｍ−３の結合を遮断する薬剤は、内因性ｔｉｍ−３とガレクチン−９への結合を競合する組換えｔｉｍ−３ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、薬剤は、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸３０〜１２８または（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸３０〜１２８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、ポリペプチド薬は、ペグ化され、そして／またはヒト血清アルブミンまたは免疫グロブリンのＦｃドメインとの融合タンパク質である。別の実施形態では、被験体においてＴｈ１細胞を活性化するか免疫寛容を減少させる方法で使用される薬剤は、配列番号２のアミノ酸配列を有する可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、薬剤は、ｔｉｍ−３のＩｇＶドメイン（配列番号１１のアミノ酸３０〜１２８）を含む。さらに別の実施形態では、可溶性ｔｉｍ−３ポリペプチドは、ｔｉｍ−３のＩｇＶドメイン、任意選択的にｔｉｍ−３の細胞内ドメイン、および免疫グロブリンのＦｃドメインを含むが、ｔｉｍ−３のムチンドメインやｔｉｍ−３の膜貫通ドメインを含まない。好ましい実施形態では、これらのポリペプチドはガレクチン−９に結合する。これらのポリペプチドの変異型（ｔｉｍ−３リガンドの結合を増加させる変異型など）を使用することもできる。
いくつかの実施形態では、ｔｉｍ−３活性を減少させる薬剤は、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸３０〜１２８を含むポリペプチドの（ｉｉ）ガレクチン−９（ガレクチン−９の長鎖形態または単鎖形態など）への結合を阻害する。
出願人は、ラクトースがｔｉｍ−３へのガレクチン−９の結合を阻害することを発見した。したがって、１つの実施形態では、ガレクチン−９への全長ｔｉｍ−３の結合を阻害する薬剤は、ラクトースまたはペクチン／修飾ペクチンなどの炭水化物を含む。修飾ペクチンは、米国特許公開公報２００３／０００４１３２号および同第２００２／０１８７９５９号に記載されている。
別の実施形態では、Ｔｈ１応答を促進し、そして／またはＴｈ２応答を阻害するように活性化するための本明細書中に記載の方法で使用される薬剤は、全長ｔｉｍ−３ポリペプチドまたはガレクチン−９などのｔｉｍ−３リガンドの発現レベルを減少させる。１つの実施形態では、薬剤は、本発明によって提供された二本鎖ＲＮＡ種であり、全長ｔｉｍ−３またはｔｉｍ−３リガンド（ガレクチン−９など）を指示するものが含まれる。
好ましい実施形態では、Ｔｈ１応答を促進し、そして／またはＴｈ２応答を阻害するように活性化するための本明細書中に記載の方法で使用される薬剤またはｔｉｍ−３機能を阻害するために使用される薬剤は、例えば、分子量が約２，０００ダルトン未満であり、ｔｉｍ−３のガレクチン−９などのそのリガンドへの結合を遮断するペプチドまたはオリゴヌクレオチド以外の有機小分子である。このような薬剤を、例えば、本発明によって提供された方法を使用して同定することができる。別の実施形態では、ｔｉｍ−３機能を阻害する薬剤は、ｔｉｍ−３に結合するガレクチン−９の一部の構造を模倣したペプチドまたはペプチド誘導体である。このようなペプチドは、ｔｉｍ−３とそのリガンドとの間の機能的相互作用の防止によって拮抗競合物として作用することができる。１つの実施形態では、リガンドはガレクチン−９である。
本発明によれば、その発現レベルの減少またはｔｉｍ−３／リガンド複合体の形成の減少などによってｔｉｍ−３活性を減少させる薬剤を、増殖性状態の治療のための他の組成物および手順と組み合わせて使用することができる。例えば、腫瘍を、手術、照射、または化学療法を使用して従来のように治療することができ、その後、微小転移の休止を延長して任意の残存する原発性腫瘍を安定化するために、ｔｉｍ−３またはガレクチン−９などのｔｉｍ−３リガンドに対する二本鎖ＲＮＡ、抗体、または小分子インヒビターを投与することができる。
本発明の別の態様は、ｔｉｍ−３、ガレクチン−９、またはその両方の発現または活性を増加させるか、ガレクチン−９へのｔｉｍ−３の結合を増加させる有効量の薬剤を被験体に投与する工程を含む、このような治療を必要とする被験体におけるＴｈ１媒介障害を治療または予防するか、罹患する可能性を減少させる方法を提供する。
本発明はまた、被験体のＴｈ１媒介免疫応答を減少させるか、阻害するか、抑制するか、改善するか、遅延させるのに十分な量でｔｉｍ−３またはガレクチン−９アゴニスト（本明細書中に記載のｔｉｍ−３またはガレクチン−９アゴニスト）を被験体に投与する工程を含む、必要とする被験体のＴｈ１関連応答を減少させるか、阻害するか、抑制するか、改善するか、遅延させる方法を特徴とする。
Ｔｈ２媒介障害と対照的に、本明細書中で使用される、「Ｔｈ１媒介障害」は、Ｔｈ１免疫応答の発生に関連する疾患をいう。本明細書中で使用される、「Ｔｈ１免疫応答」は、少なくとも１つのＴｈ１−サイトカインまたはＴｈ１の誘導をいう。好ましい実施形態では、Ｔｈ１サイトカインまたはＴｈ１−抗体を誘導する。したがって、Ｔｈ１媒介疾患は、Ｔｈ１応答の誘導に関連する疾患であり、少なくとも１つのＴｈ１−サイトカインまたはＴｈ１−抗体の部分的もしくは完全な誘導または少なくとも１つのＴｈ１−サイトカインまたはＴｈ１−抗体レベルの増加をいう。これらの障害は当該分野で公知であり、例えば、自己免疫（特に、臓器特異的）疾患、乾癬、Ｔｈ１炎症障害、細胞外寄生虫感染症（例えば、蠕虫に対する応答）、固形臓器同種移植片拒絶（例えば、急性腎臓同種移植片拒絶）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）感染に関する症状（例えば、ＨＢＶ急性期または回復期）、慢性Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）感染、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、多発性硬化症（ＭＳ）、亜急性リンパ球性甲状腺炎（「無痛性甲状腺炎」）、クローン病、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、急性移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、糸球体腎炎、抗糸球体基底膜病、ウェゲナー病、炎症性筋障害、シェーグレン症候群、ベーゲット症候群、関節リウマチ、ライム関節炎、および原因不明の再発性流産が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Ｔｈ１関連障害は、アテローム性動脈硬化症、細胞外寄生虫感染症、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）感染に関する症状（例えば、ＨＢＶ急性期または回復期）、慢性Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）感染、無痛性甲状腺炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、糸球体腎炎、抗糸球体基底膜病、ウェゲナー病、炎症性筋障害、シェーグレン症候群、ベーゲット症候群、関節リウマチ、および原因不明の再発性流産からなる群から選択される。
本明細書中に記載のＴｈ１媒介免疫応答を減少させる方法は、被験体の自己免疫疾患を治療するのに特に有利であり得る。１つの実施形態では、本発明の被験体のＴｈ１応答を減少させる方法は、自己免疫疾患を罹患しているか発症リスクが高い被験体に適用する。「自己免疫疾患」は、被験体自身の抗体が宿主組織と反応するか免疫エフェクターＴ細胞が内因性自己ペプチドと自己反応して組織を破壊する疾患クラスである。したがって、自己抗原と呼ばれる被験体自身の抗原に対して免疫応答が開始される。
本明細書中で使用される、「自己抗原」は、正常な宿主組織の抗原をいう。正常な宿主組織は、癌細胞を含まない。したがって、自己免疫疾患という状況において、自己抗原に対して開始された免疫応答は望ましくない免疫応答であり、正常組織の破壊および損傷に寄与するのに対して、癌抗原に対して開始される免疫応答は望ましい免疫応答であり、腫瘍または癌の破壊に寄与する。
自己免疫疾患には、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症（ＭＧ）、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡）、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症、混合性結合組織病、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎（例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性、および自己免疫性真性糖尿病（１型真性糖尿病；インスリン依存性真性糖尿病）が含まれるが、これらに限定されない。最近、自己免疫疾患は、アテローム性動脈硬化症およびアルツハイマー病も含むと認識されている。１つの特定の実施形態では、自己免疫疾患は、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、橋本甲状腺炎、クローン病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、胃炎、自己免疫性肝炎、溶血性貧血、自己免疫性血友病、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性ブドウ膜網膜塩、糸球体腎炎、ギヤン−バレー症候群、乾癬、および重症筋無力症からなる群から選択される。別の実施形態では、Ｔｈ１媒介障害は、移植片対宿主病（ＨＶＧＤ）である。関連する実施形態では、被験体は、臓器または組織移植レシピエントである。
本発明のさらに別の態様は、ｔｉｍ−３もしくはガレクチン−９の機能、発現、またはガレクチン−９へのｔｉｍ−３の結合を増加させる治療有効量の薬剤を被験体に投与する工程を含む、被験体の移植免疫寛容を増加させる方法を提供する。１つの特定の実施形態では、被験体は、同種移植片のレシピエントである。移植片は、任意の臓器または組織移植片（心臓、腎臓、肝臓、皮膚、膵臓、骨髄、皮膚、または軟骨が含まれるが、これらに限定されない）であり得る。本明細書中で使用される、「移植免疫寛容」は、レシピエントの免疫系によるドナー臓器拒絶の欠如をいう。さらに、組織または細胞移植片を拒絶する可能性を抑制または減少するための薬剤を使用することができる。
本明細書中で使用される、用語「薬剤」および「化合物」には、タンパク質および非タンパク質部分の両方が含まれる。薬剤は、合成されたか、組換え技術によって作製されたか、天然供給源から単離した任意の化学物質（元素、分子、化合物、薬物）であり得る。例えば、薬剤は、ペプチド、ポリペプチド、抗体もしくは抗体フラグメント、ペプトイド、糖類、ホルモン、または核酸分子（アンチセンスまたはＲＮＡｉ核酸分子など）であり得る。さらに、薬剤は、コンビナトリアルケミストリーによって作製され、例えば、ライブラリーに集められる小分子またはより複雑な分子であり得る。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、アルキルハライド、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテル、および有機溶媒の他のクラスを含み得る。薬剤はまた、細胞（細菌、動物、または植物）の溶解物または成長培地から単離した天然産物または遺伝子操作された産物であり得る。
１つの実施形態では、ｔｉｍ−３活性を増加させる薬剤（Ｔｈ２応答の促進および／またはＴｈ１応答の阻害に使用される薬剤など）は、全長ｔｉｍ−３のリガンドへの結合を促進する。好ましい実施形態では、ｔｉｍ−３リガンドはガレクチン−９である。薬剤は、それ自体がｔｉｍ−３に結合するか、それ自体がガレクチン−９などのｔｉｍ−３リガンドに結合することができ、ｔｉｍ−３とリガンドとの間の結合相互作用を増加させるポリペプチドであり得る。
本明細書中に記載の方法の１つの実施形態では、ｔｉｍ−３活性を増加させる薬剤はｔｉｍ−３リガンドである。このようなリガンドの例はガレクチン−９である。したがって、いくつかの実施形態では、薬剤はガレクチン−９ポリペプチドを含む。別の実施形態では、薬剤は、ガレクチン−９の２つの炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）の少なくとも１つ（すなわち、少なくともＮ末端、Ｃ末端、またはその両方）を含むポリペプチドを含む。
別の実施形態では、ｔｉｍ−３活性を増加させる薬剤は、配列番号１０または配列番号１８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドを含む。別の実施形態では、配列は、配列番号１０または配列番号１８に記載のアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ヒトガレクチン−９の少なくとも１つのＣＲＤのアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である。
別の実施形態では、ｔｉｍ−３活性を増加させる薬剤は、ｔｉｍ−３受容体の活性化においてガレクチン−９として機能することができるペプチド模倣物または小分子である。ペプチドまたは小分子はｔｉｍ−３に結合するガレクチン−９の表面と構造が類似し得るので、ペプチドまたは小分子は結合時にｔｉｍ−３を活性化してｔｉｍ−３の活性化およびＴｈ１細胞の活性化を増加させることができる（細胞増殖およびサイトカインの分泌の増加が含まれる）。特定の実施形態では、ｔｉｍ−３活性を増加させる薬剤は、ｔｉｍ−３の細胞内ドメインのチロシンリン酸化を促進する。
別の実施形態では、本明細書中に記載の方法においてｔｉｍ−３活性を増加させる薬剤は、抗体またはそのフラグメントである。ｔｉｍ−３に結合してリガンド結合を模倣し、それにより細胞内シグナル伝達が行われる抗体を生成することができる。ｔｉｍ−３の細胞外ドメインに結合する抗体の生成の際、当業者は、抗体がｔｉｍ−３を活性化してＴｈ１細胞増殖を抑制し、サイトカイン放出を減少させ、寛容を増加させるかどうかを試験することができる。実験手順に記載の方法を使用して、抗体結合により全長ｔｉｍ−３が活性化されるかどうかを決定することができる。特定の実施形態では、ｔｉｍ−３活性を増加させる抗体は、ｔｉｍ−３およびガレクチン−９に特異的な二重特異性抗体である。
さらに別の実施形態では、ｔｉｍ−３活性を増加させる薬剤は、可溶性ｔｉｍ−３の発現または機能を減少させるが、全長ｔｉｍ−３の発現または機能には直接影響を与えない。１つの実施形態では、薬剤は、可溶性ｔｉｍ−３の発現を特異的に阻害する二本鎖ＲＮＡ種（配列番号１５のヌクレオチド配列を含むものなど）である。このような二本鎖ＲＮＡを、二本鎖ヘアピンＲＮＡとして投与することができる。別の実施形態では、ｔｉｍ−３活性を増加させる薬剤は、可溶性ｔｉｍ−３に特異的に結合するが全長ｔｉｍ−３に結合しない抗体（本発明によって提供される抗体など）である。
（配列表の説明）
配列番号１は、ヒト可溶性ｔｉｍ−３イソ型のコード配列である。
配列番号２は、ヒト可溶性ｔｉｍ−３タンパク質である。
配列番号３は、マウス可溶性ｔｉｍ−３イソ型のコード配列である。
配列番号４は、マウス可溶性ｔｉｍ−３タンパク質である。
配列番号５は、ヒト可溶性ｔｉｍ−３ｃＤＮＡの新規のスプライス部位と同一の１６ヌクレオチドのＤＮＡフラグメントである。
配列番号６は、ヒト可溶性ｔｉｍ−３タンパク質の新規のＩｇＶドメイン／細胞内ドメイン連結部と同一の１６アミノ酸のペプチドである。
配列番号７は、マウス可溶性ｔｉｍ−３ ｃＤＮＡの新規のスプライス部位と同一の１６ｂｐのＤＮＡフラグメントである。
配列番号８は、マウス可溶性ｔｉｍ−３タンパク質の新規のＩｇＶドメイン／細胞内ドメイン連結部と同一の１６アミノ酸のペプチドである。
配列番号９は、ヒトガレクチン−９のコード配列（単鎖形態）である。
配列番号１０は、ヒトガレクチン−９のアミノ酸配列（単鎖形態）である。
配列番号１１は、全長ヒトｔｉｍ−３のコード配列である。
配列番号１２は、全長マウスｔｉｍ−３のコード配列である。
配列番号１３は、全長ヒトｔｉｍ−３のアミノ酸配列である。
配列番号１４は、全長マウスｔｉｍ−３のアミノ酸配列である。
配列番号１５は、ヒト可溶性ｔｉｍ−３の新規のスプライス部位に対応する１６ヌクレオチドのＲＮＡ配列である。
配列番号１６は、マウスガレクチン−９のコード配列である。
配列番号１７は、マウスガレクチン−９のアミノ酸配列である。
配列番号１８は、マウスガレクチン−９のアミノ酸配列（長鎖形態）である（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３４８３８も参照のこと）。
配列番号１９は、ヒトガレクチン−９のアミノ酸配列（長鎖形態）である（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３３６６５も参照のこと）。
本発明を一般的に記載し、以下の実施例を参照することによって本発明はより深く理解される。実施例は本発明の一定の態様および実施形態の例示のみを目的として含まれ、本発明を制限することを意図しない。
実施例は、２つの部に分けられ、それぞれ実施例で使用した方法の説明のみを含む。
（第１実験）
（Ａ．方法）
（ｓ−Ｔｉｍ−３のクローニング）
脾細胞を、１μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で活性化した。活性化の４８時間後、細胞を回収し、製造者の説明書に従って、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、ＲＮＡを逆転写した。ｆｌ−Ｔｉｍ−３およびｓ−Ｔｉｍ−３の両方の増幅のために、ＳｍａＩ制限オーバーハングを有するＴｉｍ−３プライマーを、Ｔｉｍ−３遺伝子の５’（ＴＩＭ−３−Ｆ：５’ＧＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＴＡＡＡＧＣＴＡＴＣＣＣＴＡＣＡＣＡ３’）および３’（ＴＩＭ３−Ｒ：５’ＧＣＣＣＧＧＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＴＴＧＣＣＡＡＧＴＧＡＣＡＴＡ３’）ＵＴＲ中にデザインした。ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）にて、９５℃で１分間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で９０秒間の伸長を１サイクルとして３５サイクルの反応を行った。反応を、７２℃で１０分間の最後の伸長で完了した。全産物を、１．２％アガロースゲルで分離し、臭化エチジウムで視覚化した。
（Ｔ細胞の分子およびＴｉｍ−３−リガンド染色）
全脾細胞およびリンパ節細胞を、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から採取し、ＣＤ４＋Ｔ細胞をカラムで精製した（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４４、およびＣＤ５４に対するｍＡｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色した。細胞をビオチン化ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ、ｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ、またはｈＩｇＧで染色し、ストレプトアビジン−ＰＥを、フローサイトメトリーでの検出のための二次検出試薬として使用した。
ＡＥ７（ハトシトクロムｃ特異的Ｉ−Ｅｋ制限Ｔｈ１クローン３４，４５）およびＬＲ１Ｆ１（ＰＬＰ １３９〜１５１が変化したペプチドＱ１４４（ＨＳＬＧＫＱＬＧＨＰＤＫＦ）特異的Ｉ−Ａｓ制限Ｔｈ２クローン３６）を、０．１Ｍ非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＭＥＭ必須ビタミン混合物（１×）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、アスパラギン（０．１ｍＭ）、葉酸（０．１ｍｇ／ｍｌ）、および２−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．６％Ｔ細胞成長因子（Ｔ−Ｓｔｉｍ，Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、および０．０６％組換えＩＬ−２を補足したＤＭＥＭ中に維持した。細胞を、６、３４に記載のように静止／刺激プロトコール（刺激培地は、Ｔ−Ｓｔｉｍおよびｒ−ＩＬ−２を含まない完全培地である）で維持し、ｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ結合について染色した。
