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JP2008544744A - 抗生物質耐性に対し感受性でない抗生物質の同定のための新規標的 - Google Patents

抗生物質耐性に対し感受性でない抗生物質の同定のための新規標的 Download PDF

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JP2008544744A
JP2008544744A JP2008511376A JP2008511376A JP2008544744A JP 2008544744 A JP2008544744 A JP 2008544744A JP 2008511376 A JP2008511376 A JP 2008511376A JP 2008511376 A JP2008511376 A JP 2008511376A JP 2008544744 A JP2008544744 A JP 2008544744A
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nucleic acid
seq
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rrna
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Application number
JP2008511376A
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Inventor
カニンガム，フイリツプ・アール
Original Assignee
ウエイン・ステイト・ユニバーシテイ
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
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Abstract

１６Ｓ ｒＲＮＡの保存されたおよび変動可能な領域を同定するために、即時進化実験を１６Ｓ ｒＲＮＡ全体で実施した。これらの変異体の分析は機能に必要とされる領域を同定した。これらの保存された配列は、分類学的に特異的でありかつ薬使用物質耐性の発生に不応性である医薬品の標的として使用しうる。

Description

関連出願
本出願は、２００５年５月１１日出願の米国特許出願第６０／６８０，１３８号および２００５年８月２５日出願の米国特許出願第６０／７１１，４９２号（これらの双方の内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）に対する優先権を主張する。
抗生物質耐性細菌の増大する出現は世界的な問題である。［非特許文献１］抗生物質耐性細菌は１９９６年に全世界で１７００万例の死亡の原因であり、米国単独で推定費用は３００億ドルである。［非特許文献２］大製薬企業による新たな研究のための資金提供は、新たな抗菌薬の開発がそうであったように堅調に減少している。さらに、新たな分類の抗菌薬に対する耐性の急速な出現が臨床設定でのそれらの使用を制限している。これらの傾向は、継続される場合、この先ずっと細菌感染症の大多数に対する有効な抗菌薬の欠如をもたらすであろう。
全部の現在使用されている治療薬に対する耐性の機構は決定されている。細菌耐性の数種の一般的機構が存在する。すなわち、１）抗生物質取り込みの低下、２）細胞からの抗生物質の輸送、３）抗生物質の酵素的不活性化、４）代替の代謝経路の使用、５）標的の過剰産生による抗生物質の滴定、および６）それがもはや抗生物質により認識されないような標的の改変。［非特許文献３］これらの機構のうち、標的の改変は新たに開発される抗生物質に対する耐性の最も一般的な機構である。抗生物質−標的結合の特異性は標的の構造ならびに配列を関わらせる。機能を遂げることなく標的の配列若しくは構造に影響を及ぼす突然変異は、抗生物質の結合を低下若しくは排除しかつ耐性をもたらしうる。例えば、アミノグリコシド抗生物質は細菌の１６ＳリボソームＲＮＡのＡ部位を標的としかつ翻訳エラー率を増大させる。［非特許文献４］単一のＡ１４０８Ｇ突然変異はリボソーム機能をおよそ３０％だけ低下させる（未発表の結果）が、しかし、ある種のアミノグリコシド抗生物質の結合を完全に破壊する。［非特許文献５］従って、機能を維持する特定のリボソーム領域の全部の可能な変異体に抗生物質の標的を定めることは、耐性のこの機構を排除するとみられる。
全部の天然に存在する抗生物質のほぼ半分は、タンパク質合成の一局面、およびより具体的にはリボソームを標的とする。７０Ｓの細菌のリボソームはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のタンパク質への翻訳を司る。リボソームの結晶構造および生化学的研究は、該ＲＮＡがリボソームの触媒的に活性の成分であり、従って該リボソームはリボザイムであることを示した。［非特許文献６；非特許文献７］タンパク質合成過程の該不可欠な性質はリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を理想的な薬物標的とする。
多数の異なる生物体からのｒＲＮＡ配列の研究は、リボソームの全体構造が生命の全３超界内で保存されていることを示した。ｒＲＮＡ配列の系統発生分析は、対形成相互作用およびヌクレオチド保存についての大量の情報を提供した。これらの分析のそれぞれは、しかしながらゲノム若しくはオルガネラのｒＲＮＡ配列を使用する。これらの配列はタンパク質合成におけるそれらの不可欠の役割により束縛される。結果として、機能上重要であると考えられるｒＲＮＡ領域中で配列の変動はほとんど若しくは全く観察されない。決定的に重要な残基の周囲の構造に対するわずかな変化でさえ、機能を低下させかつ忠実度に影響を及ぼしうるからである。加えて、これらの保存された部位は機能上重要よりはむしろ構造上重要でありうる。従って、これらの部位を標的とする薬物は、該配列が変異し得るがしかし機能的構造を維持し得る場合に耐性を見込むとみられる。理想的な薬物は、
標的部位の全部の可能な機能的突然変異を標的とすることができる。
Ｆａｕｃｉ，Ａ．Ｓ．、Ｔｏｕｃｈｅｔｔｅ，Ｎ．Ａ．とＦｏｌｋｅｒｓ，Ｇ．Ｋ．（２００５）．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ：ａ １０−ｙｅａｒ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １１、５１９−２５． Ｌｅｖｙ，Ｓ．Ｂ．とＭａｒｓｈａｌｌ，Ｂ．（２００４）．Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ：ｃａｕｓｅｓ，ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １０、Ｓ１２２−９． Ｌａｉｏｓ，Ｅ．、Ｗａｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．、Ｓａｙａｉｙａ，Ａ．Ａ．、Ｂａｋｅｒ，Ｋ．Ａ．、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｅ．、Ｐａｍａｒａｔｈｙ，Ｄ．とＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｐ．Ｒ．（２００４）．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｗ ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅｓ．Ａｒｃｈ Ｐａｔｈｏｌ Ｌａｂ Ｍｅｄ １２８、１３５１−９． Ｍａｇｎｅｔ，Ｓ．とＢｌａｎｃｈａｒｄ，Ｊ．Ｓ．（２００５）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ １０５、４７７−９８． Ｒｅｃｈｔ，Ｍ．Ｉ．、Ｄｏｕｔｈｗａｉｔｅ，Ｓ．、Ｄａｈｌｑｕｉｓｔ，Ｋ．Ｄ．とＰｕｇｌｉｓｉ，Ｊ．Ｄ．（１９９９）．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａ ｓｉｔｅ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｏｎ ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８６、３３−４３． Ｙｕｓｕｐｏｖ，Ｍ．Ｍ．、Ｙｕｓｕｐｏｖａ，Ｇ．Ｚ．、Ｂａｕｃｏｍ，Ａ．、Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｋ．、Ｅａｒｎｅｓｔ，Ｔ．Ｎ．、Ｃａｔｅ，Ｊ．Ｈ．とＮｏｌｌｅｒ，Ｈ．Ｆ．（２００１）．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ａｔ ５．５ Ａ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２、８８３−９６ Ｗｉｍｂｅｒｌｙ，Ｂ．Ｔ．、Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎ，Ｄ．Ｅ．、Ｃｌｅｍｏｎｓ，Ｗ．Ｍ．，Ｊｒ．、Ｍｏｒｇａｎ−Ｗａｒｒｅｎ，Ｒ．Ｊ．、Ｃａｒｔｅｒ，Ａ．Ｐ．、Ｖｏｎｒｈｅｉｎ，Ｃ．、Ｈａｒｔｓｃｈ，Ｔ．とＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｖ．（２０００）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ３０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｓｕｂｕｎｉｔ．Ｎａｔｕｒｅ ４０７、３２７−３９．
［発明の要約］
１６Ｓ ｒＲＮＡの保存されたおよび変動可能な領域を同定するため、無作為突然変異誘発実験を１６Ｓ ｒＲＮＡ全体で実施した。これらの変異体の分析は機能に必要とされる領域を同定した。これらの保存された配列を、分類上特異的でありかつ薬作用物質耐性の発生に不応性である医薬品の標的として使用しうる。
本発明の一局面は、式Ｉ：
Figure 2008544744
［式中、各存在について独立に、Ｔは、核酸配列、配列番号１〜６４、または配列番号１〜６４のいずれか１つに対する約８５％以上若しくはそれに等しい相同性をもつ配列よりなる群から選択され；Ｌは、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニン、テキサスレッドマレイミドおよびテトラメチルローダミンよりなる群から選択される１置換基で場合によっては置換されている、アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される核酸であり；ｎは１〜１１の間の整数であり；ならびにｍは０〜４０の間の整数である］
により表される核酸に関する。
本発明の別の局面は、式ＩＩ：
Figure 2008544744
［式中、各存在について独立に、Ｔは、配列番号３、１２、２３、５０および５１よりなる群から選択され；Ｌは、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニン、テキサスレッドマレイミドおよびテトラメチルローダミンよりなる群から選択される１置換基で場合によっては置換されている、アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される核酸であり；Ｚ１およびＺ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニンおよび樹脂ビーズよりなる群から選択され；ならびにｍおよびｎは０〜４０の間の整数である］
により表される核酸に関する。
本発明の別の局面は、式ＩＩＩ：
Figure 2008544744
［式中、各存在について独立に、Ｔ１およびＴ２は、配列番号１５、１６、３２、３４、３６、３７、４０、４１、５６、５７、６０および６１よりなる群から選択され；Ｌは、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニン、テキサスレッドマレイミドおよびテトラメチルローダミンよりなる群から選択される１置換基で場合によっては置換されている、アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される核酸であり；Ｚ１およびＺ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニンおよび樹脂ビーズよりなる群から選択され；ならびに、ｍ、ｎおよびｐは０〜４０の間の整数である］
により表される核酸である。
本発明の別の局面は、式ＶＩ：
Figure 2008544744
［式中、各存在について独立に、Ｔ１、Ｔ２およびＴ３は、配列番号７、１３、１４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３５、３８、３９、４２、６２、６３および６４よりなる群から選択され；Ｌは、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニン、テキサスレッドマレイミドおよびテトラメチルローダミンよりなる群から選択される１置換基で場合によっては置換されている、アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される核酸であり；Ｚ１およびＺ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニンおよび樹脂ビーズよりなる群から選択され；ならびに、ｍ、ｎ、ｐおよびｑは０〜４０の間の整数である］
により表される核酸に関する。
本発明の別の局面は、式Ｖ：
Figure 2008544744
［式中、各存在について独立に、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５は、配列番号４、８、９、１０、１１、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９よりなる群から選択され；Ｌは、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニン、テキサスレッドマレイミドおよびテトラメチルローダミンよりなる群から選択される１置換基で場合によっては置換されている、アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される核酸であり；Ｚ１およびＺ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニンおよび樹脂ビーズよりなる群から選択され；ならびに、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓは０〜４０の間の整数である］
により表される核酸に関する。
本発明の別の局面は、核酸の蛍光を測定してそれにより第一の蛍光示度を確立する段階；試験化合物を前記核酸と接触させる段階、および生じる蛍光を測定してそれにより第二の蛍光示度を確立する段階；前記第一の蛍光示度と前記第二の蛍光示度の間の差違を決定する段階；ならびに前記第一の蛍光示度と前記第二の蛍光示度の間の差違がゼロでない化合物を選択して、それにより作用物質を同定する段階を含んでなる、前述の核酸のいずれかに結合する作用物質の同定方法に関する。
ある態様において、本発明は、同定された作用物質を改変してそれにより改変された作用物質を形成する段階；ならびに、前記改変された作用物質を前記核酸と接触させる段階、および生じる蛍光を測定してそれにより改変された第二の蛍光示度を確立する段階；前記第一の蛍光示度と前記改変された第二の蛍光示度の間の差違を決定する段階；ならびに、前記第一の蛍光示度と前記第二の改変された蛍光示度の間の差違がゼロでない化合物を選択して、それにより改変された作用物質を同定する段階をさらに含んでなる、前述の方法に関する。
本発明の別の態様は、前述の核酸のいずれかの蛍光を測定してそれにより第一の蛍光示度を確立すること；試験化合物を前記核酸と接触させること、および生じる蛍光を測定してそれにより第二の蛍光示度を確立すること；前記第一の蛍光示度と前記第二の蛍光示度の間の差違を決定すること；前記第一の蛍光示度と前記第二の蛍光示度の間の差違がゼロでない化合物を選択して、それにより作用物質を同定すること；細胞、細胞抽出液若しくは精製されたリボソームにそれを投与することにより、該作用物質の阻害特性をアッセイすること；ならびにタンパク質合成を検出すること［ここで、タンパク質合成の減少は該作用物質がタンパク質合成の阻害剤であることを示す］を含んでなる、タンパク質合成の阻害剤の同定方法に関する。
本発明の別の局面は前述の方法のいずれか１種得られた化合物に関する。本発明のなお別の局面は、患者が例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などにより引き起こされる感染症のような微生物感染症と関連する疾患に罹っている、前述の方法のいずれか１つにより得られる化合物のそれの必要な患者への投与方法に関する。ある態様において、前記微生物感染症は細菌感染症である。
［発明の詳細な記述］
本発明は医薬品の同定で使用されるべき新規標的を提供する。１６Ｓ ＲＮＡ全体での即時進化（ｉｎｓｔａｎｔ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）実験により同定された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１６Ｓ ｒＲＮＡの保存されたおよび変動可能な領域が提供される。これらの保存された配列を、分類上特異的である、薬作用物質耐性の発生に不応性である、若しくは双方の医薬品の標的として使用しうる。
定義
冠詞「ある」（「ａ」および「ａｎ」）は、該冠詞の文法上の目的語の１個若しくは１個以上（すなわち最低１個）を指すために本明細書で使用する。
「アミノ酸」という用語は当該技術分野で既知である。一般に、アミノ酸および保護基を指定するために本明細書で使用される略語は、生化学的命名法に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ規約（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７２）１１：１７２６−１７３２を参照されたい）の推奨に基づく。ある態様において、本発明の出願で使用されるアミノ酸は、タンパク質中で見出される天然に存在するアミノ酸、またはアミノおよびカルボキシル基を含有するこうしたアミノ酸の天然に存在する同化若しくは異化生成物である。とりわけ適するアミノ酸側鎖は、以下のアミノ酸、すなわち、グリシン、アラニン、バリン、システイン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンのものから選択される側鎖を包含する。
「アミノ酸」という用語は、本明細書に付託されるいかなる特定のアミノ酸のアナログ、誘導体および同類物、ならびにＣ末端若しくはＮ末端保護されたアミノ酸誘導体（例えば、Ｎ末端若しくはＣ末端保護基で修飾された）をさらに包含する。例えば、本発明は、カルボキシル、アミノ、若しくは他の反応性前駆体官能基を環化になお提供しつつ側鎖が延長若しくは短縮されているアミノ酸アナログ、ならびに適切な官能基をもつバリアント側鎖を有するアミノ酸アナログの使用を企図している）。例えば、主題の化合物は、例えば、シアノアラニン、カナバニン、ジエンコール酸、ノルロイシン、３−ホスホセリン、ホモセリン、ジヒドロキシフェニルアラニン、５−ヒドロキシトリプトファン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、ジアミノピメリン酸、オルニチン若しくはジアミノ酪酸のようなアミノ酸アナログを包含し得る。本明細書で適する側鎖を有する他の天然に存在するアミノ酸代謝物若しくは前駆体は当業者により認識されることができ、そして本発明の範囲に包含される。
アミノ酸の構造が立体異性体の余地がある場合に、こうしたアミノ酸の（ｄ）および（ｌ）立体異性体もまた包含される。本明細書のアミノ酸およびアミノ酸残基の配置は適切な記号（ｄ）、（ｌ）若しくは（ｄｌ）により指定され、さらに、配置が指定されない場合、アミノ酸若しくは残基は配置（ｄ）、（ｌ）若しくは（ｄｌ）を有し得る。本発明の化合物のいくつかの構造は非対称炭素原子を包含することが指摘されるであろう。こうした非対称から生じる異性体が本発明の範囲内に包含されることが従って理解されるべきである。こうした異性体は、古典的分離技術および立体的に制御される合成により実質的に純粋な形態で得ることができる。本出願の目的上、それとは反対に明示的に言及されない限り、言及されるアミノ酸は（ｄ）若しくは（ｌ）双方の立体異性体を包含すると解釈されるべきである。Ｄ−およびＬ−α−アミノ酸は、以下のフィッシャー投影図、ならびに破線くさび（ｗｅｄｇｅ−ａｎｄ−ｄａｓｈ）図により表される。大多数の場合において、Ｄ−およびＬ−アミノ酸はそれぞれＲ−およびＳ−絶対配置を有する。
Figure 2008544744
ある態様において、本発明のポリペプチドは、化学的に、細胞を含まない系でリボソームで、若しくは細胞内でリボソームで合成しうる。本発明のポリペプチドの化学合成は、段階的固相合成、ペプチドフラグメントのコンホメーションに補助される再連結による半合成、クローン化した若しくは合成のペプチドセグメントの酵素的連結、および化学的連結を包含する多様な技術に認識される方法を使用して実施しうる。天然の化学的連結は、２個の保護されていないペプチドセグメントの化学選択的反応を使用して一時的なチオエステル結合中間体を生じる。該一時的なチオエステル結合中間体はその後再配列を自発的に受けて、連結部位に天然のペプチド結合を有する完全長の連結生成物を提供する。完全長の連結生成物は、細胞を含まない合成により製造されるタンパク質に化学的に同一である。完全長の連結生成物は、再フォールディングされることができ、かつ／若しくは許容されるように酸化されて天然のジスルフィド含有タンパク質分子を形成しうる。（例えば、米国特許第６，１８４，３４４号および同第６，１７４，５３０号明細補；ならびにＴ．Ｗ．Ｍｕｉｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９３）：ｖｏｌ．４、ｐ ４２０；Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）：ｖｏｌ．２４６、ｐ １１９４；Ａ．Ｗｌｏｄａｗｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）：ｖｏｌ．２４５、ｐ ６１６；Ｌ．Ｈ．Ｈｕａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９１）：ｖｏｌ．３０、ｐ ７４０２；Ｍ．Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．（１９９２）：ｖｏｌ．４０、ｐ １８０−１９３；Ｋ．Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）：ｖｏｌ．２６４、ｐ ９０；Ｒ．Ｅ．Ｏｆｆｏｒｄ、“Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｊ．Ｂ．Ｈｏｏｋ、Ｇ．Ｐｏｓｔｅ編（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９０）中、ｐｐ．２５３−２８２；Ｃ．Ｊ．Ａ．Ｗａｌｌａｃｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）：ｖｏｌ．２６７、ｐ ３８５２；Ｌ．Ａｂｒａｈｍｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９１）：ｖｏｌ．３０、ｐ ４１５１；Ｔ．Ｋ．Ｃｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４）９１：１２５４４−１２５４８；Ｍ．Ｓｃｈｎｌｚｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）：ｖｏｌ．３２５６、ｐ ２２１；およびＫ．Ａｋａｊｉら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ）（１９８５）３３：１８４を参照されたい）。
本発明のある種の化合物は特定の幾何若しくは立体異性体で存在しうる。本発明は、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ異性体、Ｒ−およびＳ−鏡像異性体、ジアステレオマー、（ｄ）−異性体、（ｌ）−異性体、それらのラセミ混合物、ならびにそれらの他の混合物を包含する全部のこうした化合物を、本発明の範囲内にあるとして企図している。付加的な非対称炭素原子がアルキル基のような置換基中に存在してもよい。全部のこうした異性体ならびにそれらの混合物は、本発明に包含されることを意図している。
例えば本発明の化合物の特定の一鏡像異性体が望ましい場合、それは非対称合成、若しくは、キラルな補助物質を用いる誘導により製造することができ、生じるジアステレオマーの混合物を分離し、そして補助基を切断して純粋な所望の鏡像異性体を提供する。あるいは、分子がアミノのような塩基性官能基若しくはカルボキシルのような酸性官能基を含有する場合、適切な光学活性の酸若しくは塩基を用いてジアステレオマーの塩を形成し、次いで当該技術分野で公知の分別結晶若しくはクロマトグラフィー手段により、かように形成されたジアステレオマーを分割し、そしてその後純粋な鏡像異性体を回収する。
「保存的置換」という用語は、広範に類似の分子特性のアミノ酸間の変化を指す。例えば、脂肪族群アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン内の交換は保存的とみなし得る。ときに、これらの１種の代わりのグリシンの使用もまた保存的とみなし得る。他の保存的交換は、脂肪族群アスパラギン酸およびグルタミン酸内；アミド群アスパラギンおよびグルタミン内；ヒドロキシル群セリンおよびトレオニン内；芳香族群フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン内；塩基性群リシン、アルギニンおよびヒスチジン内；ならびにイオウ含有群メチオニンおよびシステイン内のものを包含する。ときに、群メチオニンおよびロイシン内の置換もまた保存的とみなし得る。好ましい保存的置換群は、アスパラギン酸−グルタミン酸；アスパラギン−グルタミン；バリン−ロイシン−イソロイシン；アラニン−バリン；バリン−ロイシン−イソロイシン−メチオニン；フェニルアラニン−チロシン；フェニルアラニン−チロシン−トリプトファン；リシン−アルギニン；およびヒスチジン−リシン−アルギニンである。
核酸若しくはヌクレオチド配列を記述するのに使用される場合の「同等な」は、機能上同等なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を指す。同等なヌクレオチド配列は、アレルバリアントのような１個若しくはそれ以上のヌクレオチド置換、付加若しくは欠失により異なる配列を包含することができ；そして従って遺伝暗号の縮重により異なる配列
を包含することができる。例えば、核酸バリアントは、ヌクレオチド置換、欠失若しくは付加により生じられるものを包含しうる。該置換、欠失若しくは付加は１個若しくはそれ以上のヌクレオチドを伴いうる。バリアントは、コーディング領域、非コーディング領域若しくは双方で変えられうる。コーディング領域中の変化は、保存的若しくは非保存的アミノ酸置換、欠失若しくは付加を生じうる。
「相同性」若しくは、あるいは「同一性」は、２種のペプチド間若しくは２種の核酸分子間の配列の類似性を指す。相同性は、比較の目的上整列しうる各配列中の１位置を比較することにより決定しうる。比較される配列中の１位置が同一の塩基若しくはアミノ酸により占有される場合には、該分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、該配列により共有される一致する若しくは相同な位置の数の関数である。
「同一性パーセント」という用語は、２種のアミノ酸配列間若しくは２種のヌクレオチド配列間の配列の同一性を指す。同一性は、比較の目的上整列しうる各配列中の１位置を比較することにより決定しうる。比較される配列中の同等な１位置が同一の塩基若しくはアミノ酸により占有される場合には、該分子はその位置で同一であり；同等な部位が同一若しくは類似のアミノ酸残基（例えば立体および／若しくは電子的性質が類似）により占有される場合には、該分子はその位置で相同（類似）と称されうる。相同性、類似性若しくは同一性のパーセントとしての表現は、比較される配列により共有される位置での同一若しくは類似のアミノ酸の数の関数を指す。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ若しくはＥＮＴＲＥＺを包含する多様な整列アルゴリズムおよび／若しくはプログラムを使用しうる。ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴはＧＣＧ配列分析パッケージ（ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン）の一部として入手可能であり、そして例えばデフォルトの設定で使用しうる。ＥＮＴＲＥＺは国立保健研究所国立医学図書館国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、メリーランド州ベセスダを通じて入手可能である。一態様において、２配列の同一性パーセントは、１のギャップ重み（ｇａｐ
ｗｅｉｇｈｔ）を伴うＧＣＧプログラムにより決定することができ、例えば、各アミノ酸のギャップを、それが２配列間で単一アミノ酸若しくはヌクレオチド不適正であるかのように加重する。他の整列技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６）、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ ＆ Ｃｏ．、米国カリフォルニア州サンディエゴに記述されている。好ましくは、配列中のギャップを許容する整列プログラムを利用して配列を整列する。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列の整列でギャップを許容するアルゴリズムの１つの型である。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）を参照されたい。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈの整列法を使用するＧＡＰプログラムを利用して配列を整列しうる。代替の検索戦略は、ＭＡＳＰＡＲコンピュータ上で作動するＭＰＳＲＣＨソフトウェアを使用する。ＭＰＳＲＣＨは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを使用して、大規模並列処理コンピュータ上で配列を評価する。このアプローチは、離れて関係する一致を拾い上げる能力を改良し、そして小さなギャップおよびヌクレオチド配列のエラーにとりわけ寛容である。核酸にコードされるアミノ酸配列を、タンパク質およびＤＮＡ双方のデータベースを検索するのに使用しうる。個々の配列を含むデータベースがＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ編、上記に記述されている。データベースは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよび日本ＤＮＡデータベース（ＤＤＢＪ）を包含する。
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、ポリマーの形態のいかなる長さの
デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドいずれかのヌクレオチドまたはそれらのアナログを指すのに互換性に使用する。以下は、ポリヌクレオチドの制限しない例である。すなわち、遺伝子若しくは遺伝子フラグメントのコーディング若しくは非コーディング領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（複数若しくは１個）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離されたＤＮＡ、いずれかの配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログのような修飾ヌクレオチドを含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾はポリマーの集成前若しくは後に賦与されうる。ヌクレオチドの配列はヌクレオチド以外の成分により中断されうる。ポリヌクレオチドは、標識成分との複合によるように重合後にさらに修飾されうる。「組換え」ポリヌクレオチドという用語は、天然に存在しないか若しくは非天然の配置の別のポリヌクレオドに連結されているかのいずれかのゲノム、ｃＤＮＡ、半合成若しくは合成起源のポリヌクレオチドを意味している。「オリゴヌクレオチド」は約１００ヌクレオチド未満、約例えば７５、５０、２５若しくは１０ヌクレオチド未満を有する一本鎖ポリヌクレオチドを指す。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」（１本鎖の場合）という用語は、アミノ酸のポリマーを指すのに本明細書で互換性に使用される。該ポリマーは直鎖状若しくは分枝状であることができ、それは修飾アミノ酸を含むことができ、そしてそれは非アミノ酸により中断されうる。該用語は、修飾されているアミノ酸ポリマー；例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、若しくは標識成分との複合のようないずれかの他の操作もまた包含する。本明細書で使用されるところの「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤ若しくはＬ双方の光学異性体を包含する天然のおよび／若しくは非天然すなわち合成アミノ酸、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物のいずれも指す。
「特異的にハイブリダイズする」という用語は検出可能かつ特異的な核酸結合を指す。本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸は、非特異的核酸への検出可能な結合の認識可能な量を最小限にするハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。緊縮性条件を使用して、当該技術分野で既知かつ本明細書で論考されるところの選択的ハイブリダイゼーション条件を達成しうる。一般に、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸と目的の核酸配列の間の核酸配列の相同性は、最低３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％若しくはそれ以上であることができる。ある場合には、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、慣習的ハイブリダイゼーション手順に従い、かつ、本明細書にさらに記述されるところの緊縮性条件下で実施する。
「緊縮性条件」若しくは「緊縮性のハイブリダイゼーション条件」という用語は、二重鎖を形成するように２本の相補的ポリヌクレオチド鎖間の特異的ハイブリダイゼーションを促進する条件を指す。緊縮性条件は、規定されるイオン強度およびｐＨで所定のポリヌクレオチド二重鎖の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択しうる。相補的ポリヌクレオチド鎖の長さおよびそれらのＧＣ含量が、二重鎖のＴｍ、そして従ってハイブリダイゼーションの所望の特異性を得るのに必要なハイブリダイゼーション条件を決定することができる。Ｔｍは、完全に一致する相補鎖にポリヌクレオチド配列の５０％が（規定されたイオン強度およびｐＨ下で）ハイブリダイズする温度である。ある場合には、特定の二重鎖のＴｍにほぼ等しくなるようにハイブリダイゼーション条件の緊縮性を増大させることが望ましいかもしれない。
多様なＴｍ推定技術が利用可能である。典型的には、約８０〜１００℃の理論的最大ま
で、二重鎖中のＧ−Ｃ塩基対はＴｍに約３℃寄与すると推定される一方、Ａ−Ｔ塩基対は約２℃寄与すると推定される。しかしながら、Ｇ−Ｃスタッキング相互作用、溶媒効果、所望のアッセイ温度などを考慮に入れたＴｍのより洗練されたモデルが利用可能である。例えば、プローブは、式：Ｔｄ＝（（（（（３×＃ＧＣ）＋（２×＃ＡＴ））×３７）−５６２）／＃ｂｐ）−５［式中、＃ＧＣ、＃ＡＴおよび＃ｂｐは、該二重鎖の形成に関与するそれぞれグアニン−シトシン塩基対の数、アデニン−チミン塩基対の数、および全塩基対の数である］を使用して、およそ６０℃の解離温度（Ｔｄ）を有するように設計し得る。
ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、４×ＳＳＣ、３×ＳＳＣ、２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ若しくは０．２×ＳＳＣ中で最低約１時間、２時間、５時間、１２時間若しくは２４時間実施しうる。ハイブリダイゼーションの温度は、反応の緊縮性を調節するように増大させうる（例えば、約２５℃（室温）から約４５℃、５０℃、５５℃、６０℃若しくは６５℃まで）。ハイブリダイゼーション反応は、緊縮性に影響を及ぼす他の作用物質もまた包含することができ、例えば、５０％ホルムアミドの存在下で実施されるハイブリダイゼーションは規定された温度でのハイブリダイゼーションの緊縮性を増大させる。
ハイブリダイゼーション反応に、単一洗浄段階、または同一若しくは異なる塩分および温度ででありうる２若しくはそれ以上の洗浄段階が続きうる。例えば、洗浄温度は、緊縮性を調節するために約２５℃（室温）から約４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃若しくはそれ以上まで増大させうる。洗浄段階は洗作用物質、例えば０．１若しくは０．２％ＳＤＳの存在下で実施しうる。例えば、ハイブリダイゼーションに、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃で各約２０分間の２回の洗浄段階、および、場合によっては０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃で各約２０分間の２回の追加の洗浄段階が続きうる。
例示的緊縮性ハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ（０．２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％ウシ血清アルブミン）および２００μｇ／ｍｌの変性担体ＤＮＡ、例えば剪断サケ精子ＤＮＡを含んでなるか若しくはそれらよりなる溶液中６５℃で一夜ハイブリダイゼーション、次いで２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃で各約２０分間の２回の洗浄段階、ならびに０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃で各約２０分間の２回の洗浄段階を包含する。
ハイブリダイゼーションは、溶液中の２種の核酸、若しくは固体支持体、例えばフィルターに結合された核酸に溶液中の核酸をハイブリダイズさせることよりなることができる。一方の核酸が固体支持体上にある場合、前ハイブリダイゼーション段階をハイブリダイゼーション前に実施しうる。前ハイブリダイゼーションは、（相補ポリヌクレオチド鎖を含まない）ハイブリダイゼーション溶液と同一の溶液中かつ同一温度で最低約１時間、３時間若しくは１０時間実施しうる。
適切な緊縮性条件は、当業者に既知であるか若しくは当業者により実験で決定されうる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９８９）、６．３．１−１２．３．６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク；Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ（編）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２０巻；Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅｓ、例えば第Ｉ章 ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク；ならびにＴｉｂａｎｙｅｎｄａ，Ｎ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３９：１９（１９８４）、およびＥｂｅｌ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１：１２０８３（１９９２）を参照されたい。
核酸若しくはアミノ酸配列に関して使用される場合の「実質的に相同な」という用語は、相互と配列が実質的に同一若しくは類似であり、コンホメーションの相同性、および従って１種若しくはそれ以上の生物学的（免疫学的を包含する）活性の有用な程度までの保持を生じる配列を指す。該用語は配列の共通の進化を意味することを意図していない。
「患者」という用語は特定の処置の必要な哺乳動物を指す。好ましい一態様において、患者は、霊長類、イヌ、ネコ若しくはウマである。別の好ましい態様において、患者はヒトである。
本明細書に見出される構造式中で「−」は共有結合を示す。例えば、Ｌ−Ｔは、１核酸と、配列番号１〜６４よりなる群から選択される核酸配列の間の共有結合を示す。
即時進化
宿主の機能に影響を及ぼすことなくｒＲＮＡの研究を可能にするｉｎ ｖｉｖｏ系が開発された。［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら 第ＷＯ２００４／００３５１１号明細書。］該系はｐＲＮＡ１２３の誘導体であるプラスミドｐＲＮＡ２２８を含んでなる。［Ｌｅｅ，Ｋ．、Ｈｏｌｌａｎｄ−Ｓｔａｌｅｙ，Ｃ．Ａ．とＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｐ．Ｒ．（１９９６）．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ：ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍＲＮＡ−ｒＲＮＡ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ．ＲＮＡ ２、１２７０−８５；Ｌｅｅ，Ｋ．、Ｖａｒｍａ，Ｓ．、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｊ．，Ｊｒ．とＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｐ．Ｒ．（１９９７）．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ７９０ ｌｏｏｐ ｉｎ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６９、７３２−４３；およびＭｏｒｏｓｙｕｋ，Ｓ．Ｖ．、Ｌｅｅ，Ｋ．、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｊ．、Ｊｒ．とＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｐ．Ｒ．（２０００）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ６９０ ｈａｉｒｐｉｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｅｍ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３００、１１３−２６．］ｐＲＮＡ２２８プラスミドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのｒｒｎＢオペロンを含有する。加えて、１６Ｓ ｒＲＮＡの抗Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏが、正常な宿主ｍＲＮＡを認識しない配列に改変されている。［Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．とＤａｌｇａｒｎｏ，Ｌ．（１９７４）．Ｔｈｅ ３’−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｔｏ ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｔｒｉｐｌｅｔｓ ａｎｄ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ７１、１３４２−６；Ｈｕｉ，Ａ．とｄｅ Ｂｏｅｒ，Ｈ．Ａ．（１９８７）．Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｓｙｓｔｅｍ：ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｔｒａｎｓｌａｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｍＲＮＡ ｓｐｅｃｉｅｓ ｂｙ ａ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８４、４７６２−６；およびＨｕｉ，Ａ．、Ｊｈｕｒａｎｉ，Ｐ．とｄｅ Ｂｏｅｒ，Ｈ．Ａ．（１９８７）．Ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ ｔｏ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｍＲＮＡ ｓｐｅｃｉｅｓ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３、４３２−５２．］該プラスミドは２個のレポーター遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もまた含有し、それらの双方は１６Ｓ ｒＲＮＡの抗Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列に相補的な改変Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含有する。従って、該プラスミド由来の３０Ｓサブユニットは正常な宿主ｍＲＮＡを翻訳せず、そして宿主リボソームはレポーター遺伝子のｍＲＮＡを翻訳しない。
１６Ｓ ｒＲＮＡを、生成物全体に突然変異を無作為に導入するためのマンガンの存在下でＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応中のマンガンの濃度は、ＰＣＲ産物に導入される突然変異の数に比例する。１６Ｓ ｒＲＮＡに導入される突然変異の数を至適化するために、ＰＣＲをある範囲のＭｎ２＋（０ないし０．５ｍＭ Ｍｎ２＋）濃度の存在下で実施した。各Ｍｎ２＋濃度からのＰＣＲ産物をｐＲＮＡ２２８にクローン化し（位置２０から位置１５０３までの１６Ｓ ｒＲＮＡの合計１４８４ヌクレオチド）、配列決定し、そしてクローンあたりの突然変異の平均数を分析した。期待されたとおり、突然変異の平均数はＭｎ２＋の濃度とともに増大した（図１ａ）。１６Ｓ ｒＲＮＡに組込まれている突然変異の型をさらに特徴付けした。トランジションとトランスバージョンの間のおよそ２対１の比が観察された（図１ｂ）。挿入および欠失もまた変異体プール中で同定されたが、しかしはるかにより低率でであった（データは示されない）。突然変異は、高度に変異された領域を伴わずに１６Ｓ ｒＲＮＡ全体に分布して見出された（データは示されない）。
各濃度のＭｎ２＋からのクローンをその後、クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）含有培地で機能について選択した。生存体を、ＧＦＰ蛍光のレベルを野生型ＧＦＰ蛍光と比較することにより機能についてアッセイし、そして突然変異を同定するため配列決定した。生存クローンの分析は、クローンあたりの突然変異の平均数の減少をもたらした。０．３ｍＭ Ｍｎ２＋で、クローンあたりの突然変異の平均数は６．１から１．４まで減少した。０．４および０．５ｍＭのＭｎ２＋濃度についてのクローンあたりの突然変異の平均数は０未満（それぞれ０．１および０．３）に減少した。クローンあたり１．４個の突然変異の平均は、合理的な数のクローンで１６Ｓ ｒＲＮＡの各位置での突然変異の数を提供しなかったとみられる。配列あたりの変異体の数を増大させるため、クロラムフェニコール濃度を低下させることにより選択を至適化した。誘導されない野生型プラスミドならびに致死的クローンのクロラムフェニコールの最小阻害濃度（ＭＩＣ）は１５μｇ／ｍｌであることが決定された。従って、選択の間のクロラムフェニコールの濃度を５０μｇ／ｍｌから２５μｇ／ｍｌまで減少させた。このクロラムフェニコール濃度は、非機能的クローンの増殖をなお阻害しつつ機能的クローンの選択を見込む。多様な濃度のＭｎ２＋で変異させた１６Ｓ ｒＲＮＡを含有するクローンを２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールで選択し、配列決定し、そして機能についてアッセイした。より低濃度のクロラムフェニコールでの選択は、０．３ｍＭ Ｍｎ２＋濃度でのクローンあたりの突然変異の数を有意に増大させなかったが、しかしながら、０．４ｍＭ Ｍｎ２＋濃度でのクローンあたりの突然変異の数は０．１から３．９まで増大した（図１ａ）。０．４ｍＭ Ｍｎ２＋で変異させかつ２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールで選択した１６Ｓ ｒＲＮＡを含有するクローンのより大きなプールの分析は、多数の野生型および複製クローンをもたらした。プール中の野生型および複製サンプルの数を減少させるため、Ｍｎ２＋濃度を０．４５ｍＭ Ｍｎ２＋に増大させ、また、誘導時間を２時間に短縮した。これらの条件は、突然変異の数と機能の間の至適の均衡をもたらした（データは示されない）。
