JP2008271973A - ヒトインシュリン様成長因子ｉの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ｈＩＧＦ−Ｉを高い純度と収率で製造する方法を提供すること。
【解決手段】ヒトインシュリン様成長因子Ｉの製造方法であって、該製造方法が、
（Ａ） ヒトインシュリン様成長因子Ｉ生産菌の培養液のｐＨを培養終了後に８以上に調整する工程；
（Ｂ） 工程（Ａ）で得られた培養液を放置する工程；および
（Ｃ） 工程（Ｂ）で得られた培養液から該生産菌を除去する工程；
を含む、修飾を受けたヒトインシュリン様成長因子Ｉを除去する工程を含むことを特徴とする前記製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヒトインシュリン様成長因子Ｉ（以下、ｈＩＧＦ−Ｉと称す）の製造方法に関する。詳しくは、ｈＩＧＦ−Ｉ生産菌の培養液を所定条件下で放置することにより、高い純度と収率でｈＩＧＦ−Ｉを得ることができる、ｈＩＧＦ−Ｉの製造方法に関する。

ｈＩＧＦ−Ｉは，天然に存在する公知のポリペプチド化合物であり（非特許文献１，２）、細胞増殖活性を有する（非特許文献３）。
ｈＩＧＦ−Ｉは、それ自身医薬として使用可能であり、医薬として使用するための開発が進められている（例えば非特許文献４，５，６）。ｈＩＧＦ−Ｉはまた、細胞増殖活性を有することから、抗体医薬品などバイオ医薬品を生産するにあたり、該医薬品の有効成分となるタンパク質を生産する細胞の培地用添加剤としても使用できる。バイオ医薬品の生産量は近年急増していることから、ｈＩＧＦ−Ｉも大量の需要が見込まれている。
このような背景のもと，組換えＤＮＡ法により形質転換された微生物（以下，組換え微生物と称す）を培養してｈＩＧＦ−Ｉを生産し、精製する方法が種々報告されている。例えば特許文献１では組換え大腸菌，特許文献２では組換え酵母が用いられている。

これらの方法では，組換え大腸菌又は組換え酵母を培養してｈＩＧＦ−Ｉを生産し、精製するが、ｈＩＧＦ−Ｉの培養過程および／または精製過程で，目的とするｈＩＧＦ−Ｉ以外に，大腸菌又は酵母が本来産生する色素やタンパク質等も生じるし、ｈＩＧＦ−Ｉとは異なる一次構造を有する異性体も生じる。
この異性体は，分子内に形成される３対のジスルフィド結合の組み合わせが天然型のｈＩＧＦ−Ｉとは異なるため，ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ｈＩＧＦ−Ｉと呼ばれ、物理的性質のみならず生物学的性質も天然型のｈＩＧＦ−Ｉとは異なることが知られている（非特許文献７）。そのため，該異性体は天然型のｈＩＧＦ−Ｉと分離し除去する必要がある。その方法としては、該異性体を天然型のｈＩＧＦ−Ｉに異性化する方法や、該異性体を分離除去する方法（例えば特許文献３，４）が報告されている。

ｈＩＧＦ−Ｉの産業的利用を考えるに，大量のｈＩＧＦ−Ｉを安価に製造する方法を開発することが切望される。
本件出願人は、これまでに、ヒト上皮細胞増殖因子の生産宿主として組換えコリネ型細菌を使用すると、組換えコリネ型細菌が培養液中で本来産生するタンパク質の量は，他の組換え微生物が培養液中で本来産生するタンパク質の量に比べて少ないことを発見している（特許文献５）。

米国特許第6,331,414号明細書 米国特許第5,324,639号明細書 米国特許第7,071,313号明細書 米国特許第5,231,178号明細書 特開2002-291476号公報 Rinderknecht, E. et al., The amino acid sequence of human insulin-like growth factor I and its structural homology with proinsulin. J Biol Chem, 1978. 253(8): p. 2769-76. Iwai, M. et al., Direct identification of disulfide bond linkages in human insulin-like growth factor I (IGF-I) by chemical synthesis. J Biochem (Tokyo), 1989. 106(6): p. 949-51. Humbel, R.E., Insulin-like growth factors I and II. Eur J Biochem, 1990. 190(3): p. 445-62. Savage, M.O. et al., Therapeutic applications of the insulin-like growth factors. Growth Horm IGF Res, 2004. 14(4): p. 301-8. Gasparini, L. et al., Potential roles of insulin and IGF-1 in Alzheimer's disease. Trends Neurosci, 2003. 26(8): p. 404-6. Ren, J. et al., Insulin-like growth factor I as a cardiac hormone: physiological and pathophysiological implications in heart disease. J Mol Cell Cardiol, 1999. 31(11): p. 2049-61. Sato, A. et al., Three-dimensional solution structure of a disulfide bond isomer of the human insulin-like growth factor-I. J Pept Res, 2000. 56(4): p. 218-30.

ｈＩＧＦ−Ｉを分泌生産するに当たり、菌体が本来産生するタンパク質は不純物に相当するため、該タンパク質の量はできるだけ少ない方が望ましいところ、本発明者は、組換えコリネ型細菌を用いれば、コリネ型細菌が本来産生するタンパク質の量を少なく抑えつつｈＩＧＦ−Ｉを得ることができると考え、組換えコリネ型細菌を培養してｈＩＧＦ−Ｉを生産させ，その培養液からｈＩＧＦ−Ｉを得ることを試みた。その結果、コリネ型細菌が本来産生するタンパク質の量を低く抑えることができることを確認したものの、組換えコリネ型細菌の培養液中に、ｈＩＧＦ−Ｉの分子量とは異なる分子量を有する、修飾を受けたｈＩＧＦ−Ｉ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈＩＧＦ−Ｉ、以下ｍｈＩＧＦ−Ｉと称す）が存在することが新たにわかった。ｍｈＩＧＦ−Ｉは、天然に存在するか否かが未だ明らかになっていない。また、本発明者によると、ｈＩＧＦ−Ｉとは異なる物理的性質を有することが判明した。
そこで、本発明は、ｈＩＧＦ−Ｉを高い純度と収率で製造する方法を提供することを目的とする。

