JP2008195625A

JP2008195625A - Ｇ蛋白質共役型レセプター抑制剤および医薬

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Publication number: JP2008195625A
Application number: JP2007029766A
Authority: JP
Inventors: Gozo Tsujimoto; 豪三辻本; Akira Hirasawa; 明平澤; Yoshiyuki Takahara; 義之高原
Original assignee: PHARMA FRONTIER KK
Current assignee: PHARMA FRONTIER KK
Priority date: 2007-02-08
Filing date: 2007-02-08
Publication date: 2008-08-28

Abstract

【課題】Ｇ蛋白質共役型レセプターの活性化を抑制する物質および医薬を提供する。
【解決手段】ロジグリタゾン，トログリタゾン，シグリタゾン等のチアゾリジン系化合物の添加によって、ＧＰＲ１２０保有細胞内で誘導される細胞内Ｃａ^２＋濃度上昇は、大きく抑制されており、ＧＰＲ１２０保有細胞の活性化が抑制（阻害）されている。この作用を利用して、チアゾリジン系化合物から選ばれた化合物を有効成分として含有するＧ蛋白質共役型レセプター抑制剤を提供することができる。同様に、Ｇ蛋白質共役型レセプター抑制剤を有効成分として含有する医薬を提供することもできる。
【選択図】図６

Description

本発明は、Ｇ蛋白質共役型レセプター抑制剤，および消化器治療薬，精神障害治療薬，低血糖症，肺疾患等の医薬に関する。

ホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプター蛋白質を通じて、その機能を果たしうる。レセプター蛋白質は、一般的には、共役しているグァニジン三リン酸（ＧＴＰ）結合蛋白質（GTP-bindig Protein）（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）の活性化を通じて、細胞内のシグナル伝達を行うことから、Ｇ蛋白質共役型レセプター（蛋白質）と総称される。また、Ｇ蛋白質レセプターは、７個の膜質貫通領域を有する構造から、７回膜質貫通型レセプター蛋白質とも総称される。

上記Ｇ蛋白質共役型レセプターとして、例えば、腸管、肺、脳、脂肪細胞、下垂体などに存在するＧＰＲ１２０が知られている。Ｇ蛋白質共役型レセプターなどの細胞内生理活性物質の活性化を促進するものはアゴニスト、阻害するものはアンタゴニストと呼ばれている。たとえば、特許文献１，非特許文献１には、ＧＰＲ１２０を保有する細胞に、ＧＰＲ１２０を作動させるリガンドを作用させると、細胞内のＣａ^２＋が上昇し、ＧＰＲ１２０を有する腸管ホルモン分泌細胞からのコレシストキニン（ＣＣＫ）やＧＬＰ−１（グルカゴン様ポリペプチド−１）のようなペプチドホルモンが放出されることが開示されている。

そこで、アゴニストやアンタゴニストとなるリガンドを、各種疾患などに対する治療薬として利用することが提案されている。例えば、特許文献１には、ＣＣＫの放出を促進させる物質の投与により、摂食障害およびそれに伴う疾患等の症状を改善できることが記載されている。非特許文献１には、細胞内Ｃａ^２＋濃度を上昇させる物質の投与により、ＧＬＰ−１やインシュリンの分泌量を高め、糖尿病を治療できることが記載されている。また、特許文献１には、ＧＰＲ１２０保有細胞からＣＣＫの放出を促進させる物質を、消化活動の協調的促進剤、消化活動障害の治療薬として用いることが提案されている。また、非特許文献３には、このようなリガンドを、食欲抑制による肥満予防治療薬、過食症の治療薬として用いることが開示されている、非特許文献４には、このようなリガンドを、膵臓β細胞の分化増殖促進による糖尿病予防治療薬。特にβ細胞あるいはその前駆細胞移植治療時の治療効果促進剤として用いることが提案されている。非特許文献５には、このようなリガンドを、神経細胞可塑性、生存維持作用による神経移植、神経接合時の治療促進剤あるいはアルツハイマー症等、神経細胞障害が原因の疾患治療薬として用いることが提案されている。非特許文献６には、このようなリガンドを、腸管運動の正常化作用による腸炎時の腸管運動異常の治療薬として用いることが開示されている。非特許文献７には、このようなリガンドを、ＣＣＫ濃度低下によるモルヒネ等鎮痛剤の効果促進や不安やストレスによる障害の治療薬として利用することが記開示されている。非特許文献８には、このようなリガンドを、肺におけるサーファクタント分泌促進によるＣＯＰＤ(慢性閉塞性肺疾患)などの肺疾患治療薬として用いることが開示されている。

