JP2008139147A - 液体クロマトグラフ装置 - Google Patents

Abstract

【課題】機差に起因した測定結果の偏差を解消することができる液体クロマトグラフ装置を提供する。
【解決手段】本発明によると、予め、液体クロマトグラフの溶離液到達時間Ｔを求める。溶離液到達時間Ｔは、ポンプによって混合された溶離液が検出器に到達するまでの時間である。液体クロマトグラフを運転するとき、グラジエント送液を開始してから、溶離液到達時間Ｔに相当する時間が経過したとき、溶離液への試料の注入を開始する。溶離液への試料の注入の開始から所定時間経過後に、検出器から出力されているデータの収集を開始する。
【選択図】図１

Description

本発明は、液体クロマトグラフ装置に関し、特に、多成分同時分析を目的としたグラジエント溶出法を実行するのに好適な液体クロマトグラフ装置に関する。

液体クロマトグラフ装置では、毎分マイクロリットルレベルの複数の溶液を混合して供給するグラジエント送液が行われる。グラジエント送液とは、複数の溶液の混合比を、時間と共に、連続的に又は段階的に変化させながら、一定流量の混合液を連続的に送液する技術である。通常、２つの溶液の混合液を送液する。

近年、多数の液体クロマトグラフ装置を同時に運転し、多量の測定結果を生成し、そこから、目的成分の分析を行うことがある。この場合、装置間に機差があると、測定結果に機差に起因した偏差が含まれる。このような偏差を有する測定結果からは正確な分析結果は得られない。

従って、液体クロマトグラフ装置による測定結果を用いて目的成分の分析を行う場合には、測定結果に含まれる機差に起因した偏差を低減する必要がある。

特許文献１（特開2002-243712号公報）には、グラジエント溶出法による混合比率の偏りに関する補正方法が開示されている。

特開2002-243712号公報

特許文献１に記載されている技術は、ポンプ単体における混合比率の偏りに関する補正方法であり、液体クロマトグラフ装置の機差に起因した測定結果の偏差を解消する機能はない。

本発明の目的は、機差に起因した測定結果の偏差を解消することができる液体クロマトグラフ装置を提供することにある。

本発明によると、予め、液体クロマトグラフの溶離液到達時間Ｔを求める。溶離液到達時間Ｔは、ポンプによって混合された溶離液が分析カラムに到達するまでの時間である。液体クロマトグラフを運転するとき、グラジエント送液を開始してから、溶離液到達時間Ｔに相当する時間が経過したとき、溶離液中への試料の注入を開始する。溶離液中への試料の注入の開始直後又は所定時間経過後に、検出器から出力されているデータの収集を開始する。

本発明によると、機差に起因した測定結果の偏差を解消することができる。

図１を参照して本発明による液体クロマトグラフ装置の概要を説明する。本例の液体クロマトグラフ装置は、液体クロマトグラフ１０とデータ処理装置１００を有する。液体クロマトグラフ１０は、ポンプ１２、オートサンプラ１５、カラムオーブン１７、検出器１８等を有する。データ処理装置１００は、システム制御部１０１とデータ処理部１０４を有する。システム制御部１０１は、分析機器制御部１０２とパラメータ記憶部１０３を有する。

液体クロマトグラフ１０の詳細は、以下に、図２及び図５を参照して説明する。ここでは、データ処理装置１００を説明する。

分析機器制御部１０２は、パラメータ記憶部１０３からパラメータを入力し、ポンプ１２に制御信号を送信し、グラジエント送液を行う。グラジエント送液は、予め作成されたグラジエントプログラムに従って行う。パラメータ記憶部１０３は、グラジエント送液開始時間、試料注入開始時間、溶離液到達時間等を記憶するが、これらについては後に説明する。データ処理部１０４は、検出器１８の出力を処理し、分析結果を生成する。

尚、図１には示していないが、本例の液体クロマトグラフ装置は、ユーザがデータ及び命令を入力するための入力装置とデュエルボリュームを入力するためのデュエルボリューム設定画面を表示する表示装置とを有する。デュエルボリューム設定画面の例は図８に示す。