本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果，驚くべきことに，培養終了後の培養液のｐＨをアルカリ性にして放置することにより，ｍｈＩＧＦ−Ｉの量が減少する一方で，ｈＩＧＦ−Ｉが増加することを見出した。すなわち、本発明は、第一の態様として、ヒトインシュリン様成長因子Ｉの製造方法であって、該製造方法が、
（Ａ） ヒトインシュリン様成長因子Ｉ生産菌の培養液のｐＨを培養終了後に８以上に調整する工程；
（Ｂ） 工程（Ａ）で得られた培養液を放置する工程；および
（Ｃ） 工程（Ｂ）で得られた培養液から該菌体を除去する工程；
を含む、ヒトインシュリン様成長因子Ｉから、修飾を受けたヒトインシュリン様成長因子Ｉを除去する工程を含むことを特徴とする前記製造方法を提供する。

本発明者はまた、培養終了後、培養液から菌体を除き、その培養液のｐＨを弱酸性からアルカリ性にして放置することにより、ｍｈＩＧＦ−Ｉの量が減少する一方で，ｈＩＧＦ−Ｉが増加することを見出した。従って、本発明は、第二の態様として、ヒトインシュリン様成長因子Ｉの製造方法であって、該製造方法が、
（ａ） ヒトインシュリン様成長因子Ｉ生産菌の培養液から該菌体を除去する工程；
（ｂ） 工程（ａ）で得られた培養液のｐＨを５以上に調整する工程；および
（ｃ） 工程（ｂ）で得られた培養液を放置する工程；
を含む、ヒトインシュリン様成長因子Ｉを含む培養液から、修飾を受けたヒトインシュリン様成長因子Ｉを除去する工程を含むことを特徴とする前記製造方法を提供する。

本発明はまた、ヒトインシュリン様成長因子Ｉの製造方法であって、該製造方法が、
（Ａ） ヒトインシュリン様成長因子Ｉを生産するコリネ型細菌の培養液のｐＨを培養終了後に８以上に調整する工程；
（Ｂ） 工程（Ａ）で得られた培養液を放置する工程；および
（Ｃ） 工程（Ｂ）で得られた培養液から該菌体を除去する工程；
を含み、かつ、上記（Ａ）および（Ｂ）の工程に有機溶媒が存在しないことを特徴とする、前記製造方法を提供する。

本発明により、ｈＩＧＦ−Ｉを高い純度と収率で製造することができる。本発明の方法によれば、ｈＩＧＦ−Ｉの製造に際し、ｍｈＩＧＦ−Ｉを分離・除去するための煩雑な精製工程を省くことができるため、高純度のｈＩＧＦ−Ｉを簡便にかつ安価に製造することができる。本発明の方法によれば、培養終了後の培養液の処理条件を適切に選ぶことにより，ｍｈＩＧＦ−Ｉ除去目的のクロマトグラフィー精製操作を施さなくても、該クロマトグラフィー精製操作を施したのと同程度の量のｍｈＩＧＦ−Ｉを除去することができる。

本発明において用いるヒトインシュリン様成長因子Ｉ生産菌の宿主菌としては、特許文献５に示されるコリネ型細菌、例えばＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（以下、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍと称す）ＡＴＣＣ１３８６９等があげられる。
本発明において用いるヒトインシュリン様成長因子Ｉ生産菌としては、ヒトインシュリン様成長因子Ｉを生産するように組換えた組換えコリネ型細菌が好ましく、組換えコリネ型細菌としては、組換えＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍが好ましい。
これらの菌は通常用いられる方法および条件に従って培養することができる。例えば、炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地で培養することができる。さらに高い増殖を得るために、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を必要に応じて添加することもできる。炭素源としてはグルコースおよびシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類、その他を使用することができる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その他が使用できる。無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン等を必要に応じて適宜使用する。培養はｐＨ５．０〜８．５、温度１５℃〜３７℃の適切な範囲にて好気的条件下で行い、１〜７日間程度培養する。このような条件下で培養することにより、目的タンパク質、すなわちｈＩＧＦ−Ｉは菌体内で多量に生産され効率よく菌体外に分泌される。培養液中には目的とするｈＩＧＦ−Ｉのほか、ｈＩＧＦ−Ｉの分子量とは異なる分子量を有する副生物ｍｈＩＧＦ−Ｉも含まれる。
なお、ｍｈＩＧＦ−Ｉは、逆相高速液体クロマトグラフィーによる分析（カラムはＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ８ ＯＣ３０Ｓ０５−１０４６ＷＴ，粒子径５μｍ，ポアサイズ３０ｎｍ，内径４．６ｍｍ，高さ１００ｍｍ（株式会社ワイエムシィ），流速は１ｍＬ／ｍｉｎ。溶出には，溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液，溶離液Ｂ：０．１％ＴＦＡと８０％アセトニトリルを含有する水溶液を用い，０−５ｍｉｎで３２％溶離液Ｂ−３４％溶離液Ｂ（溶離液Ａと溶離液Ｂの％合計が１００％、以下同じ）の直線濃度勾配，５−１６ｍｉｎで３４％溶離液Ｂ−３９％溶離液Ｂの直線濃度勾配，１６−１７ｍｉｎで３９％溶離液Ｂ−１００％溶離液Ｂの直線濃度勾配をかけた後，必要に応じて洗浄）に供すと、ｈＩＧＦ−Ｉより遅れて溶出される。ｍｈＩＧＦ−Ｉの分子量は、ｈＩＧＦ−Ｉの分子量よりも７０だけ大きく，ｍｈＩＧＦ−ＩのＮ末端はブロックされている。ｈＩＧＦ−ＩとｍｈＩＧＦ−Ｉそれぞれから調製したアミノ酸残基番号１番から１１番までからなるペプチドのモノアイソトピックイオン同士の精密質量差は７０．０４である。また、ｍｈＩＧＦ−Ｉから調製したアミノ酸残基番号１番から１１番までからなるペプチドのタンデム質量分析では、ｍｈＩＧＦ−ＩのＮ末端グリシンのアミノ基に修飾が起こっていると推定される衝突誘起解離イオンが検出される。

