JP2008104424A - アンモニウムカチオンを用いたオリゴヌクレオチドの融解温度制御法 - Google Patents

Abstract

【課題】ハイブリダイゼーション反応において、効率的に特異的ハイブリッドを形成させるオリゴヌクレオチドの融解温度の制御方法の提供。
【解決手段】下記式（式中、Ｒ_１〜Ｒ_４は水素原子であってよいが、Ｒ_１〜Ｒ_４の全てが水素原子であるものは除く）で示されるアンモニウムカチオンを用いる。

【選択図】なし

Description

本発明は、オリゴヌクレオチドの融解温度を制御する方法に関する。より詳しくは、特定のアンモニウムカチオンを用いて、ハイブリダイゼーション反応におけるオリゴヌクレオチドの融解温度を制御する方法に関する。

ゲノム上には、塩基の置換や欠失、逆位、挿入、遺伝子の重複や転座等、多くの多型が存在している。このうち遺伝子をコードする領域で見られる１〜数十塩基の置換や欠失、挿入は、疾病の発症に直接関連する遺伝子変異として、現在までに種々の遺伝子及び疾患に関連して膨大なデータが蓄積されてきている。近年、これらの遺伝子変異に加えて、一塩基多型（single nucleotide polymorphism、ＳＮＰ）と呼ばれる多型が注目されるようになってきている。ＳＮＰは、ゲノム上数百塩基から１０００塩基に１ヶ所程度の割合で存在する一塩基の置換であり、ヒトゲノム上には３００万〜１０００万のＳＮＰがあると推定されている。SNPは個々人の疾患感受性や薬剤応答性を規定しているものと考えられており、いわゆるオーダーメード医療の実現に向け、精力的なデータ収集が行なわれている。

これらの多型を検出するための手段についても、盛んに研究が進められており、これまでにハイブリダイゼーションに基づくもの、プライマー伸長に基づくもの、あるいは酵素の基質特異性を利用するもの等、様々な手法が開発されるに到っている。このなかでも、ハイブリダイゼーションに基づく方法（以下、ハイブリダイゼーション法という）は、現在最も広く普及した多型解析手段となっている。ハイブリダイゼーション法は、非相補的な塩基対（ミスマッチ）が存在する２本鎖ＤＮＡは、完全に相補的な２本鎖ＤＮＡに比べて、ハイブリッド形成が不安定であるという性質を利用して、多型を検出する手法である。

完全相補的な２本鎖ＤＮＡは、相補的な塩基対（アデニン−チミン、グアニン−シトシン）間に形成される水素結合によって安定的にハイブリッドを形成する。これに対して、１塩基でもミスマッチが存在する２本鎖（ミスマッチ鎖）ＤＮＡでは、当該ミスマッチ塩基間において水素結合が形成されないため、ハイブリッドが形成されにくく、また、形成されたとしても当該ハイブリッドは不安定な状態となる。ハイブリダイゼーション法は、このような完全相補鎖ＤＮＡとミスマッチ鎖ＤＮＡの安定性の違いを利用して、ミスマッチ鎖はハイブリッドを形成できないが、完全相補鎖はハイブリッドを形成できるような一定の条件下においてハイブリダイゼーション反応を行い、完全相補鎖が形成したハイブリッドを検出することを基本原理としている。

例を挙げて説明すると、ハイブリダイゼーション法として最も基本的なものであるＡＳＯ法においては、標識したオリゴヌクレオチドプローブが完全に相補的なＤＮＡ（正常遺伝子）とはハイブリッドを形成できるが、ミスマッチがあるＤＮＡ（変異遺伝子）とはハイブリッドを形成できないような条件下において、オリゴヌクレオチドプローブと被検ＤＮＡのハイブリダイゼーション反応を行う。この反応により、被検ＤＮＡと標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズして、被検ＤＮＡが標識されれば、被検ＤＮＡは正常遺伝子と判定することができ、一方、被検ＤＮＡと標識オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズせず、被検ＤＮＡが標識されなければ、被検ＤＮＡは変異遺伝子と判定することができる。