図２を参照して、本発明による液体クロマトグラフの構成例を説明する。本例の液体クロマトグラフは、２つの溶離液タンク１１ａ、１１ｂ、２つのポンプ１２ａ、１２ｂ、ジョイント１３、ミキサ１４、オートサンプラ１５、分析カラム１６、分析カラム１６の恒温装置であるカラムオーブン１７、検出器１８、廃液タンク１９、及び、洗浄液タンク２０を有する。２つの溶離液タンク１１ａ、１１ｂには、異なる溶離液が収容されている。ポンプ１２ａ、１２ｂは、グラジエント送液用ポンプであり、２つの溶離液の混合比率を変化させながら一定量を送液することができる。２つの溶離液タンク１１ａ、１１ｂに収容されている溶離液は、２つのポンプによって吸引され、ジョイント１３に送られる。２つの溶離液は、ジョイント１３で混合される。ジョイント１３からは一定の流量の混合液が、ミキサ１４に送られる。混合液は、ミキサ１４を通過することによって、混合される。

ミキサ１４から出た溶離液は、オートサンプラ１５に送られる。オートサンプラ１５にて、試料が溶離液中に注入される。試料が注入された溶離液は、分析カラム１６に送られる。分析カラム１６によって試料に含まれる成分が分離される。分析カラム１６は、カラムオーブン１７によって常に一定の温度に恒温される。分析カラム１６によって分離された成分は、検出器１８によって検出される。検出器１８からの廃液は、廃液タンク１９に収容される。オートサンプラ１５は洗浄液タンク２０に収容されている洗浄液によって洗浄される。

ここで、液体クロマトグラフの溶離液到達時間を次の式によって定義する。
Ｔ ＝ DV / F.R. 式１
T：溶離液到達時間(s)
DV：デュエルボリューム(uL)
F.R.：ポンプ流量(Flow Rate)(uL/s)

デュエルボリュームDVは、ジョイント１３から分析カラム１６までの溶離液の経路の全体積である。例えば、ミキサ１４の体積をＶｍ、配管の体積をＶｐとすると、DV＝Ｖｍ＋Ｖｐである。ポンプ流量は、ポンプからの溶離液の混合液の流量である。２つのポンプ溶離液到達時間Ｔは、ジョイント１３から分析カラム１６までの経路に溶離液が充填されている状態で、ジョイント１３を出発した溶離液が分析カラム１６に到達するまでの時間である。溶離液到達時間Ｔは、ジョイント１３から分析カラム１６までの経路に充填されている溶離液が新しい溶離液によって完全に置換されるまでの時間である。

デュエルボリュームDV及びポンプ流量F.R.は、液体クロマトグラフ毎に決まる一定値である。従って、溶離液到達時間Ｔは、液体クロマトグラフ毎に決まる一定値である。デュエルボリュームDVを正確に求めることは困難であるが、溶離液到達時間は実測が可能である。

先ず、液体クロマトグラフ装置の標準装置を仮定する。標準装置を用いて、溶離液到達時間を求める。これを標準溶離液到達時間Ｔoと呼ぶ。次に、実際の分析に使用する液体クロマトグラフ装置について、溶離液到達時間を求める。これをＴ１とする。分析に使用する液体クロマトグラフ装置の溶離液到達時間の偏差は次の式によって求められる。

ΔＴ＝Ｔ１−Ｔo
ポンプ流量F.R.が全ての装置において一定であると仮定すると、この偏差ΔＴは、デュエルボリュームDVの偏差に対応する。即ち、偏差ΔＴは、その液体クロマトグラフ装置の機差を表わす。この偏差ΔＴの影響を消去することにより、機差のない測定データを得ることができる。

図３を参照して本発明による液体クロマトグラフ装置の運転方法を説明する。ここでは、３つの液体クロマトグラフ装置の運転を例に説明する。第１の液体クロマトグラフ装置は、機差があり、その溶離液到達時間をＴ１とする。第２の液体クロマトグラフ装置は、機差のない液体クロマトグラフ装置、即ち、標準装置である。標準溶離液到達時間をＴｏとする。第３の液体クロマトグラフ装置は、機差があり、その溶離液到達時間をＴ２とする。ここで、Ｔ１＜Ｔｏ＜Ｔ２である。即ち、第１の液体クロマトグラフ装置の溶離液到達時間Ｔ１は、標準溶離液到達時間Ｔｏより小さく、第２の液体クロマトグラフ装置の溶離液到達時間Ｔ２は、標準溶離液到達時間Ｔｏより大きい。