合計２６０９クローンの配列をデータベースに取り込んだ。該データベースは配列を整列し、端を切り取り、そしてサンプル中の全突然変異を同定する。これらのクローンは１６Ｓ ｒＲＮＡ内（位置２０〜１５０３）に１０，７５８個の突然変異を含有し、各位置で平均７．３個の突然変異に変わる。各位置の突然変異の数は、２の最頻値および６の中央値を伴い、０から３８までの範囲にわたった。３個若しくはそれ未満の突然変異を含有する１６Ｓ ｒＲＮＡ中の３個若しくはそれ以上の連続したヌクレオチドの領域は、０ないし１個の突然変異を含有する２個若しくはそれ以上の領域がそうであるように、統計学的に有意である。これらの基準を使用して合計４７領域を同定した。４個若しくはそれ以上の突然変異をもつ単一位置により他の類似の位置から分離される３個若しくはそれ未満の突然変異をもつ単一位置もまた同定した。同定された領域を、３個若しくはそれ未満の突然変異を含有したがしかし以前に同定された領域から４個以上の突然変異を有する単一位置により分離された位置を包含するように増大させた。これは、以前に同定された領域を拡大しかつ以前に単離されていない領域を同定した。一緒にすれば、合計６４個の保存された領域をデータベースから同定し、そして１６Ｓ ｒＲＮＡの二次構造にマッピングした（図２）。同定された保存された領域を、１６Ｓ ｒＲＮＡの系統発生分析で同定された保存された領域と比較した。同定された領域は、系統発生分析により同定された保存された領域に良好に匹敵する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１６Ｓ ｒＲＮＡ結晶構造のエネルギー最小化モデルをこれらの保存された領域で標識して、三次元空間でのそれらの位置を決定した。このモデルは、領域間のいかなる相互作用も同定するのに、また、他のリボソーム成分とのいかなる相互作用も同定するのにもまた使用した（図３）。
本発明の標的
５’ドメイン。１６Ｓ ｒＲＮＡの位置１ないし５６０が５’ドメインであるとみなされる。突然変異ライブラリー中で、５’ドメインは、領域のクラスター若しくは単離された領域いずれかとして見出される２７個の保存された領域を含有する。領域３（位置７３−７６）はヘリックス６（Ｈ６、本出願を通じて使用される表記法）中に見出され、そして位置９３−９７と塩基対形成する（図４ａ）。領域３の残基の全部が塩基対形成するとは言え、反対鎖の位置９４がはじき出される。位置９４は何かと相互作用することが知られておらず、そしてこのヘリックスはいずれかの既知の機能と関連付けられていない。このヘリックスは、しかしながら、結晶充填の間にＰ部位に結合したｔＲＮＡを模倣することが報告されたが、しかし、これがｉｎ ｖｉｖｏで起こるかどうかは未知である。
領域１２（位置１９８−２０７）はＨ１０に見出され、そして位置２１２−２１９と塩基対形成する（図４ｂ）。二次構造中で示されるとおり、位置２０４および２０５は塩基対形成せず、そしてヘリックスからはじき出されている。位置２０５は主溝中に位置し、主溝との可能な相互作用を破壊する一方、位置２０４は溶媒に完全に露出されている。Ｈ１０は３０Ｓサブユニットの溶媒側に位置し、そしてリボソームタンパク質のいずれかと相互作用することは知られていない。このヘリックスの機能は未知である。
領域２３（位置４２８−４３０）はＨ１６中でバルジループの一部として見出される（図４ｃ）。リボソームタンパク質Ｓ４は領域２３のバックボーンと相互作用するが、しかしながら、領域２３のヌクレオチドは主溝中に面する。このバルジの独特の構造は、保存されない位置４１２をヘリックスからはじき出す。この領域は、Ｆｅ（ＩＩ）を伸長因子−Ｇ（ＥＦ−Ｇ）中の多様な位置に繋ぎ留めた指向されたヒドロキシルラジカル切断実験の間に切断されることが示され、それがＥＦ−Ｇの結合部位の一部であることを示唆する。［Ｗｉｌｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．とＮｏｌｌｅｒ，Ｈ．Ｆ．（１９９８）．Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＥＦ−Ｇ ｉｎ ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ ｐｒｏｂｉｎｇ．Ｃｅｌｌ ９２、１３１−９．］
領域２５（位置５００−５０３）、２６（位置５１８−５３０）および２７（位置５３８−５４１）はＨ１８に位置する（図４ｄ）。領域２５および２７はＨ１８の基部にあり、そして５３０ループ構造の形成で役立つ。領域２７の位置５３８、５３９および５４０は位置５１１、５１２および５１３と相互作用する一方、領域２７の位置５４１は位置５０４と相互作用する。これはステム中にバルジをもたらし、それはその後Ｈ１８の上部の四塩基ループ（ｔｅｔｒａｌｏｏｐ）とともに偽結び目構造を形成し得る。偽結び目構造形成は領域２６を正しい方向に置き、位置５３０の機能上重要なヌクレオチドがＡ部位に配置されることを可能にする。［Ｙｕｓｕｐｏｖ，Ｍ．Ｍ．、Ｙｕｓｕｐｏｖａ，Ｇ．Ｚ．、Ｂａｕｃｏｍ，Ａ．、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｋ．、Ｅａｒｎｅｓｔ，Ｔ．Ｎ．、Ｃａｔｅ，Ｊ．Ｈ．とＮｏｌｌｅｒ，Ｈ．Ｆ．（２００１）．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ａｔ ５．５ Ａ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２、８８３−９６；およびＯｇｌｅ，Ｊ．Ｍ．、Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎ，Ｄ．Ｅ．、Ｃｌｅｍｏｎｓ，Ｗ．Ｍ．，Ｊｒ．、Ｔａｒｒｙ，Ｍ．Ｊ．、Ｃａｒｔｅｒ，Ａ．Ｐ．とＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｖ．（２００１）．］Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｇｎａｔｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ ｂｙ ｔｈｅ ３０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｓｕｂｕｎｉｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２、８９７−９０２．位置５３０は同族および近同族（ｎｅａｒ−ｃｏｇｎａｔｅ）ｔＲＮＡの間の識別に関与することが示されている。［Ｏｇｌｅ，Ｊ．Ｍ．、Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎ，Ｄ．Ｅ．、Ｃｌｅｍｏｎｓ，Ｗ．Ｍ．，Ｊｒ．、Ｔａｒｒｙ，Ｍ．Ｊ．、Ｃａｒｔｅｒ，Ａ．Ｐ．とＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｖ．（２００１）．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｇｎａｔｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ ｂｙ ｔｈｅ ３０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｓｕｂｕｎｉｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２、８９７−９０２．領域２６は開始因子１（ＩＦ１）、抗生物質ストレプトマイシンおよびｒタンパク質（ｒｐｒｏｔｅｉｎ）Ｓ１２ともまた相互作用する。Ｃａｒｔｅｒ，Ａ．Ｐ．、Ｃｌｅｍｏｎｓ，Ｗ．Ｍ．、Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎ，Ｄ．Ｅ．、Ｍｏｒｇａｎ−Ｗａｒｒｅｎ，Ｒ．Ｊ．、Ｈａｒｔｓｃｈ，Ｔ．、Ｗｉｍｂｅｒｌｙ，Ｂ．Ｔ．とＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｖ．（２００１）．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ３０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｓｕｂｕｎｉｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１、４９８−５０１；およびＣａｒｔｅｒ，Ａ．Ｐ．、Ｃｌｅｍｏｎｓ，Ｗ．Ｍ．、Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎ，Ｄ．Ｅ．、Ｍｏｒｇａｎ−Ｗａｒｒｅｎ，Ｒ．Ｊ．、Ｗｉｍｂｅｒｌｙ，Ｂ．Ｔ．とＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｖ．（２０００）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ３０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４０７、３４０−８．］この領域、ならびにそれが相互作用するリボソーム成分が、翻訳忠実度の維持に重要であることが示されている。
領域１５（位置２８５−２９４）および１６（位置２９７−３０２）はＨ１１ａおよびＨ１２の一部である（図４ｅ）。領域１５はＨ１１ａとＨ１２の間の結合部の形成に関与している。領域１６はＨ１２のステムおよびＧＮＲＡ四塩基ループの一側を形成する。どのタンパク質もこの領域と相互作用することが見出されていないとは言え、１６Ｓ ｒＲＮＡの５’端が該四塩基ループと相互作用しているようであり、おそらくその移動性を制限している。しかしながら、特定の機能はこの領域に関連付けられていない。
リボソームの底部は、突然変異ライブラリーで同定された５領域、すなわち領域４（位置１０２−１０６）、８（位置１４５−１４７）、９（位置１５０−１５３）、１０（位置１７１−１７５）および１１（位置１９１−１９３）を含有する。領域８および９を除き、これらの領域はｒタンパク質Ｓ２０の結合に関与する（図４ｆ）。Ｓ２０はＨ９およびＨ４４双方と相互作用する一次結合タンパク質である。この相互作用がリボソームの底部を安定化しかつＨ４４をリボソームの本体に固定する。Ｈ４４の固定は、Ｈ４４を巻き込むサブユニット間架橋部位の形成、ならびにＨ４４の上部で発生する翻訳の正確度に重要でありうる。Ｓ２０との相互作用の大部分はしかしながらバックボーン相互作用である。これらの領域の塩基は５’ドメインの他の区分と塩基対形成しかつヘリックスを形成する。最後に、領域８および９はＳ２０への結合に関与していないとは言え、領域１０とともにＨ８のステムおよび内的ループを構成する。
３領域すなわち領域７（位置１２４−１２８）、１３（位置２３５−２４２）および１４（位置２４６−２４８）のクラスターがＨ７およびＨ１１中で同定された。ｒタンパク質Ｓ１７は一次結合タンパク質であり、そしてこれらの領域のバックボーンを接触させる（図４ｇ）。Ｓ１７の結合はＨ７−Ｈ１１結合部の急カーブを安定化し、かつ、１６Ｓ ｒＲＮＡの全般的集成で補助する。領域７および１４は塩基対形成し、そしてそれぞれＨ７若しくはＨ１１のセグメントを形成する。領域１３の位置２３６−２３９はＨ７を形成するための塩基対形成に関与する一方、位置２４０−２４２はＨ１１を形成するための塩基対形成に関与する。Ｓ１７との相互作用は、これらの領域の保存を説明するのに不十分なようであるが、しかし他の機能は同定されていない。
５’ドメインの領域の最後のクラスター形成は、領域１（位置３９−４９）、２（位置５２−５８）、５（位置１０９−１１０）、６（位置１１３−１１７）、１７（位置３１０−３１９）、１８（位置３２２−３２８）、１９（位置３３７−３４２）、２０（位置４３８−３６２）、２１（位置３６５−３７５）、２２（位置３８４−３９１）および２４（位置４４７−４５０）を関わらせる。保存された領域のこの大型クラスターは本体の中心に位置し、そしてｒタンパク質Ｓ１２、Ｓ１６およびＳ２０と制限された接触を成す（図４ｈ）。保存された領域のこのクラスターの溶媒側はｒＲＮＡおよびｒタンパク質で覆われている。このクラスターの界面側は、それでも、３０Ｓサブユニットとして溶媒に、若しくは翻訳する場合は５０Ｓサブユニットに露出される。Ｈ１４の位置３４３−３４５とｒタンパク質Ｌ１４の間の１個のサブユニット間架橋Ｂ８が同定されている。しかしながらこれらの位置（３４３−３４５）は保存されていると同定されなかった。領域１９および２０はＨ１４の端でループを創製し、これはサブユニット間架橋Ｂ８の形成に不可欠でありうる。このクラスター中の他のヘリックスの機能は知られていない。
中央ドメイン。中央ドメインすなわち位置５６１−９３０は、７群に連合する１６個の保存された領域を含有する。領域３４（位置７３７−７４１）はＨ２２に位置し、そして非対称内的ループの一部である（図５ａ）。領域３４のバックボーンはｒタンパク質Ｓ６およびＳ１５との相互作用に関与する一方、該塩基は位置６６４−６６９と塩基対形成する。この塩基対形成は位置６６５をヘリックスからはじき出させる。位置６６５のはじき出しは、それがＨ２３ａ中の位置７２３と相互作用することを可能にする。この相互作用は、Ｈ２２およびＨ２３が同軸方向に積み重なり得るようにＨ２３ａを安定化するのに役立つようである。［Ａｇａｌａｒｏｖ，Ｓ．Ｃ．、Ｓｒｉｄｈａｒ Ｐｒａｓａｄ，Ｇ．、Ｆｕｎｋｅ，Ｐ．Ｍ．、Ｓｔｏｕｔ，Ｃ．Ｄ．とＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．（２０００）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓ１５，Ｓ６，Ｓ１８−ｒＲＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘ：ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ３０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｄｏｍａｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８、１０７−１３．］Ｈ２２およびＨ２３のスタッキングはｒＲＮＡのフォールディングおよび他のｒタンパク質の結合に重要である。
領域３２（位置７０３−７０５）はＨ２３とＨ２３ｂの間の非対称内的ループ中に位置する（図５ａ）。該ループ内の相互作用は、領域３２からのヌクレオチドを含有するポケットの形成をもたらす。領域３２の塩基はｒタンパク質Ｓ１１と相互作用し、そしてその主要結合部位であるようである。Ｓ１１は、Ｈ２３の折曲がったコンホメーションおよびＨ２３とＨ２４の間の相互作用を安定化するのを助ける。Ｈ２３およびＨ２４の双方は、Ａ部位でのｔＲＮＡの識別である役割を有するようであるＥ部位に位置推定された。
Ｈ２１の端の内的ループおよび五塩基ループもまた、ライブラリー中で保存されている
と同定された。ヘリックス２１は領域２９（位置６０４−６０９）、３０（位置６１７−６２６）および３１（位置６３１−６４３）を含有する。Ｈ２１のループ（領域３０）はｒタンパク質Ｓ４とのバックボーンの接触をなす一方、領域３０の残部および領域２９のバックボーンはＳ１６と相互作用する（図５ｂ）。領域３０の位置６２１は位置４２（領域１の一部）と相互作用し、その結果これらの領域が一緒にされる。最後に、領域３１および領域２９の位置６０４−６０６が塩基対形成する。この塩基対形成は、Ｈ２１の内的ループの形成、および領域２９の位置６０７−６１０をヘリックスからはじき出すことを見込みうる。位置６０７および６０８は、それぞれ、おそらくＨ２１の位置を決める塩基対２９１：３０９および２９２：３０８と相互作用するようである。最後に、領域２９の位置６０９−６１０はｒタンパク質Ｓ４およびＳ１６への結合に関与する。Ｈ２１は、５’ドメイン中で同定される領域の大型クラスター（領域１、２、５、６、１７、１８、１９、２０、２１、２２および２４）の溶媒側に配置される。このヘリックスの位置決めは領域のこのクラスターを保護しうるか、若しくはそれらの相互作用に安定性を提供する。領域３０はＨ２１のステムおよびループの一側を形成する。領域３０とＳ１６の間のバックボーンの接触が存在するとは言え、他の機能はこのヘリックスに帰されていない。
Ｈ２４ａは領域３６（位置７８３−７９１）および３７（位置７９５−７９７）を含有しかつ一般に７９０ループと命名される（図５ｃ）。領域３７は、領域３６の位置７８５−７８６と塩基対形成して７９０ループのステムを形成する。６９０ループは７９０ループのステムと相互作用して、これら２ループの位置を一緒に決めてＥ部位の一部を形成する。該ステムの底部は２３Ｓ ｒＲＮＡのＨ６９とのサブユニット間架橋Ｂ２ｂの形成でもまた補助する。領域３６の残部は該ループ中に伸長する。７９０ループ（７８８−７８９）はＰ部位およびＥ部位双方に結合したｔＲＮＡと相互作用することが示されている。位置７９０および７９１はまた、それがリボソームによりつながれる際にｍＲＮＡと相互作用してその方向を安定化する。抗生物質パクタマイシンおよびエデインもまた７９０ループ中に結合部位を有し、そしてそれぞれトランスロケーション若しくは正確度いずれかを阻害することにより翻訳に影響を及ぼす。７９０ループのこれらの機能は、系統発生分析および突然変異ライブラリー双方におけるその保存を説明する。
スイッチヘリックス（Ｈ２７）のループは、土台の底部に位置しかつ溶媒に露出されている２個の保存された領域すなわち領域４０（位置８９４−８９９）および領域４１（９０２−９０３）を含有する（図５ｄ）。領域４１は領域４０の位置８９６−８９７と塩基対形成してＨ２７のステムを形成する。領域４０の位置８９４−８９７はステムの一部である一方、位置８９８−８９９はＧＮＲＡ四塩基ループの一部を形成する。該四塩基ループはＨ２４の基部にドッキングし、位置７９６、７７０および８１０と相互作用する。Ｈ２７はリボソームの正確度を調節すると考えられていたとは言え、最近の研究はこれが真実でないことを示した。［Ｌｏｄｍｅｌｌ，Ｊ．Ｓ．とＤａｈｌｂｅｒｇ，Ａ．Ｅ．（１９９７）．Ａ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｃｏｄｉｎｇ ｏｆ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７、１２６２−７；Ｇａｂａｓｈｖｉｌｉ，Ｉ．Ｓ．、Ａｇｒａｗａｌ，Ｒ．Ｋ．、Ｇｒａｓｓｕｃｃｉ，Ｒ．、Ｓｑｕｉｒｅｓ，Ｃ．Ｌ．、Ｄａｈｌｂｅｒｇ，Ａ．Ｅ．とＦｒａｎｋ，Ｊ．（１９９９）．Ｍａｊｏｒ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ７０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ３Ｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ａ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ．Ｅｍｂｏ Ｊ １８、６５０１−７；およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃｏｒｒｅａ，Ｄ．とＤａｈｌｂｅｒｇ，Ａ．Ｅ．（２００４）．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｈｅｌｉｘ ２７ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｗｉｔｃｈ ｍｏｄｅｌ．Ｒｎａ １０、２８−３３．］
領域２８（位置５６６−５７２）、３９（位置８８０−８８７）および４２（位置９１６−９１８）は中央ドメインに位置し、そして構造要素であるようである（図５ｅ）。領域３９の位置８８０−８８４は領域２８の位置５６６−５６９と塩基対形成してＨ１９を生成する。Ｈ１９は２個の大きな結合部ループを分離し、そしてまたｒタンパク質Ｓ１２のＣ末端の結合にも関与している。領域３９の残部は、Ｈ２７のステムを形成するための位置９１０−９１２への塩基対形成に関与する。領域２８の位置５７２は、Ｈ１９、Ｈ２０、Ｈ２４およびＨ２５結合部の一区分を形成する一方、位置５７０および５７１はＨ２６ａのループからの位置８６５および８６６と塩基対形成する。位置１７−１９との領域４２の対形成はＨ２を形成しかつ中央の偽結び目構造を創製する。興味深いことに、位置５７１はＨ２の隣の位置１８と相互作用して偽結び目構造をさらに安定化する。これらの領域の保存は構造形成および安定化におけるそれらの役割によるとみられる。
中央ドメインの最後のクラスターは領域３３（位置７１０−７１４）、３５（位置７７３−７７６）および３８（位置８０１−８０６）から構成される。領域３３はＨ２３中で見出され、そして内的ループの形成に関与するようである（図５ｆ）。領域３３の位置７１２および７１３はサブユニット間架橋Ｂ７ｂの形成に関与する。領域３５および３８はＨ２４中に位置する。Ｈ２４は、バルジ、内的ループおよび保存された７９０末端ループを含有する。領域３５の位置７７３および７７４は領域３８の位置８０５および８０６と塩基対形成する。二次構造と対照的に、Ｇ７７５−Ｕ８０４のゆらぎ対は結晶構造中に存在しない。代わりに、位置８０４が位置Ｇ７７８とゆらぎ対を形成してバルジを領域３５の一部として残す。領域３５中のこのバルジ（位置７７４−７７６）はまた２３Ｓ ｒＲＮＡとも相互作用してサブユニット間架橋Ｂ７ｂを形成する。興味深いことに、領域３５の位置７７７はＨ２４のバルジからはじき出され、そして領域３３により創製されるＨ２３の副溝中に配置される。これはＨ２３およびＨ２４の一緒の位置決めで役立ちうる。最後に、領域３８の残存する位置（８０１−８０３）は、閉鎖塩基対の一部かつ内的ループの最初の塩基である。このクラスター間ならびにｒタンパク質Ｓ６、Ｓ１１およびＳ１５とのいくつかの小さな相互作用もまた同定された。
３’ドメイン。１６Ｓ ｒＲＮＡの３’ドメインは、位置９３１ないし該ｒＲＮＡの３’端よりなる。このドメインは、３０Ｓサブユニットの頭部を構成する位置９３１−１３９０よりなる３’主ドメイン、および３０Ｓサブユニットの本体まで延びるヘリックス４４を形成する位置１３９１−１５４２よりなる３’副ドメインにさらに細分される。３０Ｓサブユニットに帰される解読機能を主として司るのは３’副ドメインである。
領域５０（位置１１２７−１１３４）はＨ３９の一部としてリボソームの頭部に位置する。Ｈ３９は非対称内的ループ、バルジおよび五塩基ループを含有する（図６ａ）。領域５０は五塩基ループの前のバルジおよびステムの形成に関与する。位置１１３０および１１３１はバルジを形成し、そして該ヘリックスから副溝に排除される。残存する位置が塩基対形成し、そして五塩基ループの前のバルジおよびステムの形成の原因でありうる。ｒタンパク質Ｓ９は位置１１２８−１１３１とのいくつかのバックボーン接触に関与するとは言え、特定の機能はこの領域と関連付けられていない。
領域５１（位置１１５３−１１５６）はリボソームの溶媒側のＨ５１中に位置する。領域５１はＨ３８、Ｈ３９およびＨ４０の間の結合部の一部である（図６ｂ）。位置１１５３−１１５５は、二次構造で見られるとおり位置１１１８−１１２０と塩基対形成する。位置１１５６は位置１１１７および１１７９と相互作用しているようであり、それが緊密な近接にあるようにバルジの他側を安定化する。この領域の保存はこの結合部の形成におけるその役割によるとみられる。
ヘリックス２９、３０、４１および４２は３’主ドメイン中の結合部から広がる。領域
４３（位置９３９−９４１）、４４（位置９４４−９４８）、５５（位置１２３３−１２３４）、５６（位置１２９０−１２９６）および５７（位置１３００−１３０５）は、この結合部を取り囲むヘリックスを構成する（図６ｃ）。これらの領域の大部分はヘリックス中に位置し、数個の位置が実際に結合に関与するとは言え、これらのヘリックスの正確な構造が結合部の適正な形成を確実にするとみられる。リボソームタンパク質Ｓ７、Ｓ９およびＳ１３はこれらの領域により形成されるヘリックスに結合し、これらの領域の保存をおそらく説明する。
領域６０（位置１３４３−１３５３）および６１（位置１３６９−１３７５）は、Ｈ２８、Ｈ２９およびＨ４３の間の結合部、ならびにＨ４３のステムの一部を形成する（図６ｄ）。領域６０の位置１３５０−１３５３は領域６１の位置１３６９−１３７２と塩基対形成する。双方の領域の残存する位置が結合部を形成する。ｒタンパク質Ｓ７およびＳ９がこれら２領域と広範囲の接触をなす。Ｓ７は一次結合タンパク質である一方、Ｓ９は二次結合タンパク質である。一次結合タンパク質の結合はＲＮＡの正確なフォールディングおよびその後のタンパク質の結合に不可欠である。領域６０および６１の保存はＳ７の結合におけるそれらの役割によるようである。
５個の保存された領域のクラスター（４５（位置９５８−９５９）、４６（位置９７６−９８５）、５４（位置１２１８−１２２３）、５８（位置１３０９−１３１６）および５９（位置１３２３−１３２８））が、ｒタンパク質Ｓ１９の主結合部位を形成すると同定された。これらの領域は３０Ｓサブユニットの界面側に位置し、そしてＳ１９と広範囲の接触をなすが、しかし、Ｓ１３およびＳ１４を包含する数個の二次および三次結合ｒタンパク質ともまた相互作用する（図６ｅ）。領域５８および５９は、Ｓ１９の結合におけるそれらの役割により保存されるようである。領域５８および５９により形成されるＨ４２のループは、Ｈ３０、Ｈ３１およびＨ３２の間の結合部（それらの大部分は領域４５、４６および５４により形成される）と相互作用する。Ｈ３１のループ（９７０ループ）はＰ部位に位置し、そしてＰ部位に結合されたｔＲＮＡと相互作用することが示されている。Ｓ１９の結合は、Ｓ１６ ｒＲＮＡのＨ３１とＨ４３の間の相互作用を安定化しかつＰ部位中の９７０ループの位置決めを可能にするとみられる。
リボソームを通るｍＲＮＡの経路がｘ線結晶学で解明された。［Ｙｕｓｕｐｏｖａ，Ｇ．Ｚ．、Ｙｕｓｕｐｏｖ，Ｍ．Ｍ．、Ｃａｔｅ，Ｊ．Ｈ．とＮｏｌｌｅｒ，Ｈ．Ｆ．（２００１）．Ｔｈｅ ｐａｔｈ ｏｆ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍｅ．Ｃｅｌｌ １０６、２３３−４１．］ｍＲＮＡは、リボソーム界面におよびそれから２個のチャンネルを縫うようにして進むことが示された。上流のチャンネルは、リボソームの頭部、首部および肩部により創製される開口部である。頭部および首部で、このチャンネルの組成は、界面側で領域４７（位置１０４８−１０５８）、４８（位置１０６６−１０７３）、４９（位置１１０２−１１０６）、５２（位置１１９１−１１９５）および５３（位置１２０３−１２０８）、ならびに溶媒側でリボソームタンパク質Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４およびＳ５を包含する（図６ｆ）。チャンネルの底部は５３０ループにより境界を定められる（中央ドメインの節を参照されたい）。領域４８および４９はＨ３５（ｒタンパク質Ｓ２の主結合部位）を形成する。より重要にではあるが、Ｓ５と相互作用するＨ３６の形成がありうる。Ｓ５はリボソームの溶媒側に結合しかつｍＲＮＡチャンネルの形成で役立つ。領域４８の位置１０６８はスペクチノマイシンとの相互作用にもまた関与する。［Ｃａｒｔｅｒ，Ａ．Ｐ．、Ｃｌｅｍｏｎｓ，Ｗ．Ｍ．、Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎ，Ｄ．Ｅ．、Ｍｏｒｇａｎ−Ｗａｒｒｅｎ，Ｒ．Ｊ．、Ｗｉｍｂｅｒｌｙ，Ｂ．Ｔ．とＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｖ．（２０００）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ３０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４０７、３４０−８．］領域４７および５３の塩基対形成はＨ３４の一部を形成する。Ｈ３４のこの区分は位置１０５３−１０５４を巻き込むバルジを含有する。位置１０５３は位置１０５７および１２０３と塩基トリプルを形成する一方、位置１０５４はｍＲＮＡチャンネルからはじき出されて、それがＡ部位に結合されたｔＲＮＡならびにテトラサイクリンと相互作用することを可能にする。以前に、位置１０５４は、Ａ部位におけるコドン−アンチコドン相互作用の第三の位置と相互作用することが示された。領域４７および５３の保存は、位置１０５４のはじき出しを見込むためであるとみられる。この領域中の最後の領域は領域５２である。反対鎖とのこの領域の塩基対形成は位置１１９６でのバルジの形成をもたらし、ヘリックスから塩基をはじき出しかつこの位置がテトラサイリンと相互作用することを可能にする。位置１１９６はｍＲＮＡチャンネルに向けられ、そしてＡ部位の下流でｍＲＮＡの位置を定めるようはたらきうる。この領域は位置１１９２（スペクチノマイシン耐性を賦与する突然変異）もまた含有する。［Ｓｉｇｍｕｎｄ，Ｃ．Ｄ．、Ｅｔｔａｙｅｂｉ，Ｍ．とＭｏｒｇａｎ，Ｅ．Ａ．（１９８４）．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ １６Ｓ ａｎｄ ２３Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １２、４６５３−６３．］スペクチノマイシンは、Ａ部位からＰ部位へのｔＲＮＡの伸長因子Ｇ（ＥＦ−Ｇ）に触媒されるトランスロケーションを阻害する。この領域はＥＦ−Ｇ結合に関与しないとは言え、頭部の動きはタンパク質合成の局面で重要であるようであり、そしてスペクチノマイシン結合により影響を及ぼされ得る。［Ｐｅｓｋｅ，Ｆ．、Ｓａｖｅｌｓｂｅｒｇｈ，Ａ．、Ｋａｔｕｎｉｎ，Ｖ．Ｉ．、Ｒｏｄｎｉｎａ、Ｍ．Ｖ．とＷｉｎｔｅｒｍｅｙｅｒ，Ｗ．（２００４）．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｓｕｂｕｎｉｔ ｄｕｒｉｎｇ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｇ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔＲＮＡ−ｍＲＮＡ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３４３、１１８３−９４．］Ｈ３４中に位置する多数のバルジが柔軟性を増大させかつタンパク質合成に不可欠な必要とされる動きを見込みうる。これらの機能に加え、これらの領域はまた、ｍＲＮＡチャンネルの溶媒側を構成するリボソームタンパク質Ｓ３、Ｓ４およびＳ５と相互作用しかつそれらの位置を定める。これらのタンパク質との相互作用は、ありそうには、翻訳のためｍＲＮＡを正しく向けることにおける第一段階である。
保存された領域の最後のクラスターは解読部位である。領域６２（位置１３８７−１３８９）、６３（位置１３９９−１４１１）および６４（位置１４８８−１５０１）がＨ４４の上部に位置する（図６ｇ）。領域６２は位置９２８−９３０と塩基対形成してヘリックス２８の一部を形成する。この領域の隣が、該ヘリックスからはじき出されかつ位置１５０５に積み重なる位置９２５のバルジである。このスタッキングは、位置１５０５と１５０６の間の方向の大きな変化を安定化するのに役立ちうる。方向のこの変化はＨ４５の位置をＨ４４の隣に定めかつそれらの相互作用を可能にする。領域６３および６４は、ｔＲＮＡ結合、開始因子１（ＩＦ１）結合、アミノグリコシド抗生物質結合、およびｍＲＮＡの解読の部位と同じくらいリボソーム機能において重要と多数の研究で以前に同定された。Ａ部位中の位置１４０８、１４９２および１４９３は、同族のｔＲＮＡ結合の決定におけるそれらの役割により期待されるであろうとおり高度に保存されている。［Ｏｇｌｅ，Ｊ．Ｍ．、Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎ，Ｄ．Ｅ．、Ｃｌｅｍｏｎｓ，Ｗ．Ｍ．，Ｊｒ．、Ｔａｒｒｙ，Ｍ．Ｊ．、Ｃａｒｔｅｒ，Ａ．Ｐ．とＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｖ．（２００１）．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｇｎａｔｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ ｂｙ ３０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｓｕｂｕｎｉｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２、８９７−９０２．］位置１４００、１４０２、１４０３および１４９８もまた、それらがＰ部位の一部であるため、重要であると同定された。サブユニット間架橋Ｂ２ａは、領域６３および６４中の位置１４０８−１４１０および１４９４−１４９５、ならびに２３Ｓ ｒＲＮＡからのヘリックス６９を関わらせる。付加的な保存された領域が機能のための適切な構造の形成を司るようである。
突然変異ライブラリーの分析は、機能に必要とされる多数の領域を同定した。既知の機能上重要な領域の同定は、他の同定された領域もまた機能に重要であるという仮定に信頼を与える。このライブラリーからの保存された領域の系統発生地図との比較は顕著な類似性を示す。しかしながら、本明細書に記述される領域は、系統発生分析で見られるものより少なく広範囲である。この差違の１つの可能な説明は、選択における低下された機能要件である。リボソームは、完全に機能的であるために必要とされないため、機能を低下させかつ従って適応度を低下させる突然変異もまた表される。これらの突然変異は、とは言え環境中で生存しないとみられ、そして従って系統発生分析で保存されていることが見出される。突然変異ライブラリー中の保存された領域はいずれかの機能に絶対に必要とされる位置を表す。１６Ｓ ｒＲＮＡの全ドメイン中の保存された領域が同定され、ｒＲＮＡがその機能を遂行するために全体としてはたらくことを意味している。機能に不可欠であるようであるのが、末端ループよりむしろ内的ループおよび結合部であることは興味深い。
本発明の核酸
本発明の一局面は配列番号１〜６４よりなる群から選択される核酸配列に関し；本発明の別の局面は、核酸テザーにより結合された配列番号１〜６４よりなる群から選択される２核酸配列に関し；本発明の別の局面は、核酸テザーにより結合された配列番号１〜６４よりなる群から選択される３核酸配列に関し；本発明の別の局面は、核酸テザーにより結合された配列番号１〜６４よりなる群から選択される４核酸配列に関し；本発明の別の局面は、核酸テザーにより結合された配列番号１〜６４よりなる群から選択される５核酸配列に関し；および、本発明の別の局面は、核酸テザーにより結合された配列番号１〜６４よりなる群から選択される５と１１個の間の核酸配列に関する。本発明の別の局面は、場合によっては図１０に示される組み合わせの図９の核酸配列の使用に関する。本発明の別の局面は、図４〜６に示されるクラスターに関する。
本発明の別の局面は、式Ｉ：
Figure 2008544744
［式中、各存在について独立に、
Ｔは、核酸配列、配列番号１〜６４、または配列番号１〜６４のいずれか１つに対する約８５％以上若しくはそれに等しい相同性をもつ配列よりなる群から選択され；
Ｌは、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニン、テキサスレッドマレイミドおよびテトラメチルローダミンよりなる群から選択される１置換基で場合によっては置換されている、アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される核酸であり；
ｎは１〜１１の間の整数であり；ならびに
ｍは０〜４０の間の整数である］
により表される核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｌが未置換である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｎが１、２、３若しくは５である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔが、核酸配列、配列番号１〜６４、または配列番号１〜６４のいずれか１つに対する約９０％以上若しくはそれに等しい相同性をもつ配列よりなる群から選択される、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔが、核酸配列、配列番号１〜６４、または配列番号１〜６４のいずれか１つに対する約９５％以上若しくはそれに等しい相同性をもつ配列よりなる群から選択される、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔが、核酸配列、配列番号１〜６４、または配列番号１〜６４のいずれか１つに対する約９９％以上若しくはそれに等しい相同性をもつ配列よりなる群から選択される、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔが配列番号１〜６４よりなる群から選択される前述の核酸に関する。
本発明の別の局面は、式ＩＩ：
Figure 2008544744
［式中、各存在について独立に、
Ｔは、配列番号３、１２、２３、５０および５１よりなる群から選択され；
Ｌは、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニン、テキサスレッドマレイミドおよびテトラメチルローダミンよりなる群から選択される１置換基で場合によっては置換されている、アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される核酸であり；
Ｚ１およびＺ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニンおよび樹脂ビーズよりなる群から選択され；ならびに
ｍおよびｎは０〜４０の間の整数である］
により表される核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔが配列番号３である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔが配列番号１２である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔが配列番号２３である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔが配列番号５０である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔが配列番号５１である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｚ１がフルオレセインである前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｚ２がビオチンである前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｌが、未置換のアデノシン、シチジン、グアノシンおよ
びウリジンよりなる群から選択される前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｍおよびｎが０〜２５の間の整数である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｍおよびｎが５〜１５の間の整数である前述の核酸に関する。
本発明の別の局面は、ＩＩＩ：
Figure 2008544744
［式中、各存在について独立に、
Ｔ１およびＴ２は、配列番号１５、１６、３２、３４、３６、３７、４０、４１、５６、５７、６０および６１よりなる群から選択され；
Ｌは、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニン、テキサスレッドマレイミドおよびテトラメチルローダミンよりなる群から選択される１置換基で場合によっては置換されている、アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される核酸であり；
Ｚ１およびＺ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニンおよび樹脂ビーズよりなる群から選択され；ならびに
ｍ、ｎおよびｐは０〜４０の間の整数である］
により表される核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔ１が配列番号１５であり；およびＴ２が配列番号１６である、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｎが４である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔ１が配列番号３２であり；およびＴ２が配列番号３４である、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｎが３１である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔ１が配列番号３６であり；およびＴ２が配列番号３７である、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｎが３である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔ１が配列番号４０であり；およびＴ２が配列番号４１である、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｎが２である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔ１が配列番号６０であり；およびＴ２が配列番号６１である、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｎが１５である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｚ１がフルオレセインである前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｚ２がビオチンである前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｌが、未置換のアデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｍおよびｐが０〜２５の間の整数である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｍおよびｐが５〜１５の間の整数である前述の核酸に関する。
本発明の別の局面は、ＶＩ：
Figure 2008544744
［式中、各存在について独立に、
Ｔ１、Ｔ２およびＴ３は、配列番号７、１３、１４、２５、２６、２７，２８、２９、３０、３１、３３、３５、３８、３９、４２、６２、６３および６４よりなる群から選択され；
Ｌは、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニン、テキサスレッドマレイミドおよびテトラメチルローダミンよりなる群から選択される１置換基で場合によっては置換されている、アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される核酸であり；
Ｚ１およびＺ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニンおよび樹脂ビーズよりなる群から選択され；ならびに
ｍ、ｎ、ｐおよびｑは０〜４０の間の整数である］
により表される核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔ１が配列番号２５であり；Ｔ２が配列番号２６であり；およびＴ３が配列番号２７である、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｎが１４である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｐが７である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔ１が配列番号７であり；Ｔ２が配列番号１３であり；およびＴ３が配列番号１４である、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｎが６である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｐが３である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔ１が配列番号２９であり；Ｔ２が配列番号３０であり；およびＴ３が配列番号３１である、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｎが７である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｐが４である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔ１が配列番号２８であり；Ｔ２が配列番号３９であり；およびＴ３が配列番号４２である、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｎが７である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｐが２８である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔ１が配列番号３３であり；Ｔ２が配列番号３５であり；およびＴ３が配列番号３８である、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｐが２４である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔ１が配列番号６２であり；Ｔ２が配列番号６３であり；およびＴ３が配列番号６４である、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｎが１０である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｚ１がフルオレセインである前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｚ２がビオチンである前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｌが、未置換のアデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｍおよびｑが０〜２５の間の整数である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｍおよびｑが５〜１５の間の整数である前述の核酸に関する。
本発明の別の局面は、Ｖ：
Figure 2008544744
［式中、各存在について独立に、
Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５は、配列番号４，８、９、１０、１１、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９よりなる群から選択され；
Ｌは、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニン、テキサスレッドマレイミドおよびテトラメチルローダミンよりなる群から選択される１置換基で場合によっては置換されている、アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される核酸であり；
Ｚ１およびＺ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニンおよび樹脂ビーズよりなる群から選択され；ならびに
ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓは０〜４０の間の整数である］
により表される核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔ１が配列番号４であり；Ｔ２が配列番号８であり；Ｔ３が配列番号９であり；Ｔ４が配列番号１０であり；およびＴ５が配列番号１１である、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｐが２である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｑが１７である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｒが１５である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔ１が配列番号４３であり；Ｔ２が配列番号４４であり；Ｔ３が配列番号５５であり；Ｔ４が配列番号５６であり；およびＴ５が配列番号５７である、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｎが２である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｒが３である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔ１が配列番号４５であり；Ｔ２が配列番号４６であり；Ｔ３が配列番号５４であり；Ｔ４が配列番号５８であり；およびＴ５が配列番号５９である、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｎが１６である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｒが６である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｔ１が配列番号４７であり；Ｔ２が配列番号４８であり；Ｔ３が配列番号４９であり；Ｔ４が配列番号５２であり；およびＴ５が配列番号５３である、前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｎが７である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｐが３７である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｒが７である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｚ１がフルオレセインである前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｚ２がビオチンである前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、Ｌが、未置換のアデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｍおよびｓが０〜２５の間の整数である前述の核酸に関する。