本発明の第一の態様について説明する。
本発明の（Ａ）工程において、培養終了後に、すなわち培養液への通気を停止した後に培養液のｐＨを８以上、好ましくはｐＨ９以上、より好ましくはｐＨ９〜１０に調整する。ｐＨの調整には、アンモニアガスやアンモニア水（例えば２８質量％）、水酸化ナトリウム水溶液（例えば１ｍｏｌ／Ｌ）等を用いることができる。
本発明の（Ｂ）工程において、ｐＨを８以上に調整した培養液を放置する。放置するときの培養液の温度は、−１０℃〜５０℃、好ましくは１０℃〜４０℃、より好ましくは２０℃〜２５℃であるのが好ましい。放置時間は２時間以上、好ましくは４時間以上、更に好ましくは１２時間以上であるのが好ましい。これより短い時間でもｍｈＩＧＦ−Ｉの量が減少し、代わりにｈＩＧＦ−Ｉの量が増加するが、より長い時間放置することにより、より多量のｈＩＧＦ−Ｉを回収することができる。菌体は、培養を終了してもなお活動を続けるため、培養液中の溶存物質が消費されたり代謝産物が蓄積されたりすることにより、培養液のｐＨは時間が経過するにつれて変動する。そのため、放置する工程の間、培養液のｐＨの値が８以上、好ましくは９以上に維持されるよう、放置する工程の間、ｐＨの調整を続けるのが好ましい。
ｈＩＧＦ−Ｉ生産菌の培養液にはもとよりｈＩＧＦ−Ｉが含まれているが、本発明により、培養液のｐＨを８以上に調整し、かつ放置することにより、放置前の培養液に含まれているｍｈＩＧＦ−Ｉの量よりも、放置後の培養液に含まれているｍｈＩＧＦ−Ｉの量の方が少なくなる。対応して、放置前の培養液に含まれているｈＩＧＦ−Ｉの量よりも、放置後の培養液に含まれているｈＩＧＦ−Ｉの量の方が多くなる。ｍｈＩＧＦ−Ｉの減少量に比してｈＩＧＦ−Ｉの増加量の方が多くなることがあるが、これは、いかなる理論にも拘束されるものではないが、放置している間に、菌体内および／または菌体表面に存在するｈＩＧＦ−Ｉが培養液中に移行することによっても、あるいは、培養液中に存在するｈＩＧＦ−Ｉの異性体（ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ｈＩＧＦ−Ｉ）がｈＩＧＦ−Ｉに異性化されることによっても、ｈＩＧＦ−Ｉの量が増加するためと考えられる。
逆相高速液体クロマトグラフィー（以下、逆相ＨＰＬＣと称す）による純度測定では、例えば、培養終了時には、ｈＩＧＦ−Ｉの量に対して約２０％のｍｈＩＧＦ−Ｉが含まれているが、２５℃、１６時間の放置後には１％未満となる。
従って、本発明の方法によれば、培養終了後の培養液の処理条件を適切に選ぶことにより，ｍｈＩＧＦ−Ｉ除去目的のクロマトグラフィー精製操作を施さなくても、該クロマトグラフィー精製操作を施したのと同程度の量のｍｈＩＧＦ−Ｉを除去することができ、精製操作が大幅に簡略化される。

本発明の（Ｃ）工程において、放置した培養液からｈＩＧＦ−Ｉ生産菌を除去する。除去手段としては、濾過分離、遠心分離等があげられる。

本発明の（Ｃ）工程の後に、（Ｃ）工程で得られたｈＩＧＦ−Ｉ溶液をさらに精製し、ｍｈＩＧＦ−Ｉ以外の不純物も除くことができる。精製する手段としては、例えば、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニーティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、またはこれらを組み合わせることにより分離精製することができ、高い純度のｈＩＧＦ−Ｉを得ることができる。

工程（Ａ）の前に、工程（Ａ）の後であって工程（Ｂ）の前に、又は工程（Ａ）中に、さらに前記培養液に有機溶媒を添加してもよい（工程（Ｄ））。例えば工程（Ａ）の前と工程（Ａ）中とに二回以上に分けて添加してもよい。
既述のとおり、一般的に培養終了後に培養液のｐＨは変動する。実験室スケールにおいては，遠心操作などにより速やかに，例えば数分で菌体を除くことが可能であり，菌体の活動によるｐＨ変動を最低限に抑えることができる。しかしながら，商業生産スケールにおいては，除菌操作に長時間，例えば数時間を要するため，この間に培養液のｐＨが変動することがある。本発明において、有機溶媒を添加することにより、ｐＨ８以上に調整した培養液のｐＨを、培養液を放置している間、調整した値に維持できる。有機溶媒としては、エタノール等を用いることができる。有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、およびアセトニトリルからなる群から選ばれるのが好ましい。これにより、有機溶媒を加えた以降の工程および必要に応じて本発明の方法に続いて行っても良い精製工程のｐＨ管理が容易になる。
有機溶媒の添加量としては、培養液の全体積に対して１／４以上が好ましく、１／４〜１／３がより好ましい。

