JP2008306974A - Ｈｃｖ遺伝子型判定方法、並びに、これに用いるｌｎａプローブ及びキット - Google Patents
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Abstract
【課題】ＨＣＶ遺伝子型を、簡便な工程、短時間、低コストで、高精度に同定できる、ＨＣＶ遺伝子型の判定方法を提供する。また、該方法に好適に用いることができるＬＮＡプローブ及びキットを提供する。
【解決手段】（１）特定の塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を鋳型として、特定の別の塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、特定の塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて第二の遺伝子増幅反応を行う工程と、（２）前記第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出する工程とを含むことを特徴とするＨＣＶ遺伝子型判定方法、並びに、これに用いるＬＮＡプローブ及びキット。
【選択図】図１
【解決手段】（１）特定の塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を鋳型として、特定の別の塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、特定の塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて第二の遺伝子増幅反応を行う工程と、（２）前記第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出する工程とを含むことを特徴とするＨＣＶ遺伝子型判定方法、並びに、これに用いるＬＮＡプローブ及びキット。
【選択図】図１
Description
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の遺伝子型を判定する方法、並びに、これに用いるＬＮＡプローブ及びキットに関する。
Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ；ＨＣＶ）は、輸血後非Ａ非Ｂ肝炎の主たる原因ウイルスで、約９，５００塩基のプラス鎖ＲＮＡをゲノムとして持っている。厚生労働省の統計によると、日本での２０００年におけるＨＣＶのキャリア数は、１５０万人以上であると推計されている。ＨＣＶに感染した場合は、一過性の急性肝炎を経た後に、慢性肝炎、肝硬変、肝癌への進展傾向が強く、日本における原発性肝癌のおおよそ８０％がＨＣＶ関連肝癌であると考えられている。ＨＣＶは、塩基配列の相同性によって遺伝子型が分類され、全世界では３０種類程度に分類される。日本においては、日本人に感染が認められる遺伝子型及び日本国内で検出された遺伝子型として、１ａ型、１ｂ型、２ａ型、２ｂ型、３ａ型の５つの遺伝子型が確認されている。日本における前記５つの遺伝子型の割合としては、１ｂ型、２ａ型及び２ｂ型がほとんどを占めており、１ａ型及び３ａ型はわずかである。
現在、ＨＣＶによる慢性肝炎の治療には、主にインターフェロン（ＩＦＮ）が用いられており、ＩＦＮとリバビリンとの併用療法は特に効果的であることが知られている。
なお、ＩＦＮによる治療効果は、ＨＣＶのウイルス量と遺伝子型とに影響されることが知られている。一般に、患者が保有するＨＣＶのウイルス量が少ないほど、ＩＦＮの治療効果が高い。また、ＩＦＮの治療効果は、ＨＣＶが３ａ型の場合には高く、２ａ型、２ｂ型の場合にはやや高く、１ａ型、１ｂ型の場合には低いことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。したがって、ＩＦＮによる治療を開始する前に、患者が保有するＨＣＶのウイルス量を測定したり、遺伝子型を同定したりすることによって、ＩＦＮの治療効果をある程度予測することができる。また、ＩＦＮによる治療中又は治療後に、患者が保有するＨＣＶのウイルス量を測定したり、遺伝子型を同定したりすることによって、ＩＦＮの治療効果の判定を行うことができる。
なお、ＩＦＮによる治療効果は、ＨＣＶのウイルス量と遺伝子型とに影響されることが知られている。一般に、患者が保有するＨＣＶのウイルス量が少ないほど、ＩＦＮの治療効果が高い。また、ＩＦＮの治療効果は、ＨＣＶが３ａ型の場合には高く、２ａ型、２ｂ型の場合にはやや高く、１ａ型、１ｂ型の場合には低いことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。したがって、ＩＦＮによる治療を開始する前に、患者が保有するＨＣＶのウイルス量を測定したり、遺伝子型を同定したりすることによって、ＩＦＮの治療効果をある程度予測することができる。また、ＩＦＮによる治療中又は治療後に、患者が保有するＨＣＶのウイルス量を測定したり、遺伝子型を同定したりすることによって、ＩＦＮの治療効果の判定を行うことができる。
現在、ＨＣＶのウイルス量を測定する方法としては、体外診断用キットであるコバスアンプリコアＨＣＶモニター（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社製）を用いて、血清中のＨＣＶのＲＮＡ量を測定する方法が代表的である。前記方法は、具体的には、（１）患者から採取された組織又は血液からＨＣＶのゲノムＲＮＡを抽出する工程、（２）逆転写反応による標的ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成工程、（３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるｃＤＮＡの増幅反応工程、（４）ＤＮＡプローブと増幅ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応工程、（５）発色反応による増幅ＤＮＡの定量工程、からなる方法である。なお、前記（２）乃至（３）工程は、ワンステップのＲＴ−ＰＣＲとして行われる反応であって、前記（２）乃至（３）工程において用いられるプライマー対（第一のプライマー対）は、共通のものとして、キットに添付されている。前記第１のプライマー対を構成する２種類のプライマーは、配列番号１及び２で表される塩基配列からなることが開示されている。
前記コバスアンプリコアＨＣＶモニターは、高い精度で簡便にＨＣＶのＲＮＡ量を定量できるので、国内の９０％以上の検査機関で使用されていると推定される。
前記コバスアンプリコアＨＣＶモニターは、高い精度で簡便にＨＣＶのＲＮＡ量を定量できるので、国内の９０％以上の検査機関で使用されていると推定される。
ＨＣＶ遺伝子型の同定方法としては、特異的なプライマーやシークエンスを用いた方法など、様々な方法が報告されている。ＨＣＶ遺伝子型を同定するための既製品のキットとしては、ＨＣＶ ＧＥＮＯＴＹＰＥ プライマーキット（株式会社 特殊免疫研究所製）が挙げられる。前記キットを用いたＨＣＶ遺伝子型の同定方法は、主に、ＨＣＶのＲＮＡを抽出する工程、逆転写反応工程（約１時間２０分）、１ｓｔ ＰＣＲ工程（約２時間）、２ｎｄ ＰＣＲ工程（約１時間１５分）、電気泳動工程（４０分）、エチジウムブロマイドによる染色工程（約１５分）、からなり、合計で５〜６時間かかる方法である。また、他の従来の方法も、多くの工程を必要とするものであり、時間がかかるなどの問題があった。
一方で、遺伝子の変異を高い精度で検出する技術として、近年、ＬＮＡプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法が開発され、遺伝子診断分野への応用が期待されている。ＬＮＡプローブは、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸塩基のみからなる一般的なプローブに比べ、Ｔｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値が高く、また、１塩基のミスマッチでもＴｍ値が大幅に低下するという特性を有している。さらに、ＬＮＡプローブは、核酸鎖にハイブリダイズするだけでなく、ハイブリダイズした後に、プライマーとして核酸伸長反応の開始点となりうる特性や、５’→３’エキソヌクレアーゼに対して分解される特性を有している（例えば、非特許文献２参照）。
しかしながら、遺伝子診断分野における診断対象は多様であり、前記ＬＮＡプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法を遺伝子診断に応用する場合に、選択された診断対象や、その応用方法によっては、予想外に顕著な効果をもたらす可能性がある。
Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｙｏ Ｖｏｌ．６２ Ｓｕｐｐｌ．７（２００４） Ｍａｔｔｈｅｗ Ｐ．ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌａｒｉｓａ Ｍ．Ｈａｕｐｔ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＬＮＡ） ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＮＰ） ｇｅｎｏｔｙｐｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３２ Ｎｏ．６（２００４）
しかしながら、遺伝子診断分野における診断対象は多様であり、前記ＬＮＡプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法を遺伝子診断に応用する場合に、選択された診断対象や、その応用方法によっては、予想外に顕著な効果をもたらす可能性がある。
Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｙｏ Ｖｏｌ．６２ Ｓｕｐｐｌ．７（２００４） Ｍａｔｔｈｅｗ Ｐ．ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌａｒｉｓａ Ｍ．Ｈａｕｐｔ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＬＮＡ） ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＮＰ） ｇｅｎｏｔｙｐｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３２ Ｎｏ．６（２００４）
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ＨＣＶ遺伝子型を高い精度で判定することができ、簡便な工程で、短時間に、低コストで行うことができる、ＨＣＶ遺伝子型の判定方法を提供することを目的とする。また、本発明は、この判定方法に好適に用いることができるＬＮＡプローブ及びキットを提供することを目的とする。
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、コバスアンプリコアＨＣＶモニターを用いてＨＣＶのＲＮＡ量の測定が終わった試料を鋳型として、ＬＮＡプローブを用いたリアルタイムＰＣＲを行ったところ、ＨＣＶ遺伝子型を高い精度で同定することができたという知見である。
前記したように、ＨＣＶ遺伝子型の同定方法としては、ＨＣＶ ＧＥＮＯＴＹＰＥ プライマーキット（株式会社 特殊免疫研究所製）を初めとして、特異的なプライマーやシークエンスを用いた方法など、様々な方法が報告されている。
しかしながら、コバスアンプリコアＨＣＶモニターの測定が終わった試料をリアルタイムＰＣＲの鋳型として用いることで、その相乗的な効果により、簡便な工程で、短時間に、低コストでＨＣＶ遺伝子型の同定を行うことができ、そのうえで、高い精度でＨＣＶ遺伝子型を同定できることは、従来全く知られておらず、本発明者らの新たな知見である。
前記したように、ＨＣＶ遺伝子型の同定方法としては、ＨＣＶ ＧＥＮＯＴＹＰＥ プライマーキット（株式会社 特殊免疫研究所製）を初めとして、特異的なプライマーやシークエンスを用いた方法など、様々な方法が報告されている。
しかしながら、コバスアンプリコアＨＣＶモニターの測定が終わった試料をリアルタイムＰＣＲの鋳型として用いることで、その相乗的な効果により、簡便な工程で、短時間に、低コストでＨＣＶ遺伝子型の同定を行うことができ、そのうえで、高い精度でＨＣＶ遺伝子型を同定できることは、従来全く知られておらず、本発明者らの新たな知見である。
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ （１）配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を鋳型として、
配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、
（ａ）第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出するためのプローブ、
