JP2008151784A - 自己蛍光を除去するために複数の検出チャネルを使用するシステム及び方法 - Google Patents

Abstract

【課題】単一のレーザを使用し、単一の染料だけでよく、しかも自己蛍光イベントに起因して発生するような偽実体を排除可能にする。
【解決手段】サンプルに単一のプローブを付着させ、サンプルを単一波長の光源で励起し、それによって光源からある距離において光を放出させることによって、自己蛍光を信号から分離することを可能にするシステム及び方法。放出された光はスプリットされ、スプリットされた光は２つ以上の別個のチャネル内に集められる。別個のチャネルの第１のチャネルは第２のチャネルよりも光源の近くに位置決めされ、第２のチャネルは第１のチャネルよりも単一プローブの放出周波数の近くにある。第１のチャネル内に集められた光及び第２のチャネル内に集められた光が調査され、調査に基づいて出力信号が生成される。
【選択図】図５

Description

本発明はイメージング分野に関し、独特なイメージングシステムを横切る低及び高密度細胞の検出、血液スミアの探知及び識別、生物検定等に特定の応用が見出される。以下このような応用に関連して説明するが、これらの実施の形態は、半導体ウェーハのイメージング、流体または薄い固体フィルム内の粒状汚染物のイメージングのような種々の実質的に平らな表面及びサンプル上の他の型の低または高密度特色をイメージし、探知し、そして識別する応用をも見出すことができ、このようなイメージングは印刷分野、電子分野、医療分野、その他の科学的及びエンジニアリング分野に特定用途を見出すことができる。

希細胞の研究では、典型的に、血液または他の体液内の希細胞の濃度が低いことに起因する特定の問題が生ずる。典型的な希細胞研究においては、不必要な細胞を除去するように血液が処理される。次いで、抗体に付着する蛍光材料のようなプローブを用いて、希細胞の細胞表面または細胞タンパク質に選択的に付着させる。細胞タンパク質は、膜タンパク質、または細胞質タンパク質のような細胞内のタンパク質であることができる。抗体は希細胞の他の型の分子、並びにＤＮＡにも付着することができる。

蛍光材料は、蛍光マーカー染料、または関心がある細胞を識別するものであればどのような他の適当な材料であっても差し支えない。このように処理されるスミア（血液及び／または血液の成分を含むことができる）は、標的とする型の希細胞を識別するために準備され、光学的に分析される。統計的な精度を上げるためには、特定のプロセスが要求するだけの多数の細胞を入手することが重要である。若干の研究では、少なくとも10個の希細胞を識別すべきであり、そのためには希細胞濃度が１／百万の場合、少なくとも一千万個の細胞のサンプリングが必要になる。このような血液スミアは、典型的に約100ｃｍ²の面積を占有する。しかしながら、これは単なる一例に過ぎず、特定の試験または研究の統計的精度を上げるためには他の数の細胞を必要とし得ることを理解されたい。使用され、研究される他の細胞識別子は、量子ドット及びナノ粒子プローブである。また、希細胞を１／百万細胞濃度として説明したが、これは本発明を限定することを意図するものではなく、探し求めている細胞の希有さの例として示したに過ぎない。本明細書に記述されている概念は、より高い、またはより低いレベルの細胞濃度に有用であることを理解されたい。

多数の細胞を高速度で走査する能力が、試験プロセスの処理能力を増加させるキーアスペクトであると考えられる。従って、細胞検出システム及び／またはプロセスによって達成することができる速度、信頼性、及び処理コストを改善するシステムを提供することが価値あるものと考えられる。

ファイバアレイ走査技術（ＦＡＳＴ）は、サンプルの走査、及び潜在的なまたは候補希細胞の検出を達成できる速度を増加させ、従って、大きいサンプルの研究に役立つ。

一般的に、ＦＡＳＴシステムでは、調べられる材料のサンプルは、蛍光材料（例えば、選択的に付着する、またはラベル付けに用いられる染料）を用いて処理される。この処理は、典型的には、測定された量の蛍光材料をサンプル自体内へ導入することによって行われる。サンプルはスライドに付着され、典型的にはレーザ光である放射がサンプルを横切って走査する。これは、本質的にサンプルのラスタ走査であり、通常はスライド上の規準マークに対するサンプル上のレーザの入射位置が常時精密に測定される。レーザビームの走査によって得られる光の出力強度はサンプルの表面上の位置と共に変化する。適切なハードウェアが出力光の選択された波長を検出し、プロセッサが検出された出力光を分析し、蛍光イベントと位置とを関連付ける。

