JP2008101968A - 創薬スクリーニング装置及び創薬スクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 取得した試料の画像から測定対象の数を計数する際に、オペレータの差によるばらつきを無くし、再現性の高い創薬スクリーニング装置を提供する。
【解決手段】 ウェルプレート６０に載置された試料６に励起光１を照射し、試料６からの蛍光信号７に基づいて画像処理を行って創薬スクリーニングを行う装置であって、画像に存在する測定対象の数を計数する画像処理装置１１において、試料６ごとに測定対象の大きさの上下限閾値を予め記憶したメモリ１３を備え、画像処理装置１１は前記上下限閾値に基づいて測定対象の数を自動的に計数する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、蛍光顕微システムを利用した創薬スクリーニング装置において、取得した試料の画像から測定対象の数を計数する画像処理装置に関わる。

創薬スクリーニング装置ではウェルプレートにあるアレイ状のウェル（穴）に並べられた試料に特定の波長の光を照射して励起し、励起された試料から出る蛍光像を顕微鏡システムで拡大し、拡大像をカメラで取り込んでいる。その場合、全ウェルから蛍光画像を取得するため、ＸＹステージでウェルプレートを移動する。

次に、カメラで取得した画像に対して画像処理をし、その結果を元に薬の候補になる試料を見出している。画像の画質を高めるため、顕微鏡とカメラの間に共焦点スキャナが設置される。

このような共焦点スキャナを用いた創薬スクリーニング装置の先行技術としては下記のような特許文献が知られている。

特開２００２−０６２４８０号公報 特開２００５−０９５０１２号公報 特開２００５−０９８７２２号公報

図５は上記特許文献１に記載された従来の創薬スクリーニング装置の技術を示す構成図である。共焦点スキャナ１００は顕微鏡２００に接続されており、照明用平行励起光束１（一点鎖線）はマイクロレンズアレイディスク（ＭＬディスクという）２により個別の光束に集光される。

分光特性を持つ平板ミラーからなる第１のダイクロイックミラー（ＤＭという）３を透過後、ニポウディスク４の個々のピンホールを通過し、顕微鏡２００の対物レンズ５により、ウェルプレート６０に載置されたサンプル６の各試料に集光され蛍光試薬を励起する。ＭＬディスク２とニポウディスク４は連結部材８で機械的に連結された状態で、回転中心軸１２の周りを回転する。

サンプル６の各試料の蛍光試薬が発した蛍光信号７は再び対物レンズ５を通り、ニポウディスク４の個々のピンホール上に集光される。個々のピンホールを通過した蛍光信号７はＤＭ３で反射され、リレーレンズ９を介して、共焦点光学像がカメラ１０に結像される。

上述の構成では、ニポウディスク４のピンホールが並んでいる平面と、サンプル６上の被観察平面と、カメラ１０の受光面とは互いに光学的に共役な関係に配置してあるので、カメラ１０にはサンプル６の光学的断面像、すなわち共焦点画像が結像される。したがって、サンプル６の共焦点画像をカメラ１０の受光面上に形成することができるため、多数の被検査試料をマトリックス上に並べたサンプル６を顕微鏡２００と共焦点スキャナ１００に対して相対的に移動させることにより、試料全数の共焦点画像を高速に取り込むことができる。

ところで、上述の従来例においては、ニポウディスク４を出し入れすることにより、蛍光画像又は共焦点画像を選択している。創薬のアプリケーションにおいて、細胞核から細胞質への移行を解析するトランスロケーションや、カルシウムシグナルの測定は蛍光画像が適し、神経突起の伸長測定など高画質が必要な場合は共焦点画像が適している。これらのアプリケーションでは、様々な反応を画像処理によって数値化し、その際、反応の程度を細胞の数で規格化する。

従来の例では、細胞の数を計数する際、取得した画像に対して、その中にある独立した領域をラベリングし、面積を計算する。そして、面積について、オペレータ（あるいはユーザ）が上限閾値と下限閾値を設定して、下限閾値以下のものはノイズとみなして計数せず、上下限閾値の間のものは細胞が１個あるとみなして計数し、上限閾値以上のものは複数個の細胞が接触している状態とみなして計数する。

しかし、上記のようにして細胞の数を計算すると、画像処理の際、面積の閾値はオペレータが設定するため、オペレータによって、ばらつきが生じ、測定結果の再現性に影響を及ぼし、測定精度が低下してしまうという問題があった。

