JP2008187923A - PROBE FOR DETECTING WT1 mRNA AND REAGENT FOR DETECTING LEUKEMIC GEMMULE - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はＷＴ１ ｍＲＮＡ検出プローブ及び白血病芽球検出試薬に関する。より詳細には、本発明は、ＷＴ１ ｍＲＮＡをＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）により検出することを利用して、白血病芽球を検出することに関する。 The present invention relates to a WT1 mRNA detection probe and a leukemia blast detection reagent. More particularly, the present invention relates to the detection of leukemia blasts utilizing the detection of WT1 mRNA by FRET (fluorescence resonance energy transfer).
白血病の診断・治療にとって、白血病芽球（癌化した白血球）のキメラ染色体の解析が重要である。正確な解析を行うためには検体中の白血病芽球の比率（白血球全体に占める割合）が高いことが望ましいが、通常、その比率は数パーセント程度であり、正確な解析を行うには不十分である。そこで、種々の方法により白血病芽球の濃縮が試みられているが、臨床現場の要求を満足する充分な方法は存在しない。 For the diagnosis and treatment of leukemia, analysis of chimeric chromosomes of leukemia blasts (cancerous leukocytes) is important. In order to perform an accurate analysis, it is desirable that the ratio of leukemia blasts in the sample (the ratio of the total number of leukocytes) is high, but usually the ratio is only a few percent, which is insufficient for accurate analysis. It is. Thus, although various methods have attempted to concentrate leukemia blasts, there is no sufficient method that satisfies the requirements of clinical practice.
白血病芽球を白血球分画から濃縮又は分離する優れた方法が開発できれば、白血病をより正確に診断でき、より適切に治療できる。したがって、本発明の目的は、白血病芽球の濃縮又は分離に応用できる、白血病芽球を特異的に検出する試薬を提供することにある。 If an excellent method for concentrating or separating leukemia blasts from the leukocyte fraction can be developed, leukemia can be diagnosed more accurately and treated more appropriately. Therefore, an object of the present invention is to provide a reagent for specifically detecting leukemia blasts, which can be applied to enrichment or separation of leukemia blasts.
白血病芽球を特異的に検出するため、本発明者らはＷＴ１遺伝子に着目した。ＷＴ１遺伝子は、当初、小児の腎臓癌であるウィルムス腫瘍の原因遺伝子として見つかったが、その後、白血病芽球において高発現していることが分かっている（非特許文献１）。本発明者らは、ＷＴ１ ｍＲＮＡを発現している細胞を特異的に検出することで白血病芽球が検出でき、セルソーター等と組み合わせることにより白血病芽球を分離することができると考えた。 In order to specifically detect leukemia blasts, the inventors focused on the WT1 gene. The WT1 gene was initially found as a causative gene for Wilms tumor, which is a childhood kidney cancer, but has subsequently been found to be highly expressed in leukemia blasts (Non-patent Document 1). The present inventors thought that leukemia blasts can be detected by specifically detecting cells expressing WT1 mRNA, and leukemia blasts can be separated by combining with a cell sorter or the like.
そして、ＷＴ１ ｍＲＮＡを発現している細胞を特異的に検出する方法として、ＦＲＥＴを利用した方法（特許文献１）を適用することとし、ＷＴ１ ｍＲＮＡを検出するためのＦＲＥＴプローブを開発した。 Then, as a method for specifically detecting cells expressing WT1 mRNA, a method using FRET (Patent Document 1) was applied, and a FRET probe for detecting WT1 mRNA was developed.
すなわち、本発明は、以下のオリゴヌクレオチド対からなるＷＴ１ ｍＲＮＡ検出プローブ（ＦＲＥＴプローブ；一方はドナープローブで、他方はアクセプタープローブである）を提供する。
（１）5'-tgaaggagtgaggcggcg-3'及び5'-cagctcggctcctgtttga-3'（配列番号１及び２）。
（２）5'-gacagtgaaggcgctcaggc-3'及び5'-gtgaactggccggaaaagtg-3'（配列番号３及び４）。
（３）5'-tgagtggttggggaactg-3'及び5'-tgggatcctcatgcttgaa-3'（配列番号９及び１０）。
（４）5'-tccatttcactgagctgga-3'及び5'-tggttgctctgcccttctg-3'（配列番号１１及び１２）。
（５）5’-tattgggctccgcagagg-3'及び5'-accgtgcgtgtgtattctg-3'（配列番号１３及び１４）。
（６）5'-acagtccttgaagtcacact-3'及び5'-ggtatggtttctcaccagtg-3'（配列番号１５及び１６）。
（７）5'-gaagggcttttcacttgtttt-3'及び5'-acctgtatgagtcctggtg-3’（配列番号１７及び１８）。
（８）5'-gacagctgaagggcttttc-3'及び5'-acctgtatgagtcctggtg-3'（配列番号１９及び１８）。
ここで、オリゴヌクレオチド対のうち一方のオリゴヌクレオチドはAlexa Fluor 488であるエネルギードナー蛍光色素が導入され（ドナープローブ）、他方のオリゴヌクレオチドはAlexa Fluor647であるエネルギーアクセプター蛍光色素が導入されている（アクセプタープローブ）。また、オリゴヌクレオチド対とＷＴ１ ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて、エネルギードナー蛍光色素とエネルギーアクセプター蛍光色素は２〜２０塩基離れた位置に存在する。
That is, the present invention provides a WT1 mRNA detection probe (FRET probe; one is a donor probe and the other is an acceptor probe) comprising the following oligonucleotide pairs.
(1) 5′-tgaaggagtgaggcggcg-3 ′ and 5′-cagctcggctcctgtttga-3 ′ (SEQ ID NOs: 1 and 2).
(2) 5′-gacagtgaaggcgctcaggc-3 ′ and 5′-gtgaactggccggaaaagtg-3 ′ (SEQ ID NOs: 3 and 4).
(3) 5′-tgagtggttggggaactg-3 ′ and 5′-tgggatcctcatgcttgaa-3 ′ (SEQ ID NOs: 9 and 10).
(4) 5′-tccatttcactgagctgga-3 ′ and 5′-tggttgctctgcccttctg-3 ′ (SEQ ID NOs: 11 and 12).
(5) 5′-tattgggctccgcagagg-3 ′ and 5′-accgtgcgtgtgtattctg-3 ′ (SEQ ID NOs: 13 and 14).
(6) 5′-acagtccttgaagtcacact-3 ′ and 5′-ggtatggtttctcaccagtg-3 ′ (SEQ ID NOs: 15 and 16).
(7) 5′-gaagggcttttcacttgtttt-3 ′ and 5′-acctgtatgagtcctggtg-3 ′ (SEQ ID NOs: 17 and 18).
(8) 5′-gacagctgaagggcttttc-3 ′ and 5′-acctgtatgagtcctggtg-3 ′ (SEQ ID NOs: 19 and 18).
Here, one oligonucleotide of the oligonucleotide pair is introduced with an energy donor fluorescent dye, which is Alexa Fluor 488 (donor probe), and the other oligonucleotide is introduced with an energy acceptor fluorescent dye, which is Alexa Fluor 647 ( Acceptor probe). Further, in the hybrid of the oligonucleotide pair and WT1 mRNA, the energy donor fluorescent dye and the energy acceptor fluorescent dye are present at positions separated by 2 to 20 bases.
上記（１）〜（８）のＦＲＥＴプローブは、高い効率でＷＴ１ ｍＲＮＡにハイブリダイズするため、ＷＴ１ ｍＲＮＡを高感度に検出できる。 Since the FRET probes (1) to (8) above hybridize with WT1 mRNA with high efficiency, WT1 mRNA can be detected with high sensitivity.
また、上記（１）〜（８）のＦＲＥＴプローブは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド及び２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチド（２’−Ｏ−４’−Ｃ−メチレン架橋ヌクレオチド、２’−Ｏ−４’−Ｃ−エチレン架橋ヌクレオチドなど）から選択されるいずれかのヌクレオチド、またはこれらのヌクレオチドの任意の組合せからなる２種以上のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドである。また、オリゴヌクレオチドは、通常のホスホジエステル型ではなく、ホスホロチオエート型であってもよい。 The FRET probes of (1) to (8) above are deoxyribonucleotides, ribonucleotides, 2′-O-methyl-ribonucleotides and 2′-O-4′-C-bridged nucleotides (2′-O-4). Any of the nucleotides selected from '-C-methylene bridged nucleotides, 2'-O-4'-C-ethylene bridged nucleotides, etc.) or any combination of these nucleotides. Oligonucleotide. Further, the oligonucleotide may be a phosphorothioate type instead of a normal phosphodiester type.
また、本発明は、上記ＦＲＥＴプローブからなる白血病芽球検出試薬を提供する。白血病芽球はＷＴ１を高発現しているため、上記ＦＲＥＴプローブを用いてＷＴ１ ｍＲＮＡが高発現していることが確認できた細胞を白血病芽球であると同定することができる。 The present invention also provides a leukemia blast detection reagent comprising the FRET probe. Since leukemia blasts highly express WT1, it is possible to identify cells that have been confirmed to be highly expressing WT1 mRNA using the FRET probe as leukemia blasts.