ＦＡＳＴシステム、及び他の殆どの検出システムでは、可能な限り多くの偽実体（即ち、標的細胞の不正確な識別）を排除できることが重要である。このような偽実体の１つの源は、ダスト、残骸、健全細胞であり、これらは蛍光染料を付着させなくても入射入力光に応答して光を放出（もしくは、発光）する（以下、自己蛍光（auto-fluorescence）という）。自己蛍光イベントを識別する、従って、単一の染料が使用されている場合にこのような偽実体を排除できるようにするために、典型的には、蛍光イベントが自己蛍光イベントよりも遙かに輝くように、十分に多量の染料をサンプル内に使用する。しかしながら、使用される染料は比較的高価であり、使用する染料が多過ぎると標的細胞に選択的に付着する能力が失われ、サンプルを飽和させ、サンプル内の意図していない種々の成分に付着するようになる。

自己蛍光を原因とする偽実体を減少させる別のアプローチでは、２つの異なる染料材料をサンプル内に導入する（各染料材料は、入射放射に応答して異なる波長の蛍光を発する）。各染料は、比較的均一に標的細胞に付着する。自己蛍光イベントは入力波長に近付くと最も輝くから、一方の染料はその蛍光波長が源波長から比較的離れるように選択される。蛍光イベントは、両染料の出力波長において調べられる。一方の波長だけに優勢な蛍光イベントは自己蛍光から生ずるような偽実体であると考えられ、一方、両波長において放出されるイベントは標的細胞の存在を表しているものと考えられる。

このデュアル染料配列は、サンプル内にかなりな量の染料が導入されるという欠陥を有している。更に、若干の場合には、染料の一方の“カラー”の他方に対する比を、注意深く制御しなければならない。例えば、488ｎｍレーザで走査し、“緑”及び“赤”染料（即ち、それぞれ緑及び赤波長帯内で蛍光を発する染料）を用いてサンプルする場合、自己蛍光に起因して放出される光は赤チャネルよりも緑チャネルの方が大きい。従って、入射レーザ光によってもたらされる蛍光放出が、スペクトルの緑部分におけるよりも赤部分の方がより強くなるように、２つの染料の比を平衡させる必要がある。励起は、赤染料の方が緑染料よりもかなり非効率的である。従って、かなり多くの赤染料をサンプル内に導入しなければならない。赤対緑の比が33：１であることが典型的である。従って、上述したコスト及び飽和問題、並びにクロストーク及び蛍光間の干渉が発生し得る。

２つの異なる染料の使用に関連する問題を解消するために、U.S. Ser. No. 11 / 018,759は、異なる波長で発光する２つの異なるプローブの使用を通して発生する蛍光間のクロストーク及び干渉を最小にする試みとして、２つの分離したレーザビームで交互に走査する技術を提唱している。しかしながら、この技術は、前述したように高価であること、及びサンプルの準備及びデータ分析が複雑であることを含むそれ自体の欠陥を有している。特に、そして前述したように、第１のプローブ、例えば赤染料の励起が、第２のプローブ、例えば緑染料より非効率的であり、緑染料の約33倍程多くの赤染料を使用しなければならない。この要求のために、サンプルの処理はより複雑になり、総合的に費用が増加するようになる。更に、赤染料または他のプローブ材料を大量に使用することも、染料または材料の累積または凝集をもたらすが、これは望ましいことではない。

従って、当分野においては、単一のレーザを使用し、単一の染料だけでよく、しかも自己蛍光イベントに起因して発生するような偽実体を排除可能にすることによってコスト及び複雑さを低減させるような、希細胞を走査するプロセス及びシステムに対する要望が存在している。

本発明によるシステム及び方法によれば、単一のプローブをサンプルに付着させ、単一波長の光源を用いてサンプルを励起し、光源からある距離に光を放出させることによって自己蛍光を信号から分離することができる。放出された光はスプリットされ、スプリットされた光は２つまたはそれ以上の別個のチャネル内に集められる。別個のチャネルの第１のチャネルは、別個のチャネルの第２のチャネルより光源の近くに位置決めされる。第２のチャネルは、第１のチャネルより単一のプローブの発光周波数に接近している。第１のチャネル内に集められた光、及び第２のチャネル内に集められた光が調査され、結果はその調査に基づく。

