JP2008157724A - Analysis method for sugar chain-containing specimen - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、糖鎖含有試料の解析方法に関する。より具体的には、糖タンパク質、及びその糖鎖の解析方法に関する。 The present invention relates to a method for analyzing a sugar chain-containing sample. More specifically, the present invention relates to a glycoprotein and a method for analyzing the sugar chain.
タンパク質には、翻訳後に修飾を受けることで機能を発揮するものがある。そのためポストゲノム研究においては、修飾部分に起因する機能の解析が重要である。また、真核細胞由来のタンパク質の翻訳後修飾の中で最も多いのが糖鎖による修飾反応であること、そして真核細胞由来のタンパク質の５０％以上のものには糖鎖が付加されていることから、糖鎖解析はプロテオーム研究において重要な領域とされている。 Some proteins exert their functions by being modified after translation. Therefore, in post-genome research, it is important to analyze the functions attributable to the modified portion. In addition, the most frequent post-translational modification of proteins derived from eukaryotic cells is a modification reaction with sugar chains, and sugar chains are added to more than 50% of proteins derived from eukaryotic cells. Therefore, sugar chain analysis is an important area in proteome research.
実際の糖鎖解析では、タンパク質を修飾している糖鎖部分がどのような成分から構成されているのか、そしてタンパク質のどの部位に糖鎖がいくつ付加されているのかが調べられる。また、糖鎖は細胞間認識や接着といった現象に関与していることから、糖（糖リガンド）と糖レセプターとの相互作用を解析することも行われている。例えば特許文献１においては、表面プラズモン共鳴法を使って、糖鎖とレクチンとの相互作用が測定・解析されている。
特許文献１に開示されている表面プラズモン共鳴法においては、糖鎖又は糖レセプターの何れかを、測定前に固相化する必要がある。また、この文献では糖鎖に蛍光標識を行い、標的物（レクチン）との間の相互作用を蛍光偏光度の計測により解析し、更に液体クロマトグラフィーによる２次元マッピング法により糖鎖構造を明らかにしている。従って、測定前の前処理（標識化・固相化）のみならず、測定そのものも煩雑であり、スループットがよくないという問題がある。そのため表面プラズモン共鳴法は一般に、多種・多量の試料の迅速な解析には不向きであるという問題が存在している。
In the surface plasmon resonance method disclosed in
解析のためには解析対象を大量に準備する必要がある。しかしながら大腸菌を使った通常のタンパク質大量合成においては、糖鎖を付加することができないため、糖タンパク質を解析対象とする場合には、これを生体から抽出してくる必要がある。しかしながら天然物由来の糖の分離・精製は、糖鎖の構造の複雑性ゆえに、煩雑且つ長時間を要することが多い。また、測定用に蛍光標識を解析対象に付加する場合には、付加反応により糖タンパク質の生理機能が失活してしまうことがある。その場合、糖鎖の解析が十分に行えないという問題もある。更に、多様な糖鎖を有する糖タンパク質群の中から、特定種類の糖鎖を有するものをスクリーニングすることは、スループットの観点からは従来の方法では困難である。
このような点に鑑み、簡便であり、少量の試料であっても確実に、更に多種類の試料を取り扱う場合であっても迅速に、且つ糖タンパク質がネイティブな状態のまま解析できる手法が望まれている。
For analysis, it is necessary to prepare a large number of analysis objects. However, in general protein mass synthesis using Escherichia coli, a sugar chain cannot be added. Therefore, when a glycoprotein is to be analyzed, it must be extracted from a living body. However, separation and purification of sugars derived from natural products are often complicated and require a long time due to the complexity of the structure of sugar chains. In addition, when a fluorescent label is added to an analysis target for measurement, the physiological function of the glycoprotein may be deactivated by the addition reaction. In that case, there is also a problem that the sugar chain cannot be sufficiently analyzed. Furthermore, it is difficult to screen for those having a specific type of sugar chain from a group of glycoproteins having various sugar chains from the viewpoint of throughput.
In view of these points, it is desirable to provide a method that is simple, reliable even with a small amount of sample, and capable of analyzing a glycoprotein in its native state quickly even when handling many types of samples. It is rare.
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、具体的には下記の構成をとる。
（I） （１）糖鎖を含む解析対象と、当該糖鎖に特異的に結合する糖レセプターを光学的に検出可能な標識で適宜ラベルしたものとを接触させ、当該糖鎖と糖レセプターからなる複合体を形成させる工程；
（２）当該複合体の検出に適する波長の光を当該複合体に照射する工程；及び
（３）当該複合体からの信号を計測する工程；
を含む、糖鎖の解析方法。
The present invention has been made in view of the above circumstances, and specifically has the following configuration.
(I) (1) An analysis target including a sugar chain is brought into contact with a sugar receptor that is specifically labeled with an optically detectable label for a sugar receptor that specifically binds to the sugar chain. Forming a complex comprising:
(2) irradiating the complex with light having a wavelength suitable for detection of the complex; and (3) measuring a signal from the complex;
A method for analyzing sugar chains.
（II） （ａ）糖鎖を含む解析対象中の糖鎖に特異的に結合する糖レセプターを光学的に検出可能な標識で適宜ラベルしたものに、当該糖レセプターの検出に適する波長の光を照射する工程；
（ｂ）当該糖レセプターからの信号を計測する工程；
（ｃ）上記工程（ｂ）後の糖レセプターに、当該糖鎖を含む解析対象を接触し、当該糖鎖及び当該糖レセプターからなる複合体を形成する工程；
（ｄ）上記工程（ａ）と同一波長の光を当該複合体に照射する工程；及び
（ｅ）当該複合体からの信号を計測する工程；
を含む、糖鎖の解析方法。
(II) (a) A sugar receptor that specifically binds to a sugar chain in an analysis target containing a sugar chain is appropriately labeled with an optically detectable label, and light having a wavelength suitable for detection of the sugar receptor is applied. Irradiating;
(B) measuring a signal from the sugar receptor;
(C) a step of contacting the sugar receptor after the step (b) with an analysis target containing the sugar chain to form a complex composed of the sugar chain and the sugar receptor;
(D) a step of irradiating the complex with light having the same wavelength as in the step (a); and (e) a step of measuring a signal from the complex;
A method for analyzing sugar chains.
（III） （４）上記糖鎖と同一種類の糖鎖であって濃度既知のものにより予め作成された検量線に基づき、上記工程（３）で計測した値から検出対象中の糖鎖を定量する工程；を更に含む、前記（I）に記載の糖鎖の解析方法。 (III) (4) Quantifying the sugar chain in the detection target from the value measured in the above step (3) based on a calibration curve prepared in advance with a sugar chain of the same type as the sugar chain and having a known concentration The method for analyzing a sugar chain according to (I), further comprising the step of:
（IV） 前記糖レセプターは、特定の糖鎖に対して特異的に結合する複数種類の糖レセプターの集合であり、且つ分光特性が互いに有意に異なる、光学的に検出可能な標識でそれぞれラベルされたものであり；更に、
前記工程（１）又は（ｃ）において、
前記糖レセプターと前記解析対象との接触を、複数の糖レセプターについて同一の反応系内で行う、前記（I）又は（II）に記載の糖鎖の解析方法。
(IV) The sugar receptor is an assembly of a plurality of types of sugar receptors that specifically bind to a specific sugar chain, and each is labeled with an optically detectable label that has significantly different spectral characteristics. And moreover,
In the step (1) or (c),
The method for analyzing a sugar chain according to (I) or (II), wherein the sugar receptor and the analysis target are contacted in the same reaction system for a plurality of sugar receptors.
（V） 前記光学的に検出可能な標識が蛍光標識であり、
前記工程（３）又は（ｅ）の信号の計測が蛍光相互相関解析（ＦｘＣＳ）により行われる、前記（IV）に記載の糖鎖の解析方法。
(V) the optically detectable label is a fluorescent label;
The method for analyzing a sugar chain according to (IV), wherein the measurement of the signal in step (3) or (e) is performed by fluorescence cross-correlation analysis (FxCS).
