JP2008109898A - Method for screening compound having antipruritic activity - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、痒みを鎮める、あるいは抑制する作用（鎮痒作用）を有する化合物を、モデル動物の観察によらずに評価、選別する方法、並びに痒みの度合いの評価方法に関する。 The present invention relates to a method for evaluating and selecting a compound having an action of suppressing or suppressing itching (antipruritic action) without observing a model animal, and an evaluation method of the degree of itching.
痒み（そう痒）は、皮膚特有の感覚で、炎症を伴う様々な皮膚疾患において訴えられる症状の一つである。痒みは、悪性腫瘍、糖尿病、肝疾患、腎不全、腎透析、痛風その他の内科系疾患や寄生虫感染が原因となって生じる場合の他に、薬剤性や心因性で生じる場合もある。痒みは患者にとって不快な症状であり、重症の場合は患者が皮膚を強く引っ掻いて皮膚を掻破し、その結果感染症を招いたり、あるいは不眠となって患者のQOLの低下を招くこともしばしば見受けられる。 Itching (pruritus) is a skin-specific sensation and is one of the symptoms complained in various skin diseases accompanied by inflammation. Itching may be caused by malignant tumors, diabetes, liver disease, renal failure, renal dialysis, gout and other medical diseases and parasitic infections, as well as by drug or psychogenicity. Itching is an unpleasant symptom for the patient, and in severe cases the patient often scratches the skin and scratches the skin, often resulting in infection or insomnia leading to a reduction in the patient's quality of life. It is done.
「痒み」が治療対象となる具体的な皮膚疾患としては、アトピー性皮膚炎、神経性皮膚炎、接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、自己感作性皮膚炎、毛虫皮膚炎、皮脂欠乏症、老人性皮膚そう痒、虫刺症、光線過敏症、蕁麻疹、痒疹、疱疹、膿痂疹、湿疹、白癬、苔癬、乾癬、疥癬、尋常性座瘡などが挙げられる。かかる疾患に伴う痒みの治療には、その原因となる基礎疾患の治療が必要であるが、対症療法的に痒みそのものを鎮める鎮痒あるいは止痒も、重要な対処法である。なお、本発明においては鎮痒と止痒は同義語として理解される。 Specific skin diseases for which “itching” is treated include atopic dermatitis, neurodermatitis, contact dermatitis, seborrheic dermatitis, self-sensitizing dermatitis, caterpillar dermatitis, sebum deficiency, Examples include senile cutaneous pruritus, insect bites, photosensitivity, urticaria, urticaria, shingles, impetigo, eczema, ringworm, lichen, psoriasis, scabies, acne vulgaris. Treatment of itching associated with such a disease requires treatment of the underlying disease that causes it, but anti-pruritus or antipruritic therapy that calms itching symptomatically is also an important countermeasure. In the present invention, antipruritic and stamen are understood as synonyms.
鎮痒作用を有する薬物としては、従来抗ヒスタミン薬、抗アレルギー薬、非ステロイド系抗消炎薬、局部麻酔薬などが主に用いられる。しかしこれらの薬物の中には、鎮痒作用の発現までに時間のかかることや、中枢神経抑制作用（眠気、倦怠感）、消化器系に対する障害などの副作用が問題となっている。中には長期使用における副腎機能低下やリバウンドなどの副作用が問題となる薬物もある。そのため、新たな鎮痒作用を有する薬物の開発が望まれている。 Conventionally, antihistamines, antiallergic drugs, nonsteroidal anti-inflammatory drugs, local anesthetics and the like are mainly used as drugs having an antipruritic action. However, among these drugs, there are problems such as the time taken to develop an antipruritic action, side effects such as central nervous system inhibitory action (drowsiness, fatigue), and disorders to the digestive system. Some drugs may cause side effects such as decreased adrenal function and rebound in long-term use. Therefore, development of a drug having a new antipruritic action is desired.
しかし、痒みは主観的な感覚であるため、その程度を数量的に客観的に評価することが難しい症状の一つであり、このことが患者における症状の客観的な評価、並びに薬物の鎮痒効果の評価を難しいものとしている。 However, since itching is a subjective sensation, it is one of the symptoms that it is difficult to quantitatively evaluate the degree of itching. This is an objective evaluation of symptoms in patients and the antipruritic effect of drugs. Is difficult to evaluate.
痒みを訴えているヒトを直接用いること以外の薬物の鎮痒効果を評価する方法の代表例は、痒みを有するモデル動物を用意し、モデル動物の引っ掻き回数を指標にする方法である（例えば、特許文献１、特許文献２など）。これらの方法では、非ヒト動物の「行動」という評価基準を採用するが故の客観性、定量性等における問題は、依然として完全には解決されていない。 A typical example of a method for evaluating the antipruritic effect of a drug other than directly using a human complaining of itch is a method of preparing a model animal having itch and using the number of scratches of the model animal as an index (for example, patents) Document 1, Patent Document 2, etc.). In these methods, problems such as objectivity and quantitativeness due to the adoption of the evaluation standard of “behavior” of non-human animals are still not completely solved.