さらに、上記（７）及び（８）のＦＲＥＴプローブからなる白血病芽球検出試薬を用いることによって、ＷＴ１のKTSに関する異性体を判別して検出することが可能となる。ＷＴ１には異性体のうち第９エクソンの末尾のアミノ酸３残基（KTS）をコードする塩基配列がスプライシングを受けるものがあり、KTSを有する異性体ＷＴ１（KTS+）及びKTSを欠失する異性体ＷＴ１（KTS-）が通常１つの細胞内に存在する。また、KTSの有無が生理活性に影響を与え、ＷＴ１（KTS+）及びＷＴ１（KTS-）の両者のバランスが細胞のガン化に生理的な意味を持つことが示唆されている。したがって、ＷＴ１（KTS+）及びＷＴ１（KTS-）の両者を判別して検出することができ、両者を発現している白血病芽球を特異的に分離することができることは、診断・治療への応用という観点から有効である。 Furthermore, by using the leukemia blast detection reagent comprising the FRET probe of (7) and (8) above, it is possible to discriminate and detect the isomer of WT1 relating to KTS. Among isomers, WT1 has spliced base sequence encoding amino acid residue (KTS) at the end of exon 9, isomer WT1 with KTS (KTS +) and isomer lacking KTS WT1 (KTS-) is usually present in one cell. In addition, the presence or absence of KTS has an effect on physiological activity, and it has been suggested that the balance between WT1 (KTS +) and WT1 (KTS-) has a physiological meaning in canceration of cells. Therefore, both WT1 (KTS +) and WT1 (KTS-) can be discriminated and detected, and leukemia blasts expressing both can be specifically isolated. It is effective from the viewpoint.
本発明のＷＴ１ ｍＲＮＡ検出プローブは、ＷＴ１ ｍＲＮＡを特異的かつ高感度に検出することができ、それにより、白血病芽球を検出することができる。したがって、本発明の白血病芽球検出試薬を利用して、白血病芽球を特異的に分離することができ、白血病の診断・治療に応用することができる。 The WT1 mRNA detection probe of the present invention can specifically detect WT1 mRNA with high sensitivity, thereby detecting leukemia blasts. Therefore, leukemia blasts can be specifically separated using the leukemia blast detection reagent of the present invention, and can be applied to diagnosis and treatment of leukemia.
本発明のＷＴ１ ｍＲＮＡ検出プローブは、表１に示した塩基配列を有し、それぞれ１分子の蛍光色素で標識された１対のオリゴヌクレオチド（ＦＲＥＴプローブ対）からなる。 The WT1 mRNA detection probe of the present invention comprises a pair of oligonucleotides (FRET probe pair) each having the base sequence shown in Table 1 and labeled with one molecule of a fluorescent dye.
表１中、a, t, g,cはそれぞれ、アデニン、チミン、グアニン、シトシンのヌクレオチド塩基を表す（ただし、tは適宜u（ウラシル）と読み替えるものとする）。位置は、ＷＴ１ ｍＲＮＡの開始コドンのアデニンの位置を１としたときのＷＴ１ ｍＲＮＡにおける相対的な位置を表す。 In Table 1, a, t, g, and c represent nucleotide bases of adenine, thymine, guanine, and cytosine (provided that t is appropriately read as u (uracil)). The position represents a relative position in the WT1 mRNA when the adenine position of the start codon of the WT1 mRNA is 1.
蛍光色素の導入位置は、ドナープローブ、アクセプタープローブ及びＷＴ１ ｍＲＮＡの３者により形成されるハイブリッドにおいて、エネルギードナー蛍光色素（Alexa Fluor 488）からエネルギーアクセプター蛍光色素（Alexa Fluor 647）に有意の効率でＦＲＥＴが生じるように決定する。ハイブリッド上において２つの蛍光色素の距離が２〜２０塩基であるときにこのような条件を満足することが、先行技術文献において明らかである（Tsujiet al., Biophys. J., vol. 78, pp.3260-3274 (2000) 及び Tsuji et al., Biophys. J.,vol. 81, pp.501-515 (2001) 等）。また、蛍光色素の導入位置は、５’末端、３’末端及び鎖内のいずれでもよい（Tsuji et al.,Biophys. J., vol. 78, pp.3260-3274 (2000) 及び Tsuji et al., Biophys. J., vol.81, pp.501-515 (2001) 等）。高い効率でＦＲＥＴを生じさせるためには、２つの蛍光色素の距離は、２〜４塩基であることが好ましい。 The introduction position of the fluorescent dye is a significant efficiency from the energy donor fluorescent dye (Alexa Fluor 488) to the energy acceptor fluorescent dye (Alexa Fluor 647) in the hybrid formed by the donor probe, acceptor probe and WT1 mRNA. To determine that FRET occurs. It is clear in the prior art literature that this condition is satisfied when the distance between the two fluorescent dyes is 2 to 20 bases on the hybrid (Tsuji et al., Biophys. J., vol. 78, pp. .3260-3274 (2000) and Tsuji et al., Biophys. J., vol. 81, pp. 501-515 (2001)). The fluorescent dye may be introduced at any of the 5 ′ end, 3 ′ end and within the chain (Tsuji et al., Biophys. J., vol. 78, pp. 3260-3274 (2000) and Tsuji et al. Biophys. J., vol. 81, pp. 501-515 (2001), etc.). In order to generate FRET with high efficiency, the distance between the two fluorescent dyes is preferably 2 to 4 bases.
エネルギードナー蛍光色素は、直接又はヘキシルアミノ基などのリンカーを介して結合している。エネルギーアクセプター蛍光色素も、直接又はヘキシルアミノ基などのリンカーを介して結合している。本発明においては、エネルギードナー蛍光色素としてはAlexa Fluor 488を用い、エネルギーアクセプター蛍光色素としてはAlexa Fluor 647を用いることを特徴とする。 The energy donor fluorescent dye is bound directly or via a linker such as a hexylamino group. The energy acceptor fluorescent dye is also bound directly or through a linker such as a hexylamino group. In the present invention, Alexa Fluor 488 is used as the energy donor fluorescent dye, and Alexa Fluor 647 is used as the energy acceptor fluorescent dye.
ここで、AlexaFluor 488とは、モレキュラープローブス社から入手可能なAlexa Fluor（商標）シリーズの１つであり、以下の式（Ｉ）で表わされる、最大吸収波長：494nm、最大蛍光波長：517nmの蛍光色素である。図１は、AlexaFluor 488の吸収スペクトルと蛍光スペクトルを表すグラフである。さらに、スクシンイミジルエステルではなく、テトラフルオロフェニルエステルである、式（ＩＩ）で表される蛍光色素等もAlexaFluor 488に含まれる。 Here, AlexaFluor 488 is one of the Alexa Fluor (trademark) series available from Molecular Probes. The maximum absorption wavelength is 494 nm and the maximum fluorescence wavelength is 517 nm represented by the following formula (I). It is a fluorescent dye. FIG. 1 is a graph showing the absorption spectrum and fluorescence spectrum of AlexaFluor 488. Further, AlexaFluor 488 includes a fluorescent dye represented by the formula (II) which is not a succinimidyl ester but a tetrafluorophenyl ester.
また、AlexaFluor 647とは、モレキュラープローブス社から入手可能なAlexa Fluor（商標）シリーズの１つであり、構造式は公開されていないが分子量約1250 MW、最大吸収波長：649nm、最大蛍光波長：666nmの蛍光色素である。図２は、AlexaFluor 647の吸収スペクトルと蛍光スペクトルを表すグラフである。 AlexaFluor 647 is one of the Alexa Fluor (trademark) series available from Molecular Probes. Molecular structure is not disclosed, but molecular weight is about 1250 MW, maximum absorption wavelength: 649 nm, maximum fluorescence wavelength: 666nm fluorescent dye. FIG. 2 is a graph showing the absorption spectrum and fluorescence spectrum of AlexaFluor 647.
上記のＦＲＥＴプローブは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド及び２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチド（２’−Ｏ−４’−Ｃ−メチレン架橋ヌクレオチド、２’−Ｏ−４’−Ｃ−エチレン架橋ヌクレオチドなど）からなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド、またはこれらのヌクレオチドの任意の組合せからなる２種以上のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドである。 The above FRET probes are deoxyribonucleotides, ribonucleotides, 2′-O-methyl-ribonucleotides and 2′-O-4′-C-bridged nucleotides (2′-O-4′-C-methylene bridged nucleotides, 2 Any oligonucleotide selected from the group consisting of '-O-4'-C-ethylene-bridged nucleotides, etc.) or any combination of these nucleotides.
デオキシリボヌクレオチドから構成されるプローブはＤＮＡプローブであり、リボヌクレオチドから構成されるプローブはＲＮＡプローブである。 A probe composed of deoxyribonucleotides is a DNA probe, and a probe composed of ribonucleotides is an RNA probe.
２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチドは、リボヌクレオチドのリボース２’位のヒドロキシル基がメチル化されており、そのオリゴヌクレオチドから構成されるプローブは、ＤＮＡプローブやＲＮＡプローブに比べてヌクレアーゼに対する安定性等が向上している。 In 2′-O-methyl-ribonucleotide, the hydroxyl group at the 2′-position of ribose of the ribonucleotide is methylated, and the probe composed of the oligonucleotide is more stable against nucleases than DNA probes and RNA probes. Etc. have improved.
