JP2008249565A - 細胞標本調製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 細胞観察に支障をきたすことなく、できるだけ大きな細胞標本を提供できる細胞標本調製方法を提供すること。
【解決手段】 板材であるスライドグラス上に、細胞を含む液体を滴下し、該液体が滴下された平面に対して概垂直方向に遠心力を加えて細胞標本を調製する方法において、該細胞が拡大することを特徴とする細胞標本調製方法によって達成される。このとき遠心力を加えたのちの細胞数は１ｍｍ^２あたりに５ｘ１０^３個よりも低い値とされていることが好ましく、遠心力は回転中心からスライドグラスまでの距離を９５ｍｍに換算して回転数が２００ｒｐｍ以上であることが好ましい。
【選択図】 図８

Description

本発明は、細胞診などに用いる細胞標本の調製方法に関する。

細胞をスライドグラスの表面に固定する方法は様々なものが存在する。それらのうち、安価なことから、引きガラス法や摺りあわせ法が繁用されている。しかし、均等な塗抹を行うためには、技術的な習熟が求められる。
これに対し、細胞標本を調製する方法として、例えば特許文献１に開示されたものがある。この方法では、予めスライドグラスを希釈液で濡らしておき、この部分に細胞組織片の割面を押し付け、そのスライドグラスがなす平面に対して平行にスライドグラスを回転させて遠心力を加えるというものである。

また、直接遠心塗抹法で用いられる装置として、サイトスピン、オートスメアなどがある。これらの装置を用いると、同時に他検体を処理できることに加え、均一な結果を得ることができる。図１には、サイトスピン１の構造を簡単に示した。図中の左側は、装置の駆動前の停止した状態を、右側は、駆動中の状態を示している。サイトスピン１の内部空間には、複数のチャンバー２が遠心軸３に対して対称的に配置されている。チャンバー２には、細胞を含む細胞懸濁液４を導入するテーパー状のサンプル導入筒５と、この筒の下端部に連結して細胞懸濁液４を移動させるパイプ部６と、パイプ部６の他端に配置されるスライドグラス７とが設けられている。

装置が停止した状態で、チャンバー２にスライドグラス７を配置し、サンプル導入筒５に細胞懸濁液４を導入した後、サイトスピン１を駆動する。すると、スライドグラス７が回転方向に対して、鉛直方向の位置に起立し、この状態で遠心力がかけられる。細胞懸濁液４中の細胞は、サンプル導入筒５の下端からパイプ部６を通り、スライドグラス７の表面において所定の位置に塗布・固定される。細胞が塗布される面積は、約２０ｍｍ^２であり、ここに約１０^６個の細胞が張り付く。このため、細胞数は１ｍｍ^２あたりに約５ｘ１０^４個程度となる。
特開平７−７７４８５号公報

サイトスピンを用いた細胞調製方法では、細胞の大きさは、それほど変化せず、元の形に近い状態での観察が行える。しかし、細胞同士が密着した状態があり、異形細胞の同定が困難となる場合がある。また、細胞中の微小器官（例えば、核内の染色体、細胞質中の微小繊維など）を観察しようとする場合には、解像度を上げる等の工夫を必要とした。
本発明は上記した事情に鑑みたものであり、その目的は、細胞観察に支障をきたすことなく、できるだけ大きな細胞標本を提供できる細胞標本調製方法を提供することである。

本発明者らは、鋭意検討の結果、従来の調製方法よりも少ない細胞数とすることにより、各細胞を大きくでき、かつ従来通りの細胞観察方法を使用できることを見出し、基本的には本発明を完成するに至った。
こうして、上記目的を達成するための第１の発明に係る細胞標本調製方法は、板材上に細胞を含む液体を滴下し、該液体が滴下された平面に対して概垂直方向に遠心力を加えて細胞標本を調製する方法において、該細胞が拡大することを特徴とする。
第２の発明に係る細胞標本調製方法は、板材上に細胞を含む液体を滴下し、該液体が滴下された平面に対して概垂直方向に遠心力を加えて細胞標本を調製する方法において、隣り合う細胞内組織が実質的に重ならないことを特徴とする。
上記発明においては、遠心力を加えたのちの前記細胞数は、１ｍｍ^２あたりに５ｘ１０^３個よりも低い値とされていることが好ましい。
また、遠心力は、板材の当該平面から回転の中心軸までの距離を９５ｍｍに換算して回転数を２００ｒｐｍ以上として加えられることが好ましい。このとき、遠心力の加速度（ｍ／ｓ^２）は、約４０となる。本発明においては、この加速度以上がかかるようにすれば、細胞は良好に拡大する。
また、前記細胞内組織が、細胞核であることが好ましい。
また、前記板材としては、スライドグラスが挙げられる。
本発明に適用可能な細胞としては、各種臓器の細胞（例えば、肝臓、肺、胃、腸、脾臓、腎臓、心臓、脳、神経、血管、リンパ管）に加えて、血液細胞（例えば、赤血球、白血球（リンパ球、マクロファージ、ＮＫ細胞などを含む））、培養細胞などが含まれる。各細胞によって、大きさが異なるので、隣り合う細胞内組織が実質的に重ならない細胞数は、適当に変化させる必要がある。当業者であれば、そのような検討は容易に行える。