（増殖アッセイ）
雌ＳＪＬ／Ｊマウス（６〜１２週齢）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）の各側腹部に、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）（Ｄｉｆｃｏ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）で乳化した５０μｇのＰＬＰ １３９〜１５１ペプチド（ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ）（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。マウスに、１００μｇ ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇもしくはｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇまたは１００μｇ コントロールｈＩｇＧもしくは１００μｌ ＰＢＳのいずれかを１日おきに腹腔内注射した（免疫化日から開始し（０日目）、８日目まで係属する）。１０日目にマウスを屠殺し、脾臓を取り出した。５×１０５細胞／ウェルの細胞を丸底９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）にプレートし、０〜１００μｇ／ｍｌ ＰＬＰ １３９〜１５１を４８時間添加し、プレートに１μＣｉ３［Ｈ］−チミジン／ウェルで１６〜１８時間パルスした。組み込まれた放射性標識チミジンを、Ｂｅｔａ Ｐｌａｔｅシンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｗａｌｌａｃ Ｉｎｃ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）を使用して測定した。データを、三連のウェルの平均ｃｐｍとして示す。
細胞分離実験のために、ＣＤ１１ｂ＋細胞およびＢ２２０＋細胞を、ＭＡＣＳ Ｓｏｒｔ磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）によるポジティブ選択によって精製し、ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＣＤ１１ｂ＋細胞およびＢ２２０＋細胞の枯渇後にネガティブ選択カラム（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって精製した。１０５細胞／ウェルのＣＤ３＋Ｔ細胞をプレートし、２×１０５細胞／ウェルのＣＤ１１ｂ＋細胞およびＢ２２０＋細胞をプレートした。
寛容誘導実験のために、ＳＪＬマウスを、５０μｇ ＰＬＰ １３９〜１５１／ＣＦＡを使用してｓ．ｃ．で免疫化すると同時に、寛容を誘導するために５００μｇの可溶性ＰＬＰ １３９〜１５１を腹腔内注射した。５×１０５細胞／ウェルの脾細胞および２×１０５細胞／ウェルのリンパ節細胞をプレートした。
（サイトカインＥＬＩＳＡ）
定量的捕捉ＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αについてサイトカイン産生を測定した。簡単に述べれば、マウスＩＬ−２（クローンＪＥＳ−１Ａ１２）、ＩＬ−４（クローンＢＶＤ４−１Ｄ１１）、ＩＬ−１０（クローンＪＥＳ５−２Ａ５）、ＩＦＮ−γ（クローンＲ４−６Ａ２）、およびＴＮＦ−α（クローンＧ２８１−２６２６）に対する精製ラットｍＡｂを、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手し、これを使用してＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ４，Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）をコーティングした。Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎの組換えマウスサイトカインを使用して、検量線を構築し、マウスＩＬ−２（クローンＪＥＳ６−５Ｈ４）、ＩＬ−４（クローンＢＶＤ６−２４Ｇ２）、ＩＬ−１０（クローンＳＸＣ−１）、ＩＦＮ−γ（クローンＸＭＧ１．２）、およびＴＮＦ−α（クローンＭＰ６−ＸＴ３）に対するビオチン化ラットｍＡｂを二次抗体として使用した。プレートを、ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して発色させ、停止液の添加後にＢｅｎｃｈｍａｒｋマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して４５０ｎｍの値を読んだ。
（ＢｒｄＵ組み込み）
１０日目にＰＬＰ １３９−１５１／ＣＦＡ免疫化したＴｉｍ−３−ＩｇまたはｈＩｇＧ 処置マウスから脾臓を取り出し、５×１０５〜１×１０６個の全脾臓細胞（９６ウェルの丸底プレート）を、５〜１０μＭ ５−ブロモデオキシウリジン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と共に３７℃、１０％ＣＯ２中で４８時間インキュベートした。４８時間後、細胞を、ＣＤ３−ＣｙＣ、ＣＤ２５−ＰＥ、およびＣＤ６９−ＰＥに対するｍＡｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色した。次いで、細胞を固定し、透過処理し（Ｃｙｔｏｐｅｒｍ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処置した。次いで、細胞をＢｒｄＵに対するＦＩＴＣ抱合ｍＡｂ（またはアイソタイプコントロールとしてのマウスＩｇＧ１）で染色し、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）によって分析した。
（Ｂ．第１実験の例）
（実施例１：細胞外免疫グロブリンドメインを含むが、全長Ｔｉｍ−３のムチンドメインを欠く可溶性Ｔｉｍ−３の同定）
マウスＴｉｍ−３遺伝子の５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）中にプライマーをデザインし、これを使用してＰＣＲによってコンカナバリンＡ（ｃｏｎ−Ａ）活性化脾細胞から生成したｃＤＮＡからＴｉｍ−３を増幅した。約１ｋｂのＴｉｍ−３の全長形態に加えて、サイズが８００ｂｐの別のアンプリコンを同定した（図１Ａ、レーン１）。１ｋｂアンプリコンの推定アミノ酸翻訳により、シグナルペプチドドメイン、ＩｇＶドメイン、ムチンドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含むＴｉｍ−３の全長膜固定形態（ｆｌ−Ｔｉｍ−３）と一致する読み取り枠（ＯＲＦ）が証明された（図１Ｂ）。８００ｂｐの産物由来のＯＲＦの分析により、シグナルペプチドドメイン、ＩｇＶドメイン、および細胞質ドメインのみを含み、ムチンドメインおよび膜貫通領域を欠くＴｉｍ−３の新規のイソ型の存在が証明された（図１Ｂ、１Ｃ）。ムチンドメインおよび膜貫通ドメインの非存在は、ムチンＴｉｍ−３遺伝子からのエクソン３、４、および５のスプライシングと一致する（図１Ｃ）。これらのデータにより、８００ｂｐアンプリコンによってコードされる産物は、細胞質ドメインに融合したマウスＴＩＭ−３の細胞外ドメインのＩＧＶ部分を含むＴｉｍ−３の選択的にスプライシングされた可溶性形態（ｓ−Ｔｉｍ−３）であることが示唆される。
（実施例２．可溶性Ｔｉｍ−３−Ｉｇ融合タンパク質の構築）
潜在的Ｔｉｍ−３−リガンドおよびＴＩＭ−３とのその機能的インビボ相互作用を同定するために、Ｔｉｍ−３の全長形態および可溶性形態の両方のための可溶性融合タンパク質をデザインした（２１）。マウスＴｉｍ−３の全細胞外部分をコードするが膜貫通および細胞質テールを含まないｃＤＮＡを、ヒトＩｇＧ１ ＦｃテールをコードするｃＤＮＡと融合して、全長Ｔｉｍ−３−Ｉｇ融合タンパク質（ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ）を形成した。細胞外ドメイン（図１Ａ、１Ｂ）のＩｇＶ部分のみを含むＴｉｍ−３の分泌形態の存在に照らして、可溶性Ｔｉｍ−３−Ｉｇ融合タンパク質（ｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ）を形成するために、ヒトＩｇＧ１ ＦｃテールをコードするｃＤＮＡと融合したマウスＴｉｍ−３のＩｇＶ部分をコードするｃＤＮＡからなる第２の融合タンパク質を構築した。これらの構築物を、ＮＳ．１ Ｂ細胞に安定にトランスフェクトし、上清からタンパク質を精製した（２１）。
（実施例３．ＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｉｍ−３−リガンドを発現する）
細胞がＴｉｍ−３−リガンドを発現するかどうかを決定するために、ナイーブ非免疫かＳＪＬ／Ｊ、ＮＯＤ、Ｃ５７ＢＬ／６、およびＢＡＬＢ／ｃマウス由来の全脾細胞を、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇまたはｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇで染色し、種々の細胞表面マーカーについて同時染色した。フローサイトメトリーで分析した場合、各株から得たＣＤ４＋Ｔ細胞は、ｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇまたはｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ融合タンパク質のいずれかで染色した場合にＴｉｍ−３−リガンド発現について陽性であった。精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を細胞表面活性化マーカーのパネルについて同時染色した場合、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇおよびｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ染色の両方によって評価したところ、ナイーブ（ＣＤ２５−、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４４ｌｏ、ＣＤ４５ＲＢｈｉ、ＣＤ５４−）および活性化記憶／調節（ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ４４ｈｉ、ＣＤ４５ＲＢｌｏ、ＣＤ５４＋）集団は共にＴｉｍ−３−リガンドを発現することが見出された（図２Ａ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞を精製してＣＤ２５発現について分取した場合、ＣＤ４＋２５＋集団およびＣＤ４＋２５−集団は共にＴｉｍ−３−リガンドを発現した。しかし、分取した細胞をインビトロで４８時間漸増濃度の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８およびＩＬ−２で活性化した場合、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞はＴｉｍ−３−リガンドの発現を保持するのに対して、ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞は下方制御された。全脾臓由来のＣＤ１１ｃ＋樹状細胞およびＣＤ１１ｂ＋マクロファージの小画分もＴｉｍ−３−Ｉｇ融合タンパク質によって染色されたが、全脾臓由来のＢ細胞（Ｂ２２０＋、ＣＤ１９＋）はＴｉｍ−３−リガンドについていずれの融合タンパク質でも染色されなかった。
ＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｉｍ−３−Ｉｇ融合タンパク質で陽性染色されるので、長期Ｔｈ２およびＴｈ２クローンのパネルを、Ｔｉｍ−３−リガンドの発現について試験してＴｈ１細胞またはＴｈ２細胞におけるＴｉｍ−３−リガンドの選択的発現が存在するかどうかを決定した。興味深いことに、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞は、静止状態のｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇでの染色について陽性である一方で（０日目、図２Ｂ）、これらの細胞株の活性化によりＴｉｍ−３−リガンド発現が下方制御された（４日目、図２ｂ）。活性化から７〜１０日目に、その時点で静止しているＴ細胞クローンにおけるＴｉｍ−３−リガンド発現が下方制御された（１０日目、図２ｂ）。したがって、静止Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞の両方でＴｉｍ−３−リガンドが発現し、活性化時に発現が下方制御するようである。これらのデータは、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞（エフェクターＴ細胞を含む）が活性化時にＴｉｍ−３−リガンド発現が下方制御されることを証明する第２実験由来のデータと一致する。
（実施例４．Ｔｉｍ−３−Ｉｇのインビボ投与によって過剰増殖が誘導される）
一連のＴｈ１免疫応答の間のＴｉｍ−３／Ｔｉｍ−３−リガンド相互作用のインビボでの役割を決定するために、ＳＪＬ／Ｊマウスを、ミエリンプロテオリピドタンパク質ＰＬＰ １３９−１５１を含むフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）で免疫化し、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇまたはｓ−Ｔｉｍ−３−ＩｇおよびヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）またはコントロールとしてＰＢＳで処置した。１０日目に処置したマウスを屠殺し、脾臓をインビトロで再刺激して増殖およびサイトカイン産生を決定した。コントロールｈＩｇＧまたはＰＢＳ処置マウス由来の全脾細胞は、抗原再刺激を行わない場合に低いバックグラウンド（基底）応答を示し（図３Ａ）、ＰＬＰ １３９−１５１ペプチドの添加によって増殖の用量依存性増加が証明された（図３Ｂ）。逆に、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇまたはｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇで処置したマウス由来の脾細胞は抗原再刺激を行わない場合に基底増殖が非常に高く、いくつかの実験では、１２０，０００ｃｐｍにもなった（図３Ａ）。しかし、特定の抗原（ＰＬＰ １３９−１５１）をｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇまたはｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウス由来の細胞培養中で増加させた場合、増殖応答の大きな増加は認められなかった（図３Ｂ）。まとめると、これらのデータにより、いずれかの融合タンパク質で処置した免疫化マウス由来の脾臓細胞がインビボで増殖し、それによりさらなる抗原刺激を行うことなくインビトロで増幅し続けることが示唆される（図３Ａ、３Ｂ）。
（実施例５．Ｔｉｍ−３のインビボ投与によって増幅されたＴｈ１サイトカイン産生が誘導される）
増幅細胞もサイトカインを産生するかどうかを決定するために、４８時間後にインビトロ培養物から上清を採取し、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、およびＩＮＦ−γについてのサイトカインＥＬＩＳＡを行った。分析により、抗原再刺激を行わない場合にｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇまたはｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇで処置した免疫化ＳＪＬ／Ｊマウス由来の脾細胞が大量のＴｈ１サイトカイン、ＩＬ−２、およびＩＦＮ−γを産生することが明らかとなった（図３Ａ）。対照的に、コントロールＰＢＳまたはｈＩｇＧで処置したマウス由来の脾細胞は、抗原再刺激を行わない場合にＩＬ−２またはＩＦＮ−γのいずれも産生しなかった（図３Ａ）。ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇまたはｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇで処置したマウス由来の脾細胞は、ＰＬＰ １３９−１５１ペプチド再刺激後にインビトロで大量のＩＬ−２およびＩＦＮ−γも分泌した（図３Ｂ）。コントロールＰＢＳまたはｈＩｇＧで処置したマウス由来の脾細胞は、ＩＦＮ−γをほとんどまたは全く産生せず、ＰＬＰ １３９−１５１ペプチドの再刺激時にＩＬ−２を産生しただけであった（図３Ｂ）。まとめると、これらのデータにより、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇまたはｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇでのインビボ処置によってｅｘ ｖｉｖｏでのＴｈ１細胞の過剰増殖およびＴｈ１サイトカインの放出が誘導されることが明らかとなった。
（実施例６．過剰増殖およびＴｈ１サイトカイン産生はＴｉｍ−３−Ｉｇ処置マウス中のＴ細胞によって媒介される）
免疫化されたＴｉｍ−３−Ｉｇ処置マウスで増殖する細胞型の表現型を決定するために、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ１１ｂ＋マクロファージ、およびＢ２２０＋Ｂ細胞の細胞集団を、免疫化マウスの脾臓から精製した。精製後、細胞集団を個別に培養し、インビトロで再度組み合わせ、３［Ｈ］−チミジン組み込みによって検出される増殖能力について評価した。全ての細胞型のうち、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇで処置したマウス由来の精製ＣＤ３＋Ｔ細胞はペプチド再刺激を行わずに非常に増殖するのに対して、コントロールｈＩｇＧ処置マウス由来のＣＤ３＋Ｔ細胞は低いバックグラウンド増殖レベルしか示さなかった（図４Ａ）。コントロールｈＩｇＧ処置マウス由来のＢ２２０＋Ｂ細胞またはＣＤ１１ｂ＋細胞の各集団は、低い増殖を示した（約１０，０００ｃｐｍ；図４Ａ）。ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウス由来のＢ細胞およびＣＤ１１ｂ＋細胞がｈＩｇＧ処置コントロールマウス由来のＢ細胞およびＣＤ１１ｂ＋細胞の２倍の増殖を示す一方で（約２０，０００ｃｐｍ；図４Ａ）、この増殖はｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウス由来のＣＤ３＋Ｔ細胞の増殖と比較して最小であった。これにより、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウスから採取されたＴ細胞は過剰増殖するが、Ｂ２２０＋Ｂ細胞やＣＤ１１ｂ＋マクロファージは過剰増殖しないことが示唆された。これは、活性化および拡大の大部分がＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４−８０＋マクロファージ集団で認められるが、Ｔ細胞区画やＢ細胞区画では認められないという抗ＴＩＭ−３抗体処置マウスにおける所見と対照的である（２０）。Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウスにおける過剰増殖表現型についてのリンパ球に対する依存性は、免疫化ＲＡＧ−２−／−マウスへのＴｉｍ−３−Ｉｇの投与から得たデータによってさらに支持される。ＳＪＬ−ＲＡＧ−２−／−マウスをＰＬＰ １３９−１５１を含むＣＦＡで免疫化してｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇまたはｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇで処置した場合、抗原再刺激に対する増殖バックグラウンドや応答が認められず、免疫化融合タンパク質処置マウスから採取した脾細胞で認められたバックグラウンド応答がＴ細胞および／またはＢ細胞の存在に依存することが示唆される。非免疫化マウスへのｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇまたはｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇの投与もバックグラウンド増殖応答を増加させたが、Ｔ細胞応答をヒトＩｇまたはＴｉｍ−３−Ｉｇ融合タンパク質のいずれかで再現することができなかったので、これは融合タンパク質中に存在するヒトＦｃテールに対するポリクローナル応答に起因しなかった。さらに、非免疫化マウスにおけるヒトＩｇの投与によって基底増殖応答は誘導されなかった（図３Ａ）。これにより、非免疫化マウスにおけるわずかに継続している免疫応答をＴｉｍ−３−Ｉｇ投与によって明らかにすることもできることが示唆される。