（VI） ＦｘＣＳにより相互相関が観測されなかったことが判明した後に、
（Ｘ）各標識からの信号をＦＣＳにより解析する工程；
を行うことを含む、前記（V）に記載の糖鎖の解析方法。
(VI) After it was found that no cross-correlation was observed by FxCS,
(X) analyzing the signal from each label by FCS;
The method for analyzing a sugar chain according to the above (V), comprising:
（VII） 前記糖レセプターが基体に固相化されている、前記（I）又は（II）に記載の糖鎖の解析方法。 (VII) The method for analyzing a sugar chain according to (I) or (II), wherein the sugar receptor is immobilized on a substrate.
（VIII） 異なる濃度の二種類の蛍光色素の組合せで標識されたビーズの組合せである基体のそれぞれに、結合特異性の異なる糖レセプターがそれぞれ固相化され；
前記工程（１）と（２）の間、又は前記工程（ｃ）と（ｄ）の間において、
（Ｙ）前記糖レセプターが認識する部位とは異なる、解析対象上の糖鎖以外の部位を特異的に認識する抗体を、当該ビーズの標識に用いられている蛍光色素の組合せの分光学的性質とは異なる分光学的性質を有する蛍光色素によりラベルしたものを、前記複合体を含む反応系に添加する工程；
を更に含み；
前記工程（３）又は（ｅ）において、当該ビーズからの蛍光と当該抗体からの蛍光について蛍光相互相関分析（ＦｘＣＳ）を行う、前記（V）に記載の糖鎖の解析方法。
(VIII) Sugar receptors having different binding specificities are immobilized on each of the substrates, which are combinations of beads labeled with a combination of two kinds of fluorescent dyes at different concentrations;
Between the steps (1) and (2) or between the steps (c) and (d),
(Y) Spectroscopic properties of a combination of fluorescent dyes used for labeling the antibody, which specifically recognizes a site other than the sugar chain on the analysis target, which is different from the site recognized by the sugar receptor Adding a label labeled with a fluorescent dye having a spectroscopic property different from that to the reaction system containing the complex;
Further comprising;
The sugar chain analysis method according to (V), wherein in the step (3) or (e), fluorescence cross-correlation analysis (FxCS) is performed on fluorescence from the beads and fluorescence from the antibodies.
（IX） （１’）以下の三種類：
（ｉ）解析対象の糖鎖；
（ｉｉ）当該糖鎖に特異的に結合する複数種類の第１レセプターの集合のそれぞれを、異なる濃度の二種類の蛍光色素の組合せで標識されたビーズの組合せである基体のそれぞれに固相化したもの；及び
（ｉｉｉ）当該第１レセプターの認識部位とは異なる、当該解析対象上の糖鎖以外の部位を特異的に認識する第２レセプターに、前記二種類の蛍光色素の組合せとは分光学的性質のことなる蛍光標識を付加したもの；
を接触することにより、解析対象含有試料を調製する工程；
（２’）当該解析対象含有試料に対し、当該標識の検出に適した波長の光を照射する工程；
（３’）当該混合物からの信号を蛍光相互相関分析（ＦｘＣＳ）により解析する工程；
を含む糖鎖の解析方法。
(IX) (1 ') The following three types:
(I) sugar chain to be analyzed;
(Ii) Immobilizing each of a plurality of types of first receptor aggregates that specifically bind to the sugar chain on each of the substrates that are combinations of beads labeled with a combination of two types of fluorescent dyes at different concentrations And (iii) a combination of the two types of fluorescent dyes is different from the recognition site of the first receptor, which is different from the recognition site of the first receptor and specifically recognizes a site other than the sugar chain on the analysis target. With a fluorescent label with different optical properties;
A step of preparing a sample to be analyzed by contacting the sample;
(2 ′) a step of irradiating the analysis target-containing sample with light having a wavelength suitable for detecting the label;
(3 ′) analyzing the signal from the mixture by fluorescence cross-correlation analysis (FxCS);
For analyzing sugar chains containing
（X） 前記糖レセプター又は前記第１レセプターがレクチンである、前記（I）、（II）、又は（XI）に記載の糖鎖の解析方法。 (X) The method for analyzing a sugar chain according to (I), (II), or (XI), wherein the sugar receptor or the first receptor is a lectin.
（XI） 前記光学的に検出可能な標識が蛍光標識である、前記（I）又は（II）に記載の糖鎖の解析方法。 (XI) The method for analyzing a sugar chain according to (I) or (II), wherein the optically detectable label is a fluorescent label.
（XII） 前記工程（３）又は（ｅ）における信号の計測が、検出対象を含む複合体についての、並進拡散時間、１分子当たりの蛍光強度、蛍光偏光度、散乱、の変化についての計測である、前記（I）又は（II）に記載の糖鎖の解析方法。 (XII) The measurement of the signal in the step (3) or (e) is a measurement of changes in translational diffusion time, fluorescence intensity per molecule, fluorescence polarization degree, and scattering of the complex including the detection target. The method for analyzing a sugar chain according to (I) or (II).
（XIII） 前記工程（３）又は（ｅ）における信号の計測が、自己相関関数解析（ＦＣＳ）、蛍光強度分布解析（ＦＩＤＡ）、蛍光偏光度解析（ＦＩＤＡ−ＰＯ）、又は散乱解析により行われる、前記（I）又は（II）に記載の糖鎖の解析方法。 (XIII) Signal measurement in the step (3) or (e) is performed by autocorrelation function analysis (FCS), fluorescence intensity distribution analysis (FIDA), fluorescence polarization degree analysis (FIDA-PO), or scattering analysis. The method for analyzing a sugar chain according to (I) or (II).
本発明の解析方法においては糖鎖ではなく糖レセプターを適宜標識化する。また複数種類の糖レセプターを同一反応系にて使用することが可能である。これらに起因して、試料が微量にしか入手できない場合においても、更に多種類の試料を対象とする場合においても、効果的且つ迅速に糖鎖の解析を行うことが可能である。 In the analysis method of the present invention, not a sugar chain but a sugar receptor is appropriately labeled. Multiple types of sugar receptors can be used in the same reaction system. As a result, even when only a very small amount of sample is available, or when more types of samples are targeted, it is possible to analyze sugar chains effectively and quickly.
本発明の糖鎖の解析方法は、（１）糖鎖を含む解析対象と、当該糖鎖に特異的に結合する糖レセプターを光学的に検出可能な標識で適宜ラベルしたものとを接触させ、当該糖鎖と糖レセプターからなる複合体を形成させる工程；（２）当該複合体の検出に適する波長の光を当該複合体に照射する工程；及び（３）当該複合体からの信号を計測する工程；を含むものである。
工程（１）においては、糖鎖を含む解析対象ではなく糖レセプターを適宜標識する。そのため、微量にしか存在しないか、又は存在するかどうか不明の糖鎖含有試料を標識するといった不確実な作業を行う必要がなくなる。糖鎖含有試料と糖レセプターとから形成される複合体は、糖レセプター単独時とは異なる光学的性質を帯び、及び/又は異なる光学的挙動をとる。従って、工程（２）においては当該性質又は当該挙動の検出に適した波長の光を照射し、次いで工程（３）で複合体からの信号を適切な手段により計測することにより、当該複合体の存在やその性質についての情報を入手することが可能になる。
The sugar chain analysis method of the present invention comprises: (1) an analysis target containing a sugar chain and a sugar receptor that specifically binds to the sugar chain is appropriately labeled with a label that can be optically detected; Forming a complex comprising the sugar chain and a sugar receptor; (2) irradiating the complex with light having a wavelength suitable for detection of the complex; and (3) measuring a signal from the complex. A process.
In step (1), a sugar receptor is appropriately labeled instead of an analysis target containing a sugar chain. Therefore, it is not necessary to perform an uncertain operation such as labeling a sugar chain-containing sample that exists only in a minute amount or is unknown. A complex formed from a sugar chain-containing sample and a sugar receptor has optical properties different from those of a sugar receptor alone and / or takes different optical behavior. Therefore, in the step (2), light of a wavelength suitable for the detection of the property or the behavior is irradiated, and then the signal from the complex is measured by an appropriate means in the step (3). It becomes possible to obtain information about existence and its nature.