本発明は上記従来技術の課題を解決するためになされたもので、取得した試料の画像から測定対象の数を計数する際に、オペレータの差によるばらつきを無くし、再現性の高い創薬スクリーニング装置を実現することを目的としている。

このような課題を達成するために、本発明のうち請求項１記載の発明は、
ウェルプレートに載置された試料に励起光を照射し、前記試料からの蛍光信号に基づく画像に存在する測定対象の数を計数する創薬スクリーニング装置において、
前記測定対象の大きさの上下限閾値が予め記憶されたメモリ
を備えたことを特徴とする。

請求項２記載の発明は、
請求項１記載の創薬スクリーニング装置において、
前記上下限閾値の範囲内の独立領域の個数と、前記上限閾値より大きな独立領域の個数の２倍を加算することにより前記測定対象の個数を計数することを特徴とする。

請求項３記載の発明は、
請求項１記載の創薬スクリーニング装置において、
前記メモリは接触又は重なっている複数の前記測定対象の大きさの複合上限閾値が予め記憶され、前記上下限閾値と前記複合上限閾値とを組み合わせて前記測定対象の数を計数することを特徴とする。

請求項４記載の発明は、
請求項３記載の創薬スクリーニング装置において、
前記複合上限閾値は前記上限閾値の前記複数倍としたことを特徴とする。

請求項５記載の発明は、
請求項１乃至請求項４記載の創薬スクリーニング装置において、
ニポウ方式の共焦点スキャナを用いて、光軸方向に焦点位置を変化させ、各焦点位置において前記試料に前記励起光を照射することにより共焦点画像を取り出すことを特徴とする。

請求項６記載の発明は、
請求項１乃至請求項５記載の創薬スクリーニング装置において、
前記測定対象を細胞又は細胞核とすることを特徴とする。

請求項７記載の発明は、
ウェルプレートに載置された試料に励起光を照射し、前記試料からの蛍光信号に基づく画像に存在する測定対象の数を計数する創薬スクリーニング方法において、
前記測定対象の大きさの上下限閾値を予めメモリに記憶することを特徴とする。

請求項８記載の発明は、
請求項７記載の創薬スクリーニング方法において、
前記上下限閾値の範囲内の独立領域の個数と、前記上限閾値より大きな独立領域の個数の２倍を加算することにより前記測定対象の個数を計数することを特徴とする。

請求項９記載の発明は、
請求項７記載の創薬スクリーニング方法において、
前記メモリは接触又は重なっている複数の前記測定対象の大きさの複合上限閾値が予め記憶され、前記上下限閾値と前記複合上限閾値を組み合わせて前記測定対象の数を計数することを特徴とする。

請求項１０記載の発明は、
請求項９記載の創薬スクリーニング方法において、
前記複合上限閾値は前記上限閾値の前記複数倍としたことを特徴とする。

請求項１１記載の発明は、
請求項７乃至請求項１０記載の創薬スクリーニング方法において、
ニポウ方式の共焦点スキャナを用いて、光軸方向に焦点位置を変化させ、各焦点位置において前記試料に前記励起光を照射することにより共焦点画像を取り出すことを特徴とする。

請求項１２記載の発明は、
請求項７乃至請求項１１記載の創薬スクリーニング方法において、
前記測定対象を細胞又は細胞核とする。

請求項１３記載の発明は、
請求項１乃至請求項１２記載の創薬スクリーニング装置又は創薬スクリーニング方法において、
前記大きさは面積であることを特徴とする。

本発明の創薬スクリーニング装置によれば、予め使用する試料の大きさに関する情報をメモリに記憶し、試料の大きさに対して予め上下限閾値を設定して、実際に取得した画像にその値を適用することによって、オペレータの差によるばらつきを無くし、測定対象の数を再現性良くカウントすることができる創薬スクリーニング装置を実現することができる。

以下、図１を参照して、本発明による創薬スクリーニング装置の一実施形態について説明する。

図１において図５に示す従来例と同一要素には同一符号を付して重複する説明は省略する。従来例と異なる点は、予め使用する試料の大きさに関する情報をデータベース化してメモリに記憶し、試料の大きさに対して予め上下限閾値を設定し、実際に取得した画像に自動的に適用するようにした点にある。