ｈＩｇＧ処置マウス由来のＣＤ３＋Ｔ細胞をｈＩｇＧ処置マウス由来のＢ２２０＋Ｂ細胞またはＣＤ１１ｂ＋細胞と混合した場合、増殖は低いままであり（約２０，０００ｃｐｍ）、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウス由来のＢ２２０＋Ｂ細胞またはＣＤ１１ｂ＋細胞の添加によってわずかに増加するだけであった（約３０〜４０，０００ｃｐｍ）（図４Ａ）。ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウス由来のＣＤ３＋Ｔ細胞をｈＩｇＧまたはｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウスのいずれか由来のＢ２２０＋Ｂ細胞と培養した場合、最も高い増殖が認められた（〜約１５０，０００ｃｐｍ）（図４Ａ）。興味深いことに、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウス由来のＣＤ３＋Ｔ細胞をｈＩｇＧまたはｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウス由来のＣＤ１１ｂ＋細胞と混合した場合、Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウス由来のＣＤ３＋Ｔ細胞で認められた自発的増殖が顕著に減少した（精製ＣＤ３＋Ｔ細胞のみについては、９０，０００ｃｐｍから３０〜３８，０００ｃｐｍに低下）（図４Ａ）。まとめると、これらのデータにより、免疫応答の継続中のｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇの投与によってＣＤ３＋Ｔ細胞の過剰増殖が誘導され、ＡＰＣの増殖への影響はより少ないことが示唆される。Ｂ２２０＋Ｂ細胞は、その供給源に関係なく、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウス由来のＴ細胞増殖を増強するのに対し、ＣＤ１１ｂ＋マクロファージはｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウス由来のＣＤ３＋Ｔ細胞の自発的過剰増殖を阻害した。
これらの各細胞集団のサイトカイン分泌パターンを決定するために、４８時間後に上清を採取し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、およびＩＮＦ−γ産生について分析した。ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウス由来の各細胞集団でＩＬ−２の産生が見出された一方で、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇで処置したマウス由来のＣＤ３＋Ｔ細胞は大部分のＩＦＮ−γ産生を担った（図４Ｂ）。Ｂ２２０＋Ｂ細胞またはＣＤ１１ｂ＋マクロファージ（ｅｘ−Ｔｉｍ−３−ＩｇまたはｈＩｇＧ処置マウスのいずれか由来）の添加により、ＣＤ３＋Ｔ細胞によってｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウスからＩＬ−２が分泌された。逆に、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウス由来のＣＤ３＋Ｔ細胞へのＢ２２０＋Ｂ細胞またはＣＤ１１ｂ＋マクロファージの添加により、これらのＣＤ３＋Ｔ細胞由来のＩＦＮ−γ産生が減少した（図４Ｂ）。要するに、これらのデータは、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウス由来のＣＤ３＋Ｔ細胞の過剰増殖によってＩＦＮ−γが大量に産生されたが、ＩＬ−２の産生にＡＰＣは必要ないことを証明する。
ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇでのインビボ処置に応答して過剰増殖する細胞をさらに特徴づけるために、５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（循環細胞によって組み込まれるチミジンアナログ）を組み込んだ細胞の表現型を決定した。Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置群における活性化ＣＤ３＋ＣＤ２５＋細胞の比率は、ｈＩｇＧ処置コントロール群の２〜３倍であった。このデータから（図４Ｃ）、ｈＩｇＧ処置コントロールと比較した場合にＢｒｄＵが組み込まれたＴｉｍ−３−Ｉｇ処置マウス由来のＣＤ３＋Ｔ細胞の比率が増加することも明らかであった。このデータは、コントロールｈＩｇＧ処置マウス由来の細胞と比較してＴｉｍ−３−Ｉｇ処置マウス由来の全脾細胞で認められたＣＤ３＋ＣＤ２５＋細胞およびＣＤ３＋ＣＤ６９＋細胞の比率の増加と一致した。この所見はインビトロ増殖およびサイトカインデータを支持し（図４Ａ、４Ｂ）、Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置免疫化マウス由来のＴ細胞が高度に活性化された急速に増殖する細胞であることが確認された（図４Ｃ）。
（実施例７．マウスへのＴｉｍ−３−Ｉｇの投与によって寛容の誘導が無効にする）
インビボでのＴｉｍ−３−Ｉｇの投与によってＩＬ−２産生の増幅を伴ってＴｈ１細胞が過剰に活性化されるので、出願人は、Ｔｉｍ−３−Ｉｇの投与によって末梢性寛容の誘導を防止するか無効にすることができると仮定した。ＳＪＬ／Ｊマウスを高用量の可溶性ＰＬＰ １３９−１５１ペプチドで寛容化し、同時にＣＦＡ中に乳化したＰＬＰ １３９−１５１で免疫化した。この寛容化プロトコールによってＰＬＰ １３９−１５１特異的Ｔ細胞がその後の活性化に寛容性を示すようになり、細胞増殖が低下してＩＬ−２を産生しない（２４）。寛容誘導に対するｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇの効果を試験するために、寛容化マウスを、Ｔｉｍ−３−ＩｇまたはコントロールＰＢＳまたはｈＩｇＧで８日間１日おきに処置し、１０日目にリンパ節および脾臓を取り出し、増殖およびサイトカイン産生によるＰＬＰ １３９−１５１に対するインビトロリコール（ｒｅｃａｌｌ）応答について試験した。
流入領域リンパ節でＴ細胞が誘導されて最初に活性化されるので、脾臓に加えて、流入領域リンパ節における寛容の誘導を試験した。図５に示すように、可溶性ＰＬＰで寛容化した免疫化マウス由来のリンパ節細胞は、コントロール（ＰＢＳ寛容化ｈＩｇＧ処置群）と比較して、ＰＬＰ１３９−１５１での再刺激に対する増殖が有意に増加した。Ｔｉｍ−３−Ｉｇを寛容誘発用量のＰＬＰ １３９−１５１と同時投与した場合、コントロール非寛容化マウスと比較して類似するかさらに高い有意な増殖応答が認められ、寛容誘導に伴ってＴｉｍ−３−Ｉｇが消失または妨害されることが証明された（図５）。コントロールｈＩｇＧ処置群においてＰＬＰ １３９−１５１での寛容化によってＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生が完全に喪失する一方で、Ｔｉｍ−３−Ｉｇで処置したマウスは、インビトロにて同族抗原で再刺激した場合にＴｈ１サイトカインを産生し続けた（図５）。
マウスの脾臓における寛容誘導の効果を決定した。図５Ａに示すように、ＰＬＰ免疫化マウスにおける可溶性ＰＬＰ １３９−１５１の同時インビボ投与によってＰＬＰ １３９−１５１ペプチドに対する増殖応答が劇的に増加し、可溶性１３９−１５１のインビボでＴ細胞寛容を誘導する能力が確認された。ｈＩｇＧまたはＰＢＳの可溶性ＰＬＰ １３９−１５１との投与によって寛容誘導は変化しなかった（図６Ａ）。しかし、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇを寛容誘発用量のＰＬＰ １３９−１５１と共に投与した場合、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウス由来の脾細胞の増殖は、非寛容化コントロール動物由来の脾細胞で得られた増殖と等価であった（図６Ａ）。したがって、Ｔｉｍ−３−Ｉｇの投与により、寛容の誘導を克服するか消失させ、Ｔ細胞が拡大する。
高用量の可溶性抗体はＴｈ１細胞の寛容を支配的に誘導し、特にＩＬ−２産生を阻害することが知られているので、出願人は、次に、寛容化マウスの脾臓におけるサイトカインの産生を調査した。４８時間後にインビトロ培養物から上清を採取し、寛容化してＴｉｍ−３−Ｉｇ処置したマウス由来の脾細胞がサイトカインを産生するかどうかを決定するために、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、およびＩＮＦ−γについてのサイトカインＥＬＩＳＡを行った。予想どおり、ＰＬＰ免疫化マウスへの可溶性ＰＬＰの投与によってＩＬ−２産生が阻害された（図６Ｂ）。ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇの同時投与により、ＩＬ−２産生が劇的に増加し、非寛容化ＰＬＰ免疫化マウスと比較した場合に、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウスにおいてより低い抗原濃度でＩＬ−２が産生された（図６Ｂ）。ＰＬＰ免疫化マウスがいかなる有意なＩＦＮ−γまたはＩＦＮ−α産生を示さないのに対し、寛容化マウスのＴｉｍ−３−Ｉｇ処置により、インビトロでの再刺激時に脾臓培養物からＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−αが劇的に産生された（図６Ｂ）。最も高い用量の特異的抗原でのインビトロ再刺激においてのみ、寛容化されたｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置マウス由来の上清で低レベルのＩＬ−４およびＩＬ−１０が認められた（図６Ｂ）。
（Ｃ．第１実験の考察）
Ｔｈ１特異的膜貫通タンパク質としてのＴｉｍ−３の発見により、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞を表現型で区別する新規の手段が得られる。完全に分化した（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）Ｔｈ１上で発現したこの細胞表面タンパク質の機能的役割の調査を開始する。最初の研究は、一連の免疫応答中の抗Ｔｉｍ−３抗体の投与によって自己免疫疾患ＥＡＥが悪化し、マクロファージの活性化および拡大が起こることを示した（２０）。本明細書中に記載のデータで可溶性Ｔｉｍ−３融合タンパク質の使用によるＴｉｍ−３／Ｔｉｍ−３−リガンド相互作用のインビボ効果の調査を開始する。免疫応答の継続中におけるインビボでのｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇまたはｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ融合タンパク質の投与により、抗原再刺激を行わない場合でさえもＴｈ１サイトカイン（ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２）の自発的産生を伴ってＴ細胞が過剰増殖した。さらに、Ｔｉｍ−３−Ｉｇは、高用量の可溶性抗原の投与によって媒介された寛容の誘導を消失または妨害した。
ナイーブマウスから採取してＴｉｍ−３−Ｉｇで染色したリンパ性細胞のフローサイトメトリー分析により、Ｔｉｍ−３のリガンドがＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現することが明らかとなった。さらに、Ｔ細胞クローン（Ｔｈ１表現型またはＴｈ２表現型のいずれか）がＴｉｍ−３−Ｉｇに結合する。少数のＣＤ１１ｃ＋樹状細胞およびＣＤ１１ｂ＋マクロファージもＴｉｍ−３−Ｉｇで染色されるようであるが、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｉｍ−３−リガンドを発現する主要な細胞型であった。Ｔｉｍ−３に関する本発明者らの最初の所見が、抗Ｔｉｍ−３抗体での免疫化ＳＪＬ／Ｊマウスの処置によってマクロファージとＴｈ１細胞との間の細胞間相互作用を介して全脾細胞の基底増殖が増加することを示したので、このデータは一見驚くべきものであった（２０）。これにより、Ｔｉｍ−３のリガンドがマクロファージ上で潜在的に発現することおよび抗Ｔｉｍ−３抗体がそのリガンドを介してマクロファージを活性化するためにＴｈ１細胞上でＴｉｍ−３を同時キャッピングするか、負のシグナルを遮断してマクロファージを活性化することが示唆された。考えられる解釈の１つは、ｉｍ−３のリガンドを有し得る小さいが潜在的に重要なマクロファージ集団が抗体投与によってこの様式で活性化されたということである。別の可能性は、インビボでの抗Ｔｉｍ−３抗体処置の際に認められるマクロファージ活性化は他のＴ細胞上に発現したＴｉｍ−３−リガンドとのＴｉｍ−３の相互作用破壊の二次的結果であり得るということである（２５）。
最終的に分化したＴｈ１細胞上でＴｉｍ−３−リガンドが発現し、且つＣＤ４＋Ｔ細胞上で潜在的なＴｉｍ−３−リガンドが発現することを知ることにより、これらのパートナーがどのようにしてインビボで相互作用するのかという問題が提起される。Ｔｉｍ−３融合タンパク質がＴｉｍ−３−リガンドとインビボで相互作用することができる少なくとも２つの潜在的機構が存在する。第１に、Ｔｉｍ−３−Ｉｇは、一連の免疫化中にインビボでＣＤ４＋Ｔ細胞に結合し、このリガンドを介してシグナルを発し得る。このシグナルは、優先的にナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１細胞に分化するか、これらのＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化状態を増加させることができる。ＣＦＡ中のＰＬＰ １３９−１５１での免疫化によって得られたＴｈ１環境を仮定すると、これらの活性化細胞は優先的にＴｈ１表現型に二分（ｐｏｌａｒｉｚｅ）されるので、有意に増加したＴ細胞増殖およびＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の産生が説明される。しかし、プレート結合抗体によるＣＤ３架橋を使用するか使用しないＴ細胞に対するＴｉｍ−３−リガンドの直接架橋により、Ｔｈ１細胞の過剰増殖やＴｈ１サイトカインの産生は誘導されない。これにより、Ｔｉｍ−３−リガンドのＴｉｍ−３−Ｉｇライゲーションによって実際は活性化することができないか、Ｔｈ１二分化条件下にてインビボで固有に起こり得ることが示唆される。第２の可能性は、Ｔｉｍ−３−Ｉｇがリガンド保有細胞（Ｔ細胞、マクロファージ、および／または樹状細胞）上でＴｉｍ−３−リガンドに結合し、それにより、二分化Ｔｈ１細胞上でＴｉｍ−３と相互作用する能力を遮断することができることである。Ｔｉｍ−３とＴｉｍ−３−リガンドとの間の相互作用の正常な生理学的機能がＴｈ１応答を下方制御することである場合、Ｔｉｍ−３−Ｉｇの投与によるリガンドの遮断により、認められたＴｈ１細胞増殖の増加およびＴｈ１サイトカイン産生が説明される。
本明細書中に記載のデータおよび第２の実験のデータは、Ｔｉｍ−３とそのリガンドとの相互作用が阻害的相互作用であり、且つＴｉｍ−３−Ｉｇ投与によりこの負の相互作用が遮断されてＴｈ１細胞が発現するという仮説を支持する。この可能な機構は、Ｔｉｍ−３−Ｉｇの投与によって末梢性寛容の誘導が無効にするというデータによってさらに支持され、Ｔｉｍ−３とＴｉｍ−３−リガンドとの間の生理学的相互作用がＴｈ１細胞の発現を制限するのに役立ち、エフェクターＴｈ１細胞の寛容の誘導に寄与することが示唆される。Ｔｉｍ−３−Ｉｇが寛容誘導を無効にすることができる少なくとも２つの可能な機構が存在する。Ｔｉｍ−３−ＩｇはエフェクターＴｈ１細胞を過剰に活性化することができ、それによって産生されたＩＬ−２は高用量可溶性抗原によるアネルギーの誘導を防止することができる。しかし、別の可能性は、Ｔｉｍ−３−Ｉｇが（低親和性ＴＣＲ／ＭＨＣ−ペプチド相互作用によって）通常増殖することができない非寛容化Ｔ細胞中で増殖およびエフェクター機能を誘導することができ、正味の結果が非応答よりもむしろＴ細胞拡大であることである。高用量寛容がしばしばＴｈ１細胞を寛容化する一方で、Ｔｈ２細胞が節約（ｓｐａｒｉｎｇ）または拡大することが知られている（２６）。Ｔｉｍ−３−Ｉｇの投与によりＴｈ１細胞のこの寛容誘導が無効になるので、Ｔｈ２細胞は影響を受けないままであり、インビトロでの脾細胞の再刺激の際に認められたＴｈ２サイトカインであるＩＬ−４およびＩＬ−１０が産生される（図５Ｂ）。
本発明者らの結果により、Ｔｉｍ−３／Ｔｉｍ−３−リガンド経路が寛容誘導に重要であり得ることが示唆される。興味深いことに、寛容誘導にＣＴＬＡ−４が必要であることも示された（２７）。寛容誘導におけるＴｉｍ−３およびＴｉｍ−３−リガンドの重要性を考慮すると、Ｔｉｍ−３／Ｔｉｍ−３−リガンド経路がＣＴＬＡ−４と類似の形式であるがエフェクターＴｈ１細胞に特異的に免疫応答の負のレギュレーターとして機能することができることが可能である。
Ｔｉｍ−３の可溶性のＩｇドメインのみの形態の発見により、Ｔｈ１応答の制御における可溶性Ｔｉｍ−３の役割が問題として提起される。このＴｉｍ−３の可溶性スプライス変異型は、Ｔ細胞によって可溶性分子として作製された他の免疫調節／阻害受容体（例えば、ＣＴＬＡ−４）に類似し、受容体のこれらの可溶性の選択的スプライシング形態は自己免疫疾患に対する感受性および耐性で重要な役割を果たすことが示されている（２３）。しかし、この段階では、Ｔｈ１細胞分化のどの時点でｓ−Ｔｉｍ−３が作製されるかおよびどのように機能するのかは明らかでない。本データによって示唆されるように、Ｔｉｍ−３／Ｔｉｍ−３−リガンド相互作用が阻害相互作用である場合、ｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇの産生により、この阻害効果を遮断し、Ｔｈ１細胞の拡大および分化を促進するように作用することができる。Ｔｉｍ−３−リガンドへのＴｉｍ−３の結合がＴｉｍ−３−リガンドへの膜結合ｅｘ−Ｔｉｍ−３の阻害的結合と競合する場合にこれが起り得る。この競合は、Ｔｉｍ−３−リガンドへのｅｘ−Ｔｉｍ−３のライゲーションを減少または防止することができ、その後、Ｔｈ１応答の下方制御を減少させるか無効にする。ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルでのｓ−Ｔｉｍ−３に対するｅｘ−Ｔｉｍ−３の産生の潜在的調節により、エフェクターＴｈ１細胞の免疫機能の動的調節手段を得ることができる。
ｓ−Ｔｉｍ−３はＩｇＶドメインのみを含むがムチンドメインを欠くので、このデータにより、Ｔｉｍ−３の免疫調節活性の大部分をそのＩｇドメインによって媒介することができることがさらに示唆される。予備データにより、ｓ−Ｔｉｍ−３−ＩｇがＣＤ４＋Ｔ細胞への高親和性／アビディティ結合を示し、インビボでより強力な免疫調節効果も媒介することが示唆される。ピコルナウイルス科のメンバー（ポリオウイルスおよびライノウイルスなど）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は後続の機能ドメインよりもむしろ受容体のＩｇドメインに結合することが以前に示されている（２８〜３１）。さらに、ｈａｖｃｒ−１（ピコルナウイルス科のメンバーであるＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）の受容体）は、ｈａｖｃｒ−１のＮ末端システイン（Ｃｙｓ）リッチ領域（受容体のＩｇドメインの一部である）を介してＨＡＶに結合することが示されている（２８、２９）。ｈａｖｃｒ−１がマウスＴｉｍ−１のヒトホモログ（Ｔｉｍ遺伝子ファミリーのメンバー）であると仮定すると（１９）、Ｔｉｍ−３が類似の様式でそのＩｇドメインを介してそのリガンドと相互作用することができることは理にかなっている。
Ｔｉｍ−３の全長膜固定形態の一部であるムチンドメインの潜在的な機能的役割は不明確である。ｈａｖｃｒ−１のトレオニン／セリン／プロリン（ＴＳＰ）リッチなムチン様領域がＨＡＶへの結合を容易にするために細胞表面上にＣｙｓリッチ領域を広げるのに役立ち得ると主張されている（２８，３２）。Ｔｉｍ−３のムチンドメインは、機能的結合様式よりもむしろ類似の構造で機能することができる。別の可能性は、Ｔｉｍ−３のムチンドメインがセクレチンと相互作用することができる炭水化物部分を提示することができるので、エフェクターＴｈ１細胞の輸送を容易にすることができることである。リンパ球ホーミング促進におけるこのような役割は、構造的に類似の多ドメイン受容体ＭＡｄＣＡＭ−１のムチン領域のためであると主張されている（３３）。
