JP2008178344A - 細胞培養方法及び細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞培養における培地成分を高精度に管理及び制御することができ、所望の細胞培養を達成する。
【解決手段】培養液中の状態を測定するサンプリング工程を複数回行う培養方法において、サンプリング工程間において培地成分を複数回添加するに際して、生細胞数変動量と培地成分減少量との関係に基づいて各回の添加量及び/又は添加タイミングを算出し、当該培地成分を培養液に添加する工程を含む。
【選択図】なし

Description

本発明は、例えば、医薬品等の主原料となる物質を生産する細胞を培養する際に適用される細胞培養方法及び細胞培養装置に関する。

抗体医薬をはじめとする医薬品は、細胞が産生する物質を主成分として含有している。このような物質は、例えば動物細胞により分泌生産されるため、動物細胞を培養し、培養液中に分泌された目的物質を分離精製することで得ることができる。

細胞培養における培養方式は、種細胞を摂取してから培養終了時まで何も加えない回分培養方式、培養中に制限基質を加えるが培養終了時まで培養液は抜き取らない流加培養方式、培地を連続的に加えると共に等量の培地を抜いていく連続培養法式の３種類に分類できる。工業的な大量培養にはバリデーションの容易さより回分培養法が現在多く用いられている。

細胞を用いた有用物質の生産方法においては、大量に使用する培地にかかるコストが高く、有用物質を低コストに提供することが困難である。したがって、細胞による有用物質の生産方法においては、より効率のよい培養方式が望まれている。現在主流の回分培養方式では、細胞の増殖と共に培地中の栄養源が減少し、乳酸、アンモニアなどの有害代謝産物が蓄積するため、細胞増殖期間を長く保つことができず、結果として有用物質の収率は低い。

この問題を解決するために、近年、流加培養方式が検討されている。この方式では、流加培養と流加方法を工夫する方式が提案されている。具体的には、エネルギー源の一つであるグルコースの利用と、主として乳酸代謝からＴＣＡ（tricarboxylic acid）サイクルによる完全酸化とによってエネルギー源を効率的に利用させる方式である。これにより、有害代謝産物の蓄積を防いで高密度で細胞培養を達成することができる。また、流加培養方式は、回分培養方式で使用した既存の微生物培養装置の設備、ノウハウが応用できるメリットもある。

ところで、流加培養では、有害物質の蓄積を効果的に抑えるために、グルコース及びグルタミンをはじめとする各種栄養源を低濃度に設定している。これにより有害物質の蓄積を劇的に減らすことが可能である。一方、培養対象の細胞が増殖できる最低限の栄養濃度を維持しながら培養する必要もある。このため、現実の培養プラントでは培養液中の栄養濃度を測定する必要がある。しかしながら、培地成分を測定するには約１時間程度の時間間隔が必要となり、測定結果に基づいて培地成分添加量を算出したとしても、培養液中の栄養成分を精密に制御することができないといった問題がある。

例えば、培養中の細胞数を計測し、細胞数に対して統計的に細胞が適切に培養可能な密度となるように培地供給量を制御する細胞培養システムが特許文献１に開示されている。また、赤外線等の電磁波によって培養細胞の密度を計算し、この値に基づいて培地供給量を制御する培養装置が特許文献２に開示されている。さらに、特許文献３には、培養装置の運転状態を目標値に一致するように制御し、培養中の状態（温度、pH、濁度）を分析して得られた分析値に基づいて当該目標値を変更するといった培養制御方法が開示されている。

特開２００６−１４６９３号公報 特開２００４−３０５１８０号公報 特開２００３−２３５５４４号公報

しかしながら、特許文献１〜３に開示された細胞培養システム及び方法においては、培養期間に複数回の培地成分測定を行う培養方法を前提とする技術ではなく、培養中の各種成分を厳密に制御する技術を提供するものではない。そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、細胞培養における培地成分を高精度に管理及び制御することができ、所望の細胞培養を達成することができる培養方法及び培養装置を提供することを目的とする。

