JP2008125364A

JP2008125364A - 光学活性アミノ酸及びｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸類の製造方法

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Publication number: JP2008125364A
Application number: JP2006310356A
Authority: JP
Inventors: Osamu Kato; 修加藤; Hiroyuki Mori; 浩幸森
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 2006-11-16
Filing date: 2006-11-16
Publication date: 2008-06-05

Abstract

【課題】
光学活性アミノ酸、及び光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸類を収率良く得ることができる光学活性アミノ酸、及び光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸類の製造方法を提供すること。
【解決手段】
ラセミ体アミノ酸アミドを含む水溶液のｐＨを酸により中性付近に調整した後、アミノ酸アミドのアミダーゼによる立体選択的加水分解反応を行う。その後、該水溶液に酸がほぼ中和されるｍｏｌ量の無機塩基化合物を加え、さらに水溶液の溶媒を水から炭素数３以上のアルコール溶媒で置換して光学活性アミノ酸を結晶回収する光学活性アミノ酸の製造方法。
加水分解反応液から回収された光学活性アミノ酸の精製操作を行うことなく光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸製造の原料として使用する、光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸の製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、光学活性アミノ酸及び光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸類の製造方法に関するものである。光学活性アミノ酸、及び光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸類は、抗生物質、ペプチド、ポリペプチド、たんぱく質及びアミノ酸配糖体等の化学合成において、ペプチド結合形成の際、目的化合物を選択的に得るための出発物質や中間体として用いられる。

生体触媒を用いた光学活性アミノ酸の製造方法としては、例えばアミダーゼ活性を有する生体触媒による光学分割による製造方法が挙げられる（特許文献１〜４）。該方法においては、加水分解反応後得られる光学活性アミノ酸及び光学活性アミノ酸アミドを含む水溶液から必要に応じ両化合物を分離しなければならない。分離方法としては、該水溶液に低級アルコールなどの水溶性有機溶剤を添加し、光学活性アミノ酸結晶を選択的に回収する方法（特許文献１、２）、水溶液の水を溜去した後、残渣を有機溶媒で洗浄し光学活性アミノ酸アミドを選択的に除去する方法（特許文献３）、水溶液の溶媒を水から炭素数３以上のアルコール溶媒で置換した後、光学活性アミノ酸結晶を得る方法（特許文献４）、が報告されている。しかし何れの報告にもアミノ酸アミドの立体選択的加水分解反応時、水溶液のｐＨが光学活性アミノ酸の蓄積濃度に与える影響について詳細な報告は無い。また水溶液のｐＨを調整するために用いた鉱酸が、後段の光学活性アミノ酸の分離、回収操作に与える影響ついての記載もない。

一方、光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸類は、光学活性アミノ酸及びＮ−アルコキシカルボニル化剤とを水性媒体中で反応させ、次いで生成したＮ−アルコキシカルボニルアミノ酸を反応液から回収、単離することで製造できる。アミノ酸とＮ−アルコキシカルボニル化剤との水性媒体中での反応は、塩基性化合物存在下、アミノ酸の水性媒体溶液にＮ−アルコキシカルボニル化剤を滴下して行う方法が報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。これら報告では、原料光学活性アミノ酸にはいずれも純品、あるいはそれに近似した純度有する光学活性アミノ酸を用いており、無機塩など不純物含有し純度が低い光学活性アミノ酸、例えば前述した生体触媒反応液から回収された光学活性アミノ酸の粗生成物を、光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸類の製造の原料として利用した報告は無かった。
Ｊ．Ｐｏｓｐｉｓｅｋ等、Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４２，１０６９（１９７７）ＧｕｉｄｏＢｏｌｄ等、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１，３３８７（１９９８）特開昭５９−１５９７８９号公報特開平１−１８６８５０号公報特開昭６１−２９３３９４号公報特開２００１−３２８９７０号公報

本発明の目的は、光学活性アミノ酸結晶を収率良く得ることができる操作性の良好な光学活性アミノ酸の製造方法、及び原料精製操作を必要とせず、製造効率、工程収率が改善された光学活性N−アルコキシカルボニルアミノ酸類の製造方法を提供することにある。

本発明では、下記の（１）〜（５）の工程を含む、光学活性アミノ酸の製造方法が提供される。
（１）ラセミ体アミノ酸アミドを含む水溶液の２０〜３０℃におけるｐＨを、酸を用いてｐＨ５．０〜９．８に調整する工程；
（２）前記水溶液に、アミダーゼ活性を有する生体触媒を加えてアミノ酸アミドの立体選択的加水分解反応を行う工程；
（３）（１）工程で使用した酸に対し、０．９００〜１．１００ｍｏｌ当量の無機塩基化合物を加える工程；
（４）前記水溶液の溶媒を、炭素数３以上のアルコール溶媒で置換する工程；
（５）光学活性アミノ酸アミドをアルコール溶液として分離し、光学活性アミノ酸結晶を回収する工程。
また、本発明では、上記製造方法によって得られた光学活性アミノ酸をさらに精製することなく使用し、該光学活性アミノ酸とＮ−アルコキシカルボニル化剤とを反応させる、光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸類の製造方法が提供される。

本発明によれば、操作性良好な光学活性アミノ酸結晶を収率良く得ることができる光学活性アミノ酸の製造方法、及び原料精製操作を必要とせず、製造効率、工程収率が改善された光学活性N−アルコキシカルボニルアミノ酸又はその塩（光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸類）の製造方法を提供することができる。

以下、本発明について詳細に説明する。

１．光学活性アミノ酸
本発明に関わる光学活性アミノ酸は下記一般式（I）で示される化合物の光学活性体である。

上記一般式（I）中、Ｒ₁及びＲ₂は、同一又は異なっており、水素原子、または任意
の置換基を示す。
任意の置換基としては、例えば、低級アルキル基、置換低級アルキル基、低級アルケニル基、置換低級アルケニル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、芳香族基、置換芳香族基、複素環基、又は置換複素環基等が好ましい。