本発明の第二の態様について説明する。
本発明の工程（ａ）において、ｈＩＧＦ−Ｉ生産菌を培養液から除去する。除去手段としては、濾過分離、遠心分離等があげられる。培養終了後、望ましくは培養終了直後に該生産菌を培養液から除去することにより、菌体の活動によって生じる培養液のｐＨの変動を防止することができる。これにより、本工程（ａ）以降および必要に応じて本発明の方法に続いて行っても良い精製工程のｐＨ管理が容易になる。
本発明の工程（ｂ）において、該生産菌を除いた後の培養液のｐＨを５以上に調整する。培養終了直後の培養液のｐＨは培養開始前に設定した値又は培養中の値であるが、除菌後の培養液のｐＨは、除菌に要した時間に応じて変動する。除菌後の培養液のｐＨが５未満の場合、第一の態様に関して記載したアンモニアガスやアンモニア水（例えば２８質量％）、水酸化ナトリウム水溶液（例えば１ｍｏｌ／Ｌ）等を用いて、培養液のｐＨを５以上、好ましくはｐＨ６以上、より好ましくはｐＨ６〜１０に調整する。

本発明の（ｃ）工程において、ｐＨを５以上に調整した培養液を放置する。放置することにより、培養液に含まれるｍｈＩＧＦ−Ｉの量が減少する一方、ｈＩＧＦ−Ｉの量が増加する。放置時間および放置温度は、第一の態様に記載したのと同じである。放置時間は２時間以上、好ましくは４時間以上、更に好ましくは１２時間以上であるのが好ましい。これより短い時間でもｍｈＩＧＦ−Ｉの量が減少し、代わりにｈＩＧＦ−Ｉの量が増加するが、より長い時間放置することにより、より多量のｈＩＧＦ−Ｉを回収することができる。
ｈＩＧＦ−Ｉ生産菌の培養液にはもとよりｈＩＧＦ−Ｉが含まれているが、本発明により、ｈＩＧＦ−Ｉ生産菌を除いた培養液のｐＨを５以上に調整し、かつ放置することにより、放置前の培養液に含まれているｍｈＩＧＦ−Ｉの量よりも、放置後の培養液に含まれているｍｈＩＧＦ−Ｉの量の方が少なくなる。対応して、放置前の培養液に含まれているｈＩＧＦ−Ｉの量よりも、放置後の培養液に含まれているｈＩＧＦ−Ｉの量の方が多くなる。ｍｈＩＧＦ−Ｉの減少量に比してｈＩＧＦ−Ｉの増加量の方が多くなることがあるが、これは、いかなる理論にも拘束されるものではないが、放置している間に、培養液中に存在するｈＩＧＦ−Ｉの異性体（ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ｈＩＧＦ−Ｉ）がｈＩＧＦ−Ｉに異性化されることよっても、ｈＩＧＦ−Ｉの量が増加するためと考えられる。
逆相ＨＰＬＣによる純度測定では、例えば、培養終了時には、ｈＩＧＦ−Ｉの量に対して約２０％のｍｈＩＧＦ−Ｉが含まれているが、２５℃、２０時間の放置後には１％未満となる。
従って、本発明の方法によれば、培養終了後の培養液の処理条件を適切に選ぶことにより，ｍｈＩＧＦ−Ｉ除去目的のクロマトグラフィー精製操作を施さなくても、該クロマトグラフィー精製操作を施したのと同程度の量のｍｈＩＧＦ−Ｉを除去することができ、精製操作が大幅に簡略化される。

本発明の（ｃ）工程の後に、（ｃ）工程で得られたｈＩＧＦ−Ｉ溶液をさらに精製し、ｍｈＩＧＦ−Ｉ以外の不純物も除くことができる。精製手段は第一の態様に記載したのと同じである。

工程（ａ）の前に、又は工程（ａ）中に、さらに前記培養液に有機溶媒を添加してもよい（工程（ｄ））。有機溶媒を添加することにより、工程（ａ）を開始する際、または工程（ａ）中の培養液のｐＨをその値に維持できる。有機溶媒としては、エタノール等を用いることができる。有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、およびアセトニトリルからなる群から選ばれるのが好ましい。有機溶媒を添加することにより、菌体の活動によって生じる培養液のｐＨの変動を防止することができる。これにより、有機溶媒を加えた以降の工程および必要に応じて本発明の方法に続いて行っても良い精製工程のｐＨ管理が容易になる。
有機溶媒の添加量としては、培養液の全体積に対して１／４以上が好ましく、１／４〜１／３がより好ましい。

ｈＩＧＦ−ＩおよびｍｈＩＧＦ−Ｉの各種分析に際し、
・逆相ＨＰＬＣによる含量決定、純度決定、および分取、
・Ｎ末端配列分析装置によるＮ末端配列決定、
・各種質量分析計による分子質量決定、
・タンデム質量分析による構造情報の取得
・細胞増殖活性を指標とする生物活性の測定、
・タンパク質分解酵素による限定分解、還元ＣＭ化
は，いずれもこの分野で通常行われている常套手段を用いて実施できる。

以下、本発明を実施例および比較例により更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［参考例］：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ６８７２の細胞表層タンパク質のシグナル配列、およびｈＩＧＦ−Ｉをコードする配列を有する融合遺伝子を用いたｈＩＧＦ−Ｉの分泌生産
（１）「ｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子の構築」
ｈＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列は既に決定されている（J Biol Chem, 1978. 253(8): p. 2769-76）ので、このアミノ酸配列をコードするような塩基配列を構築した。構築した塩基配列を参考にして配列番号１〜６に示したプライマーを合成し、配列番号１〜６に示したプライマー自身を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。その後、このＰＣＲ反応産物ＤＮＡを鋳型とし、配列番号７と配列番号８に示したプライマーを用いて再度ＰＣＲ反応を行った。配列番号８に示したプライマーは、プラスミドへ挿入するために必要な制限酵素ＸｂａＩの認識配列を含んでいる。
ＰＣＲ反応の結果、アガロースゲル電気泳動により約０．２ｋｂの増幅断片を検出した。この断片をＥＡＳＹ ＴＲＡＰ Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてアガロースゲルから回収した。回収したＤＮＡをＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ＵＰ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）により精製し、特開平９−０７０２９１号公報記載のｐＶＣ７のＳｍａＩ部位に挿入することによって、ｐＶＣＩＧＦｍを得た。ダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）とＤＮＡシークエンサー３７７Ａ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて挿入断片の塩基配列の決定を行い、予想通りの遺伝子が構築されていることを確認した。