上述した目的を達成した本発明は、以下を包含する。
本発明に係る培養方法は、培養液中の状態を測定するサンプリング工程を複数回行う培養方法において、サンプリング工程間において培地成分を複数回添加するに際して、生細胞数変動量と培地成分減少量との関係に基づいて各回の添加量及び/又は添加タイミングを算出し、当該培地成分を培養液に添加する工程を含んでいる。

特に、上記生細胞数変動量は、培地中の栄養成分消費量及び/又は酸素消費速度から算出することができる。なお、上記栄養成分消費量は、炭素源消費量及び炭素源の自己分解物の消費量の合算値として定義することが好ましい。

また、本発明に係る培養方法においては、サンプリング工程間における、上記培地成分を培養液に添加する回数及び添加タイミングを予め設定しておき、所定の添加時における添加量を、次の添加時までに培地成分が減少する量とすることが好ましい。

或いは、本発明に係る培養方法において、アミノ酸成分については当該アミノ酸が自己分解を起こす濃度より低い値、及び/又は炭素源成分については当該炭素源が自己分解を起こす濃度より低い値となるように、サンプリング工程間における培地成分の添加量を予め設定しておき、生細胞数変動量と培地成分減少量との関係から培地成分濃度が細胞の生育に必要な濃度に達する時間を、次回の添加タイミングとすることが好ましい。

一方、本発明によれば、上述した培養方法を実行することが可能な、培養槽と制御装置の制御により当該培養槽内に培地成分を供給する培地供給装置とを備える培養装置も提供される。

本発明により、細胞が分泌する有害物質の蓄積を低く抑えながら、細胞を高密度で培養することができる優れた細胞培養法を提供することができる。本発明に係る細胞培養方法によれば、細胞が産生する物質を低コストに製造することができる。これにより、例えば医薬品の主成分となる有用物質を低コストに生産することができる。

以下、本発明に係る細胞培養方法及び細胞培養装置を図面を参照して詳細に説明する。本発明に係る細胞培養方法は、医薬品等の主原料となる物質を生産する細胞を培養する際に適用することができる。本発明において、生産対象の物質としては、何ら限定されるものではなく、例えば抗体や酵素等のタンパク質、低分子化合物及び高分子化合物等の生理活性物質を挙げることができる。また、培養対象の細胞としては、何ら限定されるものではなく、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、細菌、酵母、真菌及び藻類等を挙げることができる。特に、本発明に係る細胞培養方法は、抗体や酵素等のタンパク質を生産する動物細胞を培養対象とすることが好ましい。

本発明を適用した細胞培養装置としては、例えば図１に示すように、培養槽１と、制御装置２の制御により当該培養槽１内に培地成分を供給する培地供給装置３とを備えている。ただし、図１に示す培養装置は、本発明に係る細胞培養方法を可能にする一つの形態であり、これに限るものではない。

培養槽１は、内部において回転可能に配設された撹拌翼４と、内部の温度を制御する加温用ヒータ５と、焼結金属から形成され培養液に気泡を供給することができる通気散気管（焼結スパージャー）６を備えている。また、図示しないが、培養槽１には、培養液の温度を測定する温度測定電極、培養液のｐHを測定するｐＨ電極、培養液の溶存酸素濃度を測定するＤＯ電極が取り付けられている。

培地供給装置３は、培養槽１とポンプ７を介して連結されている。培地供給装置３は、培養槽１に供給するための培養液（以下、フィード培地）を充填した培地供給槽８を有している。培地供給槽８は、ポンプ７に連結されている。また、培地供給装置３は、培養槽１に取り付けられたサンプリングノズル９を介して採取された培地を分析するための培養液分析計１０を備えている。さらに、サンプリングノズル９は、例えば三方弁を有しており、三方弁のうち１つを培養槽１に連結し、１つを培養液分析計１０に連結し、残りの１つを高圧スチーム発生装置１１に連結している。高圧スチーム発生装置１１は、高圧スチームをサンプリングノズル９内に供給することができる。

培地供給装置３における制御装置２には、培養液分析計１０から培地の状態に関する出力信号が入力される。また、制御装置２は、詳細を後述するように、フィード培地の添加量及び/又は添加タイミングを算出し、制御信号をポンプ７に対して出力する。