ある態様において、本発明は、ｍおよびｓが５〜１５の間の整数である前述の核酸に関する。
標的の改良
上で示された標的を同定するのに使用される同一の方法（「即時進化」）を、それらをさらに改良するのに使用する。本方法の利点の１つは、それが、薬作用物質耐性に至る可能性を有するすべての標的突然変異の同定を見込み、かつ、該標的を使用して新たな薬物リード（ｌｅａｄ）を単離する前に決定的に重要な、構造的および決定的に重要でないヌクレオチドの決定を可能にすることである。
標的スクリーニング
本明細書に記述されるとおり、機能的標的突然変異のライブラリーを、標的の野生型および実現可能な変異体を認識する新たな薬物リードを発見するために化合物ライブラリーをスクリーニングするのに使用する。最初に、ライブラリーを野生型標的でスクリーニングする。ヒットをその後、対応するヒト標的に対し対スクリーニングして、ヒトリボソームを阻害するであろう化合物を除外する。化合物をその後、実現可能な変異体のプールに対しスクリーニングして、野生型および実現可能な変異体双方の配列と相互作用する化合物を選択して、かように標的部位の突然変異に抵抗性であるはずである薬物について選択する。このアプローチにより同定されるヒットは、標的の天然のリガンド（それが存在する場合）を模倣するはずである。
大部分の小分子スクリーニングのアプローチは、タンパク質に結合する分子の同定に重点を置く。タンパク質と相互作用する治療薬の研究から多くを学び得る一方、本明細書に記述されるスクリーニングは、ＲＮＡ標的に基づく薬物設計戦略の使用を必要とする。例えば、そして制限なしにファージディスプレイライブラリー、合成ペプチドライブラリーおよびＲＮＡ結合化合物を使用するＲＮＡ−リガンドに基づくスクリーニングアッセイを使用して、ＲＮＡ標的中の決定的に重要なヌクレオチドに結合し得る分子を同定し得る。
ある態様において、標的を固体支持体に固定することが有利でありうる。多数の固定技術が使用されており、そして固相イムノアッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイおよび固定した酵素の分野で公知である。［例えば：Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇｒｅｇ，Ｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク。１９９５、７８５ｐｐ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｍａｌｌｉａ，Ａ．Ｋ．とＳｍｉｔｈ．Ｐ．Ｋ．Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９２、４５４ｐｐ；およびＡｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ｄ．Ｓａｖａｇｅ、Ｇ．Ｍａｔｔｓｏｎ、Ｓ．Ｄｅｓａｉ、Ｇ．Ｎｉｅｌａｎｄｅｒ、Ｓ．ＭｏｒｇａｎｓｅｎとＥ．Ｃｏｎｋｌｉｎ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード、１９９２、４６７ｐｐを参照されたい。］
多様なスクリーニングアッセイが、ＲＮＡ−リガンド相互作用を特異的に評価するのに開発された。例えば、Ｃｈｏｗらにより開発された「５Ｆアッセイ」［Ｌｌａｎｏ−Ｓｏｔｅｌｏ，Ｂ．、Ａｚｕｃｅｎａ，Ｅ．Ｆ．，Ｊｒ．、Ｋｏｔｒａ，Ｌ．Ｐ．、Ｍｏｂａｓｈｅｒｙ，Ｓ．とＣｈｏｗ，Ｃ．Ｓ．（２００２）．Ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ａｃｙｌ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｉｔｅ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９、４５５−４６３．］その中で、ＲＮＡは色素分子（例えばフルオレセイン若しくは比色標識）で標識され、そしてＲＮＡのリガンドに誘導されるコンホメーション変化をモニターする。色素分子の例は、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ（Ｍａｓｏｎ，Ｗ．Ｔ．編、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）（引用することにより本明細書に組込まれる）に見出し得る。重要なことには、本発明は５’端標識の性質により制限されず；多様な適する５’端標識が当該技術分野で既知であり、そして限定されるものでないが、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイトおよびジゴキシゲニンを挙げることができる。
５Ｆアッセイは蛍光に基づき、そしてリボソームのＡ部位でアミノグリコシドにより誘導されるコンホメーション変化を研究するのに使用されている。［Ｆｏｕｒｍｙ，Ｄ．、Ｒｅｃｈｔ，Ｍ．Ｉ．、Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｓ．Ｃ．とＰｕｇｌｉｓｉ，Ｊ．Ｄ．（１９９６）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａ ｓｉｔｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １６Ｓ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ Ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４、１３６７−１３７１；およびＹｏｓｈｉｚａｗａ，Ｓ．、Ｆｏｕｒｍｙ，Ｄ．とＰｕｇｌｉｓｉ，Ｊ．Ｄ．（１９９８）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ａｃｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ Ｊ．１７、６４３７−６４４８．］このアッセイを使用して、Ａ部位に結合する新たな抗生物質を発見し、ならびに酵素で改変されたアミノグリコシドの結合をモニターした。［Ｌｌａｎｏ−Ｓｏｔｅｌｏ，Ｂ．、Ａｚｕｃｅｎａ，Ｅ．Ｆ．，Ｊｒ．、Ｋｏｔｒａ，Ｌ．Ｐ．、Ｍｏｂａｓｈｅｒｙ，Ｓ．とＣｈｏｗ，Ｃ．Ｓ．（２００２）．Ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ａｃｙｌ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｉｔｅ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９、４５５−４６３；およびＨａｄｄａｄ，Ｊ．、Ｋｏｔｒａ，Ｌ．Ｐ．、Ｌｌａｎｏ−Ｓｏｔｅｌｏ、Ｋｉｍ，Ｃ．Ａ．、Ｅ．Ｆ．，Ｊｒ．、Ｌｉｕ，Ｍ．Ｖ．、Ｓ．Ｂ．、Ｌｅｅ．Ｈ．Ｃ．、Ｃ．Ｓ．とＭｏｂａｓｈｅｒｙ，Ｓ．（２００２）．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｔｈａｔ Ｂｉｎｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｉｔｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４、３２２９−３２３７．］アミノグリコシドアナログの１種が、ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡを上回る１６Ｓ ｒＲＮＡへの結合の４５倍の増強を表し（Ａ１４０８対Ｇ１４０８）、リガンド結合の高い特異性がほとんど同一の配列をもつＲＮＡについてさえ達成され得ることを示す。このアッセイで、標的ＲＮＡフラグメントの５’端をフルオレセイン若しくは別の色素で標識する。あるいは、ＲＮＡを、５’ビオチン標識を伴い化学的に合成し得る。［Ｃａｎｎｏｎｅ，Ｊ．Ｊ．、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｓ．、Ｓｃｈｎａｒｅ，Ｍ．Ｎ．、Ｃｏｌｌｅｔｔ，Ｊ．Ｒ．、Ｄ’Ｓｏｕｚａ，Ｌ．Ｍ．、Ｄｕ，Ｙ．、Ｆｅｎｇ，Ｂ．、Ｌｉｎ，Ｎ．、Ｍａｄａｂｕｓｉ，Ｌ．Ｖ．、Ｍｕｌｌｅｒ，Ｋ．Ｍ．、Ｐａｎｄｅ，Ｎ．、Ｓｈａｎｇ，Ｚ．、Ｙｕ，Ｎ．とＧｕｔｅｌｌ，Ｒ．Ｒ．（２００２）．Ｔｈｅ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＲＮＡ Ｗｅｂ（ＣＲＷ）Ｓｉｔｅ：ａｎ ｏｎｌｉｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ，ｉｎｔｒｏｎ，ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ＲＮＡｓ：Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３、１５．］このアッセイの１利点は、ＲＮＡおよびリガンドの小容量および濃度のみが必要とされ（μＬ、ｎＭ−μＭ）かつそれを９６若しくは３８４ウェルプレート形式に適合させ得ることである。
本発明の標的をスクリーニングするのに使用しうる別のアッセイは「３Ｆ−ＦＲＥＴ」アッセイである。［Ｂａｔｅｙ，Ｒ．Ｔ．とＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．（１９９６）．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ１５ ｗｉｔｈ １６Ｓ ｒＲＮＡ：ＩＩ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ＲＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６１、５５０−６７．］このアッセイは、リガンドの存在下でのＲＮＡフラグメントのコンホメーション変化およびリガンドによるリボソームタンパク質／ｒＲＮＡ複合体の破壊の双方を検出し得る３フルオロフォア蛍光共鳴エネルギー移動アッセイである。
３Ｆ−ＦＲＥＴアッセイは、リボソーム集成の小分子阻害剤についてスクリーニングするのに使用されている。３０Ｓリボソームサブユニットの集成の間に、小サブユニットタンパク質が階層的様式で１６Ｓ ｒＲＮＡに結合する。Ｓ１５は、１６Ｓ ｒＲＮＡの中央ドメイン中の三方向結合部と相互作用しかつコンホメーション変化を誘発する一次結合リボソームタンパク質である。該アッセイにおいて、Ｓ１５結合部位を含有するＲＮＡフラグメントを２種のフルオロフォアで標識し、そして第三のフルオロフォアをＳ１５タンパク質に結合する。結合部に結合しかつコンホメーションに影響を及ぼす化合物を同定し得る。該アッセイは高度に感受性でありかつハイスループットスクリーニングのため３８４ウェルマイクロタイタープレート中で実施し得る。
双方のアッセイの応用は下に見出される例示でさらに論考する。
化合物ライブラリー
大部分の化合物集合物およびコンビナトリアルケミストリーが、タンパク質に結合する分子の同定に基づいて設計された。リボソームのＲＮＡ分子は多数のタンパク質に結合し、そして、該過程はＲＮＡ分子の規定された三次元構造に依存する。本発明のｒＲＮＡ標的はｒＲＮＡ／タンパク質相互作用に関与しうる。潜在的薬物リードは、タンパク質との相互作用が阻害されるように核酸の機能的三次元構造を変えうるか、若しくはそれらは能力のあるＲＮＡ−タンパク質複合体の形成を予防しうる。これゆえに、タンパク質を標的とした治療薬で使用される同一化合物をスクリーニングしうる一方、ＲＮＡと相互作用するように特別に設計される化合物もまたスクリーニングしうる。ｒＲＮＡ標的の天然のリガンドはタンパク質のＲＮＡ結合ドメインであることがありそうであるため、該戦略は、ファージおよびペプチドライブラリーと一緒にＲＮＡ結合分子を含有する化合物ライブラリーを使用して弱い結合ヒットを見出すことである。これらのヒットをその後、構造研究において標的と一緒に分析し、次いでリードを開発する。
ファージおよびペプチドライブラリーをスクリーニングに使用しうる。ファージディスプレイの方法論は、ｒＲＮＡ領域のような標的に対する高親和性をもつペプチドリガンドおよびそれらの機能的変異体を製造するための便宜的一方法を提供する。この化合物分類は、ｉ）多数のペプチドが抗生物質活性を表す；ｉｉ）ペプチドはＲＮＡ分子を結合する証明された能力を有する；ｉｉｉ）標準的な２０種のアミノ酸のみを使用する分子多様性のレベルは莫大であり；「非天然の」アミノ酸の包含は該多様性をなおさらに劇的に増大
させる；ｉｖ）ペプチドの生成（ファージディスプレイ若しくは化学合成いずれかによる）は慣例でありかつ高度に信頼できる；ｖ）ペプチドリードは、ペプチド以外のリガンドおよびペプチド模倣物を生成するための基礎として使用し得る、ならびにｖｉ）ペプチドおよびそれらの誘導体は治療薬としての使用の歴史を有する、ために選ばれた。［Ｂａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｅ．とＲｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．（２００２）．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ Ａｒｔｉｆｉｃａｌ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ＲＮＡ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１１、２６８８−２６９６；Ａｄａｎｇ，Ａ．Ｅ．Ｐ．、Ｈｅｒｍｋｅｎｓ，Ｐ．Ｈ．Ｈ．、Ｌｉｎｄｅｒｓ，Ｊ．Ｔ．Ｍ．、Ｏｔｔｅｎｈｅｉｊｍ，Ｈ．Ｃ．Ｊ．とｖａｎ Ｓｔａｖｅｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．（１９９４）．Ｃａｓｅ Ｈｉｓｔｏｒｉｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ Ｄｒｕｇｓ．Ｒｅｃｌ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．Ｐａｙｓ−Ｂａｓ １１３、６３−７８；およびＫｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ，Ｔ．、Ｍｕｒａｌｉ，Ｒ．とＧｒｅｅｎｅ，Ｍ．Ｉ．（１９９７）．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．８、４３５−４４１．］重要なことに、これらの実験は、標的の高分解能構造、若しくは標的および実現可能な（機能的）突然変異のどの領域（１個若しくは複数）が構造的に類似であるかについての情報のいかなる事前の知識なしにも実施し得る。最後に、ペプチドおよび他の有機リガンドを、バルジ形成した（ｂｕｌｇｅｄ）残基および拡大されかつ接近可能な主溝（提案される標的中に存在しうる構造）を含有するＲＮＡ領域を結合するように設計し得る。［Ｈｗａｎｇ，Ｓ．、Ｔａｍｉｌａｒａｓｕ，Ｎ．、Ｒｙａｎ，Ｋ．、Ｈｕｑ，Ｉ．、Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｓ．、Ｓｔｉｌｌ，Ｗ．Ｃ．とＲａｎａ，Ｔ．Ｍ．（１９９９）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６、１２９９７−１３００２；Ｍｕｃｈａ，Ｐ．、Ｓｚｙｋ，Ａ．、Ｒｅｋｏｗｓｋｉ，Ｐ．、Ｗｅｉｓｓ，Ｐ．Ａ．とＡｇｒｉｓ，Ｐ．Ｆ．（２００１）．Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ Ｄｏｍａｉｎ Ｍａｔｈｙｌａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｏｆ Ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡＰｈｅ ａｒｅ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｍｉｎａｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｏｆ ａ Ｐｈａｒｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０、１４１９１−１４１９９；Ｍｕｃｈａ，Ｐ．、Ｓｚｙｋ，Ａ．、Ｒｅｋｏｗｓｋｉ，Ｐ．、Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，Ｒ．とＡｇｒｉｓ，Ｐ．Ｆ．（２００２）．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｗｉｔｈ Ｐｈａｒｇｅ−Ｄｉｓｐｌａｙ Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ．ＲＮＡ ８、６９８−７０４；Ｗａｎｇ，Ｙ．、Ｈａｍａｓａｋｉ，Ｋ．とＲｎａｄｏ，Ｒ．Ｒ．（１９９７）．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ １６Ｓ ｒＲＮＡ Ｄｅｃｏｄｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ＨＩＶ−ＲＲＥ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｒｅｇｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６、７６８−６６９；およびＬｉｎｄ，Ｋ．Ｅ．、Ｄｕ，Ｚ．、Ｆｕｊｉｎａｇａ，Ｋ．、Ｐｅｔｅｒｌｉｎ，Ｂ．Ｍ．とＪａｍｅｓ，Ｔ．Ｌ．（２００２）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ａｓｓａｙ，ａｎｄ ＮＭＲ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｈａｔ Ｔａｒｇｅｔ ＴＡＲ ＲＮＡ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９、１８５−１９３．］
「ヒット」の集合物が一旦生成されれば、ハイスループットスクリーニングのための新たな化合物の選択を導くために、化合物の集中されたライブラリーを、ペプチドおよび化合物の構造を使用して集成する。これらの努力は、合理的決断を行うことを可能にする、ＲＮＡ−リガンド複合体のＮＭＲ研究、および各リガンドに対する部位特異的化学変化に
よる結合相互作用の微調整により補助されうる。商業的に入手可能な化合物および特許の集合物を本発明の方法で使用しうる。
標的および化合物の構造研究
ヒット（ペプチドおよび化合物）ならびに薬物リードのそれらの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒＲＮＡ標的との相互作用を、ＮＭＲ分光法を使用して特徴付けして、該相互作用で重要な、重要な官能基を決定する。このデータは、合理的薬物設計および医薬品化学を使用する薬物リードの改変において生物学的利用性、薬力学を改良しかつ毒性を低減するために役立つ。
ＮＭＲ研究はいくつかの型の決定的に重要な情報を提供する。第一に、ＮＭＲを使用して、リボソームの情況から採用された単離されたＲＮＡ標的の構造がリボソーム中でのそれらの構造に似ているかどうか、そして従って化合物ライブラリーをスクリーニングするための妥当な標的であることができるかどうかを確認する。ＮＭＲ分光法は、小分子リガンドのＲＮＡ標的との結合の機構に関する詳細な立体化学情報もまた提供する。最後に、ＮＭＲ研究は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とヒト小サブユニットｒＲＮＡの間の決定的に重要な差違を示す。野生型および変異体の構造の比較は、リボソーム機能に必要とされる不可欠な官能基および機能的折り畳み（ｆｏｌｄ）を示すことができ、それによりこれらの決定的に重要な残基に薬物の設計の焦点を当てる。ＲＮＡ−リガンド複合体の構造の特徴付けは、各化合物が不可欠な標的モチーフをどのように認識するかを示すことができる。さらに、結合された薬物リードの存在および非存在下でのＮＭＲによるＲＮＡダイナミックスの特徴付けは、ＲＮＡ認識における誘導適合の役割を示すことができる。［Ｃｈｏｗ，Ｃ．Ｓ．とＢｏｇｄａｎ，Ｆ．Ｍ．（１９９７）．Ａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ＲＮＡ−Ｌｉｇａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７、１４８９−１５１３．］
標的の検証
潜在的薬物化合物を、真核生物および細菌のｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成アッセイで試験する。野生型および変異体の細菌リボソームを阻害するがしかし真核生物リボソームを阻害しない化合物をさらに開発し、そして選択された標的のｉｎ ｖｉｔｒｏ検証を可能にする。
別の態様において、上で同定される機能上重要な領域を、生物体の緊密に関係した群にそれらが存在するかどうかに基づき群に分割する。例えば、ｒＲＮＡのいくつかの領域は全細菌中で見出されるがしかし他の生物体で見出されない。ｒＲＮＡの他の領域は、特定の１種のメンバー、例えばミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）若しくは連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）のメンバーの全部のような、細菌の緊密に関係した群でのみ見出される。
さらなる一態様において、生物体の非常に大きな群、例えば全細菌若しくは全真菌で見出される領域を、その群内の多数の生物体からの感染症を処置するのに使用しうる広域スペクトルの抗生物質を開発するのに使用する。本発明の方法は、同定されるこれらの領域および機能的変異体リボソームで実施しうる。これらの機能的変異体リボソームは例えば化合物ライブラリーでスクリーニングしうる。
なお別の態様において、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の全メンバー若しくはミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の全メンバーのような、生物体の比較的小さな群においてのみ位置する領域を、これらのより小さな群にある生物体の増殖のみを阻害することができる狭域スペクトルの抗生物質を設計するのに使用しうる。本発明の方法は、同定されるこれらの領域および機能的変異体リボソームで実施しうる。こ
れらの機能的変異体リボソームは例えば化合物ライブラリーでスクリーニングすることができる。
本発明の方法
本発明の一局面は、
核酸の蛍光を測定してそれにより第一の蛍光示度を確立する段階；
試験化合物を前記核酸と接触させる段階、および生じる蛍光を測定してそれにより第二の蛍光示度を確立する段階；
前記第一の蛍光示度と前記第二の蛍光示度の間の差違を決定する段階；ならびに
前記第一の蛍光示度と前記第二の蛍光示度の間の差違がゼロでない化合物を選択して、それにより作用物質を同定する段階
を含んでなる、前述の核酸のいずれかに結合する作用物質の同定方法に関する。
ある態様において、本発明は、
同定された作用物質を改変してそれにより改変された作用物質を形成する段階；ならびに前記改変された作用物質を前記核酸と接触させる段階、および生じる蛍光を測定してそれにより改変された第二の蛍光示度を確立する段階；
前記第一の蛍光示度と前記改変された第二の蛍光示度の間の差違を決定する段階；ならびに
前記第一の蛍光示度と前記第二の改変された蛍光示度の間の差違がゼロでない化合物を選択して、それにより改変された作用物質を同定する段階
をさらに含んでなる、前述の方法に関する。
本発明の別の局面は、
前述の核酸のいずれかの蛍光を測定してそれにより第一の蛍光示度を確立すること；
試験化合物を前記核酸と接触させること、および生じる蛍光を測定してそれにより第二の蛍光示度を確立すること；
前記第一の蛍光示度と前記第二の蛍光示度の間の差違を決定すること；
前記第一の蛍光示度と前記第二の蛍光示度の間の差違がゼロでない化合物を選択して、それにより作用物質を同定すること；
細胞、細胞抽出液若しくは精製されたリボソームにそれを投与することにより、該作用物質の阻害特性をアッセイすること；ならびに
タンパク質合成を検出することであって；ここで、タンパク質合成の減少は該作用物質がタンパク質合成の阻害剤であることを示す、
を含んでなる、タンパク質合成の阻害剤の同定方法に関する。
ある態様において、本発明は、作用物質の阻害特性をアッセイすることが、タンパク質合成を検出することを含んでなる、前述の方法に関する。
ある態様において、本発明は、作用物質の阻害特性をアッセイすることが、ｍＲＮＡ翻訳を阻害することについての阻害定数を決定することを含んでなる、前述の方法に関する。
本発明の別の局面は、前述の方法いずれか１つ得られる化合物に関する。本発明のなお別の局面は、患者が、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などにより引き起こされる感染症のような微生物感染症と関連する状態に苦しめられている、前記方法のいずれか１つにより得られる化合物のそれの必要な患者への投与方法に関する。ある態様において、前記微生物感染症は細菌感染症である。
［実施例］
例示
本発明は今や全般的に記述されたので、本発明のある局面および態様の具体的説明の目的上単に包含されかつ本発明を制限することを意図していない以下の実施例を参照することにより、それはより容易に理解されるであろう。
標的の選択
サブドメインを、特定の選択基準を使用して本明細書で同定される６４のＲＮＡ「目的領域」から潜在的標的として選択する。本明細書で同定される標的のうち８種は既知の抗生物質標的である。５６の潜在的薬物標的の残存するプールから、これらの領域のいくつかを、以下の基準、すなわち（１）大きさおよび複雑さ、（２）修飾ヌクレオチドの非存在、（３）タンパク質若しくはｒＲＮＡの他の部分との既知の相互作用、（４）溶媒への接近可能性、（５）対応するヒト配列からの差違、（６）単離されたＲＮＡ標的が正しくフォールディングするかどうか、およびＮＭＲ分析に従いやすいかどうか、ならびに（７）既知のリガンドがそこに存在するかどうか、に基づき、さらなる開発のため選ぶ。
配列組成およびヒトｒＲＮＡに対する類似性に基づき標的のいくつかを除外した後、残存する標的ＲＮＡを、正しくフォールディングしかつそれらが完全なリボソーム中で有すると同一の天然のコンホメーションを有するそれらの能力について評価する。各目的領域の小サンプルを合成し、そし１Ｄ ＮＭＲ実験を実施してどの領域が正しくフォールディングするか（完全なリボソームの情況での該領域と比較して）、およびどれが最良のＮＭＲスペクトルを示しかつ従ってＮＭＲ構造決定に従いやすいかを決定する。標的は溶媒への曝露に際しての変化（該標的が接近可能であるかどうかをわれわれに告げる）についてもまた評価する。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の標的を、標準的ホスホルアミダイト化学を使用して合成し、また、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから商業的に得ることができる。比較的単純な一連の実験がＲＮＡの相同性構造を確認する。各目的領域について、化学的プロービング実験を、単離されたドメインならびに完全な３０Ｓリボソームで実施して、それらが類似の反応性パターンおよび従って類似の構造を有するかどうか決定する。類似のパターンを示す領域を、１ＤイミノプロトンＮＭＲおよび２Ｄ ＮＯＥＳＹにより研究する。野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ドメインの帰属の利用可能性は、われわれがＮＯＥのパターンおよび化学シフトを一致させて野生型および単離された領域の構造が類似であるかどうかを定性的に決定することを可能にする。
標的の改良
「即時進化」を使用して、ＲＮＡサブドメイン中の薬作用物質耐性につながり得るすべての突然変異を同定し、また、ＮＭＲ分光法および相同性モデル化を使用して２標的の不可欠の構造成分を決定する。
薬物標的の飽和突然変異誘発およびクロラムフェニコール選択実験を、即時進化を使用して実施して、実現可能な変異体を同定する。実現可能な変異体を配列決定し、アッセイしかつ分析して、各標的の不可欠の成分を同定する。各変異体のＧＦＰ産生を、全細胞中のＧＦＰ蛍光を測定することにより決定する。飽和突然変異誘発実験で同定される不可欠の配列および構造モチーフを、標的ＲＮＡ中の提案されたモチーフを破壊若しくは維持するのいずれかの部位特異的突然変異を構築すること、およびタンパク質合成に対する該突然変異の影響をｉｎ ｖｉｖｏで測定することにより検証する。
ＲＮＡ相同性モデル化ソフトウェア（例えばＪｏｈｎ ＳａｎｔａＬｕｃｉａ博士およ
びＤＮＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．により共同で開発されたもの）を使用して、野生型標的、実現可能な変異体および対応するヒト配列の構造を予測する。該ソフトウェアは既知の３Ｄ構造の入力を必要とする。次に、該ソフトウェアは、３Ｄ構造中のどこで置換、欠失若しくは挿入を行うことができるかを決定するために配列アライメントを必要とする。各ドメインの配列アライメントは、双方の二次構造からの対にされた残基が適正な登録にある、制約にかけられる配列アライメントを自動的に実施するＳＢＳＡ（構造に基づく配列アライメント（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｂａｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ））と呼ばれる新たなアライメントプログラムを用いて行いうる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの１６Ｓ ｒＲＮＡおよびヒト１８Ｓ ｒＲＮの系統発生的に決定された二次構造が利用可能である。
無作為突然変異誘発および実現可能な変異体の選択。飽和突然変異誘発を、Ｈｉｇｕｃｈｉにより本質的に記述されるところのＰＣＲ突然変異誘発により実施する。［Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．（１９８９）．Ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｔｏ ｅｎｇｉｎｅｅｒ ＤＮＡ．ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．編）中ｐｐ．６１−７０、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク。（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．編版）．］部分的無作為化突然変異を、組換えＰＣＲを使用して導入し、ｐＲＮＡ１２３にクローン化し、そして電気穿孔法により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５細胞を形質転換するのに使用する。所定の標的の実現可能な変異体の数は、選択の緊縮性および標的の機能的制約に依存する。実現可能な変異体を単離するために、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧおよび５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天上に形質転換体をプレーティングする。これは、第二の部位の補完突然変異の連続的蓄積により耐性につながりうる低下させた活性をもつ突然変異を排除することを回避するための系で野生型リボソームを発現する細胞のクロラムフェニコールの最小阻害濃度（ＭＩＣ）（７００μｇ／ｍｌ）の有意に下である。［Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｊ．、Ｎａｇａｅｖ，Ｉ．、Ｂｅｒｇ，Ｏ．Ｇ．、Ｈｕｇｈｅｓ，Ｄ．とＡｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｄ．Ｉ．（２０００）．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｏｎ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｏ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ ｃｏｓｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７、１４７９−８２；およびＡｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｄ．Ｉ．、Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｊ．とＨｕｇｈｅｓ，Ｄ．（１９９８）．｛Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｈｅｒｅ ｔｏ ｓｔａｙ？Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｒｅｓｔｏｒｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ｝．Ｌａｋａｒｔｉｄｎｉｎｇｅｎ ９５、３９４０、３９４３−４．］ＰＣＲ反応、制限酵素消化、ＤＮＡライゲーションおよび電気穿孔法は標準的手順に従って実施することができる。電気穿孔法は、実現可能な変異体の単離のための十分な形質転換体を提供するために、ＢＴＸ高容量（８００μｌ）電気穿孔チャンバーを使用して実施することができる。
単離および特徴付けは、各標的について約３００の実現可能な変異体について実施する。分析される変異体の最終数は、これらの変異体からのデータの初期評価に依存する。予備実験に基づき、３００の変異体は各部位の実現可能な変異体の総数を超えるようであり、そして、機能に不可欠である標的の成分の同定を可能にするのに十分であるはずである。再サンプリングの統計学を使用して、当初の３００の単離物からのデータに基づき実現可能な変異体の可能な総数が決定された。［Ｌｅｅ，Ｋ．、Ｖａｒｍａ，Ｓ．、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｊ．，Ｊｒ．とＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｐ．Ｒ．（１９９７）．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ７９０ ｌｏｏｐ ｉｎ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６９、７３２−４３；およびＺｈａｎｇ，Ｋ．とＺｈａｏ，Ｈ．（２０００）．Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｇａｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｆｒｏｍ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ．Ｆｕｎｃｔ Ｉｎｔｅｇｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １、１５６−７３．］実現可能な変異体の予測される数が３００の初期単離物より大きい場合、付加的な変異体を単離しかつ特徴付けして、可能な標的部位変異体の大部分が単離されたことを確認する。変異体構築物を、双方の外的ライゲーション結合部を通して配列決定して、増幅反応の間に挿入されたプログラムされない突然変異の存在について確認する。
ＧＦＰアッセイ。一夜培養物をＬＢ−Ａｍｐ１００培地で希釈し、そして３７℃で振とうしながらＯＤ６００＝０．１まで増殖させる。培養物をＩＰＴＧ（１ｍＭ）で誘導し、そして振とうしながら追加の３時間インキュベートする。インキュベーション後に１ｍｌの各培養物を取り出し、ペレットにし、２回洗浄しそして緩衝液に再懸濁する。細胞密度（ＯＤ６００）を測定し、また、蛍光（励起＝３９５ｎｍ、測定＝５０９ｎｍ）をＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＧＥＭＩＮＩマイクロプレート蛍光計を使用して測定する。各培養物について、蛍光をＯＤ６００により除算しそして野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）構築物のパーセントとして提示する。各構築物のアッセイは最低３回実施し、そして結果を平均する。
相同性モデル化。前に記述したＲＮＡ相同性モデル化ソフトウェアを使用して、野生型標的、実現可能な変異体およびヒトドメインの構造を予測する。各標的の配列アライメントを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの１６Ｓ ｒＲＮＡおよびヒト１８Ｓの既知の系統発生的に決定された構造を比較することにより行う。構造は機能的変異体の数についてもまた予測することができる。野生型および変異体の構造を重ね合わせて、全部の機能的変異体中で保存されている官能基を示す。
高分解能構造の決定。当初の焦点は野生型標的およびヒトｒＲＮＡにある。これに高度に機能的な変異体の配列の分析が続き；これらの変異体構造の２種を各標的について解明する。ＮＭＲは、野生型配列の帰属が一旦知られれば、変異体構造の解明に良好に適合される。
ＮＭＲサンプル調製。ＮＭＲサンプルは、標準的ホスホルアミダイト化学を使用して合成するか、若しくはラン・オフ転写を使用して生成する。高度に構造化されたＲＮＡは、しばしば、一本鎖合成鋳型よりも直鎖状にされたプラスミドからより効率的に転写される。合成鋳型を商業的供給源から注文し、そして収量が十分でない場合（とりわけ標識サンプルが必要とされる場合）にはプラスミドを調製する。研究されるべきｒＲＮＡ配列のそれぞれに対応するＤＮＡ二重鎖をプラスミドｐＷＫ１２２にクローン化する。このプラスミドは、Ｔ７クラスＩＩＩプロモーターおよびラン・オフ転写を助長する制限部位を含有する。［Ｋｒｚｙｚｏｓｉａｋ，Ｗ．、Ｄｅｎｍａｎ，Ｒ．、Ｎｕｒｓｅ，Ｋ．、Ｈｅｌｌｍａｎｎ，Ｗ．、Ｂｏｕｂｌｉｋ，Ｍ．、Ｇｅｈｒｋｅ，Ｃ．Ｗ．、Ａｇｒｉｓ，Ｐ．Ｆ．とＯｆｅｎｇａｎｄ，Ｊ．（１９８７）．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ ｃｈａｎｇｅｓ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎｔｏ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ３０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６、２３５３−６４。転写反応は以前に記述されたとおり実施することができる。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｐ．Ｒ．、Ｎｅｇｒｅ，Ｄ．、Ｗｅｉｔｚｍａｎｎ，Ｃ．、Ｄｅｎｍａｎ，Ｒ．、Ｎｕｒｓｅ，Ｋ．とＯｆｅｎｇａｎｄ，Ｊ．（１９８８）．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ １６Ｓ ＲＮＡ ｉｎ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ Ｅｘｐ （Ｓａｎｔｉａｇｏ）２１、３９３−４０１．］転写物を変性ポリアクリルアミドゲルで精製し、そして電気溶離により回収する。十分な転写を得るために、Ｔ７プロモーターの一部を形成する最初の数ヌクレオチドをグアニンおよびシトシンに変異することがしばしば必要である。これが配列に必要である場合は、それらの生物学的活性を、７９０ループの研究についてなされたとおり、ｐＲＮＡ１２３にコードされる全リボソーム中で同一の変異体を作成することにより確認する。［Ｌｅｅ，Ｋ．、Ｖａｒｍａ，Ｓ．、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｊ．，Ｊｒ．とＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｐ．Ｒ．（１９９７）．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ７９０ ｌｏｏｐ ｉｎ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６９、７３２−４３．］
標識ＮＭＲサンプルの調製。ＲＮＡの均一な１３Ｃおよび１５Ｎ標識は公表された方法を使用して実施する。［Ｎｉｋｏｎｏｗｉｃｚ，Ｅ．Ｐ．、Ｓｉｒｒ，Ａ．、Ｌｅｇａｕｌｔ，Ｐ．、Ｊｕｃｋｅｒ，Ｆ．Ｍ．、Ｂａｅｒ，Ｌ．Ｍ．とＰａｒｄｉ，Ａ．（１９９２）．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ １３Ｃ ａｎｄ １５Ｎ ｌａｂｅｌｌｅｄ ＲＮＡｓ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｕｌｔｉ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ＮＭＲ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０、４５０７−４５１３；Ｂａｔｅｙ，Ｒ．Ｔ．、Ｉｎａｄａ，Ｍ．、Ｋｕｊａｗｉｎｓｋｉ，Ｅ．、Ｐｕｇｌｉｓｉ，Ｊ．Ｄ．とＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．（１９９２）．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ ｌａｂｅｌｌｅｄ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ＲＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０、４５１５−４５２３．］均一な標識は、多次元で共鳴を分解することにより、および磁化の結合を通しての（ｔｈｒｏｕｇｈ−ｂｏｎｄ）移動に頼ることにより、共鳴の帰属を容易にする。こうした標識は、Ｅ．ＣＯＳＹ型の方法により測定される異核Ｊカップリングおよび残余の双極子結合により有意の付加的な情報もまた提供する。
標的スクリーニング
化合物、ファージおよびペプチドライブラリーを、野生型標的および該標的の実現可能な変異体に対しスクリーニングする。ＲＮＡ結合能力をもつ化合物およびファージのライブラリーを構築し、そして選択およびハイスループット蛍光アッセイを使用してスクリーニングして、野生型ｒＲＮＡ標的およびこれらのｒＲＮＡ標的の実現可能な変異体に対する高親和性しかしヒトリボソームに対する低親和性をもつリード化合物を単離する。ヒットのそれらの標的との相互作用の性質を、リード−標的複合体のＮＭＲ分析および他の生物物理学的研究により決定する。初期ヒットの集合物を生成しかつ配列情報を得た後に、ＲＮＡ結合分子を含有する化合物ライブラリーを合成し、そして商業的および非商業的供給源からアクセスする。初期リードの単量体に似ている構造および機能の特徴をもつ制限された一組の入力構成要素を使用することにより、ＲＮＡ標的との結合相互作用をさらに高めかつ至適化する。ＲＮＡは前に記述されたとおり合成することができる。
５Ｆ蛍光に基づくアッセイ。蛍光標識ＲＮＡを化学的方法により合成し、そして本明細書に記述されるところの標準的手順により脱保護する。化学合成の最後の段階の間にフルオレセインをＲＮＡの５’端に付加する。他の色素を利用し得、そして対応する商業的ホスホルアミダイトを使用して結合し得る。ヒトｒＲＮＡ配列および非特異的競合体ＲＮＡを、いかなる標識も伴わずに合成する。５Ｆ標識ＲＮＡとのインキュベーション後に、蛍光を発する化合物ライブラリービーズを選択し、そして文献に記述されるとおりアッセイする。［Ｈｗａｎｇ，Ｓ．、Ｔａｍｉｌａｒａｓｕ，Ｎ．、Ｒｙａｎ，Ｋ．、Ｈｕｑ，Ｉ．、Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｓ．、Ｓｔｉｌｌ，Ｗ．Ｃ．とＲａｎａ，Ｔ．Ｍ．（１９９９）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６、１２９９７−１３００２；Ｒｏｔｈｍａｎ，Ｊ．Ｈ．とＳｔｉｌｌ，Ｗ．Ｃ．（１９９７）．Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ：Ａ Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ Ｍｉｍｉｃｓ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｄ−Ａｌａ−ｄ−Ａｌａ Ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７、３１５９−３１６４；およびＬａｍ，Ｋ．Ｓ．、Ｗａｄｅ，Ｓ．、Ａｂｄｕｌ−Ｌａｔｉｆ，Ｆ．とＬｅｂｌ，Ｍ．（１９９５）．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｃｈｅｍｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａ Ｒａｎｄｏｍ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８０、２１９−２２３．］特異性は、目的の構造モチーフを欠く未標識ＲＮＡで非特異的結合する化合物を阻害することにより達成される。［Ｈｗａｎｇ，Ｓ．、Ｔａｍｉｌａｒａｓｕ，Ｎ．、Ｒｙａｎ，Ｋ．、Ｈｕｑ，Ｉ．、Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｓ．、Ｓｔｉｌｌ，Ｗ．Ｃ．とＲａｎａ，Ｔ．Ｍ．（１９９９）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６、１２９９７−１３００２．］ビーズのライブラリーをＦ標識した標的野生型ＲＮＡとインキュベートする。洗浄段階を、特異的若しくは非特異的いずれかのＲＮＡ（１０−２５μＭ）を用いて実施する。非特異的ＲＮＡは、内的ループへの結合について選択するために、標的ＲＮＡの二重鎖領域である。感受性のレベルは約５０ｐモルであることが期待され、従って、結合が、高いｎＭないしμＭの解離定数をもつ化合物について検出される。洗浄段階でのより高い緊縮性を標的ＲＮＡに対するより高い親和性をもつペプチドについて選択するために後の回で適用し得る。ビーズを、ＣＣＤカメラおよび画像処理ソフトウェアを装備した蛍光顕微鏡を使用して画像化し；蛍光を発するビーズを選択しかつ混合物から取り出す。野生型ＲＮＡ配列に結合する化合物を固定したビーズが一旦同定されれば、変異体ＲＮＡとの競合研究を実施して、関連するＲＮＡの全部に対する結合親和性をもつペプチドを発見する。ヒトＲＮＡ配列について、競合アッセイを実施し、そして蛍光を発するビーズを保持する（すなわち細菌ＲＮＡに結合するがしかしヒトＲＮＡにしないビーズについて選択する）。フルオレセイン標識ＲＮＡで成功が存在しない場合は、使用しうるビーズ選択に成功裏に適用されている色素の多様な組合せを用いる他の応用が文献に存在する。［Ｈｗａｎｇ，Ｓ．、Ｔａｍｉｌａｒａｓｕ，Ｎ．、Ｒｙａｎ，Ｋ．、Ｈｕｑ，Ｉ．Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｓ．、Ｓｔｉｌｌ，Ｗ．Ｃ．とＲａｎａ，Ｔ．Ｍ．（１９９９）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６、１２９９７−１３００２；Ｒｏｔｈｍａｎ，Ｊ．Ｈ．とＳｔｉｌｌ，Ｗ．Ｃ．（１９９７）．Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ：Ａ Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ
ｏｆ Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ Ｍｉｍｉｃｓ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｄ−Ａｌａ−ｄ−Ａｌａ Ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７、３１５９−３１６４；およびＬａｍ，Ｋ．Ｓ．、Ｗａｄｅ，Ｓ．、Ａｂｄｕｌ−Ｌａｔｉｆ，Ｆ．とＬｅｂｌ，Ｍ．（１９９５）．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｃｈｅｍｅ ｉｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａ Ｒａｎｄｏｍ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８０、２１９−２２３．］