図１に示すように、ウェルプレート６０にあるアレイ状のウェル（穴）の１つにある試料６に対して、レーザ光源（図示なし）から出る励起光束１を用いて照射する。照射された試料６から蛍光信号７を発し、顕微鏡２００によって集光され、蛍光像が得られる。ＳＮ比の高い画像を得るのに共焦点スキャナ１００を用いる。共焦点スキャナ１００を通った単色又は多色の蛍光画像はカメラ１０に撮像され、画像処理装置１１で画像処理が行われる。画像処理装置１１において、メモリ１３には予め試料の大きさに関する情報がデータベース化されて記憶される。メモリ１３から読み出すことにより画像処理装置１１に予め試料の大きさの上下限閾値が設定される。

以下に画像処理装置１１における動作を説明する。
図２にカメラ１０で取得した画像の概念図を示す。このような画像２０をもとに、例えば細胞核（以下、核という）の数を計数する場合、画像の中の独立した領域、すなわち細胞２１，核２２，ノイズ２３，重なった細胞核２４などをまず検出し、ラベリングする。ラベリングされた独立領域のうち、測定対象（核）について、大きさ別に独立領域の数を計数して、大きさの度数分布を求める。大きさの度数分布図の一例を図３に示す。このために、画像処理装置１１には、予め、メモリ１３内のデータベースに基づき、測定対象（核）の大きさに応じて下限閾値と上限閾値が設定される。一例として、試料として広く使用されているヒト由来のＨｅ−Ｌａ細胞では、核の大きさは約５〜１０μｍである。

核の数は上下限閾値を用いて以下のように求められる。
（１）図３の下限閾値以下の範囲では、核の数は０とする。（例：図２のノイズ２３）
（２）図３の下限閾値〜上限閾値の範囲では、核の数は大きさ別度数の合計とする。（例：図２の核２２）
（３）図３の上限以上の範囲では、核の数は大きさ別度数の合計の２倍とする。（例：図２の重なり細胞核２４）
以上の結果、核の数は上記（２）と（３）の合計となる。

図４に画像処理装置１１が核の数を自動的に計数するフローチャートを示す。
以下、図４に基づいて、画像処理装置１１の詳細な動作を説明する。試料がセットされると細胞核の数ｍ（以下計数値という）を初期値０にする（ステップ３０１）。次にメモリ１３のデータベース内から上記試料に対応するデータを取り出し、核についての上下限閾値Ｓmax，Ｓminを設定する（ステップ３０２）。カメラで画像を取得し（ステップ３０３）、独立領域１〜Ｎのラベリングを行う（ステップ３０４）。次に独立領域１〜Ｎについて、それぞれの面積Ｓn（ｎ＝１〜Ｎ）を計算する（ステップ３０５）。ｎ＝１と置いて領域１を選択し（ステップ３０６）、ｎを独立領域の数Ｎと比較し（ステップ３０７）、ｎが独立領域の数Ｎより大きければ終了する（ステップ３１３）。ｎが独立領域の数Ｎより大きくない場合は、独立領域１の面積Ｓ1を下限閾値Ｓminと比較し（ステップ３０８）、独立領域１の面積Ｓ1が下限閾値Ｓminより小さい場合はノイズとみなして計数値ｍに加算せず、ｎ＝ｎ＋１＝２として（ステップ３１２）次の領域２の計数に移る。独立領域１の面積Ｓ1が下限閾値Ｓminより小さくない場合は、独立領域１の面積Ｓ1を上限閾値Ｓmaxと比較（ステップ３０９）する。独立領域１の面積Ｓ1が上限閾値Ｓmaxより大きい場合は ｍ＝ｍ＋２＝０＋２＝２とし（ステップ３１０）、独立領域の面積Ｓ1が上限閾値Ｓmaxより大きくない場合（ステップ３０９）はｍ＝ｍ＋１＝０＋１＝１とする（ステップ３１１）。その後ｎ＝ｎ＋１＝２として（ステップ３１２）独立領域２の計数に移り、領域２〜Ｎについて３０７以下のステップを繰り返し、最終的な核の計数値ｍを得る。

上記のような創薬スクリーニング装置によれば、予め使用する試料の面積に関する情報をデータベース化してメモリに記憶し、試料の面積に対して予め上下限閾値を設定して、実際に取得した画像にその値を適用することによって、オペレータの差によるばらつきを無くし、測定対象の数を再現性良くカウントすることができる創薬スクリーニング装置を実現することができる。