一般式（Ｉ）で示される化合物としては、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、システイン、チロシン、リジン、ヒスチジン、２−アミノ酪酸、シクロヘキシルアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、６−ヒドロキシノルロイシン、ネオペンチルグリシン、ペニシラミン、ｔｅｒｔ−ロイシン、フェニルグリシン、２−クロロフェニルグリシン、３−クロロフェニルグリシン、４−クロロフェニルグリシン等が挙げられる。好ましくはノルバリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、フェニルグリシン、フェニルアラニンであり、特に好ましくはｔｅｒｔ−ロイシン、フェニルアラニンである。

２．光学活性アミノ酸の調製
光学活性アミノ酸の調製としては、例えばα−ケトカルボン酸のデヒドロゲナーゼ、または同活性を有する生体触媒用いた還元的不斉アミノ化反応、ラセミ体ヒダントインのヒダントイナーゼまたは同活性を有する生体触媒用いた立体選択的加水分解開環反応、ラセミ体Ｎ−アシル−アミノ酸のアシラーゼまたは同活性を有する生体触媒用いた立体選択的加水分解反応、ラセミ体アミノ酸エステルのエステラーゼまたは同活性を有する生体触媒用いた立体選択的加水分解反応、及びラセミ体アミノ酸アミドのアミダーゼを用いた立体選択的加水分解反応などの生体触媒反応が挙げられる。これらのうち、本発明にかかる光学活性アミノ酸の製造方法では、原料の汎用性、立体選択性などの観点から、ラセミ体アミノ酸アミドのアミダーゼ活性を有する生体触媒用いた立体選択的加水分解反応が採用される。

ラセミ体アミノ酸アミドのアミダーゼ活性を有する生体触媒を用いた立体選択的加水分解反応（以下、「アミダーゼによる立体選択的加水分解反応」とも称する）は、ラセミ体アミノ酸アミド水溶液にアミダーゼまたはアミダーゼ活性を有する生体触媒を加え、アミノ酸アミドに該触媒を作用させて行う。

ラセミ体アミノ酸アミド水溶液中のアミノ酸アミドの濃度は、１〜７０質量％とすることが好ましい。この範囲内であると光学活性アミノ酸の製造効率の点で好ましい。濃度は、５〜６０質量％とすることがより好ましく、１０〜５０質量％とすることが特に好ましい。

アミダーゼによる立体選択的加水分解反応の開始時、ラセミ体アミノ酸アミド水溶液のｐＨは、室温（具体的には２０〜３０℃付近）での測定値が５．０〜９．８となるように調整する（（１）工程）。この範囲内であるとアミダーゼ活性を有する生体触媒の触媒活性、反応収率、光学活性アミノ酸蓄積濃度などの点で好ましい。ｐＨは、５．５〜９．５とすることがより好ましく、６．０〜９．０とすることがさらに好ましい。ラセミ体アミノ酸アミド水溶液は通常塩基性を示すため、ｐＨ調整には酸を用いる。酸としてはリン酸、塩酸、硫酸などの鉱酸が挙げられ、この中で塩酸、硫酸を用いることがより好ましい。使用形態は、化合物そのもの若しくは水溶液の状態で用いることができる。

ｐＨ調整後、ラセミ体アミノ酸アミド水溶液にアミダーゼ活性を有する生体触媒を加え（以下、単に「触媒」とも称する）、アミノ酸アミドの立体選択的加水分解反応を行う（（２）工程）。触媒としては、水性媒体中でラセミ体アミノ酸アミドに立体特異的に作用し、光学活性アミノ酸と対応する光学特性を有するアミノ酸アミドを与える作用を有するものであれば、特に制限はなく使用することができる。
例えば以下に例示する（組換）微生物が産生するアミダーゼが好適に使用される。
・エンテロバクタ−・クロアッセイＮ−７９０１（ＦＥＲＭＢＰ−８７３）
・バチルス・ステアロサーモフィラスＮＣＩＭＢ８９２３
・サーマス・アクアティカＮＣＩＭＢ１１２４３
・サーマス属Ｏ−３−１株（ＦＥＲＭＢＰ−８１３９）
・オクロバクテリウム・アントロピＮＣＩＢ４０３２１
・クレブシェラ属ＮＣＩＢ４０３２２株
・Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＬＡ２０５（ＦＥＲＭＢＰ−７１３２）
・Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＭ５０１ＫＮこれらの微生物は、菌体をそのまま又は菌体処理物（洗浄菌体、乾燥菌体、菌体破砕物、菌体抽出物、粗又は精製酵素、及びこれらの固定化物）として反応に使用される。菌体又は菌体処理物の濃度は、その活性量により異なるがアミノ酸アミド質量に対し１／１００００〜１質量、好ましくは１／１０００〜１／１０質量である。この範囲内であると反応時間や触媒除去操作性が容易であるなどの点で好ましい。

反応温度は５〜７０℃の範囲が好ましい。この範囲内であると、反応時間、反応収率などの点で好ましい。１５〜６０℃がさらに好ましく、２５〜４５℃が特に好ましい。
反応中、水溶液のｐＨを調整するため、適宜酸または無機塩基化合物を添加しても良い。この場合、ｐＨは、２０〜３０℃での測定値が、５．０〜９．８となるように調整することが好ましく、５．５〜９．５とすることがより好ましく、６．０〜９．０とすることがさらに好ましい。

反応時間は、触媒量、ラセミ体アミノ酸アミドの種類により異なるが、通常５〜６０時間である。この範囲内であると反応収率、製造工程の操作効率などの点で好ましい。アミダーゼによる立体選択的加水分解反応の反応終了は、触媒や原料アミノ酸アミドの種類により異なるため一概ではないが、例えば下式で定義される原料変換率を高速液体クロマトグラフィーの分析値から算出し、原料変換率が９０％以上消費された時点で反応終了とすることが好ましく、９５％以上とすることがより好ましく、９９％以上とすることが特に好ましい。この範囲内であると、光学活性アミノ酸の収率が向上する。
原料変換率（％）＝（（目的とする鏡像体の光学活性アミノ酸ｍｏｌ量）Ｘ２００）／（（目的とする鏡像体の光学活性アミノ酸ｍｏｌ量）＋（残アミノ酸アミドｍｏｌ量））