（ｂ）第二の遺伝子増幅反応のための第二のプライマー対のうち、少なくとも一つのプライマー、
のいずれかとして用いて前記第二の遺伝子増幅反応を行う工程と、
（２）前記第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出する工程とを含むことを特徴とするＨＣＶ遺伝子型判定方法である。
＜２＞ （１）配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を鋳型として、
配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、
（ａ）第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出するためのプローブ、
（ｂ）第二の遺伝子増幅反応のための第二のプライマー対のうち、少なくとも一つのプライマー、
のいずれかとして用いて前記第二の遺伝子増幅反応を行う工程と、
（２）前記第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出する工程とを含むことを特徴とするＨＣＶ遺伝子型判定方法である。
＜３＞ （１）配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を鋳型として、
配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列からなり、少なくとも１塩基がＬＮＡからなるＬＮＡプローブを、
（ａ）第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出するためのプローブ、
（ｂ）第二の遺伝子増幅反応のための第二のプライマー対のうち、少なくとも一つのプライマー、
のいずれかとして用いて前記第二の遺伝子増幅反応を行う工程と、
（２）前記第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出する工程とを含むことを特徴とするＨＣＶ遺伝子型判定方法である。
＜４＞ （１）配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を鋳型として、
配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、少なくとも１塩基がＬＮＡからなるＬＮＡプローブを、
（ａ）第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出するためのプローブ、
（ｂ）第二の遺伝子増幅反応のための第二のプライマー対のうち、少なくとも一つのプライマー、
のいずれかとして用いて前記第二の遺伝子増幅反応を行う工程と、
（２）前記第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出する工程とを含むことを特徴とするＨＣＶ遺伝子型判定方法である。
＜５＞ 少なくとも１つのＬＮＡプローブが、配列番号８〜１３のいずれかで表される塩基配列を含む＜３＞に記載の方法である。
＜６＞ 少なくとも１つのＬＮＡプローブが、配列番号８〜１３のいずれかで表される塩基配列に相補的な塩基配列を含む＜４＞に記載の方法である。
＜７＞ ＬＮＡプローブが、蛍光物質で標識されてなる＜３＞から＜６＞のいずれかに記載の方法である。
＜８＞ ＬＮＡプローブが、消光物質で標識されてなる＜３＞から＜７＞のいずれかに記載の方法である。
＜９＞ 第二の遺伝子増幅反応がＰＣＲ法である＜３＞から＜８＞のいずれかに記載の方法である。
＜１０＞ ＰＣＲ法がリアルタイムＰＣＲ法である＜９＞に記載の方法である。
＜１１＞ 配列番号８及び１２で表される塩基配列を含むＬＮＡプローブを用いて、ＨＣＶ遺伝子型が１ａ型であるか否かを判定する、＜３＞から＜１０＞のいずれかに記載の方法である。
＜１２＞ 配列番号８及び１３で表される塩基配列を含むＬＮＡプローブを用いて、ＨＣＶ遺伝子型が１ｂ型であるか否かを判定する、＜３＞から＜１０＞のいずれかに記載の方法である。
＜１３＞ 配列番号９及び１２で表される塩基配列を含むＬＮＡプローブを用いて、ＨＣＶ遺伝子型が２ａ型であるか否かを判定する、＜３＞から＜１０＞のいずれかに記載の方法である。
＜１４＞ 配列番号１０及び１２で表される塩基配列を含むＬＮＡプローブを用いて、ＨＣＶ遺伝子型が２ｂ型であるか否かを判定する、＜３＞から＜１０＞のいずれかに記載の方法である。
＜１５＞ 配列番号１１で表される塩基配列を含むＬＮＡプローブを用いて、ＨＣＶ遺伝子型が３ａ型であるか否かを判定する、＜３＞から＜１０＞のいずれかに記載の方法である。
＜１６＞ 配列番号８から１３で表される塩基配列を含むＬＮＡプローブを用いて、ＨＣＶ遺伝子型が１ａ型、１ｂ型、２ａ型、２ｂ型及び３ａ型のいずれかであるかを同定する、＜３＞から＜１０＞のいずれかに記載の方法である。
＜１７＞ ＜３＞から＜１６＞のいずれかに記載の方法を行うためのＬＮＡプローブであって、
配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列からなり、少なくとも１塩基がＬＮＡからなるＬＮＡプローブである。
＜１８＞ ＜３＞から＜１６＞のいずれかに記載の方法を行うためのＬＮＡプローブであって、
配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、少なくとも１塩基がＬＮＡからなるＬＮＡプローブである。
＜１９＞ 配列番号８〜１３のいずれかで表される塩基配列を含む請求項１７に記載のＬＮＡプローブである。
＜２０＞ 配列番号８〜１３のいずれかで表される塩基配列に相補的な塩基配列を含む＜１８＞に記載のＬＮＡプローブである。
＜２１＞ ＜３＞から＜１６＞のいずれかに記載の方法を行うためのＨＣＶ遺伝子型判定キットであって、＜１７＞から＜２０＞のいずれかに記載のＬＮＡプローブを含むＨＣＶ遺伝子型判定キットである。
＜１＞ （１）配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を鋳型として、
配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、
（ａ）第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出するためのプローブ、
（ｂ）第二の遺伝子増幅反応のための第二のプライマー対のうち、少なくとも一つのプライマー、
のいずれかとして用いて前記第二の遺伝子増幅反応を行う工程と、
（２）前記第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出する工程とを含むことを特徴とするＨＣＶ遺伝子型判定方法である。
＜２＞ （１）配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を鋳型として、
配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、
（ａ）第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出するためのプローブ、
（ｂ）第二の遺伝子増幅反応のための第二のプライマー対のうち、少なくとも一つのプライマー、
のいずれかとして用いて前記第二の遺伝子増幅反応を行う工程と、
（２）前記第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出する工程とを含むことを特徴とするＨＣＶ遺伝子型判定方法である。
＜３＞ （１）配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を鋳型として、
配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列からなり、少なくとも１塩基がＬＮＡからなるＬＮＡプローブを、
（ａ）第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出するためのプローブ、
（ｂ）第二の遺伝子増幅反応のための第二のプライマー対のうち、少なくとも一つのプライマー、
のいずれかとして用いて前記第二の遺伝子増幅反応を行う工程と、
（２）前記第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出する工程とを含むことを特徴とするＨＣＶ遺伝子型判定方法である。
＜４＞ （１）配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を鋳型として、
配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、少なくとも１塩基がＬＮＡからなるＬＮＡプローブを、
（ａ）第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出するためのプローブ、
（ｂ）第二の遺伝子増幅反応のための第二のプライマー対のうち、少なくとも一つのプライマー、
のいずれかとして用いて前記第二の遺伝子増幅反応を行う工程と、
（２）前記第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出する工程とを含むことを特徴とするＨＣＶ遺伝子型判定方法である。
＜５＞ 少なくとも１つのＬＮＡプローブが、配列番号８〜１３のいずれかで表される塩基配列を含む＜３＞に記載の方法である。
＜６＞ 少なくとも１つのＬＮＡプローブが、配列番号８〜１３のいずれかで表される塩基配列に相補的な塩基配列を含む＜４＞に記載の方法である。
＜７＞ ＬＮＡプローブが、蛍光物質で標識されてなる＜３＞から＜６＞のいずれかに記載の方法である。
＜８＞ ＬＮＡプローブが、消光物質で標識されてなる＜３＞から＜７＞のいずれかに記載の方法である。
＜９＞ 第二の遺伝子増幅反応がＰＣＲ法である＜３＞から＜８＞のいずれかに記載の方法である。
＜１０＞ ＰＣＲ法がリアルタイムＰＣＲ法である＜９＞に記載の方法である。
＜１１＞ 配列番号８及び１２で表される塩基配列を含むＬＮＡプローブを用いて、ＨＣＶ遺伝子型が１ａ型であるか否かを判定する、＜３＞から＜１０＞のいずれかに記載の方法である。
＜１２＞ 配列番号８及び１３で表される塩基配列を含むＬＮＡプローブを用いて、ＨＣＶ遺伝子型が１ｂ型であるか否かを判定する、＜３＞から＜１０＞のいずれかに記載の方法である。
＜１３＞ 配列番号９及び１２で表される塩基配列を含むＬＮＡプローブを用いて、ＨＣＶ遺伝子型が２ａ型であるか否かを判定する、＜３＞から＜１０＞のいずれかに記載の方法である。
＜１４＞ 配列番号１０及び１２で表される塩基配列を含むＬＮＡプローブを用いて、ＨＣＶ遺伝子型が２ｂ型であるか否かを判定する、＜３＞から＜１０＞のいずれかに記載の方法である。
＜１５＞ 配列番号１１で表される塩基配列を含むＬＮＡプローブを用いて、ＨＣＶ遺伝子型が３ａ型であるか否かを判定する、＜３＞から＜１０＞のいずれかに記載の方法である。
＜１６＞ 配列番号８から１３で表される塩基配列を含むＬＮＡプローブを用いて、ＨＣＶ遺伝子型が１ａ型、１ｂ型、２ａ型、２ｂ型及び３ａ型のいずれかであるかを同定する、＜３＞から＜１０＞のいずれかに記載の方法である。
＜１７＞ ＜３＞から＜１６＞のいずれかに記載の方法を行うためのＬＮＡプローブであって、
配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列からなり、少なくとも１塩基がＬＮＡからなるＬＮＡプローブである。
＜１８＞ ＜３＞から＜１６＞のいずれかに記載の方法を行うためのＬＮＡプローブであって、
配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、少なくとも１塩基がＬＮＡからなるＬＮＡプローブである。
＜１９＞ 配列番号８〜１３のいずれかで表される塩基配列を含む請求項１７に記載のＬＮＡプローブである。
＜２０＞ 配列番号８〜１３のいずれかで表される塩基配列に相補的な塩基配列を含む＜１８＞に記載のＬＮＡプローブである。
＜２１＞ ＜３＞から＜１６＞のいずれかに記載の方法を行うためのＨＣＶ遺伝子型判定キットであって、＜１７＞から＜２０＞のいずれかに記載のＬＮＡプローブを含むＨＣＶ遺伝子型判定キットである。
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、ＨＣＶ遺伝子型を高い精度で判定することができ、簡便な工程で、短時間に、低コストで行うことができる、ＨＣＶ遺伝子型の判定方法を提供することができる。また、本発明によると、この判定方法に好適に用いることができるＬＮＡプローブ及びキットを提供することができる。
（ＨＣＶ遺伝子型判定方法）
本発明のＨＣＶ遺伝子型判定方法は、下記工程（１）、（２）を含んでなり、更に必要に応じてその他の工程を含む。
工程（１）：
配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を鋳型として、後記する所定のＬＮＡプローブ（本発明の「オリゴヌクレオチド」に相当する。）を用いて、第二の遺伝子増幅反応を行う工程。
工程（２）：
前記第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出する工程。