本願発明の方法において解析対象とすることができる糖鎖含有試料は、糖鎖を含む試料であれば特に限定されないが、主として真核細胞由来の糖タンパク質を挙げることができる。細胞からの抽出物及び遺伝子工学的手法により真核細胞において産製したものの何れをも対象とすることができる。しかし本発明の解析方法においては、糖鎖を含む試料を標識化することなく測定・解析できるので、微量にしか入手できない天然由来のものを対象とする場合に特にその効果を発揮する。 The sugar chain-containing sample that can be analyzed in the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a sample containing a sugar chain, but mainly includes eukaryotic cell-derived glycoproteins. Both extracts from cells and those produced in eukaryotic cells by genetic engineering techniques can be targeted. However, in the analysis method of the present invention, a sample containing a sugar chain can be measured and analyzed without labeling, so that the effect is particularly exerted when a naturally derived one that is available only in a trace amount is targeted.
本願発明の方法において使用することができる糖レセプターとしては、糖鎖を特異的に認識できる蛋白質等を挙げることができる。より具体的には、レクチン、抗体等である。入手及び標識化の容易性の観点からは、レクチンが好ましい。レクチンは、その種類によって認識する糖鎖の構造が異なり、例えばConA（コンカナバリンA）はマンノース結合型、LCA（レンチルレクチン）はフコース結合型、WGA（小麦胚芽アグルチニン）はN-アセチルグルコースアミン結合型である。これらのレクチンには、光学的に検出可能な標識、例えば当該技術分野で知られる蛍光標識を使い、公知の方法により適宜ラベル化を施しておく。使用可能な蛍光標識の種類としては、Rhodamine Green、AlexaFluoro488、TAMRA、TRITC、DY630、AlexaFluoro647等の商品名又は慣用名で販売されるものを挙げることができるが、これら以外のものも利用することができる。あるいは、市販されている蛍光標識化済のレクチンを使用することも可能である。更には分子生物学的な手法において、例えば非天然アミノ酸をアンバーコドン又は４塩基コドンなどの配列に対応させ、そのコドンに対応した蛍光標識ｔRNAを用いることで、レクチンの蛍光標識化を行うことも可能である。この場合、レクチン１分子当たりの蛍光分子数を予め決定し、その設計に沿ったものを調製することが可能である。そのため蛍光強度分布解析においては、糖蛋白質に結合する蛍光標識レクチンの数を正確に定量することが可能になる。また、糖レセプターを遺伝子工学的に産製させたものとする場合には、予めGFP（緑色蛍光蛋白質）やRFP（赤色蛍光蛋白質）等の蛍光性蛋白質との融合蛋白質を作製し、適宜分離・精製したものを標識化済糖レセプターとして利用することも可能である。
尚、上記では複合体検出のために糖レセプターをラベル化したが、当該検出を複合体からの散乱光の検出により行う場合には、ラベル化の必要はない。
Examples of sugar receptors that can be used in the method of the present invention include proteins that can specifically recognize sugar chains. More specifically, they are lectins and antibodies. From the viewpoint of availability and labeling, lectins are preferred. The structure of sugar chains recognized by lectins varies depending on the type, for example, ConA (Concanavalin A) is mannose-linked, LCA (lentil lectin) is fucose-linked, and WGA (wheat germ agglutinin) is N-acetylglucosamine-linked. It is a type. These lectins are appropriately labeled by known methods using optically detectable labels such as fluorescent labels known in the art. Examples of fluorescent labels that can be used include those sold under the trade names or common names such as Rhodamine Green, AlexaFluoro488, TAMRA, TRITC, DY630, AlexaFluoro647, but other types can also be used. it can. Alternatively, a commercially available fluorescently labeled lectin can be used. Furthermore, in molecular biology techniques, for example, a non-natural amino acid can be associated with a sequence such as an amber codon or a 4-base codon, and a fluorescently labeled tRNA corresponding to the codon can be used to fluorescently label the lectin. Is possible. In this case, it is possible to determine in advance the number of fluorescent molecules per lectin molecule and prepare a product in accordance with the design. Therefore, in the fluorescence intensity distribution analysis, the number of fluorescently labeled lectins that bind to the glycoprotein can be accurately quantified. In addition, when a sugar receptor is produced by genetic engineering, a fusion protein with a fluorescent protein such as GFP (green fluorescent protein) or RFP (red fluorescent protein) is prepared in advance, and separated and The purified product can be used as a labeled sugar receptor.
In the above description, the sugar receptor is labeled for complex detection. However, when the detection is performed by detecting scattered light from the complex, labeling is not necessary.
本発明の解析方法においては、まず、解析対象中の糖鎖に特異的に結合する糖レセプターに、光学的に検出可能な標識で適宜ラベルしたものと、当該糖鎖を含む解析対象とを接触させる。この接触は、液相又は固相において行うことができる。液相における接触は、解析対象を含む溶液と、適宜標識化した糖レセプターを含む溶液を、複合体形成に適した条件下で混合することにより行うことができる。一方、固相における接触は、解析対象又は糖レセプターの何れかを担体・基体（例えば金コロイドやラテックスビーズ）に固相化しておき、これにもう一方を含む試料を接触させることで行うことができる。解析対象試料である糖鎖が微量にしか存在しないか、存在するか否かが不明の際に固相接触を行う場合は、標識化済糖レセプター側を固相化することが好ましい。 In the analysis method of the present invention, first, a sugar receptor that specifically binds to a sugar chain in the analysis target is appropriately labeled with an optically detectable label and the analysis target containing the sugar chain is contacted. Let This contact can take place in the liquid phase or in the solid phase. Contact in the liquid phase can be carried out by mixing a solution containing the analysis target and a solution containing an appropriately labeled sugar receptor under conditions suitable for complex formation. On the other hand, the contact in the solid phase can be performed by immobilizing either the analysis target or the sugar receptor on a carrier / substrate (for example, colloidal gold or latex beads) and contacting the sample containing the other. it can. When solid phase contact is performed when it is unclear whether or not the sugar chain that is the sample to be analyzed is present in a trace amount, it is preferable to immobilize the labeled sugar receptor side.
解析対象と糖レセプターとの複合体形成は、結合特異性が阻害されず、より好ましくは以下の検出工程が阻害されない条件下で行う。接触を固相において行う場合には、接触時の環境（溶液組成等）と、検出時の環境とを変えることもより容易であり、適宜洗浄工程を接触工程と検出工程との間に含めることが可能である。従って、複合体形成のための条件が検出工程を阻害する可能性がある場合、固相での接触により複合体を形成し、複合体検出前に洗浄工程を行うことが好ましい。 Complex formation between the analysis target and the sugar receptor is performed under conditions that do not inhibit the binding specificity, and more preferably do not inhibit the following detection step. When contact is performed in a solid phase, it is easier to change the environment at the time of contact (solution composition, etc.) and the environment at the time of detection, and appropriately include a washing step between the contact step and the detection step. Is possible. Therefore, when there is a possibility that the conditions for complex formation may hinder the detection process, it is preferable to form a complex by contact with a solid phase and perform a washing step before complex detection.
解析対象と糖レセプターとの複合体形成のための反応条件は、解析する糖鎖及び糖レセプターとの関係によって決まるものであり、当業者らが決定できるものである。複合体が糖鎖とレクチンとの組合せからなる場合、通常の反応条件は室温〜２４℃で、３０〜６０分間である。 The reaction conditions for complex formation between the analysis target and the sugar receptor are determined by the relationship between the sugar chain to be analyzed and the sugar receptor, and can be determined by those skilled in the art. When the complex is a combination of a sugar chain and a lectin, normal reaction conditions are room temperature to 24 ° C. and 30 to 60 minutes.
本発明の解析方法においては次に、上記複合体の検出に適する波長の光を当該複合体に照射する工程を行う。糖レセプターを標識化している場合には、そのラベルの種類に適した波長の光を照射する。本発明において好ましい標識は蛍光標識であり、当業者は使用する蛍光標識の特性に応じて波長を決定することができる。一方、糖レセプターを標識化せず、散乱光を利用して解析を行うことも可能である。 Next, in the analysis method of the present invention, a step of irradiating the complex with light having a wavelength suitable for detection of the complex is performed. When the sugar receptor is labeled, light having a wavelength suitable for the type of the label is irradiated. A preferred label in the present invention is a fluorescent label, and those skilled in the art can determine the wavelength according to the characteristics of the fluorescent label used. On the other hand, it is also possible to analyze using scattered light without labeling the sugar receptor.