さらに、特許文献２には、脂肪細胞および下垂体は、ＧＰＲ１２０を保有し、それぞれ脂肪分解抑制作用およびＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）分泌抑制作用を有することが示されている。しかるに、ＧＰＲ１２０アンタゴニストは、脂肪細胞での脂肪蓄積抑制による肥満症治療薬またはＡＣＴＨ分泌障害や下垂体機能障害の治療薬となりうる。
特開２００５−１５３５８号公報ＷＯ２００４／０６５９６０Ａ１ Nature Medicine、11(1),90-94,2005 Nutrition 2001; 17(3):230-5 Physiol Behav. 2004;83(4): 617-21 Diobetology, 2005;48(9):1700-13 Curr Drug Target CNS Neurol Disord 2002 Drug 2003;63(12):1785-97 Neurosci Biobehav Rev.2005:29(8):1361-73 Endocrinology. 1998;139(5):2363-8

しかしながら、Ｇ蛋白質共役型レセプターを抑制する物質、すなわち、アンタゴニストについては、その弊害が指摘されているものの、これを積極的に利用することについては、ほとんど考えられていないのが現状である。

そこで、本発明者達がその利用法について、研究を進めた結果、従来、治療薬としての利用法が未確立であったアンタゴニストの利用についての知見を得た。

本発明の目的は、Ｇ蛋白質共役型レセプターを抑制する物質を有益に活用する手法を確立することにある。

本発明のＧ蛋白質共役型レセプター抑制剤は、チアゾリジン系化合物を有効成分として含有するＧ蛋白質共役型レセプター（特に、ＧＰＲ１２０）のアンタゴニストである。ここで、ＧＰＲ１２０とは、Ｇ蛋白質共役型レセプター（以下、ＧＰＣＲと略する場合もある）の１つであって、配列表１〜３で表されるポリペプチドである。

これにより、従来、生活習慣病の弊害のみが取り上げられていたＧ蛋白質共役型レセプターのアンタゴニストを種々の目的に利用することが可能になる。すなわち、チアゾリジン系化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプターの作用を緩和させるために利用することなどが可能になる。また、チアゾリジン系化合物を、各種実験を行う際に必要とする生理的状態を細胞や生物に生ぜしめるための投与剤として利用することが可能になる。

本発明のチアゾリジン化合物は、下記一般式（１）

（式中、Ｒ１は置換されてもよい低級アルキル基を示す）で表される化合物である。

Ｒ１で示される置換されていても良い低級アルキル基の低級アルキル基としては、直鎖又は分岐鎖のＣ１〜６のアルキル基が挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基等である。

Ｒ１における低級アルキル基上の置換基としては、置換されていても良いピリジル基、置換されていても良いアミノ基、置換されていても良いシクロアルキル基、置換されていても良いクロマニル基などが挙げられる。

置換されたピリジル基のピリジル基上の置換基としては、Ｃ１〜３のアルキル基、Ｃ１〜３のアルコキシ基、水酸基等が挙げられる。

置換されたアミノ基のアミノ基上の置換基としては、Ｃ１〜３のアルキル基、ピリジル基等が挙げられる。

置換されたシクロアルキル基のシクロアルキル基上の置換基としては、Ｃ１〜３のアルキル基等が挙げられる。

置換されたクロマニル基上の置換基としては、Ｃ１〜３のアルキル基、水酸基等が挙げられる。

好ましいＲ１としては、下記式（２），（３），（４），（５）によって表される基である。

即ち、好ましいチアゾリジン系化合物としては、図２に示す、ロジグリタゾン(rosiglitazone)、トログリタゾン(troglitazone)、シグリタゾン(ciglitazone)、ピオグリタゾン(pioglitazone)等が挙げられる。

従来、ロジグリタゾン(rosiglitazone)、トログリタゾン（troglitazone）等のチアゾリジン系化合物は、脂肪細胞の核内受容体型転写因子であるペルオキシゾーム増殖促進受容体ガンマ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma：ＰＰＡＲγ）に結合し、種々の分子の転写を促進することが知られている。これより脂肪細胞の分化を促進し、結果的にインスリン抵抗性の改善、ひいては糖尿病の治療に用いられてきた。

しかしながら、本研究によりチアゾリジン系化合物の一部がＧＰＲ１２０等のＧ蛋白質共役型レセプターの機能を遮断（抑制）させることが明らかとなった。具体的には、チアゾリジン系化合物が腸管ホルモン分泌細胞等に働いて、コレシストキニン（ＣＣＫ）のようなペプチドホルモンおよびケモカインなどメディエーターの放出を抑制し、これらメディエーターの惹起する疾患を抑制するという新しいメカニズムに基づくものである。つまり、チアゾリジン系化合物は、従来の糖尿病治療等のメカニズムとまったく異なる、新規なメカニズムに基づき、従来知られていなかった薬効を発揮するのである。

本発明の医薬は、上記Ｇ蛋白質共役型レセプター抑制剤を有効成分として含有しており、これにより、各種疾患の治療が可能になる。たとえば、ＧＰＲ１２０を有する細胞が存在する腸管、肺、脳などにおけるＧ蛋白質共役型レセプターの作動（活性化状態）に連動して生じる細胞内Ｃａ^２＋濃度上昇の抑制作用を利用して、消化器疾患治療薬，精神障害治療薬，低血糖症、および肺疾患治療薬として用いることができる。