近年になって「痒み」発症の作用機序に関する研究が進展した結果、痒みは、末梢性の痒みと中枢性の痒みとに大別し得ることが提唱されている。末梢性の痒みは、皮膚表皮と真皮の境界部に存在する神経終末に作用して生じた痒みのインパルスが、求心性Ｃ繊維により伝達され脳に到達することで痒みとして認識されると考えられている。かかる痒みのメディエーターとしては、ヒスタミンの他にプロスタグランジン、セロトニン、インターロイキン６、トリプターゼ等がある。 As a result of recent studies on the mechanism of action of “itch” onset, it has been proposed that itching can be broadly divided into peripheral itch and central itch. Peripheral itch is considered to be recognized as itch because the itch impulse generated by acting on nerve endings existing at the boundary between the skin epidermis and dermis is transmitted by afferent C fibers and reaches the brain. ing. Such itch mediators include prostaglandins, serotonin, interleukin 6, tryptase and the like in addition to histamine.
一方の中枢性の痒みは近年、内因性のモルヒネ様オピオイドペプチドがメディエーターとなって中枢神経組織に作用することで認識されると考えられている。例えば、β−エンドルフィンやエンケファリンのような内因性オピオイドペプチドが痒みを惹起すること（非特許文献１）、モルヒネやオピオイド化合物を硬膜外や髄腔内に投与した場合の副作用として痒みが惹起されること（非特許文献２）等が報告されている。一方、モルヒネ投与によって惹起された痒みがモルヒネ拮抗薬であるナロキソンによって抑制されること（非特許文献３）、内因性オピオイドペプチドのレベル上昇によって惹起された強い痒みがオピオイド拮抗薬であるナルメフェンによって抑制されたこと（非特許文献４）等が報告されている。 On the other hand, central pruritus has recently been considered to be recognized by endogenous morphine-like opioid peptides acting as mediators and acting on central nervous tissue. For example, endogenous opioid peptides such as β-endorphin and enkephalin induce itch (Non-patent Document 1), and itch is induced as a side effect when morphine or an opioid compound is administered epidurally or intrathecally. (Non-Patent Document 2) and the like have been reported. On the other hand, itch caused by morphine administration is suppressed by naloxone, a morphine antagonist (Non-patent Document 3), and strong itch caused by an increase in the level of endogenous opioid peptide is suppressed by nalmefene, an opioid antagonist. (Non-patent Document 4) and the like have been reported.
これらの事実から、モルヒネ等のオピオイド系作動薬は痒みを惹起する作用があり、逆にその拮抗薬には鎮痒作用がある、すなわちモルヒネ等が結合するオピオイドレセプターであるμオピオイドレセプター（Mu Opioid Receptor、MOR）とそのアゴニスト、アンタゴニストが、痒みの発症と抑制に関与していると推察されている。また、オピオイドレセプターの一種であるκオピオイドレセプター（Kappa Opioid Receptor、KOR）に対する作動薬が鎮痒剤となることも報告されている（特許文献３）。 From these facts, opioid agonists such as morphine have an effect of causing itch, and conversely, their antagonists have an antipruritic action, that is, mu opioid receptors (Mu Opioid Receptor) which are opioid receptors to which morphine and the like bind. MOR) and its agonists and antagonists are presumed to be involved in the development and suppression of itch. It has also been reported that an agonist for a kappa Opioid Receptor (KOR), which is a kind of opioid receptor, is an antipruritic agent (Patent Document 3).
しかしながら、これらの知見は化合物とオピオイドレセプターとの結合と痒みの発症との関連の一端を報告しているに過ぎない。
本発明は、鎮痒効果を有する化合物を効率的に評価、選別する方法、特にオピオイドレセプターが関与する中枢系の痒みに対して鎮痒作用を示す化合物をスクリーニングする方法、ならびに痒みの客観的な判定方法を提供することを課題とする発明である。 The present invention relates to a method for efficiently evaluating and selecting a compound having an antipruritic effect, particularly a method for screening a compound having an antipruritic action against central itching involving opioid receptors, and an objective judgment method for itching It is invention which makes it a subject to provide.
本発明者らは、オピオイドレセプターと痒みとの関係に着目し、痒みを訴えている患者の皮膚組織における表皮角化細胞のオピオイドレセプターについて鋭意研究を行った結果、オピオイドレセプターの発現バランスを指標として化合物の鎮痒作用を評価できることを見出し、以下の各発明を完成した。 The present inventors focused on the relationship between opioid receptors and itching, and as a result of intensive studies on the opioid receptors of keratinocytes in the skin tissue of patients complaining of itching, the expression balance of opioid receptors was used as an index. The inventors found that the antipruritic action of a compound can be evaluated, and completed the following inventions.
（１）μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターを発現することのできる培養細胞と化合物とをインキュベーションする工程、及び当該細胞におけるμオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターの発現比率を確認する工程を含む、化合物の鎮痒作用を評価する方法。 (1) Incubation of a compound comprising a step of incubating a compound with a cultured cell capable of expressing μ opioid receptor and κ opioid receptor, and a step of confirming the expression ratio of μ opioid receptor and κ opioid receptor in the cell. How to evaluate the effect.
（２）μオピオイドレセプター及びκオピオイドリセプターを発現することのできる培養細胞がヒトの外胚葉系細胞である、（１）に記載の方法。 (2) The method according to (1), wherein the cultured cells capable of expressing μ opioid receptor and κ opioid receptor are human ectodermal cells.