これらの溶離液到達時間Ｔ１、Ｔ２及び標準溶離液到達時間Ｔｏは予め求められているものとする。

図３は、これらの液体クロマトグラフ装置の運転のタイムチャートである。このタイムチャートは、時間軸３００、液体クロマトグラフの運転３０１、グラジエント送液３０２、オートサンプラによる試料注入３０３〜３０５、データ収集３０６〜３０８を含む。図示のように、時点ｔ１にて、液体クロマトグラフの運転を開始する。即ち、ポンプ１２ａ、１２ｂを作動し、溶離液を供給する。但し、この時点では、未だ、グラジエント送液が開始されていない。従って、ポンプ１２ａ、１２ｂからは１つの溶離液のみが供給される。例えば、第１の溶離液が供給される。第１の溶離液は、ジョイント１３、ミキサ１４、オートサンプラ１５、分析カラム１６を通過し、検出器１８に到るまで流れる。こうして、第１の溶離液によってジョイント１３から検出器１８に到る経路が充填される。次に、時点ｔ２にて、グラジエント送液を開始する。２つのポンプ１２ａ、１２ｂからは、２つの溶離液の混合液が一定の流量にて供給される。この混合液は、第１の溶離液に対して所定の比率にて第２の溶離液が混合されたものである。第１の溶離液に対する第２の溶離液の混合比率は、時間の経過とともに増加する。２つの溶離液の混合比率が変化しても、流量は一定である。次に、オートサンプラ１５によって試料を溶離液中に注入する。ここでは、以下に、３つの場合を説明する。

先ず、第１の液体クロマトグラフ装置の場合を説明する。線３０４にて示すように、グラジエント送液の開始時点ｔ２から時間Ｔ１だけ経過した時点ｔ３にて、オートサンプラ１５による試料注入を開始する。時点ｔ３では、グラジエント送液による２つの溶離液の混合液が、丁度、検出器１８に到達している。次に、線３０７にて示すように、時点ｔ６にて検出器１８から出力されているデータの収集を行う。

次に、第２の液体クロマトグラフ装置、即ち、標準装置の場合を説明する。線３０３にて示すように、グラジエント送液の開始時点ｔ２から時間Ｔoだけ経過した時点ｔ４にて、オートサンプラ１５による試料注入を開始する。時点ｔ４では、グラジエント送液による２つの溶離液の混合液が、丁度、検出器１８に到達している。次に、線３０６にて示すように、時点ｔ７にて検出器１８から出力されているデータの収集を行う。

第３の液体クロマトグラフ装置の場合を説明する。線３０５にて示すように、グラジエント送液の開始時点ｔ２から時間Ｔ２だけ経過した時点ｔ５にて、オートサンプラ１５による試料注入を開始する。時点ｔ５では、グラジエント送液による２つの溶離液の混合液が、丁度、検出器１８に到達している。次に、線３０８にて示すように、時点ｔ８にて検出器１８から出力されているデータの収集を行う。

こうして、本例では、グラジエント送液の開始時点を溶離液到達時間に基づいて決定する。そのため、液体クロマトグラフの機差を表わす溶離液到達時間の偏差を解消することができる。従って、検出器１８から出力されるデータは機差の影響を受けることはない。

図４を参照して、本発明による液体クロマトグラフ装置の運転方法を説明する。ステップＳ１０１にて、分析に使用する液体クロマトグラフ装置の溶離液到達時間Ｔ１を求める。ステップＳ１０２にて、その液体クロマトグラフ装置の運転を開始する。最初は、グラジエント送液を行わない。従って、１つの溶離液を送液する。ここでは第１の溶離液を送液する。第１の溶離液が、ジョイント１３、ミキサ１４、オートサンプラ１５、分析カラム１６を通過し、検出器１８に到るまで流れると、ステップＳ１０３にて、グラジエント送液を開始する。第１の溶離液に対して所定の比率にて第２の溶離液を付加する。２つの溶離液の混合比率が変化しても、流量は一定である。ステップＳ１０４にて、グラジエント送液開始から時間Ｔ１が経過すると、オートサンプラによって溶離液への試料の注入を開始する。ステップＳ１０５にて、試料の注入を開始すると同時に、又は、所定の時間が経過したとき、検出器からの出力データの収集を開始する。

図５を参照して、本発明による液体クロマトグラフの他の構成例を説明する。本例の液体クロマトグラフは、ポストカラム誘導体化法を用いた高速液体クロマトグラフである。本例の高速液体クロマトグラフは、２つの溶離液タンク１１ａ、１１ｂ、２つのポンプ１２ａ、１２ｂ、ジョイント１３、ミキサ１４、オートサンプラ１５、分析カラム１６、分析カラム１６の恒温装置であるカラムオーブン１７、検出器１８、廃液タンク１９、洗浄液タンク２０、ジョイント２１、反応コイル２２を有する反応コイルユニット２３、反応ポンプ２４、及び、反応液タンク２５を有する。