まとめると、これらのデータにより、Ｔｉｍ−３のそのリガンドとの相互作用によって正常なＴ細胞免疫応答中にＴｈ１細胞の発現および機能を調節する阻害経路が得られることが示唆される。この経路はまた、エフェクターＴｈ１細胞の末梢性寛容の調節で重要な役割を果たし得る。
（Ｄ．参考文献）
Figure 2008500013
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 （第２の実験）
（Ａ．序論）
Ｔヘルパー（Ｔｈ）前駆細胞のＴエフェクター集団への分化およびクローン性増殖は、適応免疫応答において重要な役割を果たし、細胞内のウイルスおよび病原菌に対して防御する。しかし、Ｔｈエフェクター細胞の非拘束活性化も多数の炎症性障害の根底にあることが示されている。この文脈では、Ｔｈ１エフェクター細胞は、関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、および他の自己免疫障害（Ｉ型糖尿病および多発性硬化症（１、２）ならびに同種移植片拒絶（３、４）が含まれる）の病理発生に関与する。対照的に、Ｔｈ２細胞の活性化は、アレルギー性喘息（５）の病理発生において重要な役割を果たし、移植片寛容の獲得に関与している（３、４）。Ｔ細胞活性化および分化様式の範囲を、主にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）媒介刺激の持続時間および強度によって決定する（６）。さらに、多数の同時刺激分子および補助分子（ＴＮＦ受容体（７）および免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーメンバー（８）ならびにＩＬ−２などのサイトカインが含まれる）は、クローン性増殖、欠失、および／またはアネルギー誘導の範囲を調節する（９）。しかし、出願人はナイーブＴ細胞の活性化を調製する多数の細胞機構および分子機構を認識している一方で、エフェクターＴ細胞の小集団の運命を決定する分子は依然として解明されていない。
ＩｇスーパーファミリーメンバーＴＩＭ−３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン、ムチンドメイン）は、Ｍｏｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（１０）によって分化したＴｈ１細胞上で優先的に発現される膜貫通タンパク質として最初に記載された。実験的アレルギー性能脊髄炎（ＥＡＥ）（Ｔｈ１媒介自己免疫疾患）のモデルでは、抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のインビボ投与により、脳内により重篤な炎症性事象およびより重篤な疾患を発症する。これらの所見に基づいて、ＴＩＭ−３は、ＥＡＥにおける組織破壊性免疫応答の負のレギュレーターとして提案された（１０）。しかし、これらのデータがＴＩＭ−３によって得られる負のシグナルの阻害を反映しているかどうかまたはインビボでのｍＡｂのＴＩＭ−３架橋がＴ細胞活性化および疾患の悪化を誘導するための正のシグナルを発するかどうかについては不確かなままである。本明細書中に報告した結果に基づいて、出願人は、ＴＩＭ−３のその推定リガンドへの固定により、インビボでの炎症反応を抑制するための阻害シグナルが得られると結論づけた。Ｔｉｍ−３−Ｉｇ融合タンパク質処置を介したＴＩＭ−３経路の遮断は、ＮＯＤ（非肥満性糖尿病）モデルにおける糖尿病の発症が促進し、ＣＴＬＡ４およびドナー特異的輸液（ＤＳＴ）＋抗ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）処置（強力な同時刺激遮断ベースの寛容促進移植プロトコール（１１〜１３））の組み合わせのＭＨＣ適合同種移植片の寛容を誘導する能力を無効にする。関連する正確な機構が依然としてほとんど解明されていないが、出願人は、調節Ｔ細胞の免疫応答を抑制する能力の調整によって、ＴＩＭ−３が少なくとも一部の自己免疫応答および同種免疫応答の結果を調節すると提案する。
（Ｂ．方法）
（マウス）
全マウスを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手し、関連機関および州のガイドラインにしたがって、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）、Ｂｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、またはＤＲＦＺ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の従来の動物施設にて特定の無病原体条件下で維持した。
（マウスＴＩＭ−３の同定およびクローニング）
Ｔｈ１特異的ライブラリーを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して生成した。活性化Ｔｈ１クローン由来のＲＮＡを「テスター」として使用し、活性化Ｔｈ２クローン由来のＲＮＡを「ドライバー」として使用した。各クローン由来のプラスミドＤＮＡを、ナイロンフィルターにスポットし、Ｔｈ１およびＴｈ２ ＲＮＡ由来の一本鎖プローブとハイブリッド形成させた。Ｔｈ１ライブラリー中のクローンのうちの１つは８５７ｂｐのｃＤＮＡからなり、これを使用し、マウスＴｈ１細胞由来のｃＤＮＡライブラリーを使用して全長クローンを得た。その後にヒトホモログを同定し、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーから配列決定した。マウス抗原特異的Ｔｈ１（ＡＥ７ ａｎｄ Ｄｏｒｒｉｓ）およびＴｈ２（Ｄ１０．Ｇ４、ＤＡＸ、ＣＤＣ２５）クローンを、１０〜１４日毎にペプチド、マイトマイシンＣ処理ＡＰＣ、およびＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）で刺激した。細胞を抗ＣＤ３ｍＡｂ（２Ｃ１１，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で活性化し、ＲＮＡを単離した。次いで、ＴＩＭ−３ ｃＤＮＡの差分発現を、静止および抗ＣＤ３活性化クローン由来のノーザンブロットによって確認した。
（ＴＩＭ−３ｍＡｂおよびＴＩＭ−３融合タンパク質の生成）
ＴＩＭ−３の細胞外ドメインを含むＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅し、ＣＤ５シグナル配列およびヒトＩｇＧ定常領域を含むベクターにクローン化した。ＣＯＳ細胞をトランスフェクトし、組換えタンパク質をプロテインＡカラムで精製した。Ｗｋｙラットを、精製マウスＴＩＭ−３融合タンパク質（１００μｇ）を含むＣＦＡで免疫化し、ｉ．ｐ．および皮下に追加免疫した。脾細胞をＳＰ／２骨髄腫細胞と融合し、得られたクローンをＴｉｍ−３トランスフェクトＣＨＯ細胞への結合についてスクリーニングした。これらのクローンのうちの１つ（８Ｈ７）を、ＩＣＯＳトランスファクタントではなくＴＩＭ−３への特異的結合に基づいて選択した。抗ＴＩＭ−３ ８Ｈ７ ｍＡｂを、特異的抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してラットＩｇＧ１としてアイソタイプ分類を行った。第１の実験に記載用に、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇおよびｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇを、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃテール融合タンパク質として構築し、ＮＳ．１中で発現させた。ＴＩＭ−３Ｌ染色実験のために、ビオチン化ＴＩＭ−３関連融合タンパク質またはヒトＩｇＧ１を蛍光色素抱合ストレプトアビジン（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）と共に使用した。
（島移植）
以前に記載のように島移植を行った（５１）。約７００ ＤＢＡ／２（Ｈ−２ｄ）の島を、ストレプトゾトシン誘導性糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）の腎被膜下に移植した。同種移植片の機能を、連続的血糖測定によってモニタリングした。使用した寛容化プロトコールは、移植２８日前（−２８日目）の１０７ＤＢＡ／２脾細胞のｉ．ｖ．投与および−２８日目、−２６日目、−２４日目の２５０μｇのハムスターｍＡｂ抗マウスＣＤ１５４（ＭＲ１、ＩｇＧ２ａ、ＡＴＣＣＨＢ１１０４８、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のｉ．ｐ．投与からなる。ｅｘ−Ｔｉｍ−３−ＩｇコントロールｈＩｇＧ１を、２５０μｇの用量で−２８日目、−２６日目、−２４日目にｉ．ｐ．投与した。選択されたレシピエントでは、２００μｇのラット抗マウスＣＤ２５ ｍＡｂ（ＰＣ６１、５．３、ＩｇＧ１、ＡＴＣＣＴＢ２２２）も−４０日目、−３８日目、−３６日目ｉ．ｐ．投与した。出願人は、以前に、このような用量で投与した抗ＣＤ２５ｍＡｂが二次リンパ器官および末梢血の両方で８０％を超えるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を消失すると判断している。いくつかの実験では、移植から０、２、４、６、８日後の０．１μｇのＣＴＬＡ４Ｉｇの投与によって寛容が誘導された。
（リアルタイムＰＣＲ実験）
トリゾール（ｔｒｉｚｏｌ）を使用して島移植片から総ＲＮＡを抽出し、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して逆転写を行った。ＡＢＩ７７００配列検出システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、リアルタイムＰＣＲを行った。ｍＲＮＡレベルを定量するために、標的遺伝子の発現を、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化し、データを、研究サンプルと較正サンプルとの間のｃＤＮＡ相違の相対倍率として示した。ＴＩＭ−３プライマー／プローブ配列は以下である：プローブ、５−’ＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＡＧＴＧＣＣＣ−３’；正方向プライマー、５’−ＧＣＣＧＧＴＧＧＡＣＣＴＣＡＧＴＴＴＣ−３’；逆方向プライマー５’−ＴＧＧＧＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＡＴＣＡ−３’。ＧＡＰＤＨ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、およびＩＬ−１０プライマー／プローブ組を、Ａｐｐｌｉｃｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
（皮膚同種移植片レシピエントへの細胞養子免疫伝達）
リンパ節細胞の単一細胞懸濁液を、ナイーブＣ３Ｈ／Ｈｅマウス（Ｈ−２ｋ）または１０７ＤＢＡ／２脾細胞（２８日前；−２８）および抗ＣＤ１５４（−２８日目、−２６日目、および−２４日目に２５０μｇ）または抗ＣＤ１５４＋ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ（−２８日目、−２６日目、および−２４日目にそれぞれ２５０μｇ）のいずれかのｉ．ｖ．注射で処置したＣ３Ｈ／Ｈｅマウスから得た。細胞を、蛍光色素抱合抗ＣＤ２５および抗ＣＤ４（全てＢＤＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で染色し、ＭｏＦｌｏ（登録商標）高処理細胞分取器（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ；Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）で分取した。ＣＤ４＋ＣＤ２５−およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋調製物の純度は、一貫して９０％超であった。種々の数のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ制御因子（ｒｅｇｓ）およびＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞を、２４時間後に同種ＤＢＡ／２皮膚移植を受けたＣ３Ｈ／ＨｅＳｃｉｄマウス宿主の尾静脈に注射した。いくつかの実験では、３回分の２５０μｇのｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇを、皮膚移植から０、２、および４日後に投与した。全層ＤＢＡ／２の尾皮膚同種移植を以前に記載のように行い（５２）、移植片の生存を毎日モニタリングした。拒絶を、皮膚移植片の完全な壊死と定義する。Ｔ細胞集団のドナーとしての野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＤＢＡ／２皮膚同種移植片のレシピエントとしてのＣ５７ＢＬ／６Ｒａｇ−／−を使用して、類似の実験を行った。
（インビトロ増殖アッセイ）
ＣＤ４＋Ｔ細胞小集団の増殖を評価するために、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋およびＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を以前に記載のように分取し、丸底９６ウェルマイクロタイタープレート中にて５×１０５／ｍＬの細胞密度で２μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３ｍＡｂ、５μｇ／ｍＬ抗ＣＤ２８ｍＡｂ、および１００Ｕ／ｍＬのｒＩＬ−２（全てＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）と共に培養した。細胞を回収し、ビオチン化ｓ−Ｔｉｍ−３−ＩｇまたはコントロールヒトＩｇＧ１およびその後のストレプトアビジン−シトクロムで２４時間および４８時間染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
（Ｃ．第２の実験の例）
（実施例１１．ＴＩＭ−３リガンドはＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現する）
ＴＩＭ−３の構造は、粘膜アドレシン細胞接着分子１（ＭＡｄＣａｍ−１）をいくらか連想させ、２つのＩｇドメインおよびムチンリッチ領域を含む（１０）。推定ＴＩＭ−３リガンド（ＴＩＭ−３Ｌ）の分布を評価するために、マウスＴＩＭ−３（全長またはｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ）の細胞外ドメインまたは短縮した可溶性Ｉｇドメインのみ（ｓ−ＴＩＭ−３−Ｉｇ）（１６）を組み込んだヒトＩｇＧ１由来Ｆｃ融合タンパク質を生成した。ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇおよびｓ−ＴＩＭ−３−Ｉｇは共に静止ＣＤ４＋Ｔ細胞に結合するがＣＤ８＋、Ｂ２２０＋、ＣＤ１１ｂ＋細胞に結合せず（図８Ｃ）、ｓ−ＴＩＭ−３−Ｉｇ結合がより強力であった。脾臓ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞（図７Ａ）へのいくつかの結合も認められたが、染色パターンはＣＤ４＋Ｔ細胞よりもはるかに一貫性が低かった。ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇと比較したｓ−ＴＩＭ−３−Ｉｇを用いて認められた増幅染色パターンに基づいて、ＴＩＭ−３のＩｇドメインは、ＴＩＭ−３Ｌとの相互作用を担うようである。
（実施例１２．活性化後にＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞はＴＩＭ−３Ｌ発現を下方制御するが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞は下方制御しない）
静止条件では、ＴＩＭ−３関連融合タンパク質は、エフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞および調節ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞小集団の両方を同様に結合する（図７Ｂ、上のパネル）。ＴＩＭ−３が調節またはエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞のいずれかの機能を選択的にターゲティングすることができる潜在的機構を同定するために、ｓ−ＴＩＭ−３−Ｉｇの結合によって評価した、インビトロ活性化後のＣＤ４＋ＣＤ２５−およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞上でのＴＩＭ−３Ｌの発現速度を研究した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂでの刺激により、培養の最初の２４時間ではＴＩＭ−３Ｌ発現は変化しなかった（図７Ｂ、中央のパネル）。対照的に、培養４８時間後の活性化ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞に対するＴＩＭ−３Ｌ発現は下方制御される一方で、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞に対するＴＩＭ−３Ｌ発現は残存した（図７Ｂの下のパネル）。ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞に対するＴＩＭ−３Ｌ発現の下方制御は、コンカナバリンＡまたはＬＰＳでのインビトロ活性化時にも認められた。活性化調節Ｔ細胞における推定ＴＩＭ−３Ｌの優先的発現を、活性化Ｔｈ１細胞上のＴＩＭ−３の発現によってモニタリングする。したがって、出願人は、ＴＩＭ−３／ＴＩＭ−３Ｌ相互作用がＴｈ１媒介免疫応答における免疫調節および寛容の獲得および／または維持に重要であるという仮説を調査した。
（実施例１６．ＴＩＭ−３経路の遮断は同種移植片モデルの寛容の獲得を防止する）
移植免疫寛容をＴｈ１およびＴｈ２二分化条件下で行うことができる一方で（４、２５、２６）、Ｔｈ２に対するＴｈ１の免疫偏向（ｉｍｍｕｎｏｄｅｖｉａｔｉｏｎ）により、寛容の発生が容易になる（４、２７）。実際、多数の寛容化免疫抑制投薬計画の結果は、Ｔｈ２型同種移植片応答への免疫偏向に関連する（４）。同種移植片寛容の獲得におけるＴｈ１特異的ＴＩＭ−３細胞表面タンパク質の役割を解明するために、ＣＤ４０−ＣＤ１５４同時刺激遮断を達成するためにレシピエントをドナー特異的注入（ＤＳＴ）と抗ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）との組み合わせで処置した島同種移植片モデルを使用した（１１、１２、２８）。このモデルでは、移植１ヶ月前に投与した単回用量のＤＳＴおよび抗ＣＤ１５４により、ＭＨＣ適合島同種移植片の不確実な生存が確実になる。さらに、処置した長期生存移植レシピエントは同一ドナー由来の第２の移植片を容易に受け入れる一方で、第三者の移植片を容易に拒絶し、処置がドナー特異的同種移植片拒絶を誘導することを示す（１２、２８）。対照的に、未処置コントロールレシピエントでは、島浸潤性リンパ球浸潤物が移植から７日後に認められ、ほとんどの同種移植片が移植から２０日目までに完全に破壊される（１２、２８）。
ＴＩＭ−３発現がこのモデルに関連するかどうかを決定するために、リアルタイムＰＣＲ実験を実施して、処置レシピエントおよびコントロールレシピエントにおける移植片内遺伝子発現を比較した。移植７日後に処置宿主およびコントロール宿主の両方で高い移植片内γＩＮＦおよびＴＩＭ−３遺伝子発現がみとめられる一方で（図８Ａ）、長期生存寛容レシピエントにおける同種移植片応答（移植１２０日目）を、平滑末端化ＴＩＭ−３およびγＩＦＮ移植片内遺伝子発現によって特徴づける（図８Ａ）。ＩＬ−２の移植片内発現は、７日目の処置および未処置宿主の両方においてＴＩＭ−３およびγＩＦＮの移植片内発現と密接に関連する。対照的に、７日目および１２０日目で拒絶された移植片と比較したところ、ＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４処置宿主においてＩＬ−４およびＩＬ−１０の移植片内発現の２〜３倍の増加が認められる。したがって、処置はＴｈ２型遺伝子発現の上方制御に関連する一方で、Ｔｈ１応答は移植免疫寛容の維持期（１２０日目）に起こるが、誘導期（７日目）に起こらない。
次に、完全なＴＩＭ−３経路には移植免疫寛容の達成が必要であるかどうかを評価した。ＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４とのｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇの投与により、島同種移植片寛容の獲得が防止されて、急速に拒絶される（図８Ｂ）。さらに、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ投与により、高用量の抗ＣＤ１５４での単剤療法によって媒介される寛容の誘導も無効になる。