以上のように構成された培養装置は、初期培地を培養槽１内に充填した状態で所望の細胞培養を開始する。初期培地としては、特に限定されず、培養対象の細胞の種類に応じて適宜選択される。例えば、初期培地としては、アミノ酸成分、炭素源成分、ミネラル、ビタミン、血清代替成分等を含むものを挙げることができる。ここでアミノ酸成分とは、天然タンパク質を構成する２０種類のアミノ酸、シスチン、ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、O-ホスホセリン、デスモシン等を挙げることがでる。具体的に、初期培地において濃度を規定するアミノ酸としてはグルタミンであることが好ましい。また、炭素源としては、特に限定されないが、細胞培養に一般的に使用される炭素源を挙げることができる。例えば、グルコース、ラクトース、ガラクトース、ラフィノース、マンノース、セロビオース、アラビノース、キシロース、ソルビトール、フルクトース、スクロース及びマルトース等の糖類を挙げることができる。また、炭素源としては、糖類以外にもアルコールを使用しても良い。

初期培地を充填した培養槽１に培養対象の細胞を接種し、培養を開始する。このとき、培養装置では、加温用ヒータ５によって培養温度を制御することができる。具体的に培養温度の制御は、温度測定電極により培養液の温度をモニターし、加温用ヒータ５を制御することで実施可能である。また、培養液のpHの制御は、pH電極により培養液中のpHを測定し、通気散気管６に供給するガス中の炭酸ガスの濃度を増減させることにより調節する。なお、細胞が増殖して細胞数密度が高くなるとpHは酸性側にいき、炭酸ガスの調整だけでは制御できなくなる場合が生じる。この場合には、水酸化ナトリウム等のアルカリ溶液を培養液に適量添加することでｐＨの制御を行うことができる。さらに、培養液中の溶存酸素濃度は、ＤＯ電極によりモニターすることができる。そして、通気散気管６に供給するガス中の酸素濃度を増加することにより培養中に消費した酸素を適量補うことができる。なお、通気散気管６に供給するガス中の窒素濃度を増加することにより、培養液中の溶存酸素濃度を減少させることもできる。

特に、培養装置を用いた細胞培養においては、培養液の状態をモニターするために所定の間隔で複数回のサンプリングを行う。ここで、サンプリングとは、細胞培養中の培養液を培養槽１から採取して、サンプリング時点における培地成分及び生産物の濃度や生細胞数の測定等を行う処理である。具体的にサンプリングは、サンプリングノズル９を介して培養槽１内部の培養液を採取し、採取された培養液を培養液分析計１０で分析することで実行される。

ここで、サンプリングノズル９は、培養槽１と連結した三方弁及び培養液分析計１０と連結した三方弁を開けることで培養槽１内の培養液を吸引して必要量取り出し、培養液を培養液分析計１０に供給することができる。その後、サンプリング工程では、開いた三方弁を閉めるとともに、高圧スチーム発生装置１１に連結した三方弁及び培養液分析計１０と連結した三方弁を開けることで、高圧スチーム発生装置１１からサンプリングノズル９内にスチームを流し込み、サンプリングノズル９内を滅菌する。滅菌条件としては、例えば121度、20分といった条件を採用することができる。サンプリングノズル９内の滅菌処理が終了した後、サンプリングノズル９内を乾燥させる。なお、培養液分析計１０は、採取した培養液中のグルコース、グルタミン、乳酸、アンモニア、生産物の濃度や生細胞数等を測定することができる。培養液分析計１０は、１つの装置とは限らず、それぞれ専用に測定する分析器を組み合わせて使用してもよい。

このように１回のサンプリング工程には、少なくとも20以上、好ましくは40分以上、より好ましくは60分以上の時間を要する。したがって、複数回のサンプリング工程を行う場合、所定のサンプリング工程から次のサンプリング工程までの間において上述したような所定時間を要することとなる。