また、ＣＣＫやＧＬＰ−１などの生理活性物質の分泌を促進させるリガンドを利用した各種疾患の治療において、本発明の医薬を併用することにより、生理活性物質濃度の過上昇を抑制することができるので、各種器官の各種細胞中の生理活性物質を適正な濃度に調整することが可能になる。

本発明の対象疾患と効能は血中または対象臓器内のＣＣＫ濃度の抑制、および血中又は対象臓器内のケモカイン等起炎メディエーターの抑制に基づいている。

ＣＣＫの濃度減少にともなう治療対象疾患として、例えば、
１）ＣＣＫは膵炎を促進するので、ＣＣＫ濃度を低下させることによる膵炎の治療
２）ＣＣＫは中枢で不安、ストレスによる行動障害を起こすので、ＣＣＫ濃度を低下させることによる行動障害の治療
３）ＣＣＫ濃度を低下させて、胃酸分泌を抑制することによる胃酸過多の治療
４）モルヒネ等の鎮痛剤に拮抗するためＣＣＫ濃度を低下させることによる鎮痛剤の効果の増強
５）ＣＣＫ濃度を低下させることによる感染性下痢など下痢の治療
などが対象となる。この記載に限定されるものでなく、ＣＣＫの濃度亢進また低下にともなう治療全体が対象となる。

一方、ＧＰＲ１２０などのＧ蛋白質共役型レセプターを介するケモカインなどの起炎性メディエーター放出抑制にともなう治療対象疾患として、例えば、腸炎例えば炎症性大腸炎（ＩＢＤ），過敏性腸症候群（ＩＢＳ）などあるいは神経障害例えば変性性神経疾患や免疫性神経疾患などあるいは肺疾患例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などがある。この記載に限定されるものでなく、ＧＰＲ１２０等のＧ蛋白質共役型レセプターを介するケモカイン放出にともなう疾患の治療全体が対象となる。

チアゾリジン系化合物が直接標的臓器に作用する場合と、ＧＰＲ１２０等のＧ蛋白質共役型レセプターを介するＣＣＫなどのペプチドホルモンやケモカインなどの起炎性メディエーター放出を抑制する場合とは、当然薬効は異なる。特に従来の直接作用と異なる薬効について記載すると、適用拡大は、次の通りとなる。

１）膵炎治療剤
２）精神安定剤
３）胃酸過多治療剤
４）モルヒネ等の鎮痛補助剤
５）下痢抑制剤
６）腸炎治療剤
７）肺疾患治療剤
などである。

本発明の蛋白質共役型レセプター抑制剤またはこれを有効成分として含有する医薬により、ＧＰＲ１２０等のＧ蛋白質共役型レセプターのアンタゴニストを種々の用途に有効利用することが可能になった。

以下、本発明の実施の形態においては、特に、ＧＰＲ１２０等に対するアンタゴニストとして機能させることを中心として、チアゾリジン系化合物を有効成分として含有するＧＰＣＲ抑制剤、およびＧＰＣＲ抑制剤を有効成分として含有する医薬について説明する。

ＧＰＲ１２０等は、腸管、肺、脳、脂肪細胞、下垂体などに存在し、チアゾリジン系化合物によってＧＰＲ１２０等を遮断させると、後述する実施例に開示するように、細胞内Ｃａ^２＋濃度上昇を抑制する作用があることが認められた。そして、Ｃａ^２＋濃度上昇が抑制されることにより、たとえば、ＧＰＲ１２０を有する腸管ホルモン分泌細胞からのコレシストキニン（ＣＣＫ）やＧＬＰ−１のようなペプチドホルモンの放出が抑制され、例えば下痢などを抑制する効果が得られる。また、ストレス負荷時には、食物からの脂肪酸やその誘導体に対する過敏な反応を呈し、疾患の進行に関与することから、ＧＰＲ１２０作動を抑制するチアゾリジン系化合物、特に、ロジグリタゾンやトログリタゾンがストレス負荷により発症または症状増悪する腸炎、例えばＩＢＳ（過敏性腸炎），ＩＢＤ（潰瘍性腸炎）の治療剤として望ましい。したがって、チアゾリジン系化合物を、ＧＰＲ１２０等の抑制剤として用いることにより、疾患の治療や体質改善のための利用が可能となる。

ＧＰＲ１２０等のＧ蛋白質共役型レセプターの抑制剤は、静脈内、経口への投与を含む、治療上適切な投与経路に適合するように製剤化される。具体的には、以下のような態様で、投与が可能となる。