近年、同時に数万〜数十万のＳＮＰを解析できるＤＮＡチップが登場してきているが、この多型解析用のＤＮＡチップ（以下、単にＤＮＡチップという）も、上記の基本原理に基づくハイブリダイゼーション法の１つである。ＤＮＡチップは、目的のSNP部位を含む塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブ（通常２０〜３０mer程度の長さ）をガラス基板上に合成したものである。このオリゴヌクレオチドプローブには、SNP部位の多型に応じて一塩基を変化させた複数の配列を有するプローブが用いられる。まず、多型を調べたい被検ＤＮＡを蛍光試薬で標識する。その後、被検ＤＮＡが完全に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ（被検ＤＮＡのSNPに対応するプローブ）とはハイブリッドを形成できるが、ミスマッチがあるオリゴヌクレオチドプローブ（被検ＤＮＡのSNPに対応しないプローブ）とはハイブリッドを形成できないような条件下において、オリゴヌクレオチドプローブと被検ＤＮＡのハイブリダイゼーション反応を行う。最後に蛍光強度を測定して、被検ＤＮＡがどのオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたかを検出すれば、該被検ＤＮＡと完全相補的なオリゴヌクレオチドプローブを特定することができ、結果として被検ＤＮＡの有していた塩基配列、すなわち多型を判定することが可能となる。

このようにハイブリダイゼーション法による多型解析においては、完全相補鎖ＤＮＡはハイブリッドを形成し得るが、ミスマッチ鎖ＤＮＡはハイブリッドを形成できないような条件下でハイブリダイゼーション反応を行なうことが必須となる。

仮に反応条件が適切でない場合には、例えば、ＡＳＯ法においては、標識したオリゴヌクレオチドプローブが完全相補的なＤＮＡ（正常遺伝子）とも、ミスマッチがあるＤＮＡ（変異遺伝子）ともハイブリッドを形成し、被検ＤＮＡの多型を判定することができない。また、ＤＮＡチップ法においても、蛍光標識した被検ＤＮＡが、当該被検ＤＮＡの多型に対応する完全相補的なオリゴヌクレオチドプローブのみならず、他の多型に対応するミスマッチのオリゴヌクレオチドプローブにもハイブリダイズしてしまい、有意な蛍光シグナルが得られず、被検ＤＮＡの多型を判定することができなくなる。

このようなミスマッチ鎖を形成するＤＮＡのハイブリダイズは、完全相補鎖を形成するハイブリダイズを特異的ハイブリダイズ（特異的結合）と呼ぶのに対して、非特異的ハイブリダイズ（非特異的結合）と呼ばれる。ハイブリダイゼーション法においては、この特異的ハイブリダイズによるシグナルを「Ｓｉｇｎａｌ（シグナル）」、非特異的ハイブリダイズによるシグナルを「Ｎｏｉｓｅ（ノイズ）」として、両者のシグナル強度比（Ｓ／Ｎ比）をとることで、解析結果の信頼性評価を行なっている。すなわち、Ｓ／Ｎ比が低い場合には、本来検出されるべき特異的ハイブリダイズ以外に、相当程度の非特異的ハイブリダイズをも検出しているということであり、最終的に得られた多型判定結果が間違いである可能性が高くなる。

ハイブリダイゼーション反応において、非特異的ハイブリダイズを抑制するためには、反応に用いるオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列や、反応の温度・時間、反応溶液組成等の条件検討が不可欠であり、この中でも特に温度条件の検討が重要である。２本鎖オリゴヌクレオチドが１本鎖オリゴヌクレオチドに解離する温度を、融解温度（Melting temperature, Tm）というが、完全相補鎖ＤＮＡは、安定的なハイブリッドを形成しているため、高温下でも容易に１本鎖に解離せず、Ｔｍは高い。これに対して、ミスマッチ鎖ＤＮＡは、ハイブリッド形成が不安定なため、より低い温度で解離が起き、Ｔｍは低くなる。従って、ハイブリダイゼーション反応の温度条件を、完全相補鎖ＤＮＡのＴｍより低く、かつ、ミスマッチ鎖ＤＮＡのＴｍよりは高く設定できれば、特異的ハイブリッドのみを形成させて、非特異的ハイブリダイズを抑制することが可能となる。非特異的ハイブリダイズを抑制するための別法として、特許文献１には、ハイブリダイゼーション反応後に超音波を用いた洗浄工程を行なう方法が開示されている。
特表２００５−５０２３４６号公報。