図１に示すイメージング装置はガルバノメータをベースとするレーザ走査システムを使用し、このレーザ走査システムは単一のレーザ送信機及び２チャネル検出器配列を使用している。図示したイメージング装置（または、イメージャ）１０は、スライド１６の表面の少なくとも一部分上に配置された生物学的スミア１４のようなサンプル１２を調べる。以下に説明するイメージング装置またはイメージャ１０は、微小な、または微視的な材料を検出するように設計されている。

当分野においては公知なように、細胞研究の場合のサンプル１２は、限定するものではないが、被験者からの血液または血液の部分のような生物学的流体のサンプルを引出すことによって適切に準備される。好ましい実施の形態では、サンプルは細胞の単分子膜である。流体サンプルは、限定するものではないが、タンパク質、核酸、または他の分子のような細胞の表面上または内側にあり得る異なる種類の生物学的分子に選択的に結合するマーカー染料のようなプローブを用いて処理される。当分野においては、選択された癌細胞型、胎児細胞、または他の関心を寄せている適切な細胞を含む臨床的に興味のある多くの異なる細胞型をマークするための適当なマーカーが知られている。脳細胞、肝細胞、並びに、特にバクテリア細胞のような他の多くの細胞のためのマーキング材料を開発する努力も払われている。マーキング材料は、選択された波長またはスペクトルの光による照射、ｘ線照射、電子ビーム照射等のような選択された励起照射に応答して、蛍光または燐光のような特性出力を放出することが好ましい。典型的に、特性ルミネセンスは、固有波長または波長のスペクトル範囲を有している。染料は有力なタグ付けプロセスであるが、量子ドット及びＤＮＡナノ粒子プローブとして知られるマーカーの使用を含む他の技術も存在している。

単一のマーカーまたはプローブを含むサンプル１２は、イメージャ並進運動ステージ（またはスライドホールダ）２０（部分的に図示）上に取付けられる。スライドホールダ２０は、サンプル１２を支持する線形に並進運動可能なトラック２２を含んでいる。伝導装置２６を介して電動機２４がトラック２２に接続されており、トラック２２及び支持されているサンプル１２をｙ方向（矢印２８で示す）及びｘ方向（矢印２９で示す）に沿って並進運動させる。図１には並進運動ステージ２０が回転電動機２４によって駆動されるように示してあるが、他の型の機械的駆動デバイスの使用も考えられる。更に、サンプル回転のような他の型のサンプル運動も考えられる。

光ファイバ束４０は、サンプル１２に近接する第１の端４２、及びサンプル１２から離れている第２の端４４を含む。第１の端４２は互いに実質的に平行に配列されている複数の第１のファイバ端４６を含む。第１のファイバ端４６は、全体的に線形の、即ち高アスペクト比の矩形入力開口４８を形成し、長い方のディメンションがｘ方向に揃うように配列されている。入力開口４８は、多数の、即ち数千の第１のファイバ端４６を含むことが好ましい。１つの適当な実施の形態では、各々が約50ミクロンの直径を有する40,000本のファイバが40ファイバ×1,000ファイバのアレイに配列されて入力開口４８を形成し、長い方のディメンションは約５ｃｍ、短い方のディメンションは約0,2ｃｍである。これは、25：１のアスペクト比に対応している。第１のファイバ端４６は、規則的なパターンに配列することができる。代替として、第１のファイバ端は、不規則な、または非周期的なアレイに配列することができ、50ミクロンよりも大きい、または小さい直径を有することもできる。一般的には丸いのであるが、ファイバ端は長円形、方形、六角形、または他の断面形状であることもできる。第１のファイバ端４６は、生物学的スミア１４を見るように、スミア１４の面に実質的に直角に配向される。