ＴＩＭ−３経路が抗ＣＤ１５４＋／−ＤＳＴ処置で寛容化される機能のみにおいて重要であるかどうかを決定するために、ＣＴＬＡ４Ｉｇ投与によって寛容化される移植モデルにおけるＴＩＭ−３遮断の効果を試験した。インビボでのＣＴＬＡ４Ｉｇの作用機構は、抗原反応性Ｔ細胞増殖の阻害ならびに免疫調節および末梢性寛容の誘導の両方に関与する（３０〜３２）。ＣＴＬＡ４Ｉｇ処置によって９つの処置したレシピエントのうちの７つで島同種移植片が不正確に生着する一方で、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇの同時投与によって同種移植片の大部分が拒絶された（図８Ｃ）。第１の実験の結果をまとめると、これらのデータは、ＴＩＭ−３が免疫寛容の重要なレギュレーターであることを明らかに示す。
（実施例１６．ＴＩＭ−３遮断はＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞が同種移植片を拒絶する能力を抑制するナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞の能力を排除しない）
出願人は、以前に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞がＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４で誘導された寛容状態の維持に重要に関与すると判断している（１２）。出願人は、本発明で、この調節Ｔ細胞サブセットも移植免疫寛容の誘導期に必要であるかどうかを試験した。興味深いことに、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞サブセットの枯渇の結果がｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ投与によって誘導された効果と類似し、島同種移植片の急速な拒絶が抗ＣＤ２５ｍＡｂ処置宿主で認められた（図９Ａ）。
これらの結果に基づいて、ナイーブ宿主中に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞を保有するＴＩＭ−３ＬによるＴｈ１エフェクター細胞上で発現したＴＩＭ−３の関与がその免疫抑制機能の必要条件であり得ると仮定した。ナイーブマウスから採取した調節Ｔ細胞がＴＩＭ−３が関与しないでその免疫抑制機能を発揮することができるかどうかを決定するために、ＴＩＭ−３遮断の非存在下でＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞によって媒介される同種移植片拒絶を防止するナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細の能力を評価する養子免疫伝達実験を行った。このモデルでは、わずか１×１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５−またはＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫不全ＭＨＣ不適合皮膚同種移植片レシピエントへの導入によって急速な皮膚同種移植片拒絶が起こる一方で、導入されたナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は拒絶を誘導してＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞集団が移植片を破壊するのを防止する（３３、３４）。ＤＢＡ／２皮膚同種移植片のＣ３Ｈ／Ｈｅ Ｓｃｉｄレシピエントへのｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇの投与により、導入されたナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の同時導入ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞が同種移植片拒絶するのを防止する能力を阻害しなかった（図９Ｂ）。ナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞をナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞またはＴｈ１二分化ＣＤ４＋Ｔ細胞のいずれかと同時培養し、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇの非存在下で可溶性抗ＣＤ３で刺激した場合、インビトロで同様の結果が認められた。さらに、１×１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞のみの導入により、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−ＩｇまたはコントロールｈＩｇＧを投与したかと無関係に等しい急速な皮膚移植片拒絶が生じた。まとめると、これらの結果は、ナイーブ同種抗原未経験マウスから採取したＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞がＴＩＭ−３と関与せずにＴｈ１依存性細胞変性応答を抑制することができることを示す。したがって、ＴＩＭ−３遮断は抗原未経験ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の免疫調節エフェクター機能を消失せず、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞が皮膚同種移植片を拒絶する能力を顕著に増強しない。
（実施例１７．ＴＩＭ−３は同種抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞集団の有効性の強化を調節する）
移植免疫寛容を引き起こすいくつかの治療計画は、抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞の有効性を強化することが知られている（３３〜３５）。同種抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生成に対するＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４処置の影響を決定するために、ナイーブ宿主またはＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４で処置したマウスから採取したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の免疫抑制能力を比較するためのさらなる養子免疫伝達実験を行った。処置または未処置のナイーブマウスから採取したＣＤ４＋ＣＤ２５−またはＣＤ８＋Ｔ細胞は急性皮膚同種移植片拒絶を促進する能力を変更せず（ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞のデータを図９Ｃに示す）、このモデルでは、ＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４処置はエフェクターＴ細胞集団に大きな影響を与えないことを示す。対照的に、ＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４処置宿主から分取したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ナイーブマウスから採取したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞よりもナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞に対する免疫抑制効果がはるかに高かった。したがって、高いＣＤ４＋ＣＤ２５＋：ＣＤ４＋ＣＤ２５−比（４：１）で導入した場合にナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞が皮膚同種移植片を拒絶するのを防止することができる一方で（図９Ｃ、中央のパネル）、ＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４処置宿主から採取したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のみでは１：１の調節Ｔ細胞：エフェクターＴ細胞比で有効な免疫抑制を媒介することができる（図９Ｃ、右のパネル）。顕著には、ＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４処置後に認められたこの増強された免疫抑制表現型は非常にドナー特異的であり、これは、ＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４を使用して異なるドナー株（Ｃ５７ＢＬ／６）に対して寛容化された宿主から採取したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、ドナーＤＢＡ／２皮膚同種移植片に反応してナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞よりも高い移植片防御効果を媒介しなかったからである（皮膚同種移植片生存時間の中央値は、それぞれ１４日および１２日、ｎ＝５および７）。さらに、ＤＳＴおよび抗ＣＤ１５４は共に免疫調節効果の増強に必要であり、これは、ＣＤ４０−ＣＤ１５４同時刺激遮断を使用しない同種抗原の供給がインビボでのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の免疫抑制機能に対して検出可能な効果を示さなかったからである。
これらの所見により、ＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４が、ドナー特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞の免疫抑制機能の増強によって寛容化効果を大いに発揮することが示唆される。次いで、出願人は、ＴＩＭ−３経路がこの治療効果に重要であるかどうかという問題に取り組んだ。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞をＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４処置マウスから採取し、その免疫抑制機能を、ＤＳＴ、抗ＣＤ１５４、およびｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇで処置した宿主から得た調節Ｔ細胞の免疫抑制機能とインビボで比較した。ＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４処置によって付与された増強された同種抗原特異的抑制表現型は、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇの同時投与によって消失し（図９Ｄ）、これは、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇを投与した処置宿主から採取したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞がナイーブ調節細胞よりも高い抑制効果を発揮しなかったからである（図９Ｄ）。これらの実験では、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−ＩｇをＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞ドナーにのみ投与し、皮膚移植片レシピエントを全く処置しないので、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置によりＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞とＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞との間の相互作用を妨害される可能性が最小になる。実際、本発明者らの養子免疫伝達モデルでは、出願人は、移植後のｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇの投与により、前に生成されたドナー特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の防御効果を無効にしないことに気づいた。まとめると、本発明者らのデータにより、ｉ）ＴＩＭ−３経路が寛容誘導の間にＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞によってドナー特異的免疫調節特性の獲得を容易にし、ｉｉ）ＴＩＭ−３／ＴＩＭ−３Ｌ相互作用がドナー特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋免疫調節Ｔ細胞の生成に重要であるが、免疫抑制エフェクター機能に重要ではないことが示唆される。
（実施例１８．ＴＩＭ−３リガンドとしてのガレクチン−９の同定）
推定ＴＩＭ−３リガンドの発現の分布を分析するために、ＴＩＭ−３−Ｉｇ融合タンパク質による細胞表面染色を使用して、ＴＩＭ−３リガンド発現細胞型をスクリーニングした。ｆｌＴＩＭ−３−ＩｇおよびｓＴＩＭ−３−Ｉｇは共に静止ＣＤ４＋Ｔ細胞ならびに脾臓ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞およびＣＤ１１ｂ＋マクロファージの小集団に結合するが、ＣＤ８＋またはＢ２２０＋細胞に結合しないことが示され（Ｓａｂａｔｏｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：１１０２−１１１０，Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｆｕｅｙｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：１０９３−１１０１）、これは、ＴＩＭ−３リガンドが主に静止ＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現することを示す。したがって、多数のＴ細胞株／Ｔ細胞リンパ腫をスクリーニングした。ＦＡＣＳの結果は、試験した３つのＴ細胞株はこれまでのところｓＴｉｍ−３−Ｉｇに結合するがヒトＩｇＧ１コントロールに結合せず、そのうちのＴＫ−１（Ｔ細胞リンパ腫）がｓＴｉｍ−３−Ｉｇに最も結合することを証明した（図１０Ａ）。ｆｌＴＩＭ−３−Ｉｇによる染色は類似の結果を示した（図１０Ａ）。
特異的細胞外膜結合ＴＩＭ−３結合タンパク質を同定するために、生きたＴＫ−１細胞をビオチン標識し、ホールセル溶解物を、ＴＩＭ−３−Ｉｇ融合タンパク質とのインキュベーションによる破壊アッセイに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ウェスタンブロットの結果は、ｆｌＴｉｍ−３−ＩｇおよびｓＴｉｍ−３−Ｉｇが共に分子量範囲が４０〜６０ｋＤのタンパク質またはタンパク質複合体を沈殿させることができることを証明した（図１ｂ、レーン１、２）。ＴＩＭ−２−ＩｇまたはｈＩｇＧ破壊タンパク質由来のコントロール群と比較して（図１０ｂ、レーン３、４）、４０〜６０ｋＤのバンドは、ｆｌＴＩＭ−３−ＩｇおよびｓＴＩＭ−３−Ｉｇに特異的である。ＰＮＧアーゼＦによってＮ結合オリゴ糖鎖を除去した場合、分子量が４０〜６０ｋＤのバンドは３５ｋＤに減少した。３５Ｓ−Ｍｅｔ代謝標識ＴＫ−１細胞由来の細胞溶解物を使用した同一の実験により、この３５ｋＤのバンドの汚染可能性がさらに排除された。銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから抽出した３５ｋＤバンドの質量分析により、タンパク質がガレクチン−９（リンパ球および他の細胞型上で発現する多数のガレクチンファミリー）と同定された。
（実施例１９．ガレクチン−９とＴＩＭ−３との間の特異的相互作用）
ガレクチンは、細胞表面上の糖部分に結合するための炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を含むβ−ガラクトシド結合レクチン群であり、レクチンは、免疫細胞のホメオスタシスの主なレギュレーターである（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３：３１３−３２０；Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １５７２：２７４−２８４）。ガレクチンは、ＥＲ−ゴルジ経路分泌のためのシグナルペプチドを含まない。ＩＬ−１のように、ガレクチンは別経路を介して細胞外に分泌される。ＴＫ−１細胞由来の総ＲＮＡを、ガレクチン−９ｃＤＮＡをクローン化するためのＲＴ−ＰＣＲのために調製した。２つのガレクチン−９コード配列をクローン化し、その後標準ガレクチン−９ｃＤＮＡとして見出され、ガレクチン−９の２つのＣＲＤドメインのヒンジ領域中に３１個のアミノ酸が挿入されているその長鎖イソ型は腸上皮で主に発現されると報告されている。
ガレクチン−９とＴＩＭ−３との間の相互作用を確認するために、両ガレクチン−９イソ型ｃＤＮＡを、ＥＧＦＰタンパク質をバイシストロン性に発現する発現ベクターにサブクローン化した。ガレクチン−９発現プラスミドがＣＨＯ細胞に一過性にトランスフェクトされた場合、ＥＧＦＰを発現する細胞はガレクチン−９を同時に発現する。一過性トランスフェクションでは、ガレクチン−９の発現は、細胞表面上で検出されなかった。一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞におけるガレクチン−９の発現を別の輸送機構から分離することが可能である。したがって、タンパク質産物が細胞質中に蓄積され得る。細胞内染色によってＥＧＦＰ陽性のトランスフェクトされたＣＨＯ細胞由来のｓＴｉｍ−３−ＩｇおよびｆｌＴＩＭ−３−Ｉｇによる同一の陽性染色パターンが明らかとなることが確かであり、ＴＩＭ−３融合物と相互作用する場合に標準的なガレクチン−９とその長鎖イソ型との間の相違が示唆されない。しかし、これらはいずれもｈＩｇＧコントロールに結合することができない（図１１Ａ）。
ガレクチン−９とＴＩＭ−３との間の結合特異性を証明するために、ガレクチン−９を一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、細胞内染色に供した。ｆｌＴＩＭ−３−ＩｇおよびｓＴＩＭ−３−Ｉｇは、ガレクチン−９発現細胞中で全ての陽性染色を有する唯一の融合タンパク質である。それに反して、ＴＩＭ−２−Ｉｇ、ＴＩＭ−４−Ｉｇ、およびｈＩｇＧは同一のトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に結合することができず、ＴＩＭ−３は、他のＴＩＭファミリーメンバーと比較してガレクチン−９に対する親和性が最も高いと示唆される。別のアプローチとして、精製組換えガレクチン−９をｓＴＩＭ−３−Ｉｇによって特異的に破壊することができるが、ＴＩＭ−２およびＴＩＭ−４ Ｉｇ融合物ではできない（図１１Ｃ）。他方では、ｆｌＴＩＭ−３−ＩｇおよびｓＴＩＭ−３−Ｉｇのみが共にガレクチン−９発現細胞への陽性結合を示すのに対して、細胞が非常に高いレベルのこれらのタンパク質を発現しない限り、これらはガレクチン−１、３、および４に結合せず、ＴＩＭ−３とこれらのガレクチンとの間の一定レベルの非特異的相互作用が示唆される（図１１Ｃ）。
要するに、ガレクチン−９は、ＴＩＭ−３細胞外部分に特異的に結合するタンパク質である。ｆｌＴＩＭ−３−ＩｇおよびｓＴＩＭ−３−Ｉｇは共にガレクチン−９に結合することができるので、ＴＩＭ−３上のＩｇＶドメインは、ガレクチン−９との相互作用を担い得る。インキュベーション緩衝液にラクトースを添加した場合、ガレクチン−９とＴＩＭ−３との間の相互作用は、用量依存性様式で細胞内染色および破壊アッセイの両方で弱まった（図１２Ａ）。さらに、Ｎ末端ＣＲＤまたはＣ末端ＣＲＤのいずれかを破壊する変異ガレクチン−９構築物はＴＩＭ−３に対する相互作用を部分的に喪失するのに対して、両ＣＲＤドメインの二重変異によってＴＩＭ−３への結合が完全に無効になった（図１２Ｂ）。したがって、ガレクチン−９とＴＩＭ−３との間の相互作用は、ガレクチン−９中のＣＲＤドメインに依存する。
（実施例２０．エフェクターＴｈ１細胞の調節におけるＴＩＭ−３−ガレクチン−９の役割）