ところで、本培養装置では、上述したサンプリング工程間においてフィード培地を複数回に分けて所定の添加量及び添加タイミングで添加する。フィード培地の添加量及び/又は添加タイミングは、所定のサンプリング工程から次のサンプリング工程までの間における培養槽１内の生細胞数変動量と培地成分減少量との関係に基づいて制御装置２で算出される。すなわち、制御装置２は、フィード培地の各回の添加について、予め添加タイミングが設定されている場合にはフィード培地の添加量を算出し、予め添加量が設定されている場合には添加タイミングを算出し、或いは、添加タイミング及び添加量のいずれも設定されていない場合には添加量及び添加タイミングを算出する。

制御装置２は、予め設定された若しくは算出された添加量及び添加タイミングでポンプ７の動作を制御する。これにより、培地供給装置３は、培地供給槽８内のフィード培地を所望の添加量及び/又は添加タイミングで培養槽１に供給することができる。なお、培地供給槽８には、図示しないが、液面測定センサーが取り付けてあり、添加量を測定することができる。

ここで、フィード培地としては、初期培地と同じ組成であってもよいし、初期培地とは異なる組成であってもよい。特に、フィード培地としては、初期培地に含まれる炭素源及びアミノ酸源を高濃度で含む組成であることが好ましい。フィード培地が培地成分を高濃度で含む場合には、フィード培地の添加による培養液体積の増加をほとんど無視することができる。ただし、フィード培地の添加によって細胞が分泌する有害成分を希釈することを期待する場合には、培地成分を低濃度で含むフィード培地を使用しても良い。さらに、複数種類のフィード培地を準備し、細胞増殖ステージ等の細胞の状態に応じて適したフィード培地を使用しても良い。或いは、培地成分毎にフィード培地を準備し、培地成分の種類毎に独立してフィード培地を添加しても良い。

ここで、所定のサンプリング工程から次のサンプリング工程までの間における培養槽１内の生細胞数変動量は、培養液中の生細胞数を測定又は計算することによって得ることができる。

培養液中の生細胞数を測定できる場合
細胞の増殖は下記式（１）に従う。培養槽内の生細胞数の経時変化を測定し、所定のサンプリング工程時における生細胞数の増殖速度を、式（１）を利用した式（２）を用いて算出する。この増殖速度の値を用いて、次のサンプリング工程までの細胞の増殖の経時変化を予測することができる。細胞の培養時間と生細胞数との関係を、一例として図７に示す。この関係から、所定のサンプリング工程から次のサンプリング工程までの間における培養槽１内の生細胞数変動量を導くことができる。

上記の式は、培養液に対して、サンプリングの液量が十分小さく、サンプリングによる影響を無視できるものとした。サンプリングの液量が培養液の量に対して無視できない場合は、その影響を考慮して上記式に補正項を追加しても構わない。

培養液中の生細胞数を測定できない場合
培養液中の生細胞数を、上述したように直接的に測定できない場合には、溶存酸素濃度又は培地成分濃度を指標として以下のように算出することができる。
・溶存酸素を指標とする場合
培養液中の溶存酸素を測定し、酸素量の時間変動量を導く。酸素消費速度と生細胞数は非常に高い相関関係を有するため、測定した酸素量の時間変動量を相関式に外挿することより、所定のサンプリング工程から次のサンプリング工程までの間における培養槽１内の生細胞数変動量を算出することができる。
・培地成分を指標とする場合
培地成分の濃度から生細胞数を予測することができる。培地成分としては、グルコース等の炭素源及びグルタミン等のアミノ酸源を挙げることができる。具体的には、培養液中のグルコース濃度、乳酸濃度を測定することで、生細胞数を求めることができる。時刻ｔ_ｎ（n回目のサンプリング）におけるグルコース消費量Q_{Glc n}及び乳酸消費量は次の式により算出できる。

上記の式は、培養液に対して、サンプリングの液量が十分小さく、サンプリングによる影響を無視できるものとした。サンプリングの液量が培養液の量に対して無視できない場合は、その影響を考慮して上記式に補正項を追加しても構わない。