本発明の解析方法においては次に、特定波長の光が照射された上記複合体からの信号を計測する。この計測には、例えばオリンパス社製の１分子蛍光分析システムMF20を使用することができる。MF20では、１０００兆分の１リットルという超微小領域中での１分子レベルの挙動を、自己相関関数解析（FCS）、蛍光強度分布解析（FIDA）、蛍光偏光度解析（FIDA-PO）により、大量の試料であっても同時且つ短時間で検出・解析することができるよう、反応系及び計測系が構成されている。またMF20の反応系・計測系は、生体内に近い環境とすることができ、精度が高く効率的な解析を行うことができる。 Next, in the analysis method of the present invention, a signal from the complex irradiated with light of a specific wavelength is measured. For this measurement, for example, a single molecule fluorescence analysis system MF20 manufactured by Olympus can be used. In MF20, the behavior of one molecule level in the ultra-fine region of 1/1000 trillion is analyzed by autocorrelation function analysis (FCS), fluorescence intensity distribution analysis (FIDA), and fluorescence polarization degree analysis (FIDA-PO). The reaction system and the measurement system are configured so that even a large amount of samples can be detected and analyzed simultaneously and in a short time. In addition, the reaction system / measurement system of MF20 can be set to an environment close to the living body, and can perform highly accurate and efficient analysis.
自己相関関数解析法（FCS）では、標識された分子が拡散する時間（並進拡散時間）を求めることができる。そして並進拡散時間は分子の大きさにより変化する。そのため、解析対象の分子がその他の分子と相互作用して複合体を形成する場合や、逆に分子が分解されて、より小さい分子になる場合には、並進拡散時間の変化として、分子の大きさの変化を検出することが可能となる。 In the autocorrelation function analysis method (FCS), the time (translational diffusion time) for the labeled molecule to diffuse can be obtained. The translational diffusion time varies with the size of the molecule. Therefore, when the molecule to be analyzed interacts with other molecules to form a complex, or conversely, when the molecule is decomposed into a smaller molecule, the translational diffusion time changes as the size of the molecule. It is possible to detect a change in height.
蛍光強度分布解析法（FIDA）では、１分子当たりの蛍光強度、及び（試料中の）分子数を求めることができる。例えば１の糖蛋白質が複数種類の糖鎖を有する場合、それぞれの糖鎖には異なる糖レセプターが結合できる。この場合、それぞれの糖鎖に標識化済糖レセプターが結合することで、複合体１分子当たりの（蛍光）標識強度が変化する。従って、この（蛍光）標識強度の変化を解析することで、解析対象である当該糖蛋白質に結合している糖鎖の数を決定することが可能となる。 In the fluorescence intensity distribution analysis method (FIDA), the fluorescence intensity per molecule and the number of molecules (in the sample) can be obtained. For example, when one glycoprotein has multiple types of sugar chains, different sugar receptors can be bound to each sugar chain. In this case, the labeling sugar receptor binds to each sugar chain, thereby changing the (fluorescence) labeling intensity per molecule of the complex. Therefore, by analyzing the change in the intensity of the (fluorescence) label, it is possible to determine the number of sugar chains bound to the glycoprotein to be analyzed.
蛍光偏光度解析（FIDA-PO）では、蛍光標識した解析対象からの蛍光偏光を解析することで、（蛍光）標識分子の回転拡散状態を１分子レベルで検出することができる。そしてこの解析方法で求められる蛍光偏光度は、分子の大きさにより変化する。従ってこの変化を計測することで、上記の自己相関関数解析の場合と同様に分子間の相互作用や分子の崩壊現象を観測することが可能となる。 In the degree of fluorescence polarization analysis (FIDA-PO), the rotational diffusion state of the (fluorescent) labeled molecule can be detected at the single molecule level by analyzing the fluorescence polarization from the fluorescently labeled analysis target. The degree of fluorescence polarization determined by this analysis method varies depending on the size of the molecule. Therefore, by measuring this change, it is possible to observe the interaction between molecules and the collapse phenomenon of molecules as in the case of the autocorrelation function analysis.
以上のように本発明においては、糖鎖及び適宜標識化した糖鎖レセプターの複合体に適切な波長の光を照射し、当該複合体からの信号を適切な方法により計測することで、解析対象物中の糖鎖成分や糖鎖の状態についての知見を得ることが可能となる。 As described above, in the present invention, a complex of a sugar chain and an appropriately labeled sugar chain receptor is irradiated with light of an appropriate wavelength, and a signal from the complex is measured by an appropriate method, whereby an analysis target It becomes possible to obtain knowledge about the sugar chain component and the state of the sugar chain in the product.
本発明の糖鎖の解析方法においては、複合体形成前に、糖鎖レセプターを適宜ラベルしたもの単体についての計測を行うことができる。即ち、（ａ）糖鎖を含む解析対象中の糖鎖に特異的に結合する糖レセプターを光学的に検出可能な標識で適宜ラベルしたものに、当該糖レセプターの検出に適する波長の光を照射する工程；及び（ｂ）当該糖レセプターからの信号を計測する工程；を行い、糖鎖を含む解析対象が結合していない糖レセプターについての光学的性質・挙動をあらかじめ計測しておく。
次いで、上記（１）〜（３）と同様の工程を行う。即ち、（ｃ）上記工程（ｂ）後の糖レセプターに、当該糖鎖を含む解析対象を接触し、当該糖鎖及び当該糖レセプターからなる複合体を形成する工程；（ｄ）上記工程（ａ）と同一波長の光を当該複合体に照射する工程；及び（ｅ）当該複合体からの信号を計測する工程；を行う。
そして工程（ｂ）における計測結果と工程（ｅ）における計測結果とを比較することで、解析対象中の糖鎖についての情報を得ることが可能になる。
In the method for analyzing a sugar chain of the present invention, it is possible to measure a simple substance labeled with a sugar chain receptor before complex formation. That is, (a) a sugar receptor that specifically binds to a sugar chain in an analysis target containing a sugar chain is appropriately labeled with an optically detectable label and irradiated with light having a wavelength suitable for detection of the sugar receptor. And (b) a step of measuring a signal from the sugar receptor, and measuring in advance optical properties and behavior of the sugar receptor to which the analysis target including the sugar chain is not bound.
Next, the same steps as in the above (1) to (3) are performed. That is, (c) a step of bringing the sugar receptor after the step (b) into contact with an analysis target containing the sugar chain to form a complex composed of the sugar chain and the sugar receptor; (d) the step (a And (e) a step of measuring a signal from the complex.
Then, by comparing the measurement result in the step (b) and the measurement result in the step (e), it is possible to obtain information about the sugar chain being analyzed.
本発明の糖鎖の解析方法においては、糖鎖の濃度と光学的計測値との間の関係についての検量線を予め作成しておき、濃度未知の解析対象についての計測結果をこの検量線に当てはめることで、当該解析対象中の糖鎖についての情報を定量的に得ることも可能である。例えば、上記（１）〜（３）の工程を含む方法において、（４）上記糖鎖と同一種類の糖鎖であって濃度既知のものにより予め作成された検量線に基づき、上記工程（３）で計測した値から検出対象中の糖鎖を定量する工程を更に行うことで、濃度未知の解析対象中の糖鎖の濃度を定量することが可能となる。 In the sugar chain analysis method of the present invention, a calibration curve for the relationship between the sugar chain concentration and the optical measurement value is prepared in advance, and the measurement result for the analysis target with the unknown concentration is used as the calibration curve. By applying, it is also possible to quantitatively obtain information about the sugar chain in the analysis target. For example, in the method including the steps (1) to (3) above, (4) the above step (3) based on a calibration curve prepared in advance by a sugar chain of the same kind as the sugar chain and having a known concentration. It is possible to quantify the concentration of the sugar chain in the analysis target whose concentration is unknown by further performing the step of quantifying the sugar chain in the detection target from the value measured in (1).