本発明のＨＣＶ遺伝子型判定方法は、下記工程（１）、（２）を含んでなり、更に必要に応じてその他の工程を含む。
工程（１）：
配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を鋳型として、後記する所定のＬＮＡプローブ（本発明の「オリゴヌクレオチド」に相当する。）を用いて、第二の遺伝子増幅反応を行う工程。
工程（２）：
前記第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出する工程。
なお、前記判定方法における「判定」とは、一般に５つの遺伝子型に分類されるＨＣＶ遺伝子型を、少なくとも２群に分けて、判定対象のＨＣＶがいずれの群に属するかを決定することを意味する。したがって、前記「判定」には、判定対象のＨＣＶを特定の１遺伝子型に同定することも含まれる。
本明細書における「塩基配列」とは、例えば、オリゴヌクレオチド、ゲノム、プライマー、プローブ、増幅産物などの核酸鎖において、核酸や核酸類似体などの塩基が連結している順序を意味する。前記核酸としては、特に制限はなく、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられる。前記核酸類似体としては、例えば、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）などが挙げられる。
本明細書における「プライマー対」とは、一般的に広く遺伝子工学や分子生物学で使用される意味と同じであり、核酸鎖上の特定の領域を増幅するために、前記特定の領域の上流及び下流に対向してアニールするように設計された塩基配列を有する、２種類のプライマーを意味する。前記「プライマー」とは、一般的に広く遺伝子工学や分子生物学で使用される意味と同じであり、核酸伸長反応の際に鋳型にアニールし、その３’末端が前記核酸伸長反応の開始点となる一本鎖の核酸鎖である。
本明細書における「プローブ」とは、一般的に広く遺伝子工学や分子生物学で使用される意味と同じであり、具体的には、検体である核酸鎖に特異的にハイブリダイズするか否かを指標として、前記検体が検出を所望する塩基配列を有するか否かを判断するための一本鎖の核酸鎖である。ただし、前記「ＬＮＡプローブ」は、一般的な「プローブ」としての用途だけでなく、前記「プライマー」としての用途も含む。
＜工程（１）＞
−−鋳型−−
前記工程１における前記鋳型（適宜、「第二の遺伝子増幅反応における鋳型」と称する。）としては、配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
−−鋳型−−
前記工程１における前記鋳型（適宜、「第二の遺伝子増幅反応における鋳型」と称する。）としては、配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記「第一の遺伝子増幅反応」における遺伝子増幅方法としては、核酸鎖を鋳型とした相補的核酸鎖の合成により遺伝子を増幅させる反応であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法などが挙げられる。中でも、反応のための試薬や機器を容易に入手できる点で、ＰＣＲ法が好ましい。
前記第一の遺伝子増幅反応における鋳型（前記「第二の遺伝子増幅反応における鋳型」とは異なる。）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記第一のプライマー対を用いた前記第一の遺伝子増幅反応により増幅される点で、ＨＣＶのゲノムＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡであることが特に好ましい。
前記ＨＣＶのゲノムＲＮＡの由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＨＣＶ感染を検査される患者（以下、「被検者」と称する。）から組織又は血液を採取して、採取された前記組織又は血液から抽出されたゲノムＲＮＡが特に好ましい。
前記「第一のプライマー対」を構成する塩基としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸により構成されていてもよく、ＬＮＡなどの核酸類似体により構成されていてもよく、これらの組合せによって構成されていてもよいが、扱いが容易な点で、ＤＮＡにより構成されることが好ましい。
前記「第一のプライマー対」を構成する２種類のプライマーの塩基配列としては、配列番号１及び２で表される塩基配列を含んでいる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、配列番号１及び２で表される塩基配列の５’末端及び／又は３’末端に、核酸や核酸類似体が数塩基付加されていてもよい。
前記第一の遺伝子増幅反応を触媒する酵素としては、核酸鎖を鋳型として相補的ＤＮＡを合成することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが特に好ましい。前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限はなく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔｔｈポリメラーゼなど）、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）など）、などが挙げられる。
なお、ゲノムＲＮＡを用いて遺伝子増幅反応を行うためには、一旦、逆転写反応によりゲノムＲＮＡからｃＤＮＡを合成しておく必要がある。この場合、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとして、前記逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを用いれば、逆転写反応と第一の遺伝子増幅反応とを連続的に行える点で好ましい。
前記第一の遺伝子増幅反応における反応液中には、前記鋳型（第一の遺伝子増幅反応における鋳型）、酵素、及び第一のプライマー対以外に、選択された遺伝子増幅方法に応じて必要なその他の成分が添加される。前記その他の成分としては、基質としての４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、マグネシウムイオン、緩衝液などが挙げられる。また、前記その他の成分としては、例えば、蛍光物質やマイクロ磁性粒子で標識されたプローブなど、第一の増幅産物を検出するための成分などが挙げられる。
前記第一の遺伝子増幅反応によれば、第一の増幅産物として、被検者が感染している未知のＨＣＶ遺伝子型に応じて増幅された配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡが得られる。なお、配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列は、ＨＣＶ遺伝子型の１ａ〜３ａ型にそれぞれ対応する同一領域の塩基配列である。それぞれの塩基配列は、ＨＣＶの５’−ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ（ＵＴＲ）であって、互いに高度に保存されている。このような高度に保存された領域に対しては、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸塩基からなる一般的なプローブが、特異的にハイブリダイズすることができない場合がある。
そこで、本発明の判定方法は、前記第一の遺伝子増幅反応により得られた第一の増幅産物を鋳型として利用し、ＬＮＡプローブを用いた第二の遺伝子増幅反応を行うことにより、被検者が感染しているＨＣＶ遺伝子型を判定する。
そこで、本発明の判定方法は、前記第一の遺伝子増幅反応により得られた第一の増幅産物を鋳型として利用し、ＬＮＡプローブを用いた第二の遺伝子増幅反応を行うことにより、被検者が感染しているＨＣＶ遺伝子型を判定する。
なお、前記したように、第二の遺伝子増幅反応における鋳型としては、配列番号１及び２で表される塩基配列をそれぞれ含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物であれば、特に制限はないが、コバスアンプリコアＨＣＶモニター（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社製）を用いれば、上記の諸条件を満たす第一の増幅産物を容易に得ることができる。さらには、コバスアンプリコアＨＣＶモニターを用いてＨＣＶのＲＮＡ量の測定が終わった試料（以下、「アンプリコア測定済試料」と称する。）を、第二の遺伝子増幅反応における鋳型として好適に利用することができる。なお、コバスアンプリコアＨＣＶモニターは、国内の多くの検査機関で使用されているものであり、通常、前記アンプリコア測定済試料は、所定の処理を施された後に廃棄される。
本発明においては、このようなアンプリコア測定済試料を用いることで、前記第一の増幅産物を取得するための操作が省略され、ＨＣＶ遺伝子型を判定するための時間を大幅に短縮することができる。また、前記アンプリコア測定済試料は元々廃棄されるものであって、容易に入手できるため、ＨＣＶ遺伝子型を判定するためのコストを大幅に低減させることができる。
前記第二の遺伝子増幅反応における鋳型として、前記アンプリコア測定済試料を使用する場合には、前記アンプリコア測定済試料を、例えば、水や溶液などで希釈して第二の遺伝子増幅反応に供することが好ましい。
前記水としては、特に制限はなく、例えば、蒸留水、再蒸留水（ＤＤＷ）、超純水、イオン交換水、滅菌水などが挙げられる。
前記溶液としては、特に制限はなく、例えば、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ） ｂｕｆｆｅｒなどが挙げられる。
前記溶液としては、特に制限はなく、例えば、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ） ｂｕｆｆｅｒなどが挙げられる。
前記アンプリコア測定済試料の希釈率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２〜１００，０００倍が好ましく、１０〜１０，０００倍がより好ましく、１００〜１，０００倍が更に好ましい。前記希釈率が、２倍以上であると、コバスアンプリコアＨＣＶモニター由来のプライマー（第一のプライマー対）やプローブが希釈されて、第二の遺伝子増幅反応の際に、前記プライマーやプローブの影響を無視できる程度に低減できる点で好ましい。また、前記希釈率が、１００，０００倍以下であると、第二の遺伝子増幅反応の際に、鋳型を一定量以上確保できる点で好ましい。
また、前記アンプリコア測定済試料から、前記アンプリコア測定済試料に含まれるＲＴ−ＰＣＲ増幅産物を精製した後に、第二の遺伝子増幅反応に供してもよい。前記精製方法としては、特に制限はなく、周知の核酸鎖精製方法から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール沈殿、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１００（タカラバイオ株式会社製）やＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた精製、などが挙げられる。
−−ＬＮＡプローブ−−
前記工程１における前記ＬＮＡプローブとは、核酸や核酸類似体などの塩基が連結している核酸鎖において、少なくとも１塩基がＬＮＡ又はＬＮＡアナログであるものを意味する。
前記工程１における前記ＬＮＡプローブとは、核酸や核酸類似体などの塩基が連結している核酸鎖において、少なくとも１塩基がＬＮＡ又はＬＮＡアナログであるものを意味する。
前記「ＬＮＡ」とは、リボヌクレオシドの２’部位の酸素原子と４’部位の炭素原子がメチレンを介して結合している２つの環状構造を有する核酸類似体を意味する。
前記「ＬＮＡアナログ」としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、例えば、リボヌクレオシドの２’部位の酸素原子と４’部位の炭素原子が酸素原子を介して結合しているオキシ−ＬＮＡ、硫黄原子を介して結合しているチオ−ＬＮＡ、窒素原子を介して結合しているアミノ−ＬＮＡなどが挙げられる。
前記「ＬＮＡアナログ」としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、例えば、リボヌクレオシドの２’部位の酸素原子と４’部位の炭素原子が酸素原子を介して結合しているオキシ−ＬＮＡ、硫黄原子を介して結合しているチオ−ＬＮＡ、窒素原子を介して結合しているアミノ−ＬＮＡなどが挙げられる。
前記ＬＮＡプローブの塩基配列としては、配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
該ＬＮＡプローブにおいては、前記４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基のうち少なくとも１塩基が、ＬＮＡであることが好ましい。前記塩基は、ＨＣＶの遺伝子型間で配列の異なる塩基である。