注射に適する製剤とするには、滅菌された注射可能な溶液又は分散媒であって、使用時に調製するための滅菌水溶液（水溶性の）又は分散媒及び滅菌されたパウダー（凍結乾燥された蛋白質、核酸などを含む）が含まれる。静脈内の投与に関し、適切な担体には生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。注射剤として使用する場合、ＧＰＣＲ作動剤は滅菌されており、また、シリンジを用いて投与されるために十分な流動性を保持していなくてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び適切な混合物を含む溶媒又は分散媒培地を使用することができる。例えば、レクチンなどのコーティング剤を用い、分散媒においては必要とされる粒子サイズを維持し、界面活性剤を用いることにより適度な流動性が維持される。種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールなどは、微生物のコンタミネーションを防ぐために使用可能である。また、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムのような等張性を保つ薬剤が組成物中に含まれてもよい。吸着を遅らせることができる組成物には、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤が含まれる。

滅菌的な注射可能溶液は、必要な成分を単独で又は他の成分と組み合わせた後に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を加え、滅菌することで調製される。一般に、分散媒は、基本的な分散培地及び上述したその他の必要成分を含む滅菌的媒体中に活性化合物を取り込むことにより調製される。滅菌的な注射可能な溶液の調製のための滅菌的なパウダーの調製方法には、活性な成分及び滅菌溶液に由来する何れかの所望な成分を含むパウダーを調製する真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。

経口用の製剤とする場合には、不活性な希釈剤又は体内に取り込んでも害を及ぼさない担体が含まれる。経口用製剤は、例えば、ゼラチンのカプセル剤に包含されるか、加圧されて錠剤化される。経口的治療のためには、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ又はカプセル剤の形態で使用される。また、経口用製剤は、流動性担体を用いて調製することも可能である。さらに、薬剤的に適合する結合剤、及び／又はアジュバント物質などが包含されてもよい。

錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ剤及びその類似物は、以下の成分又は類似の性質を持つ化合物の何れかを含み得る。微結晶性セルロースのような賦形剤、アラビアゴム、トラガント又はゼラチンなどの結合剤；スターチ又はラクトース、アルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬ、又はコーンスターチなどの膨化剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳＴＲＲＯＴＥＳなどの潤滑剤；コロイド性シリコン二酸化物などの滑剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、メチルサリシル酸又はオレンジフレイバーなどの香料添加剤などである。

全身投与用の製剤とする場合には、経粘膜的又は経皮的に行うことができる。経粘膜的又は経皮的投与について、標的のバリアーを透過することができる浸透剤が選択される。経粘膜浸透剤は界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経鼻スプレー又は坐薬は経粘膜的な投与に対して使用することができる。経粘膜的投与に対して、活性化合物はオイントメント、軟膏、ジェル又はクリーム中に製剤化される。

また、本発明のチアゾリジン系化合物を有効成分として含有する医薬は、直腸への送達に対して、坐薬（例えば、ココアバター及び他のグリセリドなどの基剤と共に）又は滞留性の浣腸の形態で調製することもできる。

本発明のチアゾリジン系化合物を有効成分として含有する医薬を、制御放出製剤とする場合には、体内から即時に除去されことを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。例えば、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、ＡＬＺＡＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）及びＮＯＶＡＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（ＬａｋｅＥｌｓｉｎｏｒｅ，ＣＡ）から入手することが可能で、また、当業者によって容易に調製することもできる。また、リポソームの懸濁液も薬学的に受容可能な坦体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。例えば、抗体のＦａｂ’断片などは、ジスルフィド交換反応を介して、リポソームに結合させてもよい（Ｍａｒｔｉｎ及びＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，１９８２）。詳細な調製方法は、例えば、文献（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ等，１９８５；Ｈｗａｎｇ等，１９８０）中の記載を参照することができる。

本発明のＧＰＣＲ抑制剤を有効成分として含有する医薬の投与量は、特定の疾患の治療又は予防において、投与される患者（人）又は動物の状態、投与方法等に依存するが、当業者であれば容易に最適化することが可能である。

例えば、注射投与の場合は、例えば、一日に患者の体重あたり約０．１μｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、一般に一回又は複数回に分けて投与され得るであろう。好ましくは、投与量レベルは、一日に約０．１μｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは一日に約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇである。

経口投与の場合は、好ましくは１．０から１０００ｍｇの活性成分を含む錠剤の形態で提供される。好ましくは治療されるべき患者（人）又は動物に対する有効活性成分の投与量は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇである。化合物は一日に１〜４回の投与計画で、好ましくは一日に一回又は二回投与される。