３．酸の中和（（３）工程）
アミダーゼによる立体選択的加水分解反応後、光学活性アミノ酸及び光学活性アミノ酸アミド含有水溶液が得られる。反応後該水溶液中の酸がほぼ中和されるｍｏｌ量の無機塩基化合物を加える。無機塩基化合物を添加する操作は触媒除去前でも触媒除去後何れの段階で行っても構わない。

ここでいう酸がほぼ中和されるｍｏｌ量とは、酸のプロトン（Ｈ⁺）のほとんどが中和される量〜完全に中和される量〜若干過剰量を指し、具体的には、（１）工程で使用した酸（（２）工程でｐＨを調整するために酸を用いた場合はその酸も含む）に対し、０．９００〜１．１００ｍｏｌ当量の無機塩基化合物を加える。この範囲内であると、α−光学活性アミノ酸の収率、α−光学活性アミノ酸回収工程の操作性などの点で好ましい。無機塩基化合物の量は、０．９５０〜１．０５０ｍｏｌ当量であることが好ましく、０．９７５〜１．０２５ｍｏｌ当量であることが特に好ましい。例えば、酸として硫酸を使用し、無機塩基化合物として水酸化ナトリウムを使用したとして、水溶液中に硫酸１ｍｏｌが存在している場合、水酸化ナトリウムの添加量は１．８０〜２．２０ｍｏｌの範囲内である。さらに好ましくは１．９０〜２．１０ｍｏｌの範囲であり、１．９５〜２．０５ｍｏｌの範囲が特に好ましい。

無機塩基化合物としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩などが挙げられ、これらの中でアルカリ金属塩の強塩基化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどを用いることが好ましい。使用形態は、無機塩基性化合物そのもの若しくは水溶液の状態で用いることができる。
無機塩基化合物添加時の光学活性アミノ酸及び光学活性アミノ酸アミド含有水溶液の温度はアミノ酸、アミノ酸アミドの種類や濃度により異なるが、通常５〜７０℃の範囲である。

４．溶媒置換操作（（４）工程）
光学活性アミノ酸及び光学活性アミノ酸アミド含有水溶液の溶媒を水から置換する前に触媒を除去する。除去方法は特に限定しないが例えば、遠心分離、ろ過等の方法を用いて行うことができる。菌体又は該処理物を除去した反応液は必要に応じて減圧濃縮操作を行ってもよい。

得られた反応液又は濃縮液中の水を炭素数３以上の直鎖、分岐、あるいは環状アルコールの中から選ばれた少なくとも１種類以上の溶媒に置換する。アルコールとしてはイソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール、ｉ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｎ−アミルアルコール、シクロペンタノール、ｎ−ヘキシルアルコール、シクロヘキサノール、ｎ−オクタノールなどが挙げられる。これら溶媒は収率、操作効率などの点から好ましい。イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール、ｉ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｎ−アミルアルコール、シクロヘキサノールを用いることがより好ましく、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール、ｉ−ブタノール、ｎ−アミルアルコール、シクロヘキサノールを用いることが特に好ましい。

溶媒の置換は共沸等の操作によって行なわれ、触媒による立体選択的加水分解反応後得られる光学活性アミノ酸及び光学活性アミノ酸アミド含有水溶液に含まれる水を９０質量％以上までアルコール溶媒へと置換する。この値以上であると光学活性アミノ酸の収率などの点で好ましい。置換操作条件については、高い収率で光学活性アミノ酸が回収できるのであれば特に限定はない。たとえば、用いるアルコール、光学活性アミノ酸及び光学活性アミノ酸アミドの種類により異なるが、溶媒置換効率や光学活性アミノ酸結晶の晶径などの点から、通常減圧下、内温３０〜８０℃の範囲内で置換操作を行う。アルコール溶媒へ置換した後の光学活性アミノ酸の濃度は、光学活性アミノ酸の収率、純度及び操作効率などの点から１〜５０質量％が好ましく、より好ましくは５〜４０質量％、特に好ましくは１０〜３０質量％である。この時、光学活性アミノ酸及び／又は光学活性アミノ酸アミド結晶は析出していても、析出していなくてもどちらでもよい。

５．光学活性アミノ酸結晶の回収（（５）工程）
次に、上述のごとく調製した光学活性アミノ酸及び光学活性アミノ酸アミドを含むアルコール溶媒溶液を冷却して結晶を析出させる。この時純度向上や結晶晶径改善を目的に、冷却前にアルコール溶媒溶液を３０〜８０℃の範囲で加温しても良い。
冷却速度は、結晶成長、結晶純度などの点から６０℃／hr以下とすることが好ましい。また、５０℃／hr以下とすることがより好ましく、４０℃／hr以下とすることが特に好ましい。

光学活性アミノ酸結晶の単離は、ろ過又は遠心分離等により単離することができる。単離温度は操作性、取り扱いに優れた結晶が収率良く得られれば特に制限されないが、−１０〜４０℃とすることが好ましい。この範囲内であると結晶の収率及び純度が高い点で好ましい。温度は、０〜３０℃とすることが特に好ましい。

上述のようにして、光学活性アミノ酸及び光学活性アミノ酸アミド含有水溶液から高選択的に光学活性アミノ酸の結晶を単離することができる。通常、結晶中の光学活性アミノ酸アミドの含有量は、光学活性アミノ酸に対し１質量％未満である。この値以下であると後述する光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸類の製造において収率、製品Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸類の化学純度などの点で好ましい。得られた光学活性アミノ酸湿結晶は、保存安定性などの点から必要に応じ真空乾燥などの溶媒除去操作を行っても良い。

また、アルコール溶媒溶液として回収された光学活性アミノ酸アミドは公知の方法によってラセミ化し、アミダーゼによる立体選択的加水分解反応の原料に再利用できる。通常、ラセミ化反応は該アルコール溶媒溶液に強塩基化合物を加え加熱して行う。ラセミ化反応後、公知の方法、例えば晶析操作によってラセミ体アミノ酸アミドを回収し、アミダーゼによる立体選択的加水分解反応の原料に再利用する。

６．光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸類
本発明に係る光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸は、下記一般式（II）で示される化合物である。