なお、前記ＬＮＡプローブの塩基配列としては、配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列に相補的な塩基配列であってもよい。
そして、該ＬＮＡプローブにおいては、前記４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基に相補的な塩基のうち少なくとも１塩基が、ＬＮＡであることが好ましい。前記塩基は、ＨＣＶの遺伝子型間で配列の異なる塩基である。
なお、前記ＬＮＡプローブの塩基数としては、前記したように、５塩基以上が好ましいが、８塩基以上がより好ましく、１５塩基以上が特に好ましい。前記塩基数が、５塩基以上であると、塩基配列によっては充分なＴｍ値を確保できるので、特異的に鋳型にハイブリダイズさせることができる、また、前記塩基数が、１５塩基以上であると、Ｔｍ値をより高くすることができ、より特異的に鋳型にハイブリダイズさせることができる点で好ましい。
前記ＬＮＡプローブのＴｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、４５℃以上が好ましく、５５℃以上がより好ましく、６０℃以上が更に好ましい。ＬＮＡプローブのＴｍが４５℃以上であると、特異性が向上する点で好ましい。
ここで、前記Ｔｍ値は、例えば、ＩＤＴ社ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／Ｈｏｍｅ／Ｈｏｍｅ．ａｓｐｘ）、Ｅｘｉｑｏｎ社ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｉｑｏｎ．ｃｏｍ／）に開示される算出方法に基づいて算出することができる。
ここで、前記Ｔｍ値は、例えば、ＩＤＴ社ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／Ｈｏｍｅ／Ｈｏｍｅ．ａｓｐｘ）、Ｅｘｉｑｏｎ社ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｉｑｏｎ．ｃｏｍ／）に開示される算出方法に基づいて算出することができる。
一般に、ＬＮＡプローブは、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸塩基のみからなる一般的なプローブに比べ、Ｔｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値が高く、また、１塩基のミスマッチでもＴｍ値が大幅に低下するという特性を有している。このような特性によれば、配列番号３〜７で表される塩基配列のように、異なるＨＣＶ遺伝子型において高度に保存されている塩基配列に対しても、極めて特異的にハイブリダイズできる。
さらに、ＬＮＡプローブは、核酸鎖にハイブリダイズするだけでなく、ハイブリダイズした後に、プライマーとして核酸伸長反応の開始点となりうる特性や、５’→３’エキソヌクレアーゼに対して分解される特性を有している。
さらに、ＬＮＡプローブは、核酸鎖にハイブリダイズするだけでなく、ハイブリダイズした後に、プライマーとして核酸伸長反応の開始点となりうる特性や、５’→３’エキソヌクレアーゼに対して分解される特性を有している。
前記ＬＮＡプローブを第二の増幅産物に特異的にハイブリダイズさせる条件としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
ハイブリダイズさせる温度としては、Ｔｍ値±１５℃が好ましく、Ｔｍ値±１０℃がより好ましく、Ｔｍ値±５℃が更に好ましい。
ハイブリダイズ反応に用いる試薬としては、特に制限はないが、例えば、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ファストスタートＴａｑＭａｎ プローブマスター（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）などが挙げられ、中でも、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）が好ましい。
ハイブリダイズさせる時間としては、５〜９０秒が好ましく、１０〜６０秒がより好ましく、１５〜４５秒が更に好ましい。
ハイブリダイズさせる温度としては、Ｔｍ値±１５℃が好ましく、Ｔｍ値±１０℃がより好ましく、Ｔｍ値±５℃が更に好ましい。
ハイブリダイズ反応に用いる試薬としては、特に制限はないが、例えば、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ファストスタートＴａｑＭａｎ プローブマスター（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）などが挙げられ、中でも、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）が好ましい。
ハイブリダイズさせる時間としては、５〜９０秒が好ましく、１０〜６０秒がより好ましく、１５〜４５秒が更に好ましい。
−−第二の遺伝子増幅反応−−
前記工程１における前記第二の遺伝子増幅反応としては、配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を鋳型として、後記する所定のＬＮＡプローブを用いる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記工程１における前記第二の遺伝子増幅反応としては、配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を鋳型として、後記する所定のＬＮＡプローブを用いる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記第二の遺伝子増幅反応における遺伝子増幅方法としては、核酸鎖を鋳型とした相補的核酸鎖の合成により遺伝子を増幅させる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法、ＬＡＭＰ（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が挙げられる。中でも、反応のための試薬や機器を容易に入手できる点で、ＰＣＲ法が好ましい。
前記第二の遺伝子増幅反応を触媒する酵素としては、核酸鎖を鋳型として相補的核酸鎖を合成することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが特に好ましい。前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限はなく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔｔｈポリメラーゼなど）、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）など）、などが挙げられる。
前記第二の遺伝子増幅反応の温度条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択できる。
前記第二の遺伝子増幅反応における変性の温度としては、８８〜９８℃が好ましく、９０〜９７℃がより好ましく、９２〜９６℃が更に好ましい。また、前記変性の時間としては、1〜１０秒が好ましく、２〜８秒がより好ましく、３〜５秒が更に好ましい。
前記第二の遺伝子増幅反応における伸長反応の温度としては、５５〜７５℃が好ましく、５８〜７０℃がより好ましく、６０〜６８℃が更に好ましい。前記伸長反応の時間としては、５〜９０秒が好ましく、１０〜６０秒がより好ましく、２０〜４０秒が更に好ましい。
前記第二の遺伝子増幅反応における変性の温度としては、８８〜９８℃が好ましく、９０〜９７℃がより好ましく、９２〜９６℃が更に好ましい。また、前記変性の時間としては、1〜１０秒が好ましく、２〜８秒がより好ましく、３〜５秒が更に好ましい。
前記第二の遺伝子増幅反応における伸長反応の温度としては、５５〜７５℃が好ましく、５８〜７０℃がより好ましく、６０〜６８℃が更に好ましい。前記伸長反応の時間としては、５〜９０秒が好ましく、１０〜６０秒がより好ましく、２０〜４０秒が更に好ましい。
前記温度条件のサイクル数としては、３５サイクル以上が好ましく、４０サイクル以上がより好ましく、４５サイクル以上が更に好ましい。前記サイクル数が３５以上であると、低ウイルス量の検体を検出できる点で好ましい。
前記第二遺伝子増幅反応を行う装置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サーマルサイクラーが挙げられる。前記サーマルサイクラーとしては、特に制限はないが、工程１乃至２を連続して行える点で、蛍光検出器を備えたサーマルサイクラーが好ましく、例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社製）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）などを好適に利用することができる。
ここで、前記工程１において、前記ＬＮＡプローブは、以下に示す（ａ）又は（ｂ）のいずれかとして用いられる。
（ａ）第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出するためのプローブ。
（ｂ）第二の遺伝子増幅反応のための第二のプライマー対のうち、少なくとも一つのプライマー。
以下、工程１の説明において、ＬＮＡプローブを（ａ）として用いる場合、及び、（ｂ）として用いる場合、それぞれについて、分けて説明する。
（ａ）第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出するためのプローブ。
（ｂ）第二の遺伝子増幅反応のための第二のプライマー対のうち、少なくとも一つのプライマー。
以下、工程１の説明において、ＬＮＡプローブを（ａ）として用いる場合、及び、（ｂ）として用いる場合、それぞれについて、分けて説明する。
−（ａ）ＬＮＡプローブを第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出するためのプローブとして用いる場合−
前記ＬＮＡプローブは、蛍光物質や消光物質により標識されていてもよく、標識されていなくてもよいが、標識されていることが好ましい。
前記ＬＮＡプローブが標識される形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光物質のみで標識されていてもよく、消光物質のみで標識されていてもよく、蛍光物質と消光物質との両者により標識されていてもよい。
前記蛍光物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＦＩＴＣなどが挙げられる。
前記消光物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＢＨＱ−１（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ−１）、ＢＨＱ−２（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ−２）、Ｄａｂｃｙｌなどが挙げられる。
前記ＬＮＡプローブは、蛍光物質や消光物質により標識されていてもよく、標識されていなくてもよいが、標識されていることが好ましい。
前記ＬＮＡプローブが標識される形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光物質のみで標識されていてもよく、消光物質のみで標識されていてもよく、蛍光物質と消光物質との両者により標識されていてもよい。
前記蛍光物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＦＩＴＣなどが挙げられる。
前記消光物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＢＨＱ−１（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ−１）、ＢＨＱ−２（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ−２）、Ｄａｂｃｙｌなどが挙げられる。
なお、１つのＬＮＡプローブに、蛍光物質及び消光物質の両方が標識される場合には、前記蛍光物質から発する蛍光波長と、前記消光物質が吸収する吸収波長とが、一致することが好ましい。
前記蛍光物質及び／又は消光物質が標識される部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＬＮＡプローブのＴｍ値に与える影響が少なく、塩基配列を設計しやすい点で、ＬＮＡプローブの５’末端又は３’末端であることが好ましい。
前記蛍光物質及び／又は消光物質が標識される部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＬＮＡプローブのＴｍ値に与える影響が少なく、塩基配列を設計しやすい点で、ＬＮＡプローブの５’末端又は３’末端であることが好ましい。
−−第二のプライマー対−−