本発明のＧＰＣＲの抑制剤作動剤により、細胞内Ｃａ^２＋濃度の濃度抑制によるＣＣＫやＧＬＰ−１などの放出抑制作用などを通じて、たとえば、下記のような疾患の治療が可能になる。
１．ＣＣＫは膵炎を促進するために、ＣＣＫ濃度を低下させることにより、膵炎治療が可能になる。
２．ＣＣＫは胃酸の分泌を促進するので、ＣＣＫ濃度の抑制により、胃酸過多の治療が可能になる。
３．ＣＣＫは中枢で不安、ストレスによる行動障害を起こすために、ＣＣＫ濃度の抑制により、行動障害の治療や精神安定剤としての利用が可能になる。
４．ＣＣＫはモルヒネ等の鎮痛剤に拮抗するので、ＣＣＫ濃度を低下させることにより、鎮痛剤の効果増強が可能である。
５．ＣＣＫ濃度の抑止により、感染性下痢など下痢の治療が可能になる。
６．ＧＬＰ−１濃度の抑制により、低血糖症の治療が可能になる。
ただし、上記疾患に限定されるものでなく、ＣＣＫやＧＬＰ−１の濃度の低下を利用した各種疾患の治療や、Ｃａ^２＋濃度の抑制により、ＣＣＫやＧＬＰ−１以外の各種生理活性物質の分泌が抑制される作用を利用して、種々の疾患の治療が可能である。

（実施例１）
本実施例では、Ｇ蛋白質共役型レセプターとしてhumanＧＰＲ４０（ＷＯ２００４／０６５９６０号参照）およびhumanＧＰＲ１２０（配列表１参照）のＮ末端にＦＬＡＧタグのついたコンストラクトをそれぞれ作成し、薬剤誘導できる発現ベクターに組み込んで、ＧＰＲ４０保有細胞およびＧＰＲ１２０保有細胞の安定発現細胞を作成した。そして、この細胞に所定の処置を施すことにより、受容体を発現させて、Ｃａ^２＋濃度を測定した。humanＧＰＲ１２０に代えて、配列表２に示すmouseＧＰＲ１２０を用いてもよい。

１．細胞内Ｃａ^２＋濃度の測定
（１）本実験には、ＧＰＲ４０保有細胞株およびＧＰＲ１２０保有細胞株を用いた。
（２）それぞれの細胞を、表面がコラーゲン処理された細胞培養用96 well1クリアボトムプレートに細胞密度が 2×10^５個/ well / 50μlになるように播種して細胞プレートを調製した。
（３）播種時の溶液には10μg/ml濃度 Doxycyclinを含むFBS(-)Mediumを用いた。この溶液で２１時間培養することによってDoxycyclin処理とStarvationを同時に進行させた。

２．Ｃａ^２＋イオン感受性蛍光色素の細胞内への負荷
（１）カルシウム感受性蛍光色素を細胞内へ負荷するために、Molecular Devices社のCalcium Assay Kit試薬を用いた。
（２）この試薬をkitマニュアルに記載の２倍濃度でＦＬＩＰＲ buffer (Hanks' Balanced Salt Solutionに 20mM HEPESを加えてpH 7.4に調製した溶液)に溶解した。
（３）調製したCalcium Assay Kit試薬溶液を50μl / wellずつ、播種後２１時間後の細胞プレートに添加した。細胞播種時に50μl / wellの培地を用いているため、この操作によりCalcium Assay Kit試薬のwell中での濃度はマニュアルに記載された所定の濃度となった。
（４）Calcium Assay Kit試薬溶液を添加した細胞を１時間室温で暗所に静置することにより、kit試薬中に含まれるカルシウムイオン感受性蛍光色素を細胞内へ負荷した。

３．リガンド調製
（１）被検化合物には、図２に示される、ロジグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ），トログリタゾン（Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ），シグリタゾン（Ｃｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）などのチアゾリジン系化合物を準備した。
以上の化合物をＤＭＳＯに溶解し、上記ＦＬＩＰＲ bufferで希釈して各化合物濃度が1.5x10-4M、ＤＭＳＯ濃度が1.5%となるように調製した。

（２）ネガティブコントロールとして、上記と同濃度のＤＭＳＯを用い、ポジティブコントロールとしてＧＰＲ４０およびＧＰＲ１２０の既知のリガンドであるα−ＬＡを用いて、それぞれ上記被検化合物と同様に調製した。

（３）細胞内Ｃａ^２＋濃度上昇の測定
無処置（induction-）および発現誘導処置した（induction+）ＧＰＲ４０保有細胞およびＧＰＲ１２０保有細胞に対し、０．３％ＤＭＳＯおよび３×１０^−８〜１×１０^−４Ｍ（０．３％ＤＭＳＯ）の各種化合物を添加し、細胞内Ｃａ^２＋濃度をＦＬＩＰＲ（Molecular Devices社製）で測定した。ピーク値を検出し、１×１０^−４Ｍ α−ＬＡ（シス型）添加時のピーク値によって標準化（規格化）した。

図１（ａ），（ｂ）は、順に、無処置（induction-）および発現誘導処置した（induction+）ＧＰＲ４０保有細胞，ＧＰＲ１２０保有細胞における，α−ＬＡ（シス型α−リノレン酸）の刺激によるＣａ^２＋濃度の上昇量を示すデータである。図１（ａ），（ｂ）の横軸は、α−ＬＡの添加濃度を示し、縦軸はＣａ^２＋濃度の上昇量を示している。いずれの細胞においても、発現誘導処置（induction+）により細胞内Ｃａ^２＋濃度の上昇が確認されており、発現誘導処置（induction+）が適正に行われていることが確認された。