出願人は、アポトーシス機構によるＴｈ１細胞増殖の調節およびホメオスタシスにおけるガレクチン−９−ＴＩＭ−３経路の機能的役割を仮定した。エフェクターＴ細胞中のガレクチン−９のアポトーシス効果を試験するために、ＤＯ１１．１０トランスジェニックマウス由来のナイーブ脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４Ｔ細胞ネガティブ選択カラムによって精製し、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞について分取した。細胞をＶＯＡペプチドおよび照射ＡＰＣにてインビトロで刺激し、インビトロで少なくとも３ラウンドＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞に二分した。活性Ｔｈ１細胞を組換えガレクチン−９で処置した場合、大部分の細胞で細胞死が誘導された。それに反して、活性化Ｔｈ２細胞は、ガレクチン−９誘導細胞死に耐性を示した（図１３）。ＡＥ７（Ｔｈ１細胞株）およびＤ１０Ｇ４（Ｔｈ２細胞株）に対して行ったさらなる実験は、インビボでの組換えガレクチン−９によって誘導された類似の細胞死効果を証明した。
（実施例２１．組換えガレクチン−９はＴｈ１細胞活性化を弱める）
Ｔｈ１免疫応答中のガレクチン−９とＴＩＭ−３との相互作用のインビボ効果を決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、ＭＯＧ３５−５５を含むフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）で免疫化した。組換えガレクチン−９（１００μｇ）を、３日目から９日目まで免疫化マウスにｉ．ｐ．注射した。細胞増殖およびサイトカイン産生アッセイのために、脾細胞を採取した。しかし、ＰＢＳ処置コントロール群と比較して、ガレクチン−９投与は３Ｈチミジン組み込みによって脾細胞増殖を変化させないが、ＥＬＩＳＡの結果は、５０％を超えるＩＦＮ−γ産生の減少を示した。ＥＬＩＳＰＯＴは、ガレクチン−９処置脾臓由来のより少ない細胞がＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を産生することをさらに証明した。興味深いことに、ＰＢＳ処置マウスと比較して、ＩＬ−４およびＩＬ−５産生は変化しなかった（図１４）。
（実施例２２．ＥＡＥ処置におけるガレクチン−９−ＴＩＭ−３の治療効果）
ＴＩＭ−３は、Ｔｈ１細胞応答および末梢性寛容の調節において重要な機能を有することが証明されている。その発現は、ＥＡＥおよびヒト多発性硬化症（ＭＳ）の病理学と相関する。興味深いことに、星状細胞におけるガレクチン−９の発現は、ＩＬ−１βによって誘導され、このタンパク質がＣＮＳにおける炎症の制限に関与し得ることを示す（Ｙｏｓｈｉｄａｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ １２：３７５５−３７５８）。ＴＩＭ３−ＴＩＭ−３リガンド相互作用がＴｈ１応答を調節して免疫寛容を促進することができるので、これらの機能がＴＩＭ−３−ガレクチン−９の相互作用によって媒介されることが可能である。この可能性に取り組むために、組換えガレクチン−９を、ＭＯＧペプチド３５−５５／ＣＦＡ免疫化Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに免疫化した日から１日おきに投与する。疾患をモニタリングし、脳および脊髄を組織病理学的に試験する。ＴＩＭ−３の機能的リガンドとして、ガレクチン−９投与は、ＥＡＥの重症度を減少させるか、そして／またはＥＡＥに対する寛容を誘導すると予想される。コントロールとして、出願人は、Ｃ５７ＢＬ／６ＪバックグラウンドにおけるＴｉｍ−３−／−マウスも試験する。Ｔｉｍ−３欠損マウスはガレクチン−９投与の影響を受けないと予想される。
（Ｄ．第２の実験の考察）
Ｔｈ１またはＴｈ２経路へのＴｈ前駆体の拡大および分化は、細菌、ウイルス、自己抗原、および同種抗原の結果を調節する。これらのＴ細胞応答の範囲は、サイトカインおよび補助分子群（ＴＮＦ受容体（７）およびＩｇスーパーファミリー（８）が含まれる）の影響を受ける。ＴＩＭ−３は、Ｍｏｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（１０）によってＥＡＥにおける組織破壊免疫応答の負のレギュレーターとして最近同定された新規のＴｈ１特異的Ｉｇスーパーファミリーメンバーである。このモデルでは、抗ＴＩＭ−３ ｍＡｂ処置によってマクロファージの数および活性レベルならびに脳内組織の損傷の重症度を増加させた。これらの結果に基づいて、抗ＴＩＭ−３はＴｈ１細胞の脳への移動の強化またはＴＩＭ−３と推定阻害ＴＩＭ−３Ｌとの間の相互作用の遮断によってマクロファージを活性化することができることを提案した。
出願人は、活性化Ｔｈ１およびＴｈ２クローンの遺伝子発現プロフィールの比較によってＴＩＭ−３を同定し、出願人は、自己免疫モデルおよび同種免疫モデルにおいてＴＩＭ−３がＴｈ１媒介応答の制限で重要な役割を果たすこと、およびこれらの効果がＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞集団の免疫抑制機能の調整によって少なくとも一部が媒介されるようであるということを報告する。
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞は、自己寛容の維持（３６〜３８）および同種移植片の長期許容（１２、３４、３５）で中心的役割を果たす。その正確な作用機構は依然として定義されていないが、細胞−細胞接触相互作用および可溶性因子がその免疫抑制機能に関与する（３９、４０）。本発明者らの結果は、ＴＩＭ−３はこれらのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が免疫抑制効果を送達する分子経路ではないことを示し、これは、ナイーブまたは寛容宿主由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞はインビボおよびインビトロの両方におけるＴＩＭ−３の有効な発現を欠くＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を強く抑制することができる（図９Ｂ）。しかし、ＴＩＭ−３／ＴＩＭ−３Ｌ感受性経路は、ＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４処置などの寛容治療薬の投与後に出現するドナー特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞の機能的生成を担う（図９Ｄ）。したがって、ＴＩＭ−３依存性経路および非依存性経路は共にＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞依存性免疫調節に関与する。
ＴＩＭ−３およびそのリガンドを含む正確な細胞および分子の相互作用は依然として完全に解明されていないにもかかわらず、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−３Ｌで認められる発現パターン（図８Ａ〜Ｄ）により、ＴＩＭ−３陽性Ｔｈ１エフェクター細胞とＴＩＭ−３Ｌ陽性調節Ｔ細胞との間の直接相互作用は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が増強された免疫抑制機能を獲得する機構を構成し得ることが示唆される。あるいは、ＴＩＭ−３Ｌ発現がいくつかの樹状細胞でも認められると仮定すると、調節Ｔ細胞に対するＴＩＭ−３の効果を、ＡＰＣの介入によって直接発揮することができる。この最後の解釈は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞媒介免疫調節の調整における樹状細胞表現型の役割に関する所見と一致するであろう（４１、４２）。最後に、ＴＩＭ−３がライゲーション時にｓｒｃキナーゼを漸増することができ、それによって下流シグナル伝達事象に影響を与えることができるという事実は、ＴＩＭ−３ライゲーションはＴｈ１細胞自体に対して直接阻害シグナルも発揮することができることを示す。それにもかかわらず、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置移植レシピエントの脾臓におけるＩＬ−２およびγＩＦＮ産生エフェクターＴ細胞の頻度が有意に増加しないことにより、移植においてＴＩＭ−３がエフェクターＴ細胞集団よりも調節に対して強力な効果を示すことが示唆される。
本発明者らの所見は、ＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４が移植における寛容の誘導を促進する機構に新規の洞察をもたらす。抗ＣＤ１５４誘導免疫抑制環境における宿主Ｔ細胞への同種抗原の提供により、アネルギーおよび／またはアポトーシスによって同種反応性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球が直接不活化され、その後寛容状態を自己永続することができる調節Ｔ細胞の発現を促進すると現在理解されている（１１〜１３、２８、４３）。出願人は、ポリクローナル系においてＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４が主に同種抗原特異的様式でＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の免疫抑制機能の増加によって作用する一方で、エフェクターＴ細胞集団の同種移植片を拒絶する能力に対する処置の効果はあまり強力ではないことを示す証拠を提供する。
ＣＤ４０−ＣＤ１５４同時刺激を行わない同種抗原を使用した以前の偶然によってこれらのＴＩＭ−３感受性免疫調節網が誘導される機構が推定される。同種ペプチドを認識することができる調節Ｔ細胞クローンは選択的増殖を受け（４４、４５）、そして／またはより有効な免疫抑制機能を獲得し、それにより、ドナー特異的免疫調節回路強化される。実際、本発明者らのモデルにおけるＤＳＴ単剤療法の効果の欠如により、エフェクターＴ細胞のアポトーシスおよびアネルギーを促進することが公知のＣＤ１５４遮断（１３、４３）が調節Ｔ細胞の機能および生存を許容するかさらに増強することが示唆される。あるいは、ＣＤ４０−ＣＤ１５４同時刺激遮断は常在ＡＰＣの表現型を調整し、それにより活性化されたナイーブドナー反応性Ｔ細胞の免疫調節区画に漸増させることができる。興味深いことに、ＡＰＣ上のＣＤ４０発現の欠如は、いくつかの場合、ＣＤ４＋調節Ｔ細胞の生成（４９）によって抗原特異的寛容を促進すると報告されている（４６〜４９）。したがって、本発明者らの所見に基づいて、出願人は、ＣＤ４０およびＴＩＭ−３は拮抗作用を有し、そのバランスは寛容と免疫の決定のチェックポイントとして役立つと推測する。免疫寛容を促進するＴＩＭ−３／ＴＩＭ−３Ｌ経路の重要性は、ＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４が移植免疫寛容を達成する機構に排他的に制限されない。実際、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−ＩｇがＣＴＬＡ４Ｉｇ処置後に寛容誘導を無効にするという本発明者らの所見に基づいて（図９Ｄ）、出願人は、ＴＩＭ−３はＴｈ１媒介免疫応答の調節および免疫寛容の発生の促進で基本的役割を果たすと結論づけることができる。
要するに、出願人は、ＩｇスーパーファミリーメンバーであるＴＩＭ−３が積極的なＴｈ１媒介自己免疫応答および同種免疫応答を阻害するように機能することを記載している。これらの効果は、少なくとも一部が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞の免疫抑制効力の調節を媒介するようである。したがって、Ｔｈ１細胞上のＴＩＭ−３発現は、炎症性Ｔｈ１依存性Ｔ細胞応答を弱めて関連組織損傷を制限する働きをする重要なチェックポイントを提供する。
（Ｅ．参考文献）
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 （等価物）
当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を理解し、または確認し得る。このような等価物は、特許請求の範囲により包含されることが意図される。種々の出版物が、本出願を通して引用される。これらの出版物の内容は、本明細書により参考として本出願に援用される。
（配列表）
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図１は、Ｔｉｍ−３の選択的スプライシングを行った可溶性形態の同定を示す。（ａ）Ｔｉｍ−３の全長形態および選択的スプライシングを行った形態を、コンカナバリンＡ刺激脾細胞から生成したｃＤＮＡから増幅させた。プライマーをＴｉｍ−３遺伝子の５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ中にデザインし、ＲＴ−ＰＣＲに供した。産物を１．２％アガロースゲルで分離し、臭化エチジウムを使用して視覚化した（レーン１）。８００ｂｐおよび１ｋｂのアンプリコンをｐＥＦベクターにクローン化した（レーン２および３）。クローニングを確認するために、プラスミドＤＮＡをＳｍａＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。ローディング色素で反応を終了させ、１．２％アガロースゲルで泳動し、臭化エチジウムで視覚化した（レーン２および３）。１ｋｂまたは８００ｂｐのインサートを含むクローンを配列決定した。レーン１：Ｔｉｍ−３−ＦプライマーおよびＴｉｍ−３−Ｒプライマーを使用したＰＣＲによって増幅したｃｏｎ−Ａ活性化脾細胞ｃＤＮＡ；レーン２：１ｋｂのクローン化産物（ｆｌ−Ｔｉｍ−３）；レーン３：８００ｂｐのクローン化産物（ｓ−Ｔｉｍ−３）。 図１は、Ｔｉｍ−３の選択的スプライシングを行った可溶性形態の同定を示す。（ｂ）シグナルペプチド、ＩｇＶ、ムチン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインからなるＴｉｍ−３（ｆｌ−Ｔｉｍ−３）の全長形態に一致する１ｋｂアンプリコン由来のヌクレオチド配列の推定アミノ酸翻訳。８００ｂｐのアンプリコン由来のヌクレオチド配列のアミノ酸翻訳とｆｌ−Ｔｉｍ−３とのアラインメントにより、シグナルペプチド、ＩｇＶ、および細胞質ドメインのみを含む新規のイソ型（ｓ−Ｔｉｍ−３）が証明された。 図１は、Ｔｉｍ−３の選択的スプライシングを行った可溶性形態の同定を示す。（ｃ）Ｔｉｍ−３遺伝子構造ならびにｆｌ−Ｔｉｍ−３およびｓ−Ｔｉｍ−３に対応する選択的スプライシングを行った転写物の略図。マウスＴｉｍ−３遺伝子は、７つのエクソンからなる。ｆｌ−Ｔｉｍ−３転写物は、全７エクソンから構成される。対照的に、ｓ−Ｔｉｍ−３転写物は、エクソン１、エクソン２、エクソン６、およびエクソン７から構成される。転写物のコード領域シグナルペプチド、ＩｇＶ、ムチン、膜貫通（ｔｍ）、および細胞質ドメインを示す。 図２は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上でＴｉｍ−３−リガンドが発現されることを示す。（ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の全脾細胞をＣＤ４＋カラムで精製し、ＣＤ４発現について染色およびゲーティングし、種々の細胞表面マーカー（ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＢ、およびＣＤ５４）について同時染色した。細胞を、ビオチン化ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇまたはｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇを使用してＴｉｍ−３−Ｉｇについて同時染色し、その後検出用二次試薬としてストレプトアビジン−ＰＥで染色した。細胞をＣＤ４＋および表面マーカー陽性または陰性集団に対してゲーティングした。説明：（破線）ｈＩｇＧ；（太い実線）ｓ−Ｔｉｍ−３；および（点線）ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ。 図２は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上でＴｉｍ−３−リガンドが発現されることを示す。（ｂ）Ｔｈ１（ＡＥ７）およびＴｈ２（ＬＲ１Ｆ１）クローンを、ビオチン化ｓ−Ｔｉｍ−３−ＩｇまたはｈＩｇＧで染色し、その後ストレプトアビジン−ＰＥで染色した。細胞を、静止細胞（０日目）、活性化から４日後の活性化細胞（４日目）、および活性化から１０日後の静止細胞（１０日目）として染色した。説明：（破線）ｈＩｇＧ；（太い実線）ｓ−Ｔｉｍ−３。 図３は、Ｔｉｍ−３−Ｉｇの投与によってＴｈ１サイトカインの過剰増殖および自発的産生が誘導されることを示す。（ａ）ＳＪＬ／Ｊマウスを、ＰＬＰ １３９−１５１／ＣＦＡで免疫化し、０〜８日目まで１００μｇのｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇもしくはｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ、またはコントロールとしてｈＩｇＧ（１００μｇ）もしくはＰＢＳ（１００μｌ）を１日おきに腹腔内注射した。１０日目にマウスを屠殺し、脾臓を取り出し、ペプチドで再刺激することなくインビトロで４８時間培養した。４８時間後に３Ｈ−チミジン組み込みによって３連のウェルにおける増殖を測定した。４８時間後に上清を採取し、サイトカインＥＬＩＳＡで使用した；ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生を示す；ＩＬ−４、ＩＬ−１０、またはＴＮＦ−αは検出されなかった。各マウスの増殖についての１０実験の代表およびサイトカインについての５実験の代表についてのデータを示す。 図３は、Ｔｉｍ−３−Ｉｇの投与によってＴｈ１サイトカインの過剰増殖および自発的産生が誘導されることを示す。（ｂ）１０日目の免疫化融合タンパク質処置マウスから採取した脾細胞を、０〜１００μｇのＰＬＰ １３１−１５１ペプチドにてインビトロで刺激した。４８時間後に３Ｈ−チミジン組み込みによって３連のウェルにおける増殖を測定した。４８時間後にＰＬＰ １３９−１５１ペプチドで再刺激した全脾細胞のインビトロ培養物から上清を採取し、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、およびＩＮＦ−γについてのサイトカインＥＬＩＳＡを行った。ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生を示す；ＩＬ−４、ＩＬ−１０、またはＴＮＦ−αは検出されなかった。説明：▲、ＰＢＳ処置；■、ｈＩｇＧ処置；●、ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置；および○、ｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ処置。各マウスの増殖についての１０実験の代表およびサイトカインについての５実験の代表についてのデータを示す。 図４は、同時過剰増殖およびサイトカイン放出がＴ細胞によって媒介されることを示す。（ａ）ＳＪＬ／Ｊマウスを、ＰＬＰ １３９−１５１／ＣＦＡで免疫化し、１００μｇのｅｘ−Ｔｉｍ−３−ＩｇまたはコントロールとしてのｈＩｇＧにて腹腔内で処置し（０〜８日間１日おき）、１０日目に屠殺した。Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＣＤ１１ｂ＋細胞を、脾臓から精製した。全脾細胞（５×１０５個）またはＴ細胞（１０５個）のいずれかを、２×１０５個のＢ細胞、２×１０５個のＣＤ１１ｂ＋細胞、またはその両方のいずれかの存在下または非存在下でインキュベートし、増殖応答を測定した（３連のウェルにおける３Ｈ−チミジン組み込み）。結果を、４匹のマウスの組み合わせ（３つの各実験）の平均として示す。 図４は、同時過剰増殖およびサイトカイン放出がＴ細胞によって媒介されることを示す。（ｂ）４８時間後に（ａ）に記載のインビトロ培養物から上清を採取し、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、およびＩＮＦ−γについてのサイトカインＥＬＩＳＡを行った。ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生を示す；ＩＬ−４、ＩＬ−１０、またはＴＮＦ−αは検出されなかった。結果を、４匹のマウスの組み合わせの平均として示す。 図４は、同時過剰増殖およびサイトカイン放出がＴ細胞によって媒介されることを示す。（ｃ）ＳＪＬ／ＪマウスをＰＬＰ １３９−１５１／ＣＦＡで免疫化し、１００μｇのｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ、ｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ、またはコントロールとしてのｈＩｇＧで０〜８日間１日おきに腹腔内に投与し、１０日目に脾細胞を採取した。