塩基配列中の１塩基ないしは数塩基の違いによって、被検ＤＮＡとオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成が左右されるようなハイブリダイゼーション反応の温度条件を見出すことは、実際には容易ではないため、温度条件の最適化によっても、高い再現性をもって特異的ハイブリダイズのみを検出することは困難である。これは、Ｔｍはオリゴヌクレオチドに存するミスマッチのみに依存して決定されるわけではなく、該オリゴヌクレオチドの塩基数（長さ）や、塩基配列に占めるグアニン又はシトシンの比率（ＧＣ含有率）にも依存する性質があるためである。

一般に、オリゴヌクレオチドが長いほど、塩基対の数及び塩基対間に形成される水素結合の数が多くなるため、Ｔｍは高くなる。また、アデニン−チミン間においては２つの水素結合しか形成されないのに対して、グアニン−シトシン間では３つの水素結合が形成されるため、オリゴヌクレオチドのＧＣ含有率が高くなるほど、水素結合の数が増えて、Ｔｍは高くなる。従って、ハイブリダイゼーション反応の温度条件を設定する際には、これらオリゴヌクレオチドプローブのTmを規定する要素を勘案して、適切な温度条件を検討する必要がある。

Tmを規定する上記要素のうち、オリゴヌクレオチドプローブの長さについては、該プローブの設計段階である程度調整することが可能である。しかし、オリゴヌクレオチドプローブのGC含有率については、検出したい多型部位の周辺配列に相補的に設計せざるを得ない。そのため、GC含有率が高いオリゴヌクレオチドでは、該オリゴヌクレオチドにミスマッチが存したとしても、Tmは比較的高く、他の完全相補的ではあるがGC含有率が低いオリゴヌクレオチドのＴｍよりも高くなることがある。このことは、GC含有率が高いオリゴヌクレオチドプローブでの非特異的ハイブリダイズを抑制するために、ハイブリダイゼーション反応の温度を上げると、他のGC含有率が低いオリゴヌクレオチドプローブでは特異的ハイブリダイズさえも起こらなくなってしまうということを意味し、ハイブリダイゼーション法における温度条件設定の困難さの原因となっている。特に、ＤＮＡチップ法では、それぞれＴｍが異なる数万〜数十万のオリゴヌクレオチドプローブについて、本来的にはその全てに共通する画一的な最適温度条件を設定する必要がある。しかし、実際の解析においては、非特異的ハイブリダイズを最小限に抑え得る温度条件を検討し、該温度条件においてハイブリダイゼーション反応を行ってもなお生ずる非特異的ハイブリダイズについては、ノイズとして甘受せざるを得ない状況であった。

そこで、本発明は、ハイブリダイゼーション反応において、非特異的ハイブリダイズを抑制し、効率的に特異的ハイブリッドのみを形成させることを目的とした、オリゴヌクレオチドの融解温度の制御方法を提供する。

上記課題を解決するため、本発明においては、まず、
式：
（式中、Ｒ_１〜Ｒ_４は水素原子であってよいが、Ｒ_１〜Ｒ_４の全てが水素原子であるものは除く）
で示されるアンモニウムカチオンを用いて、ハイブリダイゼーション反応におけるオリゴヌクレオチドの融解温度を制御する方法を提供する。

本発明において、「オリゴヌクレオチド」とは、DNA及びオリゴヌクレオチドプローブ、オリゴヌクレオチドプライマーを包含し得る概念とする。また、「ハイブリダイゼーション反応」とは、一般に、１本鎖オリゴヌクレオチドが２本鎖オリゴヌクレオチドを形成することをいうが、本発明においては、オリゴヌクレオチドが「２本鎖の形成と１本鎖への解離との間でなす熱平衡反応」を広く意味するものとする。

上記アンモニウムカチオンは、オリゴヌクレオチドが形成するハイブリッドの安定性を低下させることで、オリゴヌクレオチドのTmを、
（１）低下させる作用
（２）GC含有率に非依存的とする作用
を発揮する。本発明における「オリゴヌクレオチドの融解温度の制御」とは、上記アンモニウムカチオンがオリゴヌクレオチドのTmに及ぼすこれらの作用によって実現されるものであり、ハイブリダイゼーション反応において、非特異的ハイブリダイズを抑制し、効率的に特異的ハイブリッドのみを形成させることを可能とするものである。なお、上記アンモニウムカチオンがこれらの作用を発現するメカニズムについては、図を用いて後述する。

本願発明者は、まず上記アンモニウムカチオンの有するオリゴヌクレトチドのTmを（１）低下させる作用について検討を重ね、当該作用は、
（１a）オリゴヌクレオチドに存するミスマッチが多くなるほど顕著に現れる
（１b）上記式中Ｒ_１〜Ｒ_４に有する残基の分子量が大きいほど増強されることを見出した。本発明において「残基」とは、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、芳香族炭化水素基、エーテル基、アシル基等を広く含み、特に限定はされない。