上記一般式（II）中、Ｒ₁及びＲ₂は、同一又は異なっており、水素原子、または任意の置換基を示す。
任意の置換基としては、例えば、低級アルキル基、置換低級アルキル基、低級アルケニル基、置換低級アルケニル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、芳香族基、置換芳香族基、複素環基、又は置換複素環基等が好ましい。

上記一般式（II）中、−ＯＲ₃は、アルコキシ基であり、炭素数１〜８の直鎖又は分岐アルコキシ基、ベンジルオキシ基又はフェネチルオキシ基等が好ましく、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ｉｓｏ−プロポキシ基、ブトキシ基、ｉｓｏ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基又はベンジルオキシ基等が特に好ましい。

一般式（II）で示される化合物としては、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、システイン、チロシン、リジン、ヒスチジン、２−アミノ酪酸、シクロヘキシルアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、６−ヒドロキシノルロイシン、ネオペンチルグリシン、ペニシラミン、ｔｅｒｔ−ロイシン、フェニルグリシン、２−クロロフェニルグリシン、３−クロロフェニルグリシン、４−クロロフェニルグリシン等のＮ−アルコキシカルボニル誘導体が挙げられる。好ましくはノルバリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、フェニルグリシン、フェニルアラニンのＮ−アルコキシカルボニル誘導体であり、特に好ましくは、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ｔｅｒｔ−ロイシン、Ｎ−エトキシカルボニル−ｔｅｒｔ−ロイシン、Ｎ−メトキシカルボニル−ｔｅｒｔ−ロイシン、Ｎ−ベンジルオキシ−カルボニル−ｔｅｒｔ−ロイシン、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−フェニルアラニン、Ｎ−エトキシカルボニル−フェニルアラニン、Ｎ−メトキシカルボニル−フェニルアラニン又はＮ−ベンジルオキシカルボニル−フェニルアラニンである。

また場合によっては、光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸を酸性化合物の塩、又は塩基化合物の塩として回収しても良い。塩酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、カルシウム塩、メチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩などが操作性、収率などの面で好ましく、ジシクロヘキシルアミン塩がより好ましい。

７．光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸の調製
光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸は、光学活性アミノ酸とＮ−アルコキシカルボニル化剤とを水性媒体中で反応させ調製する。この時光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸製造の原料として、本発明にかかる光学活性アミノ酸の製造方法により、立体選択的加水分解反応の反応液から回収された光学活性アミノ酸の粗生成物を使用できる。例えば、上述アミダーゼによる立体選択的加水分解反応で光学活性アミノ酸は、通常結晶中に酸の中和操作により生じた無機塩を含んでいるが、公知の方法による無機塩除去操作、例えば再結晶又はイオン交換樹脂への吸着、などを行うことなく光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸製造の原料として使用できる。

Ｎ−アルコキシカルボニル化剤としては、アミノ酸のアミノ基をＮ−アルコキシカルボニル化できるものであれば良い。好ましくは、クロロギ酸エステル（例えば、クロロギ酸メチル、クロロギ酸エチル、クロロギ酸ベンジル）、ジアルキルジカーボネート（例えば、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート）等から適宜選択され、Ｎ−メトキシカルボニル−アミノ酸、Ｎ−エトキシカルボニル−アミノ酸、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−アミノ酸、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ酸等が得られる。

本発明において、水性媒体とは、水、あるいは水と水に親和性を有する有機溶媒との混合溶媒又は水と水に実質的に混和しない有機溶媒の二相系溶媒をいう。二相系溶媒を用いる場合は、その水相部分で反応を行う。

Ｎ−アルコキシカルボニル化反応は、塩基性条件下で行うことが好ましい。
水性媒体を塩基性に調整する際に用いる塩基性化合物としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン又はピリジン等の有機塩基化合物、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド又はカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド等のアルカリ金属アルコラート化合物、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム又は炭酸カリウム等の無機塩基化合物等が挙げられ、これら化合物の１種又は複数種を組み合わせて用いることができる。塩基性化合物の使用形態は、塩基性化合物そのもの若しくは水溶液又は有機溶媒溶液として用いることができる。

反応時の水性媒体のｐＨを１０〜５０℃での測定値が７．５〜１３．５の間で保つことがより好ましく、ｐＨを８〜１３の間で保つことが特に好ましい。この範囲内であると反応収率の点で好ましい。
反応液のｐＨを一定の範囲で保つ場合は上記塩基性化合物の１種又は複数種を組み合わせて適宜添加しても良い。

反応時間は、０．１〜１００時間が好ましい。この範囲内であると反応収率や反応温度・ｐＨ制御等操作性の点で好ましい。反応時間は、０．２〜２４時間とすることがより好ましく、１〜１５時間とすることが特に好ましい。反応温度は、０〜９０℃が好ましい。この範囲内であると反応収率の点で好ましい。反応温度は５〜６０℃とすることがより好ましく、１０〜３０℃とすることが特に好ましい。

Ｎ−アルコキシカルボニル化反応は、原料であるアミノ酸の量を高速液体クロマトグラフィーにより分析し、９０％以上消費された時点で反応終了とすることが好ましく、９５％以上とすることがより好ましく、９９％以上とすることが特に好ましい。この範囲内であると、Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸の収率が向上する。

上述のように、Ｎ−アルコキシカルボニル化反応によってＮ−アルコキシカルボニルアミノ酸水溶液が生成する。Ｎ−アルコキシカルボニル化反応後、回収光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸の純度向上を目的として、回収工程前にＮ−アルコキシカルボニルアミノ酸反応液のｐＨを、反応時のｐＨより高く、かつｐＨ１４未満に保持する操作を行っても良い。例えば、反応時のｐＨより、１０〜５０℃においての測定値で、０．２〜６．０高くすることが好ましく、０．２５〜４．０高くすることが更に好ましい。

Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸水溶液からのＮ−アルコキシカルボニルアミノ酸の回収操作については、高純度のＮ−アルコキシカルボニルアミノ酸を回収できる方法であれば良く、例えば、保持工程後のＮ−アルコキシカルボニルアミノ酸水溶液を酸性とした後、有機溶媒によってＮ−アルコキシカルボニルアミノ酸を抽出する方法、有機溶媒を添加した後、水相部分が酸性となるようにｐＨを調整し、有機溶媒によってＮ−アルコキシカルボニルアミノ酸を抽出する方法等が挙げられる。水溶液または水相部分のｐＨは、１０〜５０℃での測定値が、例えば、０．５〜６．０であることが好ましく、１．０〜５．０であることが更に好ましい。
ここで、水溶液または水相を酸性にするために添加する酸性物質としては、硫酸、塩酸、又は硝酸等の鉱酸が好ましい。

抽出に用いる有機溶剤としてはＮ−アルコキシカルボニルアミノ酸を効率よく抽出できるものであれば良い。例えば、酢酸エチル又は酢酸ブチル等のエステル類、トルエン又はキシレン等の芳香族炭化水素又はクロロベンゼン等のハロゲン化芳香族炭化水素、ｎ−ペンタン又はｎ−ヘキサン等の脂肪族炭化水素、クロロホルム又は塩化メチレン等のハロゲン化脂肪族炭化水素、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類等が挙げられる。この中でトルエン又はキシレン等の芳香族炭化水素又はクロロベンゼン等のハロゲン化芳香族炭化水素が、抽出効率、単離操作の操作収率などの点で好ましく、トルエン又はキシレン等の芳香族炭化水素がより好ましい。

抽出操作時の温度は３０〜８０℃の範囲が好ましい。この範囲であると抽出効率などの点で好ましく、４０〜７０℃の範囲がより好ましい。

光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸類の単離前に、純度向上や単離収率向上を目的として、光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸を含む有機溶媒溶液を、少量の水、及び／又は無機塩を含む水で洗浄する、あるいは／さらに共沸脱水等の脱水処理を行う等の操作を行っても良い。脱水処理後の光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸を含む有機溶媒溶液の水分濃度は、結晶成長、結晶純度、収率等が向上する点で０．５質量％以下とすることが好ましく、０．１質量％以下とすることがより好ましく、０．０５質量％以下とすることが特に好ましい。

光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸を含む有機溶媒溶液の光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸濃度は、２〜５０質量％とすることが好ましい。この範囲内であると操作が容易である。濃度は、５〜４０質量％とすることがより好ましく、１０〜３０質量％とすることが特に好ましい。

８．光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸類の単離工程
次に、上述のごとく調製したＮ−アルコキシカルボニルアミノ酸を含む有機溶媒溶液からＮ−アルコキシカルボニルアミノ酸類を単離する。
例えば光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸結晶を単離する場合、有機溶媒溶液から冷却晶析により光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸結晶を回収できる。
冷却速度は、結晶成長、結晶純度などの点から２５℃／hr以下とすることが好ましい。また、２０℃／hr以下とすることがより好ましく、１５℃／hr以下とすることが特に好ましい。

有機溶媒溶液からＮ−アルコキシカルボニルアミノ酸の析出してくる析出温度は、光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸の種類、濃度等により異なる。通常は、−１０〜８０℃のである。例えば、トルエンからＮ−メトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させる場合の析出温度は、濃度１５〜３０質量％のとき４５〜６５℃である。結晶析出後、冷却操作を継続しても良いが、結晶成長、結晶純度、収率等が向上する点で、光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸結晶が析出している有機溶媒溶液を析出した光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸結晶が完全に再溶解しない温度まで昇温し、光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸結晶の一部を残存させて再溶解させた後、再度、該溶液を冷却しても良い。冷却速度は、上述の条件と同じである。

単離温度は操作性、取り扱いに優れた結晶が収率良く得られれば特に制限されないが、−１０〜５０℃とすることが好ましい。この範囲内であると結晶の収率及び純度が高い点で好ましい。温度は、０〜４０℃とすることが特に好ましい。

また、光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸塩類、例えば光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸ジシクロヘキシルアミン塩を単離する場合、回収した光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸を含む有機溶媒溶液にジシクロヘキシルアミンを加え光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸ジシクロヘキシルアミン塩を調製した後、前述操作と同様にして晶析操作を行い、該塩を単離することができる。

上述のようにして、高い化学純度有する光学活性Ｎ−アルコキシカルボニル酸類を回収できる。通常化学純度は９８％以上である。光学活性アミノ酸の粗成生物を使用した場合でも、精製した高純度の光学活性アミノ酸を使用した場合と同様の化学純度を有する光学活性Ｎ−アルコキシカルボニル酸類を製造できるため、製造工程時間、収率などの点で工業的に優位である。

以下、本発明を実施例及び比較例により具体的に説明する。
なお、実施例中の化合物の分析は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行った。

＜ｔｅｒｔ−ロイシンアミド及びＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンのＨＰＬＣ分析条件＞
試料調製：反応液を純水で希釈する
カラム：イナートシルＯＤＳ−３ＶＧＬサイエンス社製
移動層：０．１％リン酸水溶液（ｖ／ｖ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの保持時間：約４．５分
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの保持時間：約８．７分

アミダーゼによる立体選択的加水分解反応での原料変換率は、上述分析条件により算出した原料ｔｅｒｔ−ロイシンアミド残量と生成Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン量から下式により計算した。
原料変換率（％）＝（（Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンｍｏｌ量）Ｘ２００）／（（Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンｍｏｌ量）＋（残ｔｅｒｔ−ロイシンアミドｍｏｌ量））

＜Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの結晶の化学純度のＨＰＬＣ分析条件＞
試料調製：結晶を純水に溶解し、１．０％ｗ／ｖ溶液を調製する
カラム：イナートシルＯＤＳ−３ＶＧＬサイエンス社製
移動層：０．１％リン酸水溶液（ｖ／ｖ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの保持時間：約４．５分
Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの保持時間：約８．７分

＜Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンのＨＰＬＣ分析条件＞
試料調製：反応液を移動層で希釈する
カラム：イナートシルＯＤＳ−３ＶＧＬサイエンス社製
移動層：１０ｍＭリン酸２水素１ナトリウム水溶液（ｐＨ３．０）：アセトニトリル（４０：６０）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ（２１０ｎｍ）
各化合物の保持時間：
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン約５．２分