配列番号１：5'-GGCCCTGAAACTCTGTGTGGTGCCGAACTGGTGGATGCCTTGCAGTTTGT-3'
配列番号２：5'-TTGTTAAAATAGAAGCCGCGATCGCCGCACACAAACTGCAAGGCATCCAC-3'
配列番号３：5'-CGCGGCTTCTATTTTAACAAACCAACCGGTTACGGTTCCAGCTCCCGCCG-3'
配列番号４：5'-CACTCATCGACGATTCCGGTTTGTGGAGCGCGGCGGGAGCTGGAACCGTA-3'
配列番号５：5'-ACCGGAATCGTCGATGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGCGACCTCCGCCGCCT-3'
配列番号６：5'-GCCTCTAGATCATGCGGATTTTGCGGGCTTCAGGGGTGCGCAGTACATCTCCAGGCGGCGGAGGTCGCAGCT-3'
配列番号７：5'-GGCCCTGAAACTCTGTGTGG-3'
配列番号８：5'-GCCTCTAGATCATGCGGATTTTGCGGGCT-3'

（２）「Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９の細胞表層蛋白質遺伝子（ｃｓｐＢ）のプロモーター、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ６８７２の細胞表層タンパク質のシグナル配列を有するｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子の構築」
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９の細胞表層蛋白質遺伝子（ｃｓｐＢ）のプロモーター、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ（以下、Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓと称す） ＡＴＣＣ６８７２の細胞表層タンパク質のシグナル配列を有するプロトランスグルタミナーゼの融合遺伝子は既に構築されて、ｐＰＳＰＴＧ１としてプラスミド上にクローン化されている（Kikuchi, Y. et al., Secretion of active-form Streptoverticillium mobaraense transglutaminase by Corynebacterium glutamicum: processing of the pro-transglutaminase by a cosecreted subtilisin-Like protease from Streptomyces albogriseolus. Appl Environ Microbiol, 2003. 69(1): p. 358-66.）。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９の細胞表層蛋白質遺伝子（ｃｓｐＢ）の配列を参考にして配列番号９と配列番号１０に示したプライマーを合成し、ｐＰＳＰＴＧ１を鋳型としＰＣＲ反応を行った。配列番号１０に示したプライマーはｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子との融合遺伝子を構築するために、ｈＩＧＦ−ＩのＮ末端側のアミノ酸をコードする配列を含んでいる。

配列番号９：5'-GGCGGTACCCAAATTCCTGTGAATTAGCTG-3'
配列番号１０：5'-CCACACAGAGTTTCAGGGCCTGCCGTTGCCACAGGTGCGG-3'

一方、参考例（１）の配列番号７と配列番号８のプライマーを用い、ｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子の配列を含んでいる参考例（１）で構築したプラスミドｐＶＣＩＧＦからｈＩＧＦ−Ｉをコードする領域をＰＣＲ法にて増幅した。
次に、増幅させたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９の細胞表層蛋白質遺伝子（ｃｓｐＢ）のプロモーター、およびＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ６８７２の細胞表層タンパク質のシグナル配列をコードする領域のＰＣＲ反応液１μＬと、やはり増幅させたｈＩＧＦ−Ｉの遺伝子領域のＰＣＲ反応液１μＬを混ぜて鋳型とし、配列番号９と配列番号８を用いてクロスオーバーＰＣＲを行い、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９の細胞表層蛋白質遺伝子（ｃｓｐＢ）のプロモーター、およびＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ６８７２の細胞表層タンパク質のシグナル配列をコードする領域に接続されたｈＩＧＦ−Ｉの融合遺伝子を増幅させた。アガロースゲル電気泳動により約０．９ｋｂの増幅断片を検出した。この断片をＥＡＳＹ ＴＲＡＰ Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてアガロースゲルから回収した。回収したＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩとＸｂａＩ（宝酒造社製）により切断し、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ＵＰ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）により精製し、特開平９−３２２７７４記載のプラスミドｐＰＫ４（カナマイシン耐性遺伝子を含む）のＫｐｎＩ−ＸｂａＩ部位に挿入することによって、ｐＰＳＩＧＦｍを得た。ダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）とＤＮＡシークエンサー３７７Ａ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて挿入断片の塩基配列の決定を行い、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。

（３）「ｈＩＧＦ−Ｉ生産株の作製」
（２）で作製したｈＩＧＦ−Ｉ発現プラスミドｐＰＳＩＧＦｍを用いてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＪ１２０３６（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３４）（ＷＯ／２００２／０８１６９４明細書）をエレクトロポレーション法により形質転換し、カナマイシン耐性株を取得した。

［実施例１］
（１）「組換えコリネ型細菌の培養液の調製」
２５ｍｇ/Ｌのカナマイシンを含むＣＭ２Ｇ寒天培地（酵母エキストラクト １０ｇ、トリプトン １０ｇ、グルコース ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、寒天 １５ｇ、水で１Ｌにする）で３０℃で一晩生育した（３）で作製したｈＩＧＦ−Ｉ生産株を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＣＭ２Ｇ液体培地（酵母エキストラクト １０ｇ、トリプトン １０ｇ、グルコース ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、水で１Ｌにする）の２０ｍＬを含む５００ｍＬ容の坂口フラスコに接種し、３０℃で一晩培養した。これをシードとして用いた。メイン培養として、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＭＭＴＧ液体培地（グルコース １２０ｇ、ＣａＣｌ₂ ２ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ３ｇ、ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ ０．０３ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０３ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ３ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ １．５ｇ、チアミン塩酸塩 ４５０μｇ、ビオチン ４５０μｇ、ＤＬ−メチオニン ０．１５ｇ、ｐＨ６．７、水で１Ｌにする）を１Ｌ容量のジャーファーメンターに３００ｍＬ張り込み、シード量は５％（１５ｍＬ）とし、アンモニアガスを添加してｐＨ６．７に維持しながら、３０℃、３日間、通気攪拌培養を行なった。