本例の液体クロマトグラフは、図２に示した例と比較して、分析カラム１６の後の処理が異なる。本例では、反応液タンク２５に収容されている反応液は、反応ポンプ２４によってジョイント２１に供給される。ジョイント２１では、分析カラム１６によって分離されてきた成分と反応ポンプ２４から供給された反応液が混合される。混合液は、反応コイル２２に送られる。混合液は、反応コイル２２を通過する過程で、分離成分と反応液が完全に反応し、反応生成物が生成される。この反応生成物は、検出器１８によって検出される。

本例では、デュエルボリュームDVは、ジョイント１３から分析カラム１６までの溶離液の経路の全体積である。例えば、ミキサ１４の体積をＶｍ、配管の体積をＶｐとすると、DV＝Ｖｍ＋Ｖｐである。

図６を参照して、オートサンプラ１５の概略を説明する。オートサンプラ１５は注入バルブ６０とサンプルループ７０を有する。注入バルブ６０は、６つのポート６１〜６６を有する。第１のポート６１は、ミキサ１４に接続され、第２のポート６２は分析カラム１６に接続されている。第３のポート６３と第６のポート６６の間は、サンプルループ７０によって接続されている。第４のポート６４から図示しないニードルによって洗浄液又は試料が注入される。第５のポート６５はドレインに接続されている。

図６Ａに示すように、液体クロマトグラフの運転が開始されると、第２のポート６２と第３のポート６３が接続され、第４のポート６４と第５のポート６５が接続され、第６のポート６６と第１のポート６１が接続される。従って、ミキサ１４から供給された溶離液は、第１のポート６１、第６のポート６６、サンプルループ７０、第３のポート６３、第２のポート６２を経由して、分析カラム１５に送られる。一方、ニードルからの洗浄液は、第４のポート６４から導入され第５のポート６５からドレインに排出される。従って、この状態では、試料が注入されていない溶離液が、オートサンプラ１５を通過する。

図６Ｂに示すように、次に、サンプルループに試料を充填する。第１のポート６１と第２のポート６２が接続され、第３のポート６３と第４のポート６４が接続され、第５のポート６５と第６のポート６６が接続される。従って、ミキサ１４から供給された溶離液は、第１のポート６１及び第２のポート６２を経由して、分析カラム１５に送られる。ニードルからの試料は、第４のポート６４から注入され第３のポート６３を経由してサンプルループ７０に導かれ、第６のポート６６及び第５のポート６５を経由してドレインに放出される。

こうして、サンプルループ７０が試料で充填されると、図６Ａに示すように、バルブを切り替える。ミキサ１４から供給された溶離液は、第１のポート６１及び第６のポート６６を経由して、サンプルループ７０に導かれる。サンプルループ７０内の試料は、溶離液によって押し出され、第３のポート６３及び第２のポート６２を経由して分析カラム１６に導かれる。

図７は液体クロマトグラフ装置によるアミノ酸分析のシュミレーション結果を示す。図７Ａは、従来の運転方法によって得られた分析結果であり、図７Ｂは、本発明による運転方法によって得られた分析結果である。これらのグラフにて。横軸は保持時間、縦軸は検出器からの信号強度である。保持時間は、データの収集を開始してから経過した時間である。

図７Ａの上側のグラフは、機差を有する液体クロマトグラフ装置によって得られた分析結果であり、図７Ａの下側のグラフは、機差を有さない液体クロマトグラフ装置、即ち、標準装置によって得られた分析結果である。図示のように、機差を有する液体クロマトグラフ装置によって得られた分析結果では、標準装置によって得られた分析結果と比べて、ピークが現れる保持時間が０．４ｍｉｎだけ遅い。これは、機差を有する液体クロマトグラフ装置では、機差、即ち、デュエルボリュームDVが標準装置のデュエルボリュームDVより大きいからである。

図７Ｂの上側のグラフは、機差を有する液体クロマトグラフ装置によって得られた分析結果であり、図７Ｂの下側のグラフは、機差を有さない液体クロマトグラフ装置、即ち、標準装置によって得られた分析結果である。図示のように、機差を有する液体クロマトグラフ装置によって得られた分析結果は、標準装置によって得られた分析結果と比べて、ピークが現れる保持時間が０．１ｍｉｎだけ遅い。即ち、図７Ａの場合より、ピークの現れる時点の遅れが小さい。これは、機差を有する液体クロマトグラフ装置では、オートサンプラによる試料の注入時間を調整しているからである。