２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチドは、リボヌクレオチドのリボースの２’−Ｏと４’−Ｃとがアルキレン鎖（メチレン、エチレンなど）で架橋されているヌクレオチドであり、Locked Nucleic Acid（ＬＮＡ）とも呼ばれる。架橋によってリボース環のフレキシビリティが制限され、それにより、ハイブリダイゼーション能が向上し（Ｔｍ値の増加）、ヌクレアーゼに対する安定性も向上している。 2'-O-4'-C-bridged nucleotide is a nucleotide in which 2'-O and 4'-C of ribose of ribonucleotide are bridged with an alkylene chain (methylene, ethylene, etc.), and Locked Nucleic Acid Also called (LNA). Cross-linking restricts the flexibility of the ribose ring, thereby improving the hybridization ability (increasing Tm value) and improving the stability against nucleases.
また、上記オリゴヌクレオチドは、通常のホスホジエステル型ではなく、ホスホロチオエート型であってもよく、そのようなオリゴヌクレオチドをＳ−オリゴという。オリゴヌクレオチドは、通常、ホスホジエステル結合を介してリボース同士が結合しているが、その結合がホスホロチオエート基に置き換わったＳ−オリゴは、ヌクレアーゼに対する安定性が向上している。デオキシリボヌクレオチドやリボヌクレオチドがホスホロチオエート基で結合したオリゴヌクレオチドのみならず、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチドや２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチドがホスホロチオエート基で結合したオリゴヌクレオチドも、ＦＲＥＴプローブとして機能し得る。 The oligonucleotide may be a phosphorothioate type instead of a normal phosphodiester type, and such an oligonucleotide is referred to as an S-oligo. In an oligonucleotide, riboses are usually bonded to each other via a phosphodiester bond, but S-oligos in which the bond is replaced with a phosphorothioate group have improved stability against nucleases. Not only oligonucleotides in which deoxyribonucleotides and ribonucleotides are bonded with phosphorothioate groups, but also oligonucleotides in which 2′-O-methyl-ribonucleotides and 2′-O-4′-C-bridged nucleotides are bonded with phosphorothioate groups are FRET. Can function as a probe.
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、公知の方法（例えば、ホスホロアミダイト法、βシアノエチルアミダイト法、ホスホロチオエート法）に従って合成することが可能である。目的とするオリゴヌクレオチドの種類に応じて、必要な試薬（ホスホロアミダイト試薬等）を使い分けることができ、そのような試薬は市販されている。 The oligonucleotide according to the present invention can be synthesized according to a known method (eg, phosphoramidite method, β-cyanoethylamidite method, phosphorothioate method). Depending on the type of the target oligonucleotide, necessary reagents (phosphoramidite reagents and the like) can be used properly, and such reagents are commercially available.
以上、本発明のＷＴ１ ｍＲＮＡ検出プローブ及びＦＲＥＴプローブの合成方法について説明してきたが、ＷＴ１ ｍＲＮＡ検出プローブを用いた白血病芽球の検出方法について以下で説明する。 The method for synthesizing the WT1 mRNA detection probe and the FRET probe of the present invention has been described above. The method for detecting leukemia blasts using the WT1 mRNA detection probe will be described below.
本実施形態のＷＴ１ ｍＲＮＡ検出プローブを用いた白血病芽球の検出方法は以下の４工程を備える。
（１）ＦＲＥＴプローブを合成する工程
（２）ＷＴ１ ｍＲＮＡに対するＦＲＥＴプローブの定量性を確認する工程
（３）細胞内へＦＲＥＴプローブを導入する工程
（４）導入されたＦＲＥＴプローブのフローサイトメーターによる検出と分離する工程
The method for detecting leukemia blasts using the WT1 mRNA detection probe of this embodiment comprises the following four steps.
(1) Step of synthesizing the FRET probe (2) Step of confirming the quantification of the FRET probe against WT1 mRNA (3) Step of introducing the FRET probe into the cell (4) Detection of the introduced FRET probe with a flow cytometer And separation process
工程（１）は、上述のＦＲＥＴプローブの合成方法を用いればよい。 Step (1) may use the above-described method for synthesizing the FRET probe.
次の工程（２）では、ＦＲＥＴプローブの定量性を確認するために、ＷＴ１ ｍＲＮＡに対するＦＲＥＴによる蛍光強度変化を溶液中で測定する。具体的には、以下の方法を挙げることができる。対象となるｍＲＮＡ（ＷＴ１ ｍＲＮＡ）はIn vitro 転写によって調製することができる。ドナープローブ及びアクセプタープローブを添加した溶液に、対象となるｍＲＮＡを一定量ずつ加える。この操作の過程において、AlexaFluor 488/647に対応する励起波長488nm、蛍光波長500-750nmの範囲で蛍光スペクトルを測定し、ＦＲＥＴプローブと対象となるｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションに伴う蛍光スペクトルの変化を観察する。ＦＲＥＴによる蛍光強度変化が対象となるｍＲＮＡの用量依存的であることを確認する。 In the next step (2), in order to confirm the quantitativeness of the FRET probe, a change in fluorescence intensity due to FRET with respect to WT1 mRNA is measured in a solution. Specifically, the following methods can be mentioned. The mRNA of interest (WT1 mRNA) can be prepared by in vitro transcription. A predetermined amount of target mRNA is added to the solution to which the donor probe and the acceptor probe have been added. During this process, the fluorescence spectrum is measured in the range of excitation wavelength 488nm and fluorescence wavelength 500-750nm corresponding to AlexaFluor 488/647, and the change in fluorescence spectrum due to hybridization of FRET probe and target mRNA is observed. To do. It is confirmed that the change in fluorescence intensity due to FRET is dose-dependent of the target mRNA.
工程（３）では、本発明のＷＴ１ ｍＲＮＡ検出プローブを生細胞（白血球）に導入する。導入方法は公知の方法、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法などが適用可能である。また、ストレプトリシンＯなどの細菌毒素で膜穿孔処理する方法も適用できる。 In step (3), the WT1 mRNA detection probe of the present invention is introduced into living cells (leukocytes). As the introduction method, known methods such as microinjection method, electroporation method, lipofection method and the like can be applied. Further, a method of perforating the membrane with a bacterial toxin such as streptolysin O can also be applied.
細胞内にＷＴ１ ｍＲＮＡ検出プローブを導入した後は、ドナープローブ及びアクセプタープローブをＷＴ１ ｍＲＮＡにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、白血病芽球検出試薬を導入した細胞を室温において数分間インキュベーションすればよい。 After introducing the WT1 mRNA detection probe into the cell, the donor probe and the acceptor probe are hybridized to the WT1 mRNA. The hybridization condition may be, for example, by incubating the cell into which the leukemia blast detection reagent has been introduced for several minutes at room temperature.
ストレプトリシンＯなどで膜穿孔処理をした場合、ハイブリダイゼーション後に膜の再封入（血清を含む培地で数分間インキュベーションする）を行うことが好ましい。 When membrane perforation treatment is performed with streptricin O or the like, it is preferable to re-encapsulate the membrane (incubate with a medium containing serum for several minutes) after hybridization.
工程（４）では、まず、ドナープローブ及びアクセプタープローブとＷＴ１ ｍＲＮＡとのハイブリッドが存在する細胞を検出する。ドナープローブに結合している蛍光色素の励起光を細胞に照射し、ＦＲＥＴに基づくアクセプタープローブに結合している蛍光色素からの蛍光を観測することで、白血病芽球が検出できる。 In step (4), first, a cell in which a hybrid of a donor probe, an acceptor probe, and WT1 mRNA is detected is detected. Leukemia blasts can be detected by irradiating the cells with excitation light of a fluorescent dye bound to the donor probe and observing fluorescence from the fluorescent dye bound to the acceptor probe based on FRET.
励起光の照射によって、ｍＲＮＡとハイブリダイズしているドナープローブのエネルギードナー蛍光色素も、ｍＲＮＡとハイブリダイズしていないドナープローブのエネルギードナー蛍光色素も同時に励起されるが、ドナープローブに近接してアクセプタープローブがハイブリダイズしている場合にのみＦＲＥＴが生じ、このときはアクセプタープローブのエネルギーアクセプター蛍光色素から蛍光が生じる。すなわち、エネルギーアクセプター蛍光色素からの蛍光の観察は、ドナープローブとアクセプタープローブが近接していることを意味し、生細胞中にＷＴ１ ｍＲＮＡが発現していることがわかる。 The excitation light irradiation simultaneously excites the energy donor fluorescent dye of the donor probe hybridized with the mRNA and the energy donor fluorescent dye of the donor probe not hybridized with the mRNA. FRET occurs only when the ceptor probe is hybridized, and at this time, fluorescence is generated from the energy acceptor fluorescent dye of the acceptor probe. That is, observation of fluorescence from the energy acceptor fluorescent dye means that the donor probe and the acceptor probe are close to each other, and it can be seen that WT1 mRNA is expressed in living cells.
このようにして検出されたＷＴ１ ｍＲＮＡを発現している生細胞が選択的に分離される。分離方法に関しては特に制限はないが、セルソーター（Fluorescence Activated Cell Sorter、ＦＡＣＳ）を用いて、ＷＴ１ ｍＲＮＡを発現している生細胞を検出するとともに、選択的に分離することが好ましい。 The living cells expressing the WT1 mRNA detected in this manner are selectively separated. Although there is no restriction | limiting in particular regarding the isolation | separation method, While using the cell sorter (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), it is preferable to isolate | separate selectively, while detecting the living cell which is expressing WT1 mRNA.