光ファイバ束４０の第２の端４４は、コンパクトで全体的に円形の出力開口５２を形成している複数の第２のファイバ端を含むように、第１の端４２と第２の端４４との間で断面ディメンション及び形状を“モーフ（morphs）”、または変化させる。好ましくは、第１のファイバ端４６と第２のファイバ端５０との間に１：１の対応が存在し、それ自体の導波クラッディングを有する個々の、そして別々のファイバによって、各第１のファイバ端が第２のファイバ端に接続されている。代替として、各ファイバは、光透過性ファイバコア、及び光を導波するための周囲／コア界面機能だけを含むことができる。他の光ファイバ型も使用することができ、このようなファイバは当分野においては公知であり、典型的にはガラス、プラスチック、または他の光透過性材料から押出し方法で形成される。押出され、全体的に線形の第１の端４２からコンパクトな、全体的に円形の第２の端４４まで形状がモーフされているファイバ束４０は、連続的に光ファイバ束４０のファイバの空間的配列を変化させることによって形成することが好ましい。各ファイバが50ミクロンの直径を有する40,000本のファイバの場合には、全体的に円形の出力開口５２は約1.3ｃｍの円形直径を有している。

ファイバを配列する上で、便宜上、第１及び第２のファイバ端４６、５０をそれぞれの開口４８、５２において互いに他方に対して選択された対応を有するように配列されているが、代わりに、ファイバ端４６、５０はそれらの間に全体的に相関していない、任意の関係を有することができる。光ファイバ束４０に類似のモーフされた光ファイバ束が公知であり、集束された光を線形照明パターンに変換するような他の応用のために、及び光ビームをモノクロメータまたは分光計の線形スリット内へ結合するために、光学の分野において使用されている。

良好な光透過を得るために、光ファイバ束４０は高いファイバパッキング係数を有することが好ましく、例えば、光ファイバ束４０は約0.80またはそれより高いパッキング係数を有している。光透過に影響を及ぼす他のファクタは、第１及び第２のファイバ端４６、５０のチップの研磨または光透過特性、ファイバの単位長当たりの吸収、及びファイバの総合長さを含む。光ファイバ束４０の鋭い曲げを回避することによって、曲げ損失を回避することが好ましい。

集めた光の輸送モードとしてファイバ束を説明したが、適切な特性を含む既存の、またはその後に開発された光透過要素、または光路、または光パイプを、光路または光パイプとして使用することができることが理解できる。

更に図１を参照する。適当な実施の形態の走査放射（光）源６０は、生物学的スミア１４をマークするのに使用される材料を励起するために選択されたある波長、または波長範囲の励起光（放射ビーム）６４を発生するレーザ６２を含む。励起光６４は、電気的入力に応答して回転する（湾曲した矢印６８で示す）反射性表面を有するガルバノメータ６６によって角度的に走査される。オプションである集束レンズ７０は、角度的に走査された励起光６４をサンプル１２上に、特定的には、生物学的スミア１４上に集束させる。回転鏡６６によって発生された角度的走査は、生物学的スミア１４上の励起光を、入力開口４８の下に配列され、そして入力開口４８の長い方のディメンションに平行な線形軌道に沿う線形掃引または高速走査（矢印７２で示す）に変換する。即ち、図１の座標系を用いれば、線形軌道７４はｘ方向に平行であり、適当な実施の形態では、軌道７４は入力開口４８の約１ｍｍ下の生物学的スミア１４上に配置されている。この距離は、これらの概念を実現するデバイス及び環境に依存して他の距離であることも適切である。

細胞研究の場合、励起放射６４は細胞のサイズ（サイズは変化し得るが、典型的には約１乃至30ミクロンのサイズである）と実質的に適合するスポットサイズを生物学的スミア１４上に発生することが好ましい。このような細いビーム集束を得るために、典型的に集束レンズ７０が含まれている。

更に図１を参照する。電子制御ユニット９２はガルバノメータ６６及び並進運動ステージ２０と通信し、軌道７４に沿う放射ビーム６４の線形掃引または走査７２、及びサンプル１２の線形並進運動２８を調和させ、短い軌道７４のスパン及び入力開口４２の長い方のディメンションによってｘ方向を限られているサンプルの選択された面積を横切ってラスタリングを遂行させる。好ましくは、軌道７４のスパンを、入力開口４２の長い方のディメンションと実質的に適合させる。