（３）μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターの発現比率を、μオピオイドレセプターとκオピオイドレセプターをそれぞれ特異的に認識する２種以上の抗体を用いた抗体染色法を用いて確認する、（１）に記載の方法。 (3) The expression ratio of μ opioid receptor and κ opioid receptor is confirmed using an antibody staining method using two or more kinds of antibodies that specifically recognize μ opioid receptor and κ opioid receptor. The method described.
（４）μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターの発現比率を、μオピオイドレセプター及びκオピオイドリセプターのそれぞれをコードするｍＲＮＡの発現量を測定して確認する、（１）に記載の方法。 (4) The method according to (1), wherein the expression ratio of μ opioid receptor and κ opioid receptor is confirmed by measuring the expression level of mRNA encoding each of the μ opioid receptor and κ opioid receptor.
（５）患者から採取した皮膚組織におけるμオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターの発現比率を確認する工程を含む、痒みの度合いの判定方法。 (5) A method for determining the degree of itchiness, comprising the step of confirming the expression ratio of μ opioid receptor and κ opioid receptor in skin tissue collected from a patient.
（６）μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターの発現比率をμオピオイドレセプターとκオピオイドリセプターをそれぞれ特異的に認識する２種以上の抗体を用いた抗体染色法を用いて確認する、（５）に記載の方法。 (6) The expression ratio of μ opioid receptor and κ opioid receptor is confirmed using an antibody staining method using two or more antibodies that specifically recognize μ opioid receptor and κ opioid receptor, respectively. the method of.
（７）μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターの発現比率を、μオピオイドレセプター及びκオピオイドレセプターのそれぞれをコードするｍＲＮＡの発現量を測定して確認する、（５）に記載の方法。 (7) The method according to (5), wherein the expression ratio of μ opioid receptor and κ opioid receptor is confirmed by measuring the expression level of mRNA encoding each of the μ opioid receptor and κ opioid receptor.
（８）μオピオイドレセプターとκオピオイドレセプターをそれぞれ特異的に認識する２種以上の抗体及び／又はμオピオイドレセプターとκオピオイドレセプターのそれぞれをコードする核酸と特異的にハイブリダイズする２種以上のＤＮＡを含むキット。 (8) Two or more types of DNA that specifically hybridize with two or more types of antibodies that specifically recognize μ opioid receptor and κ opioid receptor and / or nucleic acid encoding each of μ opioid receptor and κ opioid receptor Including kit.
（９）（１）〜（４）のいずれかに記載の方法において使用するための、（８）に記載のキット。 (9) The kit according to (8) for use in the method according to any one of (1) to (4).
（１０）（５）〜（７）のいずれかに記載の方法において使用するための、（８）に記載のキット。 (10) The kit according to (8) for use in the method according to any one of (5) to (7).
本発明の方法は、モデル動物の利用を必要とせず、痒みの発症に関連するとされている分子の発現状態を直接観察することで、客観的な化合物の評価、あるいは痒みの程度の判定を行うことができる。 The method of the present invention does not require the use of a model animal, and directly evaluates the expression state of molecules that are considered to be related to the development of itching, thereby objectively evaluating the compound or determining the degree of itching. be able to.
オピオイドレセプターには、μオピオイドレセプター（MOR）、δオピオイドレセプター（delta Opioid Receptor、DOR）およびκオピオイドレセプター（KOR)の３種類の存在が知られている。また、それぞれのレセプターには、それぞれを選択的に刺激する内因性オピオイドペプチドが存在する。MOR及びDORに対する内因性オピオイドペプチドは、β−エンドルフィン（βendorphin、βend）やエンケファリンであり、KORに対する内因性オピオイドペプチドはダイノルフィン（Dynorphin A、DynA）である。 Three types of opioid receptors are known: μ opioid receptor (MOR), δ opioid receptor (DOR), and κ opioid receptor (KOR). Each receptor has an endogenous opioid peptide that selectively stimulates each receptor. Endogenous opioid peptides for MOR and DOR are β-endorphin (βend) and enkephalin, and endogenous opioid peptides for KOR are dynorphin (Dynorphin A, DynA).
前記の通り、MORの作動薬が痒みを惹起し、MORのアンタゴニストが鎮痒作用を示すこと、並びにKORの作動薬が鎮痒作用を示すことが知られているが、それぞれのオピオイドレセプターと内因性オピオイドペプチドが痒みの発症部位においてどの様に発現しあるいは作用しているかの報告はなかった。 As described above, it is known that agonists of MOR cause itch, antagonists of MOR exhibit antipruritic activity, and agonists of KOR exhibit antipruritic activity, but each opioid receptor and endogenous opioid There was no report of how the peptide was expressed or acting at the site of itch.