セルソーターは、フローサイトメーターと細胞分取装置とを備えたものであり、特定物質を蛍光標識プローブで染色した個々の細胞に、細い流路の途中でレーザー光を照射することにより、散乱光（前方散乱光や側方散乱光）や蛍光のシグナル情報を個々の細胞ごとに測定し、その結果を、例えば度数分布（ドットプロット）として表示する機能を有しており、特定のシグナル情報を発する細胞にゲートをかけ所望の細胞を分取することができる。以上のような方法はフローサイトメトリーと呼ばれている。 The cell sorter is equipped with a flow cytometer and a cell sorting device. Each cell stained with a fluorescently labeled probe is irradiated with a laser beam in the middle of a narrow flow path to produce scattered light ( Forward scattered light and side scattered light) and fluorescence signal information is measured for each cell, and the result is displayed, for example, as a frequency distribution (dot plot), and specific signal information is emitted. The cells can be gated to sort the desired cells. Such a method is called flow cytometry.
例えば以下に述べる方法を適用して、ＷＴ１ ｍＲＮＡを発現している生細胞を分離することができる。すなわち、セルソーターにより個々の生細胞における、エネルギードナー蛍光色素（Alexa Fluor 488）を励起するレーザーを照射したときの同蛍光色素の相対的蛍光強度、及びＦＲＥＴに基づくエネルギーアクセプター蛍光色素（AlexaFluor 647）の相対的蛍光強度のシグナル情報を得て、例えば、前者を横軸、後者を縦軸としてドットプロットを行い、後者が高い値をとる細胞群を選択し、Ｒ２として領域指定する。さらに、測定対象の生細胞の細胞サイズに基づく前方散乱光と、生細胞の内部構造の複雑さに基づく側方散乱光のシグナル情報を得て、例えば、前者を横軸、後者を縦軸としてドットプロットを行い、測定対象の生細胞を表わしていると考えられる細胞群を選択し、Ｒ１として領域指定する。そして、Ｒ１及びＲ２の両選択条件を満たす（Ｒ１かつＲ２に属する）生細胞のみを分取できるようにセルソーターをセッティングすることにより、ＷＴ１ ｍＲＮＡが発現している細胞のみを選択的に分離することができる。 For example, live cells expressing WT1 mRNA can be isolated by applying the method described below. That is, the relative fluorescence intensity of the fluorescent dye when irradiated with a laser that excites the energy donor fluorescent dye (Alexa Fluor 488) in each living cell by a cell sorter, and the energy acceptor fluorescent dye based on FRET (AlexaFluor 647) For example, dot plotting is performed with the former as the horizontal axis and the latter as the vertical axis, and a cell group in which the latter has a high value is selected, and the region is designated as R2. Furthermore, the signal information of the forward scattered light based on the cell size of the living cell to be measured and the side scattered light based on the complexity of the internal structure of the living cell is obtained, for example, with the former as the horizontal axis and the latter as the vertical axis. Dot plotting is performed, a cell group considered to represent a living cell to be measured is selected, and an area is designated as R1. Then, by setting a cell sorter so that only living cells satisfying both selection conditions of R1 and R2 (belonging to R1 and R2) can be sorted, only cells expressing WT1 mRNA are selectively separated. Can do.
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated more concretely based on an Example, this invention is not restrict | limited to a following example.
（実施例１：ＦＲＥＴプローブの設計）
標的となるＷＴ１ ｍＲＮＡ(Homosapiens Wilms tumor 1, transcript variant D, mRNA、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：NM_024426)の全塩基配列はＮＣＢＩ（NationalCenter for Biotechnology Information）の公開データーベースより入手した。この配列をもとにして、以下の手順でＦＲＥＴプローブの設計を行った。
(Example 1: Design of FRET probe)
The entire nucleotide sequence of the target WT1 mRNA (Homosapiens Wilms tumor 1, transcript variant D, mRNA, GenBank accession number: NM_024426) was obtained from the NCBI (National Center for Biotechnology Information) public database. Based on this sequence, the FRET probe was designed according to the following procedure.
まず、RNAが取り得る高次構造のパターンの中で個々の核酸塩基が鎖内で相補鎖形成にかかわらない場合の数（SS-count値）を公開プログラム（ｍFold）により計算し、その値を40塩基分連続する核酸塩基について平均をとった。その結果を図３に示す。図３は、横軸にＷＴ１ ｍＲＮＡの塩基番号、縦軸に各塩基下流40塩基の平均SS-Count値を示した図である。 First, the number (SS-count value) of cases where individual nucleobases are not involved in complementary strand formation within the strand in the higher-order structure pattern that RNA can take is calculated by the published program (mFold), and the value is calculated. The average was taken for nucleobases continuous for 40 bases. The result is shown in FIG. FIG. 3 is a graph showing the base number of WT1 mRNA on the horizontal axis and the average SS-Count value of 40 bases downstream of each base on the vertical axis.
次に、平均SS-count値が高い（RNA鎖内で熱的に不安定である）領域をＦＲＥＴプローブの標的配列としドナープローブ、アクセプタープローブのTmがほぼ一致するような配列を17塩基から21塩基の長さに収まるように2分して6組の検出用ＦＲＥＴプローブの配列を決定した。すなわち、WT1Ex1a/Aプローブ、WT1Ex1b/Aプローブ、WT1Ex2/Aプローブ、WT1Ex5/Aプローブ、WT1Ex6/Aプローブ、WT1Ex8/Aプローブの6組のプローブである。 Next, the region where the average SS-count value is high (thermally unstable in the RNA strand) is used as the target sequence of the FRET probe, and the sequence in which the Tm of the donor probe and the acceptor probe are almost the same from 17 bases. Six sets of FRET probes for detection were sequenced by being divided into two so as to be within the length of 21 bases. That is, there are six sets of probes: WT1Ex1a / A probe, WT1Ex1b / A probe, WT1Ex2 / A probe, WT1Ex5 / A probe, WT1Ex6 / A probe, and WT1Ex8 / A probe.
また、上記ＦＲＥＴプローブの設計方法によるＦＲＥＴプローブの比較対照として、以下の通り、ＦＲＥＴプローブの設計を行った。平均SS-Count値が一定して低い（RNA鎖内で熱的に安定である）領域をハイブリダイゼーションが起き難い配列として設定し同様に1組のコントロール用ＦＲＥＴプローブの配列として決定した。すなわち、配列番号５及び６に記載の配列を有するWT1Ex1b(2)/Aプローブ、並びに、配列番号７及び８に記載の配列を有するWT1Ex1c/Aプローブの2組のプローブである。 In addition, as a comparative control of the FRET probe by the FRET probe design method, the FRET probe was designed as follows. A region where the average SS-Count value was constant and low (thermally stable in the RNA strand) was set as a sequence in which hybridization hardly occurs, and was similarly determined as a sequence of a set of control FRET probes. That is, there are two sets of probes: a WT1Ex1b (2) / A probe having the sequences described in SEQ ID NOs: 5 and 6, and a WT1Ex1c / A probe having the sequences described in SEQ ID NOs: 7 and 8.
さらに、ＷＴ１(KTS+)及びＷＴ１(KTS-)の両者の異性体を区別して検出するために、以下の通りにＦＲＥＴプローブを設計した。ＷＴ１のKTSに関する異性体は、第９エクソンの末尾のアミノ酸３残基（KTS）をコードする塩基配列のオルタナティブスプライシングにより生じる。この第９エクソン末尾のオルタナティブスプライシング部位を挟むようにドナープローブ及びアクセプタープローブを配するようにプローブを設計した。具体的には、両者で共通の配列（配列番号１８）をアクセプタープローブに設定した。そして、ＷＴ１（KTS+）ｍＲＮＡ上でアクセプタープローブと隣接するドナープローブ（WT1KTS+）に設定し、ＷＴ１（KTS-）ｍＲＮＡ上でアクセプタープローブと隣接するドナープローブ（WT1KTS-）に設定した。すなわち、ＷＴ１（KTS+） ｍＲＮＡに対してWT1KTS+/Aプローブ及びＷＴ１（KTS-） ｍＲＮＡに対してWT1KTS-/Aプローブの2組のプローブである。 Furthermore, in order to distinguish and detect both WT1 (KTS +) and WT1 (KTS-) isomers, a FRET probe was designed as follows. The isomer of WT1 with respect to KTS is generated by alternative splicing of the base sequence encoding the last 3 amino acid residues (KTS) of exon 9. The probe was designed so that the donor probe and the acceptor probe were arranged so as to sandwich the alternative splicing site at the end of the ninth exon. Specifically, a common sequence (SEQ ID NO: 18) was set as an acceptor probe. Then, the donor probe (WT1KTS +) adjacent to the acceptor probe on WT1 (KTS +) mRNA was set, and the donor probe (WT1KTS-) adjacent to the acceptor probe on WT1 (KTS-) mRNA was set. That is, there are two sets of probes, a WT1KTS + / A probe for WT1 (KTS +) mRNA and a WT1KTS- / A probe for WT1 (KTS-) mRNA.