励起放射ビーム６４は、入力開口４２の集光角よりも大きい傾斜角で生物学的スミア１４上に入射する。集光角は、入力開口４２の短い方のディメンション、入力開口４２と生物学的スミア１４との間の距離、及び第１のファイバ端４６の集光特性に依存する。後者は、ファイバ端の数値開口によって適当に特徴付けられる。当分野においては公知のように、光ファイバ端は典型的に、細胞の弱い特性ルミネセンスを集めるのに特に有利な大きい集光角に対応する大きい数値開口を有している。適当な実施の形態においては、放射ビーム６４は30°−90°でサンプルに衝突する。ビーム６４が約90°でサンプル１２上に衝突する場合、二股光路を設けることができ、光は走査ビームの両側で集められる。このような二股光路の例が、2004年12月20日付Douglas N. Curryらの米国特許出願第11 / 017,440号（代理人ドケットA2247-US-NP、XERZ 2 00868）「希細胞検出器のための走査及び集光の改良された方法及び装置」に開示されているので参照されたい。

放射ビーム６４の入射角は入力開口４２の集光角よりも大きいので、鏡のように反射した放射は、入力開口４２によって集められない。しかしながら、処理された細胞が発生する特性ルミネセンスは一般的に全ての空間的方向に均一に放出される。即ち、各処理された細胞が点光源に対応することになる。従って、特性ルミネセンスの実質的な部分が入力開口４２によって集められる。これは、入力開口４２が生物学的スミア１４上の放射ビーム軌道７４の直近にあってそれと整列していること、また第１のファイバ端４６の数値開口が大きいからである。集められた光は第１のファイバ端４６へ入り、個々のファイバに沿って伝わり、そして第１のファイバ端４６に対応する第２のファイバ端５０において光ファイバ束４０から出て行く。

特定の細胞が発生した特性ルミネセンスは、一般的には、第１のファイバ端４６の全て、または殆どが集めることはないことが理解される。そうではなく、その細胞に密接している１本または数本の第１のファイバ端４６だけが、それらから特性ルミネセンスを集める。例示実施の形態では、放射のスポットサイズは約７−14ミクロンであって（または、他の実施の形態では、７−15ミクロンまたは他の適切なサイズのスポット）、これは類似のサイズの細胞に対応しており、一方、各第１のファイバ端４６は約50ミクロンの直径を有している。従って、掃引している放射ビーム６４の任意の位置の特性ルミネセンスを見て集めるためには、１本または数本のファイバだけが必要であり得る。

しかしながら、ファイバ束４０の第２の端４４における第２のファイバ端５０はコンパクトな出力開口５２を形成するように配列されているので、特性ルミネセンスは、第１ファイバ端４６のどれが特性ルミネセンスを集めたかには関係なく、出力開口５２に対応するスペースの小さい領域から放射される。励起ビーム６４が、入力開口４８に平行な、そして典型的には入力開口４８の下の軌道７４に沿って掃引するにつれて、第１のファイバ端４６の直近の１本または数本が特性ルミネセンスを集める。この特性ルミネセンスは、光ファイバ束４０によってコンパクトな出力開口５２へ伝えられる。

本発明の１つの適当な実施の形態では、第１のレンズ８０は、出力開口５２から∀10°の角度発散以内に発する光ビーム８２を平行化する公知の光学設計方法を使用して設計されているレンズ組合せを含む。レンズ８０からの平行化された光ビーム８６の別々の部分を、少なくとも２つの別個の検出チャネル８８及び９０の１つへ導くために、ビームスプリッタ８４が使用される。各別個の検出チャネルは、ブロッキングフィルタ８８ａ、９０ａを組入れることができる。これらのフィルタは干渉フィルタであり、反射部分は使用される放射ビーム６４の波長と一致し、透過部分は特性ルミネセンスの波長に対応する。当分野においては公知のように、光干渉フィルタは、光の入射角に強く依存する排除比を有している。１つの実際に構築された実施の形態に使用した干渉フィルタの例は、垂直入射の∀10°以内の光入射に対して10⁶：１またはそれ以上の排除比を呈する。

更に図１を参照する。第２のレンズ８８ｂ、９０ｂは、コンパクトな出力開口５２を、第１の検出チャネル８８及び第２の検出チャネル９０の集束光学系と組合せることによって、平行化され、集められた光を光検出器配列８８ｃ、９０ｃ上に集束させる。各チャネルの光検出器８８ｃ、９０ｃは、空間的に分配された線形入力開口４８のために信号検出を行う単一の光検出器であることができる。処理された細胞が発生して集められた特性ルミネセンスの強度は典型的に低いので、光検出器８８ｃ、９０ｃは光電子増倍管であることができる。当分野においては公知のように、光電子増倍管は、多段高電圧陰極における電子のカスケード増倍を通して実質的な信号利得が得られる。信号対雑音比を更に改善するために、検出チャネル８８、９０の光路を囲んで迷光に起因する雑音を実質的に減少させることができる。検出チャネル８８及び９０からの出力はコントローラ９２へ送られ、ディスプレイ９４上に表示されるイメージが生成される。