図８は、本発明の液体クロマトグラフ装置の表示装置に表示されるデュエルボリューム設定画面の例を示す図である。図示のデュエルボリューム設定画面では、先行グラジエントにチェックが記入され、デュエルボリュームには、３００マイクロリットルが設定されている。ここで設定されたデュエルボリュームを式１に代入して、溶離液到達時間が求められる。溶離液到達時間に基づいて、グラジエント送液の開始時点が設定される。

図９及び図１０を参照して説明する。図９は、デュエルボリュームを設定しない従来の方法による実験結果を示し、図１０は、デュエルボリュームを設定する本発明による方法による実験結果を示す。実験条件は次の通りである。
試料希釈溶媒：アセトニトリル
試料の注入量：100ppm 5μL
検出器：UV247nm（高耐圧セミミクロセル、レスポンス0.01s、SP10ms）

図９Ａ及び図１０Ａは、グラジエントプログラムを示す。従来の方法と本発明の方法では同一のグラジエントプログラムを用いる。グラジエントプログラムの条件は次の通りである。
Ａ：水
Ｂ：アセトニトリル
温度：40℃
流量：1.2mL/min

図示のように、最初、水とアセトニトリルの比は、６５：３５であったが、１分後には、５：９５に変化している。

図９Ｂ及び図１０Ｂは、測定結果のグラフであり、図９Ｃ及び図１０Ｃは、測定結果のピークの数値である。ピークが現れる時間を、図９Ｂ及び図９Ｃに示す従来の方法と図１０Ｂ及び図１０Ｃに示す本発明の方法で比較する。本発明の方法では従来の方法と比較してピークが現れる時間が早い。図９Ｂ及び図９Ｃに示すように、従来の方法では、９番目のピークが現れる時間は１．２ｍｉｎである。一方、図１０Ｂ及び図１０Ｃに示すように、本発明の方法では、９番目のピークが現れる時間は０．９３ｍｉｎである。従って、本発明による分析方法を用いると、分析時間を短縮することができる。

更に、ピーク幅を、図９Ｃに示す従来の方法と図１０Ｃに示す本発明の方法で比較する。図９Ｃの右端の欄に示す従来の方法によるピーク幅（半値幅）と、図１０Ｃの右端の欄に示す本発明の方法によるピーク幅（半値幅）を比較すると明らかなように、本発明の方法では従来の方法と比較してピーク幅が狭い。即ち、本発明によると、分離精度が高くなる効果が得られる。

以上本発明の例を説明したが本発明は上述の例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲にて様々な変更が可能であることは当業者に容易に理解されよう。

本発明によると、グラジエント溶出法の時間遅れに関するハードウエアのデッドボリュームの機差をソフトウエアのデータ処理上の調節パラメータを用いて補償することができ、ピークの保持時間などのシステム間の機差を抑えることができる。

本発明の液体クロマトグラフ装置の構成例を示す図である。 本発明の液体クロマトグラフの構成例を示す図である。 本発明の液体クロマトグラフ装置の運転スケジュールを示す図である。 本発明の液体クロマトグラフ装置の運転方法の例を示す図である。 本発明のポストカラム誘導体化法を用いた高速液体クロマトグラフの構成例を示す図である。 本発明の液体クロマトグラフ装置のオートサンプラの構成例を示す図である。 本発明の液体クロマトグラフ装置の運転方法のシミュレーション結果を示す図である。 本発明の液体クロマトグラフ装置のデュエルボリューム設定画面の例を示す図である。 デュエルボリュームを設定しない場合の実験結果を示す図である。 デュエルボリュームを設定した場合の実験結果を示す図である。

符号の説明

１１、１１ａ、１１ｂ…溶離液タンク、１２、１２ａ、１２ｂ…ポンプ、１３…ジョイント、１４…ミキサ、１５…オートサンプラ、１６…分析カラム、１７…カラムオーブン、１８…検出器、１９…廃液タンク、２０…洗浄液タンク、２１…ジョイント、２２…反応コイル、２３…反応コイルユニット、２４…反応ポンプ、２５…反応液タンク、１００…データ処理装置、１０１…システム制御部、１０２…分析機器制御部、１０３…パラメータ記憶部、１０４…データ処理部

Claims (15)