３Ｆ−ＦＲＥＴアッセイ。本アッセイは、１６Ｓ ｒＲＮＡ中のヘリックス２０、２１および２２により形成される三方向結合部（３ＷＪ）へのリボソームタンパク質Ｓ１５の結合を使用する。［Ｂａｔｅｙ，Ｒ．Ｔ．とＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．（１９９６）．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｕｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ１５ ｗｉｔｈ Ｓ１６ ｒＲＮＡ：ＩＩ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ＲＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６１、５５０−６７；およびＳｅｒｇａｎｏｖ，Ａ．Ａ．、Ｍａｓｑｕｉｄａ，Ｂ．、Ｗｅｓｔｈｏｆ，Ｅ．、Ｃａｃｈｉａ，Ｃ．、Ｐｏｒｔｉｅｒ，Ｃ．、Ｇａｒｂｅｒ，Ｍ．、Ｅｈｒｅｓｍａｎｎ，Ｂ．とＥｈｒｅｓｍａｎｎ，Ｃ．（１９９６）．Ｔｈｅ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ１５：ｃｏｍｐａｒｏｓｏｎ ｗｉｔｈ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｓ１５、ｍｉｎｉｍｕｍ ｓｉｔｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ＲＮＡ、２、１１２４−１１３８．］これは、３０Ｓサブユニット集成の初期段階における機能的な細菌の７０Ｓリボソームの形成で重要な段階である。Ｓ１５の結合は、この結合部で１６Ｓ ｒＲＮＡのコンホメーション変化を誘発し、そしてリボソーム集成の間のその後の結合事象の必要条件としてはたらく。［Ｏｒｒ，Ｊ．Ｗ．、Ｈａｇｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｊ．とＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．（１９９８）．Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｇ（２＋）−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓ１５ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｆ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５、４５３−４６４．］類似のコンホメーション変化は、他のリボソームタンパク質がＲＮＡに結合する場合に起こる。
ハイスループットスクリーニングのための蛍光に基づくアッセイ。上述された蛍光アッセイは、ペプチドおよび化合物ライブラリーを用いるハイスループットアッセイでの使用に適合される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）標的に結合するビーズが一旦同定されれば、化合物を製造し得、そして９６若しくは３８４ウェルプレートに結合し得かつ標的ＲＮＡの実現可能な変異体でスクリーニングし得る。唯一のＦ標識ＲＮＡ標的が製造されることを必要とするような競合アッセイを使用することができる。この様式で、実現可能な変異体への結合を蛍光の喪失によりハイスループットの様式で評価し得る。蛍光プレートリーダーを使用し、その結果、多くのＲＮＡ若しくは化合物を短時間で評価し得る。前向きの新たな化合物の相互作用を分析し、そして選択された化合物および変異体標的配列を用いるさらなるハイスループット結合アッセイ、次いでリードの至適化を実施する。二色アッセイを使用して、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および変異体の配列のような２種の特定のＲＮＡ配列間の直接比較を行う。
ｉｎ ｖｉｖｏで単離された実現可能な標的変異体の全部は、それらのリガンド（１種若しくは複数）との標的の適正な相互作用に不可欠である化学および構造特性を有する。これらの特性が何であるかを知らずにさえ、実現可能な変異体を使用してそれらに特異的に結合する薬物リードを同定する。このアッセイの１つの大きな利点は、ＲＮＡ標的およびその機能的変異体を小分子結合について同時に分析し得るような複数のフルオロフォアが入手可能であることである。このスクリーニング法の別の重要な利点は、標的とリードの相互作用をそれらの３Ｄ構造のいかなる事前の知識もなしに同定し得ることである。スクリーニングは、強固に結合する分子（ｎＭ若しくはより良好）が同定されるまで、新たな標的およびリード化合物を用いて反復過程により継続する。
ファージディスプレイライブラリー。２種の商業的ファージディスプレイ系、Ｍ１３およびＴ７をスクリーニングする。一方は、一般に溶菌性ファージ調製物より少ない汚染する細菌タンパク質を含有する繊維状ファージＭ１３（Ｐｈ．Ｄ．−７、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中で構築される。これは、ＲＮアーゼ分解によりＲＮＡ結合ペプチドについてスクリーニングする場合に重要である。［Ｄａｎｎｅｒ，Ｓ．とＢｅｌａｓｃｏ，Ｊ．Ｇ．（２００１）．Ｔ７ ｐｈａｒｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：ａ ｎｏｖｅｌ
ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９８、１２９５４−９．ライブラリーを、５コピーのペプチドを表すＭ１３コートタンパク質ｐＩＩＩへのＮ末端融合としてＭ１３ＫＥ（Ｍ１３ｍｐ１９誘導体）にクローン化する。Ｃｈａ，Ｊ．、Ｂｉｓｈａｉ，Ｗ．とＣｈａｎｄｒａｓｅｇａｒａｎ，Ｓ．（１９９３）．Ｎｅｗ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｇｅｎｅ １３６、３６９−７０．］標準的ヘプタペプチドライブラリーを初期スクリーニングで使用する。プールの複雑さは２．８×１０９形質転換体である。これは、７アミノ酸を無作為化する場合に得られる配列の数（１．２８×１０９）より大きい。他のＭ１３ライブラリーもまた試みられる。Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃライブラリー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）は環状ペプチドを含有しかつより強固な結合ペプチドを生じることができる。直鎖状および環状双方のＭ１３ライブラリーを最初にスクリーニングする。
第二の型のファージディスプレイライブラリーは溶菌性ファージＴ７中で構築する（Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ ４１５−１、Ｎｏｖａｇｅｎ）。ここで、溶菌性ファージの表面上のペプチドの多様性は、細菌膜を通過することのそれらの不能により制限されない。［Ｃａｓｔａｇｎｏｌｉ，Ｌ．、Ｚｕｃｃｏｎｉ，Ａ．、Ｑｕｏｎｄａｍ，Ｍ．、Ｒｏｓｓｉ，Ｍ．、Ｖａｃｃａｒｏ，Ｐ．、Ｐａｎｎｉ，Ｓ．、Ｐａｏｌｕｚｉ，Ｓ．、Ｓａｎｔｏｎｉｃｏ，Ｅ．、Ｄｅｎｔｅ，Ｌ．とＣｅｓａｒｅｎｉ，Ｇ．（２００１）．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃｏｍｂ Ｃｈｅｍ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ ４、１２１−３３．］該ライブラリーは、Ｔ７キャプシドタンパク質１０ＢへのＣ末端融合を生じることができ、そしてファージあたり４１５コピーで存在する。１０Ｂタンパク質は通常、１０Ａ遺伝子のフレームシフトタンパク質として産生されるが、しかし、本構築物中では、フレームシフトシグナルは１種の型のみのキャプシドタンパク質が産生されるように除去されている。欠失されたＲＮアーゼＩ遺伝子を伴う株は、ＲＮＡ標的のスクリーニングにおけるその使用を容易にする。
ＲＮＡ標的のファージライブラリーでのスクリーニング。野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）標的配列を最初にスクリーニングする。結合するファージを単離しかつ増幅することができる。野生型標的をスクリーニングすることに由来するファージのプールを、内的ループ若しくはバルジを欠く二重鎖配列で、対応するヒトｒＲＮＡおよび競合体ＲＮＡに対し対スクリーニングする。ヒト若しくは競合体ＲＮＡに対する親和性を欠くファージを潜在的ヒットとして保持しかつ増幅する。増幅したプールをその後、実現可能な変異体ＲＮＡにもまた結合するファージを単離するのに使用することができる。各結合反応後にファージを増幅しかつ次の標的をスクリーニングするのに使用する。細菌配列の全部を結合するファージをさらなる研究のため保持する。生じるヒットは、従って、細菌中での生存可能性に不可欠である標的の成分を認識するはずである。標的配列は化学合成するか若しくはラン・オフ転写を容易にするプラスミドにクローン化するかのいずれかである。各構築物は、転写物が３’端にＲＮＡ尾部をもつステム中で安定なクランプ配列を形成するように設計する。
ＲＮＡ標的を５’ビオチン結合ＤＮＡとアニーリングするか、若しくは５’ビオチン標識（修飾ヌクレオチドを含有するものについて）を用いて合成する。ストレプトアビジン被覆ビーズを用いる結合反応は、ＲＮＡ（１０〜１２０ｎＭ）、ファージ（１〜５×１０９ｐｆｕ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔＲＮＡおよびＲＮアーゼ阻害剤を含有する。ビーズを遠心分離により回収し、そして結合したファージ（ビーズからの放出を伴わない）を使用して、ビーズからの放出を伴わずに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を感染させる。プラークアッセイを実施してファージを力価測定する。各回のパニング後にファージプールの一部分を配列決定し、そしてライセートのアリコートを次の回の選択に使用することができる。
化合物ライブラリー。ＲＮＡに結合する分子を含有する化合物ライブラリー（合成若し
くは天然いずれかの生成物のライブラリー）をスクリーニングに使用し得る。機能上多彩な有機足場構造もまた合成しうる。初期ヒットの単量体に似ている構造および機能の特徴をもつ、制限された一組の入力構成要素を使用することにより、結合相互作用をさらに高めるか若しくは至適化する。ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートに基づくアッセイの形式は、該化合物がＮ末端でビオチニル化されることを必要とする。使用されるオリゴマーリガンドの全部が、ビオチンに結合され得る遊離末端アミン部分を有する。［Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂ．Ｔ．、Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｔ．Ｊ．、Ｒｏｇｅｒｓ，Ｍ．Ｅ．とＫｕｒｏｓｋｙ，Ａ．（１９９７）．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ａｍｉｎｅ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｅｓｔｅｒｓ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｉｄｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １８、１５８５−１５９５．］初期ヒットの集合物を生成しかつ配列情報を得た後に、小ライブラリー（約１０〜１００化合物）を収集しかつスクリーニングする。第二世代の分子を設計し、そして標的−ヒット複合体の構造研究に基づきアクセス若しくは合成する。確立された方法を使用してリガンドのさらなる至適化に着手する。［Ａｈｎ，Ｊ．Ｍ．、Ｂｏｙｌｅ，Ｎ．Ａ．、ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｍ．Ｔ．とＪａｎｄａ，Ｋ．Ｄ．（２００２）．Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２、４６３−４７３．］この努力は、ＲＮＡ−リガンド複合体のＮＭＲ構造の利用可能性により大きく補助され、各リガンドに対する部位特異的化学修飾および変更による結合相互作用の「微調整」に関して合理的決定が行われることを可能にする。
標的および化合物の検証
標的／ヒット複合体の構造研究は、ヒット化合物の至適化、およびｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成アッセイを使用する標的の検証を見込む。それらの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒＲＮＡ標的との薬物リードの相互作用を、ＮＭＲ分光法を使用して特徴付けする。この情報は、化合物のどの官能基が結合に不可欠であるか、ならびに、生物学的利用性、薬力学を改良しかつ毒性を低減するために合理的薬物設計および医薬品化学を使用してどの官能基を改変しうるかを決定することにより、ヒットの至適化を可能にする。加えて、上で単離された化合物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質合成を阻害するそれらの能力について特徴付けする。スクリーニングにより同定される化合物は、標的突然変異を含むものを包含する細菌リボソームのタンパク質合成を阻害するはずである。この仮説を試験するため、ペプチドおよび化合物を真核生物および細菌のｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成アッセイに添加する。細菌タンパク質合成アッセイを野生型リボソームを使用して実施することができる。スクリーニングで使用されない機能的標的変異体の数回の試験を実施して、全部の実現可能な標的突然変異を認識する化合物の能力を評価する。
ＮＭＲ構造研究からの情報はアッセイを補完し、そして前臨床開発のための化合物の設計を改良するのに使用する。これらの機能的および構造的に特徴付けられた化合物は、薬物リードを至適化するための構造に基づく設計のアプローチの出発点を表す。［Ｂｕｒｓａｖｉｃｈ，Ｍ．Ｇ．とＲｉｃｈ，Ｄ．Ｈ．（２００２）．Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｎｏｎ−Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ｉｎ ｔｈｅ ２１ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ：Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ
Ｅｎｓｅｍｂｌｅｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５、５４１−５５８；およびＷｉｎｋｌｅｒ，Ｆ．Ｋ．、Ｂａｎｎｅｒ，Ｄ．Ｗ．とＢｏｈｍ，Ｈ．Ｊ．（２００１）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｅｒｎｓｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ３４、１２３−１４２．］
細菌のｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成アッセイ。化合物がタンパク質合成を阻害する
能力を有するかどうかを決定するため、それらを細菌のｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成アッセイで試験する。商業的に入手可能な細菌のｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成アッセイキット（例えば直鎖状鋳型のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ３０抽出物系（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｌｉｎｅａｒ Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ）、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用する。このキットは、結合された転写および翻訳が可能である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ株（Ｆ−、ｈｓｄＳ、ｇａｌ、ＯｍｐＴ、ｌｏｎ、ｒｅｃＢＣＤ）のＳ３０抽出物を含有する。［Ｌｅｓｌｅｙ，Ｓ．Ａ．、Ｂｒｏｗ，Ｍ．Ａ．とＢｕｒｇｅｓｓ、Ｒ．Ｒ．（１９９１）．Ｕｓｅ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｒｏｍ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｃｏｒｅ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｎｄ ｆｏｒ
ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６、２６３２−８．］それはまた、アミノ酸を除く全成分（ＮＴＰ、ｔＲＮＡ、ＡＴＰ再生系、ＩＰＴＧおよび塩）を提供するＳ３０予混合物もまた含有し；システイン、メチオニンおよびロイシンを欠く数種のアミノ酸混合物が該反応で必要とされる。ｐＢＥＳＴＬｕｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の提供される対照ＤＮＡを転写鋳型として使用する。このプラスミドはＰｔａｃの転写制御下のホタルルシフェラーゼ遺伝子およびアンピシリンｒマーカーを含有する。阻害を測定するために、変動する量のペプチドを含有する一連の反応をインキュベートし、そして、３５Ｓ−メチオニン標識産物を定量する。［Ａｏｋｉ，Ｈ．、Ｋｅ，Ｌ．、Ｐｏｐｐｅ，Ｓ．Ｍ．、Ｐｏｅｌ，Ｔ．Ｊ．、Ｗｅａｂｅｒ，Ｅ．Ａ．、Ｇａｄｗｏｏｄ，Ｒ．Ｃ．、Ｔｈｏｍａｓ，Ｒ．Ｃ．、Ｓｈｉｎａｂａｒｇｅｒ，Ｄ．Ｌ．とＧａｎｏｚａ，Ｍ．Ｃ．（２００２）．Ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｔａｒｇｅｔ ｔｈｅ Ｐ ｓｉｔｅ ｏｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４６、１０８０−５．］阻害は、緩衝液のみの添加に比較しての用量依存的様式での産物形成の喪失により示される。
変異体Ｓ３０抽出物を用いる細菌のｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成アッセイ。ｐＢＥＳＴＬｕｃ中のルシフェラーゼ遺伝子のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を、部位特異的突然変異誘発を使用して、特化されたリボソーム系中でＣＡＴおよびＧＦＰにより使用される同一配列に改変する。該新たな構築物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成アッセイでｐＢＥＳＴＬｕｃの代わりに用いられるが、しかし変異体に特化されたリボソームにより翻訳されることが可能であるのみである。それ以外は、該アッセイは上述された細菌のタンパク質合成アッセイに同一である。
真核生物のｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成アッセイ。同定される化合物は真核生物リボソームを阻害するはずがない。細菌のタンパク質合成を阻害する化合物を真核生物のｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成アッセイで試験する。商業的に入手可能なウサギ網状赤血球ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成アッセイキット（例えばＰｒｏｔｅｉｎｓｃｒｉｐｔ
ＩＩ連結転写：翻訳キット（Ｐｒｏｔｅｉｎｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｌｉｎｋｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）、Ａｍｂｉｏｎ）を使用する。転写および翻訳反応は別個である。該キットは、Ｔ７酵素およびウサギ網状赤血球ライセートを包含する、転写および翻訳双方に必要とされる全試薬を含有する。［Ｐｅｌｈａｍ，Ｈ．Ｒ．とＪａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．（１９７６）．Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｒｏｍ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６７、２４７−５６．］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｄｈ５ １６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のあいだの機能の差違
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５ゲノムは７個のリボソームオペロンを含有する。オペロンｒｒｎＡ、ｒｒｎＢおよびｒｒｎＥからの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は同一である。４個の他のリボソームオペロン（ｒｒｎＣ、ｒｒｎＤ、ｒｒｎＧおよびｒｒｎＨ）のそれぞれからの１６Ｓ ｒＲＮＡは独特な配列の不均一性を含有する。従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に５種の異なる１６Ｓ ｒＲＮＡ配列が存在する。これらの配列の不均一性がタンパク質合成に影響を及ぼすかどうかを決定するために、該５種の異なる配列のそれぞれを、本明細書に記述されるところの特化されたリボソーム系にクローン化しかつ発現させた。
５種の異なる１６Ｓ ｒＲＮＡを発現するクローンを、ｉｎ ｖｉｖｏで多様な温度、ｐＨおよびイオン強度でリボソーム機能についてアッセイした。オペロンｒｒｎＣおよびｒｒｎＤからの１６Ｓ ｒＲＮＡは試験した全条件下でｒｒｎＢ １６Ｓ ｒＲＮＡに機能上同一であった。標準的増殖条件（３７℃、ＬＢ培地中での好気的増殖）下で、オペロンｒｒｎＧからの１６Ｓ ｒＲＮＡを含有するリボソームは、ｒｒｎＢ １６Ｓ ｒＲＮＡを含有するリボソームよりおよそ２０％より活性であり、また、ｒｒｎＨ １６Ｓ ｒＲＮＡはおよそ２０％より少なく活性である。ｒｒｎＧの１６Ｓ ｒＲＮＡを含有するリボソームは、増大するイオン強度若しくはｐＨとともに機能が低下した一方、ｒｒｓＨの１６Ｓ ｒＲＮＡは機能が増大した。これらのデータは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒＲＮＡに存在する配列の不均一性が、環境条件を変えることに応答して異なるレベルのリボソーム機能をもたらすことを示し、可能な進化の利点を示唆する。
細菌ゲノムは複数のリボソームオペロンをしばしば含有することが既知である。リボソームオペロンの構成の類似性および低レベルの配列不均一性は、これらのオペロンが機能上同一であるという仮定に至った。機能的に専用のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子の例がしかしながら同定された。寄生虫プラスモディウム ベルゲイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ）は、その生活環のげっ歯類および蚊の段階の間に特殊な１８Ｓ ｒＲＮＡを発現することが示された（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎら、１９８７）。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２の完全なゲノム配列の分析は５種の異なる１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を同定した（Ａｃｉｎａｓら、２００４）。オペロンＡ（ｒｒｓＡ）、Ｂ（ｒｒｓＢ）およびＥ（ｒｒｓＥ）からの１６Ｓ ｒＲＮＡは同一配列を含有した一方、オペロンＣ（ｒｒｓＣ）、Ｄ（ｒｒｓＤ）、Ｇ（ｒｒｓＧ）およびＨ（ｒｒｓＨ）からの１６Ｓ ｒＲＮＡは配列の不均一性を表した（図２．１）。各オペロンからの１６Ｓ ｒＲＮＡが機能上同一であったかどうかを決定するため、ＤＨ５からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をｐＲＮＡ１２３にクローン化し、そして多様な増殖条件下で機能についてアッセイした。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２のｒＲＮＡオペロンは、ｒｒｓＢと比較する場合に１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子内に配列の不均一性を含有する（図２．１）。これらの配列の変動がリボソーム機能を遂げたかどうかを決定するため、ＤＨ５からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、そして特化したリボソームベクターｐＲＮＡ１２３にクローン化した（Ｌｅｅら、１９９６；Ｌｅｅら、１９９７；Ｍｏｒｏｓｙｕｋら、２００１）。ｐＲＮＡ１２３はｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にｒｒｎＢオペロンを含有するｐＢＲ３２２誘導体である。１６Ｓ ｒＲＮＡの抗Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、プラスミド由来の３０Ｓサブユニットが宿主ｍＲＮＡを翻訳しないように変えられている（Ｌｅｅら、１９９６；Ｌｅｅら、１９９７）。１６Ｓ ｒＲＮＡの変えられた抗Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列に相補的な変えられたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を伴う２種のレポーター遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もまた該プラスミド上にある。プラスミド由来の３０ＳサブユニットのみがレポーターのｍＲＮＡを翻訳することが可能である。
最初に、クローン化した１６Ｓ ｒＲＮＡを配列決定して正しいオペロンを同定した。配列決定に際して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２およびＤＨ５からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の間の不一致を同定した。これらの差違は、ｒｒｎＣ、ｒｒｎＧおよびｒｒｎＨからの１６Ｓ ｒＲＮＡを伴った（図２．１）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５のｒｒｓＣはＧ９０３に１個の挿入を含有する一方、ｒｒｓＧは、Ｇ５８９Ｕ塩基転換および位置５９２と５９３の間の１個の欠失を含有する。最後に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５のｒｒｓＨ遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２のｒｒｓＨ遺伝子中で見出されないＵ８５５Ａトランスバージョンを含有した。該１６Ｓ ｒＲＮＡを再クローン化しかつ配列決定して、観察された差違を確認した。
ＤＨ５からの各オペロンの機能を多様な温度、Ｍｇ２＋濃度、イオン条件およびｐＨ下で決定した。多様な１６Ｓ ｒＲＮＡのＧＦＰ分析（３７℃のＬＢ中）は、ｒｒｓＣおよびｒｒｓＤがｒｒｓＢに機能上同一であったことを示した（図２．２ａ）。ｒｒｓＧは、しかしながらｒｒｓＢよりおよそ２０％より機能的であった一方、ｒｒｓＨは機能がおよそ２０％より低かった（図２．２ａ）。温度が機能に影響を及ぼしたかどうかを決定するため、該オペロンの全４種を３０℃および４２℃で機能についてアッセイした。３０℃および４２℃双方で、ｒｒｓＣおよびｒｒｓＤはｒｒｓＢに機能上同一であった。ｒｒｓＧは双方の温度でｒｒｓＢよりおよそ３０％より多い機能をもたらした一方、ｒｒｓＨは３０℃でおよそ３０％より少ない機能および４２℃で２０％より少ない機能をもたらした。
Ｍｇ２＋の濃度を増大させることが機能の差違を解消し得るかどうかを決定するために、各１６Ｓ ｒＲＮＡを５０ｍＭおよび１００ｍＭ Ｍｇ２＋でアッセイした。機能の変化は５０ｍＭ Ｍｇ２＋で観察されなかった（図２．２ｂ）。１００ｍＭ Ｍｇ２＋の存在下では、しかしながら全４種のオペロンは機能が同様であった。ｒｒｓＧの機能は９５％に低下した一方、ｒｒｓＨの機能はｒｒｓＢの１０８％に増大した。これは、Ｍｇ２＋の細胞内濃度を増大させることがリボソームを安定化しかつｒｒｓＢに比較可能な機能を復帰しうることを示唆する。
４種のオペロンからの１６Ｓ ｒＲＮＡの機能を５．５と９．０の間の多様なｐＨで測定した（図２．２ｃ）。ｒｒｓＣはｐＨ５．５でわずかにより高い機能を有したが、しかし試験した全部の他のｐＨでは野生型の機能に戻った。ｒｒｓＤもまたｐＨ５．５で機能がわずかにより高かった。この機能はｐＨ６．３で８２％に下落したが、しかしその後、全部の他のｐＨで野生型のレベルに戻った。最も興味深い効果はｒｒｓＧおよびｒｒｓＨで見られた。ｒｒｓＧはより低いｐＨで野生型より高い機能を有したが、しかしｐＨが増大された際に野生型のレベルに低下した（図２．２ｃ）。ｒｒｓＨについて逆が真であり、野生型より一貫してより低い機能を有したが、しかしｐＨ９．０で野生型レベルに増大した。
ｒｒｓＣおよびｒｒｓＤ双方が、多様なイオン強度で機能についてアッセイする場合に野生型の機能を維持した（図２．２ｄ）。ｒｒｓＧの機能は低イオン強度でさらに増大したが、しかしイオン強度が増大された際に低下する。ｒｒｓＨについて逆が真であった。イオン強度を増大させた際に、機能のレベルは６０％から１１０％まで増大した（図２．２ｄ）。イオン強度をさらに増大させることは、しかしながらｒｒｓＨの機能を低下させた。
ｒｒｓＧの一般により大きな機能およびｒｒｓＨのより低い機能の原因である配列変動を決定するため、ｒｒｓＢと比較した場合の各１６Ｓ ｒＲＮＡ中の独特の差違を同定し
た。ｒｒｎＧの１６Ｓ ｒＲＮＡは、他の１６Ｓ ｒＲＮＡに存在しない２個の差違すなわちＡ１３１ＧおよびＣ１８３Ｕを含有する（図２．１ｂ）。ｒｒｎＧ １６Ｓ ｒＲＮＡ中の他の変動はｒｒｎＣおよびｒｒｎＤ １６Ｓ ｒＲＮＡにもまた存在した。ｒｒｓＢに類似の機能をもつ１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中のこれらの差違の存在は、これらの差違がｒｒｓＧ表現型の原因でなかったことを意味すると解釈された。Ａ１３１およびＣ１８３の単一突然変異を部位特異的ＰＣＲにより構築しそしてｐＲＮＡ１２３にクローン化した。標準的条件すなわち３７℃のＬＢ培地で、突然変異は野生型機能をもたらしたか若しくは非機能的であったかのいずれかであった。位置１８３の単一プリン突然変異は非機能的であった一方、ピリミジン突然変異は野生型機能を有した（図２．３）。位置１３１で、Ｇ１３１およびＵ１３１のみが機能的であった。
ｒｒｎＨ １６Ｓ ｒＲＮＡは、ｒｒｓＢからの以下の差違、すなわちＵ８５５Ａ、Ｃ１１２０Ｕ、ならびにヘリックス３３中の９個の差違（Ｇ１００２Ａ、Ｇ１００６Ｃ、Ｕ１０１０Ｃ、Ａ１０１９Ｇ、Ｇ１０２０Ａ、Ａ１０２１Ｕ、Ａ１０２２Ｕ、Ｕ１０２３ＧおよびＣ１０３８Ｕ）を含有する（図２．１ｂ）。Ｃ１１２０Ｕ変動は、Ｇ−Ｃ塩基対をこの位置で塩基対を維持するＧ−Ｕゆらぎに転化するため、それは分析しなかった。Ｕ８５５Ａ変動はヘリックス２６中の塩基対を破壊し、そして、潜在的に、観察された表現型の原因であり得る。ヘリックス３３は他のオペロンからの合計９個の差違を含有する。該９個の差違のうち、該変動の２個はＧ１００２−Ｃ１０３８塩基対をＡ−Ｕ対に置換し、また、２個の他の変動はＵ１０１０−Ａ１０１９塩基対をＣ−Ｇ塩基対で置換する。３個の他の変動は、２個のＧ−Ｕゆらぎ対（Ｇ１００６−Ｕ１０２３およびＵ１００９−Ｇ１０２０）を標準的なワトソン−クリック対（Ｃ１００６−Ｇ１０２３およびＵ１００９−Ａ１０２０）で置換する。最後に、最後の２個の変動はＵ−Ａ塩基対（Ｕ１００７−Ａ１０２２およびＵ１００８−Ａ１０２１）をＵ−Ｕ不適正（Ｕ１００７−Ｕ１０２２およびＵ１００８−Ｕ１０２１）で置換する。Ｕ８５５Ａおよびヘリックス３３の変動をＰＣＲにより個別に増幅し、クローン化しそして機能についてアッセイした。標準的条件で、ただＵ８５５Ａ変動を含有する１６Ｓ ｒＲＮＡはおよそ９２％機能的であった一方、ただヘリックス３３の変動を含有する１６Ｓ ｒＲＮＡは野生型のおよそ１０７％の機能を有した（図２．４）。増殖温度を３０℃に低下させることは、独立したヘリックス３３の機能をおよそ１３０％の機能に増大させる一方、ただＵ８５５Ａの機能は一定のまま留まった。増殖温度を４２℃に増大させることもまた、ただヘリックス３３の機能をおよそ１３０％の機能に増大させたが、しかしＵ８５５Ａの機能はおよそ８０％に低下した。
ｒｒｓＢと異なる配列を有した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をｐＲＮＡ１２３（Ｌｅｅら、１９９６；Ｌｅｅら、１９９７）をクローン化した。これらのクローンをその後、多様な環境条件下で機能についてアッセイした。オペロンｒｒｎＣおよびｒｒｎＤからの１６Ｓ ｒＲＮＡは、試験した全環境条件下で野生型であると考えられたｒｒｓＢに機能が類似であった。従って、オペロンｒｒｎＣおよびｒｒｎＤからの１６Ｓ ｒＲＮＡで見出される配列の変動は、試験した条件下でリボソーム機能を遂げない。オペロンｒｒｎＧおよびｒｒｎＨからの１６Ｓ ｒＲＮＡは、しかしながらｒｒｓＢと機能上異なった。これらの差違は試験した全環境条件下で維持された。
ｒｒｎＧからの１６Ｓ ｒＲＮＡは、高Ｍｇ２＋濃度ｐＨ若しくはイオン強度でを除きｒｒｓＢより機能が高かった。われわれの系では、ＧＦＰタンパク質のレベルは３０Ｓサブユニットの機能に基づく。変異体３０Ｓサブユニットにより生じられるＧＦＰ蛍光の量をその後、同時に増殖させた野生型３０Ｓサブユニットにより生じられるＧＦＰ蛍光のレベルと比較する。ＧＦＰ蛍光の増大されたレベルは、ｒｒｓＧリボソームがｒｒｓＢより多くのタンパク質を作成することを示す。翻訳速度とエラー率の間の逆相関がしばらくの間知られていた（ＡｌｌｅｎとＮｏｌｌｅｒ、１９８９；ＡｌｌｅｎとＮｏｌｌｅｒ、１９９１；ＤｏｎｇとＫｕｒｋａｎｄ、１９９５；Ｎｉｎｉｏ、１９７４；ＰｅｔｔｅｒｓｓｏｎとＫｕｒｌａｎｄ、１９８０）。低下された忠実度を伴いタンパク質合成を増大させるｒＲＮＡ突然変異が以前の研究で同定された（Ａｌｋｓｎｅら、１９９３；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９２）。ＧＦＰタンパク質は、しかしながら堅固であり、そして発色団を構成する３ヌクレオチド中の突然変異のみがＧＦＰタンパク質を非蛍光にするとみられる（Ｔｓｉｅｎ、１９９８）。
位置Ａ１３１およびＣ１８３はタンパク質結合に関与する領域中に見出される（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）。位置Ａ１３１はリボソームタンパク質（ｒタンパク質）Ｓ１７の結合部位に隣接する。Ｓ１７は５’ドメインおよび中央ドメインのフォールディングに関与する一次結合タンパク質である（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）。５’ドメイン中で、ｒタンパク質Ｓ１７は位置１２９および１３０で非対称内的ループに結合する（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）。位置Ａ１３１は、該非対称内的ループの下でＵ２３１と閉鎖塩基対形成するワトソン−クリックを形成する。該内的ループの破壊はｒタンパク質Ｓ１７の結合を遂げうる。非機能的であるＡ１３１Ｃを除き、他の単一突然変異は機能を遂げず、これらの突然変異がＳ１７結合に影響を及ぼさないことを示唆する。
位置１８３はＳ２０の別の一次結合タンパク質の結合に関与する。Ｓ２０はヘリックス９およびヘリックス４４と相互作用することにより３０Ｓサブユニットの底部を安定化する。Ｓ２０はヘリックス７、８、９および１０により形成される結合部ループならびにヘリックス９と相互作用する（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）。高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）３０Ｓサブユニットの結晶構造（Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２００１）において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の１８３に対応する位置はＧでありかつ位置１９４と塩基対形成する。われわれの実験結果では、しかしながら位置１８３のＧへの突然変異は致死的である。機能のこれらの差違は、ヘリックス９の長さならびにＳ２０のＣ末端の長さが、高度好熱菌（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中でより長いためでありうる。結晶構造中で、Ｓ２０のＣ末端はヘリックス９の副溝に沿って存する（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）。この相互作用はＳ２０とその結合部位の間の付加的な安定性を見込みうる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においては、しかしながらＳ２０は相互作用のためのより小さい領域を有し、そして従って単一突然変異の破壊がより有意の影響を有しうる。Ｓ２０のＣ末端欠失変異体の結合研究は、約６残基の欠失が結合の有意の喪失をもたらしたことを示した（ＤｏｎｌｙとＭａｃｋｉｅ、１９８８）。加えて、Ｓ２０を欠く大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異体は低Ｍｇ２＋濃度でサブユニットの会合が不完全であり（Ｇｏｔｚら、１９８９）ならびに翻訳開始が不完全である（Ｇｏｔｚら、１９９０）ことが見出された。Ｓ２０結合の低下若しくは喪失もまた、ヘリックス４４および３０Ｓサブユニットの底部の安定性に影響を及ぼすとみられる。ヘリックス４４の上部はＡおよびＰ部位の形成の原因である一方、該ヘリックスの残部は５０Ｓサブユニットと多数のサブユニット間接触点を形成し、ヘリックス４４の増大された柔軟性が翻訳の正確さを低下させうることを示唆する。
いずれかの部位での単一突然変異は、ｒｒｓＧで見られるより高レベルの機能を生じさせるのに十分ではない（図２．３）。位置１３１および１８３双方でのヌクレオチド変化が、より高い機能を生じさせるのに必要とされ、そして従ってＳ１７およびＳ２０双方の結合の変化が増大された機能の原因でありうる。ｒｒｓＢ機能への復帰は高Ｍｇ２＋濃度、ｐＨおよびイオン強度で見られた。イオン強度を増大させることは細胞中の陽イオン濃度を増大させるとみられる。それはｐＨを増大させることについて真実でありうる。５．０ないし９．０の外的ｐＨ範囲での増殖の間の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の内的ｐＨは７．４ないし７．８に維持される（ＳｌｏｎｃｚｅｗｓｋｉとＦｏｓｔｅｒ）。外的ｐＨが増大する際に、細胞はＳＯＳ応答を開始し（Ｔａｇｌｉｃｈｔら、１９８７）、そして、Ｎａ＋／Ｈ＋対向輸送の活性が増大して、細胞のｐＨの低下を引き起こす（Ｔａｇｌｉｃｈｔら、１９９１）。Ｈ＋の増大された濃度は、正常レベルの転写をもたらす、ＲＮＡとｒタンパク質の間のより安定な相互作用を可能にしうる。これらの条件下で、ｒタンパク質−ＲＮＡ相互作用が安定化されることができ、かつ、機能のｒｒｓＢレベルへの復帰を可能にしうる。
ｒｒｓＨは、高Ｍｇ２＋濃度、ｐＨおよびイオン強度下を除きｒｒｓＢに比較してより低い機能を有する。これらの結果をさらに理解するため、ｒｒｓＨとｒｒｓＢの間の２個の差違（Ｕ８５５Ａおよびヘリックス３３全体）を単離しかつ機能についてアッセイした。ヘリックス３３はｒｒｓＨオペロンに特異的な９個の変動を含有する単一単位として単離した。ｒｒｓＢにクローン化したｒｒｓＨからの単離されたヘリックス３３は、３０℃および４２℃でｒｒｓＢよりおよそ３０％、ならびに３７℃でわずかにより高くより機能的である。ヘリックス３３はリボソームの嘴部を構成しかつｒタンパク質Ｓ１９およびＳ１４と相互作用する。Ｓ１９は、Ｓ１４のＴｒｐ３４とヘリックス３３のループ中の位置Ａ１０１４の間の特異的相互作用をなす一方、ｒタンパク質Ｓ１４は、ヘリックス３３のループ中の位置１０１５および１０１６とバックボーン接触をなす（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）。Ｓ１４はタンパク質Ｓ３およびＳ１０の結合を助長する二次結合タンパク質である。Ｓ３は、ｍＲＮＡがリボソームに進入するチャンネルの溶媒側にあることが示された（Ｙｕｓｕｐｏｖａら、２００１）。加えて、リボソームはヘリカーゼ活性を有することが最近示され、また、Ｓ３中の突然変異は、翻訳を遂げうる（Ｔａｋｙａｒら、２００５）この活性を低下させる（Ｔａｋｙａｒら、２００５）。野生型Ｕ−Ｇゆらぎ対のワトソン−クリック対での置換、およびヘリックス３３中の２個のワトソン−クリック塩基対の破壊は、ヘリックス３３ならびにタンパク質Ｓ１９およびＳ１４、そして順にＳ３の間の相互作用を破壊しうる。温度の増大はこの相互作用をさらに不安定化しうる一方、温度の低下は、機能の変化を引き起こす異なる部位での結合を可能にしうる。
ｒｒｓＨのヘリックス３３の配列のｂｌａｓｔ検索は、それらのリボソームオペロン中にこの配列を含有する他の細菌を同定した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５と、この配列を含有する他の細菌の間の水平遺伝子移入事象は、ｒｒｎＨ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子がヘリックス３３のこのバリアントをどのように獲得したかを説明しうる。このヘリックス３３バリアントの獲得は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の適応度に対する劇的な影響を有するとみられる。３７℃での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５の増殖は、ｒｒｓＨからのただヘリックス３３を含有する１６Ｓ ｒＲＮＡが比較的正常に機能することを可能にするとみられる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、しかしながら多様な温度条件下で生存しなければならず、そして、ｒｒｓＨからのヘリックス３３を含有する１６Ｓ ｒＲＮＡは３０℃若しくは４２℃で増殖される場合にＧＦＰのｍＲＮＡをより迅速に翻訳する。翻訳速度を増大させることはエラー率を増大させる（ＡｌｌｅｎとＮｏｌｌｅｒ、１９８９；ＡｌｌｅｎとＮｏｌｌｅｒ、１９９１；ＤｏｎｇとＫｕｒｌａｎｄ、１９９５；Ｎｉｎｉｏ、１９７４；ＰｅｔｔｅｒｓｓｏｎとＫｕｒｌａｎｄ、１９８０）。増大されたエラー率は生物体の適応度を低下させるとみられる。ｒｒｓＢ中のＵ８５５Ａ変動は３０℃および３７℃でおよそ９０％機能的であった。Ｕ８５５Ａの機能は、しかしながら４２℃で増殖される場合に８０％に低下した。Ｕ８５５Ａが至適以下の温度条件下で翻訳エラー率を低下させるために発生した補償突然変異であることが可能である。ｐＨ若しくはイオン強度を増大させることはこの破壊のいくらかを解消しかつ正常な機能を見込みうる。
ｒｒｓＢからの配列の差違を含有した１６Ｓ ｒＲＮＡがクローン化されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５の７種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のあいだの配列の不均一性が、多様な環境条件の間の生存に重要な機能の差違を提供しうるか、若しくは生活環の間の特定の点で翻訳の原因となりうると仮説を立てた。分析は、Ｍｇ２＋濃度、ｐＨおよびイオン強度の変化に応答してｒｒｓＧおよびｒｒｓＨについての特定の機能的差違を示した。これらの１６Ｓ ｒＲＮＡは変化する環境条件への適合においてある役割を演じうる。
制限酵素、リガーゼ、および仔ウシ腸アルカリホスファターゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓおよびＧｉｂｃｏ−ＢＲＬからであった。配列決定改変ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチドおよび配列決定緩衝液はＥｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからであった。オリゴヌクレオチドはＭｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（テキサス州ミッドランド）若しくはＩＤＴ ＤＮＡ（アイオワ州コーラルビル）から購入した。ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲ試薬はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ（マサチューセッツ州ボストン）からであった。
プラスミドおよび突然変異誘発。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５からのオペロンは、プライマー１６Ｓ １Ｆ（５’−ＡＡＡ ＴＴＧ ＡＡＧ ＡＧＴ ＴＴＧ ＡＴＣ Ａ−３’）および１６Ｓ ３’端（５’−ＣＧＣ ＧＴＡ ＡＡＣ ＧＣＣ ＴＴＧ ＣＴＴ
ＴＴ−３’）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｈｉｇｕｃｈｉら、１９８８；Ｍｕｌｌｉｓら、１９８６；ＭｕｌｌｉｓとＦａｌｏｏｎａ、１９８７）を使用して単離した。
多様なオペロンからの１６Ｓ ｒＲＮＡのｐＲＮＡ１２３への挿入：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５からの染色体ＤＮＡを、標準的方法を使用して単離した。ゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、全部のオペロンから１６Ｓ ｒＲＮＡをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をその後、ＢｃｌＩおよびＢｓｔＥＩＩ制限部位を使用してｐＲＮＡ１２３にクローン化した。ライゲーションを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５に形質転換し、そしてＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）寒天板にプレーティングした。生存体を配列決定して１６Ｓ ｒＲＮＡの同一性を決定した。クローンはＧＦＰ蛍光を使用して機能についてアッセイした。
ｒｒｎＢ １６Ｓ ｒＲＮＡでのｒｒｓＧ二重変異体の構築。二重変異体を、ｐＲＮＡ１２３に類似のしかし１６Ｓ ｒＲＮＡのみを含有するｐＵＣ１９誘導体、ｐＡＳＳ２−ＧＦＰ（Ｌｅｅら、１９９６；Ｌｅｅら、１９９７）で、ＰＣＲ１についてプライマー１６Ｓ ｒｒｓＧ１（５’−ＧＴＴ ＴＣＣ ＡＧＴ ＡＧＴ ＴＡＴ ＣＣＣ ＣＣＴ ＣＣＡ ＴＣＡ ＧＧＣ ＡＧＮ ＴＴＣ ＣＣＡ ＧＡＣ Ａ−３’）およびｌａｃ ＵＶ５−７４（５’−ＧＣＡ ＧＴＧ ＡＧＣ ＧＣＡ ＡＣＧ ＣＡ−３’）、ならびにＰＣＲ２について１６Ｓ ｒｒｓＧ２（５’−ＡＴＡ ＡＣＴ ＡＣＴ ＧＧＡ ＡＡＣ ＧＧＴ ＡＧＣ ＴＡＡ ＴＡＣ ＣＧＣ ＡＴＡ ＡＮＧ ＴＣＧ ＣＡＡ ＧＡＣ−３’）および１６Ｓ Ｈ６９３（５’−ＣＧＧ ＴＡＴ ＴＣＣ ＴＣＣ ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＴＡ ＣＧＣ ＡＴＴ ＴＨＡ ＣＣＧ ＣＴＡ ＣＡＣ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＡ−３’）を用いる部位特異的組換えＰＣＲを使用して構築した。二重変異体を、ＢｃｌＩおよびＡｖｒＩＩ制限部位を使用してｒｒｎＢからの１６Ｓ ｒＲＮＡにクローン化した。ライゲーションを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５に形質転換し、そしてＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）寒天板にプレーティングした。生存体を配列決定して突然変異を同定した。クローンをｐＲＮＡ１２３にサブクローニングし、そしてＧＦＰ蛍光を使用して機能についてアッセイした。
ｒｒｎＢ １６Ｓ ｒＲＮＡ中のｒｒｓＨ変動の単離。ヘリックス３３をＡｐａＩおよびＸｂａＩでの消化により単位全体として単離した。ＡｐａＩおよびＸｂａＩ制限部位を使用して、フラグメントをｐＲＮＡ２７２（ｒｒｎＢ １６Ｓ ｒＲＮＡ中に単一ＡｐａＩ部位を含有するｐＲＮＡ１２３の誘導体）にクローン化した。ライゲーションを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５に形質転換しかつＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）寒天板にプレーティングした。生存体を配列決定してヘリックス３３の変動の存在を確認した。Ｕ８５５Ａ突然変異は、プライマー１６Ｓ １０３８ ｒｒｓＨ（５’−ＡＧＴ ＴＣＣ ＣＧＡ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＡＡ ＴＣ−３’）および１６Ｓ ＡｖｒＩＩ（５’−ＡＣＧ ＴＣＧ ＣＡＡ ＧＡＣ ＣＡＡ ＡＧＡ ＧＧ−３’）を用いる部位特異的ＰＣＲを使用して構築した。該ＰＣＲ産物もまた、ＡｐａＩおよびＢｇｌＩＩ制限部位を使用してｐＲＮＡ２７２にクローン化した。これらのクローンをその後大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５細胞に形質転換した。変異体を配列決定してＵ８５５Ａ突然変異の存在を確認し、そしてＧＦＰ蛍光を使用して機能についてアッセイした。