本発明者らは、アトピー性皮膚炎に伴う痒みを訴えている患者において、PUVA治療を行う前と後での皮膚組織におけるオピオイドレセプターとそれぞれの内因性オピオイドペプチドの発現を調べ、正常な皮膚との比較を行った。ここに言うPUVA療法とは、紫外線治療の一種で、８−メトキシソラレン（8-methoxypsoralen）を外用または内服投与後に長波長紫外線（UVA）を照射する治療方法であり、アトピーや尋常性乾癬、難治性の湿疹などの治療を目的として採用される治療方法である。その作用機序としては、DNA 合成の抑制、ランゲルハンス細胞の抗原提示能の障害、角化細胞由来免疫抑制サイトカインの産生増強、T リンパ球の遊走抑制、NK 細胞の数の減少と活性低下などが報告されている。しかしながら、オピオイドレセプターの発現を作用機序とする考えは従来報告されていない。 The present inventors investigated the expression of opioid receptors and their respective endogenous opioid peptides in the skin tissue before and after PUVA treatment in patients complaining of itching associated with atopic dermatitis, A comparison was made. The PUVA therapy mentioned here is a type of ultraviolet treatment, which is a treatment method that uses 8-methoxypsoralen (8-methoxypsoralen) for external or internal use followed by irradiation with long-wavelength ultraviolet (UVA). Atopy, psoriasis vulgaris, intractable It is a treatment method adopted for the purpose of treating eczema. The mechanism of action includes suppression of DNA synthesis, impaired antigen-presenting ability of Langerhans cells, enhanced production of keratinocyte-derived immunosuppressive cytokines, suppression of T lymphocyte migration, decreased number of NK cells and decreased activity. It has been reported. However, the idea of opioid receptor expression as a mechanism of action has not been reported so far.
その結果、１）正常な皮膚組織においては、MORとKORがほぼ同程度発現していること、２）PUVA治療前のアトピー性皮膚炎の患部皮膚組織ではMORは正常皮膚組織と同程度に発現しているのに対してKORの発現が著しく減少していること、３）患部に対してPUVA治療を行うことによってMORの発現量が有意に低下すること、４）正常な皮膚組織においてはMORの内因性作動薬であるβendとKORの内因性作動薬であるDynAがほぼ同程度発現していること、５）PUVA治療前のアトピー性皮膚炎の患部皮膚組織ではβ endは正常皮膚組織と同程度に発現しているのに対してDynAの発現が減少していること、６）患部に対してPUVA治療を行うことによってDynAの発現量が正常皮膚組織と同レベルにまで回復すること、等が確認された。 As a result, 1) MOR and KOR are expressed to the same extent in normal skin tissue, and 2) MOR is expressed to the same extent as normal skin tissue in the affected skin tissue of atopic dermatitis before PUVA treatment. The expression of KOR is markedly reduced compared to the above, 3) The MOR expression level is significantly reduced by treating the affected area with PUVA, and 4) MOR in normal skin tissue. Βend, which is an endogenous agonist of DOR, and DynA, which is an endogenous agonist of KOR, are expressed approximately at the same level. 5) In the affected skin tissue of atopic dermatitis before PUVA treatment, β end is normal skin tissue. DynA expression is decreased compared to the same level of expression, 6) The expression level of DynA is restored to the same level as normal skin tissue by treating the affected area with PUVA, Etc. were confirmed.
従って、MORとKORを発現している培養細胞と化合物とをインキュベートし、MORとKORの発現比率を確認することで、PUVA療法と同様の効果を与える化合物、すなわち鎮痒作用を有する化合物をスクリーニングすることが可能であると考えられる。 Therefore, by incubating cultured cells and compounds expressing MOR and KOR, and confirming the expression ratio of MOR and KOR, screening for compounds that have the same effect as PUVA therapy, that is, compounds with antipruritic activity It is considered possible.
このスクリーニング方法において利用可能な培養細胞としては、MORとKORを発現することのできる細胞であれば特に制限はないが、例えばHaCaT、NHEK、NHEK-Adなどのヒトの外胚葉系細胞や神経系細胞の利用が好ましい。特に、皮膚組織を構成する細胞、さらに表皮の基底層にあるケラチノサイト（keratinocyte、角化細胞ともいう）の利用が好ましい。ケラチノサイトのインビトロにおける細胞培養条件は公知であり、本発明においても当業者に公知の方法でケラチノサイトをインビトロで培養すればよい。ケラチノサイト以外のヒトの細胞を利用する場合も、それぞれの細胞において好適な培養条件下で培養すればよく、その様な培養条件の設定は、当業者の通常の能力の範囲内の作業である。 The cultured cells that can be used in this screening method are not particularly limited as long as they can express MOR and KOR. For example, human ectodermal cells such as HaCaT, NHEK, NHEK-Ad, and nervous system. Use of cells is preferred. In particular, the use of keratinocytes (also called keratinocytes) in the basal layer of the epidermis, as well as the cells constituting the skin tissue, is preferred. In vitro cell culture conditions for keratinocytes are known, and in the present invention, keratinocytes may be cultured in vitro by methods known to those skilled in the art. Even when human cells other than keratinocytes are used, the cells may be cultured under suitable culture conditions. Setting such culture conditions is an operation within the ordinary ability of those skilled in the art.