以下に、ＷＴ１ ｍＲＮＡに対する各ＦＲＥＴプローブの配列とその標的部位の一覧（表２）を示す。なお、表２で用いられているa, t, g, cはそれぞれアデニン、チミン、グアニン、シトシンの核酸塩基を意味しており、T, G, AはFRETによる蛍光検出でドナーとなる蛍光色素（AlexaFluor 488）で修飾されている塩基を示し、T及びAはアクセプターとなる蛍光色素（Alexa Fluor 647）が修飾されている塩基は示す。ハイブリダイゼーション部位は、ＷＴ1のｍＲＮＡにおいて翻訳開始点（スタートコドン）のアデニンを１としたときの相対的な塩基番号である。 A list of the FRET probes for WT1 mRNA and a list of target sites thereof (Table 2) are shown below. In Table 2, a, t, g, and c are nucleobases of adenine, thymine, guanine, and cytosine, respectively, and T, G, and A are fluorescent dyes that serve as donors in fluorescence detection by FRET. A base modified with (AlexaFluor 488) is shown, and T and A are bases modified with an acceptor fluorescent dye (Alexa Fluor 647). The hybridization site is a relative base number when the translation start point (start codon) adenine is set to 1 in WT1 mRNA.
なお、ドナープローブ、アクセプタープローブ及びＷＴ１ ｍＲＮＡの３者により形成されるハイブリッドにおいて、ドナー色素によって修飾されたヌクレオチドとアクセプター色素によって修飾されたヌクレオチドの間に4塩基を挟むように設計した。しかし、蛍光色素によって修飾されたヌクレオチド間の距離は４塩基に限定されるものではない。 In the hybrid formed by the donor probe, acceptor probe, and WT1 mRNA, 4 bases were designed to be sandwiched between the nucleotide modified with the donor dye and the nucleotide modified with the acceptor dye. However, the distance between nucleotides modified with a fluorescent dye is not limited to 4 bases.
（実施例２：ＦＲＥＴプローブの合成）
表２に記載した配列を有するドナープローブのうち、５’末端の塩基がAlexa Fluor 488によって修飾されているドナープローブを特許文献１に記載の方法に準じて合成した。より詳細には、以下の通りである。AlexaFluor 488色素（インビトロジェン社製Alexa Fluor 488 Oligonucleotide Amine Labeling Kit Cat.NoA20191）を７μLのDMSOに溶かした。
(Example 2: Synthesis of FRET probe)
Among the donor probes having the sequences shown in Table 2, a donor probe in which the base at the 5 ′ end was modified with Alexa Fluor 488 was synthesized according to the method described in Patent Document 1. More details are as follows. AlexaFluor 488 dye (Alexa Fluor 488 Oligonucleotide Amine Labeling Kit Cat. NoA20191 manufactured by Invitrogen) was dissolved in 7 μL of DMSO.
一方、DNA/RNAシンセサイザー（PerkinElmer社製モデル394又はPerceptive Biosystems社製モデル8909）を用いて、βシアノエチルアミダイト法により、表２に記載の塩基配列を有するオリゴDNAを合成した。合成したオリゴDNAの5'末端に、６−（トリフルオロアセチルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイトを用いてヘキシルアミノ基を導入し、凍結乾燥した。これを25μg/μLの濃度で0.5MNa2HCO3/NaH2CO3緩衝液（pH9.3）に溶解した。 On the other hand, using DNA / RNA synthesizer (model 394 manufactured by PerkinElmer or model 8909 manufactured by Perceptive Biosystems), oligo DNAs having the base sequences shown in Table 2 were synthesized by the β-cyanoethyl amidite method. A hexylamino group was introduced into the 5 ′ end of the synthesized oligo DNA using 6- (trifluoroacetylamino) hexyl- (2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl) -phosphoramidite and lyophilized. . This was dissolved in 0.5 MNa 2 HCO 3 / NaH 2 CO 3 buffer (pH 9.3) at a concentration of 25 μg / μL.
AlexaFluor488色素DMSO溶液7μL、0.1Mホウ酸ナトリウムpH8.5を41μL、合成オリゴヌクレオチド水溶液（25μg/μL）を2μL混合して一晩室温で反応させた。反応液をゲル濾過して未反応の色素取り除いた後に20%ポリアクリルアミドゲル電気泳動で目的のオリゴヌクレオチドプローブを得た。 AlexaFluor488 dye DMSO solution 7 μL, 0.1 M sodium borate pH 8.5 41 μL, synthetic oligonucleotide aqueous solution (25 μg / μL) 2 μL were mixed and reacted overnight at room temperature. The reaction solution was subjected to gel filtration to remove unreacted dye, and then the target oligonucleotide probe was obtained by 20% polyacrylamide gel electrophoresis.
次に、表２に記載したアクセプタープローブ及びAlexa Fluor 488によって５’末端以外の塩基が修飾されているドナープローブを特許文献１に記載の方法に準じて合成した。より詳細には、以下の通りである。AlexaFluor 488色素（インビトロジェン社製Alexa Fluor 488 Oligonucleotide Amine Labeling Kit Cat.NoA20191）及びAlexa Fluor 647色素（インビトロジェン社製AlexaFluor647 Oligonucleotide AmineLabeling Kit Cat.No A20196）を７μLのDMSOに溶かした。 Next, the acceptor probe described in Table 2 and a donor probe in which a base other than the 5 'end was modified with Alexa Fluor 488 were synthesized according to the method described in Patent Document 1. More details are as follows. AlexaFluor 488 dye (Alexa Fluor 488 Oligonucleotide Amine Labeling Kit Cat.NoA20191 manufactured by Invitrogen) and Alexa Fluor 647 dye (AlexaFluor647 Oligonucleotide Amine Labeling Kit Cat.No A20196 manufactured by Invitrogen) were dissolved in 7 μL of DMSO.
一方、Uni-LinkAminoModifier (Clontech社製)を用いて表２に記載の塩基配列中、大文字表記（T, A又はT）の部分にヘキシルアミノ基修飾したヌクレオチドを導入したオリゴDNAを合成し、凍結乾燥した。これを25μg/μLの濃度で0.5MNa2HCO3/NaH2CO3緩衝液（pH9.3）に溶解した。 On the other hand, using Uni-LinkAminoModifier (manufactured by Clontech), an oligo DNA in which nucleotides modified with a hexylamino group were synthesized in the base sequence shown in Table 2 in the capital letter notation ( T , A or T) and frozen. Dried. This was dissolved in 0.5 MNa 2 HCO 3 / NaH 2 CO 3 buffer (pH 9.3) at a concentration of 25 μg / μL.
AlexaFluor488色素またはAlexaFluor647色素のDMSO溶液7μL、0.1Mホウ酸ナトリウムpH8.5を41μL、合成オリゴヌクレオチド水溶液（25μg/μL）を2μL混合して一晩室温で反応させた。反応液をゲル濾過して未反応の色素取り除いた後に20%ポリアクリルアミドゲル電気泳動で目的のオリゴヌクレオチドプローブを得た。 7 μL of AlexaFluor488 dye or AlexaFluor647 dye in DMSO, 41 μL of 0.1 M sodium borate pH 8.5, and 2 μL of a synthetic oligonucleotide aqueous solution (25 μg / μL) were mixed and allowed to react overnight at room temperature. The reaction solution was subjected to gel filtration to remove unreacted dye, and then the target oligonucleotide probe was obtained by 20% polyacrylamide gel electrophoresis.
（実施例３：ＷＴ1 ｍＲＮＡの調製）
ＦＲＥＴプローブとハイブリッド形成をするｍＲＮＡを調製するために、以下の手順でin vitro合成を行った。ヒトＷＴ1のｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ（ｐＵＣＷＴ1；理化学研究所バイオリソースセンターから購入）を制限酵素EcoRI及びHincIIで切断し、ＷＴ1 ｃＤＮＡ断片を得た。ＷＴ1 ｃＤＮＡ断片を、ＲＮＡ合成用ベクターpBluescriptIIKS+のEcoRI/HincIIによる消化部位に、Ｔ７プロモーター下流に断片が位置するように、ライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて結合させた。得られた組換えプラスミドを大腸菌JM109株のコンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入し、得られた形質転換体を培養し組換えプラスミドを複製した。
(Example 3: Preparation of WT1 mRNA)
In order to prepare mRNA that hybridizes with the FRET probe, in vitro synthesis was performed according to the following procedure. Plasmid DNA containing human WT1 cDNA (pUCWT1; purchased from RIKEN BioResource Center) was cleaved with restriction enzymes EcoRI and HincII to obtain a WT1 cDNA fragment. The WT1 cDNA fragment was bound to the digestion site of RNA synthesis vector pBluescriptIIKS + with EcoRI / HincII using a ligation kit (manufactured by Takara Bio Inc.) so that the fragment was located downstream of the T7 promoter. The obtained recombinant plasmid was introduced into competent cells (manufactured by Takara Bio Inc.) of Escherichia coli JM109 strain, and the resulting transformant was cultured to replicate the recombinant plasmid.