細菌株および培地。全部のプラスミドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５（ｓｕｐＥ４４、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１）（Ｈａｎａｈａｎ、１９８３）中で維持しかつ発現した。培養物は１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培地（ＬｕｒｉａとＢｕｒｒｏｕｓ、１９５７）（ＬＢ−Ａｐ１００）中で維持した。ｌａｃＵＶ５プロモーターからのプラスミド由来ｒＲＮＡの合成を誘導するため；ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を各実験で指定された時点で１ｍＭの最終濃度まで添加した。株はＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｃｅｌｌ Ｐｏｒａｔｏｒを使用する電気穿孔法（Ｄｏｗｅｒら、１９８８）により形質転換した。別の方法で示されない限り、形質転換体は、選択培地にプレーティングする前にＳＯＣ培地（Ｈａｎａｈａｎ、１９８３）中で１時間増殖させてプラスミド由来遺伝子の発現を可能にした。高Ｍｇ２＋培地：５０ｍＭ若しくは１００ｍＭ Ｍｇ２＋を含有する標準ＬＢ培地。ＧＦＰアッセイを上述されたとおり実施した。多様なイオン強度培地：ＮａＣｌを含まないＬＢ培地、ＴＹＥ（トリプトン５ｇ；酵母抽出物２．５ｇ；ｐＨ７）を低イオン強度増殖のため作成した。ＴＹＥ培地中３Ｍ ＫＣｌ溶液を使用してＴＹＥ培地のイオン強度を適切な濃度に調節した。ＧＦＰアッセイは下述されるとおり実施した。多様なｐＨの培地：標準ＬＢ培地を、緩衝液ＭＥＳ（ｐＨ５．５）、ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．３）、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）およびＡＭＰＳＯ（ｐＨ９．０）を使用して多様なｐＨに調節した。１００ｍＭの適切な緩衝作用物質を含有するＬＢを使用して培養物を各ｐＨで増殖させた。ＧＦＰアッセイは下述されるとおり実施した。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）アッセイ。変異体ならびに野生型対照の一夜培養物を、Ａｍｐ１００を含む適切な培地中３７℃で振とうしながら１２〜１６時間増殖させた。一夜細胞培養物をその後、Ａｍｐ１００およびＩＰＴＧ（１ｍＭ）を含有する適切な培地で１００倍希釈した。誘導した培養物を３７℃で振とうしながら２４時間増殖させた。２４時間後に５００μＬの培養物を１．７ｍＬ微小遠心管に分注し、そしておよそ１１ｇで１分間遠心分離して細胞をペレットにした。細胞ペレットを５００μＬのＨＮ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４および０．８５％ＮａＣｌ）で２回洗浄し、そして５００μＬのＨＮ緩衝液に再懸濁した。細胞を再懸濁した後に１００μＬの細胞懸濁液を９６ウェルの透明底マイクロタイタープレートに移した。細胞密度（λ＝６００ｎｍ）を、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ １９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）を使用して測定し、また、蛍光（励起＝３９５ｎｍおよび測定＝５０９ｎｍ）はＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＧＥＭＩＮＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）を使用して測定した。各培養物について、蛍光をＡ６００により除算しかつ野生型のパーセントとして提示した。値は、異なる日に行った３個の別個の培養物での最低３回のアッセイの平均を表す。
５３０ループ内の相互作用の同定
リボソームの解読機能は１６Ｓ ｒＲＮＡの３領域、すなわち解読領域（ヌクレオチド１４００−１５００）、ヘリックス３４（１０５０／１２００領域）および５３０ループを必要とすると考えられる。５３０ループは全部の小サブユニットリボソームＲＮＡで見出される保存された４５ヌクレオチドのステム−ループ構造である。系統発生および突然変異研究は、この保存されたループ内の３個のワトソン−クリック相互作用に対する要件を示唆した。これらの相互作用は、５２１−５２２および５２７−５２８の間の提案され
た塩基対形成、５０５−５０７および５２４−５２６の間の提案された偽結び目構造、ならびに５１６−５１９と５２９−５３２の間の可能な相互作用である。これらの相互作用の性質および機能上の意義を検査するため、各提案される相互作用におけるヌクレオチドを同時に変異しかつ機能的変異体を選択かつ分析した、３回の無作為突然変異誘発実験を実施した。
データの解析は、位置５２１−５２２および５２７−５２８の間、ならびにヌクレオチド５０５−５０７および５２４−５２６の間の有意の共変動を示し、これらの位置での塩基対形成の重要性を示した。中央の偽結び目構造の形成がリボソーム機能に構造上重要である。データのさらなる解析は塩基対形成する能力に加えて配列特異性を示さなかった。ヌクレオチド５１６−５１９および５２９−５３２の解析は有意の共変動および配列特異性を示し、ループ内のこれらのヌクレオチドの同一性および相互作用がリボソーム機能に重要であることを示した。位置５１６、５１８、５１９、５２９および５３０は強い配列特異性および共変動を示し、それらが機能上重要であることを示した。位置５２７、５２８および５３０の突然変異は位置１４９２若しくは１４９３の突然変異を補完することに失敗した。
１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は、タンパク質合成の間に基礎的な役割を演じると考えられている多くの保存されたヌクレオチドを含有する。これらの領域の最も保存されたものの１つは一般に５３０ループ（ヘリックス１８、ヌクレオチド５００−５４０）と称される（図３．１）。５３０ループは、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）結合（ＭｏａｚｅｄとＮｏｌｌｅｒ、１９９０；Ｏｇｌｅら、１００２）、翻訳忠実度（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９２；ＳｈｅｎとＦｏｘ、１９８９）、およびストレプトマイシン耐性（Ｍｅｌａｎｃｏｎら、１９８８；ＰｏｗｅｒｓとＮｏｌｌｅｒ、１９９１；Ｓａｎｔｅｒら、１９９３；Ｓａｎｔｅｒら、１９９５）に関係づけられている。最近の結晶構造（Ｏｇｌｅら、２００１；Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００）および多数の生化学研究（Ｂｒｉｍａｃｏｍｂｅ、１９９２；ＭｏａｚｅｄとＮｏｌｌｅｒ、１９９０；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９７）は、このループを解読領域に位置推定した。化学的保護研究は、位置５２９、５３０および５３１がＡ部位に結合したｔＲＮＡにより化学修飾から保護されている一方、位置５３２はＰ部位に結合したｔＲＮＡにより保護されていることを示した（ＭｏａｚｅｄとＮｏｌｌｅｒ、１９９０）。位置５３０の突然変異は致死的であり（ＰｏｗｅｒｓとＮｏｌｌｅｒ、１９９０）、また、再構成実験はこれらの変異体リボソームが開始依存性のペプチド結合の形成が不完全であり（Ｓａｎｔｅｒら、１９９３）かつポリソーム中でまれに見出される（ＰｏｗｅｒｓとＮｏｌｌｅｒ、１９９０；Ｓａｎｔｅｒら、１９９３）ことを示した。Ｕ６オリゴヌクレオチドおよびアンチコドンステムループ（ＡＳＬ）と複合体形成した高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）３０Ｓサブユニットの結晶構造（Ｏｇｌｅら、２００１）は、Ａ１４９２、ｔＲＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への水素結合接触をもつＡ部位中の位置５３０を示す。この結晶構造は、位置５３０が第二の位置でコドン−アンチコドン相互作用の監視に関与している、および５３０ループが翻訳忠実度に関与しているという仮定に至った（Ｏｇｌｅら、２００１）。位置５１７の突然変異は、ｉｎ ｖｉｖｏで試験される場合に増大されたフレームシフト速度および終止コドンの読み過ごしをもたらした（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９２；ＳｈｅｎとＦｏｘ、１９８９）。リボソームタンパク質Ｓ４、Ｓ５およびＳ１２中の突然変異は翻訳忠実度に影響を及ぼすことが既知であり（Ａｌｋｓｎｅら、１９９３；ＢｉｓｗａｓとＧｏｒｉｎｉ、１９７２；ＲｏｓｓｅｔとＧｏｒｉｎｉ、１９６９）、また、全３種は５３０ループの近傍に位置する（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２；Ｃａｐｅｌら、１９８７）。最後に、翻訳のエラー率を増大させる（Ｄａｖｉｅｓら、１９６４；ＧｏｒｉｎｉとＫａｔａｊａ、１９６４；Ｋａｊｉら、１９６６；Ｐｅｓｔｋａ、１９６７）ストレプトマイシン耐性は、５３０ループ中の位置５０７（ＰｏｗｅｒｓとＮｏｌｌｅｒ、１９９１）、５２３（Ｍｅｌａｎｃｏｎら、１９８８）、５２５（ＰｏｗｅｒｓとＮｏｌｌｅｒ、１９９１）、５２９（Ｓａｎｔｅｒら、１９９５）および５３０（Ｓａｎｔｅｒら、１９９３）に位置推定された。
系統発生分析（Ｃａｎｎｏｎｅら、２００２）および結晶構造（Ｏｇｌｅら、２００１；Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００）は５３０ループ内の興味深い二次および三次相互作用を示した。位置５２１−５２２は位置５２７−５２８と塩基対形成する。これは位置５２３−５２６の四塩基ループの形成をもたらす。四塩基ループの位置５２４−５２６は、偽結び目構造の形成をもたらすステムバルジ中の位置５０５−５０７と相互作用する（Ｄａｍら、１９９２；Ｐｌｅｉｊら、１９８５）。機能上重要な塩基対が、これらの相互作用は結晶構造中で見られない（Ｏｇｌｅら、２００１；Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００）とは言え、位置５１６−５１９および５２９−５３２の間に存在する（Ｖａｎ ＲｙｋとＤａｈｌｂｅｒｇ、１９９５）こともまた提案された。
焦点は、ル―プ内（図３．１）で同定される相互作用、とりわけヌクレオチド５２１−５２２および５２７−５２８（４Ｎ）、ヌクレオチド５０５−５０７および５２４−５２６（６Ｎ）ならびにヌクレオチド５１６−５１９および５２９−５３２（８Ｎ）に与えられた。
５３０ループ（図３．１）内の潜在的相互作用の役割を検査するため、提案された相互作用に関与するヌクレオチドを、ＰＣＲを使用して無作為に変異させ、そしてｐＲＮＡ１６ＳＴ（ｐＲＮＡ１２２の誘導体（Ｌｅｅら、１９９６；Ｌｅｅら、１９９７））にクローン化した。ｐＲＮＡ１６ＳＴは、オペロン全体よりむしろｒｒｎＢオペロンからの１６Ｓ ｒＲＮＡのみを含有する。これは１６Ｓ ｒＲＮＡ中の付加的な独特の制限部位をもたらす。この特化されたｉｎ ｖｉｖｏ系において、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーターメッセージが、正常の細胞メッセージを翻訳し得ないプラスミド由来リボソームにより独占的に翻訳される（Ｌｅｅら、１９９６；Ｌｅｅら、１９９７）。従って、各変異体のクロラムフェニコールの最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、プラスミド由来リボソームの機能のレベルに相関する。これはクロラムフェニコール含有培地での機能的変異体の選択を見込む。生存体をその後配列決定し、そして各変異体のＭＩＣを決定することにより機能についてアッセイした。
元は系統発生分析により同定された（ＷｏｅｓｅとＧｕｔｅｌｌ、１９８９）、５２１−５２８および５２２−５２７の間の相互作用（図３．１）を試験して塩基対形成の存在を確認した。合計５１０，０００個の形質転換体を得て、２５６個（４４）の変異体配列のそれぞれが選択されたプールで表されたことを確認した（ＣｌａｒｋｅとＣａｒｂｏｎ、１９７６）。プレーティングした細胞のおよそ２．０％が５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール含有培地で生存し、そして５３個のクロラムフェニコール耐性クローンを選択しかつ配列決定した。合計１０個の独特の変異体配列を同定しかつさらに分析した（図３．１ａ）。
統計学的解析。クロラムフェニコール耐性クローン中の各変異させた位置のヌクレオチドの同一性が無作為であったかどうかを決定するため、各位置のヌクレオチドの分布を可能な置換のあいだの均一な分布への適合度について検査した。単離された変異体のこの分析はヌクレオチド５２８を除く全位置で非ランダム性を示した（図３．２）。選択された機能的クローンのあいだでのヌクレオチドの非ランダム分布は、変異させた配列内のヌクレオチド同一性がリボソーム機能のレベル（ＭＩＣ）に影響を及ぼしうることを示唆する。これが真実であったかどうかを決定するため、各位置の全変異体の活性の平均を単一因子分散分析（ＡＮＯＶＡ）により比較した（Ｌｅｅら、１９９７）。ＡＮＯＶＡ結果の解析は、５２１−２２および５２７−５２８内のヌクレオチド同一性が、各位置でリボソーム機能のレベルに対する有意の影響を有しなかったことを示す。共変動分析はプール内の各位置の全部の可能な突然変異の非存在により適用可能でなかった。提案された相互作用についてのワトソン−クリック塩基対、ゆらぎ塩基対および不適正の分布の検査は、しかしながら位置５２１：５２８および５２２：５２７の間の塩基対形成に対する顕著な好みを示す（表３．２）。
Ｃ５２８とＡ１４９２の間のいかなる潜在的相互作用も同定するため、位置５２７、５２８および１４９２の突然変異をｐＲＮＡ１２３（ｐＲＮＡ１２２の誘導体）（Ｌｅｅら、１９９６；Ｌｅｅら、１９９７）にクローン化した。このｉｎ ｖｉｖｏ系で、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーターメッセージは、正常の細胞メッセージを翻訳し得ないプラスミド由来のリボソームにより独占的に翻訳される。従って、各変異体のクロラムフェニコールの最小阻害濃度（ＭＩＣ）およびＧＦＰ蛍光がプラスミド由来リボソームの機能のレベルに相関する。位置５２７および５２８の単一突然変異は、ｍ７Ｇ５２７Ｕ若しくはＣ５２８Ｕ変異体を除き非機能的リボソームをもたらした。これらの２種の突然変異は野生型と比較した場合にそれぞれ１４％および２４％の機能を維持した。５２８と１４９２若しくは１４９３の間、ならびに５２７と１４９２若しくは１４９３の間の二重変異体もまた作成した。これらの位置の間の二重変異体は相補性を示さなかった。
５０５−５０７および５２４−５２６（６Ｎ）相互作用。系統発生分析によりまた同定される、１６Ｓ ｒＲＮＡ中のヌクレオチド５０５−５０７および５２４−５２６を関わらせる相互作用（図３．１）がＷｏｅｓｅとＧｕｔｅｌｌ（１９８９）により提案された。合計６８０，０００個の形質転換体を、４０９６（４６）個の変異体配列の全部が＞９９．９％信頼性を伴い選択されたプール中で表されたことを確認するためにプレーティングした（ＣｌａｒｋｅとＣａｒｂｏｎ、１９７６）。プレーティングした細胞のおよそ５．３％が５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する培地で生存し、そのうち５４個のクロラムフェニコール耐性クローンを選択かつ配列決定した。合計３９個の独特の変異体配列をさらに分析した（表３．１ｂ）。
統計学的解析。３９個の独特な変異体からの配列データを使用して、ヌクレオチドの好みが各位置で存在するかどうかを統計学的に決定した。全４種のヌクレオチドが各位置で見出されたとは言え、プール中の各位置に野生型ヌクレオチドに対する有意の好みが存在した（図３．３）。
ヌクレオチド同一性がリボソーム機能に対しいずれかの影響を有したかどうかを決定するために、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を各位置について実施した。位置５２４（ｐ＜０．０５）を除き、リボソーム機能に対するヌクレオチド同一性の有意の影響は存在しなかった。従って、５２４を除く各変異させた位置でのヌクレオチドの同一性は機能的変異体の選択で決定的に重要でないようである。従って、５２１：５２８および５２２：５２７の相互作用でのように、これらの位置は主として構造的役割を演じている。
これらの変異させたヌクレオチド間の相互作用がこの系でリボソーム機能にもまた有意に影響を及ぼしうるため、共変動分析を実施して、一位置の特定の１ヌクレオチドの存在が別の変異させた位置でのヌクレオチド選択に影響を及ぼしたかどうかを検査した。有意の共変動は提案された塩基対形成位置間で観察されたのみであった（ｐ＜１０−４）。これらの共変動は塩基対を形成し得るヌクレオチドに対する好みを示す。提案された相互作用についてのワトソン−クリック塩基対、ゆらぎ塩基対および不適正の分布のさらなる分析は、５０５：５２６および５０６：５２５の間の塩基対形成に対する有意の好みを示す一方、５０７：５２４間の塩基対形成は緊縮性としてでないである（表３．３）。これらのデータは、５３０ループが高度に制約されることを示す。
５１６−５１９および５２９−５３２（８Ｎ）相互作用。１６Ｓ ｒＲＮＡ中のヌクレオチド５１６−５１９および５２９−５３２を関わらせる潜在的相互作用（図３．１）がＶａｎＲｙｋとＤａｈｌｂｅｒｇにより提案された。これら８位置（５１６−１９および５２９−３２）を同時に変異させ、そして機能的変異体を選択し、配列決定しかつリボソーム機能について分析した。４．５０×１０５（４８）個の変異体配列のそれぞれが選択したプールで表されたことを確実にするために、合計４５０，０００個の形質転換体を得た。プレーティングした細胞のおよそ１．９０％が５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含有培地で生存し、そのうち９１個のクロラムフェニコール耐性クローンを選択しかつ配列決定した。合計６６個の独特の変異体配列をさらに分析した（表３．１ｃ）。
統計学的解析。図３．４に示されるとおり、有意のヌクレオチドの好みが位置５１６（ｐ＝４．７×１０−１３）、５１８（ｐ＝１．８×１０−３１）、５１９（ｐ＝４．１×１０−３３）、５２９（ｐ＝４．４×１０−３０）および５３０（ｐ＝１．２×１０−２４）について見出され；一方、位置５１７、５３１および５３２のヌクレオチドの選択は無作為であった（ｐ＞０．１）。リボソーム機能のレベルに対するヌクレオチド同一性の有意の効果を示した位置（ＡＮＯＶＡ）は：５１６（ｐ＝８．０×１０−６）、５１８（ｐ＝１．３×１０−３）、５１９（ｐ＝３．４×１０−７）、５２９（ｐ＝６．０×１０−５）および５３０（ｐ＝２．３×１０−２）であった（表３．４）。最も有意の共変動は位置５１８と５３０（ｐ＝３．８×１０−８）および５１８と５２９（ｐ＝７．５×１０−８）の間で観察された。共変動は、位置５１６および位置５１７（ｐ＝８．２×１０−３）、５１８（ｐ＝５．９×１０−６）、５２９（ｐ＝１．２×１０−５）ならびに５３０（ｐ＝６．４×１０−５）の間で同定された。共変動はまた、位置５２９と５３０の間（ｐ＝５．２×１０−４）、かつ、位置５３１と５３２の間（ｐ＝４．１×１０−２）の弱い共変動も同定された。位置５１９はループ内で位置５１６、５１８、５２９と共変動するが；しかしながら、これらの位置のあいだでの共変動分析はプール中の位置５１９のアデノシン変異体の非存在により適用可能でなかった。位置５１６と５３２の間および位置５１７と５３１の間の提案される相互作用は観察されなかった。
５３０ループと解読領域の間の補完。最近、Ｏｇｌｅらは、オリゴヌクレオチド（ｍＲＮＡ）およびアンチコドンステムループ（ＡＳＬ）フラグメント（ｔＲＮＡ）と複合体形成した３０Ｓの結晶構造に基づく翻訳忠実度のモデルを提案した。このモデルにおいて、５３０ループ、およびより具体的にはヌクレオチド５３０は、解読領域のヌクレオチド１４９２および１４９３と一緒になって、同族および非同族のｔＲＮＡの間の識別で直接的役割を演じている。位置Ｇ５３０およびＡ１４９２はコドン−アンチコドン相互作用における第二の塩基対の解読に関与することが提案されている。該ヌクレオチドはそれらのＮ１位置の間の水素結合により相互作用する。以前の研究は、これらの位置のいかなる突然変異も致死的であることを示した（ＰｏｗｅｒｓとＮｏｌｌｅｒ、１９９０；Ｓａｎｔｅｒら、１９９３）［本研究］。位置５３０および１４９２の突然変異の致死性がこの相互作用の破壊によったかどうかを決定するために、Ｇ５３０とＡ１４９２の間の二重突然変異を構築し、そして機能の復帰について分析した。これらの位置の間の補完は観察されなかった。
３種の別個の飽和突然変異誘発（Ｌｅｅら、１９９７）実験を実施して、保存された５３０ステムループ内の相互作用を検査した。これらの実験は、５３０ループが１６Ｓ ｒＲＮＡの高度に構造化されかつ制約された領域であることを示す、ヌクレオチド５０５−５０７：５２４−５２６および５２１−５２２：５２７−５２８を関わらせる相互作用を確認する。系統発生分析と対照的に、われわれのデータは、５３０ループが、一般的５３０ループ構造が維持される限りは配列の変動を適応しかつ高いリボソーム機能を保持し得ることを示す。
５２１−５２２および５２７−５２８（４Ｎ）相互作用。データは、ヌクレオチド５２２と５２７の間およびヌクレオチド５２１と５２８の間の塩基対形成がリボソーム機能に重要であるという仮説を裏付ける。低レベルの機能さえの選択は、塩基対形成する何らかの能力を有する変異体のみの単離をもたらした。野生型ヌクレオチドが各位置で好ましいようであったが、しかし各位置の突然変異が観察された。これらの突然変異は、しかしながら塩基対形成を可能にした相補的突然変異もまた存在した場合に機能に影響を及ぼすようではなかった。単離された変異体の少ない数により、共変動相互作用若しくはヌクレオチドの好みは確認し得なかった。共変動は、しかしながら５３０ループ全体の即時進化で同定され（Ｃｈｏ、１９９９）、これらのヌクレオチド間の相互作用を確認した。
系統発生分析は、修飾ヌクレオチドｍ７Ｇ５２７が保存されていることを示す。この位置は構造的および機能的双方で重要であることが見出された（Ｃｈｏ、１９９９）。これは本明細書に提供される例示と一致する。数種の高度に機能的な変異体がこの位置に置換を含有したとは言え、塩基対形成が維持される。該修飾はしかしながらリボソーム中の他の領域との相互作用の破壊に関与しうる。
Ｇ５２８とＡ１４９２の間の相互作用が提案されている。この相互作用を研究するため、位置５２７、５２８および１４９２の単一変異体を創製した。位置５２７若しくは５２８の単一突然変異は、ｍ７Ｇ５２７ＵおよびＣ５２８Ｕ変異体を除きリボソーム機能の喪失をもたらした。これらの変異体はそれぞれ１４％および２４％の機能を保持した。これらの結果の最も単純な説明は、他の３種のヌクレオチドと少なくとも何らかの水素結合を形成するＵの能力である。この説明は、即時進化の結果ならびに系統発生データと一致する。位置１４９２の単一変異体は非機能的であった。位置５２７と１４９２の間および位置５２８と１４９２の間の二重突然変異もまた非機能的であった。これは、これらの位置間で相互作用を示さない結晶構造と一致する。
５０５−５０７および５２４−５２６（６Ｎ）相互作用。５０５−５０７および５２４−５２６の間の相互作用の分析は野生型ヌクレオチドに対する好みを示すが、しかし、構造の制約を侵害しない多くの変異体もまた高度に機能的であった。変異体プールの共変動分析は、５０５：５２６、５０６：５２５および５０７：５２４の間の強い相互作用を示し、これらのヌクレオチド間の塩基対形成を示す（表３．３）。これらの位置での塩基対形成の要件はＰｏｗｅｒｓとＮｏｌｌｅｒ（１９９１）により以前に示された。全３位置間の塩基対を含有しなかったいくつかの高度に機能的な変異体、ならびに全３位置間の塩基対を含有しなかった低機能的変異体が同定された。この矛盾のいくつかの説明が存在し；塩基対形成は別のリガンド若しくは配列により助長されることができ、ならびに塩基対形成は機能に重要である。この偽結び目構造に関与するヌクレオチドはリボソームタンパク質Ｓ１２により化学的攻撃から保護され（Ｓｔｅｒｎら、１９８８）、これらの５３０ループヌクレオチドとＳ１２の間の相互作用を示唆している。最近の結晶構造（Ｏｇｌｅら、２００１；Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００）は、Ｓ１２を偽結び目構造の緊密な近位にもたらす、Ｓ１２のＡｓｐ９２に水素結合したＡ５２３のＮ６位置を示す。５３０ループへのＳ１２の近接はこの偽結び目構造を安定化する原因でありうる（ＰｏｗｅｒｓとＮｏｌｌｅｒ、１９９４）。第二に、偽結び目構造の形成に関与するヌクレオチドは系統発生論を通じて保存されている。これらの位置はただ塩基対形成以外の理由上保存されうる。事実、解読領域へのアミノグリコシド抗生物質の結合はＣ５２５の反応性を高め（ＭｏａｚｅｄとＮｏｌｌｅｒ、１９８７）、そしてまたｔＲＮＡおよびｍＲＮＡの存在下でのコンホメーション変化にいくぶん類似の５３０ループ中のコンホメーション変化も誘導する（Ｏｇｌｅら、２００１）。これは、偽結び目構造がタンパク質合成の間の何らかの点で破壊されること、および偽結び目構造形成に関与するヌクレオチドが別の場所で相互作用し得ることを意味するとみられる。さらに、位置５２４−５２６の単一突然変異の導入は位置５２４のものが致死的であることを示した（ＰｏｗｅｒｓとＮｏｌｌｅｒ、１９９１）。これは、ヌクレオチド同一性が位置５２４で機能に対し影響を有した（ｐ＝０．０１）ことを示した変異体プールのＡＮＯＶＡ解析と矛盾しない。従って、ヌクレオチド同一性ならびに偽結び目構造を形成する能力が機能に重要である。
６Ｎおよび４Ｎ実験は、５３０偽結び目構造がｉｎ ｖｉｖｏでどのように形成されうるかに関する情報を提供する。位置５２１：５２８および５２２：５２７の間の塩基対形成は５３０ループの上部でのＡＧＣＣ四塩基ループの形成をもたらす。ＡＧＣＣ四塩基ループは保存されたＡＧＮＮ四塩基ループの一族の一部である。ＡＧＮＮ（とりわけＡＧＵＣ）四塩基ループの溶液構造は、Ｌｅｂａｒｓら（２００１）によりＮＭＲを使用して解明された。ＡＧＵＣ四塩基ループは、ループの位置の第一（ＡのＮ３）とループの第四の位置（ＣのＮ４）の間の水素結合により安定化された。ホスホジエステルバックボーンのターンは第二（Ｇ）と第三（Ｕ）の位置の間に存在し、また、ターンの５’および３’ヌクレオチドは積み重なる。Ｏｇｌｅらの結晶構造において、５３０ループのＡＧＣＣ四塩基ループは該ループの第一（Ａ）および第四（Ｃ）の位置の間に水素結合を有しない。バックボーンのターンは位置５２３と５２４の間に存在し、塩基５２４、５２５および５２６が積み重なる。最後に、位置５２３はタンパク質Ｓ１２と相互作用するようにはじき出される。該２構造間のこの差違は位置ｍ７Ｇ５２７の修飾によりうる。該修飾は四塩基ループ内の水素結合を破壊することができ、そして、該ループが５３０ステムと相互作用して偽結び目構造を形成することを可能にしうる。
５１６−５１９および５２９−５３２（８Ｎ）相互作用。５１６：５１９および５２９：５３２の間の提案された塩基対形成相互作用は存在すると思われない。しかしながらループの二側の間に有意の相互作用が存在する（図３．４）。研究した８ヌクレオチドのうち５個（位置５１６、５１８、５１９、５２９および５３０）が有意のヌクレオチドの好みを示し、そして機能に不可欠であると思われる。位置５３１および５３２はわずかに有意のＡＮＯＶＡのＰ値を有するが、しかしながらヌクレオチドの好みはこれらの位置で見出されなかった。この有意性は分析した変異体の少数によりうるか、若しくは、該有意性は、機能のために該ループ中に存在するためのこれらの位置のスペーサーヌクレオチドに対する要件を示しうる。これらの位置の単一変異体はリボソーム機能に有意に影響を及ぼさなかった（Ｓａｎｔｅｒら、１９９３）。
位置Ψ５１６は保存されるが、しかし機能上重要よりはむしろ構造上重要である。われわれの研究室での以前の研究は、位置５１６でのトランジション変異がトランスバージョン変異より良好に耐えられたことを示した（Ｌｅｅら、２００１）。この研究は、トランジション変異体の機能の低下が７０Ｓサブユニットを形成する能力の低下に相関したと結論した。５３０ループはいかなるサブユニット間架橋にも関与しているようでなく（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）、従って、位置５１６の突然変異は７０Ｓサブユニット形成を阻害する長い範囲のコンホメーション変化を誘導しなくてはならない。トランスバージョン変異体もまた７０Ｓサブユニットを形成する能力の低下を示したが、しかしこれはこの型の変異体の機能の喪失を説明するのに十分でなかった。トランスバージョン変異体はタンパク質合成の何らかの他の局面を破壊しならびに７０Ｓサブユニットを形成する能力を低下させると考えられる。さらに、位置５１６のプソイドウリジンは不可欠と思われない。Ψ５１６の形成の原因であるｒｕｓＡ遺伝子の欠失は、変動する温度で増殖速度を遂げない（Ｃｏｎｒａｄら、１９９９）。従ってプソイドウリジンは機能に必要とされると思われない。５１６と、ループ中の他の機能上重要なヌクレオチドの間の共変動は、位置５１６の構造上の役割もまた示す（図３．４）。これは、位置５１６、５１７および５３１が積み重なりかつ５１６の２’のＯＨがＣ５１９のＮ３と水素結合を形成している結晶構造（Ｏｇｌｅら、２００１）で見ることができる。水素結合は結晶構造中で同定されなかったとは言え、位置５１６はまた位置５２９および５３０との共変動も示す。結晶構造は静的であり、位置５１６と位置５２９および５３０の間の相互作用がリボソームの動きの間に起こりうる。
以前の研究は、Ｇ５１７の突然変異が翻訳のエラーを増大させることを示した（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９２）。われわれの研究では、しかしながら、機能のレベルの有意の変化を有しなかった位置５１７の数種の単一突然変異が同定された。われわれの系では、プラスミド由来リボソームはＣＡＴ ｍＲＮＡを翻訳するのみでありかつ細胞ｍＲＮＡを翻訳しない。従って、翻訳のエラーの増大は細胞増殖に影響を及ぼさないとみられる。また、ＣＡＴレポーター遺伝子の小さな大きさにより、翻訳忠実度の低下はＭＩＣにより検出するのが困難であるとみられる。
ヌクレオチド同一性は位置５１８および５１９で強く保存される。位置５１９は上述されたところの位置５１６と水素結合、および５１９のＮ４と５２９の２’ＯＨの間の水素結合を形成する。位置５１９での変動の欠如は、立体障害、若しくはループを安定化するための５１９と５２９の間の水素結合の要件によりうる。位置５１８は位置５２９と５３０の間に挿入され、それらの全部が積み重ねられる。このスタッキングは位置５３０を安定化しかつそれが位置１４９２と相互作用することを可能にしうる。Ａ１４９２のＮ６はＣ５１８の２’ＯＨへの水素結合にもまた関与する一方、Ｃ５１８のＯ２はコドン−アンチコドンヘリックスの第三の塩基対中のコドンの２’ＯＨとの金属媒介性の相互作用に関与する（Ｏｇｌｅら、２００１）。Ｃ５１８のＯ２はリボソームタンパク質Ｓ１２のＰｒｏ４４（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の番号付け）の主鎖カルボニルともまた相互作用する。結果、これらの位置に対するいかなる変化もタンパク質合成に影響を及ぼすとみられる。
最後に、位置５２９および５３０のヌクレオチド同一性は保存されかつリボソーム機能に重要である。位置Ｇ５２９は、Ａ５２０とｓｈｅａｒｅｄ型Ｇ−Ａ塩基対、およびＧ５３０のＯ６とリボソームタンパク質Ｓ１２のＡｓｎ４９の間で水素結合を形成する。これらの相互作用はこの位置での突然変異により破壊されうる。この位置でのピリミジンの置換は、必要とされる接触をなすのに十分に達しないかもしれない一方、アデニンは類似の様式で相互作用するための官能基を有しないとみられる。５２９の相互作用の破壊は、ループの構造若しくはＳ１２の結合（その双方はタンパク質合成に影響を及ぼすとみられる）を変化させうる。結晶構造（Ｏｇｌｅら、２００１）において、５３０の位置はＡ部位、とりわけＡ１４９２と相互作用することが示され、そして、コドン−アンチコドンヘリックスの第二および第三の位置での校正に関与する。Ｇ５３０とＡ１４９２の間の相互作用は双方のヌクレオチドのＮ１位置の間の水素結合により安定化される。同族、非同族および近同族間の識別は、Ｎ３へのコドンの２’ＯＨとＡ１４９２の２’ＯＨの間の水素結合により決定される。アンチコドンの２’ＯＨがＧ５３０のＮ３および２’ＯＨに水素結合する場合に類似の相互作用が起こる。この位置での変動の欠如はおそらく正確な翻訳のための上の相互作用の要件による。
５３０ループは系統発生論を通じ配列および構造中で保存される。上の実験は、系統発生分析により同定される相互作用を確認し、ならびに構造上重要なヌクレオチドを機能上重要なヌクレオチドと分離する。
試薬。制限酵素、リガーゼおよび仔ウシ腸アルカリホスファターゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓおよびＧｉｂｃｏ−ＢＲＬからであった。配列決定改変ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチドおよび配列決定緩衝液はＥｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからであった。オリゴヌクレオチドは、Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ
Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（テキサス州ミッドランド）、ＩＤＴ ＤＮＡ（アイオワ州コーラルビル）から購入したか、若しくはＢｅｃｋｍａｎ Ｏｌｉｇｏ １０００
ＤＮＡ合成機を使用して現場で合成したかのいずれかであった。ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲ試薬はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ（マサチュ
ーセッツ州ボストン）からであった。
プラスミドおよび突然変異誘発。全部の突然変異誘発は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｈｉｇｕｃｈｉら、１９８８；Ｍｕｌｌｉｓら、１９８６；ＭｕｌｌｉｓとＦａｌｏｏｎａ、１９８７）を使用して実施し、そして使用したプライマーを表５に列挙する。
１６Ｓ ｒＲＮＡの５３０領域での突然変異の構築：全部の突然変異はｐＲＮＡ１６ＳＴで構築し、その構築は別の場所で記述されるであろう。簡潔には、これは、２３Ｓ ｒＲＮＡ全体が欠失されていることを除きｐＲＮＡ１２２（Ｌｅｅら、１９９６；Ｌｅｅら、１９９７）の全部の特徴を含有するｐＵＣ１９誘導体である。それはより独特の制限酵素部位および配列決定のためのより多量のプラスミドＤＮＡを提供するため、それは１６Ｓ ｒＲＮＡ中の突然変異の導入においてｐＲＮＡ１２２を上回る利点を有する。無作為突然変異を、ＡｖｒＩＩとＢｇｌＩＩの間の野生型配列をＰＣＲに指図される無作為突然変異を含有するフラグメントで置換することにより、ｐＲＮＡ１６ＳＴ中の１６Ｓ ｒＲＮＡの６Ｎおよび８Ｎ位置に導入した一方、ＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩを同一方法により４Ｎループに使用した。
機能的変異体の選択：形質転換体を、１ｍＭ ＩＰＴＧを含有するＳＯＣ培地中で４時間インキュベートしてｒＲＮＡ合成を誘導し、そしてその後、５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むおよび含まないＬＢ−Ａｍｐ１００−ＩＰＴＧ寒天上にプレーティングした。総数約４．５〜５．０×１０５の形質転換体を各実験から得、４Ｎおよび８Ｎについておよそ２％ならびに６Ｎについて５％のクロラムフェニコール耐性生存体を生じた。次に、５０μｇ／ｍｌ以上の最小阻害濃度（ＭＩＣ）をもつ形質転換体を無作為に選択し、そして各実験について統計学的に有意の数で配列決定した。
１６Ｓ ｒＲＮＡでの単一変異体の構築：単一変異体をｐＡＳＳ２−ＧＦＰで構築し、そしてその後、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子を含有するｐＲＮＡ１２３（ｐＲＮＡ１２２の誘導体）（Ｌｅｅら、１９９６；Ｌｅｅら、１９９７）に移入した。ＣＡＴおよびＧＦＰ遺伝子のリボソーム結合部位はプラスミド由来リボソームのメッセージ結合部位に一致するよう改変されている。従って、クロラムフェニコール耐性およびＧＦＰ蛍光のレベルは、プラスミド由来リボソームの機能に直接比例する。ＣＡＴ遺伝子は機能的変異体の選択を見込む一方、ＧＦＰ遺伝子は変異体機能のハイスループットスクリーニングを見込む。各変異体を配列決定して突然変異の存在を確認し、そしてＧＦＰアッセイを使用して機能についてアッセイした。
１６Ｓ ｒＲＮＡでの二重変異体の構築：二重変異体はｐＲＮＡ１２３の単一変異体構築物から構築した。５３０ループ単一変異体構築物をＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、そして１４９２若しくは１４９３突然変異を含有するｐＲＮＡ１２３にクローン化した。これらのクローンをその後大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５細胞に形質転換した。各変異体を配列決定して突然変異の存在を確認し、そしてＧＦＰアッセイを使用して機能についてアッセイした。
細菌株および培地。全プラスミドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５（ｓｕｐＥ４４、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１）中で維持かつ発現した（Ｈａｎａｈａｎ、１９８３）。培養物はＬＢ培地（ＬｕｒｉａとＢｕｒｒｏｕｓ、１９５７）若しくは１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培地（ＬＢ−Ａｐ１００）中で維持した。ｌａｃＵＶ５プロモーターからのプラスミド由来ｒＲＮＡの合成を誘導するため；ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を各実験で指定される時点で１ｍＭの最終濃度まで添加した。株はＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｃ
ｅｌｌ Ｐｏｒａｔｏｒを使用する電気穿孔法（Ｄｏｗｅｒら、１９８８）により形質転換した。形質転換体は、選択培地上でプレーティングする前にＳＯＣ培地（Ｈａｎａｈａｎ、１９８３）中で１時間増殖させてプラスミド由来遺伝子の発現を可能にした。
最小阻害濃度（ＭＩＣ）。ＭＩＣはマイクロタイタープレート中で標準的方法により決定した。ＬＢ−Ａｐ１００中で増殖させた一夜培養物を、１ｍＭ ＩＰＴＧを含有する同一培地で希釈しかつ３７℃で２ないし３時間誘導した。およそ１０４個の誘導した細胞をその後、ＬＢ−Ａｐ１００＋ＩＰＴＧ（１ｍＭ）および増大する濃度のクロラムフェニコールを含有するウェルに添加した。培養物を２４時間増殖させ、そして増殖を完全に阻害したクロラムフェニコールの最低濃度をＭＩＣと指定した。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）アッセイ。変異体ならびに野生型対照の一夜培養物をＬＢ−Ａｍｐ１００中３７℃で１２〜１６時間増殖させた。一夜細胞培養物をその後１０００倍希釈しかつＬＢ−Ａｍｐ１００＋ＩＰＴＧ（１ｍＭ）培地中で誘導し、そして３７℃で２４時間増殖させた。２４時間後に、１ｍＬの培養物を分注しかつ１１，０００×ｇで１分間遠心分離して細胞をペレットにした。細胞ペレットを１ｍＬのＨＮ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４および０．８５％ＮａＣｌ）で２回洗浄しかつ１ｍｌのＨＮ緩衝液に再懸濁した。細胞を再懸濁した後に１００μＬの細胞懸濁液を９６ウェルの透明底マイクロタイタープレートに移した。細胞密度（λ＝６００ｎｍ）を、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ １９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）を使用して測定し、また、蛍光（励起＝３９５ｎｍおよび測定＝５０９ｎｍ）をＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＧＥＭＩＮＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）を使用して測定した。各培養物について、蛍光をＡ６００により除算しかつ野生型のパーセントとして提示した。値は異なる３日に行った３個の別個の培養物での最低３回のアッセイの平均を表す。
９７０ループ中の突然変異の影響
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）１６Ｓ ｒＲＮＡの９７０ループ（ヘリックス３１）は２個の修飾ヌクレオチドｍ２Ｇ９６６およびｍ５Ｃ９６７を含有する。ヘリックス３１中の位置Ａ９６４、Ａ９６９およびＣ９７０、ならびに位置９６６の修飾ヌクレオチドの存在は、細菌、古細菌および真核生物にわたり保存されている。ループ中の他のヌクレオチドの配列および特定のヌクレオシド修飾は、しかしながら該３超界のそれぞれ内で保存されている。生化学的および構造研究はこのループをＰ部位近くに置き、そしてそれが解読過程および抗生物質テトラサイクリンを結合することに関与することを示した。このｒＲＮＡヘアピンの機能的成分を同定するために、ヘリックス３１の９７０ループヌクレオチドの８個のループヌクレオチドを飽和突然変異誘発にかけ、そして１２４個の独特の機能的変異体を単離しかつ分析した。非ランダムヌクレオチド分布が各変異させた位置で見出された。位置９６６、９６７、９６９および９７０のヌクレオチド同一性はリボソーム機能に有意に影響を及ぼす。ｍ２Ｇ９６６若しくはｍ５Ｃ９６７の単一突然変異をもつリボソームは野生型リボソームよりｉｎ ｖｉｖｏでより多くのタンパク質を産生する。開始因子３（ＩＦ３）の過剰発現は、タンパク質合成の野生型のレベルを９６６および９６７変異体に特異的に復帰した。
リボソームは、全部の細胞中でメッセンジャーＲＮＡのタンパク質への翻訳を司るリボソームタンパク質（ｒタンパク質）リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の複合体である。ｒＲＮＡが翻訳過程の部分反応のそれぞれで決定的に重要な機能的役割を遂行することは十分に確立されている。リボソームＲＮＡは、機能上重要であることが既知のｒＲＮＡの領域中でクラスター形成する傾向のある数個の修飾ヌクレオシドを含有する（Ｂｒｉｍａｃｏｍｂｅら、１９９３）。タンパク質合成におけるそれらの役割は不明なままであるとは言
え、これらの修飾ヌクレオチドは、構造的安定性（Ｈｅｕｓら、１９８３；Ｍｅｒｏｕｅｈら、２０００；Ｒｉｆｅら、１９９８）、サブユニット集成（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、１９９１）、サブユニット会合（Ｃｈｏ、１９９９；Ｌｅｅら、２００１）および翻訳の正確さ（Ｂｊｏｒｋら、１９９９；Ｕｒｂｏｎａｖｉｃｉｕｓら、２００１）に関わっている。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）１６Ｓ ｒＲＮＡ中で、９７０ヘアピンは、ヘリックス３１、ならびに位置９６６（ｍ２Ｇ）および９６７（ｍ５Ｃ）に２個の修飾ヌクレオチドを含有する８ヌクレオチドループ（位置９６４−９７１）よりなる（図４．１）（Ｃａｎｎｏｎｅら、２００２）。９７０ループの大きさおよび配列は、古細菌、細菌および真核生物内で保存されているが、しかし位置Ａ９６４、Ａ９６９およびＣ９７０のみが該３超界のあいだで保存されている。修飾ヌクレオシドは全３超界で位置９６６に存在するとは言え、各超界は特異的修飾を特徴とする（Ｋｏｗａｌａｋら、２０００；Ｍａｄｅｎ、１９９０）。細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡは位置９６６に２−メチルグアノシンを含有する一方、真核生物は１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジンを含有し（Ｍａｄｅｎ、１９９０）、そして古細菌は３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジンをそれらの小サブユニットｒＲＮＡ中の対応する位置に含有する（Ｂａｌｃｈら、１９７９；Ｗｏｅｓｅら、１９８４）。
リボソーム機能への９７０ループの関与はいくつかの生化学、生物物理および遺伝子研究により示唆されている。Ｗｉｌｍｓら（１９９７）は、開始因子３（ＩＦ３）の存在下で破壊された解読領域のＰ部位のｍ５Ｃ９６７とＣ１４００の間のＵＶ光化学的架橋を同定した（Ｏｆｅｎｇａｎｄら、１９８２；Ｓｈａｐｋｉｎａら、２０００；Ｗｉｌｍｓら、１９９７）。ＭｏａｚｅｄとＮｏｌｌｅｒは、ｍ２Ｇ９６６がＰ部位に結合されたｔＲＮＡにより化学的プローブから保護されることを示し、また、Ｄｏｒｉｎｇらは、ｍ５Ｃ９６６とＰ部位に結合したｔＲＮＡの２−チオＣ３２の間のジアジリン架橋を同定した（Ｂｒｉｍａｃｏｍｂｅら、１９９３；ＭｏａｚｅｄとＮｏｌｌｅｒ、１９９０；ｖｏｎ ＡｈｓｅｎとＮｏｌｌｅｒ、１９９５）。Ｙｕｓｕｐｏｖら（２００１）による７０Ｓ結晶構造もまた、ｍ２Ｇ９６６の塩基と、Ｐ部位に結合したｔＲＮＡの位置３４のバックボーンの間の接触を示す。これらのデータは、９７０ループがリボソームのＰ部位でのｔＲＮＡの適正な位置決めに関与しうることを示唆する。ｒＲＮＡオペロンがλプロモーターＰＬの制御下にある遺伝子系を使用して、Ｊｅｍｉｏｌｏらは、位置９６６および９６７での単一ヌクレオチド置換が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖速度に影響を及ぼさなかったが、しかし位置９６７の欠失はドミナントな致死的表現型をもたらしたことを見出した（Ｊｅｍｉｏｌｏら、１９９１）。高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）３０Ｓサブユニットの結晶構造（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）は、９７０ループとリボソームタンパク質Ｓ９、Ｓ１０およびＳ１３の間の相互作用を示す。ｍ２Ｇ９６６、ｍ５Ｃ９６７およびＡ９６８はタンパク質Ｓ９とバックボーン接触をなし、Ａ９６４およびＡ９６９はタンパク質Ｓ１０とバックボーン接触をなし（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）、そしてＵ９６５、Ａ９６９およびＣ９７０はタンパク質Ｓ１３と塩基接触をなす（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）。
これらの研究は９７０ループがタンパク質合成で重要な機能的役割を演じていることを示唆する。この考えは、９７０ループがテトラサイクリンの主結合部位の一部を形成することを示す構造研究（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２０００；Ｐｉｏｌｅｔｔｉら、２００１）、ならびに位置９６５、９６６および９６７に３個の突然変異を含有するヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ ｐｙｌｏｒｉ）のテトラサイクリン耐性株の最近の単離（Ｄａｉｌｉｄｉｅｎｅら、２００２）により裏付けられる。この研究では、９７０ループ全体の突然変異解析を実施して、細菌でリボソーム機能に不可欠である配列および構造モチーフを同定しかつタンパク質合成において９７０ループにより演じられる機能的役割を解明した。
ヘリックス３１の８個のループヌクレオチド９６４−９７１を、ＰＣＲを使用する飽和突然変異誘発にかけ、そして特化したリボソーム発現ベクターｐＲＮＡ１２３（Ｌｅｅら、１９９６；Ｌｅｅら、１９９７；Ｍｏｒｏｓｙｕｋら、２０００）にクローン化した。この系で、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質のみがプラスミド由来リボソームにより翻訳される。変異させたプラスミドプールをその後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５細胞を形質転換するのに使用し、そして、機能的変異体を、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）およびクロラムフェニコール（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上で形質転換体をプレーティングすることにより変異体プールから選択した。合計１２４個の９７０ループ変異体を単離し、配列決定しそして機能についてアッセイした（表４．１）。
非ランダムヌクレオチド分布（ｐ＜１．４×１０−６）が選択したプール中の全位置で観察された（表４．２、図４．２）。全部の可能な突然変異が位置９６４を除く各位置で見出されたとは言え、各位置の特定のヌクレオチドに対する好みが観察された（図４．２）。位置９６４はアデノシンに対する明瞭な好みを示し、グアノシンは排除され、そしてピリミジンは少なかった。グアノシンは、機能的単離物のあいだで、９６５、９６８および９７０で排除され（ｐ＜７．６×１０−１０）、また、ウラシルは位置９６６および９７１で排除された（ｐ＜１．４×１０−６）。シトシンおよびアデニンは、位置９６７でグアノシンおよびウラシルより優勢であった（ｐ＜２．８×１０−６）。最後に、ピリミジンを上回るプリンに対する好みが位置９６９で観察された（ｐ＜６．６×１０−２３）。機能的変異体のあいだでのヌクレオチド分布の全体的パターンは、系統発生的バリアントを比較する場合に観察されるものに類似である（表４．２）とは言え、期待されたとおり、より多くの変動が変異体で観察される。