外胚葉系細胞はそれ自身MORとKORを発現することのできる細胞であるが、外胚葉系細胞以外の細胞でも、MOR及びKORをそれぞれコードする遺伝子が組み込まれた適当なベクターで該細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞と化合物とをインキュベートして、形質転換細胞におけるMORとKORの発現比率を確認してスクリーニングを行ってもよい。 かかる方法において、MOR及びKORをそれぞれコードする遺伝子が発現可能である限り、宿主細胞の種類に制限はなく、ヒトやマウス等の動物細胞、カイコ等の昆虫細胞、酵母や大腸菌等の微生物細胞も利用可能である。また、MOR及びKORをそれぞれコードする遺伝子は公知であり、宿主細胞の形質転換に利用可能な発現ベクターも、宿主細胞の種類毎に多数公知である。これらを適宜組み合わせ、MORとKORの遺伝情報を基に組み換えベクターを調製し、宿主細胞を形質転換するまでの各種の操作や、当該操作において使用可能なベクターや宿主細胞等の選択は、当業者の通常の能力の範囲内の作業である。 Although ectoderm cells are cells that themselves can express MOR and KOR, cells other than ectoderm cells can be transformed with appropriate vectors containing genes encoding MOR and KOR, respectively. Screening may be performed by incubating the transformed cells obtained by the transformation and the compound, and confirming the expression ratio of MOR and KOR in the transformed cells. In such a method, as long as genes encoding MOR and KOR can be expressed, there are no restrictions on the type of host cell, and animal cells such as humans and mice, insect cells such as silkworms, and microbial cells such as yeast and E. coli are also included. Is available. In addition, genes encoding MOR and KOR are known, and many expression vectors that can be used for transformation of host cells are known for each type of host cell. A person skilled in the art can appropriately combine these, prepare a recombinant vector based on the genetic information of MOR and KOR, transform various types of host cells, and select vectors and host cells that can be used in the operations. The work is within the normal ability.
培養細胞と化合物とのインキュベーションは、適当な溶液中で、好ましくは使用する培養細胞に好適な培地中で培養細胞と化合物とを共存させ、細胞が生存し得る条件下でインキュベーションすればよい。適当な溶液あるいは培地の選択は、当業者の通常の能力の範囲内の作業である。 Incubation of the cultured cell and the compound may be carried out in a suitable solution, preferably in a medium suitable for the cultured cell to be used, in a state where the cultured cell and the compound coexist and under which the cells can survive. The selection of an appropriate solution or medium is an operation within the normal capabilities of those skilled in the art.
培養細胞におけるMOR及びKORの発現比率の確認は、蛋白質レベル、それらをコードする核酸レベル、いずれのレベルにおける確認でもよい。蛋白質レベルの確認は、それぞれのリガンドに対するバインディングアッセイの測定結果を利用してもよいが、MORとKORそれぞれに特異的な抗体を用いた免疫抗体染色法によって各蛋白質を染色し、得られる光学的データから発現比率を確認してもよい。 MORとKORそれぞれに対する特異抗体は、それぞれの蛋白質あるいは抗原性フラグメントを免疫源とし、当業者に周知の方法によって調製した特異抗体を使用することができるが、特異的なモノクローナル抗体の利用、特にそれぞれ異なる標識化合物が付加された、免疫染色法に利用可能な形態の抗体であることが好ましい。 Confirmation of the expression ratio of MOR and KOR in cultured cells may be confirmed at any level of protein level and nucleic acid encoding them. The protein level can be confirmed by using the measurement results of the binding assay for each ligand, but each protein is stained by an immuno-antibody staining method using antibodies specific for each of MOR and KOR. The expression ratio may be confirmed from the data. Specific antibodies against each of MOR and KOR can use specific antibodies prepared by methods well known to those skilled in the art using the respective proteins or antigenic fragments as immunogens. It is preferable that the antibody be in a form usable for immunostaining, to which a different labeling compound is added.
適当な標識化合物の種類や当該標識化合物が付加された抗体を用いて、細胞や組織に存在する蛋白質を検出し、その発現量を確認する方法は当業者に広く利用されている技術である。本発明においても、かかる公知ないし周知の方法を利用して、培養細胞内におけるMORとKORの発現比率を確認することができる。また、MORとKORを検出することのできる抗体はすでに市販もされており、例えばラビットで作製されたポリクローナル抗MOR抗体MOR-1 (H-80)（Santa cruz社）、ヤギで作製されたポリクローナル抗KOR抗体KOR-1 (N-19)（Santa cruz社）などがあり、また検出用蛍光標識２次抗体としては、Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG（インビトロジェン社）、あるいはCy3 donkey anti-goat IgG（Jackson ImmunoResearch社）等を利用することができる。 A method of detecting a protein present in a cell or tissue using an appropriate kind of labeling compound or an antibody to which the labeling compound is added and confirming the expression level thereof is a technique widely used by those skilled in the art. Also in the present invention, the expression ratio of MOR and KOR in cultured cells can be confirmed using such known or well-known methods. Further, antibodies capable of detecting MOR and KOR are already commercially available. For example, polyclonal anti-MOR antibody MOR-1 (H-80) (Santa cruz) produced by rabbits, polyclonal antibody produced by goats. Anti-KOR antibody KOR-1 (N-19) (Santa cruz) etc., and the fluorescent labeled secondary antibody for detection is Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (Invitrogen) or Cy3 donkey anti-goat IgG (Jackson ImmunoResearch) etc. can be used.