検量線を作成すると、濃度に関して複数の点で計測値を求めることになり、糖鎖と糖レセプターとの間の反応の強さ（Kd値）を求めることも可能になる。糖鎖の濃度が低い場合、糖蛋白質分子と結合する（蛍光）標識済糖レセプターの割合は低くなるため、FCS解析における並進拡散時間は短く、またFIDA-PO解析における蛍光偏光度は小さいものとなる。糖鎖の濃度が高い場合、糖蛋白質分子と結合する（蛍光）標識済糖レセプターの割合は高くなるため、並進拡散時間は長くなり、蛍光偏光度は大きいものとなる。一方、コントロールとして解析対象物中の糖鎖に特異性のない糖レセプターを使うと、並進拡散時間及び蛍光偏光度と、糖鎖濃度との間には相関関係が見られない。従って濃度が既知であり且つ複数の濃度点において、糖鎖特異的な糖レセプターを使って計測した結果を基に作成した検量線に、濃度未知の糖鎖含有試料の計測結果を当てはめることで、当該糖鎖の濃度を求めたり、糖蛋白質と糖レセプターとの間の相互作用の強さ（Kd値）を求めることが可能となる。 When a calibration curve is created, measurement values are obtained at a plurality of points with respect to the concentration, and the strength of reaction (Kd value) between the sugar chain and the sugar receptor can be obtained. When the sugar chain concentration is low, the ratio of (fluorescent) labeled sugar receptors that bind to glycoprotein molecules is low, so the translational diffusion time in FCS analysis is short, and the degree of fluorescence polarization in FIDA-PO analysis is low. Become. When the sugar chain concentration is high, the proportion of the (fluorescent) labeled sugar receptor that binds to the glycoprotein molecule is high, so that the translational diffusion time becomes long and the degree of fluorescence polarization becomes large. On the other hand, when a sugar receptor having no specificity to the sugar chain in the analysis object is used as a control, there is no correlation between the translational diffusion time and fluorescence polarization degree and the sugar chain concentration. Therefore, by applying the measurement result of the sugar chain-containing sample of unknown concentration to the calibration curve created based on the result of measurement using sugar receptors specific to the sugar chain at multiple concentration points, It is possible to determine the concentration of the sugar chain or the strength of interaction (Kd value) between the glycoprotein and the sugar receptor.
１分子当たりの蛍光強度分布の変化がFIDA解析法において観測される場合、糖蛋白質に結合する糖レセプターの数の変化が示唆される。FIDA解析法では、検出された蛍光分子の数と、１分子当たりの蛍光強度を算出することができるため、これらの算出結果に基づいて糖蛋白質１分子当たりに結合している糖レセプターの数、即ち糖蛋白質上の糖鎖の数についての知見を得ることが可能となる。 When a change in the fluorescence intensity distribution per molecule is observed in the FIDA analysis method, this suggests a change in the number of sugar receptors that bind to the glycoprotein. In the FIDA analysis method, the number of fluorescent molecules detected and the fluorescence intensity per molecule can be calculated. Based on these calculation results, the number of sugar receptors bound per molecule of glycoprotein, That is, it becomes possible to obtain knowledge about the number of sugar chains on the glycoprotein.
本発明の糖鎖の解析方法においては、前記糖レセプターを、それぞれが特定の種類に対して特異的に結合する、複数種類の糖レセプターの集合とすることができる。そしてこの場合に、特異性の異なるそれぞれの糖レセプターに、分光特性が互いに有意に異なる、光学的に検出可能な標識でラベル化を施すことにより、複数種類の糖鎖の検出・解析を同一反応系内で行うことが可能になる。即ち、上記工程（１）又は（ｃ）において、前記糖レセプターと前記解析対象との接触を、複数の糖レセプターについて同一の反応系内で行うことが可能になる。これにより解析に使用する装置の構成を簡略化することが可能になる。 In the sugar chain analysis method of the present invention, the sugar receptor can be a set of a plurality of types of sugar receptors, each of which specifically binds to a specific type. In this case, each sugar receptor with different specificity is labeled with an optically detectable label that has significantly different spectral characteristics from each other, so that multiple sugar chains can be detected and analyzed in the same reaction. It becomes possible to carry out in the system. That is, in the step (1) or (c), the sugar receptor and the analysis target can be contacted in the same reaction system for a plurality of sugar receptors. Thereby, it becomes possible to simplify the structure of the apparatus used for analysis.
複数種類の糖レセプターを用いる上記の方法を採用する場合、解析対象中の糖鎖が予め具体的に特定できていない状況下でも実施することができる。即ち、糖鎖に対して親和性の異なる複数種類の糖レセプター（レクチン等）に、光学的検出波長が有意に異なる蛍光標識を施し、これら全ての糖レセプターを解析対象と混合して複合体を形成させる。そしてこの複合体に対してFCS解析を行う。特定の糖鎖レセプターが糖鎖に結合している場合、複合体形成に伴い分子の並進拡散時間が長くなる。この変化をそれぞれの蛍光標識に適した波長において観測することで、どの糖レセプターが糖鎖に結合したかを同定することが可能となり、その結果、糖鎖の成分を同定することが可能になる。
複数種類の糖レセプターを同一反応系にて使用することができるため、本発明の方法は、微量にしか入手できないの解析に特に効果を発揮する。さらには、特定の糖鎖を有する対象物をスクリーニングすることにも効果を発揮することができる。
When the above-described method using a plurality of types of sugar receptors is employed, the method can be carried out even in a situation where the sugar chain being analyzed cannot be specifically identified in advance. That is, fluorescent labels with significantly different optical detection wavelengths are applied to multiple types of sugar receptors (lectins, etc.) that have different affinity for sugar chains, and all these sugar receptors are mixed with the analysis target to form a complex. Let it form. FCS analysis is performed on this complex. When a specific sugar chain receptor is bound to a sugar chain, the translational diffusion time of the molecule increases with complex formation. By observing this change at a wavelength suitable for each fluorescent label, it is possible to identify which sugar receptor is bound to the sugar chain, and as a result, it is possible to identify the components of the sugar chain. .
Since a plurality of types of sugar receptors can be used in the same reaction system, the method of the present invention is particularly effective for analysis that can be obtained only in trace amounts. Furthermore, the effect can also be exhibited in screening for an object having a specific sugar chain.
複数種類の糖レセプターを用いる上記の方法において、当該糖レセプターが蛍光標識されている場合には、蛍光相互相関解析（FxCS）により、上記工程（３）又は（ｅ）を行うことができる。蛍光相互相関解析においては、複数種類の糖レセプターが糖鎖に結合している場合、即ち糖鎖が複合糖鎖である場合、それぞれの糖レセプターに付加されている蛍光標識の検出に適した波長の光を照射すると、種類の異なる糖鎖の間での蛍光相互相関が観測される。従って蛍光相互相関が観測された場合には、使用した複数種類の糖レセプターが特異的に認識できる糖鎖を、解析対象の試料が有していることが同定される。使用する糖レセプターが３種類以上の場合には、ダイクロイックミラーや、蛍光フィルターを適宜使用するなど、検出系の構成を工夫したり、これに併せて蛍光標識分子の励起用光源を、ガルバノミラー等を用いる工夫をすることで、３種類以上の蛍光の中より特定の２種類の蛍光のみを選択し、それ以外の蛍光を除去することが可能である。 In the above method using a plurality of types of sugar receptors, when the sugar receptor is fluorescently labeled, the step (3) or (e) can be performed by fluorescence cross-correlation analysis (FxCS). In fluorescence cross-correlation analysis, when multiple types of sugar receptors are bound to sugar chains, that is, when the sugar chains are complex sugar chains, the wavelength is suitable for detecting the fluorescent label attached to each sugar receptor. When the light is irradiated, fluorescence cross-correlation between different types of sugar chains is observed. Therefore, when fluorescence cross-correlation is observed, it is identified that the sample to be analyzed has a sugar chain that can be specifically recognized by the plurality of types of sugar receptors used. When more than 3 types of sugar receptors are used, devise the configuration of the detection system, such as using a dichroic mirror or a fluorescent filter as appropriate, or use a light source for excitation of fluorescently labeled molecules as a galvanomirror, etc. It is possible to select only two specific types of fluorescence from among three or more types of fluorescence and to remove other types of fluorescence.
上記蛍光相互相関解析を行う場合において、測定の結果、特定の蛍光の組合せにおいて相互相関が解析されなかった場合には、その後に、工程（Ｘ）：各標識からの信号をＦＣＳにより解析する工程を行うことができる。相互相関が観測されなかった場合には、解析対象が複合糖鎖ではないことが示されるが、解析に使用した糖レセプターが糖鎖に結合している限りにおいては、引き続いてＦＣＳ解析を行うことで、ＦｘＣＳ解析に用いた同一試料を使って、糖鎖の解析を行うことが可能である。これにより、微量にしか存在しない試料を有効活用することができる。 In the case of performing the above-described fluorescence cross-correlation analysis, if the cross-correlation is not analyzed for a specific fluorescence combination as a result of the measurement, then the step (X): a step of analyzing signals from each label by FCS It can be performed. If no cross-correlation is observed, it indicates that the target of analysis is not a complex sugar chain. However, as long as the sugar receptor used in the analysis is bound to the sugar chain, the FCS analysis should be performed subsequently. Thus, it is possible to analyze a sugar chain using the same sample used for FxCS analysis. Thereby, the sample which exists only in a trace amount can be used effectively.