生細胞数の時間積分と、グルコース消費量及び乳酸消費量の合計との間には図３に示す比例関係が成り立つ。したがって、所定のサンプリング工程時におけるグルコース消費量及び乳酸消費量をこの比例関係に外挿することによって、所定のサンプリング工程から次のサンプリング工程までの間における培養槽１内の生細胞数変動量を算出することができる。測定点の誤差の影響を少なくするために、カルマンフィルタ等の処理を行ってもよい。

このようにして、所定のサンプリング工程から次のサンプリング工程までの間において、培養液中の生細胞数変動量を測定或いは算出する。次に、測定或いは算出された生細胞数変動量から、複数回に分割して添加するフィード培地の添加量及び/又は添加タイミングを決定する。すなわち、制御装置２は、例えば図４に示すような、グルタミン消費量と生細胞数の時間積分値との相関関係及びフィード培地に含まれる培地成分濃度値から、所定のサンプリング工程から次のサンプリング工程までの間において補完すべき培地成分量を算出する。特に、本発明の細胞培養方法及び細胞培養装置では、フィード培地を１回添加することで培地成分を補完するのではなく、フィード培地の添加を複数回に分割して添加している。フィード培地を１回添加することで培地成分を補完すると、添加直後の培養液においては培地成分が急激に高濃度となり、細胞の生育に有害な物質の産生が促進されてしまう。これに対して、本発明によれば、フィード培地の添加を複数回に分割することで、細胞の生育に必要な量の培地成分を維持しつつ、細胞の生育に有害な物質の産生を抑制することができる。

例えば、培地成分のうちアミノ酸源及び炭素源は、培地中に高濃度に存在するとそれぞれアンモニア及び乳酸といった細胞の生育に有害な物質に自己分解されることとなる。よって、本発明において、一回のフィード培地添加により増加するアミノ酸濃度及び炭素源濃度は、それぞれアミノ酸及び炭素源が自己分解を受ける濃度以下となるように設定することが好ましい。

ここで、アミノ酸及び炭素源が自己分解を受ける濃度とは、培養対象の細胞が産生する分解酵素によってアミノ酸及び炭素源が代謝される過程で有害代謝物質が生産され始める濃度である。有害代謝物質の蓄積量は、培地中のアミノ酸濃度及び炭素源濃度に依存して増加する。したがって、培地中の有害代謝物質の蓄積量を定量することによって、アミノ酸及び炭素源について自己分解を受ける濃度をそれぞれ一義的に決定することができる。なお、自己分解を受ける濃度は、アミノ酸の種類、炭素源の種類、細胞の種類及び培養条件によって異なる値となるが、特定のアミノ酸、炭素源、細胞及び培養条件とすることによって一意に決定することができる。例えば、アミノ酸としてグルタミン、細胞として結腸直腸癌由来のＴＨ２９細胞株を使用した場合、以下のように有害代謝物質であるアンモニアの蓄積量とグルタミン濃度との関係を決定することができる。すなわち、ＴＨ２９細胞をトリスバッファーで洗浄後、23G注射針に５回出し入れすることにより細胞を破砕する。この液に所定濃度のグルタミンを含んだK₂HPO₄液（pＨ8.0）を加え30分間インキュベーションを行い、氷冷したトリクロロ酢酸を添加することによって反応を停止する。その後、溶液中のアンモニア濃度をアンモニア分析計（例えばBioProfileTM；nova社）で測定する。各グルタミン濃度でのアンモニア量をグラフにプロットすることで、その細胞でのグルタミナーゼの活性に由来する、アンモニアの蓄積量とグルタミン濃度との関係を決定することができる（参考：Turner A, McGivan JD. "Glutaminase isoform expression in cell lines derived from human colorectal adenomas and carcinomas." Biochem J. 2003 Mar 1;370(Pt 2):403-408）。

より具体的に、フィード培地の添加回数及び添加タイミングを予め設定している場合、制御装置２は、例えば図４に示すような、グルタミン消費量と生細胞数の時間積分値との相関関係に基づいて、所定の添加時における添加量を、次の添加時までに培地成分が減少する量として算出することができる。これにより、所定のサンプリング工程から次のサンプリング工程までの間において、フィード培地を複数回に分割して添加したとしても、細胞の生育に必要な培地成分が枯渇することを防止できる。