MORとKORの発現比率の確認は、それらをコードする核酸、典型的にはｍRNAの発現量を測定することでも行うことができる。ｍRNAの発現量は、MORとKORのそれぞれをコードするｍRNA中の特異的な塩基配列とハイブリダイズする塩基配列からなるDNAを用いたハイブリダイゼーション、RT-PCR、リアルタイムPCRその他の方法によって測定することができる。例えばMORについては、下記のプライマーセットを用いてPCRを行い、102bpの増幅断片を確認することでMORをコードするmRNAの発現量を定量することができる。 Confirmation of the expression ratio of MOR and KOR can also be performed by measuring the expression level of the nucleic acid encoding them, typically mRNA. The expression level of mRNA should be measured by hybridization, RT-PCR, real-time PCR and other methods using DNA consisting of nucleotide sequences that hybridize with specific nucleotide sequences in mRNAs encoding MOR and KOR. Can do. For example, with respect to MOR, the expression level of mRNA encoding MOR can be quantified by performing PCR using the following primer set and confirming the 102 bp amplified fragment.
フォワードプライマー１：TCCACGGCCAATACAGTGGATA（配列番号１）
リバースプライマー２ ：TGAAGGTCGGAATGGCATGA（配列番号２）
またKORについては、下記のプライマーセットを用いてPCRを行い、113bpの増幅断片を確認することでKORをコードするmRNAの発現量を定量することができる。
Forward primer 1: TCCACGGCCAATACAGTGGATA (SEQ ID NO: 1)
Reverse primer 2: TGAAGGTCGGAATGGCATGA (SEQ ID NO: 2)
As for KOR, the expression level of mRNA encoding KOR can be quantified by performing PCR using the following primer set and confirming the 113 bp amplified fragment.
以下の表に記載の塩基配列からなるプライマーを挙げることができる。 The primer which consists of a base sequence of the following table | surfaces can be mentioned.
フォワードプライマー３：GTCATCTGTTGGCATCTCTGCAATA（配列番号３）
リバースプライマー４ ：GGTCCCACCAGGAGTAGTCATCA（配列番号４）
また、MOR、KORをコードするDNAの塩基配列を基に、上記以外の塩基配列からなる任意のプライマーセットを設計、調製し、PCRを行ってもよい。
Forward primer 3: GTCATCTGTTGGCATCTCTGCAATA (SEQ ID NO: 3)
Reverse primer 4: GGTCCCACCAGGAGTAGTCATCA (SEQ ID NO: 4)
Moreover, based on the base sequence of DNA encoding MOR and KOR, an arbitrary primer set having a base sequence other than the above may be designed and prepared, and PCR may be performed.
本発明のスクリーニング方法では、上記の方法によってMORとKORとを発現することができる培養細胞におけるMORとKORの発現比率の確認を、化合物と培養細胞とをインキュベーションする前後において行った結果、インキュベーション前の培養細胞と比べてインキュベーション後の培養細胞におけるKORの発現比率を高める化合物を、鎮痒作用を有する化合物として判定する。KORの発現比率を高めることのできる化合物は、KORの発現を促進させる機能を有する、MORの発現を抑制する機能を有する、あるいはその両方の機能を有する化合物として理解することができる。その様な化合物は、痒みを訴えている患者の患部に投与することで、鎮痒作用を示すことが期待される。 In the screening method of the present invention, the MOR and KOR expression ratio in cultured cells capable of expressing MOR and KOR by the above method was confirmed before and after incubation of the compound and cultured cells. A compound that increases the expression ratio of KOR in cultured cells after incubation compared with the cultured cells of is determined as a compound having an antipruritic action. A compound capable of increasing the expression ratio of KOR can be understood as a compound having a function of promoting the expression of KOR, a function of suppressing the expression of MOR, or a function of both. Such a compound is expected to exhibit an antipruritic action when administered to the affected area of a patient complaining of itching.
また、本発明の痒みの判定方法は、患者から採取された患部の皮膚組織を構成する細胞、特に外胚葉系細胞において上記に様にしてMORとKORの発現比率を確認することで、痒みの度合いを判定する方法である。この方法によって、例えばヒトの正常な皮膚組織におけるMORとKORの発現比率と比較してMORの発現比率がどれだけ高いかによって、客観的な痒みの程度を判定することができる。 The itching determination method of the present invention confirms the expression ratio of MOR and KOR as described above in cells constituting the skin tissue of the affected area collected from the patient, particularly ectoderm cells as described above. This is a method for determining the degree. By this method, for example, the degree of objective itch can be determined depending on how high the expression ratio of MOR is compared with the expression ratio of MOR and KOR in normal human skin tissue.
また本発明は、上記の方法に利用可能なキットを提供する。このキットは、MORとKORとをそれぞれ特異的に認識する２種以上の抗体、及び／又はMORとKORのそれぞれをコードする核酸に対して特異的にハイブリダイズする２種以上のDNAを含む。 Moreover, this invention provides the kit which can be utilized for said method. The kit includes two or more antibodies that specifically recognize MOR and KOR, respectively, and / or two or more DNAs that specifically hybridize to nucleic acids encoding each of MOR and KOR.
抗体は、先に説明したとおりの、MORとKORをそれぞれ特異的に認識する抗体、好ましくはモノクローナル抗体であって、それぞれ異なる標識化合物が付加された、免疫抗体染色法に利用可能な形態にある抗体であることが好ましい。その様な抗体の調製は、当業者に広く利用されている技術を用いて行うことができる。 The antibody is an antibody specifically recognizing each of MOR and KOR, preferably a monoclonal antibody, as described above, and is in a form that can be used for immuno-antibody staining, each with a different labeled compound added thereto. It is preferably an antibody. Such antibodies can be prepared using techniques widely used by those skilled in the art.