前記第二の遺伝子増幅反応のための第二のプライマー対としては、前記ＬＮＡプローブの塩基配列に対応する（前記ＬＮＡプローブがハイブリダイズする）領域を増幅することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記第二の遺伝子増幅反応のための第二のプライマー対としては、前記ＬＮＡプローブの塩基配列に対応する（前記ＬＮＡプローブがハイブリダイズする）領域を増幅することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記「第二のプライマー対」を構成する塩基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸により構成されていてもよく、ＬＮＡなどの核酸類似体により構成されていてもよく、これらの組合せによって構成されていてもよいが、扱いが容易な点で、ＤＮＡにより構成されることが好ましい。
前記「第二のプライマー対」を構成する２種類のプライマーの塩基配列としては、前記ＬＮＡプローブの塩基配列に対応する領域を増幅することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＨＣＶの１ａ〜３ａ型の遺伝子型において完全に配列が一致する塩基配列が好ましい。
なお、前記第二の遺伝子増幅反応における反応溶液中には、前記鋳型（第二の遺伝子増幅反応における鋳型、即ち、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物）、ＬＮＡプローブ、酵素及び第二のプライマー対以外に、選択された遺伝子増幅反応に応じて必要なその他の成分が添加される。前記その他の成分としては、例えば、基質としての４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、マグネシウムイオン、緩衝液などが挙げられる。
なお、１つの反応溶液中に添加されるＬＮＡプローブは、１種類であってもよく、複数種類であってもよいが、１つの反応溶液で複数の遺伝子型の判定を同時に行え、ＨＣＶ遺伝子型の判定に要する時間を短縮できる点で、複数種類のＬＮＡプローブが好ましい。現在、市販されている蛍光検出器を備えたサーマルサイクラーは、同時検出波長が最大で４波長であると思われるが、蛍光検出器を備えたサーマルサイクラーの同時検出波長が増えれば、前記１つの反応溶液中に添加されるＬＮＡプローブの種類も更に増加させることができ、ＨＣＶ遺伝子型の判定に要する時間も大幅に短縮できる。
なお、１つの反応溶液中に添加されるＬＮＡプローブは、１種類であってもよく、複数種類であってもよいが、１つの反応溶液で複数の遺伝子型の判定を同時に行え、ＨＣＶ遺伝子型の判定に要する時間を短縮できる点で、複数種類のＬＮＡプローブが好ましい。現在、市販されている蛍光検出器を備えたサーマルサイクラーは、同時検出波長が最大で４波長であると思われるが、蛍光検出器を備えたサーマルサイクラーの同時検出波長が増えれば、前記１つの反応溶液中に添加されるＬＮＡプローブの種類も更に増加させることができ、ＨＣＶ遺伝子型の判定に要する時間も大幅に短縮できる。
以上、前記（ａ）の場合における工程１によれば、被検者が感染している未知のＨＣＶ遺伝子型に応じて、前記ＬＮＡプローブに対応する塩基配列を含む第二の増幅産物が得られる。そして、前記第二の遺伝子増幅反応の途中乃至終了後に、ＬＮＡプローブが、前記第二の増幅産物に対してＨＣＶ遺伝子型特異的にハイブリダイズする。そして、この特異的なハイブリダイズを、前記第二の遺伝子増幅反応の途中乃至終了後に、検出することにより、ＨＣＶ遺伝子型を判定することができる。
−（ｂ）ＬＮＡプローブを、第二の遺伝子増幅反応のための第二のプライマー対のうち、少なくとも一つのプライマーとして用いる場合−
前記ＬＮＡプローブは、蛍光物質や消光物質により標識されていてもよく、標識されていなくてもよい。
前記ＬＮＡプローブは、蛍光物質や消光物質により標識されていてもよく、標識されていなくてもよい。
−−第二のプライマー対−−
前記「第二のプライマー対」としては、少なくとも一つのプライマーが前記所定のＬＮＡプローブである限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、第二のプライマー対を構成する１種類のプライマーのみが前記所定のＬＮＡプローブであってもよく、２種類のプライマーが両方とも前記所定のＬＮＡプローブであってもよいが、１種類のプライマーのみが前記所定のＬＮＡプローブであることが好ましい。
前記「第二のプライマー対」としては、少なくとも一つのプライマーが前記所定のＬＮＡプローブである限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、第二のプライマー対を構成する１種類のプライマーのみが前記所定のＬＮＡプローブであってもよく、２種類のプライマーが両方とも前記所定のＬＮＡプローブであってもよいが、１種類のプライマーのみが前記所定のＬＮＡプローブであることが好ましい。
１種類のプライマーのみが所定のＬＮＡプローブである場合、ＬＮＡプローブでない方のプライマーの塩基配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＨＣＶの１ａ〜３ａの遺伝子型において完全に配列が一致する塩基配列であることが好ましい。
なお、前記第二の遺伝子増幅反応における反応溶液中には、前記鋳型（第二の遺伝子増幅反応における鋳型、即ち、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物）、酵素及び第二のプライマー対（このうち少なくとも１種類のプライマーはＬＮＡプローブである。）以外に、選択された遺伝子増幅反応に応じて必要なその他の成分が添加される。前記その他の成分としては、例えば、基質としての４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、マグネシウムイオン、緩衝液などが挙げられる。
以上、前記（ｂ）の場合における前記工程１によれば、被検者が感染しているＨＣＶ遺伝子型に応じた第二の増幅産物が得られる。具体的には、ＬＮＡプローブが特異的にアニールした場合には、前記ＬＮＡプローブが第二の遺伝子増幅反応におけるプライマーとして機能することで、第二の増幅産物を得ることができる。そして、第二の増幅産物を検出することにより、ＨＣＶ遺伝子型を判定することができる。逆に、ＬＮＡプローブが、鋳型にアニールしなかった場合には、第二の遺伝子増幅反応後に第二の増幅産物は得られない。
＜工程（２）＞
−第二の増幅産物の検出方法−
前記第二の増幅産物の検出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
−第二の増幅産物の検出方法−
前記第二の増幅産物の検出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記第二の増幅産物を検出する装置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光検出器、シークエンサーシステムなどが挙げられる。前記蛍光検出器としては、特に制限はないが、工程１乃至２を連続して行える点で、蛍光検出器を備えたサーマルサイクラーが好ましい。前記蛍光検出器を備えたサーマルサイクラーとしては、前記したように、例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社製）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）などを好適に利用することができる。
前記シークエンサーシステムとしては、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍｓ ３１３０ ジェネティックアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍｓ社製）、ＣＥＱ ８０００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）などを好適に利用することができる。
以下、工程２の説明においても、工程１と同様、ＬＮＡプローブを（ａ）として用いる場合、及び、（ｂ）として用いる場合、それぞれについて、分けて説明する。
前記シークエンサーシステムとしては、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍｓ ３１３０ ジェネティックアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍｓ社製）、ＣＥＱ ８０００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）などを好適に利用することができる。
以下、工程２の説明においても、工程１と同様、ＬＮＡプローブを（ａ）として用いる場合、及び、（ｂ）として用いる場合、それぞれについて、分けて説明する。
−（ａ）ＬＮＡプローブを前記第二の増幅産物を検出するためのプローブとして用いる場合−
前記第二の増幅産物の検出方法としては、前記ＬＮＡプローブを第二の増幅産物を検出するためのプローブとして用いる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リアルタイムＰＣＲ法によるモニタリングが挙げられる。
前記リアルタイムＰＣＲ法としては、例えば、ＴａｑＭａｎプローブ法、サイクリングプローブ法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ法、ＦＲＥＴ法などが挙げられる。中でも、プローブ類を含み試薬類が手に入りやすく、多くの技術的積み重ねがあり問題点をクリアしやすく、検査可能なサーマルサイクラーが多くのメーカより発売されているなどの点で、ＴａｑＭａｎプローブ法が好ましい。
前記第二の増幅産物の検出方法としては、前記ＬＮＡプローブを第二の増幅産物を検出するためのプローブとして用いる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リアルタイムＰＣＲ法によるモニタリングが挙げられる。
前記リアルタイムＰＣＲ法としては、例えば、ＴａｑＭａｎプローブ法、サイクリングプローブ法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ法、ＦＲＥＴ法などが挙げられる。中でも、プローブ類を含み試薬類が手に入りやすく、多くの技術的積み重ねがあり問題点をクリアしやすく、検査可能なサーマルサイクラーが多くのメーカより発売されているなどの点で、ＴａｑＭａｎプローブ法が好ましい。
前記ＴａｑＭａｎプローブ法では、増幅産物を検出するためのプローブとして、一端を蛍光物質で、他端を消光物質で修飾されたプローブを用いる。
そして、前記ＴａｑＭａｎプローブ法は、増幅産物にハイブリダイズした前記プローブが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって分解されたときに、蛍光物質が消光物質から遊離することで発する蛍光をリアルタイムで検出する方法である。
そして、前記ＴａｑＭａｎプローブ法は、増幅産物にハイブリダイズした前記プローブが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって分解されたときに、蛍光物質が消光物質から遊離することで発する蛍光をリアルタイムで検出する方法である。
前記サイクリングプローブ法は、増幅産物を検出するためのプローブとして、ＲＮＡ塩基を含む核酸鎖において、一端を蛍光物質で、他端をクエンチャー物質で修飾されたプローブを用いる。
そして、前記サイクリングプローブ法は、増幅産物にハイブリダイズした前記プローブが反応液中に共存されたＲＮａｓｅＨによって分解されたときに、蛍光物質が消光物質から遊離することで発する蛍光をリアルタイムで検出する方法である。
そして、前記サイクリングプローブ法は、増幅産物にハイブリダイズした前記プローブが反応液中に共存されたＲＮａｓｅＨによって分解されたときに、蛍光物質が消光物質から遊離することで発する蛍光をリアルタイムで検出する方法である。
前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ法は、増幅産物を検出するためのプローブとして、ヘアピン型二次構造をとりうるプローブにおいて、一端を蛍光物質で、他端をクエンチャー物質で修飾されたプローブを用いる。
そして、前記サイクリングプローブ法は、前記プローブが増幅産物にハイブリダイズすることでヘアピン型二次構造が解除されたときに、蛍光物質と消光物質との距離が離れることで発する蛍光をリアルタイムで検出する方法である。
そして、前記サイクリングプローブ法は、前記プローブが増幅産物にハイブリダイズすることでヘアピン型二次構造が解除されたときに、蛍光物質と消光物質との距離が離れることで発する蛍光をリアルタイムで検出する方法である。
前記ＦＲＥＴ法は、増幅産物を検出するためのプローブとして、一端を第一の蛍光物質で修飾され、他端を第二の蛍光物質で修飾されたプローブを用いる。なお、前記第二の蛍光物質は、前記第一の蛍光物質の蛍光波長により励起される性質を有する。