上述したように、ハイブリダイゼーション反応の温度条件は、完全相補鎖のＴｍより低く、かつ、ミスマッチ鎖のＴｍよりは高く設定する必要がある。この場合において、一のオリゴヌクレオチドが完全相補的である場合のTmと、ミスマッチが存する場合のTmの温度差が小さいと、設定可能な温度条件の温度幅も小さくなるため、温度条件の設定には厳密な検討が必要となる。しかし、完全相補的である場合のTmと、ミスマッチが存する場合のTmの温度差が大きければ、設定可能な温度幅が大きくなるため、温度条件の設定が容易となる。

上記アンモニウムカチオンの存在下では、（１a）ミスマッチが多くなるほど、また（１b）上記式中Ｒ_１〜Ｒ_４に有する残基の分子量が大きくなるほど、完全相補鎖のTmに比べて、ミスマッチ鎖のTmが大きく低下し、両者の温度幅が大きくなる。従って、温度条件の設定が容易となり、非特異的ハイブリダイズを抑制し、効率的に特異的ハイブリダイズのみを形成させることが可能となる。

さらに、上記式中Ｒ_１〜Ｒ_４に有する残基の分子量を任意に変化させて、上記アンモニウムカチオンのオリゴヌクレオチドのTmを制御する機能を調整すれば、使用する解析機器等に合わせて所望のハイブリダイゼーション反応の温度条件を実現することが可能である。

特に、上記式中Ｒ_１〜Ｒ_４に有する残基をメチル基、エチル基、プロピル基等の炭化水素基とすることにより、該炭化水素基の炭素数を自由に変更して残基の分子量を容易に変更することができるため、上記アンモニウムカチオンのオリゴヌクレオチドのTmを制御する機能を任意に調整することが容易となる。

次に、本願発明者は、上記アンモニウムカチオンの有するオリゴヌクレトチドのTmを（２）GC含有率に非依存的とする作用について検討を行なった。

上述したように、オリゴヌクレオチドのTmは、該オリゴヌクレオチドの塩基数（長さ）や、ＧＣ含有率、ミスマッチの存否に依存する。ここで、オリゴヌクレオチドの塩基数が一定であり、TmがＧＣ含有率に非依存的であるならば、該オリゴヌクレオチドのTmはミスマッチの存否によってのみ決定されることとなる。すなわち、完全相補鎖オリゴヌクレオチドのTmはその塩基配列に拠らず、常にミスマッチ鎖のＴｍより高くなるため、多数の塩基配列（GC含有率）の異なるオリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーション反応であっても、温度条件の設定が容易となり、非特異的ハイブリダイズを抑制し、効率的に特異的ハイブリダイズのみを形成させることが可能となる。

続いて、本願発明者は、このような上記アンモニウムカチオンのTmを、
（１）低下させる作用
（２）ミスマッチの存否にのみ依存的とする作用
に基づいてオリゴヌクレオチドのTmを制御する方法を、DNA多型解析法及びDNAミスマッチ検出法、PCR法におけるハイブリダイゼーション反応へ応用した。

上記アンモニウムカチオンを用いて、オリゴヌクレオチドのTmを制御することにより、上述の通り、非特異的ハイブリダイズを抑制し、効率的に特異的ハイブリダイズのみを形成させることができるため、DNA多型解析法において、ノイズのない高精度の解析結果を得ることが可能となる。

DNAミスマッチ検出法も、いわばDNA多型解析方法のひとつということができ、上述のASO法とは表裏一体の関係にある。すなわち、ASO法がハイブリダイゼーション反応の温度を上昇させて、Tmの低い非特異的ハイブリッドを解離させ、特異的ハイブリッドのみを検出する方法であるのに対して、DNAミスマッチ検出法は、ハイブリダイゼーション反応の温度を上昇させて、Tmの高い特異的ハイブリッドの解離に先立って起こる非特異的ハイブリッドの解離を検出するものである。上記アンモニウムカチオンを用いたオリゴヌクレオチドのTmの制御により、非特異的ハイブリダイズが抑制された状態、換言すれば、非特異的ハイブリッドが不安定さを増した状態にあっては、非特異的ハイブリッドの解離を特異的ハイブリッドの解離とより明確に区別して、高感度に検出することが可能となる。