MORとKORのそれぞれをコードする核酸に対して特異的にハイブリダイズする２種以上のDNAとは、MORとKORのそれぞれをコードするmRNA中の特異的な塩基配列とハイブリダイズする塩基配列からなるDNAである。この本発明のキットは、MORとKORのそれぞれをコードする核酸に対して特異的にハイブリダイズする異なる２種のDNA、すなわちMORをコードする核酸に対して特異的にハイブリダイズするDNAと、KORをコードする核酸に対して特異的にハイブリダイズするDNAを含んでいてもよい。また本発明のキットは、RT-PCRやリアルタイムPCR等の核酸の増幅を行うためのDNAのセット、すなわちMORをコードする核酸を特異的に増幅するための一組のプライマーDNAと、KORをコードする核酸を特異的に増幅するための一組のプライマーDNAとを含んでいてもよい。プライマーDNAの例としては、前述のフォワードプライマー１とリバースプライマー２の組み合わせ、フォワードプライマー３とリバースプライマー４の組み合わせなどを挙げることができるが、これらには限定されない。
The two or more types of DNAs that specifically hybridize to nucleic acids encoding MOR and KOR are composed of base sequences that hybridize with specific base sequences in mRNA encoding each of MOR and KOR. DNA. This kit of the present invention comprises two different types of DNA that specifically hybridize to nucleic acids encoding MOR and KOR, that is, DNA that specifically hybridizes to a nucleic acid encoding MOR, and KOR. DNA that specifically hybridizes to the nucleic acid encoding can be included. The kit of the present invention encodes a set of DNA for performing nucleic acid amplification such as RT-PCR and real-time PCR, that is, a pair of primer DNAs for specifically amplifying a nucleic acid encoding MOR, and KOR. And a set of primer DNAs for specifically amplifying the nucleic acid to be amplified. Examples of the primer DNA include, but are not limited to, the combination of the forward primer 1 and the reverse primer 2 and the combination of the forward primer 3 and the
また本発明のキットは、上記の抗体及び／又はDNAの他に、本発明の方法の実施に利用可能なあるいは好適な、任意の試薬、器具その他の要素を含んでいてもよい。 Further, the kit of the present invention may contain, in addition to the above-described antibody and / or DNA, any reagent, instrument, or other element that can be used or suitable for carrying out the method of the present invention.
以下、非限定的な実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to non-limiting examples.
１）献体の準備
健常人の腹部皮膚を局所麻酔後に3 mmパンチを用いて採取することにより、健常検体を用意した。また、アトピー性皮膚炎患者の上腕、首、腹部などの患部皮膚を局所麻酔後に3 mmパンチを用いて採取することにより、痒みを有する部位より病変検体を用意した。さらに、ＰＵＶＡ療法を行った後の同患者の同患部から同様に皮膚検体を採取することにより、治療検体を用意した。いずれの献体も、4% パラホルムアルデヒド固定液で4時間、4度で固定し、その後、OCTコンパウンドに包埋し、液体窒素により凍結ブロックを作製し、−８０℃で保存した。
1) Preparation of a donation A healthy specimen was prepared by collecting abdominal skin of a healthy person using a 3 mm punch after local anesthesia. In addition, a lesion specimen was prepared from a site with itching by collecting affected skin such as the upper arm, neck, and abdomen of an atopic dermatitis patient with a 3 mm punch after local anesthesia. Furthermore, a treatment sample was prepared by collecting a skin sample in the same manner from the affected area of the patient after performing the PUVA therapy. All donations were fixed with 4% paraformaldehyde fixative for 4 hours at 4 degrees, then embedded in OCT compound, frozen blocks made with liquid nitrogen, and stored at −80 ° C.
２）抗体の準備
次項以降で使用した抗体は次の通りである。
2) Preparation of antibodies The antibodies used in the following sections are as follows.
・抗MOR抗体：ラビットで作製されたポリクローナル抗体MOR-1 (H-80)、Cat. no. sc-15310（Santa cruz社）。 Anti-MOR antibody: Polyclonal antibody MOR-1 (H-80) produced by rabbit, Cat. No. Sc-15310 (Santa cruz).
・抗KOR抗体：ヤギで作製されたポリクローナル抗体KOR-1 (N-19)、Cat. no. sc-7494（Santa cruz社）。 Anti-KOR antibody: Polyclonal antibody KOR-1 (N-19), Cat. No. Sc-7494 (Santa cruz) produced in goats.
・MOR、KOR検出用蛍光標識２次抗体：Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG、Cat. no. A21206（インビトロジェン社）、Cy3 donkey anti-goat IgG、Cat. no. 705-165-147（Jackson ImmunoResearch社）。 ・ Fluorescent labeled secondary antibodies for MOR and KOR detection: Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG, Cat. No. A21206 (Invitrogen), Cy3 donkey anti-goat IgG, Cat. No. 705-165-147 (Jackson ImmunoResearch Company).