複製したプラスミドをHincIIにより直鎖状にした後、ProteinaseK（タカラバイオ社製）及びフェノール・クロロホルムで処理し、変性、除タンパクを行った。このように精製した遺伝子断片を鋳型として、インビトロ転写キット（MegascriptT7 Kits：Ambion社）を用いてＲＮＡを合成した。ＲＮＡ溶液にDNaseI（タカラバイオ社製）を加えてプラスミドＤＮＡを消化した後、等量の塩化リチウム溶液と2倍量のエタノールを加えてＲＮＡを沈殿させ、70%エタノールで洗浄した後、乾燥した。RNaseを含有しない蒸留水にＲＮＡを溶解させて、以下の実験に用いた。 The replicated plasmid was linearized with HincII and then treated with Proteinase K (manufactured by Takara Bio Inc.) and phenol / chloroform for denaturation and deproteinization. Using the purified gene fragment as a template, RNA was synthesized using an in vitro transcription kit (Megascript T7 Kits: Ambion). DNase I (manufactured by Takara Bio Inc.) was added to the RNA solution to digest plasmid DNA, RNA was precipitated by adding an equal volume of lithium chloride solution and twice the amount of ethanol, washed with 70% ethanol, and then dried. . RNA was dissolved in distilled water containing no RNase and used in the following experiments.
（実施例４：ＦＲＥＴプローブとＷＴ1 ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションによる蛍光スペクトル変化）
ドナープローブとアクセプタープローブが近接してハイブリダイゼーションすることに伴うＦＲＥＴによる蛍光スペクトルの変化を測定した。ドナープローブ及びアクセプタープローブを終濃度1μMとなるように150μLの1xSSC（150mM塩化ナトリウム、17mMクエン酸ナトリウム、pH7.0）溶液に加え、37℃で15分放置した後、四面透過の石英製のキュベットに注入し、蛍光分光光度計（F4500；日立製作所製）により励起波長488nm、蛍光波長500-750nmの範囲で蛍光スペクトルを測定した。次に、この溶液にＷＴ1 ｍＲＮＡを50pmol添加し、30分放置した後、37℃における蛍光スペクトルを測定して、ハイブリダイゼーションに伴う蛍光スペクトルの変化を観察した。蛍光スペクトルを測定した後、さらにＷＴ1 ｍＲＮＡを50pmol添加し、再度、蛍光スペクトルを測定した。ＷＴ1 ｍＲＮＡの量が200pmolになるまで、同様の操作を繰り返し、蛍光スペクトルを測定した。
(Example 4: Fluorescence spectrum change due to hybridization of FRET probe and WT1 mRNA)
Changes in the fluorescence spectrum due to FRET accompanying the close hybridization of the donor probe and the acceptor probe were measured. The donor probe and the acceptor probe were added to 150 μL of 1 × SSC (150 mM sodium chloride, 17 mM sodium citrate, pH 7.0) solution to a final concentration of 1 μM, and left at 37 ° C. for 15 minutes. The sample was injected into a cuvette, and a fluorescence spectrum was measured with a fluorescence spectrophotometer (F4500; manufactured by Hitachi, Ltd.) within an excitation wavelength of 488 nm and a fluorescence wavelength of 500-750 nm. Next, 50 pmol of WT1 mRNA was added to this solution and allowed to stand for 30 minutes, and then the fluorescence spectrum at 37 ° C. was measured to observe changes in the fluorescence spectrum accompanying hybridization. After measuring the fluorescence spectrum, 50 pmol of WT1 mRNA was further added, and the fluorescence spectrum was measured again. The same operation was repeated until the amount of WT1 mRNA reached 200 pmol, and the fluorescence spectrum was measured.
表２に列挙したプローブの蛍光スペクトルの変化を図４〜１５に示す。図４〜１１は、それぞれ、WT1Ex1a/Aプローブ（図４）、WT1Ex1b/Aプローブ（図５）、WT1Ex1b(2)/Aプローブ（図６）、WT1Ex1c/Aプローブ（図７）、WT1Ex2/Aプローブ（図８）、WT1Ex5/Aプローブ（図９）、WT1Ex6/Aプローブ（図１０）及びWT1Ex8/Aプローブ（図１１）を用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。WT1Ex1b(2)/Aプローブ及びWT1Ex1c/Aプローブを用いた場合（図６及び７）には蛍光スペクトルの変化が認められなかった。それ以外のＦＲＥＴプローブ、すなわち、WT1Ex1a/Aプローブ、WT1Ex1b/Aプローブ、WT1Ex2/Aプローブ、WT1Ex5/Aプローブ、WT1Ex6/Aプローブ及びWT1Ex8/Aプローブ（図４，５及び８〜１１）には蛍光スペクトルの変化が認められ、ＦＲＥＴに基づく蛍光強度がターゲットmRNAの用量依存的に増加することが分かった。これらのＦＲＥＴプローブは平均SS-count値が高い領域に設計したものであり、したがって、平均SS-count値が高い領域に位置するプローブがＷＴ１ ｍＲＮＡの検出に適用できることが確認できた。なお、図１６は、本実施例における各ＦＲＥＴプローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。これらのＦＲＥＴプローブのうちWT1Ex6/Aプローブを用いたときが最も顕著に蛍光強度の変化を示すことが明らかとなった。 Changes in the fluorescence spectra of the probes listed in Table 2 are shown in FIGS. 4 to 11 show the WT1Ex1a / A probe (FIG. 4), the WT1Ex1b / A probe (FIG. 5), the WT1Ex1b (2) / A probe (FIG. 6), the WT1Ex1c / A probe (FIG. 7), and the WT1Ex2 / A, respectively. It is a graph showing a fluorescence spectrum change when using a probe (FIG. 8), a WT1Ex5 / A probe (FIG. 9), a WT1Ex6 / A probe (FIG. 10), and a WT1Ex8 / A probe (FIG. 11). When the WT1Ex1b (2) / A probe and the WT1Ex1c / A probe were used (FIGS. 6 and 7), no change in the fluorescence spectrum was observed. Other FRET probes, ie, WT1Ex1a / A probe, WT1Ex1b / A probe, WT1Ex2 / A probe, WT1Ex5 / A probe, WT1Ex6 / A probe and WT1Ex8 / A probe (FIGS. 4, 5 and 8-11) are fluorescent. A change in the spectrum was observed, indicating that the fluorescence intensity based on FRET increased in a dose-dependent manner with the target mRNA. These FRET probes were designed in a region having a high average SS-count value, and therefore it was confirmed that probes located in a region having a high average SS-count value can be applied to the detection of WT1 mRNA. FIG. 16 is a graph showing changes in fluorescence spectrum when each FRET probe in this example is used. Of these FRET probes, it was revealed that the WT1Ex6 / A probe showed the most remarkable change in fluorescence intensity.
また、ＷＴ１(KTS+)及びＷＴ１(KTS-)の両者の異性体を区別して検出するために設計したＦＲＥＴプローブを用い、その蛍光スペクトルの変化を測定した結果を図１２〜１５に示す。ターゲットｍRNA配列とプローブ配列とがミスマッチしている場合には蛍光スペクトルの変化が認められなかった。すなわち、WT1KTS+/AプローブとＷＴ１（KTS-） ｍＲＮＡとの組み合わせ及びWT1KTS-/AプローブとＷＴ１（KTS+） ｍＲＮＡとの組み合わせ（図１３及び１４）である。ターゲットｍRNA配列とプローブ配列とがマッチしている場合、すなわち、ＷＴ１（KTS+） ｍＲＮＡに対してWT1KTS+/Aプローブ及びＷＴ１（KTS-） ｍＲＮＡに対してWT1KTS-/Aプローブを用いた場合（図１２及び１５）には蛍光スペクトルの変化が認められ、ＦＲＥＴに基づく蛍光強度がターゲットmRNAの用量依存的に増加することが分かった。したがって、これらのＦＲＥＴプローブは、ＷＴ１(KTS+)及びＷＴ１(KTS-)の両者の異性体を区別して検出できることが確認できた。 Moreover, the result of having measured the change of the fluorescence spectrum using the FRET probe designed in order to distinguish and detect the isomer of both WT1 (KTS +) and WT1 (KTS-) is shown to FIGS. When the target mRNA sequence and the probe sequence were mismatched, no change in the fluorescence spectrum was observed. That is, a combination of a WT1KTS + / A probe and WT1 (KTS-) mRNA and a combination of a WT1KTS- / A probe and WT1 (KTS +) mRNA (FIGS. 13 and 14). When the target mRNA sequence matches the probe sequence, that is, when the WT1KTS + / A probe is used for WT1 (KTS +) mRNA and the WT1KTS- / A probe is used for WT1 (KTS-) mRNA (FIG. 12). And 15) showed a change in the fluorescence spectrum, and it was found that the fluorescence intensity based on FRET increased in a dose-dependent manner with the target mRNA. Therefore, it was confirmed that these FRET probes can detect and detect both WT1 (KTS +) and WT1 (KTS-) isomers.