すでに説明したように、細胞内Ｃａ^２＋濃度は、細胞からの生理活性物質であるホルモンの分泌量に対応しており、細胞の生理的活性状態を表す指標であることは確認されている。したがって、以下に説明する図３〜図６のデータから、各細胞の活性化について、以下の注目すべき事実が確認された。

−ＧＰＲ４０保有細胞に対して−
図３は、ロジグリタゾン，トログリタゾンおよびシグリタゾンなどのチアゾリジン系化合物をＧＰＲ４０保有細胞に添加したときのＣａ^２＋濃度の上昇量データを示すグラフである。図３から以下のことがわかる。

トログリタゾンおよびシグリタゾンの添加により、いずれも細胞内Ｃａ^２＋濃度はほとんど上昇しないので、トログリタゾンおよびシグリタゾンは、ＧＰＲ４０に対するアゴニストとしての機能をほとんど有していないと推定される。

一方、ロジグリタゾンの添加により、細胞内Ｃａ^２＋濃度は大きく上昇しており、ロジグリタゾンは、ＧＰＲ４０のアゴニストとしての機能を有していると推定される。

−ＧＰＲ１２０保有細胞に対して−
図５は、ロジグリタゾン，トログリタゾンおよびシグリタゾンなどのチアゾリジン系化合物をＧＰＲ１２０保有細胞に添加したときのＣａ^２＋濃度の上昇量データを示すグラフである。図５から以下のことがわかる。

ロジグリタゾン，トログリタゾンおよびシグリタゾンの添加によっては、細胞内Ｃａ^２＋濃度の上昇はほとんど見られない。したがって、ロジグリタゾン，トログリタゾンおよびシグリタゾンは、ＧＰＲ４０に対するアゴニストとしての機能を有していないと推定される。

なお、本実施例において、細胞内Ｃａ^２＋濃度の上昇により、ＧＰＲ４０保有細胞の分泌する生理活性物質であるインシュリンや、ＧＰＲ１２０保有細胞の分泌する生理活性物質であるＧＬＰ−１の分泌量が増大したことも確認されている。

（４）細胞の活性化抑制効果の確認
被検化合物の活性化抑制効果（アンタゴニスト活性）は、アゴニスト活性評価の際と同濃度の被検化合物で細胞を１０分間前処理した後に、つまり、ＧＰＲ４０またはＧＰＲ１２０を発現させて、細胞を活性化させる処理を行なった後に、活性化状態にある細胞を、同濃度のα−ＬＡで刺激した際の細胞内Ｃａ^２＋濃度の上昇がどの程度阻害されるかによって評価した。具体的には、まず前処理用プレート中の被検化合物を、マルチピペットを用いて色素負荷後の細胞プレート各wellへ添加し、その後細胞プレートとα−ＬＡ（シス型）を分注した化合物プレートをＦＬＩＰＲへセットして、α−ＬＡ（シス型）の添加が被検化合物を添加してから１０分後となるように、ＦＬＩＰＲを操作して、上記と同様にα−ＬＡ（シス型）添加刺激前後の細胞内Ｃａ^２＋濃度の経時変化を測定した。

また、測定終了後、各被検化合物前処理に対応するwellの蛍光強度増加のピーク値をそれぞれ求めた。この数値をＤＭＳＯのみで前処理時した際のα−ＬＡ添加刺激時の数値でnormalizeして各被検化合物の活性化抑制効果（アンタゴニスト活性）を評価した。

−ＧＰＲ４０保有細胞に対して−
図４は、チアゾリジン系化合物をＧＰＲ４０保有細胞に添加したときの活性化抑制効果を示すデータである。つまり、α−ＬＡ（シス型）により活性化されたＧＰＲ４０保有細胞に対して、ロジグリタゾン，トログリタゾンおよびシグリタゾンなどのチアゾリジン系化合物による活性化の阻害性を示すデータである。

図４に示すように、活性化状態におけるＣａ^２＋濃度上昇を１（normarizeされた値）とすると、ロジグリタゾンの添加によって、Ｃａ^２＋濃度上昇はほとんど０まで低下がしており、ＧＰＲ４０保有細胞の活性化がほとんど見られない状態まで大きく抑制（阻害）されている。したがって、ロジグリタゾンによる，ＧＰＲ４０保有細胞の活性化抑制効果（normarizeされた値）は、１．０となる。また、トログリタゾンの添加によっても、Ｃａ^２＋濃度上昇は０．２２程度（normarizeされた値）まで低下しており、ＧＰＲ４０保有細胞の活性化が抑制（阻害）されている。そして、トログリタゾンによる，ＧＰＲ４０保有細胞の活性化抑制効果（normarizeされた値）は、０．７８である。