糖鎖を含む解析対象試料が糖蛋白質である場合、遺伝子工学的手法によりアミノ酸配列に変異を起こしたものについて上記のようにFCS解析を行うと、変異に伴って糖鎖が付加されたか否かについて同定することも可能となる。蛋白質上の糖鎖付加部位が事前にわからない場合においては、糖鎖付加が予想される複数の部位についての変異体を調製する必要があるが、本発明の解析方法は、従来の表面プラズモン共鳴法等に比べてスループットが良好であるため、多数の試料数を取り扱う必要が生じる上記のような場合であっても、迅速に計測・解析を行うことが可能である。 If the sample to be analyzed containing a glycan is a glycoprotein, whether or not the glycan was added along with the mutation by performing the FCS analysis on the amino acid sequence mutated by genetic engineering techniques as described above Can be identified. When the glycosylation site on the protein is not known in advance, it is necessary to prepare mutants for a plurality of sites where glycosylation is expected, but the analysis method of the present invention is based on the conventional surface plasmon resonance method. Since the throughput is better than the above, it is possible to quickly measure and analyze even in the above-described case where it is necessary to handle a large number of samples.
本発明の解析方法は固相において行うことができるが、その場合、糖レセプター側を担体・基体に固相化する。糖レセプターの固相化に適する担体・基体の例としては、種々の金属のコロイド粒子（金コロイド等）；ラテックス等の樹脂ビーズ、半導体、ガラス等の粒子、磁気ビーズ等を挙げることができる。磁気ビーズを用いると、固相化担体の洗浄を自動で行う場合に好適に用いることができる。 The analysis method of the present invention can be performed in a solid phase. In this case, the sugar receptor side is immobilized on a carrier / substrate. Examples of carriers / substrates suitable for solidifying a sugar receptor include colloidal particles of various metals (gold colloid, etc.); resin beads such as latex, particles such as semiconductors and glass, magnetic beads, and the like. When magnetic beads are used, they can be suitably used when the solid-phased carrier is automatically washed.
上記の方法（I）〜（VII）において、多種類の糖レセプターを利用する場合には、その数だけ種類の異なる蛍光標識を用意する必要がある。しかしながら、費用の観点からは、それぞれが光学的性質の異なる多種類の蛍光標識を準備することは困難である。また、糖レセプター側の問題も存在する。即ち、使用する糖レセプターが糖鎖に比べて分子量が大きいものである場合、糖鎖への結合の前後における分子量変化が相対的に小さくなり、分子の大きさ変化に起因した光学的性質の変化を測定する本発明の場合、計測の精度が低下するという問題がある。 In the above methods (I) to (VII), when multiple types of sugar receptors are used, it is necessary to prepare different types of fluorescent labels. However, from the viewpoint of cost, it is difficult to prepare many kinds of fluorescent labels each having different optical properties. There are also problems on the sugar receptor side. That is, when the sugar receptor used has a higher molecular weight than the sugar chain, the change in molecular weight before and after binding to the sugar chain is relatively small, and the optical properties change due to the change in the size of the molecule. In the case of the present invention for measuring, there is a problem that the accuracy of measurement is lowered.
そこで本発明においては、異なる濃度の二種類の蛍光色素の組合せで標識されたビーズの組合せである基体のそれぞれに、結合特異性の異なる糖レセプターがそれぞれ固相化されたものを利用することも可能である。このようなビーズを用いる場合には、異なる濃度の蛍光色素の組合せを識別コードとして利用することが可能になる。即ち、当該組合せで標識されたビーズに、それぞれの蛍光色素に適した波長の光を照射して蛍光色素を励起する。そして励起蛍光をそれぞれの波長に適したバンドパスフィルタに通し、透過光を光センサを利用して電流に変換する。蛍光色素の濃度の組合せが異なるそれぞれのビーズ同士を比較すると、変換された電流値の差として検出されるので、この電流値の差異に基づいて、検出した蛍光がどのビーズ由来であるかを同定することが可能である。蛍光色素の濃度の組合せとしては、検出系において電流値の差異を有意に検出できる限りにおいて特に限定されることはないが、２種類の蛍光色素について数十〜１００種類程度の組合せ数であることが好ましい。このようなビーズとしては、Luminex（登録商標）として市販されているものを利用することができる。Luminexでは、二つの蛍光色素の濃度をそれぞれ１０段階用意し、これらの組み合わせて蛍光色素の組合せが１００種類のマイクロビーズを作製している。 Therefore, in the present invention, it is also possible to use a substrate in which sugar receptors having different binding specificities are immobilized on each of the substrates, which are combinations of beads labeled with a combination of two kinds of fluorescent dyes having different concentrations. Is possible. When such beads are used, a combination of fluorescent dyes having different concentrations can be used as an identification code. That is, the fluorescent dye is excited by irradiating the beads labeled with the combination with light having a wavelength suitable for each fluorescent dye. Then, the excitation fluorescence is passed through a band-pass filter suitable for each wavelength, and the transmitted light is converted into an electric current using an optical sensor. When beads with different combinations of fluorescent dye concentrations are compared, they are detected as the difference in the converted current value. Based on this difference in current value, the detected fluorescence is identified from which bead. Is possible. The combination of fluorescent dye concentrations is not particularly limited as long as a difference in current value can be detected significantly in the detection system, but the number of combinations of about several tens to 100 kinds of two types of fluorescent dyes. Is preferred. As such a bead, what is marketed as Luminex (trademark) can be utilized. In Luminex, 10 concentrations of two fluorescent dyes are prepared, and 100 kinds of microbeads are produced by combining these concentrations.
上記のような、異なる濃度の蛍光色素の組合せで標識したビーズを利用する場合、上記（１）〜（３）の工程、又は上記（ａ）〜（ｅ）の工程を有する方法においては、工程（１）と（２）の間、又は前記工程（ｃ）と（ｄ）の間において、
（Ｙ）前記糖レセプターが認識する部位とは異なる、解析対象上の糖鎖以外の部位を特異的に認識する分子（例えば抗体）を、当該ビーズの標識に用いられている蛍光色素の組合せの分光学的性質とは異なる分光学的性質を有する蛍光色素によりラベルしたものを、糖鎖及び糖レセプターからなる複合体を含む反応系に添加する工程；
を更に行う。そして当該工程（３）又は（ｅ）において、当該ビーズからの蛍光と、当該糖鎖以外の部位を認識する分子（抗体等）からの蛍光とについて蛍光相互相関分析（ＦｘＣＳ）を行うことができる。
When using beads labeled with a combination of fluorescent dyes at different concentrations as described above, in the method having the steps (1) to (3) or the steps (a) to (e), Between (1) and (2) or between said steps (c) and (d),
(Y) A molecule (for example, an antibody) that specifically recognizes a site other than the sugar chain on the analysis target, which is different from the site recognized by the sugar receptor, is a combination of fluorescent dyes used for labeling the beads. Adding a label labeled with a fluorescent dye having a spectroscopic property different from the spectroscopic property to a reaction system including a complex composed of a sugar chain and a sugar receptor;
Is further performed. And in the said process (3) or (e), a fluorescence cross-correlation analysis (FxCS) can be performed about the fluorescence from the said bead and the fluorescence from the molecule | numerator (antibody etc.) which recognizes parts other than the said sugar_chain | carbohydrate. .