（実施例５：細胞内へのＦＲＥＴプローブの導入方法の検討）
生細胞内へのＦＲＥＴプローブの導入方法として、ストレプトリシンＯ（SLO）による膜穿孔及び血清培地による再封入を利用した。SLO処理は、Giles RV et al., Nucleosides& Nucleotides, vol. 16, 1155-1163 (1997)、Palmer M et al., Eur J Biochem.1995 Jul 15; 231(2):388-95.、及び、Sekiya K et al., J Bacteriol. 1993 Sep;175(18):5953-61に記載の方法を参考にした。
(Example 5: Examination of introduction method of FRET probe into cells)
As a method for introducing a FRET probe into a living cell, membrane perforation with streptricin O (SLO) and re-encapsulation with a serum medium were used. SLO treatment was performed in Giles RV et al., Nucleosides & Nucleotides, vol. 16, 1155-1163 (1997), Palmer M et al., Eur J Biochem. 1995 Jul 15; 231 (2): 388-95. The method described in Sekiya K et al., J Bacteriol. 1993 Sep; 175 (18): 5953-61 was referred to.
ＦＲＥＴプローブを導入するための条件検索として、まずは、FITC-Dextran（分子量9300；シグマ社製）を用いて、SLO法の導入効率及び細胞毒性を検討した。 As a conditional search for introducing the FRET probe, first, the introduction efficiency and cytotoxicity of the SLO method were examined using FITC-Dextran (molecular weight 9300; manufactured by Sigma).
0.05% BSA（ウシ血清アルブミン；シグマ社製）を含む25mLのPBS（リン酸緩衝食塩水、pH7.2；インビトロジェン社製）に、SLO（シグマ社製）を溶解し、1mg/mLのSLO溶液を調製した。SLOを還元するため、膜穿孔処理の前に、終濃度5mMのDTT（ジチオスレイトール）を添加し、37℃で2時間放置した。 SLO (manufactured by Sigma) is dissolved in 25 mL of PBS (phosphate buffered saline, pH 7.2; manufactured by Invitrogen) containing 0.05% BSA (bovine serum albumin; manufactured by Sigma), and a 1 mg / mL SLO solution Was prepared. In order to reduce SLO, DTT (dithiothreitol) having a final concentration of 5 mM was added and left at 37 ° C. for 2 hours before membrane perforation.
恒常的にＷＴ１を発現していると報告されているK562培養細胞株（ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンクから入手；JCRB0019）を10% FBS（ウシ胎児血清）及び1%Glu（グルタミン酸）を含むRPMI-1640培地（いずれもインビトロジェン社製）で培養し、必要数にまで増殖した細胞を遠心操作（800g、5分、室温；以下の遠心操作は同一条件）で回収し、PBSpH7.2で懸濁し、再び遠心し、血清成分を除去した。細胞をPBS pH7.2に懸濁し、遠心管１本あたり2 x 106個の細胞を含むように分注した。 RPMI containing 10% FBS (fetal calf serum) and 1% Glu (glutamate) from K562 cultured cell line (obtained from Research Resource Bank of Human Science Foundation; JCRB0019), which is reported to express WT1 constantly Cells cultured in -1640 medium (all manufactured by Invitrogen) and grown to the required number are collected by centrifugation (800 g, 5 minutes, room temperature; the following centrifugation is performed under the same conditions) and suspended in PBS pH 7.2. The serum component was removed by centrifugation again. Cells were suspended in PBS pH 7.2 and dispensed to contain 2 x 10 6 cells per centrifuge tube.
遠心操作後に上清を除いて得られたペレット状の2 x 106個の細胞塊に、FITC-Dextranを終濃度10μMで加えたSLO溶液40μLを添加した。SLO溶液には、SLO量が0〜2μg/2x 106細胞となるよう各種濃度のSLO溶液を用いた。SLO及びFITC-Dextranを添加したK562細胞懸濁液を37℃15分インキュベーションして、細胞膜の膜穿孔とProbeの導入を行った。インキュベーション終了後、細胞懸濁液に、氷温に冷却したPBSpH7.2を1mL添加して4℃で30分間インキュベーションし、さらに終濃度10 μMとなるようにx100 濃度のPI（Propidium Iodide；シグマ社製）を加えて氷温で10分間インキュベーションした。PIはインターカレーターとして核内のDNAを染色する試薬である。PIは通常、細胞膜を透過できないため、SLOによって穿たれた細胞膜が再封入されたかを確認するために用いている。 40 μL of SLO solution containing FITC-Dextran at a final concentration of 10 μM was added to 2 × 10 6 cell pellets obtained by removing the supernatant after centrifugation. As the SLO solution, various concentrations of SLO solution were used so that the amount of SLO was 0 to 2 μg / 2 × 10 6 cells. The K562 cell suspension supplemented with SLO and FITC-Dextran was incubated at 37 ° C. for 15 minutes to perform membrane perforation of the membrane and introduction of the probe. After the incubation, add 1 mL of PBS pH 7.2 cooled to ice temperature to the cell suspension and incubate for 30 minutes at 4 ° C. Furthermore, PI (Propidium Iodide; Sigma) with a x100 concentration to a final concentration of 10 μM And incubated at ice temperature for 10 minutes. PI is a reagent that stains DNA in the nucleus as an intercalator. Since PI cannot normally pass through the cell membrane, it is used to confirm whether the cell membrane punctured by SLO has been re-encapsulated.
インキュベーション後に細胞懸濁液を遠心して上清を除き、PBSに懸濁し、遠心洗浄した。沈降した細胞塊を1mLのPBSに懸濁し、蛍光顕微鏡観察による細胞群の透過像及び蛍光像からSLOによる膜穿孔処理及び再封入の過程における細胞損傷の有無を確認した。また、同時にFACS（FACSAria；日本BD社製）により、細胞のサイズ（FSC-Height：前方散乱光）、内部構造の複雑さ（SSC-Height：側方散乱光）、細胞に取り込まれたFITC-Dextranの蛍光として測定した。また、再封入が不完全な細胞数をPIの蛍光として測定した。 After incubation, the cell suspension was centrifuged to remove the supernatant, suspended in PBS, and washed by centrifugation. The precipitated cell mass was suspended in 1 mL of PBS, and the presence or absence of cell damage in the process of membrane perforation and re-encapsulation by SLO was confirmed from the transmission image and fluorescence image of the cell group by observation with a fluorescence microscope. At the same time, FACS (FACSAria; manufactured by BD Japan), cell size (FSC-Height: forward scattered light), internal structure complexity (SSC-Height: side scattered light), FITC- Measured as fluorescence of Dextran. The number of cells with incomplete re-encapsulation was measured as PI fluorescence.
以上の測定結果より、K562細胞の膜穿孔処理によるプローブの導入効率が最も高く、かつ、不完全な膜の再封入過程による死細胞の発生が少ないと考えられる至適SLO濃度を実施毎に求めた。本実施例の条件においては、至適SLO濃度は7.5μg/2 x 106細胞であると考えられた。 Based on the above measurement results, the optimal SLO concentration, which is considered to have the highest efficiency of probe introduction by membrane perforation treatment of K562 cells and the occurrence of dead cells due to incomplete membrane re-encapsulation, is determined for each implementation. It was. Under the conditions of this example, the optimal SLO concentration was considered to be 7.5 μg / 2 × 10 6 cells.
（実施例６：K562細胞へのＷＴ1 ｍＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブの導入）
実施例１及び２で作製し、実施例３及び４で評価したＷＴ１ ｍＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブを細胞内に導入した。ＦＲＥＴプローブの導入方法は、実施例５の方法を用い、実施例５で決定した至適SLO濃度条件で行った。ただし、実施例５で用いたFITC-Dextranの代わりにＦＲＥＴプローブ（ドナープローブ及びアクセプタープローブ各々終濃度10μM）を用いた。ＦＲＥＴプローブ導入の手順は下記の通りである。遠心管１本あたり2x 106 cellのK562細胞にＦＲＥＴプローブを添加してSLOを加えて懸濁し、37℃15分間インキュベーションして膜穿孔を行った。プローブ導入を行った後、氷温PBSpH7.2を1mL加えて4℃30分間インキュベーションして再封入した。再封入した細胞を遠心して沈殿にした後、1mLのPBS pH7.2 に懸濁してFACSで解析を行った。
(Example 6: Introduction of FRET probe for detecting WT1 mRNA into K562 cells)
The FRET probe for detecting WT1 mRNA prepared in Examples 1 and 2 and evaluated in Examples 3 and 4 was introduced into the cells. The FRET probe was introduced using the method of Example 5 under the optimum SLO concentration conditions determined in Example 5. However, instead of FITC-Dextran used in Example 5, FRET probes (final concentrations of donor probe and acceptor probe each 10 μM) were used. The procedure for introducing the FRET probe is as follows. A FRET probe was added to 2 × 10 6 cells of K562 cells per centrifuge tube, SLO was added to the suspension, and the membrane was perforated by incubation at 37 ° C. for 15 minutes. After introduction of the probe, 1 mL of ice-cold PBS pH 7.2 was added, and the mixture was re-encapsulated by incubation at 4 ° C. for 30 minutes. The re-encapsulated cells were centrifuged to precipitate, then suspended in 1 mL of PBS pH 7.2 and analyzed by FACS.