このデータからわかるように、ロジグリタゾンおよびトログリタゾンは、ＧＰＲ４０に対するアンタゴニストとして機能する。特に、ロジグリタゾンのアンタゴニスト機能は非常に強い。文献（The FFA recepter GPR40 links hyperinsulinemia,hepatic steatosis,and impaired glucose homeostasis in mouse (Cell Metab. 2005 Apr;1(4):245-58) )によると、トランスジェニックマウスの実験から、長期間ＧＰＲ４０が刺激を受けると、糖尿病が誘発されることが開示されている。したがって、ロジグリタゾン，トログリタゾンを投与すると、ＧＰＲ４０の活性を抑制することにより、ＧＰＲ４０の長期刺激から生じる種々の疾病、たとえば糖尿病誘発、膵臓β細胞の疲弊、およびこれらに基づいて引き起こされる疾患、たとえば高脂血症，肥満，メタボリックシンドローム，糖尿病性腎炎等に有効であると推定される。

一方、シグリタゾンの添加によっては、Ｃａ^２＋濃度の低下はほとんどなく、ＧＰＲ４０保有細胞の活性化はほとんど抑制（阻害）されていない。したがって、シグリタゾンによる，ＧＰＲ４０保有細胞の活性化抑制効果（normarizeされた値）は、０となる。

−ＧＰＲ１２０保有細胞に対して−
図６は、チアゾリジン系化合物をＧＰＲ１２０保有細胞に添加したときの活性化抑制効果を示すデータである。つまり、α−ＬＡ（シス型）により活性化されたＧＰＲ１２０保有細胞に対して、ロジグリタゾン，トログリタゾンおよびシグリタゾンなどのチアゾリジン系化合物による活性化の阻害性を示すデータである。

図６に示すように、ロジグリタゾンの添加によって、Ｃａ^２＋濃度は、０．０１（normarizeされた値）まで低下しており、ＧＰＲ１２０保有細胞の活性化がほとんど見られない状態まで大きく抑制（阻害）されている。したがって、ロジグリタゾンによる，ＧＰＲ１２０保有細胞の活性化抑制効果（normarizeされた値）は、０．９９となる。

また、トログリタゾンの添加によっても、Ｃａ^２＋濃度は０．０２程度（normarizeされた値）まで大きく低下しており、ＧＰＲ１２０保有細胞の活性化が大きく抑制（阻害）されている。そして、トログリタゾンによる，ＧＰＲ１２０保有細胞の活性化抑制効果（normarizeされた値）は、０．９８である。

一方、シグリタゾンの添加によって、Ｃａ^２＋濃度は０．４２程度（normarizeされた値）まで低下しており、ＧＰＲ保有細胞ＧＰＲ１２０の活性化が相当に抑制（阻害）されている。そして、シグリタゾンによる，ＧＰＲ１２０保有細胞の活性化抑制効果（normarizeされた値）は、０．５８である。

ずなわち、本実施例の実験により、ロジグリタゾン，トログリタゾンおよびシグリタゾンなどのチアゾリジン系化合物は、ＧＰＲ４０，ＧＰＲ１２０などのＧ蛋白質レセプターのアンタゴニストとして用いることができることが実証された。

特に、いずれの化合物も、ＧＰＲ１２０のアンタゴニストとしての機能を有していることが確認された。また、ＧＰＲ４０については、ロジグリタゾンおよびトログリタゾンがアンタゴニストとしての機能を有していることが確認された。

図４，図６に示すデータから導かれるように、活性化状態にある細胞に対して、チアゾリジン系化合物を添加することにより、その活性を定量的に抑制することができる。活性化状態は、Ｇ蛋白質共役型レセプターに対するアゴニストの添加によって実現するが、ＧＰＲ１２０反応が過敏となっている、たとえばＧＰＲ１２０が過剰に発現している病態においては、アンタゴニストであるチアゾリジン系化合物を添加することにより、病態を治療することができる。したがって、本発明のチアゾリジン系化合物を有効成分として含むＧ蛋白質共役型レセプター抑制剤は、ＧＰＲ１２０反応が過敏となることが原因の病気に対する医薬，栄養補助剤として用いることができる。

従来、チアゾリジン系化合物とのＧ蛋白質共役型レセプターに対するアゴニスト，アンタゴニストとしての機能はほとんど知られていなかったが、本実験の結果から、チアゾリジン系化合物のＧ蛋白質共役型レセプター、特に、ＧＰＲ１２０に対するアンタゴニスト（抑制剤）としての機能が確認された。そして、本発明のＧＰＲ１２０の抑制剤を有効成分として含む医薬により、上述のような治療薬，体質改善薬などとしての効果を発揮することができる。

なお、チアゾリジン系化合物のＧＰＲ４０保有細胞とＧＰＲ１２０保有細胞とに対するアゴニストとしての機能は、ロジグリタゾンだけに確認されたが、今後、他のチアゾリジン系化合物についての知見を得ることにより、Ｇ蛋白質共役型レセプターのアゴニストとして機能する物質が得られるものと予想される。