この場合、解析対象である分子（例えば糖蛋白質）中に解析対象の糖鎖が存在すると、蛍光色素の組合せを有するビーズで標識された糖レセプターが当該糖鎖を認識し、当該糖鎖を有する糖蛋白質の糖鎖以外の部分に抗体が結合する。そしてこの抗体には、ビーズの標識に用いられている蛍光色素の組合せの分光学的性質とは異なる分光学的性質を有する蛍光色素によりラベル化されているので、糖鎖、糖レセプター、及び抗体からなる大きな複合体が形成されている。そしてこの複合体にはビーズの標識と、抗体に付加された標識との二種類の標識が存在しているため、これらの標識について蛍光相互相関分析（ＦｘＣＳ）を行うことができる。 In this case, when the sugar chain to be analyzed is present in the molecule to be analyzed (for example, glycoprotein), the sugar receptor labeled with beads having a combination of fluorescent dyes recognizes the sugar chain and has the sugar chain. The antibody binds to a portion other than the sugar chain of the glycoprotein. And since this antibody is labeled with a fluorescent dye having a spectroscopic property different from the spectroscopic property of the combination of fluorescent dyes used for labeling the beads, the sugar chain, the sugar receptor, and the antibody A large complex is formed. Since this complex has two types of labels, a label of beads and a label added to the antibody, fluorescence cross-correlation analysis (FxCS) can be performed on these labels.
上記のビーズを利用する方法は、例えば糖蛋白質を解析対象としており、蛋白質部分については抗体も入手できているが、糖鎖部分についてはどのようなタイプの糖鎖であるかが不明の場合に、数多くのレクチンを使って、糖鎖解析を行いたい場合に、特に好適に利用することができる。特定の濃度の組合せで標識されたビーズと、抗体に施された標識との間に蛍光相互相関が見られる場合には、当該ビーズに共役させたレクチンが認識する糖鎖が存在することがわかり、当該蛍光相互相関が見られない場合には、当該レクチンが認識する糖鎖が存在しないことがわかる。そして複数のレクチンに関しての情報を、一つの反応系・検出系により入手することが可能である。 The method using the above beads is for example when a glycoprotein is an object of analysis and an antibody is available for the protein part, but the type of sugar chain is unknown for the sugar chain part. It can be used particularly suitably when it is desired to perform sugar chain analysis using a large number of lectins. When a fluorescent cross-correlation is observed between a bead labeled with a specific concentration combination and a label applied to the antibody, it is understood that there is a sugar chain recognized by the lectin conjugated to the bead. When the fluorescence cross-correlation is not observed, it can be seen that there is no sugar chain recognized by the lectin. Information on a plurality of lectins can be obtained by a single reaction system / detection system.
上記のビーズを利用する方法においては、標識として用いられる当該ビーズに複数の糖レセプターを結合することができるため、１つのビーズに対して複数の糖鎖含有試料を結合させることができる。従って、糖鎖含有試料に対する分子量比が相対的に大きかった標識を使う場合に、複合体形成前後で大きな分子量変化を得られなかったという問題を解決することが可能となる。 In the above-described method using beads, a plurality of sugar receptors can be bound to the beads used as labels, so that a plurality of sugar chain-containing samples can be bound to one bead. Therefore, when a label having a relatively large molecular weight ratio with respect to the sugar chain-containing sample is used, it is possible to solve the problem that a large molecular weight change cannot be obtained before and after the complex formation.
本発明の糖鎖解析方法においては、糖鎖を標識化する必要がないため、微量にしか存在しない糖鎖試料の解析を効果的に行うことが可能であり、プロテオーム研究及びその応用分野に有効活用することができる。 In the sugar chain analysis method of the present invention, since it is not necessary to label sugar chains, it is possible to effectively analyze sugar chain samples that exist only in trace amounts, which is effective for proteome research and its application fields. Can be used.
糖タンパク質の定量
糖レセプターとしてレクチン分子Con Aに、蛍光標識Alexa488によるラベル化が施されたAlexa488-ConA（Molecular Probes P-21462）を用いた。糖タンパク質としては、ConAが認識するマンノースを持つ糖鎖を１個保有しているmouseIgG（Jucson Immunoreserch Code No. 00500003,Lot No.65361）を用いた。
まず、10ng/mlから10mg/mlまでの濃度のmouseIgG抗体溶液を作製した。次に、Alexa488-ConAをバッファ（PBS）で希釈し、約５〜10nMの濃度に調整した。上記で濃度勾配を作製したmouseIgG 溶液にAlexa488-ConAを添加し、室温（24℃）で30分の反応を行った。
反応物（Alexa488-ConAと、mouseIgGとからなる複合体）からの蛍光の計測はオリンパス社製MF２０を使って行った。MF20により、FCS解析、FIDA解析、FIDA-PO解析を行い、各抗体濃度におけるAlexa488-ConAの並進拡散時間、又は蛍光偏光度をもとめ、各抗体濃度でこれらの値をプロットし、検量線を作成した。FCS解析の結果を図１に示した。この検量線を使えば、mouseIgGと同程度の分子量（100〜150ｋDa程度）を有する、濃度が未知の糖蛋白質についても、Alexa４８８-ConAと反応させFCS計測すれば、その並進拡散時間から当該糖蛋白質の濃度を求めることができる。
Quantification of glycoprotein Alexa488-ConA (Molecular Probes P-21462) in which the lectin molecule Con A was labeled with a fluorescent label Alexa488 was used as a sugar receptor. As the glycoprotein, mouseIgG (Jucson Immunoreserch Code No. 00500003, Lot No. 65361) having one glycan having mannose recognized by ConA was used.
First, a mouse IgG antibody solution having a concentration from 10 ng / ml to 10 mg / ml was prepared. Next, Alexa488-ConA was diluted with buffer (PBS) and adjusted to a concentration of about 5-10 nM. Alexa488-ConA was added to the mouse IgG solution prepared as described above, and the reaction was performed at room temperature (24 ° C.) for 30 minutes.
The fluorescence from the reaction product (a complex consisting of Alexa488-ConA and mouse IgG) was measured using Olympus MF20. Perform FCS analysis, FIDA analysis, FIDA-PO analysis with MF20, determine the translational diffusion time of Alexa488-ConA at each antibody concentration, or fluorescence polarization degree, plot these values at each antibody concentration, and create a calibration curve did. The results of FCS analysis are shown in FIG. Using this calibration curve, glycoproteins with the same molecular weight as mouseIgG (about 100-150 kDa), but with unknown concentrations, can be reacted with Alexa488-ConA and measured by FCS. Can be determined.
糖タンパク質の糖鎖の数に関する解析
糖レセプターとして、レクチン分子ConAに蛍光色素蛍光標識Alexa488によるラベル化が施されたAlexa488-ConA（Molecular Probes P-21462）を用いた。糖タンパク質としては、ConAが認識するN型糖鎖が複数個結合している糖タンパク質を用いた。
まず、Alexa488-ConAの濃度を約10ｎMに固定し、これに対して濃度の異なる試料糖タンパク質を添加し、２４℃で３０分間反応した。そしてMF20にてFCS解析、及びFIDA解析を行った。その結果を図２及び図３に示した。
図２に示されるFCS解析の結果からは、試料糖蛋白質の濃度が濃くなるにつれて、Alexa488-ConAの蛍光色素を有する分子の並進拡散時間が長くなり、Alexa488-ConAが糖タンパク質と相互作用したことが確認された。次に図３に示されるFIDA解析の結果からは、1分子あたりの蛍光強度が糖タンパク質の濃度に伴い大きくなり、これに伴って検出される蛍光分子数が少なくなることが確認された。これは試料糖蛋白質に複数のAlexa488-ConAが結合し、試料糖蛋白質1分子あたりの蛍光強度が大きくなったことを示している。また検出される蛍光分子数が少なくなったのは、試料中に存在しているAlexa488-ConAの数は一定であることから、複数のAlexa488-ConAが1つの分子にいくつか結合したことを示唆するものである。またFCS計測結果からも並進拡散時間が長いものが観測されており分子量のかなり大きいものであることが推測され、この点からも１分子に複数のAlexa488-ConAが結合したことを支持する。
ここでAlexa488-ConAモノマーの1分子あたりの蛍光強度を基準にして、蛍光強度が大きくなったときの（複合体）分子の蛍光強度の相対比を求めた。相対比は、糖タンパク質1分子に結合しているAlexa488-ConAが約４.5個であることを示した。つまり糖タンパク質の糖鎖に存在するConAの認識する糖鎖ユニットは約4.5個であることがわかる。Alexa488-ConAの濃度を1から20ｎM程度に変化させて行なった場合には、糖鎖と結合するAlexa488-ConAの数が多くなるから、長い糖鎖の解析にも応用できる。
Analysis on the number of sugar chains of glycoprotein Alexa488-ConA (Molecular Probes P-21462) in which the lectin molecule ConA was labeled with a fluorescent dye fluorescent label Alexa488 was used as a sugar receptor. As the glycoprotein, a glycoprotein in which a plurality of N-type sugar chains recognized by ConA are bound was used.