機能的変異体のあいだでの非ランダム保存パターンは、７９０ループ内の特定の配列若しくは構造モチーフに対する要件によりうる。潜在的ヌクレオチド相互作用を同定するため、変異させた位置の全部の可能な対での共変動分析を実施した。位置９６４・９６５（ｐ＝１．４×１０−５）、９６４・９６６（ｐ＝３．６×１０−３）、９６４・９６７（ｐ＝１．２×１０−３）、９６７・９６８（ｐ＝１．４×１０−２）および９６８・９６９（ｐ＝４．４×１０−２）の間の弱い共変動が観察された。位置９６８の２種の残存する共変動もまた構造的モチーフに対する要件を示しうる。位置９６７と９６８の間（１．４×１０−２）および位置９６８と９６９の間（４．４×１０−２）の弱い共変動のみが同定された（図４．３）。位置９６４と位置９６５、９６６および９６７の間の潜在的共変動もまた同定された。これらの共変動は、しかしながら、変異体のあいだで位置９６４のいかなるグアノシンの非存在により確認され得なかった。変異体プールで分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施して、変異体のあいだでいずれかの位置に存在する特定のヌクレオチドがリボソーム機能に特異的に影響を及ぼしたかどうかを決定した。統計学的に有意のＡＮＯＶＡが、位置９６６（ｐ＜６．１×１０−６）、９６７（ｐ＜３．６×１０−２）、９６９（ｐ＜７．５×１０−５）および９７０（ｐ＜４．８×１０−３）で得られた。これらの位置は９７０ループ中の２個の積み重なった塩基トリプルの一部であり、これらのトリプルがリボソーム機能に重要であることを示唆する。
部位特異的突然変異。タンパク質合成における９７０ループの役割をより良好に理解するため、一連の部位特異的突然変異を位置９６６および９６７で構築した（図４．４）。Ｗｉｌｍｓらはｍ５Ｃ９６７とＣ１４００の間のＵＶ架橋を同定した（Ｗｉｌｍｓら、１９９７）。機能的相互作用が位置ｍ５Ｃ９６７とＣ１４００の間に存在するかどうかを決定するため、位置ｍ５Ｃ９６７とＣ１４００の間の全部の可能な部位特異的突然変異もまた構築しかつアッセイした（表４．３）。
ｍ２Ｇ９６６Ｃ突然変異はリボソーム機能にほとんど影響を有しない（９６％±２．１）が；しかしながらｍ２Ｇ９６６Ａ若しくはｍ２Ｇ９６６Ｕ突然変異を含有するリボソームは野生型リボソームより多くのＧＦＰを産生する（それぞれ１２６％および１２７％）。同様に、ｍ５Ｃ９６７Ｇ変異体は野生型より約１０７％活性である一方、ｍ５Ｃ９６７Ａおよびｍ５Ｃ９６７Ｕ変異体の活性はそれぞれ１２０％および１２７％である（図４．４）。タンパク質合成の律速段階は開始である（Ｌａｕｒｓｅｎら、２００５）ため、位置９６６および９６７の突然変異が開始に影響を及ぼしうる方法を検査した。ＩＦ３のモデル化およびＵＶ架橋は９７０ループとの相互作用を示した。ＩＦ３はＣ９６７×Ｃ１４００の間のＵＣ架橋の頻度を低下させることが示された（Ｓｈａｐｋｉｎａら、２０００）。生化学的データに適合させるためのＩＦ３のＮ末端（ＩＦ３Ｎ）のモデル化は、ＩＦ３ＮをＰ部位および９７０ループとの相互作用に配置した（Ｐｉｏｌｅｔｔｉら、２００１）。９６６および９６７の突然変異がＩＦ３結合に影響を及ぼしたかどうかを決定するため、ＩＦ３をプラスミド、ｐＡＣＹＣ１７７誘導体ｐＫａｎ６にクローン化し、そして誘導可能なＡｒａＢＡＤプロモーター（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄら、１９７８；Ｋａｐｌａｎら、１９７８）の制御下に置いた。Ｕ９６６若しくはＵ９６７のいずれか（大部分の機能をもつ変異体）と試験した場合、ＩＦ３の過剰発現が突然変異について野生型のレベルの機能を復帰させたはＵ９６６若しくはＵ９６７である（表４．４）。ＩＦ２若しくはＩＦ１の過剰発現はしかしながら正常レベルの機能を復帰せず、Ｕ９６６およびＵ９６７突然変異のＩＦ３による補完が特異的であることを示唆する。Ｃ１４００のＡ若しくはＧへの突然変異はそれぞれ１７％および１５％の機能をもたらした。Ｃ１４００Ｕ突然変異を含有するリボソームは、しかしながら野生型リボソームより２３％より多いＧＦＰを産生した。９６７／１４００二重変異体の全部で、該二重変異体のリボソーム機能は、個々の変異体のそれぞれのおよそ積であり、各部位での突然変異の効果が独立であること、ならびにｍ５Ｃ９６７およびＣ１４００はタンパク質合成の間に相互作用しないことを示唆する。９６６および９６７での修飾を、Ｊｏｈｎ ＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊｒ．博士（私信）によりエネルギー最小化したＴｕｎｇらの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３０Ｓサブユニット相同性モデルにモデル化して、構造に対するそれらの影響を同定した。ｍ５Ｃ９６７はループに背を向ける一方、ｍ２Ｇ９６６は糖側に面する。これらの修飾の双方がスタッキング表面を拡大しかつより大きな安定性を可能にする。
ヘリックス３１の９７０ループの８ヌクレオチド配列は各超界内で保存されるが、しかし３ヌクレオチドのみが全３超界間で保存されている。９７０ループは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で位置９６６および９６７で２個の修飾ヌクレオシドを含有する。飽和突然変異誘発および機能的変異体の選択は、ループの機能上重要な配列および構造モチーフを示した。
９７０ループのヌクレオシド要件。アデノシンを除くヌクレオチドはＮ２位置に荷電した基を含有し、そして９６４に対し選択した（表４．５）。位置９６４は飽和突然変異誘発で最も保存されたものであった。より小さい大きさのピリミジンはプリンと同一位置に荷電した基を配置しないとみられ、Ｏ２を含有するピリミジンの少数がなぜ機能的プールで見出されたかを説明する。９６４のピリミジンのＯ２と９６５のＵ Ｏ４若しくはＧ Ｏ６の間の静電的衝突が、９６５のＵおよびＧの少なさ、ならびにこれらの位置間で見られる共変動を説明しうる。選択したプールで同定された４３個のＵ９６５クローンのうち、Ａ９６４Ｃ突然変異をもつクローンは同定されなかった。
ウラシルは、機能的プール中で位置９７１で少ない。３０Ｓ結晶構造で９７１ははじき出され、そして１６Ｓ ｒＲＮＡの位置９４９、９５０、１３６３、１３６４および１３６５のバックボーンにより形成されるポケット中に結合する。ＵのＯ２およびＯ４基は該ポケットと増大された静電的衝突を引き起こすとみられ、この相互作用を可能にせずかつ機能的クローンでの９７１のＵの存在を減少させる。
３０Ｓ結晶構造中で、残存する６位置が２個の積み重なったトリプルを形成し、位置９６６、９６７および９６８が１個のトリプルを形成しかつ位置９６５、９６９および９７０が第二のトリプルを形成する（図４．３）。位置９６５および９６８はプリンが少なく、おそらく立体的要件を示す。加えて、Ｇが反対して強く選択され、正に荷電したＮ２基が機能に不利であったことを示した。位置９６５および９６８と対照的に、位置９６６および９６９はプリンを好みかつピリミジンが少なく、これは他のリボソーム成分を接触するための要件を表しうる。位置９６９について特異的な接触は同定されていないとは言え、位置９６６はＰ部位のｔＲＮＡと相互作用することが既知であり、これがこの位置でのプリンの要求を説明しうる。また、プリンはより大きな表面積によりピリミジンより良好に積み重なることが既知である。積み重なったトリプル中のこれらの塩基の位置が、より良好なスタッキングのためのヌクレオチドの好みを導きうる。位置９６７および９７０はＡ／Ｃを好む一方、Ｇ／Ｕは少ない。大きさの好みよりはむしろ、これらの２位置はＮ４若しくはＮ６位置に正に荷電した基を必要とする。９６６：９６７：９６８積み重ねの位置１（９６６）および２（９６７）のヌクレオチド要件は、９６５：９６９：９７０積み重ねの位置２（９６９）および３（９７０）のヌクレオチド要件に対応する。
９７０ループ突然変異はＩＦ３結合を遂げる。ＩＦ３のＮ末端は、入手可能な生化学的データを使用して３０Ｓ結晶構造にモデル化する場合に、位置９６６−９６８と相互作用することが見出された（Ｐｉｏｌｅｔｔｉら、２００１）。飽和突然変異誘発において、位置９６６はプリンを好みかつピリミジンが少なく、９６７はＡ／Ｃを好む一方Ｇ／Ｕは少なく、そして９６８はプリンが少ない（表４．５）。位置ｍ２Ｇ９６６およびｍ５Ｃ９６７の部位特異的突然変異は、野生型と比較した場合により高レベルの機能をもたらし、タンパク質合成の速度の増大を示す（図４．４）。
開始はタンパク質合成の律速段階である（Ｌａｕｒｓｅｎら、２００５）。生化学的データは、ＩＦ３が開始の間にイニシエーターｔＲＮＡをアミノアシル−ｔＲＮＡと識別することを示す（Ｈａｒｔｚら、１９９０）。ＩＦ３結合の破壊はイニシエーターｔＲＮＡの識別を妨害して、イニシエーターｔＲＮＡの緊縮性の低下および開始の増大された速度に至りうる。ＧＦＰタンパク質は、しかしながら発色団を構成するヌクレオチド中の確実かつ唯一の特異的突然変異であり（Ｔｓｉｅｎ、１９９８）ＧＦＰタンパク質を非蛍光にするとみられる。従って、われわれの系で、より迅速に開始するリボソームはより多くのＧＦＰタンパク質を作成するとみられ、そして従ってより高い蛍光をもたらすとみられる。全３種の開始因子をｍ２Ｇ９６６Ｕおよびｍ５Ｃ９６７Ｕの存在下で過剰発現させて、野生型レベルの機能を復帰し得たかどうかを見た。
位置９６６若しくは９６７の突然変異と一緒のＩＦ３の過剰発現は正常レベルの機能を復帰するが、しかし他のＩＦはしない（表４．４）。これは、位置９６６若しくは９６７の突然変異がＩＦ３Ｎ結合を妨害すること、およびこの欠陥がＩＦ３の増大された産生により軽減され得ることを示唆する。これらの位置の突然変異が、ＩＦ３Ｎ結合に影響を及ぼすとみられる位置９６６：９６７：９６８のスタッキングを破壊することが可能である。増大された濃度のＩＦ３はより低い結合親和性を補償しうる。位置９６６および９６７の修飾の役割は、９６６：９６７：９６８積み重ねトリプルをさらに安定化してそれを正しく機能させることでありうる。
スタッキングの重要性。Ｊｏｈｎ ＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊｒ．博士、ウェイン州立大学により開発されたプログラム（私信）を使用する２５種の高機能および２５種の低機能変異体のモデル化研究は、全部の機能的変異体が積み重なったトリプルを形成する能力を有することを示唆した。変異体の選択されたプールで、９６４：９７１および９６５：
９７０双方の間で塩基対を形成し得たただ１種の変異体（１０％の機能）が同定された。これらの塩基対の形成は、結晶構造中で見られる構造の形成を破壊することができ、そして従って反対して選択された。９６４：９７１若しくは９６５：９７０いずれかの間で塩基対を形成し得た他の変異体もまた、選択されたプール中で見られた。これらの大部分は、しかしながら最も容易に破壊され得るＡ−Ｕ塩基対であった。
９６６、９６７および９６８でのスタッキングが機能に必要とされる。ＩＦ３に加え、位置９６６および９６７が構造および生化学的研究によりＰ部位に位置推定されている（Ｄｏｒｉｎｇら、１９９４；ＭｏａｚｅｄとＮｏｌｌｅｒ、１９８６；ＭｏａｚｅｄとＮｏｌｌｅｒ、１９９０；ｖｏｎ ＡｈｓｅｎとＮｏｌｌｅｒ、１９９５；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）。９６６の塩基は位置３４のＰ部位ｔＲＮＡのバックボーンと相互作用し（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）、そして、飽和突然変異誘発でプリンに対する好みを示した。野生型ｍ２Ｇ９６６ Ｎ２の位置決めは、Ｐ部位ｔＲＮＡ若しくはＩＦ３Ｎを妨害することを回避するために重要であるとみられる。ループ中の付加的な突然変異の存在下で、ｍ２Ｇ９６６ Ｎ２の位置は変わりうる。飽和突然変異誘発において、Ａ９６６が野生型ｍ２Ｇ９６６より好まれた。Ｎ２に官能基を欠くＡが、ループ中の付加的な突然変異の存在下でＰ部位ｔＲＮＡ若しくはＩＦ３Ｎの結合の妨害を回避するために野生型Ｇより好まれたことが可能である。位置９６７および９６８はＰ部位ｔＲＮＡと相互作用することが示されておらず、そして最もありそうには９６６を正しい場所に配置することに関与する。９６７のヌクレオチド分布は、ＩＦ３結合に対する決定子でありうるＮ４若しくはＮ６の要件を示唆する。９６７での修飾のモデル化は、ｍ５Ｃ修飾が積み重ねを拡大かつ安定化することを示唆する。最後に、野生型Ａ９６８は、選択されたプール中でＡ９６８Ｕに有利に少なかった。これは位置９６７のＮ４若しくはＮ６の好みの結果でありうる。Ｕ９６８ Ｏ４は９６７のＮ４若しくはＮ６への水素結合を見込み、積み重ねの安定性を増大させる。この相互作用はこれらの２位置間で見られる共変動を説明するとみられ、かつ、このスタッキング相互作用の重要性を示唆する。
９６５、９６９および９７０でのスタッキングが機能に必要とされる。９６９、９７０および９６５の積み重ねの破壊は、選択されたプール中のＡ９６４Ｇ変異体の非存在により示されるとおり、リボソーム機能に不利である。結晶構造中で、位置９６４は９６５：９６９：９７０の積み重なったトリプルの上に配置される（図４．３）。Ａ９６４Ｇ突然変異の３０Ｓ結晶へのモデル化は、おそらく塩基スタッキングを破壊する、Ｃ９７０の糖とのＡ９６４ＧのＮ２の間の立体衝突を示した（図４．６）。この積み重なったトリプルの重要性は十分に理解されてはいない。高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）３０Ｓ結晶構造の分析は、リボソームタンパク質Ｓ１３のＣ末端と、位置９６９、９７０および９６５により形成される積み重なったトリプルの間の相互作用を示す。この相互作用はＳ１３の最後の３アミノ酸が関わる（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）。Ｓ１３は系統発生的に保存され、また、該Ｃ末端は、位置２９と３０の間のＰ部位に結合したｔＲＮＡのバックボーンと相互作用すると思われるいくつかの塩基性側鎖を含有する（Ｈｏａｎｇら、２００４）。興味深いことに、高度好熱菌（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｓ１３の最後の７アミノ酸は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１３中に存在しない（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１３の５個のＣ末端アミノ酸の欠失はわずかな増殖の欠損のみを表した。Ｓ１３のＣ末端のさらなる欠失（３６アミノ酸を欠失）はｔＲＮＡ結合の欠損をもたらした（Ｈｏａｎｇら、２００４）。結晶構造中で、Ｓ１３のＣ末端は非常にわずかの二次構造を含有するが；しかしながらこの領域は１６Ｓ ｒＲＮＡとの相互作用の大部分の原因である（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）。高度好熱菌（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）では、付加的なＣ末端アミノ酸が、Ｓ１３をリボソーム上で安定化するのを助けかつＰ部位でのその相互作用のための尾部の位置決めで補助しうる。
位置９６６−９６８のＩＦ３Ｎの結合はＰ部位へのイニシエーターｔＲＮＡ結合のための空間を制限する。これはＰ部位でのイニシエーター以外のｔＲＮＡの結合を阻害するために開始の間に重要でありうる。イニシエーターｔＲＮＡと複合体形成したＩＦ２は、イニシエーターをＰ部位に配置してＩＦ３Ｎが動くことを必要とする。ＩＦ２−イニシエーターｔＲＮＡの存在下で、９６５：９６９：９７０トリプルが二次的ＩＦ３Ｎ結合部位を表すことが可能である。これは、位置９６６および９６７（９６６、９６７、９６８積み重ね）ならびに位置９６９および９７０（９６５、９６９および９７０積み重ね）の間のヌクレオチド要件の類似性により示唆される。加えて、ヌクレオチド同一性は、ＡＮＯＶＡ解析により決定されるところのこれらの位置の全４個で機能に重要である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３０Ｓサブユニット中の位置９６９、９７０および９６５の役割は未だ不明である。該３個の保存されたヌクレオチドのうち２個すなわち９７０ループ中の位置９６９および９７０が、この積み重なったトリプル中に位置する。これらの位置の保存は何らかの機能を示唆するが；しかしながら現在明らかな相互作用は存在しない。該相互作用が一過性でありそして従って同定されていないことが可能である。
位置９７１は９７０ループの位置を決める。該ループ中のＡ９６４の位置は、Ｇ９７１をはじき出しならびに位置Ｕ９６５、Ａ９６９およびＣ９７０を伴うトリプルを形成するのを助ける原因でありうる。位置９７１は、１６Ｓ ｒＲＮＡ中の位置９４９、９５０、１３６３、１３６４および１３６５により形成されるポケット内で６個の水素結合を作成する。露出されたヌクレオチド９７１とのこの広範囲の水素結合は、タンパク質合成の間の９７０ループの移動性を制限しかつ９７０ループの動きをリボソームの動きに結合するようにはたらきうる。リボソームは翻訳の間にコンホメーション変化を受けることが既知である（ＦｒａｎｋとＡｇｒａｗａｌ、２０００；Ｏｇｌｅら、２００２；Ｖａｌｌｅら、２００３；ＶａｎＬｏｏｃｋら、２０００）。Ｇ９７１は９７０ループの位置決めを維持しかつその動きをリボソームと協調させうる。
試薬。制限酵素、リガーゼおよび仔ウシ腸アルカリホスファターゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓおよびＧｉｂｃｏ−ＢＲＬからであった。配列決定修飾ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチドおよび配列決定緩衝液はＥｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからであった。オリゴヌクレオチドはＭｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（テキサス州ミッドランド）若しくはＩＤＴ ＤＮＡ（アイオワ州コーラルビル）のいずれかから購入した。ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲ試薬はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ（マサチューセッツ州ボストン）からであった。
プラスミドおよび突然変異誘発。このプラスミドは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下に変えられた抗Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＡＳＤ）配列を含有する１６Ｓ ｒＲＮＡとともに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒｒｎＢオペロンを含有する。該プラスミドは、プラスミドの１６Ｓ ｒＲＮＡのＡＳＤ配列に相補的なＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列（Ｈｕｉとｄｅ Ｂｏｅｒ、１９８７；Ｈｕｉら、１９８７；Ｌｅｅら、１９９６；ＳｈｉｎｅとＤａｌｇａｒｎｏ、１９７４）とともにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子もまた含有する。従って、ＣＡＴおよびＧＦＰ ｍＲＮＡはプラスミドにコードされる３０Ｓサブユニットにより特異的に翻訳される。プラスミドにコードされる３０Ｓサブユニットは正常の宿主ｍＲＮＡを翻訳し得ず、従って１６Ｓ ｒＲＮＡ内の突然変異はレポーター遺伝子の翻訳にのみ影響を及ぼしかつ細胞の生存率に影響を及ぼさない。ＣＡＴ遺伝子は至適以下の機能をもつクローンを選択するのに使用し得る一方、ＧＦＰはハイスループット機能アッセイに使用し得る。
全部の突然変異誘発は、ＰＣＲ１についてプライマー９７０ループ ｍｕｔ（５’−Ｇ
ＧＡ ＴＧＴ ＣＡＡ ＧＡＣ ＣＡＧ ＧＴＡ ＡＧＧ ＴＴＣ ＴＴＣ ＧＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＣＧＡ ＡＴＴ ＡＡＡ ＣＣＡ ＣＡＴ ＧＣＴ ＣＣＡ ＣＣＧ−３’）および１６Ｓ ＡｖｒＩＩ（５’−ＡＣＧ ＴＣＧ ＣＡＡ ＧＡＣ ＣＡＡ ＡＧＡ ＧＧ−３’）、ならびにＰＣＲ２について９７０ループＲ（５’−ＣＣＴ ＧＧＴ ＣＴＴ ＧＡＣ ＡＴＣ ＣＡＣ ＧＧ−３’）および１６Ｓ ＸｂａＩ（５’−ＧＧＴ ＣＧＧ ＣＧＡ ＣＴＴ ＴＣＡ ＣＴＣ ＡＣ−３’）を用いる組換えポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｈｉｇｕｃｈｉら、１９８８；Ｍｕｌｌｉｓら、１９８６；ＭｕｌｌｉｓとＦａｌｏｏｎａ、１９８７）を使用して実施した。
１６Ｓ ｒＲＮＡの９７０領域での突然変異の構築：全突然変異は９７０ループに致死的突然変異（９６４−ＵＣＣＣＣＣＧＵ−９７１）を含有する改変バージョンのｐＲＮＡ１２３中で構築した。ＢｇｌＩＩとＢｓｔＥＩＩ切断部位の間の野生型配列を、ＰＣＲに指図される無作為突然変異を含有するフラグメントで置換することにより、ｐＲＮＡ１２３の１６Ｓ ｒＲＮＡに無作為突然変異を導入した。
機能的変異体の選択。形質転換体は、ＡｍｐＲ遺伝子の発現を見込むためＳＯＣ培地中３７℃で振とうしながら１時間インキュベートした。培養物のサンプルを、形質転換効率を決定するためＬＢ＋Ａｍｐ１００プレート上でプレーティングした。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）をその後、１ｍＭの濃度まで残存培養物に添加し、そして３７℃で振とうしながら追加の３時間インキュベートしてｒＲＮＡ合成を誘導した。培養物をその後、１００μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ−Ａｍｐ１００−ＩＰＴＧ寒天上にプレーティングした。およそ１０％の生存体率が観察された。生存体を無作為に選択しかつ統計学的に有意の数で配列決定した。
１６Ｓ ｒＲＮＡ中の単一変異体の構築。単一変異体は、ｐＲＮＡ１２３の誘導体ｐＲＮＡ２７２（Ｌｅｅら、１９９６；Ｌｅｅら、１９９７）で構築し、その構築は後述されるであろう。ｐＲＮＡ２７２構築物は唯一のＡｐａＩ部位を１６Ｓ ｒＲＮＡ中に含有する。位置９６６および９６７の単一変異体を、部位特異的ＰＣＲを使用して作成し、そしてＡｐａＩおよびＲｓｒＩＩ制限酵素を使用してｐＲＮＡ２７２にクローン化した。位置１４００の突然変異を、部位特異的ＰＣＲを使用して作成し、そしてＸｂａＩおよびＢｓｒＧＩ制限酵素を使用してｐＲＮＡ２７２にクロ―ン化した。各変異体を配列決定して突然変異の存在を確認し、また、ＧＦＰアッセイを使用して機能についてアッセイした。
１６Ｓ ｒＲＮＡ中の二重変異体の構築。二重変異体をｐＲＮＡ２７２中で単一変異体構築物から構築した。１４００および９６７双方の単一変異体をＲｓｒＩＩおよびＸｈｏＩで消化した。単一突然変異を含有するフラグメントを一緒に連結して二重変異体を形成した。これらのクローンをその後大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５細胞に形質転換した。各変異体を配列決定して突然変異の存在を確認しかつＧＦＰアッセイを使用して機能についてアッセイした。
細菌株および培地。全プラスミドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５（ｓｕｐＥ４４、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１）（Ｈａｎａｈａｎ、１９８３）中で維持しかつ発現させた。培養物はＬＢ培地（ＬｕｒｉａとＢｕｒｒｏｕｓ、１９５７）若しくは１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培地（ＬＢ−Ａｐ１００）中で維持した。ｌａｃＵＶ５プロモーターからのプラスミド由来ｒＲＮＡの合成を誘導するため；ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を各実験で指定される時点で１ｍＭの最終濃度まで添加した。株をＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｃｅｌｌ Ｐｏｒａｔｏｒを使用して電気穿孔法（Ｄｏｗｅｒら、１９８８）により形質転換した。別の方法で示されない限り、形質転換体は、選択培地上でプレーティングする前にＳＯＣ培地（Ｈａｎａｈａｎ、１９８３）中で１時間増殖させて、プラスミド由来遺伝子の発現を可能にした。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）アッセイ。変異体ならびに野生型対照の一夜培養物を、ＬＢ−Ａｍｐ１００中３７℃で振とうしながら１２〜１６時間増殖させた。一夜細胞培養物をその後１００倍希釈し、ＬＢ−Ａｍｐ１００＋ＩＰＴＧ（１ｍＭ）培地で誘導し、そして振とうしながら３７℃で２４時間増殖させた。２４時間後に５００μＬの培養物を１．７ｍＬ微小遠心管に分注し、そしておよそ１１，０００×ｇで１分間遠心分離して細胞をペレットにした。細胞ペレットを５００μＬのＨＮ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４および０．８５％ＮａＣｌ）で２回洗浄し、そして５００μＬのＨＮ緩衝液に再懸濁した。細胞を再懸濁した後に、１００μＬの細胞懸濁液を９６ウェルの透明底マイクロタイタープレートに移した。細胞密度（λ＝６００ｎｍ）を、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ １９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）を使用して測定し、また、蛍光（励起＝３９５ｎｍおよび測定＝５０９ｎｍ）をＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＧＥＭＩＮＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）を使用して測定した。各培養物について、蛍光をＡ６００により除算しかつ野生型のパーセントとして提示した。値は、異なる日に行った３個の別個の培養物での最低３回のアッセイの平均を表す。
１６Ｓ リボソームＲＮＡ中のヘリックス４５の役割
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）１６Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス４５は３個の修飾ヌクレオチド、ｍ２Ｇ１５１６、ｍ２ ６Ａ１５１８およびｍ２ ６Ａ１５１９を含有する。位置１５１８および１５１９のジメチルアデノシンは数種の例外を伴い全生物体で保存されている。位置１５１８および１５１９をメチル化するＫｓｇＡメチラーゼの欠失は、増殖速度に対するわずかな影響のみを有し、ならびに抗生物質カスガマイシンに対する耐性を賦与する。生化学的および構造研究は、解読領域と相互作用し、サブユニット間架橋Ｂ２ｂを形成しかつ開始因子３に結合するヘリックス４５を示した。ヘリックス４５（位置１５１２−１５２３）の役割を研究するため、飽和突然変異誘発を実施し、そして１１６個の機能的変異体を単離しかつ分析した。非ランダムヌクレオチド分布が１５１５および１５２０を除く全位置で観察された。位置１５１８および１５１９の６個の機能的突然変異が、選択されたプールで単離され、該ヘリックスの補償的変化がこれらの位置でのヌクレオチドの制約を低下させうることを示す。位置１５１８および１５１９だけの突然変異の影響を見るために単一および二重突然変異を作成した。全部の単一および二重変異体は機能の全喪失を表した。メチル化の喪失がヘリックス４５中の突然変異の機能を遂げたかどうかを決定するために１ｋｓｇＡ株を構築した。ｋｓｇＡメチラーゼの喪失は低下された開始速度をもたらした。
リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は、タンパク質合成の間のリボソームに帰される触媒機能で主要な役割を演じる。入手可能な多数のｒＲＮＡ配列の系統発生分析は、ＲＮＡの配列および構造の保存についての多くの情報を提供した。１６Ｓ ｒＲＮＡ中のヘリックス４５は３超界のあいだで保存されている（Ｃａｎｎｏｎｅら、２００２）（図５．１）。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）では、ヘリックス４５のステムは保存されたＵ１５１２：Ｇ１５２３ゆらぎ塩基対およびＡ１５１３：Ｕ１５２２ワトソン−クリック塩基対を含有する一方、該ループは位置１５１７、１５１８および１５１９に３個の保存されたヌクレオチドを含有する。該ループはまた３個の修飾ヌクレオチド、すなわち位置１５１６、１５１８および１５１９にそれぞれＮ２−メチルグアノシン（ｍ２Ｇ）および２個の隣接するＮ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン（ｍ６ ２Ａ）も含有する（Ｃａｎｎｏｎｅら、２００２）（図５．１）。ステムの不適正はＫｓｇＡメチラーゼの認識因子であることが提案された（Ｆｏｒｍｅｎｏｙら、１９９４）一方、ループヌクレオチドはリボソームサブユニット会合（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）、ＩＦ３結合（Ｅｈｒｅｓｍａ
ｎｎら、１９８６；Ｐｉｏｌｅｔｔｉら、２００１）、および抗生物質カスガマイシンに対する耐性（Ｈｅｌｓｅｒら、１９７１；Ｈｅｌｓｅｒら、１９７２；Ｖａｎ Ｂｕｕｌら、１９８３）に関与している（図５．１）。
位置１５１８および１５１９のジメチル化の原因であるメチラーゼは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でｋｓｇＡ遺伝子によりコードされ、、また、比較ホモログが、細菌（Ｈｏｕｓｅｎら、１９９７；Ｖａｎ Ｂｕｕｌら、１９８３）および真核生物（Ｌａｆｏｎｔａｉｎｅら、１９９４；Ｓｅｉｄｅｌ−Ｒｏｇｏｌら、２００３）で同定されている一方、推定のホモログが古細菌で同定されている（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌら、２００４）。ｋｓｇＡ変異体で、倍加時間の増大、開始因子３（ＩＦ３）に対する増大された必要性、低下された翻訳忠実度、およびカスガマイシンに対する耐性（Ｉｇａｒａｓｈｉら、１９８１；Ｐｏｌｄｅｒｍａｎｓら、１９７９；ｖａｎ Ｂｕｕｌら、１９８４ｂ）が見られた。酵母のｋｓｇＡオルトログ（ｄｉｍ１）はしかしながら機能に不可欠である（Ｌａｆｏｎｔａｉｎｅら、１９９４）。酵母では、Ｄｉｍ１は２種の既知の機能、すなわち位置１５１８および１５１９のメチル化ならびに１８Ｓ ｒＲＮＡのプロセシングを有する（Ｌａｆｏｎｔａｉｎｅら、１９９５）。該２機能を切り離しかつｒＲＮＡプロセシング機能のみ保持するＤｉｍ１の突然変異はなお生存可能であり、そして明白な増殖欠損を示さず、ジメチル化が機能に必要でなかったことを意味した（Ｌａｆｏｎｔａｉｎｅら、１９９８）。従って、ＫｓｇＡならびに位置１５１８および１５１９のメチル化は機能に不可欠でない。
Ｕ１５１２：Ｇ１５２３ゆらぎ塩基対はｋｓｇＡの重要な認識部位である。このゆらぎ塩基対の突然変異は、位置１５１８および１５１９のメチル化の２０〜８０％低下をもたらすが、しかしメチル化の完全な阻害はもたらさない（Ｆｏｒｍｅｎｏｙら、１９９４）。従って、メチラーゼは、ヌクレオチドよりはむしろこのゆらぎ対により形成される構造を認識しうる。
位置１５１８および１５１９のヌクレオチド同一性およびメチル化は普遍的に保存されている。今日までわずか３個の例外が同定された。すなわち、２個のアデノシンにいかなるメチル基も含有しない出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ミトコンドリア１２Ｓ ｒＲＮＡ（Ｋｌｏｏｔｗｉｊｋら、１９７５）、ならびにその双方が１個のみのジメチル化アデノシンを含有するユーグレナ グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）葉緑体ｒＲＮＡおよび古細菌スルフォロバス ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）１６Ｓ ｒＲＮＡ（Ｎｏｏｎら、１９９８；Ｓｃｈｎａｒｅら、１９９２；Ｓｔｅｅｇｅら、１９８２；Ｖａｎ Ｂｕｕｌら、１９８４ａ）。１５１８および１５１９のｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異研究はリボソーム再構成に対しほとんど影響をもたらさなかったが、しかしほとんどの活性が部分的に低下された（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、１９９０）。活性は完全に消失されなかったとは言え、最初のペプチド結合の開始依存性の形成が１５１８変異体で２／３だけ阻害された（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、１９９０）。全部の染色体ｒＲＮＡオペロンが欠失された系（Ａｓａｉら、１９９９）を使用して、Ｖｉｌａ−Ｓａｎｊｕｒｊｏら（１９９９）は、位置１５１９の突然変異がカスガマイシン耐性表現型を賦与するのみならず、しかしリボソーム機能を有意に遂げないことを見出した。酵母では、しかしながらＡ１５１８ＧおよびＡ１５１９Ｇ突然変異はｒＲＮＡの適正なプロセシングを可能にしたが、しかし増殖を支援しなかった（Ｌａｆｏｎｔａｉｎｅら、１９９５）。
ヘリックス４５のループヌクレオチド（１５１６−１５１９）はサブユニット間架橋Ｂ２ｂを形成しかつ２３Ｓ ｒＲＮＡの１９１５ループ（ヘリックス６９；１９１９−１９２０）のステムと相互作用する（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）。Ｅｈｒｅｓｍａｎｎら（１９８６）は、ｔｒａｎｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を使用して位置１５０６−１５２９とＩＦ３の間の架橋を同定した。Ｐｉｏｌｅｔｔｉらによる最近の結晶構造は、しかしながらＩＦ３のＣ末端が位置１５３２−１５３４と接触していたことを示した。それはヘリックス４５との直接接触でないとは言え、この接触はヘリックス４５の移動性に影響を及ぼすことができ、架橋Ｂ２ｂの形成を阻害しかつサブユニット会合を予防する（Ｐｉｏｌｅｔｔｉら、２００１）。
タンパク質合成におけるヘリックス４５修飾の役割を理解するため、ヌクレオチド１５１２−１５２３での飽和突然変異誘発実験を、ＫｓｇＡメチラーゼの存在若しくは非存在下のいずれかで実施した。
飽和突然変異誘発実験をヘリックス４５の１２ヌクレオチド（位置１５１２−１５２３）で実施した。全突然変異はＰＣＲにより導入しそしてプラスミドｐＲＮＡ１２３（Ｌｅｅら、１９９６；Ｌｅｅら、１９９７）にクローン化した。このプラスミドはｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒｒｎＢオペロンを含有する。１６Ｓ ｒＲＮＡの抗Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＡＳＤ）配列は、正常の宿主ｍＲＮＡがもはや結合しないように変えられている。該プラスミドはまた、該プラスミドの１６Ｓ ｒＲＮＡの変えられたＡＳＤ配列に相補的なＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列（Ｌｅｅら、１９９６）とともにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子も含有する。ＣＡＴおよびＧＦＰ ｍＲＮＡはプラスミドにコードされる３０Ｓサブユニットにより特異的に翻訳される。プラスミドにコードされる３０Ｓサブユニットは正常な宿主ｍＲＮＡを翻訳し得ず、従って１６Ｓ ｒＲＮＡ内の突然変異はレポーター遺伝子の翻訳にのみ影響を及ぼし、そして細胞の生存率に影響を及ぼさない。
未選択のクローンを配列決定して、各変異された位置が無作為であったことを確認した（データは示されない）。クローンをその後、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）およびクロラムフェニコール（１５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地上でプレーティングすることにより機能について選択した。合計１１６個の独特のクローンを単離し、配列決定しかつ機能についてアッセイした（表１）。
統計学的解析。非ランダムヌクレオチド分布が、選択されたプールで、１５１５および１５２０を除く全位置について観察された（図５．４）。全部の可能な突然変異が位置１５１２、１５１７、１５１８および１５１９を除く各位置について見出された。位置１５１７、１５１８および１５１９を除き、系統発生分析でより大きな変動性が各位置で見出された。見られた増大された変動性にもかかわらず、ヌクレオチドの好みは選択でなお明白であった（図５．４）。位置１５１２および１５２３はそれぞれ野生型のウリジンおよびグアノシンを好んだ。位置１５１３、１５１４、１５１６および１５２２もまた野生型配列を好んだが、しかし、系統発生分析から増大された変動性を示す。最後に、位置１５１５、１５２０および１５２１は、ヌクレオチドの同一性がこれらの位置で機能に不可欠でなかったことを示す、無作為ヌクレオチド分布を示した。
ヘリックス４５中のヌクレオチド相互作用を同定するために共変動分析を実施した。位置１５１３：１５２２（ｐ＝２．３×１０−１８）、１５１４：１５２１（ｐ＝４．１×１０−２５）および１５１５：１５２０（ｐ＝２．８×１０−２０）の間の非常に強い共変動が見られ、塩基対形成を示す（図５．５）。より弱い共変動は、位置１５１２と１５２３（ｐ＝７．０×１０−４）、１５１３と１５１５（ｐ＝１．８×１０−２）、１５１５と１５２２（ｐ＝２．８×１０−２）および１５２１と１５２３（ｐ＝１．１×１０−２）の間で同定された。位置１５１７と位置１５１６（ｐ＝４．８×１０−３）、１５１８（ｐ＝７．５×１０−６）および１５２３（ｐ＝１．３×１０−３）の間、ならびに位置１５１８と位置１５２０（ｐ＝２．５×１０−３）および１５２１（ｐ＝３．１×１０−２）の間の共変動もまた同定された。
１１６個の選択された変異体のうち、野生型の３０％以上の機能をもつ５７個の変異体のサブセットを統計学的解析にかけた。より高機能の変異体のこのサブセットはいくつかの位置で変動性のわずかな低下を示したが、しかし、この低下された変動性は有意であるようではなかった。ただ高度に機能的な変異体の共変動分析は、位置１５１３；１５２２（ｐ＝８．４×１０−１０）、１５１４：１５２１（ｐ＝１．４×１０−９）および１５１５：１５２０（ｐ＝１．５×１０−８）の間の強い共変動を保持した。位置１５１７と位置１５２３の間（ｐ＝２．２×１０−５）、位置１５１７と１５１８の間（ｐ＝９．６×１０−４）および位置１５１８と位置１５２０の間（ｐ＝４．２×１０−３）の弱い共変動もまた維持された。プール全体で同定された残存する共変動（１５１３：１５１５、１５１５：１５２２、１５１６：１５１７、１５１８：１５２１および１５２１：１５２３の間）は、おそらく小さなサンプルサイズにより見られなかった。変異体のこのサブセットはステムの形成に対する要件を維持する。さらに、ヘリックス４５のループとステムの間の共変動は、該ループの位置決めにおけるステムの役割を示しうる。
まれとは言え、位置１５１８および１５１９の６個の突然変異が、選択されたプールで見出された。これら６突然変異のうち４種は機能が約３５〜９０％からの範囲にわたったＡ１５１８Ｇ突然変異であった。これらのクローンの全４種が、しかしながらＣ１５２０Ａ突然変異もまた含有した。驚くべきことに、最高の機能的クローン（９２の％機能）は２個の突然変異Ａ１５１８ＧおよびＣ１５２０Ａを含有した。残存する２種の突然変異はＡ１５１９Ｇ（野生型の７３％の機能）およびＡ１５１９Ｕ（野生型の１２％の機能）であった。Ａ１５１９変異体の双方はループの閉鎖塩基対に付加的な突然変異を有した。位置１５１８および１５１９の単一突然変異は致死的であるとは言え、ステム中の補償突然変異は機能を復帰し得るようである。
ＫｓｇＡメチラーゼ。ヘリックス４５中の突然変異に対するメチル化の影響を決定するため、同質遺伝子ｋｓｇＡ株を、ＤＨ５とＪＭ１０１ ｋｓｇＡ１９の間のＰ１形質導入を使用して構築した。このｋｓｇＡ株（ＡＡＳ３）を使用してヘリックス４５の飽和突然変異誘発を反復した。ｋｓｇＡ株の生存体の数は、１５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（ｋｓｇＡ＋株を選択するのに使用される濃度）で選択した場合にｋｓｇＡ＋株から有意に減少された。生存体の数を増大させるため、クロラムフェニコール濃度を５０μｇ／ｍｌに低下させた。クロラムフェニコールの減少は生存体の数を有意に増大させなかった。低下された生存体率の原因を理解するため、ｋｓｇＡ＋株の選択の生存体をｋｓｇＡ株に形質転換した。ＧＦＰアッセイを、ｋｓｇＡ＋およびｋｓｇＡ株双方のこれらの変異体で実施した（表５．２）。試験した１２変異体のうち９種が機能のわずかな増大を示した。従って、ｋｓｇＡ＋株で選択される変異体の大多数は、選択の間に見られる低生存率にもかかわらずＫｓｇＡメチラーゼの非存在下で機能的である。３種の残存する変異体はしかしながら機能の有意の喪失をもたらした。これら３クローンは位置１５１８および１５１９にアデノシンを含有するが、しかしステム中に他の突然変異を含有する。
各クローンのΔＧおよび二次構造をＭｆｏｌｄ（Ｍａｔｈｅｗｓら、１９９９；Ｚｕｋｅｒ、２００３）を使用して計算した。ｋｓｇＡ株で非機能的であったクローンは２．３の計算されたΔＧの平均を有した（図５．７）一方、機能的クローンの計算されたΔＧの平均は−０．８６である。低下された安定性に加え、クローン１０２の構造は、位置１５１９を、この位置のメチル基の存在下で可能であるとみられない塩基対に組込む（図５．７）。該突然変異は、Ｊｏｈｎ ＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊｒ．博士、ウェイン州立大学により開発されたソフトウェアを使用してもまたモデル化した。これらの変異体のモデル化は機能の喪失の原因でありうるヘリックスの変化をもたらした。これは、ステム中の突然変異が、メチル化の非存在下で、不安定な非機能的構造の形成を引き起こしうることを示唆する。
ｋｓｇＡ株の生存体率とｋｓｇＡ株中のｋｓｇＡ＋選択した変異体の機能の間の矛盾を解明するため、ＧＦＰ誘導曲線を実施した。ＯＤ６００＝０．１でＩＰＴＧ（１ｍＭ）での増殖培養物の誘導は、プラスミド由来のリボソームがＧＦＰ ｍＲＮＡを産生しかつ翻訳する際にＧＦＰ蛍光のＳ字状曲線を生じるはずである。曲線の開始での２株間の蛍光の差違は開始の速度の差違を示す一方、曲線の傾きは伸長速度を示す。図５．６に示されるとおり、メチラーゼの非存在下で、開始の速度の低下および伸長速度の低下が存在する。開始および伸長速度のこの低下は野生型ヘリックス４５配列をもつＡＡＳ３株でさえ見られ、増殖欠損の原因であるのはとりわけメチル化の喪失であることを意味する。ＫｓｇＡメチラーゼの非存在下のヘリックス４５中の突然変異はこの欠損を構成しうる。この欠損は選択の間に観察される低生存体率の原因でありうる。ＧＦＰアッセイのための培養物は、蛍光についてアッセイする前に２４時間増殖させ、リボソームにタンパク質合成を開始するのに十分な時間を可能にする。選択の間、とは言え、培養物はクロラムフェニコール含有培地上でプレーティングされる前に３時間のみ誘導される。誘導後３時間に、ｋｓｇＡ＋およびｋｓｇＡ株の間にタンパク質合成の２５％の差違が存在する（図５．６）。結果、３時間は、選択の間にクロラムフェニコールに対する耐性を提供するのに十分なＣＡＴタンパク質を産生するための十分な時間でないかもしれず、そして生存体が観察されないとみられる。
部位特異的突然変異。位置１５１２、１５２３、１５１８および１５１９を、それらのほぼ普遍的な保存および変動性の欠如により研究の標的とした。位置１５１８と１５１９の間、および位置１５１２と１５２３の間の単一および二重変異体を構築した。位置１５１２と１５２３の間の二重突然変異の全部が野生型の０〜８０％の機能をもたらした（図５．２）。最も有害な効果はＵ１５１２Ａ：Ｇ１５２３Ａ二重変異体で観察された（１．８％の機能）。機能の有意の低下は、Ｕ１５１２Ａ：Ｇ１５２３Ｃ（７．６％の機能）、Ｕ１５１２Ｇ：Ｇ１５２３Ａ（２３．１％の機能）およびＵ１５１２Ｕ：Ｇ１５２３Ｕ（１３．１％の機能）変異体でもまた観察された。他の二重変異体は野生型の３０から８０％までの機能の範囲にわたる機能をもたらした。最高の機能的変異体（８１％の機能）はＵ１５１２Ｃ単一変異体であった一方、第二の最高の機能的変異体はＵ１５１２Ｇ：Ｇ１５２３Ｃ（６２％の機能）であった。従って、ワトソン−クリック塩基対を形成する能力は重要であるが、しかし機能の唯一の決定子でない。ピリミジンに対するわずかな好みが位置１５１２で示された一方、位置１５２３は好みを示さなかった。位置１５２３のいかなる単一突然変異も、しかしながらおよそ４５％だけ機能を低下させた。位置１５１８および１５１９の全部の単一および二重突然変異はしかしながら致死的であった（図５．３）。
ヘリックス４５は７個の保存されたヌクレオチドおよび３個の修飾ヌクレオチドを含有する。ヘリックス４５は、開始因子３（ＩＦ３）、ｔＲＮＡ結合および選択性に影響を及ぼすことが示されたヘリックス２４の７９０ループに架橋し、かつ、２３Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス６９の１９１５ループに架橋して、サブユニット間架橋Ｂ２ｂを形成する。突然変異を作成して、このヘリックス中で構造上および機能上重要なヌクレオチドを同定した。
位置１５１４：１５２１および位置１５１５：１５２０は、系統発生分析により示唆されるとおり塩基対形成に関与する。ヌクレオチド同一性は保存されないが、しかし塩基対形成する能力は維持されかつ機能に重要である。位置１５１３および１５２２はまた塩基対形成するようであるが、しかしヌクレオチド同一性は保存されている。１５１３：１５２２の役割は不明であるとは言え、この塩基対はＫｓｇＡメチラーゼ認識部位の一部でありうるか、若しくはＵ１５１２：Ｇ１５２３ゆらぎ塩基対を安定化させるのを助けうる。共変動分析は、これらの塩基対がループの正しい位置決めを見込みうることを示す。
位置１５１２および１５２３のヌクレオチド同一性は、系統発生分析ならびにわれわれの突然変異誘発分析で保存されている。Ｕ１５１２：Ｇ１５２３ゆらぎ対での突然変異は、位置１５１２でのピリミジンに対する好みおよび位置１５２３でのグアノシンに対する好みを示す。ピリミジン−ピリミジン若しくはピリミジン−プリン対形成は一般にプリン−プリン対形成より機能的であり、この型の相互作用が機能を妨害するコンホメーション変化をもたらすことを示唆した。二重変異体で見られるヌクレオチドの好みはヘリックス４５の突然変異誘発でもまた見られた。位置１５２３と位置１５１７および１５２１の間の共変動は、Ｕ：Ｇゆらぎ対およびヘリックス４５との何らかの相互作用を示す。Ｕ１５１２：Ｇ１５２３ゆらぎ対の保存はＵ：Ｇゆらぎ対の独特の特性によりうる。Ｕ：Ｇゆらぎ対はいくつかの独特の特徴、すなわち１）独特の官能基が主および副溝中に露出される２）熱力学的安定性がワトソン−クリック塩基対のものに近づく、ならびに３）Ｕ：Ｇゆらぎ対を含有するヘリックスがワトソン−クリック塩基対より柔軟性でありかつ誘導適合による認識を見込みうる（ＡｌｌａｉｎとＶａｒａｎｉ、１９９５；ＶａｒａｎｉとＭｃＣｌａｉｎ、２０００）を見込む。野生型配列と変異体の間のΔＧの変化の分析は、自由エネルギーと機能の間のいかなる相関も示さず、構造が安定性より重要であることを意味する（データは示されない）。二重変異体のうち、Ｃ１５１２：Ｇ１５２３変異体は最高の機能を保持した。この変異体はヘリックスの構造を維持するがしかしその柔軟性を減少させる。従って、Ｕ：Ｇゆらぎ対は、このヘリックスの至適の機能に必要とされる必要な構造および柔軟性を提供しうる。
位置１５１７、１５１８および１５１９の保存はおそらく、これら２ヘリックスを一緒に結合するヘリックス４４中の位置とのそれらの相互作用による。これら３個の積み重なった塩基は、ヘリックス４４の位置１４０４−１４０６および１４９６−１４９７により形成される副溝と相互作用する（図５．８）。アデノシンは該塩基の糖側の官能基を伴わない唯一の塩基であり、アデノシンのいずれかの他の塩基での置換は、官能基をヘリックス４４の主溝に置き、一方若しくは双方のヘリックスのコンホメーション変化または結合の破壊のいずれかを引き起こすとみられる。従って、位置１５１８および１５１９の単一および二重変異体で見られるとおり、これらの位置での突然変異は致死的である。これらの結果は酵母でのこれらの位置での突然変異と矛盾しないが、しかし、位置１５１９の突然変異が細胞増殖に対し小さな影響のみ有したことを見出したＶｉｌａ−Ｓａｎｊｕｒｊｏら（１９９９）の結果と対照的である。Ａ１５１８Ｇ突然変異はしかしながら選択されたプールで同定された。全部のＡ１５１８Ｇ突然変異はＣ１５２０Ａ突然変異もまた含有し、Ｇ１５１８、Ａ１５１９およびＡ１５２０配列をもたらした。代替のループ構造の形成はこれら２個のアデノシンが野生型配列に類似の様式でヘリックス４４と相互作用することを可能にしうる。突然変異Ａ１５１９ＧおよびＡ１５１９Ｕもまた選択されたプールで同定された。これらのクローンはループの閉鎖塩基対（１５１５：１５２０）に付加的な突然変異を含有し、Ｕ１５１９クローンにＣ：Ｕ不適正（１２％）およびＧ１５１９クローンにＧ：Ａ不適正（７３％）をもたらした。ループの閉鎖塩基対の不適正はループの制約を減少させかつループのより大きな柔軟性を可能にするとみられ、おそらく部分的機能を可能にする。これは、位置１５１８および１５１９の突然変異がヘリックス４５中の補償突然変異の存在下で耐えられうることを示唆する。