＜Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン結晶の化学純度のＨＰＬＣ分析条件＞
試料調製：結晶を移動層に溶解し、０．５％ｗ／ｖ溶液を調製する
カラム：イナートシルＯＤＳ−３ＶＧＬサイエンス社製
移動層：１０ｍＭリン酸２水素１ナトリウム水溶液（ｐＨ３．０）：アセトニトリル（４０：６０）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ（２１０ｎｍ）
各化合物の保持時間：
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン約５．５分

＜Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンのＨＰＬＣ分析条件＞
試料調製：反応液をメタノールで希釈する
カラム：イナートシルＯＤＳ−３ＶＧＬサイエンス社製
移動層：０．１％リン酸水溶液（ｖ／ｖ）：アセトニトリル（４０：６０）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ（２５４ｎｍ）
各化合物の保持時間：
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン約５．５分

＜Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・ジシクロヘキシルアミン塩の化学純度のＨＰＬＣ分析条件＞
試料調製：塩を移動層に溶解し、０．５％ｗ／ｖ溶液を調製する
カラム：イナートシルＯＤＳ−３ＶＧＬサイエンス社製
移動層：０．１％リン酸水溶液（ｖ／ｖ）：アセトニトリル（４０：６０）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ（２５４ｎｍ）
各化合物の保持時間：
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン約５．５分

[実施例１]
（１）アミダーゼ活性を有する生体触媒の調製
ＷＯ２０００／０６３３５４号記載の方法に従い、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＬＡ２０５（ＦＥＲＭＢＰ−７１３２）の培養を行った。培養液１Ｌを遠心分離し、次いで湿潤菌体を蒸留水に懸濁して菌体懸濁溶液２０ｇを調製した。

（２）アミダーゼによる立体選択的加水分解反応
ラセミ体ｔｅｒｔ−ロイシンアミド２５０ｇ（１．９２ｍｏｌ）を純水７１７ｇに溶解した。この時のｐＨは１１．３であった（測定温度２３℃）。これに９８％硫酸３２．７ｇ（０．３２７ｍｏｌ）を加え該水溶液のｐＨを８．３に調整し、２５質量％ラセミｔｅｒｔ−ロイシンアミド水溶液を調製した（ｐＨ測定温度２６℃）。ｐＨ調整後、（１）で調製した菌体懸濁液をラセミｔｅｒｔ−ロイシンアミド水溶液に加え、４０℃水槽中で２６時間振とうし立体選択的加水分解反応を行った。
２６時間後の原料変換率は１００％であり、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン１２５．９ｇ（０．９６０ｍｏｌ）が生成していた。

（３）無機塩基化合物の添加
反応終了後、４０℃水槽中で反応液に２５質量％水酸化ナトリウム水溶液１０４．０ｇ（０．６５０ｍｏｌ）を加えた。この時、硫酸１ｍｏｌに対して水酸化ナトリウム１．９９ｍｏｌ加えたことになる。

中和操作後、水溶液にろ過助剤（ラジオライト）及び活性炭を加え、６０℃で加温混合した後、加圧ろ過器用い菌体を除去した。ろ残を純水で洗浄、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン１２５．３ｇ（０．９５５ｍｏｌ）とＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド１２４．３ｇ（０．９５５ｍｏｌ）を含む水溶液１２５０ｇを得た。

（４）溶媒置換
内温を５５〜６０℃の範囲に保ちながら、全体量が８３９．０ｇになるまで減圧濃縮した後、ｎ−ブタノール（ｎ−ＢｕＯＨ）４５０ｇを加えた。次いで内温を５５〜６５℃の範囲に保ちながら全体量が８４０．０ｇになるまで減圧濃縮した。さらにｎ−ＢｕＯＨ４５０ｇを加え、同様の条件で全体量が８４０．０ｇになるまで減圧濃縮し共沸脱水し、結果上清の水分濃度が１質量％以下になるまで同様の操作を繰り返し、溶媒を水からｎ−ＢｕＯＨへ置換した。

（５）結晶の採取
溶媒置換後、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン結晶の析出が確認された。また溶媒置換終了時の内温は６３℃であった。次いで４０℃／hrの冷却速度で内温１５℃まで冷却し、その後、１５℃で３０分間攪拌した。遠心分離機によりＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン結晶を回収し、次いで少量のｎ−ＢｕＯＨで結晶を洗浄した。湿結晶を真空乾燥後、１７２．０ｇのＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン粗結晶が得られた。

ＨＰＬＣ分析の結果、粗結晶中に含まれるＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン純分は１２４．１ｇであった（０．９４６ｍｏｌ、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド基準で収率９８．５％）。また純分Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンに対するＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの混入量は質量比で０．１％であった。

[比較例１]
「（３）無機塩基化合物の添加」の工程の、水酸化ナトリウムによる中和操作を省略した以外は実施例１と同様に操作を行った。
「（４）溶媒置換」の工程において、内温を５５〜６０℃の範囲に保ちながら、これを全体量が８３９．０ｇになるまで減圧濃縮した後、ｎ−ＢｕＯＨ４５０ｇを加え、内温を５５〜６５℃の範囲に保ちながら全体量が８４０．０ｇになるまで減圧濃縮した。さらにｎ−ＢｕＯＨ４５０ｇを加え、同様の条件で全体量が８４０．０ｇになるまで減圧濃縮した。
結果、上記操作後の溶液は固化しておりＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンを選択的に回収することは困難であった。

[実施例２〜８、比較例２、３]
実施例１の「（３）無機塩基化合物の添加」の工程において、４０℃水槽中で硫酸１ｍｏｌに対して、表１に従って各々水酸化ナトリウム１．７５〜２．３０ｍｏｌ加え中和操作を行い、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン粗結晶を回収した。表１に、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド基準によるＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの収率、および、純分Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンに対するＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの混入量を示す。

[実施例９]
硫酸の代わりに３５質量％塩酸水溶液を用いた以外は実施例１と同様の操作を行い、ｐＨ８．３（測定温度２８℃）の２５質量％ラセミ体ｔｅｒｔ−ロイシンアミド水溶液１０００ｇを調製した。この時の３５質量％塩酸水溶液使用量は６３．５ｇ（０．６１０ｍｏｌ）であった。次に立体選択的加水分解反応を行った。２６時間後の原料変換率は１００％であり、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン１２５．９ｇ（０．９６０ｍｏｌ）が生成していた。