（２）「培養終了後の培養液のｐＨ調整と放置」
培養終了後、２５℃まで冷却した培養液の温度を一定に保ちつつ、穏やかに攪拌を続けながら，培養液の１／４体積のエタノールを該培養液に添加した。エタノール添加後の培養液のｐＨは６．８であった。ｐＨの測定は、校正したガラス電極を用いて２５℃で実施した（以下全て同じ）。エタノール添加終了直後に、培養液を複数に分割し，１０質量％酢酸または１０質量％アンモニア水を用いて培養液のｐＨを約９．０，約８．０，約６．８，約６．１，約５．２に調整した。なお、ｐＨ約６．８，約６．１，約５．２は比較例である。ｐＨを調整した後，培養液を穏やかに攪拌しながら２５℃で約１７時間放置した。陰性対照として、培養終了後の培養液の一部を別に取り、穏やかに攪拌しながら２５℃で約１７時間放置した。
エタノール添加後にｐＨを調整した培養液のｐＨは、約１７時間放置した後も、調整時の値が維持されていることが確認された。一方、陰性対照では、約１７時間放置した後の培養液のｐＨは約５．６であり、変動していることが確認された。

（３）「培養液からの菌体の除去」
各培養液をマイクロチューブに移し、小型遠心機を用いて１５，０００回転、１０分間遠心し、菌体を分離した。得られた遠心上清を、細孔径０．２μｍの除菌フィルターでろ過し、得られたろ液を菌体除去済み培養液とした。

（４）「ｈＩＧＦ−Ｉの純度および収率の評価」
菌体除去済み培養液中のｈＩＧＦ−Ｉの純度および収率は、逆相ＨＰＬＣにより評価した。結果を図１中、“ａ”から“ｇ”に示す。図１中、“ａ”は、培養終了後であって、エタノール添加前の培養液から調製した菌体除去済み培養液のクロマトグラムを、“ｂ”は，培養終了後にエタノールを添加せず、ｐＨ調整も行わずに放置した培養液から調製した菌体除去済み培養液のクロマトグラムを、“ｃ”、“ｄ”、“ｅ”、“ｆ”、“ｇ”はエタノール添加後にｐＨをそれぞれ約９．０，約８．０，約６．８，約６．１，約５．２に調整して放置した培養液から調製した菌体除去済み培養液のクロマトグラムを示す。なお、図１中、保持時間１１．７分付近に現れているピークはｈＩＧＦ−Ｉのピークであり、保持時間１２．２分付近に、ｈＩＧＦ−Ｉのピークの右肩に現れている小さなピークはｍｈＩＧＦ−Ｉのピークである。“ａ”より、培養終了時にｍｈＩＧＦ−Ｉが副生物として発生していることがわかる。“ｂ”より、ｐＨを調整しなかった培養液において、ｈＩＧＦ−Ｉが減少し、ｍｈＩＧＦ−Ｉが増加していることがわかる。“ｃ”、“ｄ”、“ｅ”、“ｆ”、“ｇ”を比較すると、ｍｈＩＧＦ−Ｉの量はｐＨに依存して変化し，ｐＨ８以上では減少することがわかる。“ａ”から“ｇ”のクロマトグラムを比較すると、ｈＩＧＦ−Ｉのピーク高さが最も高く、かつｍｈＩＧＦ−Ｉのピーク高さが最も低いのは、ｐＨを９に調整して放置した培養液であることがわかる。“ａ”のクロマトグラムから決定されたｈＩＧＦ−Ｉの量（培養終了直後のｈＩＧＦ−Ｉの量）を１００％とすると、“ａ”のクロマトグラムから決定されたｍｈＩＧＦ−Ｉの量（培養終了直後のｍｈＩＧＦ−Ｉの量）、“ｃ”のクロマトグラムから決定されたｈＩＧＦ−Ｉの量（放置後のｈＩＧＦ−Ｉの量）、および“ｃ”のクロマトグラムから決定されたｍｈＩＧＦ−Ｉの量（放置後のｍｈＩＧＦ−Ｉの量）は、それぞれ２０％、１４０％、０％であった。
なお、逆相ＨＰＬＣに使用したカラムはＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ８ ＯＣ３０Ｓ０５−１０４６ＷＴ，粒子径５μｍ，ポアサイズ３０ｎｍ，内径４．６ｍｍ，高さ１００ｍｍ（株式会社ワイエムシィ），流速は１ｍＬ／ｍｉｎとした。溶出には，溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液，溶離液Ｂ：０．１％ＴＦＡ及び８０％アセトニトリルを含有する水溶液を用い，０−５ｍｉｎで３２％溶離液Ｂ−３４％溶離液Ｂの直線濃度勾配，５−１６ｍｉｎで３４％溶離液Ｂ−３９％溶離液Ｂの直線濃度勾配，１６−１７ｍｉｎで３９％溶離液Ｂ−１００％溶離液Ｂの直線濃度勾配をかけた後，必要に応じて洗浄した。実施例２も同様である。