位置１５１８および１５１９のメチル化の保存は、四塩基ループの形成に対するそれらの安定化効果によることができる。これらのメチル基の喪失は該ループの低下された安定性および非機能的構造の形成をもたらしうる。事実、Ｍｆｏｌｄ（Ｍａｔｈｅｗｓら、１９９９；Ｚｕｋｅｒ、２００３）でモデル化された場合の変異体１０２は、大部分の安定な二次構造が位置１５１４と１５１９の間の塩基対を伴い（図５．７）、ループの形成を阻害することを示した。位置１５１９でのメチル化の存在下ではこの塩基対は可能にされないとみられ、おそらく四塩基ループの形成を可能にする。
位置ｍ２Ｇ１５１６はヘリックス４５のＧＮＲＡ四塩基ループ中で見出される修飾ヌクレオチドの１種である。位置１５１８および１５１９の保存されたジメチルアデノシンと異なり、ｍ２Ｇ１５１６は系統発生分析で保存されないとは言え、この位置でのグアノシンに対する好みが、選択された変異体プールで観察された。熱力学的研究は、位置１５１８および１５１９でのジメチルアデノシンの非存在下で、ｍ２ＧがＧＮＲＡ四塩基ループ内でＧに等エネルギーでありかつ安定性に対する影響を有しなかったことを示した（Ｒｉｆｅら、１９９８）。位置１５１７、１５１８および１５１９のヌクレオチド同一性は、位置１５１８および１５１９の修飾がそうであるように保存されている。３０Ｓサブユニットの結晶構造（Ｏｇｌｅら、２００１；Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）は、これら３位置を積み重ねられかつヘリックス４４ならびに５０Ｓサブユニットのヘリックス６９および７１と相互作用してサブユニット間架橋Ｂ２ｂを形成するとして示す。修飾ヌクレオチドを包含するループのモデル化研究は、ジメチル基が位置１５１７、１５１８および１５１９のスタッキングの安定化において補助しうることを示唆する。位置１５１６の修飾は、ループに安定性を提供しならびにループの副溝側の疎水性領域に付加する、位置１５１９との疎水性相互作用を見込む。
５個のメチル基により引き起こされるジメチルループの副溝側の疎水性領域は、７９０ループの位置７９３により覆われている（図５．９）。この疎水性相互作用は、ヘリックス４４および４５との付加的な相互作用のため７９０の位置を決めるのに役立ちうる。位置７９３とジメチルアデノシンループの間の疎水性相互作用が７９０ループの位置決めに重要でありうるとは言え、７９０ループとヘリックス４４および４５の間の他の相互作用が、おそらく、この相互作用の非存在下でなお起こるとみられる。これら２領域を一緒に配置するこれらの付加的な相互作用は、これらの部位のメチル化が機能に不可欠でない理由を説明しうる。位置１５１８および１５１９のジメチル化の原因であるＫｓｇＡメチラーゼの除去は開始および伸長のわずかな欠損をもたらす。観察された増殖欠損は、ＫｓｇＡの非存在下での開始の欠損（Ｐｏｌｄｅｒｍａｎｓら、１９７９）および翻訳忠実度の増大（ｖａｎ Ｂｕｕｌら、１９８４ｂ）を同定した以前の研究と一致する。メチル化の喪失は、ＩＦ３結合の変化および結果として開始の変化をもたらす、７９０ループ−ヘリックス４５−ヘリックス４４複合体の安定性若しくはコンホメーションを変えうる。ＩＦ３の結合は、おそらく伸長の間に元の構造に再形成することが必要とされるとみられるヘリックス４５および７９０ループの構造をＩＦ３の結合が変えることを示す、７９３：１５１７架橋を阻害することが示されている。メチル化の喪失は、開始後のこの領域の再構築に影響を及ぼしかつ従って伸長過程に影響を及ぼしうる。
３０Ｓ結晶構造中で、ヘリックス４５は７９０ループとヘリックス４４の間にきつく充填されている。７９０ループはＰ部位およびＥ部位でのｔＲＮＡ結合、ならびに６９０ループと相互作用することに関与する。６９０および７９０ループは、Ａ部位にアロステリックに結合されることが示されている３０Ｓサブユニット中のＥ部位のｔＲＮＡ結合に重要である。ヘリックス４５は、７９０ループとヘリックス４４の間の相互作用を形成しかつ安定化するのを助ける。これら２領域の結合は、ＡおよびＥ部位の状態ならびに系統発生論を通じてのヘリックス４５の保存を説明する該サブユニットの協調された動きについての情報交換に重要でありうる。
試薬。制限酵素、リガーゼおよび仔ウシ腸アルカリホスファターゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓおよびＧｉｂｃｏ−ＢＲＬからであった。配列決定修飾ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチドおよび配列決定緩衝液はＥｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからであった。オリゴヌクレオチドはＭｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（テキサス州ミッドランド）若しくはＩＤＴ ＤＮＡ（アイオワ州コーラルビル）いずれかから購入した。ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲ試薬はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ（マサチューセッツ州ボストン）からであった。
プラスミドおよび突然変異誘発。全部の突然変異誘発はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｈｉｇｕｃｈｉら、１９８８；Ｍｕｌｌｉｓら、１９８６；ＭｕｌｌｉｓとＦａｌｏｏｎａ、１９８７）を使用して実施した。
１６Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス４５突然変異の構築。全突然変異はｐＲＮＡ１２３中で構築した。ヘリックス４５は、プライマーＤＭＡ ｍｕｔ１２（５’−ＡＣＴ ＧＧＧ ＧＴＧ ＡＡＧ ＴＣＧ ＴＡＡ ＣＡＡ ＧＧＴ ＡＡＣ ＣＧＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＣ ＧＧＴ ＴＧＧ ＡＴＣ ＡＴＧ ＧＧＡ ＴＴＡ−３’）および１６Ｓ ＸｂａＩ（５’−ＧＧＴ ＣＧＧ ＣＧＡ ＣＴＴ ＴＣＡ ＣＴＣ ＡＣ−３’）を用いる部位特異的ＰＣＲを使用して無作為に変異させた。無作為突然変異は、ＸｂａＩおよびＢｓｔＥＩＩ切断部位の間の野生型配列を、ＰＣＲに指図される無作為突然変異を含有するフラグメントで置換することにより、ｐＲＮＡ１２３の１６Ｓ ｒＲＮＡ中に導入した。
機能的変異体の選択。形質転換体は、ＡｍｐＲマーカーの発現を見込むため、ＳＯＣ培地中３７℃で振とうしながら１時間インキュベートした。培養物のサンプルをＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）プレート上にプレーティングして形質転換効率を決定した。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）をその後、残存する培養物に１ｍＭの最終濃度まで添加しかつ３７℃で振とうしながら追加の３時間インキュベートしてｒＲＮＡ合成を誘導した。培養物をその後、１５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）＋ＩＰＴＧ（１ｍＭ）寒天上でプレーティングした。生存体を無作為に選択しかつ統計学的に有意の数で配列決定した。
１６Ｓ ｒＲＮＡでの二重変異体の構築：単一および二重変異体はｐＲＮＡ１２３（Ｌｅｅら、１９９６；Ｌｅｅら、１９９７）中で構築した。位置１５１２と１５２３の間、および位置１５１８と１５１９の間の全部の可能な突然変異を、双方のＰＣＲ反応について、１６Ｓ ＤＭＡ Ｎ１５１２／Ｎ１５２３（５’−ＡＣＴ ＧＧＧ ＧＴＧ ＡＡＧ
ＴＣＧ ＴＡＡ ＣＡＡ ＧＧＴ ＡＡＣ ＣＧＮ ＡＧＧ ＧＧＡ ＡＣＣ ＴＮＣ
ＧＧＴ ＴＧＧ ＡＴＣ ＡＴＧ ＧＧＡ ＴＴＡ−３’）および１６Ｓ ＤＭＡ Ｎ１５１８／Ｎ１５１９（５’−ＡＣＴ ＧＧＧ ＧＴＧ ＡＡＧ ＴＣＧ ＴＡＡ ＣＡＡ ＧＧＴ ＡＡＣ ＣＧＴ ＡＧＧ ＧＧＮ ＮＣＣ ＴＧＣ ＧＧＴ ＴＧＧ ＡＴＣ ＡＴＧ ＧＧＡ ＴＴＡ−３’）をフォワードプライマーとして、ならびに１６Ｓ ＸｂａＩをリバースプライマーとして使用する部位特異的ＰＣＲを仕様して作成した。生成物を、ＢｓｔＥＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素を使用してｐＲＮＡ１２３にクローン化した。各変異体を配列決定して突然変異の存在を確認し、また、ＧＦＰアッセイを使用して機能についてアッセイした。
細菌株および培地。全プラスミドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５（ｓｕｐＥ４４、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１）（Ｈａｎａｈａｎ、１９８３）若しくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＡＳ３（ｓｕｐＥ４４、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１、ｋｓｇＡ）中で維持しかつ発現させた。
ＤＨ５ ｋｓｇＡ株の構築。ＭＣ８６ ｔｈｒ：：ｔｎ１０で増殖させたＰ１ライセートを、標準的方法を使用してｋｓｇＡ株ＪＭ１０１ ｋｓｇＡ１９に形質導入した。生じるＪＭ１０１ ｋｓｇＡ１９ ｔｈｒ：：ｔｎ１０株で増殖させたＰ１ライセートをその後使用してプラスミドｐＭＡＳ５３を含有するＤＨ５株（ｒｅｃＡ＋）に形質導入し、そ
して１×培地Ｅ（Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ）、０．４％グルコース、０．１％ＣＡＡ、０．２×ＬＢ、５μｇ／ｍｌチアミン、４０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび５０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有する寒天上でプレーティングした。新たな株（ＡＡＳ３）でのｋｓｇＡ遺伝子の破壊をＰＣＲにより確認した。ｋｓｇＡメチラーゼが不活性化されたことを確認するために、該株をカスガマイシン上で増殖させて耐性のレベルを測定した。該株からの１６Ｓ ｒＲＮＡはまた、ヌクレオシドに消化しかつＨＰＬＣにより分析してジメチルアデノシンの欠如を確認した。
培養物は１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培地（ＬｕｒｉａとＢｕｒｒｏｕｓ、１９５７）（ＬＢ−Ａｐ１００）中で維持した。ｌａｃＵＶ５プロモーターからプラスミド由来ｒＲＮＡの合成を誘導するため；ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を、各実験で示された時点で１ｍＭの最終濃度まで添加した。株は、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｃｅｌｌ Ｐｏｒａｔｏｒを使用して電気穿孔法（Ｄｏｗｅｒら、１９８８）により形質転換した。別の方法で示されない限り、形質転換体は、選択培地上にプレーティングする前にＳＯＣ培地（Ｈａｎａｈａｎ、１９８３）中で１時間増殖させて、プラスミド由来の遺伝子の発現を可能にした。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）アッセイ。変異体ならびに野生型対照の一夜培養物をＬＢ−Ａｍｐ１００中３７℃で振とうしながら１２〜１６時間増殖させた。一夜細胞培養物をその後１００倍希釈し、ＬＢ−Ａｍｐ １００＋ＩＰＴＧ（１ｍＭ）培地中で誘導し、そして振とうしながら３７℃で２４時間増殖させた。２４時間後に５００μＬの培養物を１．７ｍＬ微小遠心管に分注しかつおよそ１１，０００×ｇで１分間遠心分離して細胞をペレットにした。細胞ペレットを５００μＬのＨＮ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４および０．８５％ＮａＣｌ）で２回洗浄しかつ５００μＬのＨＮ緩衝液に再懸濁した。細胞を再懸濁した後に１００μＬの細胞懸濁液を９６ウェルの透明底マイクロタイタープレートに移した。細胞密度（λ＝６００ｎｍ）を、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ １９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）を使用して測定し、また、蛍光（励起＝３９５ｎｍおよび測定＝５０９ｎｍ）をＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＧＥＭＩＮＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）を使用して測定した。各培養物について、蛍光をＡ６００により除算し、そして野生型のパーセントとして提示した。値は、異なる日に行った３個の別個の培養物での最低３回のアッセイの平均を表す。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１６Ｓ ｒＲＮＡ中の機能上重要なヌクレオチドの同定
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）１６ＳリボソームＲＮＡの全部の機能上重要なヌクレオチドを同定するため、誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲを使用して突然変異ライブラリーを創製し、そして至適以下の機能について選択した。クローンあたり平均４個の突然変異をもつおよそ２６００クローンを分析し、それは１６Ｓ リボソームＲＮＡの各変異された位置（位置２０〜１５０３）で平均７個の突然変異をもたらした。ヌクレオチド同一性が機能に重要である位置はゼロ若しくは数個の突然変異をもつ部位をもたらす。既知の機能上重要なヌクレオチドとの比較を使用して、これらの部位を同定するライブラリーの能力を試験した。突然変異ライブラリーは、既知のならびに以前に未知の機能的ヌクレオチドを同定した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３０Ｓサブユニットのモデルを使用して、保存された位置間の相互作用を同定した。
リボソームはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のタンパク質への翻訳を司る。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の７０Ｓ細菌リボソームは、２種の非対称サブユニット、すなわち１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）および２１リボソームタンパク質（ｒタンパク質）より構成される小（３０Ｓ）サブユニット、ならびに２３Ｓ ｒＲＮＡ
、５Ｓ ｒＲＮＡおよび３４ ｒタンパク質より構成される大サブユニット（５０Ｓ）に解離され得る。小サブユニットは解読およびｔＲＮＡ−ｍＲＮＡ相互作用の正確さの維持を司る一方、大サブユニットはペプチジルトランスフェラーゼ中心（ペプチド結合形成部位）を含有する。生化学的研究（ＧｒｅｅｎとＮｏｌｌｅｒ、１９９７；Ｎｏｌｌｅｒら、１９９２）およびリボソーム結晶構造（Ｎｉｓｓｅｎら、２０００；Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）は、ＲＮＡがリボソームの触媒的活性成分であることを示しており；従って、該リボソームはリボザイムである。
多数の異なる生物体からのｒＲＮＡ配列の比較配列分析は、ｒＲＮＡの全体的二次構造が生命の全超界内で保存されていることを示した。加えて、これらのｒＲＮＡ配列の分析は、リボソーム機能に重要であると考えられる保存されたヌクレオチドを同定した。この分析はしかしながらゲノム若しくはオルガネラのｒＲＮＡ配列を使用する。これらの配列はタンパク質合成におけるそれらの不可欠の役割により制約される。結果として、機能的に重要であると考えられるｒＲＮＡ領域に非常にわずかの配列変動が観察されるか若しくは観察されない。決定的に重要な残基を取り囲む構造に対するわずかな変化でさえ機能を低下させ、忠実度に影響を及ぼしかつ適合度を低下させうるからである。加えて、これらの保存された部位は機能上重要よりむしろ構造上重要であることができ、機能上重要な基を正しい方向に配置するようはたらく。これらの部位の突然変異は致死的でないかもしれないが、しかし部分的機能をもつリボソームをもたらしうる。これは適合度の喪失をもたらしかつ従って系統発生分析で同定されないとみられる。至適以下の機能をもつｒＲＮＡ配列の分析はより大きな変動性を見込むとみられ、かつ、機能に真に不可欠である位置の同定を見込むとみられる。
この問題を取り扱うため、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からの１６Ｓ
ｒＲＮＡを誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲを使用して無作為に変異させ、そして至適以下の機能をもつ変異体について選択した。サンプルあたり平均４．１個の突然変異をもつ合計２５９３個の機能的変異体を使用して突然変異ライブラリーを創製した。これは１６Ｓ ｒＲＮＡの各変異された位置で平均７個の突然変異に変わった。２の最頻値および６の中央値をもつ位置あたり０から３７個までの範囲の突然変異が該ライブラリーで観察された。この突然変異ライブラリーから、結晶構造中で一緒になって１６個の機能上重要なクラスターを形成する１６Ｓ ｒＲＮＡの６７個の保存された領域を同定した。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１６Ｓ ｒＲＮＡをマンガン（０．４５ｍＭ）の存在下でＰＣＲ増幅して生成物全体に突然変異を無作為に導入し、そしてｐＲＮＡ２２８ベクターにクローン化した。ｐＲＮＡ２２８は、誘導可能なｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのｒｒｎＢオペロンを含有するｐＲＮＡ１２３の誘導体である（Ｌｅｅら、１９９６；Ｌｅｅら、１９９７；Ｍｏｒｏｓｙｕｋら、２００１）。１６Ｓ ｒＲＮＡの抗Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏが、正常宿主ｍＲＮＡを認識せずそして従って翻訳しない配列に変えられている（Ｈｕｉとｄｅ Ｂｏｅｒ、１９８７；Ｈｕｉら、１９８７；ＳｈｉｎｅとＤａｌｇａｒｎｏ、１９７４）。ｐＲＮＡ２２８プラスミドは２個のレポーター遺伝子すなわちクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もまた含有し、それらの双方は１６Ｓ ｒＲＮＡの変えられた抗Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列に相補的な変えられたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含有する。プラスミド由来３０Ｓサブユニットは正常な宿主ｍＲＮＡを翻訳せず、そして宿主リボソームはレポーター遺伝子のｍＲＮＡを翻訳しない。ＣＡＴ遺伝子は部分的機能をもつ配列の選択を見込む一方、ＧＦＰ遺伝子は変異体機能のハイスループットアッセイを見込む。
クローンを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５（ｓｕｐＥ４４、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１
、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１）（Ｈａｎａｈａｎ、１９８３）に形質転換し、そして２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する培地上でプレーティングして機能的変異体を選択した。生存体を２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する培地にスポットしかつ配列決定した。
合計２５９３クローンの配列を突然変異ライブラリーに組込んだ。これらのクローンは１６Ｓ ｒＲＮＡ内に合計１０，７３６の突然変異を含有し（位置２０−１５０３）、それらは各変異された位置で平均７．２個の突然変異である。各位置の突然変異の数は２の最頻値および６の中央値を伴い０から３７までの範囲にわたった。各位置が３個若しくはそれ未満の突然変異を含有した一連の３若しくはそれ以上連続するヌクレオチドが統計学的に有意である。各位置が０若しくは１個の突然変異を含有する２若しくはそれ以上連続するヌクレオチドもまた統計学的に有意であることが見出された。これらの基準を使用して、４０種の異なるヌクレオチドのグループ分けを同定しかつ領域と称する。これらの基準を、４個若しくはそれ以上の突然変異をもつ単一位置により相互から分離される３個若しくはそれ未満の突然変異をもつ３個若しくはそれ以上の位置もまた包含するように拡大した。これらの配列もまた領域として同定した。合計６７個の保存された領域がライブラリー中で同定された（表６．１）。３個若しくはそれ未満の突然変異をもつ全位置を、図６．１で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１６Ｓ ｒＲＮＡの二次構造上に示す。この研究で同定された保存された領域を、１６Ｓ ｒＲＮＡの系統発生分析により同定された保存された領域と比較した。細菌の保存と比較して、保存されたヌクレオチドの有意の減少が突然変異ライブラリーで観察された（図６．１）。この研究で同定された保存されたヌクレオチドは、しかしながら全３超界およびオルガネラ（３Ｄ２Ｏ）の系統発生分析により同定された保存されたヌクレオチドに対するより大きな類似性を示す（図６．１）（Ｃａｎｎｏｎｅら、２００２）。突然変異ライブラリーと系統発生的保存の間の差違もまた見られた。とりわけ、ヘリックス（Ｈ）Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１２、Ｈ１３およびＨ２１は突然変異ライブラリーで保存された領域を含有したが、しかしこれらのヘリックスは３Ｄ２Ｏ系統発生的保存で保存されない。これらの差違は、リボソーム機能に対する特定の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の要件によるかも知れない。１領域になかった付加的な保存されたヌクレオチドもまたライブラリーでみられた。これらの保存された位置のいくつかは同定された領域と相互作用し、それらの保存を説明する。ライブラリーで同定される、残存する保存された位置が、機能的に重要であるか若しくは無作為の機会の産物であるかどうかは不明である。
高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）３０Ｓサブユニットの結晶構造に基づく大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３０Ｓサブユニットモデルが公表された（Ｔｕｎｇら、２００２）。このモデルのエネルギー最小化されたバージョン（Ｊｏｈｎ ＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊｒ．博士、私信）を使用して、三次元空間での保存された位置の配置を決定した（図６．２）。このモデルを使用して領域間の相互作用を同定した（図６．３）。三次元構造で一緒になって機能上重要な単位を形成する領域をクラスターと命名した。合計１６のクラスター（全クラスターの図は付録に示す）が同定された（表６．２）。
クラスター。リボソームのモジュールの性質により、単離されたクラスターは特定のドメインに位置推定されたとは言え、異なるドメインでの相互作用を伴う２クラスターが同定された。５’ドメイン（位置１−５６０）は４クラスターを含有し、中央ドメイン（位置５６１−９２２）は５クラスターを含有する一方、３’ドメイン（位置９２３−１５４２）は７クラスターを含有する。
５’ドメイン。クラスター１は、５’ドメインの領域１、２、２０、２１、２２および２３、ならびに中央ドメイン中に位置する領域３１を包含する（図６．１および６．３）。領域１、２、２１、２２および２３は、Ｈ４、Ｈ５およびＨ１５を結合する結合部３を形成する（結合部の番号付けについては図６．１を参照されたい）。領域２０、および領域２１の一部はＨ１４のステムを形成する一方、領域３１はＨ２１のステムおよびループを形成する。界面から見れば、このクラスターはリボソーム本体の左側を形成しかつリボソームタンパク質Ｓ４およびＳ１６と相互作用する（付録）。Ｓ１６は、５’ドメインの領域ならびに中央ドメインの領域３１と有意の接触をなしてこれら２ドメインを一緒にする。クラスター１とＳ４の間にわずかな接触のみが存在し（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）、クラスター１がＳ４の結合の主決定子でないことを意味している。タンパク質Ｓ４およびＳ１６の結合は別にして、クラスター１は、サブユニット間架橋Ｂ８の一部と同定されたＨ１４もまた含有する。サブユニット間架橋Ｂ８は位置３４５−３４７と大型サブユニットタンパク質Ｌ１４６の間のＲＮＡ−タンパク質架橋である（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）。Ｈ１４ループ中の保存の欠如は、架橋Ｂ８がバックボーン相互作用を伴うことを示唆する。ステムの保存は、しかしながら、ループの位置決めがサブユニット間架橋の形成に重要であることを示す。
結合部は三次元構造中でのヘリックスの位置決めを可能にするＲＮＡの構造的特徴である。５’ドメインの領域７、８、１４、１６および１８は、Ｈ７、Ｈ１１およびＨ１２を結合する結合部５を形成する。この結合部は、中央ドメインからの領域３０および３２と一緒になってクラスター２を形成する（図６．１および６．３）。クラスター２は本体の中央のｒタンパク質Ｓ１６およびＳ１７と相互作用する（付録）。Ｓ１７は５’ドメインおよび中央ドメインを一緒にすることに関与する一次結合タンパク質である（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）。Ｓ１６は、Ｓ１７の役割に類似の役割をもつ二次結合タンパク質であり、５’および中央ドメインを一緒にする。クラスター２の保存はＳ１６およびＳ１７の結合部位の形成に対する要件によるかもしれない。加えて、この結合部の保存は、Ｈ７、Ｈ１１およびＨ１２の機能上重要な位置決めを維持しうる。２個の緊密に間隔を空けられた結合部を分離するヘリックスがとりわけ保存されているようであることに注目することは興味深い（結合部３と４の間のＨ５、結合部１と７の間のＨ１９、結合部１１と１２の間のＨ２９などを参照されたい）。
領域３、５、６、９、１０、１１、１２および１９（図６．１）より構成されるクラスター３（図６．３）は、３０Ｓサブユニットの底部に位置する一次結合タンパク質、Ｓ２０の結合に関与する。クラスター３中の保存されたヌクレオチドの大多数は、タンパク質との直接相互作用よりむしろＳ２０結合部位の形成に関与する（付録）。クラスター３に加え、Ｈ４４の底部もまたＳ２０と相互作用する（ＣｕｌｖｅｒとＮｏｌｌｅｒ、１９９８；Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００）。Ｓ２０の主要な役割はＨ４４の底部の固定である。Ｈ４４の底部は、しかしながら１領域として同定されずかつクラスター３に包含されなかった。致死的でないとは言え、Ｓ２０の喪失はサブユニット集成（Ｄａｂｂｓ、１９７９；Ｒｙｄｅｎ−Ａｕｌｉｎら、１９９３）、翻訳忠実度（Ｇｏｔｚら、１９９０）およびサブユニット会合（Ｇｏｔｚら、１９８９）の欠損をもたらす。Ｈ４４の上部は解読領域として知られ、そして翻訳の部位である一方、Ｈ４４の長さは、翻訳の間に３０Ｓおよび５０Ｓサブユニットを一緒に保持する原因である複数のサブユニット間架橋の形成に関与する。トランスロケーションの間にＨ４４の上部はおよそ１２Å動くことが示されている（ＶａｎＬｏｏｃｋら、２０００）。Ｈ４４の底部は、しかしながらおそらくＳ２０による固定により動かない（ＶａｎＬｏｏｃｋら、２０００）。Ｓ２０の非存在下で、Ｈ４４の底部は自由に動くことができ、それは翻訳忠実度およびサブユニット会合の観察された欠損の原因でありうる。最後に、Ｓ２０は、３０Ｓサブユニットの底部に位置する唯一のタンパク質として、この領域のフォールディングの核となる原因である。
５’ドメインの最後のクラスター、クラスター４（図６．３）は、Ｈ１８および５３０ループを形成する領域２５、２６、２７および２８から構成される（図６．１）。５３０ループは３０Ｓサブユニットの肩部に位置し、そして翻訳の正確さ（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら
、１９９７；Ｓａｎｔｅｒら、１９９３；Ｓａｎｔｅｒら、１９９５）、開始因子１（ＩＦ１）の結合（Ｃａｒｔｅｒら、２００１；ＤａｈｌｑｕｉｓｔとＰｕｇｌｉｓｉ、２０００）およびｒタンパク質Ｓ１２（Ｏｇｌｅら、２００１；Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、２０００）の維持に関与する。その複数の役割に一致して、５３０ループは系統発生分析および突然変異ライブラリー双方で保存されている。５３０ループはただ機能上保存されているだけでなく、しかしまた構造的にも保存されている。とりわけ、位置５３０は位置１４９２（クラスター１６を参照されたい）と一緒に、コドン−アンチコドン相互作用の第二の位置を監視する（Ｏｇｌｅら、２００１）（図１．１３）。Ｇ５３０を解読領域に配置するため、Ｈ１８は偽結び目構造を形成する（付録）。領域２５、２６および２８の間の塩基対形成はＨ１８のステムを形成し、位置５０５−５１０のバルジを引き起こす。ループ中で、５２１：５２８および５２２：５２７の塩基対形成は、フォールディングして位置５０５−５０７と塩基対形成して偽結び目構造を形成する四塩基ループ（位置５２３−５２６）をもたらす（第３章を参照されたい）。加えて、ループ中の他の保存されたヌクレオチドはその機能的役割のためＧ５３０を配置しかつ安定化することにおいて補助する。
中央ドメイン。領域３３、３４および３７を含有するＨ２２（図６．１）はクラスター５を形成する（図６．３）。結合部８はＨ２０、Ｈ２１およびＨ２２を結合して、一次結合タンパク質Ｓ１５のための結合部位を形成する（付録）。Ｓ１５の結合は中央ドメインのフォールディングおよび構造化を開始する。領域３３ならびに保存された位置７４８、７５０および７５４は塩基対形成しかつ結合部に隣接するＨ２２の底部を形成する。これらの位置の保存はおそらくＳ１５結合部位の形成におけるそれらの役割による。Ｈ２２の上部で、保存された位置７３２が領域３４の位置６６７と相互作用してＨ２３ａをＨ２２に対し充填する。この充填相互作用は、Ｈ２２およびＨ２３が共軸方向に積み重なることを可能にし、中央ドメインのフォールディングを継続する（Ａｇａｌａｒｏｖら、２０００）。Ｈ２２の上部の領域３４および３７はＳ６／Ｓ１８二量体の結合部位を形成するのを助ける。
クラスター６および７（図６．３）は、Ｈ２３とＨ２４（図６．１）の間、ならびに機能上重要な６９０および７９０ループの間の相互作用により形成される。クラスター６は領域３９および４０より構成される一方、クラスター７は領域３６、３８および４１より構成される。クラスター７の保存は、最もありそうにはＨ２３とＨ２４の間の相互作用による。これらのヘリックスの間の相互作用（付録）は６９０および７９０ループを安定化しうる。Ｓ６は領域３６といくつかの相互作用を有するとは言え、それはＨ２３とＨ２４の間の相互作用の安定化において主要な役割を有しない（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）。Ｓ１１は、しかしながら、Ｈ２３により形成されるＫ−ターンモチーフに特異的に結合しかつこの急峻なターンを安定化する（Ｋｌｅｉｎら、２００１）。Ｓ１１のＣ末端ドメインは伸長され、そしてクラスター７のＨ２３およびＨ２４双方と相互作用してこの相互作用を安定化する（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）。
６９０ループはＥ部位のｔＲＮＡ結合に関与する（Ｄｏｒｉｎｇら、１９９４；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）一方、７９０ループはＰ部位およびＥ部位双方のｔＲＮＡ結合に関与する（ＭｏａｚｅｄとＮｏｌｌｅｒ、１９８６；Ｍｏｒｏｓｙｕｋら、２００１；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）。７９０ループは３超界および２種のオルガネラ（３Ｄ２Ｏ）の系統発生分析ならびにこのライブラリーの双方で保存された。６９０ループは、しかしながら３Ｄ２Ｏの系統発生分析でのみ保存された。位置Ｕ６９７のみが突然変異ライブラリーで保存された。われわれの研究室での６９０ループの以前の飽和突然変異誘発研究は、ヌクレオチド同一性が位置６９０、６９１、６９２、６９６および６９７で重要であったことを示した（Ｍｏｒｏｓｙｕｋら、２００１）。６９０ループは、３個若しくはそれ未満の突然変異をもつ位置のみを考慮する場合に突然変異ライブラリー中で保存されないとは言え、該ライブラリーで見出される突然変異の型の分析は若干のヌクレオチド要件を同定した。位置Ｇ６９１（６突然変異）、Ａ６９４（２７突然変異）およびＡ６９５（１７突然変異）は全部の可能なヌクレオチド置換を有したが；しかしながら、位置Ｇ６９０（１２突然変異）およびＧ６９３（７突然変異）はＣを除外した一方、位置Ｕ６９２（１８突然変異）はＧを除外した。最後に、位置Ａ６９６（７突然変異）はプリンのみを含有した。これらの研究の間の差違は、Ｍｏｒｏｓｙｕｋら（２００１）の研究が、残存する１６Ｓ ｒＲＮＡを一定に保ちつつ６９０ループでのみ行われ、補償突然変異の可能性を排除したという事実によりうる。加えて、これらの変異体は突然変異ライブラリー中でより高い機能について選択された（より高いクロラムフェニコール濃度で選択された）。
バックボーン相互作用によりおそらく媒介されるＥ部位のｔＲＮＡの結合における６９０ループの役割（Ｄｏｒｉｎｇら、１９９４；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）は、特異的ヌクレオチド相互作用よりむしろ機能的構造の形成を必要とする。６９０ループ中で同定された２個の保存されたヌクレオチド（位置６９７および６９８）は７９０ループとの相互作用に関与し、７９０ループとの相互作用がそれらの保存の理由であることを意味する。ＰおよびＥ部位のｔＲＮＡの結合でのその役割（Ｄｏｒｉｎｇら、１９９４；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）に加え、７９０ループはリボソームを出るｍＲＮＡもまた安定化し（Ｙｕｓｕｐｏｖａら、２００１）、２３Ｓ ｒＲＮＡのＨ６９とサブユニット間架橋Ｂ２ｂを形成し（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１；Ｌｅｅら、１９９７）、ならびに抗生物質パクタマイシンおよびエデインを結合する（Ｄｉｎｏｓら、２００４）。７９０ループの機能は突然変異ライブラリーでのその保存を説明する。
領域２９、４２および４５より構成されるクラスター８（図６．３）は３０Ｓサブユニットの中央に位置する。領域２９および４２はＨ１９を形成し、これは２個の主要な結合部（Ｈ１９、Ｈ２０、Ｈ２４およびＨ２５を結合する結合部７、ならびにＨ２、Ｈ３、Ｈ１９およびＨ２７を結合する結合部１）を結合する（図６．１）。結合部７は中央ドメイン中の主ヘリックスを正しい方向に置く一方、結合部１は５’ドメイン全体を正しい方向に置く。結合部は保存されないとは言え、Ｈ１９の形成は２個の別個の結合部を維持するのに重要でありうる。Ｈ１９の構造は、Ｈ１９およびＨ２７の基部と接触をなす、ｒタンパク質Ｓ１２のＣ末端伸長によりさらに安定化される（付録）。最後に、領域４５はＨ１のループ中の位置１７−１９と偽結び目構造を形成する。領域２９の位置５７２はフォールディングして位置１９と相互作用し、この偽結び目構造をさらに安定化する。
Ｈ２７は、クラスター９を形成する２個の保存された領域（領域４３および４４（図６．１））を含有する（図６．３）。界面側から見られる場合、クラスター９は土台の底部に位置する。ループの位置８９９−９００はＨ２４の基部（位置７６８−７７０および８０９−８１１）とドッキングする（Ｂｅｌａｎｇｅｒら、２００２）一方、位置９００−９０１はサブユニット間架橋Ｂ２ｃの形成に関与する（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）。ループ中の位置８９８および８９９が保存されているとは言え、位置７６９を除くＨ２４の基部のドッキング部位が保存されないことに注目することは興味深い。四塩基ループ−受容体結合を妨害することが翻訳忠実度およびサブユニット会合を遂げることが示されたこと（Ｂｅｌａｎｇｅｒら、２００２）を考えると、これは驚くべきである。加えて、サブユニット間架橋Ｂ２ｃの形成に関与していると考えられる９００ループ中のヌクレオチドもまた保存されない。ステムおよび閉鎖塩基対はしかしながら保存され、ループの形成および位置決めが機能に重要であること、ならびにＨ２４の基部およびサブユニット間架橋Ｂ２ｃへのドッキングがおそらくバックボーン媒介性の相互作用であることを示唆する。
３’ドメイン。３’ドメインは３０Ｓサブユニットの頭部を形成する。該サブユニットの総容量のわずか１／３とは言え、このドメインはｒタンパク質の約半分を含有する（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）。結果として、３’ドメイン中で同定されるクラスター
の多くはタンパク質結合部位である。領域４６、６３および６４は、結合部１１により結合される３ヘリックス（Ｈ２８、Ｈ２９およびＨ４３）のうち２個を形成して（図６．１）、クラスター１０を構成する（図６．３）。結合部１１は一次結合タンパク質Ｓ７および二次結合タンパク質Ｓ９の結合部位を形成する。Ｓ７の結合は、機能的３’ドメインを形成するために、頭部の残存するｒタンパク質の結合に不可欠である（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）。このクラスターの保存は系統発生分析でもまた見られ、このクラスターおよびＳ７結合部位の重要性を強調する。Ｓ９の球状ドメインはＳ７に近接して配置される一方、伸長されたＣ末端ドメインはＨ３８、Ｈ４３、Ｈ３１およびＨ２９と相互作用する（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）（付録）。Ｓ９のＣ末端はＰ部位で終端しかつＰ部位に結合したｔＲＮＡと相互作用する。Ｓ９のＣ末端からの約３アミノ酸の欠失はイニシエーター以外のｔＲＮＡに対する低下された親和性をもたらした（Ｈｏａｎｇら、２００４）。Ｈ４１中の位置１２５０および１２８７は位置１３５３および１３７０でＨ４３の副溝と相互作用して、該２ヘリックスを一緒にする。この相互作用はＨ４２と一緒になって、高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中でｒタンパク質ＴＨＸの結合部位であるポケットを形成する（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）。高度好熱菌（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の極端な天然の環境は構造を維持するためにＴＨＸ結合を必要としうる。ＴＨＸは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で見出されないとは言え、この構造の形成に関与する位置の保存は、リボソーム機能におけるその重要性を強く主張する。
クラスター１１（図６．３）は、結合部１２に結合しかつ領域４７、５８、５９および６２を含有するＨ２９、Ｈ３０、Ｈ４１およびＨ４２を関わらせる（図６．１）。Ｓ９のＮ末端ドメインは制限された接触を有する（クラスター１０を参照されたい）とは言え、クラスター１１はｒタンパク質Ｓ１３の主結合部位である。Ｓ１３は、３０Ｓサブユニットの上部に配置される球状Ｎ末端、ならびにＨ４２を包みかつその後３０Ｓサブユニットを貫通してＰ部位近くで終端する伸長されたＣ末端ドメインをもつ二次結合タンパク質である（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２；Ｈｏａｎｇら、２００４）。Ｓ１３はサブユニット間架橋Ｂ１ａおよびＢ１ｂを形成する（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）。必須でないとは言え、Ｓ１３を欠くリボソームはサブユニット会合および翻訳忠実度が不完全である（ＣｕｋｒａｓとＧｒｅｅｎ、２００５；Ｃｕｋｒａｓら、２００３）。２領域（領域６０および６１）を含有するＨ４２の端のヘアピン（図６．１）をクラスター１５と呼称した（図６．３）。Ｈ４２のステムはＳ１３接触を有する一方、Ｈ４２のループはｒタンパク質Ｓ１９を結合する（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）。二次結合タンパク質Ｓ１９は、３０Ｓサブユニットの頭部の成熟に関与するタンパク質ＲｉｍＭと相互作用することが示された（Ｌｏｖｇｒｅｎら、２００４）。
Ｈ４２のループに加え、Ｓ１９はまた領域５７とも相互作用する（図６．１）。領域５７、４８および４９はクラスター１２を形成し（図６．３）、それはＳ１９に加えてｒタンパク質Ｓ１４を結合する。高度好熱菌（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）で、Ｓ１４は４個のシステイン残基の配位により亜鉛イオンを結合する。これらの残基はしかしながら大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で見出されない（Ｔｓｉｂｏｌｉら、１９９８）。このタンパク質の役割はｒＲＮＡの安定化を別にして不明である。ｒタンパク質結合部位としてのクラスター１０、１１、１２および１５の保存はクラスター１３および１４の位置を決めるためでありうる。
クラスター１３および１４（図６．３）はそれぞれＨ３４およびＨ３５により形成される。
これらの２クラスターは、クラスター４（５’ドメインを参照されたい）および１６（下を参照されたい）と一緒になって、ｍＲＮＡがリボソームに進入するチャンネルを形成する（Ｙｕｓｕｐｏｖａら、２００１）。界面側から見られる場合に、クラスター４（５３０ループ）および１６（解読領域）は、下流のｍＲＮＡチャンネルの底部および右側を形成する一方、クラスター１３および１４は上部および左側を形成する。クラスター４および１６は翻訳忠実度を維持するためにコドン−アンチコドン相互作用を監視する一方、クラスター１３および１４は進入するｍＲＮＡを結合しかつ正しい方向に置く（Ｙｕｓｕｐｏｖａら、２００１）。クラスター１３および１４は、進入するｍＲＮＡを結合しかつ正しい方向に置くことに加え、それぞれｒタンパク質Ｓ５およびＳ３の結合部位である。これらのｒタンパク質は、Ｓ４と一緒になってｍＲＮＡチャンネルを溶媒側に並べる。これらのタンパク質が、ｍＲＮＡの二次構造を除去すること、翻訳処理能力およびリーディングフレームの維持に関与していることが示唆されている（Ｔａｋｙａｒら、２００５；Ｙｕｓｕｐｏｖａら、２００１）。最後のクラスター、クラスター１６（図６．３）は解読部位であり、領域６６および６７より構成される（図６．１）。領域６６および６７は、ＡおよびＰ部位のｔＲＮＡ結合、開始因子１（ＩＦ１）結合、アミノグリコシド抗生物質結合、ならびにｍＲＮＡの解読の部位としてリボソーム機能で重要として、多数の研究で以前に同定されている（Ｃａｒｔｅｒら、２００１；Ｏｇｌｅら、２００１；ＶｉｃｅｎｓとＷｅｓｔｈｏｆ、２００３）。Ａ部位の位置１４９２および１４９３は翻訳忠実度におけるそれらの役割により期待されるであろうとおり保存されている（Ｏｇｌｅら、２００１）。Ｐ部位の一部として、位置１３９９および１４０１は保存された。位置１４００は、しかしながら、Ｐ部位への関与（ＭｏａｚｅｄとＮｏｌｌｅｒ、１９９０；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）にもかかわらず突然変異ライブラリーで保存されず（９突然変異）、かつ、位置９６７に架橋された（Ｗｉｌｍｓら、１９９７）。位置１４００は、ライブラリーでＣ１４００Ｇを含有せずかつ２個のＣ１４００Ａ突然変異のみを含有し、プリンが高度に有害であることを示唆している。これは、プリンがリボソーム機能の８０％低下をもたらした１４００での部位特異的突然変異でもまた見られた（第４章）。サブユニット間架橋Ｂ２ａは、位置１４０８−１４１０および１４９４−１４９５、ならびに２３Ｓ ｒＲＮＡからのＨ６９を関わらせる（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）。これら５位置のうち２位置のみ（位置１４０９および１４９４）が保存された。保存されない位置は、しかしながら各位置でヌクレオチドの好みを示した。位置１４０８の全突然変異（７突然変異）はＡからＧへのトランジションであった一方、位置１４１０（１３突然変異）はＣを除外し、また、位置１４９５（６突然変異）はＧを除外した。付加的な保存された位置が機能のための適切な構造の形成の原因であるようである。この構造の形成はＩＦ１およびアミノグリコシド抗生物質の結合部位である。
サブユニット間架橋。サブユニット間架橋は、タンパク質合成の間のサブユニット間の通信を可能にする動的相互作用である。これらの相互作用は、タンパク質合成の間に大および小サブユニットを一緒に保持し、そして高度好熱菌（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の７０Ｓ結晶構造中でほぼ原子分解能で同定された（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）。合計８個のサブユニット間架橋が、中央に位置するＲＮＡ−ＲＮＡ架橋（３０Ｓおよび５０Ｓ双方のサブユニットからのＲＮＡ間の相互作用）ならびに周辺に位置するＲＮＡ−タンパク質架橋（一方のサブユニットからのＲＮＡと他方のサブユニットからのタンパク質の間の相互作用）の大多数で同定された（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）。最小のリボソームをモデル化するのに使用した全超界からのｒＲＮＡ配列の比較分析は全サブユニット間架橋の保存を見出した（Ｍｅａｒｓら、２００２）。分析へのオルガネラｒＲＮＡ配列の追加は、架橋Ｂ２ａ、Ｂ２ｃ、Ｂ３およびＢ７ｂのみの保存をもたらした（Ｍｅａｒｓら、２００２）。突然変異ライブラリーの分析は、サブユニット間架橋Ｂ２ａ、Ｂ２ｂおよびＢ７ｂの形成に関与するヌクレオチドを、保存された領域の一部であると同定した。他のサブユニット間架橋は保存されたヌクレオチドを有するが、しかしこれらのヌクレオチドは領域の一部と同定されなかった。これらの単離された保存された位置が機能上重要であるかどうか、若しくは無作為の機会により他の位置と同じくらいしばしば変異されたかどうかは不明である。架橋Ｂ２ａおよびＢ２ｂは触媒中心に近接してリボソームの中心に位置し、そしてｔＲＮＡ結合、トランスロケーションおよびサブユニット会合に関与している。サブユニット間架橋Ｂ７ｂは１６Ｓ ｒＲＮＡ中の領域３３および３５ならびに大型サブユニットタンパク質２（Ｌ２）の間のＲＮＡ−タンパク質架橋である。この架橋の保存は、ＡおよびＰ部位へのｔＲＮＡ結合におけるＬ２の役割、ならびにペプチジルトランスフェラーゼ活性におけるその役割によることができる（Ｄｉｅｄｒｉｃｈら、２０００；Ｕｈｌｅｉｎら、１９９８）。われわれの結果はモデル化研究と驚くべきことに一致し、そしてサブユニット間架橋が直接塩基対形成により相互作用しないことを示唆する。
ｔＲＮＡ結合。ｔＲＮＡと１６Ｓ ｒＲＮＡの間の相互作用が、生化学的方法を使用して、および最近は結晶学研究により同定された（ＭｏａｚｅｄとＮｏｌｌｅｒ、１９９０；Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）。ｔＲＮＡとｒＲＮＡの間の相互作用の大部分は、各部位に結合するのに必要とされる異なるｔＲＮＡの数を考えれば期待されるであろうとおり、バックボーン−バックボーン相互作用であり（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）、従って特定の塩基保存はありそうにない。突然変異ライブラリーで同定された保存された領域との既知のｔＲＮＡ−１６Ｓ ｒＲＮＡ相互作用の比較は、ＰおよびＥ部位の相互作用での１６Ｓ ｒＲＮＡの制限された保存を示す。Ｐ部位に結合したｔＲＮＡの位置４０および４１はそれぞれ保存された位置１３３９および１３３８（領域６２）と相互作用する（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）。Ｐ部位ｔＲＮＡの位置３８は領域３９からの位置７９０のバックボーンと相互作用する（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）。位置７９０（８突然変異）は保存されないが、しかしＣ突然変異がこの位置から除外された。保存された位置７８９（領域３９）および１３３９（領域６２）はそれぞれＥ部位に結合したｔＲＮＡの位置３８および３５と相互作用する（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）。ヌクレオチド同一性はｔＲＮＡ相互作用の部位で保存されないとは言え、結合部位の周囲のヌクレオチドは保存され、バックボーンの位置決めが重要であることを示唆する。対照的に、１６Ｓ ｒＲＮＡとＡ部位に結合したｔＲＮＡの間の相互作用の大多数が保存されている。１６Ｓ ｒＲＮＡの位置５３０（領域２６）、１０５４（領域４７）および１４９２−１４９３（領域６４）は、Ａ部位ｔＲＮＡとそれぞれ位置３４−３６、３４および３８で相互作用する（Ｙｕｓｕｐｏｖら、２００１）。これらの接触は、しかしながら、コドン−アンチコドン相互作用を監視することによる同族および近同族のｔＲＮＡの間の識別の原因であり、そして系統発生分析ならびに突然変異ライブラリーで普遍的に保存されている（Ｃａｎｎｏｎｅら、２００２；Ｏｇｌｅら、２００１）。