1. 複数の溶離液を時間的に変化する比率にて供給するグラジエント送液を行うポンプと、溶離液に試料を注入するオートサンプラと、試料に含まれる成分を分離する分析カラムと、を有する液体クロマトグラフ装置において、
   上記ポンプから送液された溶離液が上記分析カラムに到達するまでの溶離液到達時間を予め測定しておき、グラジエント送液を開始してから、上記溶離液到達時間に相当する時間が経過したとき、上記オートサンプラから試料を溶離液に注入することを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
2. 請求項１記載の液体クロマトグラフ装置において、上記オートサンプラによる試料注入を開始した直後又は所定の時間が経過してからデータの収集を開始することを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
3. 請求項１記載の液体クロマトグラフ装置において、上記ポンプの流量をF.R.、上記ポンプの出口から上記分析カラムの入口までの流路の全体積であるデュエルボリュームをDV、とすると、上記溶離液到達時間は次の式によって表わされることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
   Ｔ ＝ DV / F.R.
   T：溶離液到達時間(s)
   DV：デュエルボリューム(μL)
   F.R.：ポンプ流量(Flow Rate)(μL/s)
4. 請求項１記載の液体クロマトグラフ装置において、上記オートサンプラは注入バルブとサンプルループを有し、上記注入バルブを切り替えることによって試料を溶離液に注入することを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
5. 請求項１記載の液体クロマトグラフ装置において、上記分析カラムによって分離された成分を検出する検出器を備えることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
6. 請求項５記載の液体クロマトグラフ装置において、上記検出器からの出力データを収集するデータ処理部を備えることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
7. 請求項６記載の液体クロマトグラフ装置において、上記データ処理装置は、上記溶離液到達時間を格納しているパラメータ記憶部を有することを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
8. 請求項１記載の液体クロマトグラフ装置において、上記ポンプから供給された溶離液を混合するミキサを備えることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
9. 請求項１記載の液体クロマトグラフ装置において、上記分析カラムによって分離された成分に反応液を供給する反応液ポンプと、上記成分と上記反応液を混合する反応コイルと、が設けられていることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
10. 請求項１記載の液体クロマトグラフ装置において、ユーザがデータ及び命令を入力するための入力装置とデュエルボリュームを入力するためのデュエルボリューム設定画面を表示する表示装置とを有し、上記デュエルボリューム設定画面はユーザが設定するためのデュエルボリュームを入力する欄が設けられていることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
11. 液体クロマトグラフ装置によって試料を分析する方法において、
    ポンプを出発した溶離液がオートサンプラを経由して分析カラムに到達するまでの溶離液到達時間を測定する溶離液到達時間測定ステップと、
    上記ポンプを起動して溶離液を上記オートサンプラを経由して上記分析カラムまで流す溶離液供給ステップと、
    上記ポンプによって、複数の溶離液を時間的に変化する比率にて供給するグラジエント送液を開始するグラジエント送液開始ステップと、
    上記グラジエント送液を開始してから、上記溶離液到達時間に相当する時間が経過したとき、上記オートサンプラによる試料注入を開始する試料注入開始ステップと、
    を含む試料分析方法。
12. 請求項１１記載の試料分析方法において、
    上記オートサンプラによる試料注入を開始した直後又は所定の時間が経過したときデータを収集するデータ収集開始ステップと、
    を含む試料分析方法。
13. 複数の溶離液を時間的に変化する比率にて供給するグラジエント送液を行う複数のポンプと、溶離液に試料を注入するオートサンプラと、該オートサンプラからの溶離液より試料に含まれる成分を分離する分析カラムと、該分析カラムによって分離された成分を検出する検出器と、を有する液体クロマトグラフにおいて、
    上記ポンプを出発した溶離液が上記オートサンプラを経由して上記分析カラムに到達するまでの溶離液到達時間を予め測定しておき、上記ポンプによるグラジエント送液を開始してから、上記溶離液到達時間に相当する時間が経過したとき、上記オートサンプラによる試料注入を開始することを特徴とする液体クロマトグラフ。
14. 請求項１３記載の液体マトグラフにおいて、上記オートサンプラによる試料注入を開始した直後又は所定の時間が経過してから上記検出器からのデータの収集を開始することを特徴とする液体クロマトグラフ。
15. 請求項１３記載の液体クロマトグラフにおいて、上記分析カラムによって分離された成分に反応液を供給する反応液ポンプと、上記成分と上記反応液を混合する反応コイルと、が設けられ、上記反応コイルから出た反応生成物は上記検出器によって検出されることを特徴とする液体クロマトグラフ。

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