当業者ならば、検出チャネル８８、９０を、特定のイメージング状況に適応させるために、構成要素を付加、除去、または置換することによって変更することが可能であろう。また、２つの検出チャネルを示したが、２つより多いチャネルを有するシステムを設計することができよう。別の信号対雑音特性が要求される応用の場合には、光検出器８８ｃ、９０ｃとしてフォトダイオードを使用することができる。

上述した実施の形態では、誘導発光が、サンプルの上に配列された開口４８によって集められるようになっているが、図２に示すように、入力開口４８’は下方から、即ち生物学的スミア１４’とは反対のスライド１６’の側からサンプル１２’を見るように配列することができる。即ち、入力開口４８’は、細胞の特性ルミネセンスに対して光透過性であるスライド１６’を通して生物学的スミア１４’を見る。スライド１６’は、生物学的スミア１４’の下の表面にコーティングしてある吸収バンドパスフィルタのようなレーザブロッキングフィルタ９６（オプション）を含むこともできる。図２の実施の形態は、生物学的スミア１４’上の放射ビーム軌道７４’とほぼ一致する線形焦線を有するオプションとしての円筒形反射器９８を更に含むことができる。円筒形反射器９８は、集められる特性ルミネセンスの量を増加させることによって、若干のイメージング応用の信号対雑音比を改善することができる。円筒形反射器９８は、図１の構成にも使用できることが理解されよう。

従来、上述したシステムにおいては、蛍光プローブが付着した細胞を走査する時に、各々が他とは異なる波長の蛍光を発する複数のプローブを使用すると有利であると考えられていた。このようなデュアルプローブシステムの例は、単一の、及び複数の励起源の使用を意図している。

単一源励起アプローチに固有の問題は、単一の励起レーザによる刺激では長めの波長での放出（例えば、第２のプローブの）が非効率的になり、レーザの波長がその放出に近い場合にはより効率的に励起されることである。更に、１つの励起源を用いるデュアルプローブから適切な放出比を得るためには、混合体内に長い波長放出がより高い濃度で存在することが望ましい。このような高濃度は放出比の広がりをもたらすことができ、また凝集生成をももたらし得る。プローブの濃度が低いとより効率的な励起で使用することができるから、複数の励起源の使用が考えられてきた。

図３には、デュアルプローブの使用に伴う問題が示されている。関心のある波長の例を示すために、透過パーセンテージ１００を波長１０２の関数として図示してある。488ｎｍに垂直線で示されている第１のレーザ波長１０４は、約520ｎｍにピーク放出強度を有する蛍光放出１０６を有するＦＩＴＣプローブを刺激するのに適するレーザ波長である。レーザ波長１０４とＦＩＴＣプローブのピーク放出波長１０６との波長の差は、当分野において「ストークスシフト」として知られている。ストークスシフトは、吸収された量子と放出された量子の波長の差である。放出された波長は、エネルギ保存が原因で入射波長より長いか、または等しく、その差は材料の原子格子内に熱として吸収される。第１の放出フィルタ透過曲線１０８は、第１のレーザの何等かの望ましくない反射、及び他の不要周波数をフィルタし、ほぼ505ｎｍ乃至545ｎｍの範囲内の所望のプローブ蛍光を実質的に透過可能にするのに適当である。

もし576ｎｍにピーク放出強度を有する第２のＲ−ＰＥプローブ１１０を、第１のプローブ１０６と同時に添加すれば、幾つかの問題が発生することが観測されている。第２のプローブからの放出がほぼ550ｎｍ乃至600ｎｍの範囲内の第１のプローブからの放出とかなり重なり合い（信号クロストーク）、第１のプローブ放出と第２のプローブ放出とを区別するのを困難にする。上例では、ほぼ575ｎｍから640ｎｍまでの透過範囲を有する第２の放出フィルタ１１２を追加することができる。このフィルタは、第１のプローブ放出の殆どをブロックすることによって問題を部分的に軽減する。しかしながら、たとえ放出フィルタを使用したとしても、クロストークがかなり残留するので、同じ欠陥が未だ存在する。例えば、第１のプローブ１０６の放出のかなりな部分が第２の放出フィルタ１１２の透過曲線の透過帯内に伸びているので、システムの感度及び信号対雑音比が低下する。