ｍＲＮＡ結合 翻訳の間に、ｍＲＮＡはリボソームの首部の周囲に巻かれ、２個の別個のトンネルを通って進入しかつ出る（Ｙｕｓｕｐｏｖａら、２００１）（図６．２）。リボソームの頭部と土台の間の上流のトンネルは、Ｓ７、６９０ループ、７９０ループ、Ｈ４５の基部およびＨ２８により形成される（Ｙｕｓｕｐｏｖａら、２００１）。７９０ループ（領域３９）およびＨ２８の小区分（領域６５）のみが、上流のｍＲＮＡトンネルの保存された成分として同定されたとは言え、Ｈ４５の基部は突然変異誘発の一部でなかったためそれは除外され得ない。７９０ループ（領域３６）の副溝側はｍＲＮＡと直接相互作用し、それがｍＲＮＡの位置決めにおいてある役割を有することを示唆する。
４個の保存されたクラスター（クラスター４、１３、１４および１６）は下流のトンネルを形成する（Ｙｕｓｕｐｏｖａら、２００１）（図６．２）。界面側から見られる場合に、クラスター４（５’ドメインを参照されたい）および１６（３’ドメインを参照されたい）はトンネルの底部および右側を形成する一方、クラスター１３および１４は上部および左側を形成する。トンネルの界面側はＲＮＡより構成される一方、タンパク質Ｓ３、Ｓ４およびＳ５は溶媒側でトンネルを取り囲む（Ｙｕｓｕｐｏｖａら、２００１）。それぞれｒタンパク質Ｓ３およびＳ５の結合部位を形成するクラスター１３および１４、一方Ｓ４はＳ５およびクラスター４との相互作用により結合する。トンネルの溶媒側のこれら
のリボソームタンパク質はｍＲＮＡの位置を決めかつｍＲＮＡをほどくようである（Ｙｕｓｕｐｏｖａら、２００１）。最近、精製されたリボソームが、Ｓ３およびＳ４中の突然変異により減少されるヘリカーゼ活性を有することが示された（Ｔａｋｙａｒら、２００５）。結合ｒタンパク質に加え、クラスター１３および１４はｍＲＮＡの位置を決めかつ解読するのに重要な位置もまた含有する。これは、ｍＲＮＡが、進入するｔＲＮＡとＡ部位で正しく相互作用することを可能にしうる。
タンパク質結合。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３０Ｓサブユニットの２１種のリボソームタンパク質は、結合の順序に基づき３つの範疇、すなわち、ｒＲＮＡに最初に直接結合する一次結合タンパク質（Ｓ４、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ１５、Ｓ１７およびＳ２０）、一次タンパク質結合後に形成される構造に結合する二次結合タンパク質（Ｓ９、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１６、Ｓ１８およびＳ１９）、ならびに二次結合タンパク質に結合して機能的３０Ｓサブユニットを形成する三次結合タンパク質（Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１４およびＳ２１）に分離される（ＧｒｏｎｄｅｋとＣｕｌｖｅｒ、２００４；Ｈｅｌｄら、１９７３）（図１．４）。リボソームタンパク質の結合は、他のＲＮＡ結合タンパク質と異なり、主として塩基特異的接触よりはむしろポリペプチドバックボーンのアミドおよびカルボニル基とｒＲＮＡのリン酸の酸素原子の間の塩架橋による（ＡｌｌｅｒｓとＳｈａｍｏｏ、２００１）。従って、ｒＲＮＡの構造および電荷は、大部分のｒタンパク質結合にとって配列より重要である（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）。
７種のｒタンパク質（Ｓ７、Ｓ９、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１９およびＳ２０）のみが、４個若しくはそれ以上の保存された位置で直接塩基接触を有した一方、残存するｒタンパク質は保存された位置で０〜３個の間の塩基特異的接触を有した。興味深いことに、保存された領域との４個若しくはそれ以上の直接塩基接触をもつタンパク質の２種のみが一次タンパク質である。ｒタンパク質とｒＲＮＡの間の相互作用はバックボーン相互作用により起こる（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００２）。ヌクレオチド同一性の保存は、従ってタンパク質結合に不可欠でなく、そして従って多くのタンパク質結合部位が保存された領域と同定されなかった。ｒタンパク質結合へのバックボーンおよび構造の使用は、他の反応での塩基の使用を見込み、そしてｒタンパク質結合に影響を及ぼすことなく突然変異が発生することを可能にしうる。
因子結合。タンパク質合成の過程は因子により補助される。細菌では、開始は３個の開始因子ＩＦ１、ＩＦ２およびＩＦ３を必要とする。３０Ｓサブユニットに結合したＩＦ１（Ｃａｒｔｅｒら、２００１）および３０Ｓサブユニットに結合したＩＦ３のＣ末端ドメイン（ＩＦ３Ｃ）の結晶構造が解明された（Ｐｉｏｌｅｔｔｉら、２００１）。結晶構造中で、ＩＦ１は、Ｈ４４のバックボーン（クラスター１６）および５３０ループ（クラスター４）ならびにｒタンパク質Ｓ１２に結合する（Ｃａｒｔｅｒら、２００１）。３０Ｓサブユニットに結合したＩＦ２の結晶構造は解明されていないとは言え、それがイニシエーターｔＲＮＡに結合することが示され、また、リボソームに対するその親和性はＩＦ１の存在下で増大される（ＺｕｃｋｅｒとＨｅｒｓｈｅｙ、１９８６）。ＩＦ２はＡ部位でＩＦ１を上回って結合しかつＰ部位でのイニシエーターｔＲＮＡの位置決めにおいて補助することが提案された（Ｒｏｌｌ−Ｍｅｃａｋら、２０００）。最後に、ＩＦ３の位置はなお論争中である。生化学的および低温電子顕微鏡検査（低温ＥＭ）研究は、ＩＦ３のＣ末端ドメイン（ＩＦ３Ｃ）を、Ｈ２３、Ｈ２４およびＨ４５への接触を伴い土台の界面側に置いた（ＤａｌｌａｓとＮｏｌｌｅｒ、２００１；ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎら、１９９９）一方、結晶構造は、ＩＦ３Ｃを、Ｈ２３、Ｈ２６およびＨ４５への接触を伴い土台の溶媒側に置く（Ｐｉｏｌｅｔｔｉら、２００１）。該４個の結合部位のうち、ヘリックス２３および２４はクラスター６および７を形成し、Ｈ２６は保存されず、そしてＨ４５は突然変異ライブラリーに包含されなかった。伸長因子ＥＦ−ＧおよびＥＦ−Ｔｕの結合部位の大多数は、構造および生化学的研究により５０Ｓサブユニット上に配置された（Ａｇｒａｗａｌら、１９９８；Ｓｔａｒｋら、１９９７；Ｖａｌｌｅら、２００３；ＷｉｌｓｏｎとＮｏｌｌｅｒ、１９９８）。同一のデータは、ＥＦ−ＴｕおよびＥＦ−Ｇが３０Ｓサブユニットの類似の領域を接触することを示唆する（Ａｇｒａｗａｌら、１９９８；Ｓｔａｒｋら、１９９７ｂ；Ｖａｌｌｅら、２００３；ＷｉｌｓｏｎとＮｏｌｌｅｒ、１９９８）。ＥＦ−Ｇについて、これらの相互作用は、ループ５３０の基部、７９０ループ、位置１４００、ならびに位置１２１０および１２３０の周囲を包含する（ＷｉｌｓｏｎとＮｏｌｌｅｒ、１９９８）。１２１０および１２３０の周囲の領域を除き、残存する結合部位は突然変異ライブラリーで保存されている。これらの接触部位はＥＦ−Ｔｕ・ｔＲＮＡ複合体について同様であるとは言え、これらの接触はおそらくＥＦ−ＴｕとよりはむしろｔＲＮＡおよびｒＲＮＡの間で起こる。
タンパク質合成の終了は、新生タンパク質を遊離しかつ終止複合体を解離するための２分類の終結因子を必要とする。Ａ部位の終止コドンはクラスＩ終結因子ＲＦ１およびＲＦ２により認識される。３０Ｓサブユニット中で、これらの終結因子はｔＲＮＡの結合を模倣し、そしてＨ４４（クラスター１６）、Ｈ１８（クラスター４）およびｒタンパク質１２と相互作用する（Ｋｌａｈｏｌｚら、２００３）。新生タンパク質の遊離後に、クラスＩＩ終結因子ＲＦ３が、同一結合部位について競合することによりリボソームからのクラスＩ終結因子の遊離を媒介する（Ｚａｖｉａｌｏｖら、２００１）。ＲＦ３の結合は、Ｈ５、Ｈ１６およびＨ１７への付加的な接触を伴うＥＦ−ＧおよびＥＦ−Ｔｕの結合に類似である（Ｋｌａｈｏｌｚら、２００４）。
リボソーム因子はタンパク質合成の過程で不可欠な役割を演じ、そして１６Ｓ ｒＲＮＡ中の保存された部位と相互作用する。これらの保存された部位は、しかしながら因子結合に加えてそれらと関連した他の機能を有し、突然変異ライブラリーでのそれらの保存を説明する。
抗生物質結合。細胞中でのタンパク質合成の単独供給源としてのリボソームは抗生物質の理想的な標的である。多数の天然に存在する抗生物質が機能上重要な部位に結合しかつタンパク質合成を破壊する。これらの抗生物質の多くに対する耐性は、しかしながら標的修飾により達成され、これらの抗生物質の作用部位が機能上重要な領域にあるとは言えこれらの部位がいくらかの変動をなお耐え得かつ機能を保持し得ることを示唆する（ＢｅａｕｃｌｅｒｋとＣｕｎｄｌｉｆｆｅ、１９８７；Ｄａｉｌｉｄｉｅｎｅら、２００２；Ｓｉｇｍｕｎｄら、１９８４；ＳｐａｎｇｌｅｒとＢｌａｃｋｂｕｒｎ、１９８５）。例えば、アミノグリコシド抗生物質はＡ部位に結合しかつ位置Ａ１４０８、Ｇ１４９１、Ａ１４９２およびＡ１４９３を接触する（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２０００；Ｆｏｕｒｍｙら、１９９６；Ｆｏｕｒｍｙら、１９９８ａ；Ｆｏｕｒｍｙら、１９９８ｂ；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、２０００）。Ａ１４０８Ｇ突然変異は機能を３０％だけ低下させる（未発表データ）一方、横断突然変異（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）は機能のより大きな低下をもたらす。位置１４０８の突然変異は、しかしながらアミノグリコシド抗生物質の結合を阻害する（ＢｅａｕｃｌｅｒｋとＣｕｎｄｌｉｆｆｅ、１９８７；Ｈａｒｒｉｓら、１９８９）。突然変異ライブラリーで位置１４０８は保存されておらず、そして７突然変異を含有し、それらの全部はＡ１４０８Ｇトランジションである。突然変異ライブラリーの分析は、スペクチノマイシン、パクタマイシン、エデインおよびアミノグリコシドの作用部位を保存されていると同定した。加えて、突然変異ライブラリーのさらなる分析は、機能を維持しつつ抗生物質に対する耐性を提供する既知の突然変異を同定した（ＢｅａｕｃｌｅｒｋとＣｕｎｄｌｉｆｆｅ、１９８７；Ｓｉｇｍｕｎｄら、１９８４）。既知の抗生物質の作用部位の同定は、突然変異ライブラリーで見出される他の保存された領域が新たな抗菌薬の開発のための良好な標的となりうることを意味する。
突然変異ライブラリーの分析は機能に必要とされる多数の領域を同定した。既知の機能
上重要な領域の同定は、他の同定された領域もまた機能に重要であるという仮定に信用を与える。われわれのライブラリーからの保存された領域の系統発生地図との比較は顕著な類似性を示す。本明細書に記述される領域は、しかしながら系統発生分析で見られるものより少なく広範囲である。この差違の１つの可能な説明は、われわれの選択の間の低下された機能要件でありうる。われわれのリボソームは完全に機能的であることを必要とされないため、機能を低下させかつ従って適合度を低下させる突然変異もまた表される。これらの突然変異は、それでも環境中で生存しないとみられ、そして従って系統発生分析で保存されていることが見出される。突然変異ライブラリーの保存された領域は、いずれかの機能に絶対に必要とされる位置を表す。１６Ｓ ｒＲＮＡの全ドメイン中の保存された領域が同定されており、ｒＲＮＡがその機能を遂行するために全体として作用することを意味している。
試薬。制限酵素、リガーゼおよび仔ウシ腸アルカリホスファターゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓおよびＦｅｒｍｅｎｔａｓからであった。配列決定改変ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチドおよび配列決定緩衝液はＥｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからであった。オリゴヌクレオチドはＭｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（テキサス州ミッドランド）若しくはＩＤＴ ＤＮＡ（アイオワ州コーラルビル）いずれかから購入した。ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲ試薬はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ（マサチューセッツ州ボストン）からであった。
プラスミドおよび突然変異誘発。全部の突然変異誘発はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｈｉｇｕｃｈｉら、１９８８；Ｍｕｌｌｉｓら、１９８６；ＭｕｌｌｉｓとＦａｌｏｏｎａ、１９８７）を使用して実施した。１６Ｓ ｒＲＮＡ突然変異ライブラリーの構築：全突然変異はｐＲＮＡ２２８中で構築した。１６Ｓ ｒＲＮＡは、プライマーｌａｃ ＵＶ５−７４（５’−ＧＣＡ ＧＴＧ ＡＧＣ ＧＣＡ ＡＣＧ ＣＡ−３’）および２３Ｓ ２０Ｒ（５’−ＧＴＡ ＣＧＣ ＴＴＡ ＧＴＣ ＧＣＴ ＴＡＡ ＣＣ−３’）を用いる誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲを使用して変異させた。１６Ｓ ｒＲＮＡを、ＢｃｌＩとＢｓｔＥＩＩ切断部位の間の野生型配列を置換することによりｐＲＮＡ２２８にクローン化した。ライゲーションを、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｃｅｌｌ Ｐｏｒａｔｏｒを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５に形質転換した。
機能的変異体の選択。形質転換体を、ＡｍｐＲマーカーの発現を見込むため、ＳＯＣ培地中３７℃で振とうしながら０．５時間インキュベートした。培養物のサンプルをＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）プレート上でプレーティングして形質転換効率を決定した。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）をその後、残存する培養物に１ｍＭの最終濃度まで添加し、そして３７℃で振とうしながら追加の１．５時間インキュベートしてｒＲＮＡ合成を誘導した。培養物をその後、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）＋ＩＰＴＧ（１ｍＭ）寒天上でプレーティングした。生存体を無作為に選択しかつ２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）＋ＩＰＴＧ（１ｍＭ）寒天上にスポットし、そして３７℃で２４時間インキュベートした。これらのプレートをその後配列決定のためＳｅｑＷｒｉｇｈｔ Ｉｎｃ．に送った。
細菌株および培地。全プラスミドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５（ｓｕｐＥ４４、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１）（Ｈａｎａｈａｎ、１９８３）中で維持しかつ発現させた。培養物は１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培地（ＬｕｒｉａとＢｕｒｒｏｕｓ、１９５７）（ＬＢ−Ａｐ１００）中で維持した。ｌａｃＵＶ５プロモーターからのプラスミド由来ｒＲＮＡの合成を誘導するため；ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を各実験で指定された時点で１ｍＭの最終濃度まで添加した。株はＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｃｅｌｌ Ｐｏｒａｔｏｒを使用する電気穿孔法（Ｄｏｗｅｒら、１９８８）により形質転換した。別の方法で示されない限り、形質転換体は、選択培地上でプレーティングする前にＳＯＣ培地（Ｈａｎａｈａｎ、１９８３）中で１時間増殖させて、プラスミド由来遺伝子の発現を可能にした。
双方のサブユニットの多数の生化学的研究および高分解能結晶構造が、タンパク質合成の一般的機構を決定するのに使用された。分子レベルでのタンパク質合成の機構は、しかしながら未だほとんど知られていない。ここで、わたしは個別の領域でのおよび１６Ｓ ｒＲＮＡ全体の突然変異の影響を決定するために、正常の細胞機能に影響を及ぼすことなくｉｎ ｖｉｖｏでｒＲＮＡの突然変異誘発を可能にする遺伝子系を使用した。５３０ループ、９７０ループおよびヘリックス４５の飽和突然変異誘発が、リボソームの解読機能に重要である構造的および機能的双方のヌクレオチドを同定した。突然変異ライブラリーの創製がリボソーム機能に必要とされるヌクレオチドを同定した。
９７０ループは、位置９６６および９６７が変異される場合に見られる機能の増大されたレベルにより示されるとおり、タンパク質合成の開始に重要である。機能のこの変化はＩＦ３の過剰発現により補完され得る。Ｇ５３０はコドン−アンチコドン相互作用の忠実度の維持に関与している。該ループの残部はＧ５３０の位置決めに関与している。最後に、ヘリックス４５は、結晶構造中のヘリックス４４および７９０ループの緊密な一緒の位置決めに関与している。ヘリックス４４および７９０ループはＡおよびＰ部位に関与する。ヘリックス４５はＡおよびＰ部位の間の情報伝達に関与しうる。
突然変異ライブラリーを使用して、リボソーム機能に必要とされる保存されたヌクレオチドを同定した。突然変異ライブラリーで同定された保存されたヌクレオチドの、３超界および２オルガネラの系統発生分析で同定されたものとの比較は、タンパク質合成の分子機構が全生物体で同一のヌクレオチドを関わらせることを示唆する顕著な類似性を見出した。しかしながら、超界特異的でありうる差違が同定されたが、しかしこれらの結果はなお確認されなければならない。
飽和突然変異誘発および突然変異ライブラリーから生じる情報を使用して抗菌薬の開発のための新たな標的を同定し得る。飽和突然変異誘発データは、翻訳の正確さに必要とされる分子相互作用への洞察を提供した。これらの相互作用の破壊はタンパク質合成に影響を及ぼすことができ、そして、事実、天然に存在する抗生物質、テトラサイクリン、アミノグリコシドおよびカスガマイシンの作用部位は、それぞれ９７０ループ、解読領域およびヘリックス４５との相互作用を伴う。これらおよび他の天然に存在する抗生物質（スペクチノマイシン、パクタマイシンおよびエデイン）の他の作用部位もまた突然変異ライブラリー中で同定された。突然変異ライブラリーでの既知の抗生物質の作用部位の同定は、該ライブラリーに見出される他の保存された部位が新たな抗菌薬の開発のための良好な標的となりうることを示唆する。
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引用することによる組み込み
本明細書に引用される、限定されるものでないが米国特許、米国特許出願公開、公開国際出願および雑誌の論文を挙げることができる参考文献の全部は、ここに引用することにより組み込まれる。
同等物
当業者は、わずかに慣例の実験を使用して、本明細書に記述される本発明の特定の態様に対する多くの同等物を認識するであろうか、若しくは確認することが可能であろう。こうした同等物は以下の請求の範囲により包含されることを意図している。
至適の突然変異誘発条件の決定を描く。（ａ）クロラムフェニコールの非存在下（黒色）、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌで選択された（灰色）若しくは５０μｇ／ｍｌで選択された（白色）各マンガン濃度での突然変異数の平均の棒グラフ。各濃度で分析したサンプルの数がグラフの底部にある。（ｂ）至適のマンガン濃度を決定するのに使用した全部の変異体クローンで見られる突然変異の型。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））からの１６Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を描く。突然変異ライブラリーで同定される領域を示す。各位置に３個若しくはそれ未満の突然変異をもつ最低３個の連続するヌクレオチドの領域を赤色で示し、各位置に１個若しくはそれ未満の突然変異をもつ最低２個の連続するヌクレオチドの領域を緑色で示し、そして４個若しくはそれ以上の突然変異をもつ単一位置により類似の位置から分離されている３個若しくはそれ未満の突然変異をもつ位置を橙色で示す。 同定された領域を示す大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１６Ｓ ｒＲＮＡの結晶構造のモデルの４個の図を描く。彩色は図２に類似である。 ５’ドメインの保存された領域のクラスターを描く。保存された領域の各クラスターの詳細図を左に示す。論考されるクラスターをもつタンパク質を伴う大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１６Ｓ ｒＲＮＡのモデル化した結晶構造を右に参照のため示す。Ａ）ヘリックス６；領域３ Ｂ）ヘリックス１０；領域１２ Ｃ）ヘリックス１６；領域２３ Ｄ）ヘリックス１８；領域２５、２６および２７ Ｅ）ヘリックス１１および１２；領域１５および１６ Ｆ）ヘリックス６、８および９；領域４、８、９、１０および１１ Ｇ）ヘリックス７および１１；領域７、１３および１４ Ｈ）ヘリックス４、５、６、１４、１５および１７；領域１、２、５、６、１７、１８、１９、２０、２１、２２および２４。 中央ドメインの保存された領域のクラスターを描く。図４に類似の像の設定。Ａ）ヘリックス２２および２３；領域３２および３４ Ｂ）ヘリックス２１；領域２９、３０および３１ Ｃ）ヘリックス２４；領域３６および３７ Ｄ）ヘリックス２７；領域４０および４１ Ｅ）ヘリックス１９および３９；領域２８、３９および４２ Ｆ）ヘリックス２３および２４；領域３３、３５および３８。 ３’ドメインの保存された領域のクラスターを描く。図４に類似の像の設定。Ａ）ヘリックス３９；領域５０ Ｂ）ヘリックス４０；領域５１ Ｃ）ヘリックス２９、３０、４１および４２；領域４３、４４、５５、５６および５７ Ｄ）ヘリックス４３：領域６０および６１ Ｅ）ヘリックス３１、３２および４２；領域４５、４６、５４、５８および５９ Ｆ）ヘリックス３４および３５；領域４７、４８、４９、５２および５３ Ｇ）ヘリックス２８および４４；領域６２、６３および６４。 「即時進化」実験の結果をグラフで描く；すなわち、１６Ｓ ｒＲＮＡ中の各位置の突然変異の数。 それらの既知の機能と一緒の１６Ｓ ｒＲＮＡ中の標的領域の表形式化を描く。 標的領域およびそれらの配列識別子番号の表形式化を描く。 空間的近接およびタンパク質結合に基づく、標的領域のクラスターへの組織化を描く。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのｒｒｎＢ １６Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を描く。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２のリボソームオペロンのあいだの配列の差違の同定。ヌクレオチド同一性の変化を各円内に示す一方、円の色は配列変化が存在するオペロンに対応する。直接変化は直線により示し、挿入は矢印により示し、そして欠失はΔにより示す。ＤＨ５中で見られないＫ−１２中の差違を黒色で囲む一方、ＤＨ５中で見られるがしかしＫ−１２中で見られない差違を赤色で囲む。Ｃａｎｎｏｎｅら（２０００）から翻案された。 ４種の配列が異なるｒＲＮＡオペロンのあいだの機能の差違を描く。ａ）３０℃、３７℃および４２℃でのｒＲＮＡオペロンの機能の分析。ｒｒｎＣ（青色）、ｒｒｎＤ（赤色）、ｒｒｎＧ（白色）およびｒｒｎＨ（緑色）からの１６Ｓ ｒＲＮＡの機能を、同一の増殖条件下で、ｒｒｎＢの機能と比較する。ｂ）多様なＭｇ２＋濃度でのｒＲＮＡオペロンの機能の分析。ａ）に類似の彩色。ｃ）多様なｐＨでのｒＲＮＡオペロンの機能の分析。ａ）に類似の彩色。ｄ）多様なイオン濃度でのｒＲＮＡオペロンの機能の分析。ａ）に類似の彩色。 ｒｒｎＧ １６Ｓ ｒＲＮＡ特有の変動の機能を描く。位置ａ）１３１およびｂ）１８３の単一突然変異を作成しかつ機能についてアッセイし、そしてｒｒｓＢのパーセントとして示した。野生型ヌクレオチドに下線を付ける。 ｒｒｎＨ １６Ｓ ｒＲＮＡ特有の変動の機能を描く。ｒｒｎＨ １６Ｓ ｒＲＮＡからの特有の変動すなわちＵ８５５Ａおよびヘリックス３３全体を単離し、そしてｒｒｓＢにクローン化した。野生型ｒｒｓＢ（黒色）、Ｕ８５５Ａを伴うｒｒｓＢ（紫色）、およびヘリックス３３全体をもつｒｒｓＢ（青色）を、３０℃、３７℃および４２℃で機能についてアッセイした。機能は３７℃で増殖させたｒｒｓＢのパーセントである。 ５３０ループの位置および保存を描く。５３０ループは中央ドメイン中に位置する。大文字の赤色は普遍的に保存されるヌクレオチドを示す一方、小文字の赤色は細菌内でのみ保存されるヌクレオチドを示す。黒色の文字は野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）配列を示す。 ５３０ループを４Ｎ（５２１−５２２および５２７−５２８）相互作用の結果とともに描く。フォントのサイズはプール中でのそのヌクレオチドの存在の頻度を示す。機能のレベルとヌクレオチドの同一性の間の有意な相関を示す位置を囲む。 ５３０ループを６Ｎ（５０５−５０７および５２４−５２６）相互作用の結果とともに描く。フォントのサイズはプール中でのそのヌクレオチドの存在の頻度を示す。機能のレベルとヌクレオチドの同一性の間の有意な相関を示す位置を囲む。 ５３０ループを８Ｎ（５１６−５１９および５２９−５３２）相互作用の結果とともに描く。フォントのサイズはプール中でのそのヌクレオチドの存在の頻度を示す。機能のレベルとヌクレオチドの同一性の間の有意な相関を示す位置を囲む。位置の間の共変動は実線により同定し、ｐ値を線の上に示す。破線は、位置５１９のアデノシン変異体の非存在により確認され得なかった可能な共変動を示す。 表３．１．ａ−３．１．ｃを描く。 表３．２を描く。 表３．３を描く。 表３．５を描く。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の１６Ｓ ｒＲＮＡ中の９７０ループの位置を描く。赤色のヌクレオチドは３種の超界およびオルガネラのあいだで保存されている。挿入図は、示されるところの機能情報を伴う９７０ループの拡大図を含有する。 選択されたプール中のヌクレオチド頻度を描く。野生型配列は赤色で示す。円の大きさは、プール中のその位置に存在するそのヌクレオチドの頻度を示す。χ検定は各位置での不規則性の尺度である一方、コンセンサスはプ―ル中のそのヌクレオチドの最低１５％の普及に基づく。 ９７０ループ変異体の分析を描く。ａ）文字の大きさは各位置の該プール中でのそのヌクレオチドの存在量を反映するように、率に応じて定める。ヌクレオチド間の共変動は実線により示し、未確認の共変動は破線により示す。ヌクレオチドの同一性が機能と有意に相関する位置を囲む。赤色および青色は、結晶構造中で見られる２個の積み重なったトリプルの形成に関与するヌクレオチドを示す。ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３０Ｓサブユニットモデルからの９７０ループの結晶構造。位置はａ）でのように色分けし、そして、位置９６４および９７１は緑色に彩色する。ステムヌクレオチドは茶色である。 ｍ２Ｇ９６６およびｍ５Ｃ９６７単一変異体を描く。野生型ヌクレオチドに下線を付け、そして１００％に設定する。各変異体の機能の平均および標準誤差を各棒の上に示す。ａ）ｍ２Ｇ９６６単一変異体 ｂ）ｍ５Ｃ９６７単一変異体 Ａ９６４Ｇ突然変異のモデル化を描く。ａ）野生型Ａ９６４とＣ９７０の間の相互作用。ｂ）Ａ９６４Ｇ変異体のＣ９７０との相互作用。Ａ９６４Ｇ突然変異のＮ１は、位置９６５、９６９および９７０の間のスタッキング相互作用を破壊しうる、位置９７０の糖との立体衝突を引き起こす。 表４．１を描く。 表４．２を描く。 表４．３を描く。 表４．４を描く。 表４．５を描く。 ヘリックス４５（囲まれる）を示す大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１６Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を描く。赤色のヌクレオチドは３種の超界およびオルガネラで＞９０保存されている。サブユニット間架橋Ｂ２ｂの形成（●）、カスガマイシン耐性（■）、開始（▲）に関与する、およびＵ７９３に架橋する（▼）ヌクレオチドを示す。加えて、ヘリックス全体（位置１５０６−１５２９）がＩＦ３に架橋されている。 １５１８：１５１９部位特異的変異体の機能分析を描く。野生型は赤色であり（Ａ１５１８：Ａ１５１９）、二重変異体は緑色であり、そして単一変異体は青色である。点の大きさは野生型に比較した機能のレベルに比例する。３回のＧＦＰのアッセイの機能の平均（野生型のパーセント）を、標準誤差とともに各囲みの下に提供する。 １５１２：１５１３部位特異的変異体の機能分析を描く。野生型は赤色であり（Ｕ１５１２：Ｇ１５２３）、二重変異体は緑色であり、そして単一変異体は青色である。点の大きさは野生型に比較した機能のレベルに比例する。３回のＧＦＰのアッセイの機能の平均（野生型のパーセント）を、標準誤差とともに各囲みの下に提供する。 選択したプール中の各位置でのヌクレオチド分布を描く。野生型配列を赤色で示す。コンセンサスは、選択したプール中のその位置でのヌクレオチドの最低１０％の普及に基づく。χ検定は、観察されたヌクレオチド分布が無作為の機会による確率の尺度である。 選択したプール中の共変動分析を描く。３種の超界およびオルガネラのあいだで＞９０％保存されている位置を赤色で示す。ヌクレオチドのフォントサイズは、選択したプール中のこのヌクレオチドの存在に比例する。同定される共変動は実線の矢印として示す。ｐ≦０．００５を伴う共変動のみを示す。追加の弱い共変動が位置１５１３：１５１５（１．８×１０−２）、１５１５：１５２２（２．８×１０−２）、１５１８：１５２０（３．１×１０−２）および１５２１：１５２３（１．１×１０−２）の間で同定された。 ＤＨ５およびＡＡＳ３のヘリックス４５変異体のＧＦＰ誘導曲線を描く。ヘリックス４５変異体１００、１１５、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５若しくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＡＳ３中の野生型配列のＧＦＰ誘導曲線。一夜培養物を新たなＬＢ＋Ａｍｐ １００培地で１０００倍に希釈しかつＯＤ６００＝０．１まで増殖させた。培養物を１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、そして５００μＬのサンプルを多様な時間点で採取した。サンプルをペレットにし、そして５００μＬのＨＮ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４および０．８５％ＮａＣｌ）で２回洗浄し、そして５００μＬのＨＮ緩衝液に再懸濁した。蛍光（Ｅｘ：３９５、Ｅｍ：５０９）および吸光度（ＯＤ６００）を測定した。吸光度により除算した蛍光を時間に対しプロットする。 変異体１００、１０２および１０７のモデル化を描く。ａ）全３種の変異体をＭｆｏｌｄ（Ｍａｔｈｅｗｓら、１９９９；Ｚｕｋｅｒ、２００３）を使用してモデル化した。各変異体についての計算したΔＧを、フォールディングした二次構造の下に示す。ｂ）変異体は、Ｊｏｈｎ ＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊｒ．博士により開発された相同性モデル化ソフトウェア（私信）を使用してもまたモデル化した。 位置１５１８および１５１９のモデル化突然変異を描く。位置１５１８および１５１９の全部の可能な単一突然変異を、高度好熱菌（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）３０Ｓ結晶構造（Ｔｕｎｇら、２００２）に基づきエネルギー最小化した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１６Ｓ ｒＲＮＡモデル（Ｊｏｈｎ ＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊｒ．博士、私信）にモデル化した。置換ヌクレオチドのモデル化およびエネルギー最小化を実施した。ａ）位置１５１８のピリミジン突然変異は、それらの小さな大きさにより、ヘリックス４４と適正に相互作用しない。ＡからＧへの置換はＮ２アミノ基とヘリックス４４の間で立体衝突を引き起こす。ｂ）位置１５１９の突然変異は、位置１５１８の突然変異について見られるものに類似の、ヘリックス４４との立体障害を引き起こす。ヘリックスとの可能な相互作用を破壊する位置１５１８および１５１９での突然変異。 位置１５１６、１５１８および１５１９のメチル基による疎水性ポケットの形成を描く。この疎水性ポケットは７９３を含有する。この相互作用は、ヘリックス４４および４５との追加の相互作用のため７９０ループの位置を定めうる。 表５．１を描く。 表５．２を描く。 全部の保存された位置が標識されている大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１６Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を描く。突然変異なし（赤色）、１個の突然変異（緑色）、２個の突然変異（青色）および３個の突然変異（赤紫色）を伴う位置を彩色する。黒線は同定された領域を示し、そして領域番号（ｒ１）を示す。１６Ｓ ｒＲＮＡの結合部（Ｊ）を標識する。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３０Ｓサブユニットの結晶構造モデルを描く。高度好熱菌（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の結晶構造（ＰＤＢ ｉｄ １Ｍ５Ｇ）に基づく大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３０Ｓサブユニットのモデルを、Ｊｏｈｎ ＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊｒ．博士により書かれたソフトウェア（私信）によりエネルギー最小化し、そしてクラスターを同定するのに使用した。保存されている位置を図６．１に類似に彩色する。リボソームタンパク質は茶色に彩色する。ａ）３０Ｓサブユニットを界面側から見、そして部分を標識する。ｂ）ａ）から１８０°回転した 突然変異ライブラリーで同定されたクラスターを描く。図６．１でのとおり色分けされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１６Ｓ ｒＲＮＡ二次構造。同定されるクラスターを円で囲みかつ該クラスターの形成に関与する他領域と結合する。クラスターの番号付けは図６．２でと同一である。 表６．１を描く。 表６．２を描く。

Claims (83)

  1. 式Ｉ：
    Figure 2008544744
     ［式中、各存在について独立に
    Ｔは、核酸配列、配列番号１〜６４、または配列番号１〜６４のいずれか１つに対する約８５％以上若しくはそれに等しい相同性をもつ配列よりなる群から選択され；
    Ｌは、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニン、テキサスレッドマレイミドおよびテトラメチルローダミンよりなる群から選択される１置換基で場合によっては置換されている、アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される核酸であり；
    ｎは１〜１１の間の整数であり；ならびに
    ｍは０〜４０の間の整数である］
    により表される核酸。
  2. Ｌが未置換である、請求項１に記載の核酸。
  3. ｎが１、２、３若しくは５である、請求項１に記載の核酸。
  4. Ｔが、核酸配列、配列番号１〜６４、または配列番号１〜６４のいずれか１つに対する約９０％以上若しくはそれに等しい相同性をもつ配列よりなる群から選択される、請求項１に記載の核酸。
  5. Ｔが、核酸配列、配列番号１〜６４、または配列番号１〜６４のいずれか１つに対する約９５％以上若しくはそれに等しい相同性をもつ配列よりなる群から選択される、請求項１に記載の核酸。
  6. Ｔが、核酸配列、配列番号１〜６４、または配列番号１〜６４のいずれか１つに対する約９９％以上若しくはそれに等しい相同性をもつ配列よりなる群から選択される、請求項１に記載の核酸。
  7. Ｔが配列番号１〜６４よりなる群から選択される、請求項１に記載の核酸。
  8. 式ＩＩ：
    Figure 2008544744
     ［式中、各存在について独立に、
    Ｔは、配列番号３、１２、２３、５０および５１よりなる群から選択され；
    Ｌは、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニン、テキサスレッドマレイミドおよびテトラメチルローダミンよりなる群から選択される１置換基で場合によっては置換されている、アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される核酸であり；
    Ｚ１およびＺ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、ビオチン、フルオレセイン、テトラ
    クロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニンおよび樹脂ビーズよりなる群から選択され；ならびに
    ｍおよびｎは０〜４０の間の整数である］
    により表される核酸。
  9. Ｔが配列番号３である、請求項８に記載の核酸。
  10. Ｔが配列番号１２である、請求項８に記載の核酸。
  11. Ｔが配列番号２３である、請求項８に記載の核酸。
  12. Ｔが配列番号５０である、請求項８に記載の核酸。
  13. Ｔが配列番号５１である、請求項８に記載の核酸。
  14. Ｚ１がフルオレセインである、請求項８〜１３のいずれか１つに記載の核酸。
  15. Ｚ２がビオチンである、請求項８〜１４のいずれか１つに記載の核酸。
  16. Ｌが、未置換のアデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される、請求項８〜１５のいずれか１つに記載の核酸。
  17. ｍおよびｎが０〜２５の間の整数である、請求項８〜１６のいずれか１つに記載の核酸。
  18. ｍおよびｎが５〜１５の間の整数である、請求項８〜１７のいずれか１つに記載の核酸。
  19. 式ＩＩＩ：
    Figure 2008544744
     ［式中、各存在について独立に、
    Ｔ１およびＴ２は、配列番号１５、１６、３２、３４、３６、３７、４０、４１、５６、５７、６０および６１よりなる群から選択され；
    Ｌは、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニン、テキサスレッドマレイミドおよびテトラメチルローダミンよりなる群から選択される１置換基で場合によっては置換されている、アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される核酸であり；
    Ｚ１およびＺ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニンおよび樹脂ビーズよりなる群から選択され；ならびに
    ｍ、ｎおよびｐは０〜４０の間の整数である］
    により表される核酸。
  20. Ｔ１が配列番号１５であり；およびＴ２が配列番号１６である、請求項１９に記載の核酸。
  21. ｎが４である、請求項２０に記載の核酸。
  22. Ｔ１が配列番号３２であり；およびＴ２が配列番号３４である、請求項１９に記載の核酸。
  23. ｎが３１である、請求項２２に記載の核酸。
  24. Ｔ１が配列番号３６であり；およびＴ２が配列番号３７である、請求項１９に記載の核酸。
  25. ｎが３である、請求項２４に記載の核酸。
  26. Ｔ１が配列番号４０であり；およびＴ２が配列番号４１である、請求項１９に記載の核酸。
  27. ｎが２である、請求項２６に記載の核酸。
  28. Ｔ１が配列番号６０であり；およびＴ２が配列番号６１である、請求項１９に記載の核酸。
  29. ｎが１５である、請求項２８に記載の核酸。
  30. Ｚ１がフルオレセインである、請求項１９〜２９のいずれか１つに記載の核酸。
  31. Ｚ２がビオチンである、請求項１９〜３０のいずれか１つに記載の核酸。
  32. Ｌが、未置換のアデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される、請求項１９〜３１のいずれか１つに記載の核酸。
  33. ｍおよびｐが０〜２５の間の整数である、請求項１９〜３２のいずれか１つに記載の核酸。
  34. ｍおよびｐが５〜１５の間の整数である、請求項１９〜３３のいずれか１つに記載の核酸。
  35. 式ＶＩ：
    Figure 2008544744
     ［式中、各存在について独立に、
    Ｔ１、Ｔ２およびＴ３は、配列番号７、１３、１４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３５、３８、３９、４２、６２、６３および６４よりなる群から選択され；
    Ｌは、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニン、テキサスレッドマレイミドおよびテトラメチルローダミンよりなる群から選択される１置換基で場合によっては置換されている、アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される核酸であり；
    Ｚ１およびＺ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニンおよび樹脂ビーズよりなる群から選択され；ならびに
    ｍ、ｎ、ｐおよびｑは０〜４０の間の整数である］
    により表される核酸。
  36. Ｔ１が配列番号２５であり；Ｔ２が配列番号２６であり；およびＴ３が配列番号２７である、請求項３５に記載の核酸。
  37. ｎが１４である、請求項３６に記載の核酸。
  38. ｐが７である、請求項３６若しくは３７に記載の核酸。
  39. Ｔ１が配列番号７であり；Ｔ２が配列番号１３であり；およびＴ３が配列番号１４である、請求項２５に記載の核酸。
  40. ｎが６である、請求項３９に記載の核酸。
  41. ｐが３である、請求項３９若しくは４０に記載の核酸。
  42. Ｔ１が配列番号２９であり；Ｔ２が配列番号３０であり；およびＴ３が配列番号３１である、請求項２５に記載の核酸。
  43. ｎが７である、請求項４０に記載の核酸。
  44. ｐが４である、請求項４２若しくは４３に記載の核酸。
  45. Ｔ１が配列番号２８であり；Ｔ２が配列番号３９であり；およびＴ３が配列番号４２である、請求項２５に記載の核酸。
  46. ｎが７である、請求項４５に記載の核酸。
  47. ｐが２８である、請求項４６若しくは４５に記載の核酸。
  48. Ｔ１が配列番号３３であり；Ｔ２が配列番号３５であり；およびＴ３が配列番号３８である、請求項２５に記載の核酸。
  49. ｐが２４である、請求項４８に記載の核酸。
  50. Ｔ１が配列番号６２であり；Ｔ２が配列番号６３であり；およびＴ３が配列番号６４である、請求項２５に記載の核酸。
  51. ｎが１０である、請求項４８に記載の核酸。
  52. Ｚ１がフルオレセインである、請求項３５〜５１のいずれか１つに記載の核酸。
  53. Ｚ２がビオチンである、請求項３５〜５２のいずれか１つに記載の核酸。
  54. Ｌが、未置換のアデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される、請求項３５〜５３のいずれか１つに記載の核酸。
  55. ｍおよびｑが０〜２５の間の整数である、請求項３５〜５４のいずれか１つに記載の核酸。
  56. ｍおよびｑが５〜１５の間の整数である、請求項３５〜５５のいずれか１つに記載の核酸。
  57. 式Ｖ：
    Figure 2008544744
     ［式中、各存在について独立に、
    Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５は、配列番号４、８、９、１０、１１、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９よりなる群から選択され；
    Ｌは、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニン、テキサスレッドマレイミドおよびテトラメチルローダミンよりなる群から選択される１置換基で場合によっては置換されている、アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される核酸であり；
    Ｚ１およびＺ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Ｃｙ３アミダイト、Ｃｙ５アミダイト、ジゴキシゲニンおよび樹脂ビーズよりなる群から選択され；ならびに
    ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓは０〜４０の間の整数である］
    により表される核酸。
  58. Ｔ１が配列番号４であり；Ｔ２が配列番号８であり；Ｔ３が配列番号９であり；Ｔ４が配列番号１０であり；およびＴ５が配列番号１１である、請求項５７に記載の核酸。
  59. ｐが２である、請求項５８に記載の核酸。
  60. ｑが１７である、請求項５７若しくは５８に記載の核酸。
  61. ｒが１５である、請求項５７、５８若しくは５９のいずれか１つに記載の核酸。
  62. Ｔ１が配列番号４３であり；Ｔ２が配列番号４４であり；Ｔ３が配列番号５５であり；Ｔ４が配列番号５６であり；およびＴ５が配列番号５７である、請求項５７に記載の核酸。
  63. ｎが２である、請求項６２に記載の核酸。
  64. ｒが３である、請求項６２若しくは６３に記載の核酸。
  65. Ｔ１が配列番号４５であり；Ｔ２が配列番号４６であり；Ｔ３が配列番号５４であり；Ｔ４が配列番号５８であり；およびＴ５が配列番号５９である、請求項５７に記載の核酸。
  66. ｎが１６である、請求項６５に記載の核酸。
  67. ｒが６である、請求項６５若しくは６６に記載の核酸。
  68. Ｔ１が配列番号４７であり；Ｔ２が配列番号４８であり；Ｔ３が配列番号４９であり；Ｔ４が配列番号５２であり；およびＴ５が配列番号５３である、請求項５７に記載の核酸。
  69. ｎが７である、請求項６８に記載の核酸。
  70. ｐが３７である、請求項６８若しくは６９に記載の核酸。
  71. ｒが７である、請求項６８、６９若しくは７０のいずれか１つに記載の核酸。
  72. Ｚ１がフルオレセインである、請求項５７〜７１のいずれか１つに記載の核酸。
  73. Ｚ２がビオチンである、請求項５７〜７２のいずれか１つに記載の核酸。
  74. Ｌが、未置換のアデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンよりなる群から選択される、請求項５７〜７３のいずれか１つに記載の核酸。
  75. ｍおよびｓが０〜２５の間の整数である、請求項５７〜７４のいずれか１つに記載の核酸。
  76. ｍおよびｓが５〜１５の間の整数である、請求項５７〜７５のいずれか１つに記載の核酸。
  77. 核酸の蛍光を測定してそれにより第一の蛍光示度を確立する段階；
    試験化合物を前記核酸と接触させる段階、および生じる蛍光を測定してそれにより第二の蛍光示度を確立する段階；
    前記第一の蛍光示度と前記第二の蛍光示度の間の差違を決定する段階；ならびに
    前記第一の蛍光示度と前記第二の蛍光示度の間の差違がゼロでない化合物を選択して、それにより作用物質を同定する段階
    を含んでなる、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ若しくはＶの核酸に結合する作用物質の同定方法。
  78. 同定された作用物質を改変してそれにより改変された作用物質を形成する段階；ならびに
    前記改変された作用物質を前記核酸と接触させる段階、および生じる蛍光を測定してそれにより改変された第二の蛍光示度を確立する段階；
    前記第一の蛍光示度と前記改変された第二の蛍光示度の間の差違を決定する段階；ならびに
    前記第一の蛍光示度と前記第二の改変された蛍光示度の間の差違がゼロでない化合物を選択して、それにより改変された作用物質を同定する段階
    をさらに含んでなる、請求項７７に記載の方法。
  79. 式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ若しくはＶの核酸の蛍光を測定してそれにより第一の蛍光示度を確立すること；
    試験化合物を前記核酸と接触させること、および生じる蛍光を測定してそれにより第二の蛍光示度を確立すること；
    前記第一の蛍光示度と前記第二の蛍光示度の間の差違を決定すること；
    前記第一の蛍光示度と前記第二の蛍光示度の間の差違がゼロでない化合物を選択して、それにより作用物質を同定すること；
    細胞、細胞抽出液若しくは精製されたリボソームに作用物質を投与することにより、該作用物質の阻害特性をアッセイすること；ならびに
    タンパク質合成を検出することであって、ここで、タンパク質合成の減少は該作用物質がタンパク質合成の阻害剤であることを示す、
    を含んでなる、タンパク質合成の阻害剤の同定方法。
  80. 作用物質の阻害特性をアッセイすることが、タンパク質合成を検出することを含んでなる、請求項７９に記載の方法。
  81. 作用物質の阻害特性をアッセイすることが、ｍＲＮＡ翻訳を阻害することについての阻害定数を決定することを含んでなる、請求項７９に記載の方法。
  82. 請求項７７〜８１のいずれか１つに記載の方法により得られる化合物。
  83. 請求項８２に記載の化合物のそれの必要な患者への投与方法。
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