そして、前記ＦＲＥＴ法は、第一の蛍光物質を励起させる励起光を照射して、第二の蛍光物質が発する蛍光をリアルタイムで検出する方法であって、増幅産物にハイブリダイズした前記プローブが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって分解されたときに、第一の蛍光物質が第二の蛍光物質から遊離することで、第二の蛍光物質が発する蛍光強度が低下することを指標とする。
そして、前記ＦＲＥＴ法は、第一の蛍光物質を励起させる励起光を照射して、第二の蛍光物質が発する蛍光をリアルタイムで検出する方法であって、増幅産物にハイブリダイズした前記プローブが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって分解されたときに、第一の蛍光物質が第二の蛍光物質から遊離することで、第二の蛍光物質が発する蛍光強度が低下することを指標とする。
−（ｂ）ＬＮＡプローブを、第二の遺伝子増幅反応のための第二のプライマー対のうち、少なくとも一つのプライマーとして用いる場合−
前記第二の増幅産物の検出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、増幅産物を周知の手法で精製した後に波長２６０ｎｍの吸光度を測定する方法、増幅産物を電気泳動により展開した後に核酸染色剤により染色してバンドを検出する方法、リアルタイムＰＣＲ法によるモニタリングなどが挙げられる。中でも、検出に要する時間を短縮できる点で、リアルタイムＰＣＲ法によるモニタリングが好ましい。
前記第二の増幅産物の検出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、増幅産物を周知の手法で精製した後に波長２６０ｎｍの吸光度を測定する方法、増幅産物を電気泳動により展開した後に核酸染色剤により染色してバンドを検出する方法、リアルタイムＰＣＲ法によるモニタリングなどが挙げられる。中でも、検出に要する時間を短縮できる点で、リアルタイムＰＣＲ法によるモニタリングが好ましい。
前記核酸染色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして核酸の染色を行うインターカレーターが挙げられる。前記インターカレーターとしては、例えば、エチジウムブロマイド、ヨウ化プロピジウム、ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ、各種ｈｏｅｃｈｓｔ、各種ＳＹＢＲ、各種ＳＹＮＴＯＸ、各種ＴＯＴＯなどが挙げられる。
前記リアルタイムＰＣＲ法によるモニタリングとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、インターカレーター法が挙げられる。
前記インターカレーター法では、ＰＣＲの反応液中に、二本鎖ＤＮＡに挿入されることで蛍光を発する蛍光物質（インターカレーター）が添加される。前記インターカレーターとしては、例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉなどが挙げられる。
そして、前記インターカレーター法は、ポリメラーゼ反応によって合成された二本鎖ＤＮＡ中にインターカレーターが挿入されることで発する蛍光をリアルタイムで検出する方法である。
前記インターカレーター法では、ＰＣＲの反応液中に、二本鎖ＤＮＡに挿入されることで蛍光を発する蛍光物質（インターカレーター）が添加される。前記インターカレーターとしては、例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉなどが挙げられる。
そして、前記インターカレーター法は、ポリメラーゼ反応によって合成された二本鎖ＤＮＡ中にインターカレーターが挿入されることで発する蛍光をリアルタイムで検出する方法である。
以上のように、本発明のＨＣＶ遺伝子型判定方法によれば、ＨＣＶ遺伝子型を高い精度で判定することができ、簡便な工程で、短時間に、低コストで行うことができる。
なお、本発明の主なる技術的思想は、配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を利用して、ＨＣＶ遺伝子型の判定を行うことであって、本発明の技術的範囲は上記した実施形態に限定されるものではない。
例えば、前記第一の増幅産物（第二の遺伝子増幅反応における鋳型）は、部分的ではあるが、ＤＮＡプローブ（ＤＮＡ塩基のみからなるプローブ）でも特異的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有している（例えば、後記するＨＣＶ−１やＨＣＶ−３のプローブ）。このような場合、特にＬＮＡプローブ（本発明の「オリゴヌクレオチド」に相当する。）を使用する必要はなく、プローブ作製にかかるコストなどを考慮して、適宜ＤＮＡプローブ（本発明の「オリゴヌクレオチド」に相当する。）を使用してもよい。また、前記ＬＮＡプローブ及びＤＮＡプローブを併用してもよい。もちろん、ＤＮＡプローブが特異的にハイブリダイズ可能な塩基配列に対しても、ＬＮＡプローブを使用する方が、より高い精度でＨＣＶ遺伝子型を判定できることは、言うまでもない。
なお、本発明の主なる技術的思想は、配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を利用して、ＨＣＶ遺伝子型の判定を行うことであって、本発明の技術的範囲は上記した実施形態に限定されるものではない。
例えば、前記第一の増幅産物（第二の遺伝子増幅反応における鋳型）は、部分的ではあるが、ＤＮＡプローブ（ＤＮＡ塩基のみからなるプローブ）でも特異的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有している（例えば、後記するＨＣＶ−１やＨＣＶ−３のプローブ）。このような場合、特にＬＮＡプローブ（本発明の「オリゴヌクレオチド」に相当する。）を使用する必要はなく、プローブ作製にかかるコストなどを考慮して、適宜ＤＮＡプローブ（本発明の「オリゴヌクレオチド」に相当する。）を使用してもよい。また、前記ＬＮＡプローブ及びＤＮＡプローブを併用してもよい。もちろん、ＤＮＡプローブが特異的にハイブリダイズ可能な塩基配列に対しても、ＬＮＡプローブを使用する方が、より高い精度でＨＣＶ遺伝子型を判定できることは、言うまでもない。
（ＬＮＡプローブ）
本発明のＬＮＡプローブは、前記ＨＣＶ遺伝子型判定方法に用いるＬＮＡプローブである。即ち、前記ＬＮＡプローブは、前記ＨＣＢ遺伝子型判定方法において説明したＬＮＡプローブからなり、例えば、配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列からなり、少なくとも１塩基がＬＮＡからなるＬＮＡプローブである。
本発明のＬＮＡプローブは、前記ＨＣＶ遺伝子型判定方法に用いるＬＮＡプローブである。即ち、前記ＬＮＡプローブは、前記ＨＣＢ遺伝子型判定方法において説明したＬＮＡプローブからなり、例えば、配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列からなり、少なくとも１塩基がＬＮＡからなるＬＮＡプローブである。
また、前記ＬＮＡプローブは、例えば、配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、少なくとも１塩基がＬＮＡからなるＬＮＡプローブである。
前記ＬＮＡプローブの合成方法、及び、前記ＬＮＡプローブに蛍光物質や消光物質を標識する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、株式会社 医学生物学研究所に合成を委託することで、所望するＬＮＡプローブを得ることができる。
（ＨＣＶ遺伝子型判定キット）
本発明のＨＣＶ遺伝子型判定キットは、前記ＬＮＡプローブを含んでなり、更に、必要に応じて他の試薬を含む。
前記他の試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、一般に遺伝子増幅反応で用いられる試薬が挙げられ、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ用のバッファー、プライマー対（第二のプライマー対）などが挙げられる。
本発明のＨＣＶ遺伝子型判定キットは、前記ＬＮＡプローブを含んでなり、更に、必要に応じて他の試薬を含む。
前記他の試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、一般に遺伝子増幅反応で用いられる試薬が挙げられ、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ用のバッファー、プライマー対（第二のプライマー対）などが挙げられる。
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
（実施例１）
実施例１は、アンプリコア測定済試料を鋳型として、ＬＮＡプローブを増幅産物をモニタリング（検出）するためのプローブとして用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、ＨＣＶ遺伝子型を同定した実施例である。
前記リアルタイムＰＣＲは、ＴａｑＭａｎプローブ法に従って行った。具体的な手順は以下の通りである。
実施例１は、アンプリコア測定済試料を鋳型として、ＬＮＡプローブを増幅産物をモニタリング（検出）するためのプローブとして用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、ＨＣＶ遺伝子型を同定した実施例である。
前記リアルタイムＰＣＲは、ＴａｑＭａｎプローブ法に従って行った。具体的な手順は以下の通りである。
（材料及び方法）
以下、実施例１のリアルタイムＰＣＲの反応液に含まれる成分について説明する。なお、１つの鋳型につき、プローブの種類を変えて前記反応液を２種類（反応液１、反応液２）調製し、２度のリアルタイムＰＣＲ（反応１、反応２）を行った。
以下、実施例１のリアルタイムＰＣＲの反応液に含まれる成分について説明する。なお、１つの鋳型につき、プローブの種類を変えて前記反応液を２種類（反応液１、反応液２）調製し、２度のリアルタイムＰＣＲ（反応１、反応２）を行った。
−鋳型−
アンプリコア測定済試料は、本発明者らが所属する埼玉医科大学病院の中央検査部により入手した。前記アンプリコア測定済試料には、被検者の血清から採取されたＨＣＶのゲノムＲＮＡを鋳型として、コバスアンプリコアＨＣＶモニターを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った増幅産物が含有されている。
そして、前記アンプリコア測定済試料を、蒸留水で１，０００倍に希釈し、そのうちの５μｌをリアルタイムＰＣＲの鋳型として、各反応液（ｔｏｔａｌ ２５μｌ）に添加した（表１、２参照）。即ち、最終的には、アンプリコア測定済試料は５，０００倍に希釈された。
アンプリコア測定済試料は、本発明者らが所属する埼玉医科大学病院の中央検査部により入手した。前記アンプリコア測定済試料には、被検者の血清から採取されたＨＣＶのゲノムＲＮＡを鋳型として、コバスアンプリコアＨＣＶモニターを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った増幅産物が含有されている。
そして、前記アンプリコア測定済試料を、蒸留水で１，０００倍に希釈し、そのうちの５μｌをリアルタイムＰＣＲの鋳型として、各反応液（ｔｏｔａｌ ２５μｌ）に添加した（表１、２参照）。即ち、最終的には、アンプリコア測定済試料は５，０００倍に希釈された。
−プライマー−
実施例１のリアルタイムＰＣＲで使用したプライマーの配列を以下に示す。
（反応液１、２共通）
ＨＣＶ−Ｆ ： ５’−／ＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧ（配列番号：１４）／−３’
ＨＣＶ−Ｂ ： ５’−／ＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＧ（配列番号：１５）／−３’
なお、ＨＣＶ−Ｆ、ＨＣＶ−Ｂの両プライマーの塩基配列は、全てＤＮＡにより構成される。
実施例１のリアルタイムＰＣＲで使用したプライマーの配列を以下に示す。
（反応液１、２共通）
ＨＣＶ−Ｆ ： ５’−／ＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧ（配列番号：１４）／−３’
ＨＣＶ−Ｂ ： ５’−／ＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＧ（配列番号：１５）／−３’
なお、ＨＣＶ−Ｆ、ＨＣＶ−Ｂの両プライマーの塩基配列は、全てＤＮＡにより構成される。
−プローブ−
プローブの塩基配列の設計においては、効率よく複数の遺伝子型の塩基を単一反応で検出できるように、各々のプローブをＦＡＭ、ＴＥＴ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、Ｃｙ５のいずれかの蛍光物質でラベル化し、１つの反応液あたり最大４種類のプローブを同時に使用できるように設計した。前記プローブとしては、ＬＮＡプローブとＤＮＡプローブとを併用した。また、前記ＬＮＡプローブの塩基配列において、遺伝子型間で配列の異なる塩基をＬＮＡとし、遺伝子型が異なるとＴｍ値が大きく減少するように設計した。