また、フィード培地の添加量を、フィード培地添加後の培養液におけるアミノ酸成分濃度及び炭素源濃度がそれぞれ自己分解を起こす濃度より低い値となるように予め設定している場合、制御装置２は、例えば図４に示すような、グルタミン消費量と生細胞数の時間積分値との相関関係に基づいて、培養液中のグルタミン濃度が減少することによって細胞の生育に必要な濃度の下限値に達する時間を次回の添加タイミングとするように、フィード培地の添加タイミングを算出することができる。

さらに、制御装置２は、フィード培地添加後の培養液におけるアミノ酸成分濃度及び炭素源濃度がそれぞれ自己分解を起こす濃度より低い値で、且つ、細胞の生育に必要な培地成分濃度の下限値以上の範囲を維持するように、フィード培地の添加量及び添加タイミングを算出することもできる。この場合においても、例えば図４に示すような、グルタミン消費量と生細胞数の時間積分値との相関関係に基づいてフィード培地の添加量及び添加タイミングを算出する。

なお、上述したように、フィード培地の添加量及び/又は添加タイミングは、例えば図４に示すような、グルタミン消費量と生細胞数の時間積分値との相関関係及び予め入力されたフィード培地の培地成分濃度値に基づいて算出されるが、この相関関係は、あらかじめ実験で求めておいたデータを使用しても良いし、又はモニタリング工程で得られたデータに基づいて算出してもよい。また、図４に示したようなグルタミン消費量と生細胞数の時間積分値との相関関係によれば、図４に記載した傾きｋが培養時間により変化することが理解できる。しかしながら、図４に示した相関関係において各プロットの時間間隔は１２時間であり、サンプリング工程の間隔が１時間程度の場合、傾きｋの時間変化は小さく、その値の変化は無視できる。そのため、各サンプリング工程における培養液の分析値より生細胞数を求めるとともに生細胞数変動量を求め、これらｋ値と生細胞数変動量を用いて、次のサンプリングまでに消費する培地成分量を正確に予測することができる。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕
（流加培養用の培地の調製）
流加培養用の培地は培養開始時に用いる初期培地と細胞による栄養消費を補うための添加培地（フィード培地）の２種類を用意した。初期培地は、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、血清代替成分より構成され、アミノ酸の各成分は細胞の成長に必要な最低限の濃度で調製した。フィード培地に関しては、細胞が増殖する際に消費するアミノ酸及びグルコースの量の比を、細胞内代謝を考慮した化学量論的手法で算出した。このように設計したフィード培地では、消費する栄養素のうちの１種類をモニタリングし、その消費量にあわせてフィード培地を添加し培養液中の濃度を調整することで、他の栄養素も同時に濃度調整される。本実験ではフィード培地は１種類である。本実験では添加培地により増加した培養体積の影響は無視できるようにフィード培地の各成分の濃度は可能な限り高濃度にした。

（フィード培地の添加法）
培養液中のグルタミン濃度を測定し、グルタミンの自己分解の影響の比較的小さい0.8ｍMの値を上限とし、グルタミンの消費した分だけフィード培地を添加することとした。フィード培地の添加方法としては、一度に0.8mＭまで戻す添加法（以下添加法Ｉ）と、添加する量は添加法Ｉと同じであるが、次のサンプリングまで複数回に分割して添加する添加法（以下、添加法II）を採用した。添加法Iと添加法IIによる、培養時間とグルタミン濃度との関係を図５に示した。

（１Ｌバイオリアクターによる流加培養）
本実施例ではマウスマウスハイブリドーマであるCRL-1606細胞を用いた。この細胞は抗フィブロネクチン抗体を分泌する浮遊系の細胞である。