なお、活性化や活性化阻害性を定量的に調べる方法として、本実施例では、細胞内Ｃａ^２＋濃度の測定を採用したが、その他、ＣＣＫ，サイトカン，ＥＲＫ等の生理活性物質またはシグナル伝達物質の検出を利用することができる。

そして、チアゾリジン系化合物を含むＧ蛋白質共役型レセプター抑制剤を、有効成分として含有する本発明の医薬により、各種疾患の治療が可能になる。すなわち、ＧＰＲ１２０を有する細胞が存在する腸管、肺、脳などにおけるＧ蛋白質共役型レセプターの作動（活性化状態）に連動して生じる細胞内Ｃａ^２＋濃度上昇の抑制作用を利用して、消化器疾患治療薬，精神障害治療薬，低血糖症、および肺疾患治療薬として用いることができる。

また、図４，図６に示すデータおよび文献「NATURE MEDICINE Vol.11 No.1 Jan.2005 p.90-94」からわかるように、チアゾリジン系化合物を有効成分として含有するＧ蛋白質共役型レセプター抑制剤を、当該レセプター保有細胞に投与することにより、当該細胞の当該レセプターの活性化を阻害するので、あるレセプターの機能が阻害されたスクリーニング用の細胞を作成することができる。そして、当該細胞に被検化合物を添加して、血中の腸管ホルモン、たとえばＧＬＰ−１，ＣＣＫなどを測定することにより、当該レセプターの機能回復に有効なリガンドをスクリーニングすることができる。

同様に、図４，図６に示すデータおよび文献「Am. J. Clin. Nutr. 2001;73:p.1019-1026」からわかるように、チアゾリジン系化合物を有効成分として含有するＧ蛋白質共役型レセプター抑制剤を、動物に投与することにより、当該動物の各器官の細胞に存在する当該レセプターの活性化を阻害するので、あるレセプターの機能が阻害されたスクリーニング用の動物を作成することができる。そして、当該動物に被検化合物を添加して、血中の腸管ホルモン、たとえばＧＬＰ−１，ＣＣＫなどを測定することにより、当該レセプターの機能回復に有効なリガンドをスクリーニングすることができる。

本発明のＧ蛋白質共役型レセプター抑制剤は、医薬だけでなく、栄養補助剤として利用することができる。

（ａ），（ｂ）は、順に、無処置および発現誘導処置したＧＰＲ４０保有細胞ＧＰＲ１２０保有細胞における，α−ＬＡ（シス型）の刺激によるＣａ^２＋濃度の上昇量データを示すグラフである。ロジグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ），トログリタゾン（Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ），シグリタゾン（Ｃｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ），ピオグリタゾン（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）などのチアゾリジン系化合物の化学構造を示す図である。ロジグリタゾン，トログリタゾンおよびシグリタゾンなどのチアゾリジン系化合物をＧＰＲ４０保有細胞に添加したときのＣａ^２＋濃度の上昇量データを示すグラフである。チアゾリジン系化合物をＧＰＲ４０保有細胞に添加したときの活性化抑制効果を示すデータである。ロジグリタゾン，トログリタゾンおよびシグリタゾンなどのチアゾリジン系化合物をＧＰＲ１２０保有細胞に添加したときのＣａ^２＋濃度の上昇量データを示すグラフである。チアゾリジン系化合物をＧＰＲ１２０保有細胞に添加したときの活性化抑制効果を示すデータである。

Claims

チアゾリジン系化合物を有効成分として含有し、Ｇ蛋白質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）の機能を抑制する、Ｇ蛋白質共役型レセプター抑制剤。
請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター抑制剤において、
前記チアゾリジン化合物は、下記一般式（１）、

（Ｒは置換されてもよい低級アルキル基を示す）で表される化合物である、Ｇ蛋白質共役型レセプター抑制剤。
請求項２記載のＧ蛋白質共役型レセプター抑制剤において、
前記チアゾリジン系化合物が、ロジグリタゾン（rosiglitazone）、トログリタゾン（troglitazone）、およびシグリタゾン（ciglitazone）からなる群より選ばれる少なくとも１つの化合物である、Ｇ蛋白質共役型レセプター抑制剤。
請求項１〜３のいずれかに記載のＧ蛋白質共役型レセプター抑制剤において、
前記Ｇ蛋白質共役型レセプターは、ＧＰＲ１２０である、Ｇ蛋白質共役型レセプター抑制剤。
チアゾリジン系化合物を有効成分として含有する、Ｇ蛋白質共役型レセプター抑制剤を有効成分として含有する、医薬。
請求項６記載の医薬において、
消化器疾患治療薬，精神障害治療薬，低血糖症および肺疾患から選ばれる少なくとも１つの治療薬として機能する、医薬。