本発明によれば、各細胞を大きくした状態で板材の表面に固定することができる。このとき、元の細胞の構造は維持されているので、免疫蛍光染色法、蛍光インサイツハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）などを適用することが可能である。また、各細胞同士の接触度合が低いために、重なり合いも小さい。このため、分解能が良好な状態で、細胞診を行うことができる。

次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
本実施形態の細胞標本調製方法を実施するにあたり、細胞観察用のスライドグラスがなす平面に対して鉛直方向に遠心力を加える装置として、サイトスピン４（サーモ・シャンドン社製）を用いた。この装置は、同時に１２枚のスライドを調製することができる。チャンバー内の所定位置にスライドグラスと細胞懸濁液とを配置し、適度な速度と時間で遠心処理することにより、スライドグラスの表面に細胞が塗布・固定される。

＜実施例１＞
細胞として、ヒト白血病細胞（ＨＬ６０）を用いた。培養中の細胞を遠心分離（１２００ｒｐｍ、５ｍｉｎ．）して回収し、上清を除去した後、ＰＢＳで洗浄した。細胞数が２.５ｘ１０^４個／ｍｌとなるように、ＰＢＳに懸濁し、液量を変化させて、サイトスピン（回転中のスライドグラスから回転の中心軸までの距離が９５ｍｍであるもの）にセットした。細胞数は、スライドグラスに固定される面積（約２０ｍｍ^２）に対して、１ｘ１０^５個〜５ｘ１０^２個とした。１ｍｍ^２あたりには、約５ｘ１０^３個〜２５個の細胞が固定されることになる。なお、スライドグラスあたりに５ｘ１０^５個の細胞数としたものをコントロールとした。また、遠心速度を８００ｒｐｍ、遠心時間を５分間とした。
遠心処理後のスライドグラスは、常法に従って、メタノールで固定した後、細胞を染色した。このスライドグラスを顕微鏡で観察した。
結果を表１、及び図２〜図４に示した。

表１及び図４に示すように、スライドグラスあたりの細胞数を１ｘ１０^５個〜５００個まで減少させることにより、スライドグラス上に固定される細胞の大きさは、約２倍〜約１３倍まで大きくなった。このときの細胞の様子を図２（コントロール）と図３（５００個）とで比較すると、少ない細胞数で遠心した場合には、細胞同士が良好に分離され、かつ非常に大きくなっていることが判った（図２と図３とは、同じ倍率（１６０倍）で観察したものである）。なお、データは示さないが、１スライドあたりの細胞数を２５０個、或いは１２５個とした場合には、５００個とほぼ同等の結果が得られた。

＜実施例２＞
実施例１と同じ細胞について、スライドグラスあたりの細胞数を３ｘ１０^４個とし、遠心速度を２００ｒｐｍ〜１２００ｒｐｍの間で、遠心時間を１分間〜６分間の間で、それぞれ変化させて、コントロールに対する細胞の大きさの変化を調べた。
遠心速度を４００、８００、及び１２００ｒｐｍとしたときの結果を図５〜図７に示した。いずれの条件においても、細胞はコントロールに比べると、良好に拡大しており、これらの条件にほとんど影響を受けないことが判った。なお、データは示さないが、遠心速度を２００ｒｐｍとした場合も、ほぼ同様の結果であった。

次に、本実施形態によって得られた巨大細胞の調製方法の原理について、図８を参照しつつ考察する。
通常条件において、サイトスピンを実施するときには、スライドグラスあたりの細胞数は５ｘ１０^５〜１ｘ１０^６程度である。この条件を図８（Ａ）に模式的に示した。スライドグラス７上の細胞１０に遠心力Ｆがかかった場合には、細胞の密度が高いために、近接する細胞同士の押圧力により、各細胞の広がりが抑えられるために、拡大率Ｌはそれほど大きくならない。
一方、図８（Ｂ）に示すように、細胞数を減少させていくと、近接する細胞間の距離が大きくなり、遠心力Ｆによる細胞１０の広がりが抑えられず、各細胞が大きな拡大率Ｍを伴って、巨大化するものと考えられる（図８（Ｂ））。これは、細胞の拡大率が細胞数の減少に伴うこと、及び遠心力には因らないことから理解される。よって、本実施形態の細胞調製方法を用いることにより、目的に応じて観察する細胞サイズを自由に調節でき、解析の解像度を増加することができる。