反応終了後、４０℃水槽中で反応液に２０質量％水酸化ナトリウム水溶液１２２．０ｇ（０．６１０ｍｏｌ）を加えた。この時塩酸１ｍｏｌに対して水酸化ナトリウム１．００ｍｏｌ加えたことになる。
触媒除去操作、溶媒置換操作さらに冷却晶析、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン結晶単離操作行い、真空乾燥後、１５７．９ｇのＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン粗結晶が得られた。ＨＰＬＣ分析の結果、粗結晶中に含まれるＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン純分は１２４．４ｇであった（０．９４８ｍｏｌ、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド基準で収率９８．８％）。また純分Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンに対するＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの混入量は質量比で０．１５％であった。

[実施例１０〜１５、比較例４]
表２に従い、硫酸でｐＨを５．５〜１０に各々調整し、２５質量％ラセミ体ｔｅｒｔ−ロイシンアミド水溶液１０００ｇを調製した。実施例１と同様に立体選択的加水分解反応を行い、２２時間後の原料変換率を測定した。表２に、原料変換率の測定結果を示す。

[実施例１６、１７]
表３に従い硫酸で各々ｐＨを調整し、２９質量％ラセミ体ｔｅｒｔ−ロイシンアミド水溶液８６０ｇを調製した。実施例１と同様に立体選択的加水分解反応を行い、２４時間後の原料変換率を測定した。表３に、原料変換率の測定結果を示す。

[実施例１８〜２１]
実施例１の「（４）溶媒置換」の工程において、表４に従い、ｎ−ブタノールの代わりにイソプロピルアルコール、ｎ−アミルアルコール、ｉ−ブタノール、シクロヘキサノールを用いて溶媒置換を行い、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン粗結晶を回収した。

[実施例２２] Ｎ−アルコキシカルボニル化反応
実施例１で得られたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン粗結晶１７２．０ｇ（Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン純分１２４．１ｇ、０．９４６ｍｏｌ）を２７７．５ｇの１５質量％水酸化ナトリウム水溶液（１．０４ｍｏｌ）に添加後、攪拌して溶解させた。次いで、これを攪拌しながらクロロギ酸メチル９８．７ｇ（１．０４ｍｏｌ）を２時間かけて加えた。

Ｎ−アルコキシカルボニル化反応中は１５〜２０℃で反応液のｐＨが１２．２〜１２．６になるように適宜２５％ｗｔＮａＯＨ水溶液を加えた。その後、ＨＰＬＣ分析によりＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンが９９％以上消費されたことを確認し反応を終了した。反応終了後、反応液を２０℃でｐＨ１３．０〜１３．２に５時間保持した。この時、Ｎ−メトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン生成量はＨＰＬＣ分析より１７７．２ｇ（収率９９．０％）であった。

反応終了後の水溶液にトルエン２７０ｇを加え、次いで、３５質量％塩酸を水相のｐＨが１．５になるまで加えた。ｐＨを１．５に調整後、この溶液を５０℃で０．５時間、撹拌により混合した。その後、静置して分相し、トルエン相にトルエン４５０．０ｇを加え、結果Ｎ−メトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを含むトルエン溶液８９４．０ｇを回収した。このトルエン溶液の内温を５０℃に保持しながら４１ｇの水で洗浄した。水洗浄後回収したＮ−メトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを含むトルエン溶液の水分濃度をカールフィッシャー水分測定器で測定したところ、水分濃度は１．５質量％であった。このＮ−メトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン含むトルエン溶液にさらにトルエン２００ｇを加え、内温を５５〜６５℃に保持しながら全体量が８６５ｇになるまで減圧濃縮した。これにトルエン２００ｇを加え、同様の条件で全体量が８６５ｇになるまで減圧濃縮し共沸脱水した。以降トルエン溶液の水分量が０．０１質量％以下になるまで同様の操作で共沸脱水を行った。トルエン溶液を内温が７０℃になるまで加温した後、熱時ろ過して微量不溶分を除去した。ろ液としてＮ−メトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを含むトルエン溶液８６０．０ｇ（Ｎ−メトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン濃度２０質量％）を回収した。

このトルエン溶液を内温７０℃で攪拌しながら１５℃〜１８℃／hrの冷却速度で冷却した。内温５２℃でＮ−メトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン結晶が析出したことを目視で確認した。その後、内温を６０℃まで昇温してから６０℃で１時間攪拌した。この時、析出したＮ−メトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン結晶は完全に溶解せずに一部残存していることを確認した。攪拌後、１５℃〜１８℃／hrの冷却速度で該溶液を内温１０℃まで冷却し、その後、１０℃で１時間攪拌した。減圧ろ過によりＮ−メトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン結晶を回収し、次いで少量のトルエンで結晶を洗浄した。湿結晶を真空乾燥後、１７０．０ｇのＮ−メトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン結晶が得られた（０．８９８ｍｏｌ、収率９５．０％）。化学純度は９９．９％以上であり不純物はＨＰＬＣ検出限界値以下であった。

[比較例５]
（１）精製Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの調製
実施例１で得られたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン粗結晶９０．０ｇ（Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン純分６４．９ｇ）を純水６６０ｇに加え、６５℃で攪拌し溶解させた。減圧下水溶液をろ過して微量不溶物を除去した後、内温を５０−５５℃に保ちながらろ過液を３８０ｇまで減圧濃縮した。濃縮液の内温を５０℃に保ちながらメタノール１２０ｇを加えた。２５℃〜３０℃／hrの冷却速度で該溶液を内温４℃まで冷却し、その後、４℃で３時間攪拌した。減圧ろ過によりＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン結晶を回収し、次いで少量のメタノールで結晶を洗浄した。湿結晶を真空乾燥後、５１．９ｇのＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン結晶が得られた。この結晶中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン含量は５０．２ｇであり、純度は９７．０％であった（回収率７５．０％）。