本実施例で使用した培養装置を模式的に図６に示す。図６に示すように、培養装置は、１Ｌの培養槽１０１と、ヒータ１０２と、通気散気管１０３と、マグネットスターラー１０４と、サンプリング管１０５と、バルブ１０６と、ペリスタポンプ１０７と、電子天秤１０８と、フィード培地１０９と、フィルター１１０と、制御装置１１１と、コンピュータ１１２とを備えている。なお、培養装置において、コンピュータ１１２には、培地成分濃度データ、生細胞数データ、フィード培地濃度データ、培地成分濃度及び生細胞数の積分値の相関関係データ等が入力される。制御装置１１１は、コンピュータ１１２に入力された各種データに基づいてフィード培地の添加量及び/又は添加タイミングをポンプ１０７を介して制御する。本培養装置においては、電子天秤１０８上にフィード培地１０９を置き、電子天秤の変化によりフィード培地の添加量を読み取ることができる。

本実施例では、先ず、１Ｌの培養槽１０１に上記設計した初期培地を750ｍＬ張り込み、CRL-1606細胞の懸濁液を50mL添加することにより、最終細胞数密度1.5×10⁵個/ｍＬで800mLとした。培養では、溶存酸素60％飽和空気、ｐＨ7.2、温度37℃と一定になるように制御を行った。

サンプリング管１０５より１２時間に一度、培養槽１０１から無菌的にサンプリングを行い、そのサンプル中のグルタミン、グルコース、細胞数、生存率、アンモニア、乳酸、抗体を測定した。グルタミン、グルコース、乳酸の測定はバイオセンサBF-4（王子計測機器）を用いて測定した。細胞数はコールターカウンタを用い、生存率は細胞をトリパンブルーで染色し、血球計算盤を用いて計数した。アンモニアの定量では、アンモニア定量キットであるアンモニアテストワコー（和光純薬）を用いて定量した。抗体の定量では、ＥＬＩＳＡ法を用いて定量を行った。

サンプリングにより培養液中のグルタミン濃度を測定した後、この値をもとに、フィード培地の添加量を決定し、先に記述した添加法Iもしくは添加法IIとして予め設定した添加タイミングにより、フィード培地の添加を行った。

（実験結果）
単位時間単位細胞あたりのアンモニア及び乳酸量を図７に示す。図７に示すように、添加法IIでは、添加法Iに比べ、単位時間単位細胞あたりの乳酸の分泌が低く抑えられた。また、培養日数と生細胞数密度との関係を図８に示した。図８に示すように、生細胞数の増殖は添加法IIをとることにより、添加法Iに比べ細胞の増殖速度が速くなり、また最大生細胞数も向上した。

また、産生抗体量を測定した結果を図９に示した。図９に示すように、添加法IIをとることにより、添加法Iと比較して産生抗体量が約５割向上した。また、生細胞数の時間積分と抗体生産量との関係を図１０に示した。図１０に示すように、生細胞数の時間積分をみると、添加法IIの方が若干大きくなっており（図１０矢印）、また、単位時間単位細胞数あたりの抗体の生産量（図１０中のグラフの傾き）も高くなっている。これは、添加法IIのようにフィード培地を複数回に分割して添加することにより、乳酸分泌量を抑えることができ、その結果、生細胞数の向上及び、単位時間単位細胞あたりの抗体の生産性も向上できることを示している。

なお、本実施例では、グルタミン消費量を指標としてフィード培地の添加量を決定したが、添加培地中の他の栄養素を指標としても同等の効果が得られ、先に述べた効果はグルタミンに限るものではない。

本発明を適用した細胞培養装置の一例を示す模式図である。 生細胞数の増殖曲線を示す図である。 グルコース消費量と乳酸消費量の合計と生細胞数の時間積分との関係を示す図である。 グルタミン消費量と生細胞数の時間積分との関係を示す図である。 実施例で行ったフィード培地の添加方法を示す図であり、(a)は添加法Iによりフィード培地を添加する際のグルタミン濃度の経時変化を示す図であり、(b)は添加法IIによりフィード培地を添加する際のグルタミン濃度の経時変化を示す図である。 実施例で使用した１L培養槽を用いた細胞培養装置の構成を示す模式図である。 単位時間単位細胞数のアンモニア及び乳酸の分泌量を示す図である。 添加法I及び添加法IIにおける生細胞数の増殖曲線を示す図である。 添加法I及び添加法IIにおける生産抗体量の経時変化を示す図である。 生産抗体量と生細胞数の時間積分との関係を示した図である。