また、オリゴヌクレオチドのTmを制御することで、PCR法においては、効率的な目的オリゴヌクレオチドの増幅が可能となる。すなわち、PCR法においては、プライマーオリゴヌクレオチドが目的オリゴヌクレオチドと特異的ハイブリダイズを形成（プライミング）することが必要で、プライマーオリゴヌクレオチドと目的としないオリゴヌクレオチドが非特異的ハイブリダイズを形成（ミスプライミング）してしまうと、目的オリゴヌクレオチドを効率的に増幅することができなくなる。従って、上記アンモニウムカチオンを用いて、オリゴヌクレオチドのTmを制御し、非特異的ハイブリダイズを抑制すれば、効率的に目的オリゴヌクレオチドのみを増幅することが可能となるのである。

さらに、上述したように、上記式中Ｒ_１〜Ｒ_４に有する残基の分子量を任意に変化させて、上記アンモニウムカチオンのオリゴヌクレオチドのTmを制御する機能を調整すれば、DNA多型解析法、DNAミスマッチ検出法、PCR法において、所望のハイブリダイゼーション反応の温度条件を実現することができ、それぞれの精度や感度、増幅効率を任意にコントロールすることが可能となる。

本発明にかかるオリゴヌクレオチドの融解温度の制御方法により、ハイブリダイゼーション反応において、非特異的ハイブリダイズを抑制し、効率的に特異的ハイブリッドのみを形成させることが可能となる。

以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
上述の通り、

で示されるアンモニウムカチオンは、オリゴヌクレオチドが形成するハイブリッドの安定性を低下させることで、オリゴヌクレオチドのTmを、
（１）低下させる作用
（２）ＧＣ含有率に非依存的なものとする作用
を発揮する。

ここで、式中、Ｒ_１〜Ｒ_４は水素原子であってよいが、Ｒ_１〜Ｒ_４の全てが水素原子であるアンモニウムカチオンは除かれ、望ましくは、Ｒ_１〜Ｒ_４の全てが水素原子ではない第４級アンモニウムカチオンを採用することが好ましい。第４級アンモニウムカチオンは、第１級〜３級アンモニウムカチオンと異なり、溶媒のｐHによって電荷が失われることがない安定したカチオンであることによる。

上記式中Ｒ_１〜Ｒ_４は、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、芳香族炭化水素基、エーテル基、アシル基等を広く含み、限定はされないが、特に炭素と水素からなる炭化水素基が好ましく、さらにはメチル基、エチル基、プロピル基等の飽和脂肪族炭化水素基（アルキル基）が好適である。アルキル基を採用した場合には、その炭素数によりアンモニウムカチオンの分子量が一義的に表されるため、その分子量に基づくオリゴヌクレオチドのTmを制御する機能の調整が容易となる。なお、上記式で示されるアンモニウムカチオン以外にも、テトラアルキル尿素、テトラアルキルホスホニウム塩、テトラアルキルジアミン等も同様の目的で使用することが可能である。

上記アンモニウムカチオンが、（１）及び（２）の作用を発揮するメカニズムは、一に特定することはできないが、上記アンモニウムカチオンの以下のような性質が関与しているものと考えられる。

図１は、DNAの二重らせん構造におけるヌクレオチドの結合を表す模式図である。図１中、四角に囲ったA,G,T,Cの文字は、それぞれアデニン、グアニン、チミン、シトシン塩基を示している。各ヌクレオチドはホスホジエステル結合によって連結され、二本のポリヌクレオチド鎖を構成している。該ポリヌクレオチド鎖は、塩基対が形成する水素結合（図中破線）により、安定したハイブリッドを形成している。このように二本のポリヌクレオチド鎖が安定してハイブリッドを形成している状態におけるポリヌクレオチド鎖間の距離を図中L_１で表した。

図２は、上記アンモニウムカチオンの１つであるテトラメチルアンモニウムカチオンの存在下におけるヌクレオチドの結合を表す模式図である。図２中、Aはテトラメチルアンモニウムカチオンを示している。

ヌクレオチド間に形成されたホスホジエステル結合において、一の酸素原子はマイナスの極性を有している。この酸素原子にテトラメチルアンモニウムカチオンがイオン結合すると、図２のように、二本のポリヌクレオチド鎖間の距離がL_２（＞L₁）に押し広げられると考えられる（図１も参照）。