本実施例のリアルタイムＰＣＲで使用したプローブの塩基配列を以下に示す。
プローブの塩基配列の設計においては、効率よく複数の遺伝子型の塩基を単一反応で検出できるように、各々のプローブをＦＡＭ、ＴＥＴ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、Ｃｙ５のいずれかの蛍光物質でラベル化し、１つの反応液あたり最大４種類のプローブを同時に使用できるように設計した。前記プローブとしては、ＬＮＡプローブとＤＮＡプローブとを併用した。また、前記ＬＮＡプローブの塩基配列において、遺伝子型間で配列の異なる塩基をＬＮＡとし、遺伝子型が異なるとＴｍ値が大きく減少するように設計した。
本実施例のリアルタイムＰＣＲで使用したプローブの塩基配列を以下に示す。
−−反応液１のみ−−
ＨＣＶ−１ ： ５’−／ＴｅｘａｓＲｅｄ／ＣＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧ（配列番号：８）／ＢＨＱ−２／−３’
〔ただし、／ＴｅｘａｓＲｅｄ／は、ＴｅｘａｓＲｅｄが塩基配列の５’末端に結合していることを示し、／ＢＨＱ−２／は、ＢＨＱ−２が塩基配列の３’末端に結合していることを示す。〕
なお、前記ＨＣＶ−１は、１ａ型及び１ｂ型に特異的にハイブリダイズするように設計されたＤＮＡプローブである。
ＨＣＶ−１ ： ５’−／ＴｅｘａｓＲｅｄ／ＣＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧ（配列番号：８）／ＢＨＱ−２／−３’
〔ただし、／ＴｅｘａｓＲｅｄ／は、ＴｅｘａｓＲｅｄが塩基配列の５’末端に結合していることを示し、／ＢＨＱ−２／は、ＢＨＱ−２が塩基配列の３’末端に結合していることを示す。〕
なお、前記ＨＣＶ−１は、１ａ型及び１ｂ型に特異的にハイブリダイズするように設計されたＤＮＡプローブである。
ＨＣＶ−２ａ： ５’−／６−ＦＡＭ／ＣＡＡＡＴＧ{Ｇ}ＣＣＧＧ{Ｇ}ＣＡＴＡＧＡＧＴＧＧ（配列番号：９）／ＢＨＱ−１／−３’
〔ただし、／６−ＦＡＭ／は、６−ＦＡＭが塩基配列の５’末端に結合していることを示し、／３ＢＨＱ−１／は、ＢＨＱ−１が塩基配列の３’末端に結合していることを示す。{}内の塩基はＬＮＡであり、それ以外はＤＮＡである。〕
なお、前記ＨＣＶ−２ａは、２ａ型に特異的にハイブリダイズするように設計されたＬＮＡプローブである。
〔ただし、／６−ＦＡＭ／は、６−ＦＡＭが塩基配列の５’末端に結合していることを示し、／３ＢＨＱ−１／は、ＢＨＱ−１が塩基配列の３’末端に結合していることを示す。{}内の塩基はＬＮＡであり、それ以外はＤＮＡである。〕
なお、前記ＨＣＶ−２ａは、２ａ型に特異的にハイブリダイズするように設計されたＬＮＡプローブである。
ＨＣＶ−２ｂ： ５’−／ＴＥＴ／ＣＡＡＡＴＧ{Ａ}ＣＣＧＧ{Ａ}ＣＡＴＡＧＡＧＴＧＧ（配列番号：１０）／ＢＨＱ−１／−３’
〔ただし、／ＴＥＴ／は、ＴＥＴが塩基配列の５’末端に結合していることを示し、／ＢＨＱ−１／は、ＢＨＱ−１が塩基配列の３’末端に結合していることを示す。{}内の塩基は、ＬＮＡであり、それ以外はＤＮＡである。〕
なお、前記ＨＣＶ−２ｂは、２ｂ型に特異的にハイブリダイズするように設計されたＬＮＡプローブである。
〔ただし、／ＴＥＴ／は、ＴＥＴが塩基配列の５’末端に結合していることを示し、／ＢＨＱ−１／は、ＢＨＱ−１が塩基配列の３’末端に結合していることを示す。{}内の塩基は、ＬＮＡであり、それ以外はＤＮＡである。〕
なお、前記ＨＣＶ−２ｂは、２ｂ型に特異的にハイブリダイズするように設計されたＬＮＡプローブである。
−−反応液２のみ−−
ＨＣＶ−３ ： ５’−／ＴｅｘａｓＲｅｄ／ＣＡＡＡＴＴＴＣＴＧＧＧＴＡＴＴＧＡＧＣＧＧ（配列番号：１１）／ＢＨＱ−１／−３’
〔ただし、／ＴｅｘａｓＲｅｄ／は、ＴｅｘａｓＲｅｄが塩基配列の５’末端に結合していることを示し、／ＢＨＱ−１／は、ＢＨＱ−１が塩基配列の３’末端に結合していることを示す。〕
なお、前記ＨＣＶ−３は、３ａ型に特異的にハイブリダイズするように設計されたＤＮＡプローブである。
ＨＣＶ−３ ： ５’−／ＴｅｘａｓＲｅｄ／ＣＡＡＡＴＴＴＣＴＧＧＧＴＡＴＴＧＡＧＣＧＧ（配列番号：１１）／ＢＨＱ−１／−３’
〔ただし、／ＴｅｘａｓＲｅｄ／は、ＴｅｘａｓＲｅｄが塩基配列の５’末端に結合していることを示し、／ＢＨＱ−１／は、ＢＨＱ−１が塩基配列の３’末端に結合していることを示す。〕
なお、前記ＨＣＶ−３は、３ａ型に特異的にハイブリダイズするように設計されたＤＮＡプローブである。
ＨＣＶ−Ｇ３： ５’−／６−ＦＡＭ／Ｃ{Ｔ}ＡＧ{Ｃ}ＡＧ{Ｔ}ＣＴ{Ｔ}Ｇ{Ｃ}ＧＧ（配列番号：１２）／３ＢＨＱ−１／−３’
〔ただし、／６−ＦＡＭ／は、６−ＦＡＭが塩基配列の５’末端に結合していることを示し、／ＢＨＱ−１／は、ＢＨＱ−１が塩基配列の３’末端に結合していることを示す。{}内の塩基は、ＬＮＡであり、それ以外はＤＮＡである。〕
なお、前記ＨＣＶ−Ｇ３は、１ａ型、２ａ型及び２ｂ型に特異的にハイブリダイズするように設計されたＬＮＡプローブである。
〔ただし、／６−ＦＡＭ／は、６−ＦＡＭが塩基配列の５’末端に結合していることを示し、／ＢＨＱ−１／は、ＢＨＱ−１が塩基配列の３’末端に結合していることを示す。{}内の塩基は、ＬＮＡであり、それ以外はＤＮＡである。〕
なお、前記ＨＣＶ−Ｇ３は、１ａ型、２ａ型及び２ｂ型に特異的にハイブリダイズするように設計されたＬＮＡプローブである。
ＨＣＶ−Ｇ４： ５’−／ＴＥＴ／ＣＴＡＧ{Ｃ}ＡＧ{Ｔ}ＣＴ{Ｃ}Ｇ{Ｃ}ＧＧ（配列番号：１３）／ＢＨＱ−１／−３’
〔ただし、／ＴＥＴ／は、ＴＥＴが塩基配列の５’末端に結合していることを示し、／ＢＨＱ−１／は、ＢＨＱ−１が塩基配列の３’末端に結合していることを示す。{}内の塩基は、ＬＮＡであり、それ以外はＤＮＡである。〕
なお、前記ＨＣＶ−Ｇ４は、１ｂ型に特異的にハイブリダイズするように設計されたＬＮＡプローブである。
〔ただし、／ＴＥＴ／は、ＴＥＴが塩基配列の５’末端に結合していることを示し、／ＢＨＱ−１／は、ＢＨＱ−１が塩基配列の３’末端に結合していることを示す。{}内の塩基は、ＬＮＡであり、それ以外はＤＮＡである。〕
なお、前記ＨＣＶ−Ｇ４は、１ｂ型に特異的にハイブリダイズするように設計されたＬＮＡプローブである。
−−反応液１、２共通−−
ＨＣＶ−ｔｏｔａｌ： ５’−／Ｃｙ５／ＣＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣ（配列番号：１６）／ＢＨＱ−２／−３’
〔ただし、／Ｃｙ５／は、Ｃｙ５が塩基配列の５’末端に結合していることを示し、／ＢＨＱ−２／は、ＢＨＱ−２が塩基配列の３’末端に結合していることを示す。〕
なお、前記ＨＣＶ−ｔｏｔａｌは、各ＨＣＶ遺伝子型に共通の塩基配列であり、ＰＣＲがうまく行われているかどうかを確認するための内部コントロールである。
ＨＣＶ−ｔｏｔａｌ： ５’−／Ｃｙ５／ＣＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣ（配列番号：１６）／ＢＨＱ−２／−３’
〔ただし、／Ｃｙ５／は、Ｃｙ５が塩基配列の５’末端に結合していることを示し、／ＢＨＱ−２／は、ＢＨＱ−２が塩基配列の３’末端に結合していることを示す。〕
なお、前記ＨＣＶ−ｔｏｔａｌは、各ＨＣＶ遺伝子型に共通の塩基配列であり、ＰＣＲがうまく行われているかどうかを確認するための内部コントロールである。
図１は、実施例１で使用した前記プライマー及びプローブが、鋳型にハイブリダイズする位置を示す図である。
前記反応液の組成を下記の表１、２に示す。
リアルタイムＰＣＲの施行及び検出には、Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ株式会社製）を用いた。前記Ｓｙｓｔｅｍは、１つの反応液につき、４波長同時検出が可能であるという利点を有している。
反応１の温度条件は、９５℃で３０秒間保温の後、９５℃で３秒間、６５℃で３０秒間の反応を４５サイクル繰り返した。反応２の温度条件は、９５℃で３０秒間保温の後、９５℃で３秒間、６４℃で３０秒間の反応を４５サイクル繰り返した。前記反応１及び２の所要時間は４０分以内であり、並行して行った。
−検出−
Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍの蛍光検出器は、ＦＡＭ ｃｈａｎｎｅｌ（励起波長４５０〜４９５ｎｍ、検出波長５１０〜５２７ｎｍ）、ＴＥＴ ｃｈａｎｎｅｌ（励起波長５００〜５５０ｎｍ、検出波長５６５〜５９０ｎｍ）、ＴｅｘａｓＲｅｄ ｃｈａｎｎｅｌ（励起波長５６５〜５９０ｎｍ、検出波長６０６〜６５０ｎｍ）、Ｃｙ５ ｃｈａｎｎｅｌ（励起波長６３０〜６５０ｎｍ、検出波長６７０〜７５０ｎｍ）の４つに設定されており、前記温度条件において、１サイクル毎に４波長の蛍光を検出した。
Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍの蛍光検出器は、ＦＡＭ ｃｈａｎｎｅｌ（励起波長４５０〜４９５ｎｍ、検出波長５１０〜５２７ｎｍ）、ＴＥＴ ｃｈａｎｎｅｌ（励起波長５００〜５５０ｎｍ、検出波長５６５〜５９０ｎｍ）、ＴｅｘａｓＲｅｄ ｃｈａｎｎｅｌ（励起波長５６５〜５９０ｎｍ、検出波長６０６〜６５０ｎｍ）、Ｃｙ５ ｃｈａｎｎｅｌ（励起波長６３０〜６５０ｎｍ、検出波長６７０〜７５０ｎｍ）の４つに設定されており、前記温度条件において、１サイクル毎に４波長の蛍光を検出した。
即ち、反応１においては、ＦＡＭ ｃｈａｎｎｅｌでは、１ａ型及び１ｂ型の核酸鎖の増幅を検出することができる。ＴＥＴ ｃｈａｎｎｅｌでは、２ａ型の核酸鎖の増幅を検出することができる。ＴｅｘａｓＲｅｄ ｃｈａｎｎｅｌでは、２ｂ型の核酸鎖の増幅を検出することができる。Ｃｙ５ ｃｈａｎｎｅｌでは、１ａ型、１ｂ型、２ａ型、２ｂ型及び３ａ型の核酸鎖の増幅を検出することができる。
反応２においては、ＦＡＭ ｃｈａｎｎｅｌでは、１ａ型、２ａ型及び２ｂ型の核酸鎖の増幅を検出することができる。ＴＥＴ ｃｈａｎｎｅｌでは、１ｂ型及び３ａ型の核酸鎖の増幅を検出することができる。ＴｅｘａｓＲｅｄ ｃｈａｎｎｅｌでは、３ａ型の核酸鎖の増幅を検出することができる。Ｃｙ５ ｃｈａｎｎｅｌでは、１ａ型、１ｂ型、２ａ型、２ｂ型及び３ａ型の核酸鎖の増幅を検出することができる。
−解析−
プローブが特異的にハイブリダイズした検体（陽性結果）においては、蛍光強度の測定により取得されたｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｒｖｅが、ベースラインから指数関数的に立ち上がる（図２〜１１参照）。
前記陽性結果（ベースラインから指数関数的に蛍光が立ち上がること）を客観的に判定するため、ｓｅｃｏｎｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ法で解析を行なった。前記ｓｅｃｏｎｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ法とは、ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｒｖｅを２回微分したときの最も変化率の大きいサイクル数（極大値）をＣｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｃｔ）とする方法である。具体的な解析手順は、以下の通りである。
プローブが特異的にハイブリダイズした検体（陽性結果）においては、蛍光強度の測定により取得されたｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｒｖｅが、ベースラインから指数関数的に立ち上がる（図２〜１１参照）。
前記陽性結果（ベースラインから指数関数的に蛍光が立ち上がること）を客観的に判定するため、ｓｅｃｏｎｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ法で解析を行なった。前記ｓｅｃｏｎｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ法とは、ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｒｖｅを２回微分したときの最も変化率の大きいサイクル数（極大値）をＣｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｃｔ）とする方法である。具体的な解析手順は、以下の通りである。
まず、５乃至１０サイクルの間の蛍光強度をベースラインとして設定した。ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＴｅｘａｓＲｅｄの場合には、前記ベースラインから４ＳＤ（標準偏差）以上の変化率があり、かつ、Ｃｔが検出されたときに、陽性と判定した。Ｃｙ５の場合には、前記ベースラインから３ＳＤ以上の変化率があり、かつ、Ｃｔが検出されたときに、陽性と判定した。
＜結果＞