＜実施例３＞
次に、巨大細胞を従来の生化学的或いは分子生物学的手法で観察できるか否かについて、検討した。各種の細胞（例えば、白血病細胞株ＨＬ６０、子宮頸癌細胞株ｈｅｌａ、出芽酵母細胞株など）をそれぞれ細胞数１０^４個（スライドグラスあたり）、遠心速度８００ｒｐｍ、遠心時間５分間でサイトスピンにより、遠心処理し巨大細胞を調製した。巨大細胞のそれぞれについて、特定の遺伝子やタンパク質をＦＩＳＨ法や免疫蛍光染色法により可視化し、蛍光顕微鏡で観察した結果を図９〜図１２に示した。
図９〜図１１に示すように、ＹＡＣ、ＢＡＣ、及びｃｏｓｍｉｄの長さの異なる遺伝子配列に対応するＤＮＡクローンを良好に観察することができた。また、図１２に示すように、核膜に存在するタンパク質（ラミンＢ）の蛍光を良好に観察することができた。
これらのことから、本実施形態によって調製された巨大細胞においては、元の細胞の構造を維持した状態のままであることが明らかとなった。
このように本実施形態によれば、各細胞を巨大化した状態でスライドグラスの表面に固定することができた。このとき、元の細胞の構造は維持されているので、免疫蛍光染色法、ＦＩＳＨ法などを適用することが可能であった。また、各細胞同士の接触度合が低いために、重なり合いも小さい。このため、分解能が良好な状態で、細胞診を行うことができた。

サイトスピンの構造を示す概略図である。図示左側は、停止状態の位置、図示右側は、回転状態の位置をそれぞれ示す。この図は、「Ｓｈａｎｄｏｎ Ｃｙｔｏｓｐｉｎ４ Ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ」のカタログに基づき作成したものである。 スライドグラスあたり５ｘ１０^５個の細胞を２００ｒｐｍ、５分間の遠心処理を行った後の細胞の様子を示す顕微鏡写真図である（倍率は１６０倍）。 スライドグラスあたり５ｘ１０^２個の細胞を２００ｒｐｍ、５分間の遠心処理を行った後の細胞の様子を示す顕微鏡写真図である（倍率は１６０倍）。 スライドグラスあたりの細胞数（横軸）と、細胞の拡大率（縦軸）との関係を示すグラフである。スライドグラスには、２０ｍｍ^２の面積について細胞が固定される。このため１ｍｍ^２あたりの細胞数に換算すると、横軸は２.５ｘ１０ ｃｅｌｌｓ／ｍｍ^２〜２.５ｘ１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｍｍ^２となる。 遠心速度が４００ｒｐｍのときの遠心時間（横軸）と、細胞核の半径（縦軸）との関係を示すグラフである。 遠心速度が８００ｒｐｍのときの遠心時間（横軸）と、細胞核の半径（縦軸）との関係を示すグラフである。 遠心速度が１２００ｒｐｍのときの遠心時間（横軸）と、細胞核の半径（縦軸）との関係を示すグラフである。 巨大細胞の調製方法の原理を示す図である。（Ａ）は従来の調製方法の様子を、（Ｂ）は本実施形態の調製方法の様子をそれぞれ示している。 ＦＩＳＨ法により、巨大細胞中の７１Ｂ１１ ＹＡＣを観察したときの顕微鏡写真図である（倍率は６３０倍）。 ＦＩＳＨ法により、巨大細胞中の１５８Ｎ１ ＢＡＣを観察したときの顕微鏡写真図である（倍率は６３０倍）。 ＦＩＳＨ法により、巨大細胞中のＣ９３ ｃｏｓｍｉｄを観察したときの顕微鏡写真図である（倍率は６３０倍）。 免疫蛍光染色法により、巨大細胞中のラミンＢを観察したときの顕微鏡写真図である（倍率は６３０倍）。

符号の説明

７…スライドグラス（板材）

Claims (5)

1. 板材上に細胞を含む液体を滴下し、該液体が滴下された平面に対して概垂直方向に遠心力を加えて細胞標本を調製する方法において、該細胞が拡大することを特徴とする細胞標本調製方法。
2. 板材上に細胞を含む液体を滴下し、該液体が滴下された平面に対して概垂直方向に遠心力を加えて細胞標本を調製する方法において、隣り合う細胞内組織が実質的に重ならないことを特徴とする細胞標本調製方法。
3. 遠心力を加えたのちの前記細胞数は、１ｍｍ^２あたりに５ｘ１０^３個よりも低い値とされていることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞標本調製方法。
4. 遠心力は、板材の当該平面から回転の中心軸までの距離を９５ｍｍに換算して回転数を２００ｒｐｍ以上として加えられることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞標本調製方法。
5. 前記細胞内組織が、細胞核であることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載の細胞標本調製方法。