このテトラメチルアンモニウムカチオンが二本のポリヌクレオチド鎖の距離を押し広げる働きは、テトラメチルアンモニウムカチオンの有する炭化水素残基に基づくものと推定される。テトラメチルアンモニウムカチオンは４つのメチル基を有しており、分子量及び分子サイズが大きく、「嵩だか」な分子となっている。従って、ポリヌクレオチド鎖に結合すると、この「嵩だか」性により、二本のポリヌクレオチド鎖間の距離を物理的に押し広げると考えられる。

このように、ポリヌクレオチド鎖間の距離が広がった状態では、塩基対間の距離も遠くなる（L₂＞L₁）ため、塩基対間の水素結合の形成が阻害されたり、結合力が減殺される。従って、ポリヌクレオチド鎖が形成するハイブリッドの安定性が低下し、Tmが低下するものと考えられる。さらに、ここで、上述の通り、グアニン−シトシンの結合は３つの水素結合が形成されるのに対して、アデニン−チミン間の結合は２つの水素結合しか形成されないため、両塩基対の結合力には差が存在する。しかし、ポリヌクレオチド鎖間の距離が広げられ水素結合の結合力が減殺された状態にあっては、アデニン−チミン、グアニン−シトシンの結合力の差が無視することができる程度まで小さくなり、グアニン−シトシン及びアデニン−チミンのハイブリッド安定化への寄与度を同等とみなすことが可能となる。このようにして、テトラメチルアンモニウム塩は、オリゴヌクレオチドのTmをＧＣ含有率に非依存的なものとする作用を発揮するものと考えられる。

図３は、上記アンモニウムカチオンの１つであるテトラエチルアンモニウムカチオンの存在下におけるヌクレオチドの結合を表す模式図である。図３中、A₂はテトラエチルアンモニウムカチオンを示している。

ヌクレオチド間に形成されたホスホジエステル結合の酸素原子にテトラエチルアンモニウムカチオンがイオン結合すると、図３のように、二本のポリヌクレオチド鎖間の距離がL_３（＞L_２＞L₁）に押し広げられる（図１及び図２も参照）。

テトラエチルアンモニウムカチオンは４つのエチル基を有しており、テトラメチルアンモニウムカチオンに比べて、さらに分子量及び分子サイズが大きく、より「嵩だか」な分子となっている。従って、ポリヌクレオチド鎖に結合すると、二本のポリヌクレオチド鎖間の距離を一層広く押し広げることとなる（L_３＞L_２＞L₁）。

このように、ポリヌクレオチド鎖間の距離が一層広げられた状態では、塩基対間の距離もさらに遠くなるため、塩基対間の水素結合の形成が阻害されたり、結合力が減殺される効果がさらに大きくなるため、残基の分子量を大きくするほど、オリゴヌクレオチドのTmを低下させる作用が増強されたものと推定される。ただし、残基の分子量が大きくなりすぎると、ポリヌクレオチド鎖間にアンモニウムカチオンが入り込めなくなり、Tmを低下させる作用が失われる可能性があると考えられる。

以上は、上記アンモニウムカチオンがオリゴヌクレオチドのTmを低下させる作用、及び、ＧＣ含有率に非依存的なものとする作用につき、推定されるメカニズムの一つを述べたものであり、他のメカニズムの関与も当然に考えられる。

次に、上記アンモニウムカチオンのこれらの作用に基づいてオリゴヌクレオチドのTｍを制御する方法のハイブリダイゼーション反応への応用について、図４に基づいて説明する。

図４中、T₀は一般に用いられる塩化ナトリウムを含有する緩衝液中における完全相補鎖のTm、T₂はミスマッチ鎖（ミスマッチ数２）のTmを示す。そして、式中Ｒ_１〜Ｒ_４に炭素数がｋである飽和脂肪族炭化水素残基を有するアンモニウムカチオンを含有する緩衝液中における完全相補鎖のTmをT₀(R_k)、ミスマッチ鎖（ミスマッチ数２）のTmをT₂(R_k)で示した。