（実施例７：K562細胞に導入されたＦＲＥＴプローブのフローサイトメーターによる検出）
FACS解析の条件は下記の通りである。ＦＲＥＴによるアクセプタープローブの蛍光は488nmの励起光よる655nm〜735nm（PerCP-cy5.5）の蛍光としてドナープローブの蛍光（530nm：FITC）と同時にフローサイトメーター（FACSAria:日本BD社製）で測定した。FACS内の光電子増倍管に印加する電圧はFSC300V、SSC 275V、FITC 300V、PerCP-Cy5.5 350V の条件を用いて測定を行った。
(Example 7: Detection of FRET probe introduced into K562 cells by flow cytometer)
The conditions for FACS analysis are as follows. The fluorescence of the acceptor probe by FRET was measured with a flow cytometer (FACSAria: manufactured by BD Japan) simultaneously with the fluorescence of the donor probe (530 nm: FITC) as the fluorescence of 655 nm to 735 nm (PerCP-cy5.5) by the excitation light of 488 nm. did. The voltage applied to the photomultiplier tube in the FACS was measured under the conditions of FSC300V, SSC 275V, FITC 300V, PerCP-Cy5.5 350V.
実施例６で得られたＷＴ1 ｍＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブを導入したK562細胞を用いて細胞内ＦＲＥＴを測定した。結果を図１７及び１８に示す。図１７は、各ＦＲＥＴプローブを導入した細胞のFACSの解析結果を表す図である。横軸は、ドナープローブの蛍光強度を示し、縦軸は、ＦＲＥＴによるアクセプタープローブの蛍光強度を示す。図１８は、各ＦＲＥＴプローブを導入した細胞において、アクセプタープローブの蛍光強度が10以上の細胞集団について蛍光強度の平均をプロットして比較したグラフである。これらの結果から、本実施例で用いたＦＲＥＴプローブの中で、WT1Ex1a/AプローブのＦＲＥＴによるアクセプタープローブの蛍光強度が最も強いことが分かった。したがって、特にWT1Ex1a/Aプローブは細胞内ＦＲＥＴに適していることが分かった。 Intracellular FRET was measured using K562 cells into which the FRET probe for detecting WT1 mRNA obtained in Example 6 was introduced. The results are shown in FIGS. FIG. 17 is a diagram showing FACS analysis results of cells into which each FRET probe has been introduced. The horizontal axis shows the fluorescence intensity of the donor probe, and the vertical axis shows the fluorescence intensity of the acceptor probe by FRET. FIG. 18 is a graph in which the average fluorescence intensity is plotted and compared for cell populations in which the fluorescence intensity of the acceptor probe is 10 or more in the cells into which each FRET probe is introduced. From these results, it was found that among the FRET probes used in this example, the fluorescence intensity of the acceptor probe by FRET of the WT1Ex1a / A probe was the strongest. Therefore, it was found that the WT1Ex1a / A probe was particularly suitable for intracellular FRET.
（実施例８：各種培養細胞へのＷＴ１ ｍＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブの導入と実発現量の相関）
次に、ＷＴ１ ｍＲＮＡの発現量が異なると考えられる各種の培養細胞内にWT1Ex1a/Aプローブを導入して、細胞内ＦＲＥＴによるアクセプターの蛍光強度を測定した。また併せて、培養細胞内におけるＷＴ１ ｍＲＮＡの発現量を別途リアルタイムPCRにより計測し、ＷＴ１ ｍＲＮＡの発現量とＦＲＥＴによるアクセプタープローブの蛍光強度との関係を比較した。その結果を図１９に示す。横軸は、ngのRNA当りのＷＴ１ ｍＲＮＡのコピー数を示し、縦軸は、各種培養細胞における細胞内ＦＲＥＴの蛍光強度を示す。その結果、両者の間に一定の相関が認められ、異なる細胞種間においてもＦＲＥＴによるアクセプタープローブの蛍光強度がＷＴ１ ｍＲＮＡの発現量を反映することが確認できた。したがって、ヘテロな細胞集団を含む白血球リンパ球分画に対しても、実施例１〜８で選定した条件を適用できることが示された。
(Example 8: Correlation between introduction of FRET probe for detection of WT1 mRNA into various cultured cells and actual expression level)
Next, the WT1Ex1a / A probe was introduced into various cultured cells considered to have different expression levels of WT1 mRNA, and the fluorescence intensity of the acceptor by intracellular FRET was measured. In addition, the expression level of WT1 mRNA in the cultured cells was separately measured by real-time PCR, and the relationship between the expression level of WT1 mRNA and the fluorescence intensity of the acceptor probe by FRET was compared. The result is shown in FIG. The horizontal axis represents the number of WT1 mRNA copies per ng RNA, and the vertical axis represents the fluorescence intensity of intracellular FRET in various cultured cells. As a result, a certain correlation was observed between the two, and it was confirmed that the fluorescence intensity of the acceptor probe by FRET reflects the expression level of WT1 mRNA even between different cell types. Therefore, it was shown that the conditions selected in Examples 1 to 8 can be applied to leukocyte lymphocyte fractions containing heterogeneous cell populations.
Claims (14)
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がAlexa Fluor 488であり、他方がAlexa Fluor 647であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１ ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１ ｍＲＮＡ検出プローブ。 A first oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 1 into which the first fluorescent dye has been introduced and a first oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 2 into which the second fluorescent dye has been introduced. Consisting of two oligonucleotides,
Of the first and second fluorescent dyes, one is Alexa Fluor 488, the other is Alexa Fluor 647,
In the hybrid of the first and second oligonucleotides and WT1 mRNA, the first and second fluorescent dyes are present at positions separated by 2 to 20 bases.
WT1 mRNA detection probe.
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がAlexa Fluor 488であり、他方がAlexa Fluor 647であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１ ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１ ｍＲＮＡ検出プローブ。 The first oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 3 into which the first fluorescent dye is introduced and the first oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 4 into which the second fluorescent dye is introduced. Consisting of two oligonucleotides,
Of the first and second fluorescent dyes, one is Alexa Fluor 488, the other is Alexa Fluor 647,
In the hybrid of the first and second oligonucleotides and WT1 mRNA, the first and second fluorescent dyes are present at positions separated by 2 to 20 bases.
WT1 mRNA detection probe.
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がAlexa Fluor 488であり、他方がAlexa Fluor 647であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１ ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１ ｍＲＮＡ検出プローブ。 The first oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 9 into which the first fluorescent dye has been introduced and the first oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 10 into which the second fluorescent dye has been introduced. Consisting of two oligonucleotides,
Of the first and second fluorescent dyes, one is Alexa Fluor 488, the other is Alexa Fluor 647,
In the hybrid of the first and second oligonucleotides and WT1 mRNA, the first and second fluorescent dyes are present at positions separated by 2 to 20 bases.
WT1 mRNA detection probe.
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がAlexa Fluor 488であり、他方がAlexa Fluor 647であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１ ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１ ｍＲＮＡ検出プローブ。 The first oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 11 into which the first fluorescent dye was introduced and the first oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 12 into which the second fluorescent dye was introduced. Consisting of two oligonucleotides,
Of the first and second fluorescent dyes, one is Alexa Fluor 488, the other is Alexa Fluor 647,
In the hybrid of the first and second oligonucleotides and WT1 mRNA, the first and second fluorescent dyes are present at positions separated by 2 to 20 bases.
WT1 mRNA detection probe.
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がAlexa Fluor 488であり、他方がAlexa Fluor 647であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１ ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１ ｍＲＮＡ検出プローブ。 A first oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 13 into which the first fluorescent dye has been introduced and a first oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 14 into which the second fluorescent dye has been introduced. Consisting of two oligonucleotides,
Of the first and second fluorescent dyes, one is Alexa Fluor 488, the other is Alexa Fluor 647,
In the hybrid of the first and second oligonucleotides and WT1 mRNA, the first and second fluorescent dyes are present at positions separated by 2 to 20 bases.
WT1 mRNA detection probe.
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がAlexa Fluor 488であり、他方がAlexa Fluor 647であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１ ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１ ｍＲＮＡ検出プローブ。 The first oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 15 into which the first fluorescent dye has been introduced and the first oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 16 into which the second fluorescent dye has been introduced. Consisting of two oligonucleotides,
Of the first and second fluorescent dyes, one is Alexa Fluor 488, the other is Alexa Fluor 647,
In the hybrid of the first and second oligonucleotides and WT1 mRNA, the first and second fluorescent dyes are present at positions separated by 2 to 20 bases.
WT1 mRNA detection probe.
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がAlexa Fluor 488であり、他方がAlexa Fluor 647であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１ ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１ ｍＲＮＡ検出プローブ。 The first oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 17 into which the first fluorescent dye is introduced and the first oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 18 into which the second fluorescent dye is introduced. Consisting of two oligonucleotides,
Of the first and second fluorescent dyes, one is Alexa Fluor 488, the other is Alexa Fluor 647,
In the hybrid of the first and second oligonucleotides and WT1 mRNA, the first and second fluorescent dyes are present at positions separated by 2 to 20 bases.
WT1 mRNA detection probe.
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がAlexa Fluor 488であり、他方がAlexa Fluor 647であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１ ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１ ｍＲＮＡ検出プローブ。 A first oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 19 into which the first fluorescent dye is introduced and a first oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 18 into which the second fluorescent dye is introduced. Consisting of two oligonucleotides,
Of the first and second fluorescent dyes, one is Alexa Fluor 488, the other is Alexa Fluor 647,
In the hybrid of the first and second oligonucleotides and WT1 mRNA, the first and second fluorescent dyes are present at positions separated by 2 to 20 bases.
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