・抗β-end抗体：ラビットで作成されたポリクローナル抗体Cat. no. AB5028（Chemicon社）。 Anti-β-end antibody: Polyclonal antibody Cat. No. AB5028 (Chemicon) made with Rabbit.
・抗-DynA(1-17)抗体：ラビットで作成されたポリクローナル抗体Cat. no. T-4268（BACHEM社）。 Anti-DynA (1-17) antibody: Polyclonal antibody Cat. No. T-4268 (BACHEM) made with Rabbit.
・抗-DynA(1-8)抗体：ラビットで作成されたポリクローナル抗体Cat. no. T-4272（BACHEM社）。 Anti-DynA (1-8) antibody: Polyclonal antibody Cat. No. T-4272 (BACHEM) made with Rabbit.
・β-end、DynA検出用蛍光標識２次抗体：Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG、Cat. no. A21206（インビトロジェン社）。 -Fluorescently labeled secondary antibody for detecting β-end, DynA: Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG, Cat. No. A21206 (Invitrogen).
２）免疫組織染色
１）の各保存検体からCM1850 cryostatを用いて5 μmの厚さで凍結切片を作製し、シランコートが施されたスライドグラスに貼り付けた。このスライドグラスをPBS(pH 7.4)で2回洗浄後、5% normal donkey serumと2% BSAを含むPBS（ブロッキング液）を組織サンプルの上にのせ、1時間、室温でインキュベーションを行った。１時間後、スライドからブロッキング液を除去し、次にブロッキング液で希釈した１次抗体を組織サンプルの上にのせ、一晩（約１６時間）、４度でインキュベーションを行った。翌日、スライドから１次抗体を除去し、PBSで３回洗浄後、ブロッキング液で希釈した検出用蛍光標識２次抗体を組織サンプルの上にのせ、1時間、室温でインキュベーションを行った。インキュベーション後、スライドから２次抗体を除去し、PBSで３回洗浄し、vectashield mounting mediumにより封入を行った。封入した標本を共焦点レーザー顕微鏡DMIRE2 (Leica社)を用いて観察し、写真撮影を行った。
2) Immunohistochemical staining Using the CM1850 cryostat, a frozen section was prepared from each preserved specimen of 1) with a thickness of 5 μm, and attached to a silane-coated slide glass. After the slide glass was washed twice with PBS (pH 7.4), PBS containing 5% normal donkey serum and 2% BSA (blocking solution) was placed on the tissue sample and incubated at room temperature for 1 hour. After 1 hour, the blocking solution was removed from the slide, and then the primary antibody diluted with the blocking solution was placed on the tissue sample and incubated overnight (about 16 hours) at 4 times. On the next day, the primary antibody was removed from the slide, washed three times with PBS, and the fluorescent labeled secondary antibody for detection diluted with a blocking solution was placed on the tissue sample and incubated for 1 hour at room temperature. After incubation, the secondary antibody was removed from the slide, washed 3 times with PBS, and sealed with a vectashield mounting medium. The enclosed specimen was observed using a confocal laser microscope DMIRE2 (Leica) and photographed.
その結果、健常検体では、MOR（図１）とKOR（図２）がほぼ同程度発現していることが確認された。またMORの内因性作動薬であるβ-end（図３）、及びKORの内因性作動薬であるDynA（図４）も、ほぼ同程度発現していた。一方、痒みを有する病変検体では、MOR（図５）は正常皮膚組織と同程度に発現しているのに対して、KOR（図６）の発現が著しく減少していた。またβ-end（図７）は正常皮膚組織と同程度に発現しているのに対して、DynA（図８）の発現は減少していた。また治療検体に対する観察の結果、PUVA治療を行うことによってMORの発現量が有意に低下すること（図９）、DynAの発現量が正常皮膚組織と同レベルにまで回復すること（図１２）が確認され、痒みの低減にはMORの発現抑制及び／又はDynAの発現回復（増加）が関与していることが示された。また、PUVA治療後のアトピー性皮膚炎患者の患部皮膚におけるKORの発現状態（図１０、赤色の発色がKORの発現を表す）、及びβ-endの発現状態（図１１、緑色の発色がβ−endの発現を表す）を観察した。 As a result, it was confirmed that MOR (FIG. 1) and KOR (FIG. 2) were expressed in substantially the same degree in healthy samples. In addition, β-end (Fig. 3), which is an endogenous agonist of MOR, and DynA (Fig. 4), which is an endogenous agonist of KOR, were also expressed to almost the same extent. On the other hand, in the lesion specimen having itching, MOR (FIG. 5) was expressed to the same extent as normal skin tissue, whereas KOR (FIG. 6) expression was significantly reduced. In addition, β-end (FIG. 7) was expressed to the same extent as normal skin tissue, whereas DynA (FIG. 8) was decreased. Further, as a result of observation on the treated specimen, the PUVA treatment significantly decreases the expression level of MOR (FIG. 9), and the expression level of DynA recovers to the same level as that of normal skin tissue (FIG. 12). It was confirmed that it was confirmed that suppression of MOR expression and / or recovery (increase) of DynA expression was involved in the reduction of itching. In addition, the expression state of KOR in the affected skin of the patient with atopic dermatitis after PUVA treatment (FIG. 10, red color development indicates the expression of KOR), and β-end expression state (FIG. 11, green color development is β -Represents expression of end).
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