［試験例］
「ｈＩＧＦ−ＩおよびｍｈＩＧＦ−Ｉの構造および物性の確認」
図１中“ａ”を示した菌体除去済み培養液を得たのと同様にして得られた菌体除去済み培養液を逆相ＨＰＬＣに供し、保持時間１１．７分付近に現れているピーク、および、このピークの右肩の保持時間１２．２分付近に現れているピークをそれぞれ分取した。本分取操作を複数回行い、以下の分析操作を実施するに十分な量のｈＩＧＦ−ＩサンプルおよびｍｈＩＧＦ−Ｉサンプルを得た。続いて、得られたサンプルをそれぞれ濃縮乾固した後、ｈＩＧＦ−Ｉサンプルについては、質量分析、Ｎ末端アミノ酸配列分析、生物活性測定に、ｍｈＩＧＦ−Ｉサンプルについては、質量分析、Ｎ末端アミノ酸配列分析に供した。その結果、ｈＩＧＦ−Ｉサンプルについては、質量分析、Ｎ末端アミノ酸配列分析、生物活性測定全てにおいて、比較サンプルとして測定した市販ｈＩＧＦ−Ｉ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ，ＩＮＣ． Ｈｕｍａｎ ＩＧＦ−Ｉ Ｃａｔ．＃１００−１１）と同等と判断される分析値を得た。ｍｈＩＧＦ−Ｉは、質量分析の結果、ｈＩＧＦ−Ｉよりも７０だけ大きい分子量を有しており、また、Ｎ末端アミノ酸配列分析の結果、Ｎ末端がブロックされていることがわかった。なお、質量分析は、ブルカー・ダルトニクス株式会社 エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析計ｍｉｃｒＯＴＯＦを、Ｎ末端アミノ酸配列分析は、株式会社島津製作所 全自動タンパク質一次構造分析装置ＰＰＳＱ−２１Ａを用いて実施した。生物活性は、ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２２）を用いて、Cancer Research, 1988. 48: p. 4083-92に示される方法を参考にして、細胞増殖活性を指標に決定した。

次に、濃縮乾固したｍｈＩＧＦ−Ｉサンプルを用いて、タンパク質分解酵素Ａｓｐ−Ｎ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ａｓｐ−Ｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ． １１４２０４８８００１）による限定分解、続いて還元ＣＭ化反応を行い、得られたペプチド混合物をキャピラリー液体クロマトグラフィータンデム質量分析に供した。その結果、ｈＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列上、アミノ酸残基番号１番から１１番までからなるペプチドの分子量よりも７０だけ大きい分子量を有するペプチド由来のイオンが検出された。さらに、このイオンを親イオンとする衝突誘起解離イオンを解析した結果、ｈＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列上、アミノ酸残基番号１番から３番からなるペプチドの分子量よりも７０だけ大きい分子量を有するペプチド由来のイオンが検出された。以上より、ｍｈＩＧＦ−Ｉは、Ｎ末端が修飾されたｈＩＧＦ−Ｉであって、ｈＩＧＦ−Ｉよりも７０だけ大きい分子量を有する分子種であることがわかった。なお、キャピラリー液体クロマトグラフィータンデム質量分析はサーモサイエンティフィック社 イオントラップ型質量分析計ＬＣＱを用いて実施した。

さらに、同様に濃縮乾固したｈＩＧＦ−ＩサンプルおよびｍｈＩＧＦ−Ｉサンプルを用いて、Ａｓｐ−Ｎによる限定分解、続いて還元ＣＭ化反応を行って得られたそれぞれのペプチド混合物を逆相ＨＰＬＣに供し、ｈＩＧＦ−Ｉから得られるアミノ酸残基番号１番から１１番までからなるペプチドおよびｍｈＩＧＦ−Ｉから得られるアミノ酸残基番号１番から１１番までからなるペプチドをそれぞれ分取した。これら２種のペプチドをそれぞれ濃縮乾固した後２％の酢酸を含む５０％メタノール水溶液に溶解し、ｈＩＧＦ−Ｉ由来Ｎ末端ペプチド溶液、ｍｈＩＧＦ−Ｉ由来Ｎ末端ペプチド溶液とした。これらを混合し、高分解能質量分析に供したところ、モノアイソトピックイオンのｍ／ｚ値として約１１４７および約１２１７の二つの分子種の存在が確認され、それらの精密な質量差は７０．０４であった。なお、逆相ＨＰＬＣに使用したカラムはＳｕｎＦｉｒｅ（ＴＭ） Ｃ１８，粒子径５μｍ，内径４．６ｍｍ，高さ１５０ｍｍ（日本ウォーターズ株式会社），流速は１ｍＬ／ｍｉｎとした。溶出には，溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液，溶離液Ｂ：０．１％ＴＦＡ及び８０％アセトニトリルを含有する水溶液を用い，０−５ｍｉｎは０％溶離液Ｂ，５−６ｍｉｎで０％溶離液Ｂ−１５％溶離液Ｂの直線濃度勾配，６−３６ｍｉｎで１５％溶離液Ｂ−４５％溶離液Ｂの直線濃度勾配をかけた後，必要に応じて洗浄した。本条件で，ｈＩＧＦ−Ｉから得られるアミノ酸残基番号１番から１１番までからなるペプチドおよびｍｈＩＧＦ−Ｉから得られるアミノ酸残基番号１番から１１番までからなるペプチドは、それぞれ保持時間２５分付近および２６分付近に溶出する。高分解能質量分析はブルカーダルトニクス社 フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計ＡＰＥＸ−ＩＩ ７０ｅを用いて実施した。

また、上記ｈＩＧＦ−Ｉ由来Ｎ末端ペプチド溶液およびｍｈＩＧＦ−Ｉ由来Ｎ末端ペプチド溶液をそれぞれマトリックス支援レーザ脱離イオン化タンデム飛行時間型質量分析計に供し、ｍ／ｚ値それぞれ約１１４７および約１２１７のイオンを親イオンとする衝突誘起解離イオンを比較したところ、約１２１７のイオンを親イオンとした場合にのみ、ｍ／ｚ値が約１００のイオンが見出された。ｈＩＧＦ−Ｉから得られるアミノ酸残基番号１番から１１番までからなるペプチドから、衝突誘起解離によって生じるＮ末端グリシン由来のａ１イオンの質量は３０である。これに７０を加えた値が１００となるため、このｍ／ｚ値が約１００のイオンは、ｍｈＩＧＦ−Ｉから得られるアミノ酸残基番号１番から１１番までからなるペプチドから衝突誘起解離によって生じたａ１イオンと考えられ，ｍｈＩＧＦ−Ｉから得られるアミノ酸残基番号１番から１１番までからなるペプチドでは，Ｎ末端グリシンのアミノ基に７０の質量増加が起こっているものと推定された。なお、マトリックス支援レーザ脱離イオン化タンデム飛行時間型質量分析は、島津製作所 ＡＸＩＭＡ−ＴＯＦ２を用いて実施し、マトリックスにはα−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄを用いた。