符号の説明

１…培養槽、２…制御装置、３…培地供給装置、４…撹拌翼、５…加温用ヒータ、６…通気散気管、７…ポンプ、８…培地供給槽、９…サンプリングノズル、１０…培養液分析計、１１…高圧スチーム発生装置、１０１…1L培養槽、１０２…加温用ヒータ、１０３…通気散気管、１０４…マグネットスターラー、１０５…サンプリング管、１０６…バルブ、１０７…ペリスタポンプ、１０８…電子天秤、１０９…フィード培地、１１０…通気フィルタ、１１１…制御装置、１１２…コンピュータ、１１３…撹拌翼

Claims (14)

1. 培養液中の状態を測定するサンプリング工程を複数回行う培養方法において、
   サンプリング工程間において培地成分を複数回添加するに際して、生細胞数変動量と培地成分減少量との関係に基づいて各回の添加量及び/又は添加タイミングを算出し、当該培地成分を培養液に添加する工程を含む、培養方法。
2. 上記生細胞数変動量は、培地中の栄養成分消費量及び/又は酸素消費速度から算出することを特徴とする請求項１記載の培養方法。
3. 上記栄養成分消費量は、炭素源消費量の合算値であることを特徴とする請求項２記載の培養方法。
4. 上記生細胞数変動量は、下記式（１）〜（３）によって算出される生細胞数から求められることを特徴とする請求項１記載の培養方法。
   

   
5. 添加する培地成分は、アミノ酸成分及び/又は炭素源成分であることを特徴とする請求項１記載の培養方法。
6. サンプリング工程間における、上記培地成分を培養液に添加する回数及び添加タイミングを予め設定しておき、所定の添加時における添加量を、次の添加時までに培地成分が減少する量とすることを特徴とする請求項１記載の培養方法。
7. アミノ酸成分については当該アミノ酸が自己分解を起こす濃度より低い値、及び/又は炭素源成分については当該炭素源が自己分解を起こす濃度より低い値となるように、サンプリング工程間における培地成分の添加量を予め設定しておき、生細胞数変動量と培地成分減少量との関係から培地成分濃度が細胞の生育に必要な濃度に達する時間を、次回の添加タイミングとすることを特徴とする請求項１記載の培養方法。
8. 培養槽と、制御装置の制御により当該培養槽内に培地成分を供給する培地供給装置とを備え、
   培養液中の状態を測定する複数回のサンプリング工程が実行され、サンプリング工程間において培地成分を複数回添加するに際して、上記制御装置は、生細胞数変動量と培地成分減少量との関係に基づいて各回の添加量及び/又は添加タイミングを算出して上記培地供給装置を制御する、培養装置。
9. 上記制御装置は、上記生細胞数変動量を培地中の栄養成分消費量及び/又は酸素消費速度から算出することを特徴とする請求項８記載の培養装置。
10. 上記制御装置は、上記栄養成分消費量を炭素源消費量の合算値として算出することを特徴とする請求項９記載の培養装置。
11. 上記制御装置は、上記生細胞数変動量を下記式（１）〜（３）によって算出される生細胞数から求めることを特徴とする請求項８記載の培養装置。
    

    
12. 上記培地供給装置は、アミノ酸成分及び/又は炭素源成分を含む培地成分を供給することを特徴とする請求項８記載の培養装置。
13. サンプリング工程間における、上記培地成分を培養液に添加する回数及び添加タイミングを予め設定しておき、上記制御装置は、所定の添加時における添加量を、次の添加時までに培地成分が減少する量として制御することを特徴とする請求項８記載の培養装置。
14. アミノ酸成分については当該アミノ酸が自己分解を起こす濃度より低い値、及び/又は炭素源成分については当該炭素源が自己分解を起こす濃度より低い値となるように、サンプリング工程間における培地成分の添加量を予め設定しておき、上記制御装置は、生細胞数変動量と培地成分減少量との関係から培地成分濃度が細胞の生育に必要な濃度に達する時間を、次回の添加タイミングとするように制御することを特徴とする請求項８記載の培養装置。

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