図２〜１１は、実施例１におけるリアルタイムＰＣＲの検出結果を示す図であって、図２、３は、ＨＣＶが１ａ型であったときの検出結果であり、図４、５は、ＨＣＶが１ｂ型であったときの検出結果であり、図６、７は、ＨＣＶが２ａ型であったときの検出結果であり、図８、９は、ＨＣＶが２ｂ型であったときの検出結果であり、図１０、１１は、ＨＣＶが３ａ型であったときの検出結果である。また、図２、４、６、８及び１０は、リアルタイムＰＣＲの反応１における検出結果であって、図３、５、７、９、１１は、リアルタイムＰＣＲの反応２における検出結果である。図２〜１１の各ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｒｖｅにおいて、縦軸は検出された蛍光強度を示し、横軸は増幅反応のサイクル数を示す。また、図２〜１１の各ｓｅｃｏｎｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅにおいて、縦軸は蛍光強度を示し、横軸は増幅反応のサイクル数を示す。
図２〜１１は、実施例１におけるリアルタイムＰＣＲの検出結果を示す図であって、図２、３は、ＨＣＶが１ａ型であったときの検出結果であり、図４、５は、ＨＣＶが１ｂ型であったときの検出結果であり、図６、７は、ＨＣＶが２ａ型であったときの検出結果であり、図８、９は、ＨＣＶが２ｂ型であったときの検出結果であり、図１０、１１は、ＨＣＶが３ａ型であったときの検出結果である。また、図２、４、６、８及び１０は、リアルタイムＰＣＲの反応１における検出結果であって、図３、５、７、９、１１は、リアルタイムＰＣＲの反応２における検出結果である。図２〜１１の各ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｒｖｅにおいて、縦軸は検出された蛍光強度を示し、横軸は増幅反応のサイクル数を示す。また、図２〜１１の各ｓｅｃｏｎｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅにおいて、縦軸は蛍光強度を示し、横軸は増幅反応のサイクル数を示す。
まず、図２〜１１の全てのＣｙ５の検出結果において、陽性結果を確認した。即ち、ＨＣＶ遺伝子型を判定する前提として、ＰＣＲ反応により増幅産物が存在していることが示された。
図２、３に示すように、ＨＣＶが１ａ型であったときには、反応１でＴｅｘａｓＲｅｄの陽性結果が確認され、かつ、反応２でＦＡＭの陽性結果が確認された。この組合せにより、検体のＨＣＶ遺伝子型が１ａ型であると同定した。
図４、５に示すように、ＨＣＶが１ｂ型であったときには、反応１でＴｅｘａｓＲｅｄの陽性結果が確認され、かつ、反応２でＴＥＴの陽性結果が確認された。また、図示しない他の１ｂ型の１３７件の検体についても同様の検出結果であった。
図６、７に示すように、ＨＣＶが２ａ型であったときには、反応１でＦＡＭの陽性結果が確認され、かつ、反応２でＦＡＭの陽性結果が確認された。また、図示しない他の２ａ型の２３件の検体についても同様の検出結果であった。
図８、９に示すように、ＨＣＶが２ｂ型であったときには、反応１でＴＥＴの陽性結果が確認され、かつ、反応２でＦＡＭの陽性結果が確認された。また、図示しない他の２ｂ型の１４件の検体についても同様の検出結果であった。
図１０、１１に示すように、ＨＣＶが３ａ型であったときには、反応１ではＴｅｘａｓＲｅｄ、ＦＡＭ、ＴＥＴのいずれの陽性結果も確認されず、かつ、反応２でＴＥＴの陽性結果が確認された。また、図示しない他の３ａ型の検体についても同様の検出結果であった。
（実施例２）
実施例２は、本発明の要件を満たす前記実施例１の判別方法（実施例）と、本発明の要件を満たさない判別方法（比較例）により、同一の検体についてＨＣＶ遺伝子型を同定し、その結果を比較した実施例である。
実施例の具体的な手順は、実施例１に記載の手順と同様である。
なお、実施例の判定方法に要した時間は、１検体あたり３７分間であった。
実施例２は、本発明の要件を満たす前記実施例１の判別方法（実施例）と、本発明の要件を満たさない判別方法（比較例）により、同一の検体についてＨＣＶ遺伝子型を同定し、その結果を比較した実施例である。
実施例の具体的な手順は、実施例１に記載の手順と同様である。
なお、実施例の判定方法に要した時間は、１検体あたり３７分間であった。
比較例の判定方法としては、アンプリコア測定済試料をダイレクトシークエンスする方法を採用した。
前記アンプリコア測定済試料をダイレクトシークエンスする方法の具体的な手順としては、以下の通りである。
アンプリコア測定済試料としては、前記実施例と同じ検体を使用した。
そして、アンプリコア測定済試料を精製し、精製後の試料を用いてサイクルシークエンス反応を行ない、反応後試料を精製し、シークエンサーにて測定という手順により、ダイレクトシークンスを行った。
なお、比較例の判定方法に要した時間は、１検体あたり３時間であった。
アンプリコア測定済試料としては、前記実施例と同じ検体を使用した。
そして、アンプリコア測定済試料を精製し、精製後の試料を用いてサイクルシークエンス反応を行ない、反応後試料を精製し、シークエンサーにて測定という手順により、ダイレクトシークンスを行った。
なお、比較例の判定方法に要した時間は、１検体あたり３時間であった。
表３は、実施例による判定結果と、比較例による判定結果とを比較した表である。
表３に示すように、実施例による同定結果と、比較例による同定結果とは、１ａ型、１ｂ型、２ａ型、２ｂ型、３ａ型について、完全に一致した。
そのうえで、比較例では判定不能であった１３検体について、実施例ではそのうちの１２件を１ｂ型と正確に同定することができた。
また、実施例の正答率は（１９０／１９３）９８．４％であり、比較例の正答率が(１８０／１９３)９３．３％であることと比較すると、極めて高い精度であった。
そのうえで、比較例では判定不能であった１３検体について、実施例ではそのうちの１２件を１ｂ型と正確に同定することができた。
また、実施例の正答率は（１９０／１９３）９８．４％であり、比較例の正答率が(１８０／１９３)９３．３％であることと比較すると、極めて高い精度であった。
本発明の判定方法は、ＨＣＶ遺伝子型を高い精度で同定することができ、簡便な工程で、短時間に、低コストで行うことができるので、例えば、ＨＣＶ遺伝子型の診断キットとして、好適に利用できる。さらに、日本におけるＨＣＶのキャリア数は１５０万人以上であって、前記診断キットに対する市場は、潜在的に大きいものと推定される。さらに、本発明の判定方法に好適に用いることができるコバスアンプリコアＨＣＶモニターは、現在、多数の検査機関で使用されているものである。したがって、本発明の判定方法を利用したＨＣＶ遺伝子型の診断キットは、ＨＣＶ遺伝子型の診断にかかる時間及びコストを大幅に低減させることができる診断キットとして、有用性が極めて高い。
Claims (21)
- （１）配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を鋳型として、
配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、
（ａ）第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出するためのプローブ、
（ｂ）第二の遺伝子増幅反応のための第二のプライマー対のうち、少なくとも一つのプライマー、
のいずれかとして用いて前記第二の遺伝子増幅反応を行う工程と、
（２）前記第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出する工程とを含むことを特徴とするＨＣＶ遺伝子型判定方法。 - （１）配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を鋳型として、
配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、
（ａ）第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出するためのプローブ、
（ｂ）第二の遺伝子増幅反応のための第二のプライマー対のうち、少なくとも一つのプライマー、
のいずれかとして用いて前記第二の遺伝子増幅反応を行う工程と、
（２）前記第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出する工程とを含むことを特徴とするＨＣＶ遺伝子型判定方法。 - （１）配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を鋳型として、
配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列からなり、少なくとも１塩基がＬＮＡからなるＬＮＡプローブを、
（ａ）第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出するためのプローブ、
（ｂ）第二の遺伝子増幅反応のための第二のプライマー対のうち、少なくとも一つのプライマー、
のいずれかとして用いて前記第二の遺伝子増幅反応を行う工程と、
（２）前記第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出する工程とを含むことを特徴とするＨＣＶ遺伝子型判定方法。 - （１）配列番号１及び２で表される塩基配列を含む第一のプライマー対を用いた、第一の遺伝子増幅反応により得られる第一の増幅産物を鋳型として、
配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、少なくとも１塩基がＬＮＡからなるＬＮＡプローブを、
（ａ）第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出するためのプローブ、
（ｂ）第二の遺伝子増幅反応のための第二のプライマー対のうち、少なくとも一つのプライマー、
のいずれかとして用いて前記第二の遺伝子増幅反応を行う工程と、
（２）前記第二の遺伝子増幅反応により得られる第二の増幅産物を検出する工程とを含むことを特徴とするＨＣＶ遺伝子型判定方法。 - 少なくとも１つのＬＮＡプローブが、配列番号８〜１３のいずれかで表される塩基配列を含む請求項３に記載の方法。
- 少なくとも１つのＬＮＡプローブが、配列番号８〜１３のいずれかで表される塩基配列に相補的な塩基配列を含む請求項４に記載の方法。
- ＬＮＡプローブが、蛍光物質で標識されてなる請求項３から６のいずれかに記載の方法。
- ＬＮＡプローブが、消光物質で標識されてなる請求項３から７のいずれかに記載の方法。
- 第二の遺伝子増幅反応がＰＣＲ法である請求項３から８のいずれかに記載の方法。
- ＰＣＲ法がリアルタイムＰＣＲ法である請求項９に記載の方法。
- 配列番号８及び１２で表される塩基配列を含むＬＮＡプローブを用いて、ＨＣＶ遺伝子型が１ａ型であるか否かを判定する、請求項３から１０のいずれかに記載の方法。
- 配列番号８及び１３で表される塩基配列を含むＬＮＡプローブを用いて、ＨＣＶ遺伝子型が１ｂ型であるか否かを判定する、請求項３から１０のいずれかに記載の方法。
- 配列番号９及び１２で表される塩基配列を含むＬＮＡプローブを用いて、ＨＣＶ遺伝子型が２ａ型であるか否かを判定する、請求項３から１０のいずれかに記載の方法。
- 配列番号１０及び１２で表される塩基配列を含むＬＮＡプローブを用いて、ＨＣＶ遺伝子型が２ｂ型であるか否かを判定する、請求項３から１０のいずれかに記載の方法。
- 配列番号１１で表される塩基配列を含むＬＮＡプローブを用いて、ＨＣＶ遺伝子型が３ａ型であるか否かを判定する、請求項３から１０のいずれかに記載の方法。
- 配列番号８から１３で表される塩基配列を含むＬＮＡプローブを用いて、ＨＣＶ遺伝子型が１ａ型、１ｂ型、２ａ型、２ｂ型及び３ａ型のいずれかであるかを同定する、請求項３から１０のいずれかに記載の方法。
- 請求項３から１６のいずれかに記載の方法を行うためのＬＮＡプローブであって、
配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列からなり、少なくとも１塩基がＬＮＡからなるＬＮＡプローブ。 - 請求項３から１６のいずれかに記載の方法を行うためのＬＮＡプローブであって、
配列番号３〜７のいずれかで表される塩基配列において、５塩基以上の連続した塩基配列からなり、４２、５０、６３、６４、６５、６９、８８、８９、９１、９２、９４、９５、９８、１０２、１０８、１０９、１２５、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１８０、１９３及び２０５番目のいずれかの塩基を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、少なくとも１塩基がＬＮＡからなるＬＮＡプローブ。 - 配列番号８〜１３のいずれかで表される塩基配列を含む請求項１７に記載のＬＮＡプローブ。
- 配列番号８〜１３のいずれかで表される塩基配列に相補的な塩基配列を含む請求項１８に記載のＬＮＡプローブ。
- 請求項３から１６のいずれかに記載の方法を行うためのＨＣＶ遺伝子型判定キットであって、請求項１７から２０のいずれかに記載のＬＮＡプローブを含むＨＣＶ遺伝子型判定キット。
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