（２）Ｎ−メトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの合成
実施例１で得られたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン粗結晶の代わりに、（１）で調製した精製Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン結晶を用いて、実施例２２と同様の操作を行い、Ｎ−メトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを合成した。表５に、実施例２２と比較例５のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンからの収率、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドからの収率、および、化学純度を示す。

[実施例２３] Ｎ−アルコキシカルボニル化反応
実施例１で得られたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン粗結晶１７２．０ｇ（Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン純分１２４．１ｇ、０．９４６ｍｏｌ）を２７７．５ｇの１５質量％水酸化ナトリウム水溶液（１．０４ｍｏｌ）に添加後、攪拌して溶解させた。次いで、これを攪拌しながらジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート２３５．７ｇ（１．０９ｍｏｌ）を３時間かけて加えた。

Ｎ−アルコキシカルボニル化反応中は３０〜３５℃で反応液のｐＨが８．８〜９．５になるように、適宜２０％ｗｔＮａＯＨ水溶液を加えた。その後、ＨＰＬＣ分析によりＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンが９９％以上消費されたことを確認し反応を終了した。この時、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン生成量はＨＰＬＣ分析より２１６．６ｇ（収率９９．０％）であった。

このＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン水溶液にトルエン５５０ｇを加え、次いで、３５質量％塩酸を水相のｐＨが４．０になるまで加えた。ｐＨを４．０に調整後、この溶液を４０℃で０．５時間、撹拌により混合した。静置して分相した後、トルエン相に内温を４０℃に保持しながら４４ｇの水で洗浄した。水洗浄後トルエン３００ｇを加え、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを含むトルエン溶液１０９０ｇ（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン濃度１９質量％）を回収した。回収トルエン溶液を内温４０〜４５℃に保持しながら全体量が２９２ｇになるまで減圧濃縮した。この時の水分濃度は０．０１質量％であった。減圧濃縮後、内温４０℃でｎ−ヘプタン５１５ｇを加えた後、攪拌しながら１５℃〜１８℃／hrの冷却速度で該溶液を内温１０℃まで冷却し、その後、１０℃で２時間攪拌した。減圧ろ過によりＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン結晶を回収し、次いで少量のｎ−ヘプタンで結晶を洗浄した。湿結晶を真空乾燥後、２０５．７ｇのＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン結晶が得られた（０．８８９ｍｏｌ、収率９５．０％）。化学純度は９９．４％であった。

[実施例２４]
実施例１で得られたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン粗結晶８１．９ｇ（Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン純分５９．１ｇ、０．４５１ｍｏｌ）を１１７．５ｇの１６質量％水酸化ナトリウム水溶液（０．４８２ｍｏｌ）に添加後、攪拌して溶解させた。次いで、これを攪拌しながらクロロギ酸ベンジル８５．３ｇ（０．５０ｍｏｌ）を２時間かけて加えた。

Ｎ−アルコキシカルボニル化反応中は２０〜３０℃で反応液のｐＨが１２．２〜１２．６になるように適宜２５％ｗｔＮａＯＨ水溶液を加えた。その後、ＨＰＬＣ分析によりＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンが９９％以上消費されたことを確認し反応を終了した。反応終了後、反応液を２０℃でｐＨ１３．０〜１３．２に５時間保持した。この時、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン生成量はＨＰＬＣ分析より１１６．１ｇ（収率９７．０％）であった。

内温３０℃に保ちながら、このＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン水溶液をトルエン１８０ｇで２回洗浄した。さらにトルエン１９０ｇを加え、次いで２０質量％塩酸を水相のｐＨが１．４になるまで加えた。ｐＨを１．４に調整後、この溶液を４０℃で０．５時間、撹拌により混合した。静置して分相した後、回収した水相にトルエン９０ｇを加え４０℃で０．５時間、撹拌により混合した。２回の抽出操作で得られた有機相を合わせ、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを含むトルエン溶液４０５ｇ（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン濃度２８質量％）を回収した。水分濃度をカールフィッシャー水分測定器で測定したところ、水分濃度は０．３質量％であった。

このＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン含むトルエン溶液にさらにトルエン３００ｇを加え、内温を５５〜６５℃に保持しながら全体量が５６５ｇになるまで減圧濃縮した。これにトルエン１６０ｇを加え、同様の条件で全体量が５６５ｇになるまで減圧濃縮し共沸脱水した。以降トルエン溶液の水分量が０．０１質量％以下になるまで同様の操作で共沸脱水を行った。共沸脱水後、トルエンで希釈しＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン含むトルエン溶液を８６５ｇ得た。

さらにこのトルエン溶液を攪拌しながらジシクロヘキシルアミン７９．２ｇ（０．４３７ｍｏｌ）を１時間かけて加えた。添加中、内温は２０℃付近に保持し、添加後、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・ジシクロヘキシルアミン塩の析出が確認された。内温１５℃で３時間攪拌した後、減圧ろ過により、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・ジシクロヘキシルアミン塩結晶を回収し、次いで少量のトルエンで結晶を洗浄した。湿結晶を真空乾燥後、１８３．１ｇのＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン・ジシクロヘキシルアミン塩結晶が得られた（０．４１０ｍｏｌ、収率９１．０％）。化学純度は９９．５％であった。

Claims

下記の（１）〜（５）の工程を含む、光学活性アミノ酸の製造方法：
（１）ラセミ体アミノ酸アミドを含む水溶液の２０〜３０℃におけるｐＨを、酸を用いてｐＨ５．０〜９．８に調整する工程；
（２）前記水溶液に、アミダーゼ活性を有する生体触媒を加えてアミノ酸アミドの立体選択的加水分解反応を行う工程；
（３）（１）工程で使用した酸に対し、０．９００〜１．１００ｍｏｌ当量の無機塩基化合物を加える工程；
（４）前記水溶液の溶媒を、炭素数３以上のアルコール溶媒で置換する工程；
（５）光学活性アミノ酸アミドをアルコール溶液として分離し、光学活性アミノ酸結晶を回収する工程。
請求項１記載の製造方法によって得られた光学活性アミノ酸をさらに精製することなく使用し、該光学活性アミノ酸とＮ−アルコキシカルボニル化剤とを反応させる、光学活性Ｎ−アルコキシカルボニルアミノ酸類の製造方法。