全脾細胞（５×１０５〜１０６細胞）を、１０μＭ ＢｒｄＵと共にインビトロで培養した。４８時間後、細胞をＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ６９、およびＢｒｄＵに対するｍＡｂで染色した。ドットプロット（対数目盛）は、細胞集団およびＢｒｄＵ取り込みを示す。結果は、各マウスの４実験の代表である。 図５は、インビボでのＴｉｍ−３−Ｉｇ処置によって寛容の誘導が阻害されることを示す。ＳＪＬ／Ｊマウスを、ＰＬＰ １３９−１５１／ＣＦＡで免疫化し、同時に寛容を誘導するために５００ｍｇの可溶性ＰＬＰ １３９−１５１（またはコントロール賦形剤としてのＰＢＳ）を腹腔内注射した。マウスを、０〜８日目まで１００ｍｇのｅｘ−Ｔｉｍ−３−ＩｇまたはコントロールとしてのｈＩｇＧを１日おきに腹腔内注射した。１０日目にマウスを屠殺し、リンパ節を採取し、細胞（２×１０５／ウェル）を漸増濃度のＰＬＰ １３９−１５１ペプチド（データは１００ｍｇ／ｍｌのＰＬＰ １３９−１５１を示す。）と共にインビトロで培養した。４８時間後に３Ｈ−チミジン組み込みによって３連のウェルにおける増殖を測定した。４８時間後にインビトロ培養物から上清を採取し、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＮＦ−ｇについてのサイトカインＥＬＩＳＡを行った。スチューデントｔ検定によってＰ値を得た。説明：† 非寛容化（ＰＢＳ）ｈＩｇＧ群を寛容化（ＰＬＰ）ｈＩｇＧ群と比較した場合、Ｐ＜０．０１。￥ 寛容化（ＰＬＰ）ｈＩｇＧ群を寛容化（ＰＬＰ）Ｔｉｍ−３−Ｉｇ群と比較した場合、Ｐ＜０．０１。‡非寛容化（ＰＢＳ）ｈＩｇＧ群を寛容化（ＰＬＰ）ｈＩｇＧ群と比較した場合、Ｐ＜０．０１。■寛容化（ＰＬＰ）ｈＩｇＧ群を寛容化（ＰＬＰ）Ｔｉｍ−３−Ｉｇ群と比較した場合、Ｐ＜０．０５。§非寛容化（ＰＢＳ）ｈＩｇＧ群を寛容化（ＰＬＰ）ｈＩｇＧ群と比較した場合、Ｐ＜０．５。■寛容化（ＰＬＰ）ｈＩｇＧ群を寛容化（ＰＬＰ）Ｔｉｍ−３−Ｉｇ群と比較した場合、Ｐ＜０．１。 図６は、Ｔｉｍ−３−Ｉｇの投与によって寛容の誘導が防止されることを示す。（ａ）ＳＪＬ／Ｊマウスを、ＰＬＰ １３９−１５１／ＣＦＡで免疫化し、同時に寛容を誘導するために５００μｇの可溶性ＰＬＰ １３９−１５１（またはコントロール賦形剤としてのＰＢＳ）を腹腔内注射した。マウスを、０〜８日目まで１００μｇのｅｘ−Ｔｉｍ−３−ＩｇまたはコントロールとしてのＰＢＳ（１００μｌ）もしくはｈＩｇＧ（１００μｇ）を１日おきに腹腔内注射した。１０日目にマウスを屠殺し、脾臓を採取し、細胞（５×１０５／ウェル）を漸増濃度のＰＬＰ １３９−１５１ペプチドと共にインビトロで培養した。４８時間後に３Ｈ−チミジン組み込みによって３連のウェルにおける増殖を測定した。マウスに寛容原としてＰＢＳを投与し、△：ＰＢＳ、□：ｈＩｇＧ、および○：ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇで処置した。マウスに寛容原としてＰＬＰを投与し、▲：ＰＢＳ、■：ｈＩｇＧ、および●：ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇで処置した。２つのマウス／処置群の平均を示す。 図６は、Ｔｉｍ−３−Ｉｇの投与によって寛容の誘導が防止されることを示す。（ｂ）４８時間後に（ａ）に記載のインビトロ培養物から上清を採取し、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、およびＩＮＦ−γについてのサイトカインＥＬＩＳＡを行った。記号は、（ａ）と同様である。２つのマウス／処置群の平均を示す。 図７は、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−３Ｌの発現を示す。（ａ）ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ、より有意には短縮ｓ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇ融合タンパク質は、静止ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｃ＋の一部に結合するが、ＣＤ１１ｂ＋、Ｂ２２０＋、またはＣＤ８＋Ｔ細胞に結合しない。アイソタイプコントロール染色を黒塗りのヒストグラムで示し、白抜きのヒストグラムはｅｘ−ＴＩＭ−３−Ｆｃ（点線）およびｓ−ＴＩＭ−３−Ｉｇ（実線）との結合を示す。（ｂ）インビトロ刺激後にＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞はＴＩＭ−３Ｌを下方制御するが、調節ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は下方制御しない。ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は共に、静止状態でｓ−ＴＩＭ−３−Ｉｇに結合する（上のパネル）。抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、およびｒＩＬ−２でのインビトロ刺激から２４時間後にＴＩＭ−３Ｌ発現の変化は認められない一方で（中央のパネル）、４８時間後のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞においてのみＴＩＭ−３Ｌが検出される。アイソタイプコントロール染色を黒塗りのヒストグラムで示し、白抜きのヒストグラムは、ｓ−ＴＩＭ−３−Ｉｇとの結合を示す。この図中に示すデータは、３つの独立した実験の代表である。 図８は、ＴＩＭ−３がＭＨＣ不適合島同種移植片モデルにおけるＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４処置の寛容化効果に寄与することを示す。（ａ）ＴＩＭ−３およびＩＦＮ−γ遺伝子転写物は拒絶において上方制御されるが、長期生存島同種移植片においては上方制御されない。データを、標的サンプルと標準物質（単離島）との間の相対相違の倍率として示す。プロットした値は、４つの独立した実験から得た平均＋／−ＳＥを示す。 図８は、ＴＩＭ−３がＭＨＣ不適合島同種移植片モデルにおけるＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４処置の寛容化効果に寄与することを示す。（ｂ）ｅｘ−Ｔｉｍ−３−ＩｇのＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４との同時投与により、島同種移植片に対する移植免疫寛容の誘導が防止される。 図８は、ＴＩＭ−３がＭＨＣ不適合島同種移植片モデルにおけるＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４処置の寛容化効果に寄与することを示す。（ｃ）ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇの投与により、ＣＴＬＡ４Ｉｇの寛容促進能力が有意に減少する。 図９は、ＴＩＭ−３がＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞に対するＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４処置の同種抗原特異的効果を調整することを示す。（ａ）ＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４投与前のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の枯渇により、島同種移植が急速に拒絶される。ＭＳＴ＝生存期間の中央値（日）。 図９は、ＴＩＭ−３がＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞に対するＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４処置の同種抗原特異的効果を調整することを示す。（ｂ）ｅｘ−Ｔｉｍ−３−Ｉｇは、移植時に投与した場合に、養子免疫伝達皮膚同種移植片モデルにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を抑制するＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞の能力を妨害しない。 図９は、ＴＩＭ−３がＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞に対するＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４処置の同種抗原特異的効果を調整することを示す。（ｃ）ナイーブまたはＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４処置マウス由来の１×１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞により、皮膚同種移植片拒絶が急速に誘導される（左のパネル）。ナイーブ宿主から採取したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞およびＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４処置マウスから得たＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は共に、高い調節Ｔ細胞：エフェクターＴ細胞比で養子免疫伝達された場合に、皮膚同種移植片拒絶を防止することができる（４×１０５：１×１０５；中央のパネル）。処置マウスから採取されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のみが、同数のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞と共に伝達された場合に有意な移植片保護効果を発揮する（４×１０５：４×１０５；右のパネル）。中央および右のパネルでは、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、ナイーブ未処置マウスのみに由来する。 図９は、ＴＩＭ−３がＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞に対するＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４処置の同種抗原特異的効果を調整することを示す。（ｄ）ｅｘ−Ｔｉｍ−３−ＩｇのＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４抗体との同時投与により、ＤＳＴ＋抗ＣＤ１５４処置によってＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞に付与された増強免疫抑制効果が消失する（ナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞群を、統計的比較のためのベースラインとして使用する）。ＭＳＴ＝生存期間の中央値（日）。 図１０は、ＴＩＭ−３結合タンパク質としてのガレクチン−９の同定を示す。（ａ）ＴＫ−１細胞は、最も高レベルのＴＩＭ−３リガンドを発現する。３つのＴ細胞株であるＴＫ−１、Ｓ４９．１Ｇ．３ＰＨＡ １００／０、およびＢＷ１５４７．Ｇ．１．４を、２０倍希釈および５０倍希釈のビオチン化ｓＴＩＭ−３−Ｉｇ（０．４ｍｇ／ｍｌ）で染色し、抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ−ＰＥによってＴＩＭ−３リガンド発現を検出した。全Ｔ細胞株がＴＩＭ−３融合ＦＡＣＳ分析によって陽性染色され、同時に９０％までのＴＫ−１がｆｌＴＩＭ−３−ＩｇおよびｓＴＩＭ−３−Ｉｇの両方によって陽性染色された。 図１０は、ＴＩＭ−３結合タンパク質としてのガレクチン−９の同定を示す。（ｂ）破壊（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）アッセイによる３５ｋＤタンパク質とＴＩＭ−３との間の特異的相互作用の証明。生きたＴＫ−１細胞上の細胞外膜結合タンパク質を、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．９）緩衝液によって室温でビオチン化した。１時間のインキュベーション後、ＤＭＥＭ培地によって反応を停止させた。ビオチン化ＴＫ−１細胞由来の細胞溶解物を、４℃での各５μｇ ｆｌＴＩＭ−３−Ｉｇ、ｓＴＩＭ−３−Ｉｇ、ＴＩＭ−２−Ｉｇ、およびｈＩｇＧ＋プロテインＧ−アガロースビーズとのインキュベーションによる破壊実験で使用した。ビーズから溶離されたタンパク質サンプルを、ＰＮＧアーゼＦで処置するか処置せずにＮ結合糖鎖を除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットに提供した。ビオチン化膜結合タンパク質由来のシグナルのみがアビジン抱合ペルオキシダーゼに結合し、化学発光シグナルによって検出された。 図１１は、ガレクチン−９とＴＩＭ−３との間の特異的相互作用を示す。（ａ）ガレクチン−９の標準的イソ型および長いイソ型（それぞれガレクチン−９およびガレクチン−９−Ｌ）は共にＴＩＭ−３に結合することができる。２つのガレクチン−９イソ型間のタンパク質配列は、ガレクチン−９−Ｌのヒンジ領域中の３１アミノ酸ペプチドインサート以外は同一である。ＴＫ−１細胞由来のガレクチン−９のイソ型についてのマウスｃＤＮＡを、真核生物バイシストロン性発現ベクターｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰにサブクローン化した。プラスミドを、それぞれＣＨＯ細胞に一過性にトランスフェクトした。細胞を、ｆｌＴＩＭ−３−Ｉｇ、ｓＴＩＭ−３−Ｉｇ、およびｈＩｇＧでの細胞内染色のために固定し、トランスフェクションから４８時間後に抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ−ＰＥによって検出した。ＦＡＣＳ分析におけるＥＧＦＰ陽性シグナルは、トランスフェクトされた細胞を示した。抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ−ＰＥを使用して、Ｉｇ融合またはｈＩｇＧ由来の結合を検出した。 図１１は、ガレクチン−９とＴＩＭ−３との間の特異的相互作用を示す。（ｂ）ガレクチン−９、−４、−３、および−１のマウスｃＤＮＡを、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰにサブクローン化した。各ｓ−ＴＩＭ−３−Ｉｇによる細胞内染色のために、プラスミドおよびＥＧＦＰのみを産生する空のベクターを、ＣＨＯに一過性にトランスフェクトした。抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ−ＰＥを使用して、ｓＴＩＭ−３−Ｉｇ結合を検出した。 図１１は、ガレクチン−９とＴＩＭ−３との間の特異的相互作用を示す。（ｃ）ガレクチン−９ ｃＤＮＡを、原核生物発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂにサブクローン化した。ＢＬ２１ Ｅ．ｃｏｌｉ株中で組換えガレクチン−９（ｒ−ガレクチン−９）が発現し、ラクトースアガロースカラムによって精製した。破壊実験のために、２μｇの精製ガレクチン−９を使用して、Ｉｇ融合タンパク質と共にインキュベートした。プロテインＧビーズ由来の溶離物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用し、クマシーブルーによって染色した。レーン１〜３は、それぞれｓＴＩＭ−３−Ｉｇ、ＴＩＭ−２−Ｉｇ、およびＴＩＭ−４−Ｉｇ、ならびにその捕捉タンパク質由来の溶離物を示す。レーン４〜６は、Ｉｇ融合タンパク質のみを示す。ｒ−ガレクチン−９の分子量は３８ｋＤである。 図１２は、ガレクチン−９がＴＩＭ−３のオリゴサッカリド鎖中のβ−ガラクトシド結合を認識することを示す。（ａ）ガレクチン−９発現プラスミドを、ＣＨＯ細胞に一過性にトランスフェクトし、ｓＴＩＭ−３−Ｉｇによる細胞内染色のために固定した。０〜１００ｍＭの異なる濃度のα−ラクトースを含むインキュベーション緩衝液を実験で使用した。ヒストグラム中のバーは、異なる濃度のα−ラクトースの存在下でのＥＧＦＰおよびｓＴＩＭ−３−Ｉｇ染色についての二重陽性細胞集団の比率を示す。 図１２は、ガレクチン−９がＴＩＭ−３のオリゴサッカリド鎖中のβ−ガラクトシド結合を認識することを示す。（ｂ）破壊実験において、０〜１００ｍＭの異なる濃度のα−ラクトースの存在下で、２μｇのｒ−ガレクチン−９を４μｇのｓＴＩＭ−３−Ｉｇと混合した。プロテインＧビーズ由来の溶離物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用し、クマシーブルーによって染色した。５０ｋＤのバンドはｓＴＩＭ−３−Ｉｇを示し、３８ｋＤのバンドはｒ−ガレクチン−９を示す。 図１２は、ガレクチン−９がＴＩＭ−３のオリゴサッカリド鎖中のβ−ガラクトシド結合を認識することを示す。（ｃ）ガレクチン−９中のＣＲＤドメインは、ＴＩＭ−３との相互作用が必要である。Ｎ末端ＣＲＤドメイン中のＲ６４Ａ変異、Ｃ末端ＣＲＤドメイン中のＲ２３８Ａ変異、またはその両方を有する構築物を生成し、発現ベクターｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰにサブクローン化した。ｓＴＩＭ−３−Ｉｇによる細胞内染色のために、ＣＨＯ細胞を、ｗｔおよび変異ガレクチン−９発現プラスミドによって一過性にトランスフェクトした。ガレクチン−９とｓＴＩＭ−３−Ｉｇとの間の相互作用についてのＥＧＦＰおよび抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ−ＰＥ二重陽性標準。 図１３は、ガレクチン−９が活性化マウスＴｈ１細胞のアポトーシスを誘導し、そのアポトーシス効果はＴＩＭ−３とのその相互作用に機能的に関連することを示す。（ａ）ＤＯ１１．１０トランスジェニックマウス由来の脾臓ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞は、少なくとも３ラウンドでインビトロでＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞に二分された。ＶＯＡペプチドおよびＡＰＣによる刺激から３日後のＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞を、ＰＢＳ、ガレクチン−３、および異なる用量のガレクチン−９で処置した。８時間後、アポトーシス細胞の検出のために、細胞を、ＰＩおよびアネキシン Ｖ−ＦＩＴＣで染色した。ＰＩ陽性集団（ＰＩ＋アネキシンＶ＋およびＰＩ＋アネキシンＶ−の両方）は死細胞または後期アポトーシス細胞である。ＰＩ＋アネキシンＶ＋集団は初期アポトーシス細胞であり、二重陰性集団はライフセル（ｌｉｆｅ ｃｅｌｌ）である。 図１３は、ガレクチン−９が活性化マウスＴｈ１細胞のアポトーシスを誘導し、そのアポトーシス効果はＴＩＭ−３とのその相互作用に機能的に関連することを示す。（ｂ）Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞をＰＢＳ、０．７５ｍＭガレクチン−９、０．７５ｍＭ ガレクチン−９で０、２、４、８、および１２時間処置した。ヌクレオソーム富化アッセイのために細胞を採取した。細胞溶解物の上清に放出された断片化ヌクレオソーム構造をアポトーシス手順によって誘導し、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒストンに対する抗体およびゲノムＤＮＡによって検出し、ＯＤ４０５ｎｍで読み取った。（ａ）と同様に、Ｔｈ２細胞は、ガレクチン−９由来のアポトーシス効果に耐性を示した。 図１４は、マウスへのガレクチン−９の投与によってＩＦＮ−ｇおよびＩＬ−２産生細胞が下方制御されてＩＦＮ−γおよびＩＬ−２産生が減少することを示す。しかし、この減少は、全脾細胞増殖に影響を与えない。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、１００−ｍｇ ＭＯＧ３５−５５ペプチド＋２００ｍｌ ＣＦＡで免疫化した。ｒ−ガレクチン−９を３日目から９日目まで毎日マウスに腹腔内注射した。マウスを屠殺し、細胞増殖アッセイ、ＥＬＩＳＡ、およびＥＬＩＳＰＯＴのために脾細胞を採取した。 図１４は、マウスへのガレクチン−９の投与によってＩＦＮ−ｇおよびＩＬ−２産生細胞が下方制御されてＩＦＮ−γおよびＩＬ−２産生が減少することを示す。しかし、この減少は、全脾細胞増殖に影響を与えない。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、１００−ｍｇ ＭＯＧ３５−５５ペプチド＋２００ｍｌ ＣＦＡで免疫化した。ｒ−ガレクチン−９を３日目から９日目まで毎日マウスに腹腔内注射した。マウスを屠殺し、細胞増殖アッセイ、ＥＬＩＳＡ、およびＥＬＩＳＰＯＴのために脾細胞を採取した。