図４に示すように、塩化ナトリウムを含有する緩衝液中においても、完全相補鎖に比べ、安定性の低いミスマッチ鎖ではTmは低下する（T₀＞T₂）。ところが、式中Ｒ_１〜Ｒ_４に有する炭化水素残基の炭素数がｋであるアンモニウムカチオンを含有する緩衝液中おいては、完全相補鎖のTmであるT₀(R_k)に比べ、ミスマッチ鎖のT_２(.R_k)はより大きく低下する。従って、図４中、ミスマッチ数の増加に伴うTmの低下を表す直線の傾きは、塩化ナトリウムを含有する緩衝液中に比べ、炭化水素残基の炭素数がｋであるアンモニウムカチオンを含有する緩衝液中ではより大きくなっている。これは、Tmを低下させる作用は、オリゴヌクレオチドに存するミスマッチ数が多いほど顕著に現れることによる。

このような条件下で、ハイブリダイゼーション反応の適切な温度条件について検討すると、塩化ナトリウムを含有する緩衝液中における適切な温度条件は、ミスマッチ鎖のTm（T₂）より高く、完全相補鎖のTm（T₀）より低い温度、すなわち、図中Dの範囲となる。これに対して、炭化水素残基の炭素数がｋであるアンモニウムカチオンを含有する緩衝液中における反応の適切な温度条件は、図中D_ｋの範囲となり、これはDよりも大きい。従って、炭化水素残基の炭素数がｋであるアンモニウムカチオンを含有する緩衝液中においては、温度条件の設定可能範囲が広くなっているといえる。

さらに、図４中、式中Ｒ_１〜Ｒ_４に有する炭化水素残基の炭素数がｌであるアンモニウムカチオンを含有する緩衝液中における完全相補鎖のTmをT₂(R_ｌ)、ミスマッチ鎖（ミスマッチ数２）のTmをT₂(R_ｌ)で示した。ここで、ｌ＞ｋである。

炭化水素残基の炭素数がｌであるアンモニウムカチオンを含有する緩衝液中において、ミスマッチ数の増加に伴うTmの低下を表す直線の傾きは、炭化水素残基の炭素数がｋであるアンモニウムカチオンを含有する緩衝液に比して、さらに大きくなっている。これは、Tmを低下させる作用は、Ｒ_１〜Ｒ_４残基の分子量が大きいほど増強されることによる。

従って、炭化水素残基の炭素数がｌであるアンモニウムカチオンを含有する緩衝液中における反応の適切な温度条件範囲D_ｌはD及びD_kに比べてさらに広くなる。

このように、ハイブリダイゼーション反応の温度条件の設定可能範囲を広くすることで、非特異的ハイブリダイズを効率的に抑制し、特異的ハイブリダイズのみを形成させる温度条件を容易に見出すことが可能になり、例えば、DNAチップにおいてはS/N比を向上させて高精度の多型解析が可能となる他、DNAミスマッチ検出法においてはミスマッチ鎖の解離を完全相補鎖の解離とより明確に区別して高感度に検出することが可能となる。さらに、PCR法における目的オリゴヌクレオチドの効率的な増幅も可能となる。

（式中、Ｒ１〜Ｒ４は水素原子であってよいが、Ｒ１〜Ｒ４の全てが水素原子であるものは除く）
で示されるアンモニウムカチオン存在下において、完全相補鎖及びミスマッチ鎖の２本鎖オリゴヌクレオチドのTmを測定し、図５に示した。

以下に、実験方法の概略を説明する。
・ オリゴヌクレオチド
塩基配列：5'- GTG GTA GGT GAT GTT GAT GTA CAC ATT GTC -3'で表わされる１本鎖オリゴヌクレオチド（W鎖：配列番号１参照）と、その完全相補鎖である塩基配列：GAC AAT GTG TAC ATC AAC ATC ACC TAC CACで表わされる１本鎖オリゴヌクレオチド（C鎖：配列番号２参照）を合成した。さらに、C鎖に対して１塩基の置換を行った塩基配列：GAC AAT GTA TAC ATC AAC ATC ACC TAC CACを有する１本鎖オリゴヌクレオチド（M１鎖：配列番号３参照）及び３塩基の置換を行った塩基配列：GAC AAT GTG TAC TTC AAC ATG TCC TAC CACで表わされる１本鎖オリゴヌクレオチド（M３鎖：配列番号４参照）、を合成した。W鎖とC鎖、W鎖とM１鎖、W鎖とM３鎖を等量にて混合（終濃度各０.５μM）し、インターカレーターを添加して、９５℃で５分間保持した。その後２０℃まで冷却してハイブイリダイズさせ、ミスマッチ数０（W鎖とC鎖）、ミスマッチ数１（W鎖とM１鎖）、ミスマッチ数３（W鎖とM３鎖）の2本鎖オリゴヌクレオチドを生成した。
・ Tmの測定
Tm測定は塩化ナトリウム、テトラメチルアンモニウム水（ＴＭＡＣ）、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡＣ）、テトラプロピルアンモニウム（ＴＰＡＣ）、各々の水溶液（20ｍM）中で行った。ＴＭＡＣはＲ_１〜Ｒ_４に炭素数１の炭化水素残基（メチル基）を有し、ＴＥＡＣは炭素数２の炭化水素残基（エチル基）、ＴＰＡＣは炭素数３の炭化水素残基（プロピル基）を有する。従って、これらの分子量の関係は、ＮａＣｌ＜ＴＭＡＣ＜ＴＥＡＣ＜ＴＰＡＣとなっている。ＮａＣｌ，ＴＭＡＣ，ＴＥＡＣ，ＴＰＡＣ緩衝液にミスマッチ数が０〜３である上記2本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを１００μMとなるように溶解し、得られた2本鎖オリゴヌクレオチド溶液を２５℃から９５℃まで加温して、2本鎖オリゴヌクレオチドが1本鎖オリゴヌクレオチドへ解離する際のインターカレーターの放出に伴う蛍光強度の低下を計測してTmを算出した。