First, the concentration of Alexa488-ConA was fixed at about 10 nM, sample glycoproteins having different concentrations were added thereto, and the mixture was reacted at 24 ° C. for 30 minutes. FCS analysis and FIDA analysis were performed at MF20. The results are shown in FIGS.
From the results of the FCS analysis shown in FIG. 2, as the concentration of the sample glycoprotein increased, the translational diffusion time of the molecule having the Alexa488-ConA fluorescent dye increased, and Alexa488-ConA interacted with the glycoprotein. Was confirmed. Next, from the results of FIDA analysis shown in FIG. 3, it was confirmed that the fluorescence intensity per molecule increased with the concentration of glycoprotein, and the number of fluorescent molecules detected with this increased. This indicates that a plurality of Alexa488-ConA binds to the sample glycoprotein, and the fluorescence intensity per molecule of the sample glycoprotein increases. The number of fluorescent molecules detected was also small, suggesting that several Alexa488-ConAs were bound to one molecule because the number of Alexa488-ConA present in the sample was constant. To do. The FCS measurement results also indicate that the translational diffusion time is long and it is speculated that the molecular weight is quite large. This also supports the fact that multiple Alexa488-ConA molecules are bound to one molecule.
Here, based on the fluorescence intensity per molecule of Alexa488-ConA monomer, the relative ratio of the fluorescence intensity of the (complex) molecule when the fluorescence intensity increased was determined. The relative ratio showed that there were about 4.5 Alexa488-ConA bound to one molecule of glycoprotein. That is, it is understood that there are about 4.5 sugar chain units recognized by ConA present in the sugar chain of the glycoprotein. When the concentration of Alexa488-ConA is changed from 1 to 20 nM, the number of Alexa488-ConA binding to the sugar chain increases, so it can be applied to analysis of long sugar chains.
Claims (13)
（２）当該複合体の検出に適する波長の光を当該複合体に照射する工程；及び
（３）当該複合体からの信号を計測する工程；
を含む、糖鎖の解析方法。 (1) A complex comprising a sugar chain and a sugar receptor by bringing an analysis target containing the sugar chain into contact with a sugar receptor that specifically binds to the sugar chain and appropriately labeled with an optically detectable label. Forming:
(2) irradiating the complex with light having a wavelength suitable for detection of the complex; and (3) measuring a signal from the complex;
A method for analyzing sugar chains.
（ｂ）当該糖レセプターからの信号を計測する工程；
（ｃ）上記工程（ｂ）後の糖レセプターに、当該糖鎖を含む解析対象を接触し、当該糖鎖及び当該糖レセプターからなる複合体を形成する工程；
（ｄ）上記工程（ａ）と同一波長の光を当該複合体に照射する工程；及び
（ｅ）当該複合体からの信号を計測する工程；
を含む、糖鎖の解析方法。 (A) A step of irradiating light having a wavelength suitable for detection of the sugar receptor onto a sugar receptor that specifically binds to a sugar chain containing a sugar chain, which is appropriately labeled with an optically detectable label ;
(B) measuring a signal from the sugar receptor;
(C) a step of contacting the sugar receptor after the step (b) with an analysis target containing the sugar chain to form a complex composed of the sugar chain and the sugar receptor;
(D) a step of irradiating the complex with light having the same wavelength as in the step (a); and (e) a step of measuring a signal from the complex;
A method for analyzing sugar chains.
を更に含む、請求項１に記載の糖鎖の解析方法。 (4) A step of quantifying the sugar chain in the detection target from the value measured in the step (3) based on a calibration curve prepared in advance with a sugar chain of the same type as the sugar chain and having a known concentration;
The method for analyzing a sugar chain according to claim 1, further comprising:
前記工程（１）又は（ｃ）において、
前記糖レセプターと前記解析対象との接触を、複数の糖レセプターについて同一の反応系内で行う、請求項１又は２に記載の糖鎖の解析方法。 The sugar receptor is an assembly of a plurality of types of sugar receptors that specifically bind to a specific sugar chain, and is labeled with an optically detectable label that has significantly different spectral characteristics from each other. Yes;
In the step (1) or (c),
The method for analyzing a sugar chain according to claim 1 or 2, wherein the sugar receptor and the analysis target are contacted in the same reaction system for a plurality of sugar receptors.
前記工程（３）又は（ｅ）の信号の計測が蛍光相互相関解析（ＦｘＣＳ）により行われる、請求項４に記載の糖鎖の解析方法。 The optically detectable label is a fluorescent label;
The sugar chain analysis method according to claim 4, wherein the measurement of the signal in step (3) or (e) is performed by fluorescence cross-correlation analysis (FxCS).
（Ｘ）各標識からの信号をＦＣＳにより解析する工程；
を行うことを含む、請求項５に記載の糖鎖の解析方法。 After FxCS found that no cross-correlation was observed,
(X) analyzing the signal from each label by FCS;
The method for analyzing a sugar chain according to claim 5, comprising:
前記工程（１）と（２）の間、又は前記工程（ｃ）と（ｄ）の間において、
（Ｙ）前記糖レセプターが認識する部位とは異なる、解析対象上の糖鎖以外の部位を特異的に認識する抗体を、当該ビーズの標識に用いられている蛍光色素の組合せの分光学的性質とは異なる分光学的性質を有する蛍光色素によりラベルしたものを、前記複合体を含む反応系に添加する工程；
を更に含み；
前記工程（３）又は（ｅ）において、当該ビーズからの蛍光と当該抗体からの蛍光について蛍光相互相関分析（ＦｘＣＳ）を行う、請求項５に記載の糖鎖の解析方法。 Sugar receptors having different binding specificities are immobilized on each of the substrates, which are combinations of beads labeled with a combination of two kinds of fluorescent dyes having different concentrations;
Between the steps (1) and (2) or between the steps (c) and (d),
(Y) Spectroscopic properties of a combination of fluorescent dyes used for labeling the antibody, which specifically recognizes a site other than the sugar chain on the analysis target, which is different from the site recognized by the sugar receptor Adding a label labeled with a fluorescent dye having a spectroscopic property different from that to the reaction system containing the complex;
Further comprising;
The sugar chain analysis method according to claim 5, wherein in the step (3) or (e), fluorescence cross-correlation analysis (FxCS) is performed on the fluorescence from the beads and the fluorescence from the antibodies.
（ｉ）解析対象の糖鎖；
（ｉｉ）当該糖鎖に特異的に結合する複数種類の第１レセプターの集合のそれぞれを、異なる濃度の二種類の蛍光色素の組合せで標識されたビーズの組合せである基体のそれぞれに固相化したもの；及び
（ｉｉｉ）当該第１レセプターの認識部位とは異なる、当該解析対象上の糖鎖以外の部位を特異的に認識する第２レセプターに、前記二種類の蛍光色素の組合せとは分光学的性質のことなる蛍光標識を付加したもの；
を接触することにより、解析対象含有試料を調製する工程；
（２’）当該解析対象含有試料に対し、当該標識の検出に適した波長の光を照射する工程；
（３’）当該混合物からの信号を蛍光相互相関分析（ＦｘＣＳ）により解析する工程；
を含む糖鎖の解析方法。 (1 ') The following three types:
(I) sugar chain to be analyzed;
(Ii) Immobilizing each of a plurality of types of first receptor aggregates that specifically bind to the sugar chain on each of the substrates that are combinations of beads labeled with a combination of two types of fluorescent dyes at different concentrations And (iii) a combination of the two types of fluorescent dyes is different from the recognition site of the first receptor, which is different from the recognition site of the first receptor and specifically recognizes a site other than the sugar chain on the analysis target. With a fluorescent label with different optical properties;
A step of preparing a sample to be analyzed by contacting the sample;
(2 ′) a step of irradiating the analysis target-containing sample with light having a wavelength suitable for detecting the label;
(3 ′) analyzing the signal from the mixture by fluorescence cross-correlation analysis (FxCS);
For analyzing sugar chains containing
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