［実施例２］
「培養終了後にｈＩＧＦ−Ｉ生産菌を除去して放置した時のｍＩＧＦ−Ｉの量の変化」
図１中“ａ”を示した菌体除去済み培養液を、２５℃で約２０時間放置した。放置開始時の培養液のｐＨは６．４であり、放置終了時にｐＨの変化は見られなかった。
放置終了後に、この菌体除去済み培養液中のｈＩＧＦ−Ｉの純度および収率を、逆相ＨＰＬＣにより評価した。結果を図１、“ｈ”に示す。本条件により、ｍｈＩＧＦ−Ｉが減少し、ｈＩＧＦ−Ｉが増加していることがわかる。“ａ”のクロマトグラムから決定されたｈＩＧＦ−Ｉの量を１００％とすると、“ｈ”のクロマトグラムから決定されたｈＩＧＦ−Ｉの量（放置後のｈＩＧＦ−Ｉの量）、および“ｈ”のクロマトグラムから決定されたｍｈＩＧＦ−Ｉの量（放置後のｍｈＩＧＦ−Ｉの量）は、それぞれ１２０％、０％であった。

本発明の方法により得られるｈＩＧＦ−Ｉは、バイオ医薬品の有効成分となるタンパク質を生産する細胞、例えばＣＨＯ細胞の培地添加剤として使用できる。

実施例１及び２の逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。 “ａ”から“ｇ”は実施例１の逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムである。“ａ”は、培養終了後であって、エタノール添加前の培養液から調製した菌体除去済み培養液のクロマトグラムを、“ｂ”は，培養終了後にエタノールを添加せず、ｐＨ調整も行わずに放置した培養液から調製した菌体除去済み培養液のクロマトグラムを、“ｃ”、“ｄ”、“ｅ”、“ｆ”、“ｇ”はエタノール添加後にｐＨをそれぞれ約９．０，約８．０，約６．８，約６．１，約５．２に調整して放置した培養液から調製した菌体除去済み培養液のクロマトグラムを示す。 “ｈ”は実施例２の逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムである。すなわち、培養終了後の培養液から調製した菌体除去済み培養液を放置した後に、該培養液を逆相ＨＰＬＣに供して得られたクロマトグラムを示す。

Claims (15)

1. ヒトインシュリン様成長因子Ｉの製造方法であって、該製造方法が、
   （Ａ） ヒトインシュリン様成長因子Ｉ生産菌の培養液のｐＨを培養終了後に８以上に調整する工程；
   （Ｂ） 工程（Ａ）で得られた培養液を放置する工程；および
   （Ｃ） 工程（Ｂ）で得られた培養液から該生産菌を除去する工程；
   を含む、ヒトインシュリン様成長因子Ｉから、修飾を受けたヒトインシュリン様成長因子Ｉを除去する工程を含むことを特徴とする前記製造方法。
2. 前記生産菌が、組換えコリネ型細菌である請求項１記載の製造方法。
3. 前記組換えコリネ型細菌が、組換えＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである請求項２記載の製造方法。
4. 工程（Ａ）の前に、工程（Ａ）の後であって工程（Ｂ）の前に、又は工程（Ａ）中に、前記培養液に有機溶媒を添加する工程（Ｄ）を更に含む、請求項１〜３いずれか１項記載の製造方法。
5. 前記有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、およびアセトニトリルからなる群から選ばれる請求項４記載の製造方法。
6. 工程（Ｂ）において、前記培養液を２時間以上放置する、請求項１〜５のいずれか１項記載の製造方法。
7. 工程（Ｂ）において、前記培養液を−１０〜５０℃の温度において放置する、請求項１〜６のいずれか１項記載の製造方法。
8. ヒトインシュリン様成長因子Ｉの製造方法であって、該製造方法が、
   （ａ） ヒトインシュリン様成長因子Ｉ生産菌の培養液から該生産菌を除去する工程；
   （ｂ） 工程（ａ）で得られた培養液のｐＨを５以上に調整する工程；および
   （ｃ） 工程（ｂ）で得られた培養液を放置する工程；
   を含む、ヒトインシュリン様成長因子Ｉを含む培養液から、修飾を受けたヒトインシュリン様成長因子Ｉを除去する工程を含むことを特徴とする前記製造方法。
9. 前記生産菌が、組換えコリネ型細菌である請求項８記載の製造方法。
10. 前記組換えコリネ型細菌が、組換えＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである請求項９記載の製造方法。
11. 工程（ａ）の前に、又は工程（ａ）中に、前記培養液に有機溶媒を添加する工程（ｄ）を更に含む、請求項８〜１０のいずれか１項記載の製造方法。
12. 前記有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、およびアセトニトリルからなる群から選ばれる請求項１１記載の製造方法。
13. 工程（ｃ）において、前記培養液を２時間以上放置する、請求項８〜１２のいずれか１項記載の製造方法。
14. 工程（ｃ）において、前記培養液を−１０〜５０℃の温度において放置する、請求項８〜１３のいずれか１項記載の製造方法。
15. ヒトインシュリン様成長因子Ｉの製造方法であって、該製造方法が、
    （Ａ） ヒトインシュリン様成長因子Ｉを生産するコリネ型細菌の培養液のｐＨを培養終了後に８以上に調整する工程；
    （Ｂ） 工程（Ａ）で得られた培養液を放置する工程；および
    （Ｃ） 工程（Ｂ）で得られた培養液から該菌体を除去する工程；
    を含み、かつ、上記（Ａ）および（Ｂ）の工程に有機溶媒が存在しないことを特徴とする、前記製造方法。

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