Claims (101)

  1. ｔｉｍ−３ ＩｇＶドメインおよびｔｉｍ−３細胞内ドメインを含む単離ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、ｔｉｍ−３ムチンドメインまたはｔｉｍ−３膜貫通ドメインを含まない、単離ポリペプチド。
  2. 前記ポリペプチドが、ヒトポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記ポリペプチドが、マウスポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 前記ｔｉｍ−３ ＩｇＶドメインが、配列番号１３のアミノ酸２２〜１３１を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  5. 前記ｔｉｍ−３ ＩｇＶドメインが、配列番号１４のアミノ酸２２〜１３２を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  6. 前記ｔｉｍ−３細胞内ドメインが、配列番号１３のアミノ酸２２６〜３０１を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  7. 前記ｔｉｍ−３細胞内ドメインが、配列番号１４のアミノ酸２１７〜２８１を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  8. 配列番号２に示されるアミノ鎖配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  9. 配列番号６に示されるアミノ鎖配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  10. 配列番号４に示されるアミノ鎖配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  11. 前記ポリペプチドが、配列番号８に示されるアミノ酸配列をさらに含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  12. 免疫グロブリンのＦｃドメインをさらに含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  13. 請求項１に記載の単離ポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、組成物。
  14. 請求項１に記載のポリペプチドをコードする、単離核酸。
  15. 配列番号１に示される核酸配列を含む、請求項１４に記載の単離核酸。
  16. 配列番号３に示される核酸配列を含む、請求項１４に記載の単離核酸。
  17. 高ストリンジェンシー条件下で可溶性ｔｉｍ−３をコードする核酸にハイブリダイズするが、高ストリンジェンシー条件下で全長ｔｉｍ−３をコードする核酸にはハイブリダイズしない、単離核酸。
  18. 前記可溶性ｔｉｍ−３をコードする核酸が、配列番号１に示される核酸配列を含む、請求項１７に記載の単離核酸。
  19. 配列番号５に示される核酸配列を含む、請求項１８に記載の単離核酸。
  20. 前記全長ｔｉｍ−３をコードする核酸が、配列番号１１に示される核酸配列を含む、請求項１７に記載の単離核酸。
  21. 配列番号１５に示される核酸配列を含む、請求項１８に記載の単離核酸。
  22. 前記可溶性ｔｉｍ−３をコードする核酸が、配列番号３に示される核酸配列を含む、請求項１７に記載の単離核酸。
  23. 配列番号７に示される核酸配列を含む、請求項２２に記載の単離核酸。
  24. 前記全長ｔｉｍ−３をコードする核酸が、配列番号１２に示される核酸配列を含む、請求項１７に記載の単離核酸。
  25. 請求項１７に記載の単離核酸によってコードされる単離ポリペプチド。
  26. （ｉ）ｔｉｍ−３のＩｇＶドメインを含むポリペプチド、および（ｉｉ）増殖性状態の処置またはＴｈ２媒介状態の処置のための被験体への組成物の投与についての説明書を包含する、薬学的パッケージ。
  27. 前記増殖性状態が、腎細胞癌、カポジ肉腫、慢性白血病、前立腺癌、乳癌、肉腫、膵臓癌、白血病、卵巣癌、直腸癌、咽頭癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、リンパ腫、肥満細胞腫、肺癌、乳腺癌、咽頭扁平上皮細胞癌、精巣癌、ホジキンリンパ腫、消化管癌、または胃癌である、請求項２６に記載の薬学的パッケージ。
  28. （ｉ）ガレクチン−９ポリペプチドを含むポリペプチド、および（ｉｉ）自己免疫障害を処置するために、被験体へ組成物を投与するための説明書を備える、薬学的パッケージ。
  29. 配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合するが、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドには結合しない、単離抗体またはそのフラグメント。
  30. 前記抗体が、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項２９に記載の抗体。
  31. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２９に記載の抗体。
  32. 請求項３１に記載のモノクローナル抗体を分泌する、ハイブリドーマ細胞株。
  33. 配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合するが、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドには結合しない、単離抗体またはそのフラグメント。
  34. 前記抗体が、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項３３に記載の抗体。
  35. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３３に記載の抗体。
  36. 請求項３５に記載のモノクローナル抗体を分泌する、ハイブリドーマ細胞株。
  37. 免疫応答の調節を必要とする被験体の免疫応答を調節する方法であって、該被験体に治療有効量のｔｉｍ−３活性を調節する因子を投与する工程を包含する、方法。
  38. 免疫応答を調節する工程が、Ｔｈ１応答を増加させるかＴｈ２応答を減少させる工程を包含し、前記因子がｔｉｍ−３活性を減少させる、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記被験体が増殖性状態を罹患している、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記増殖性状態が、腎細胞癌、カポジ肉腫、慢性白血病、前立腺癌、乳癌、肉腫、膵臓癌、白血病、卵巣癌、直腸癌、咽頭癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、リンパ腫、肥満細胞腫、肺癌、乳腺癌、咽頭扁平上皮細胞癌、精巣癌、消化管癌、胃癌、ホジキンリンパ腫、またはこれらの組み合わせである、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記被験体がＴｈ２媒介性障害を罹患している、請求項３８に記載の方法。
  42. Ｔｈ２媒介性障害が、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、消化管アレルギー、食物アレルギー、好酸球増加症、結膜炎、または糸球体腎炎である、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記因子が、可溶性ｔｉｍ−３の発現を阻害する、請求項３８に記載の方法。
  44. 前記因子が、抗体またはそのフラグメントである、請求項３８に記載の方法。
  45. 前記抗体またはそのフラグメントが、ｔｉｍ−３に結合する、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記抗体またはそのフラグメントが、ｔｉｍ−３の細胞外ドメインに結合する、請求項４４に記載の方法。
  47. 前記因子が、配列番号１３のアミノ酸３０〜１２８を含むポリペプチドに結合する抗体または抗体フラグメントである、請求項４４に記載の方法。
  48. 前記因子が、ｔｉｍ−３へのガレクチン−９の結合を減少させる、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記因子が、
    （ｉ）配列番号１３のアミノ酸３０〜１２８；または
    （ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸３０〜１２８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、
    を含むポリペプチドを含む、請求項３８に記載の方法。
  50. 前記ポリペプチドが、ペグ化されている、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記ポリペプチドが、
    （ａ）ヒト血清アルブミン；または
    （ｂ）免疫グロブリンのＦｃドメイン
    を含む、請求項４９に記載の方法。
  52. 前記因子が、ｔｉｍ−３のＩｇＶドメイン、ｔｉｍ−３の細胞内ドメイン、および免疫グロブリンのＦｃドメインを含むポリペプチドを含むが、ｔｉｍ−３のムチンドメインまたはｔｉｍ−３の膜貫通ドメインを含むポリペプチドを含まない、請求項３８に記載の方法。
  53. 前記因子が、ｔｉｍ−３ポリペプチドまたはガレクチン−９ポリペプチドの発現レベルを減少させる、請求項３８に記載の方法。
  54. 前記因子が、二本鎖ＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記因子が、ガレクチン−９への全長ｔｉｍ−３の結合を阻害する、請求項３８に記載の方法。
  56. 前記因子が、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸３０〜１２８を含むポリペプチドの（ｉｉ）ガレクチン−９への結合を阻害する、請求項３８に記載の方法。
  57. ガレクチン−９が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. ガレクチン−９が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５６に記載の方法。
  59. 前記因子が、炭水化物を含む、請求項３９に記載の方法。
  60. 前記炭水化物が、ラクトースまたはβ−ガラクトシドである、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記因子が、グリコシル化ポリペプチドを含む、請求項５９に記載の方法。
  62. 前記因子が、ペクチンまたは修飾ペクチンを含む、請求項５９に記載の方法。
  63. 免疫応答を調節する工程が、Ｔｈ１応答を減少させるかＴｈ２応答を増加させる工程を包含し、前記因子がｔｉｍ−３活性を増加させる、請求項３７に記載の方法。
  64. 前記被験体が、自己免疫疾患を罹患している、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、橋本甲状腺炎、クローン病、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、胃炎、自己免疫性肝炎、溶血性貧血、自己免疫性血友病、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、糸球体腎炎、ギヤン−バレー症候群、乾癬、または重症筋無力症である、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記被験体が、移植片対宿主病（ＨＶＧＤ）を罹患している、請求項６３に記載の方法。
  67. 前記被験体が、器官移植レシピエントである、請求項６３に記載の方法。
  68. 前記因子が、抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドである、請求項６３に記載の方法。
  69. 前記抗体が、ｔｉｍ−３およびガレクチン−９に特異的な二重特異性抗体である、請求項６８に記載の方法。
  70. ｔｉｍ−３への前記因子の結合が、ｔｉｍ−３の細胞内ドメインのリン酸化を増加させる、請求項６３に記載の方法。
  71. 前記因子が、ｔｉｍ−３リガンドである、請求項６３に記載の方法。
  72. 全長ｔｉｍ−３への前記ｔｉｍ−３リガンドの結合が、ｔｉｍ−３の細胞内ドメインのリン酸化を増加させる、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記ｔｉｍ−３リガンドが、ガレクチン−９ポリペプチドを含む、請求項７１に記載の方法。
  74. 前記因子が、ガレクチン−９の２つの炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）の少なくとも１つを含むポリペプチドである、請求項６３に記載の方法。
  75. 前記ポリペプチドが、ガレクチン−９の２つのＣＲＤドメインを含む、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記因子が、配列番号１０または配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項６３に記載の方法。
  77. 前記ポリペプチドが、配列番号１０または配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記ポリペプチドが、配列番号１０または配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７６に記載の方法。
  79. ｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとの間の結合を調節する因子を同定する方法であって、以下：
    （ａ）試験因子の存在下でｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとを接触させる工程；および、
    （ｂ）該ｔｉｍ−３ポリペプチドと該ガレクチン−９ポリペプチドとの結合に対する該試験因子の効果を決定する工程；
    を包含し、それにより、ｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとの間の結合を調節する因子を同定する、方法。
  80. 免疫応答を調節する因子を同定する方法であって、以下：
    （ａ）試験因子の存在下でｔｉｍ−３ポリペプチドとガレクチン−９ポリペプチドとを接触させる工程；および
    （ｂ）該ｔｉｍ−３ポリペプチドと該ガレクチン−９ポリペプチドとの結合に対する該試験因子の効果を決定する工程；
    を包含し、それにより、免疫応答を調節する因子を同定する、方法。
  81. 工程（ｂ）が、試験因子の存在下でのｔｉｍ−３／ガレクチン−９複合体の形成を、適切なコントロールと比較する工程を包含する、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記適切なコントロールが、前記試験因子の非存在下での第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の複合体の形成を含む、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記因子が、ｔｉｍ−３とガレクチン−９との間の結合を増加させる、請求項８０に記載の方法。
  84. 前記因子が、ｔｉｍ−３とガレクチン−９との間の結合を減少させる、請求項８０に記載の方法。
  85. 前記因子が、低分子化合物、抗体、またはポリペプチドである、請求項８０に記載の方法。
  86. 前記ｔｉｍ−３ポリペプチド、前記ガレクチン−９ポリペプチド、またはその両方が細胞内で発現する、請求項８０に記載の方法。
  87. 前記複合体の形成を検出する工程が、レポーター遺伝子の発現を検出する工程を包含し、該レポーター遺伝子の発現が該複合体の形成に依存する、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記ｔｉｍ−３ポリペプチド、前記ガレクチン−９ポリペプチド、またはその両方が、蛍光分子で標識されている、請求項８０に記載の方法。
  89. 前記ガレクチン−９ポリペプチドが、
    （ｉ）配列番号１０のアミノ酸１〜３２３、
    （ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸１〜３５５、
    （ｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸１〜３２３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、または
    （ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸１〜３５５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、
    を含む、請求項８０に記載の方法。
  90. 前記ｔｉｍ−３ポリペプチドが、
    （ｉ）配列番号１３のアミノ酸３０〜１２８、または
    （ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸３０〜１２８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、
    を含む、請求項８０に記載の方法。
  91. 前記免疫応答が、Ｔｈ１免疫応答である、請求項８０に記載の方法。
  92. 前記免疫応答が、Ｔｈ２免疫応答である、請求項８０に記載の方法。
  93. 薬物発見ビジネスを実施する方法であって、以下：
    （ａ）ｔｉｍ−３とガレクチン−９との間の結合に影響を及ぼす化合物を同定する工程；
    （ｂ）動物における有効性および毒性について、工程（ａ）で同定された化合物またはそのさらなるアナログの治療プロファイリングを行う工程；および、
    （ｃ）工程（ｂ）で許容可能な治療プロフィールを有すると同定された１つ以上の化合物を含む薬学的調製物を処方する工程；
    を包含する、方法。
  94. 薬物発見ビジネスを実施する方法であって、以下：
    （ａ）ｔｉｍ−３とガレクチン−９との間の結合に影響を及ぼす化合物を同定する工程；
    （ｂ）動物における有効性および毒性について工程（ａ）で同定された化合物またはそのさらなるアナログの治療プロファイリングを必要に応じて行う工程；ならびに、
    （ｃ）工程（ａ）で同定された化合物またはそのアナログに関するさらなる薬物の開発および／または販売に対する権利を第三者に供与する工程；
    を包含する、方法。
  95. 前記工程（ａ）で同定された化合物またはそのアナログの販売に基づいて特許権使用料を徴収する工程をさらに包含する、請求項８４に記載の方法。
  96. 可溶性ｔｉｍ−３を発現する細胞を、可溶性ｔｉｍ−３の発現を減少させるのに十分な量の二本鎖ＲＮＡと接触させる工程を包含する、ｔｉｍ−３活性を増加させる方法であって、該二本鎖ＲＮＡが、該細胞中の全長ｔｉｍ−３の発現を阻害せず、それによりｔｉｍ−３活性を増加させる、方法。
  97. 前記二本鎖ＲＮＡが、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１を含む核酸とハイブリダイズするが、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１１を含む核酸とはハイブリダイズしない、請求項９６に記載の方法。
  98. 前記二本鎖ＲＮＡが、配列番号１５に示される核酸配列を含む、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記二本鎖ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡである、請求項９６に記載の方法。
  100. 前記接触させる工程が、被験体への前記二本鎖ＲＮＡの投与によって達成される、請求項９６に記載の方法。
  101. 可溶性ｔｉｍ−３をコードする核酸の存在を検出する工程を包含する、可溶性ｔｉｍ−３遺伝子発現を検出する方法であって、該可溶性ｔｉｍ−３をコードする核酸の検出が、可溶性ｔｉｍ−３遺伝子発現を示す、方法。
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