また試料に対応した上下限閾値を自動的に設定できるので効率的に測定対象の数を計数することができる。

なお、上記の実施例では試料の大きさとして面積を用いたが、これに限らず、例えば直径や周囲長を用いてもよい。

また、計数の対象とする画像は共焦点画像に限らず、ニポウディスク４を省略したときの蛍光画像について計数してもよい。

また、図３の上限閾値より大きい核領域において、核が複数接触又は重なっている場合について、上限閾値の複数倍の大きさの複合上限閾値を設け、以下のように、核をよりきめ細かく計数してもよい。
上限閾値から上限閾値の２倍までの領域では、核の数を実測数（度数）の２倍とする。
上限閾値の２倍から３倍までの領域では、核の数を実測数（度数）の３倍とする。
・・・・・・
上限閾値のｎ倍からｎ＋１倍までの領域では、核の数を実測値（度数）のｎ＋１倍とする。
また、上記の実施例では核の数を計数する場合を示したが、細胞その他を計数してもよい。

また、本発明は、上記実施例や変形例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形を含むものである。

本発明の創薬スクリーニング装置の一実施例を示す構成ブロック図である。 本発明の創薬スクリーニング装置のカメラ１０で取得した画像の概念図である。 測定対象の大きさの度数分布図である 本発明の創薬スクリーニング装置で核の数を計数するフローチャートである 従来の創薬スクリーニング装置の構成を示すブロック図である。

符号の説明

１ 励起光束
２ マイクロレンズアレイディスク
３ ダイクロイックミラー
４ ピンホールアレイディスク
５ 対物レンズ
６ 試料
７ 蛍光信号
８ 連結部材
９ リレーレンズ
１０ カメラ
１２ 回転中心軸
１３ メモリ
６０ ウェルプレート
１００ 共焦点スキャナ
２００ 顕微鏡

Claims (13)

1. ウェルプレートに載置された試料に励起光を照射し、前記試料からの蛍光信号に基づく画像に存在する測定対象の数を計数する創薬スクリーニング装置において、
   前記測定対象の大きさの上下限閾値が予め記憶されたメモリ
   を備えたことを特徴とする創薬スクリーニング装置。
2. 前記上下限閾値の範囲内の独立領域の個数と、前記上限閾値より大きな独立領域の個数の２倍を加算することにより前記測定対象の個数を計数することを特徴とする請求項１記載の創薬スクリーニング装置。
3. 前記メモリは接触又は重なっている複数の前記測定対象の大きさの複合上限閾値が予め記憶され、前記上下限閾値と前記複合上限閾値とを組み合わせて前記測定対象の数を計数することを特徴とする請求項１記載の創薬スクリーニング装置。
4. 前記複合上限閾値は前記上限閾値の前記複数倍としたことを特徴とする請求項３記載の創薬スクリーニング装置。
5. ニポウ方式の共焦点スキャナを用いて、光軸方向に焦点位置を変化させ、各焦点位置において前記試料に前記励起光を照射することにより共焦点画像を取り出すことを特徴とする請求項１乃至請求項４記載の創薬スクリーニング装置。
6. 前記測定対象を細胞又は細胞核とすることを特徴とする請求項１乃至請求項５記載の創薬スクリーニング装置。
7. ウェルプレートに載置された試料に励起光を照射し、前記試料からの蛍光信号に基づく画像に存在する測定対象の数を計数する創薬スクリーニング方法において、
   前記測定対象の大きさの上下限閾値を予めメモリに記憶することを特徴とする創薬スクリーニング方法。
8. 前記上下限閾値の範囲内の独立領域の個数と、前記上限閾値より大きな独立領域の個数の２倍を加算することにより前記測定対象の個数を計数することを特徴とする請求項７記載の創薬スクリーニング方法。
9. 前記メモリは接触又は重なっている複数の前記測定対象の大きさの複合上限閾値が予め記憶され、前記上下限閾値と前記複合上限閾値を組み合わせて前記測定対象の数を計数することを特徴とする請求項７記載の創薬スクリーニング方法。
10. 前記複合上限閾値は前記上限閾値の前記複数倍としたことを特徴とする請求項９記載の創薬スクリーニング方法。
11. ニポウ方式の共焦点スキャナを用いて、光軸方向に焦点位置を変化させ、各焦点位置において前記試料に前記励起光を照射することにより共焦点画像を取り出すことを特徴とする請求項７乃至請求項１０記載の創薬スクリーニング方法。
12. 前記測定対象を細胞又は細胞核とする請求項７乃至請求項１１記載の創薬スクリーニング方法。
13. 前記大きさは面積であることを特徴とする請求項１乃至請求項１２記載の創薬スクリーニング装置又は創薬スクリーニング方法。

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