図５を参照しながら、実験結果について以下に説明する。

ミスマッチ数０（W鎖とC鎖）、ミスマッチ数１（W鎖とM１鎖）、ミスマッチ数３（W鎖とM３鎖）の全ての2本鎖ヌクレオチドについて、各緩衝液中におけるＴｍは、ＮａＣｌ＞ＴＭＡＣ＞ＴＥＡＣ＞ＴＰＡＣの順で低下した。

これにより、ＴＭＡＣ，ＴＥＡＣ，ＴＰＡＣが２本鎖オリゴヌクレトチドのTmを低下させる作用を有すること、さらに、当該作用は分子量に依存して（Ｒ_１〜Ｒ_４に有する炭化水素残基の炭素数に依存して）大きくなることが明らかとなった。

さらに、ＴＭＡＣ，ＴＥＡＣ，ＴＰＡＣが２本鎖オリゴヌクレオチドのTmを低下させる作用は、当該２本鎖オリゴヌクレオチドに存するミスマッチ数が多いほど、より顕著になることが確認された。

本発明にかかるオリゴヌクレオチドの融解温度の制御方法は、ハイブリダイゼーション反応溶液中に、特定のアンモニウムカチオンを添加するのみで、非特異的ハイブリダイズを抑制し、効率的に特異的ハイブリダイズのみを形成させることを可能とするため、DNA多型解析法、DNAミスマッチ検出法、PCR法等において、従来の解析機器をそのまま利用してコストを抑えつつ、精度や感度、増幅効率を飛躍的に高めることが可能となる。

DNAの二重らせん構造におけるヌクレオチドの結合を表す模式図である。 テトラアルキルアンモニウムカチオンの存在下におけるヌクレオチドの結合を表す模式図である。 テトラエチルアンモニウムカチオンの存在下におけるヌクレオチドの結合を表す模式図である。 ハイブリダイゼーション反応の温度条件の設定可能範囲を示す図である。 オリゴヌクレオチドのTmの低下を示す図である。

Claims (6)

1. （式中、Ｒ_１〜Ｒ_４は水素原子であってよいが、Ｒ_１〜Ｒ_４の全てが水素原子であるものは除く）
   で示されるアンモニウムカチオンを用いて、ハイブリダイゼーション反応におけるオリゴヌクレオチドの融解温度を制御する方法。
2. 前記式中Ｒ_１〜Ｒ_４の残基の分子量を任意に変化させることにより、前記アンモニウムカチオンの前記オリゴヌクレオチドの融解温度を制御する機能を調節することを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 前記式中Ｒ_１〜Ｒ_４の少なくとも１つ以上が炭化水素残基であって、前記炭化水素残基の炭素数を任意に変化させることにより、前記アンモニウムカチオンの前記オリゴヌクレオチドの融解温度を制御する機能を調節することを特徴とする請求項１記載の方法。
4. 請求項１記載の方法を用いてオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応を行うことを特徴とするDNA多型解析法。
5. 請求項１記載の方法用いてオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応を行うことを特徴とするDNAミスマッチ検出法。
6. 請求項１記載の方法を用いてオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応を行うことを特徴とするPCR法。