上述した信号損失は、システム内に単一のレーザだけが含まれていること、及びレーザ波長と第２のプローブ１１０との波長の差が大きいために、第２のプローブが第１のプローブ程効率的に刺激されないという事実によってより重大になる。第２のプローブをより効率的に刺激するために、532ｎｍの波長を放出する第２のレーザ波長１１４を使用し、第１のレーザ波長１０４と同時に放出させることが示唆されてきた。しかしながら、これは別の問題をもたらす。532ｎｍの波長の第２のレーザ波長１１４は、第１の放出フィルタ１０８の透過範囲内に入る。このため、第２のレーザ波長１１４の反射が、第１のプローブ１０６からの誘導された放出として誤って検出され得る。

図４に、本発明の概念をより特定的に反映している励起放射及びその結果としての誘導のプロットを示す。

詳述すれば、図１に示すようなＦＡＳＴシステム上で希細胞を走査する場合を含む多くの信号検出システムにおいて発生する自己蛍光が偽実体をもたらし得ることは公知である。これらの自己蛍光偽実体を打破するための上述した１つの技術は、異なる波長を放出する２つの異なるプローブを使用し、これらのプローブからの信号がシステムの両チャネル内にあることを検証する。しかしながら、他に理由がないのであれば、屡々使用される赤染料型プローブが緑染料型プローブよりも低効率であるので、このような解決方法は高価になり、時間を浪費し、そしてサンプルの準備及びデータ分析を複雑にし得る。一般的には、デュアルプローブ型システムにおいては、緑染料の約33倍も多くの赤染料を使用しなければならない。このことも、処理を複雑にし、高価にする。従って、プロセスステップを簡易化し、また処理コスト及びエラーを減少させるために、図４に示す本発明の概念では単一のプローブ１１０だけを使用する。更に、第２の入力または検出チャネル（例えば、赤チャネルまたはフィルタ）１１２のために意図された検出信号を発生させるために単一の励起源周波数１０４だけを使用することも提唱する。しかしながら、システムは、単一のプローブの放出周波数よりも光源（即ち、レーザ）の励起周波数に近い第１の入力または検出チャネル（例えば、緑チャネルまたはフィルタ）１０８をも含む。本発明の概念は、第１のチャネル１０８内で生成される自己蛍光信号１１８を利用することによって検出を改善する。第１のチャネルは励起源（例えば、レーザ）の励起周波数により近く、自己蛍光信号の周波数はプローブの放出周波数よりもレーザの励起周波数により近いから、第１のチャネル１０８内で生成される自己蛍光信号１１８は第２のチャネル１１２内の対応する自己蛍光信号よりも大きくなる。

偽実体を排除するために、チャネル１０８、１１２が試験される。一実施の形態では、この試験は、第２の検出チャネル（例えば、赤チャネル）に到達する自己蛍光の量を除去することを含む。例えば、第１の検出チャネル（例えば、緑チャネル）のある部分が、第２のチャネル（例えば、赤チャネル）から減算される。次いで、検出された赤染料信号が検出された緑染料信号よりも大きい位置だけが“実体ヒット”（自己蛍光によってもたらされた信号を排除する）を決定する。

本発明の別の試験は、２つのチャネルを比較することを含む。詳述すれば、第１のチャネル（例えば、緑チャネル）の信号が第２のチャネル（例えば、赤チャネル）よりも小さいと決定された場合には、第２のチャネル内の信号の全部を使用して対応イメージを生成する。第２の実施の形態は、イメージを生成するのに使用される信号の強度を増加させることができる。

より一般的な場合は、自己蛍光と、ラベル付けされた細胞との間の分離を識別するチャネル内の値の比を経験的に決定し、その比の数を使用して関心のある細胞を識別することであろう。

図４に関連して記述したプロセスをより詳細に説明するために、図５のフロー図を参照する。ステップ１２２において、単一のプローブを用いてサンプルが準備され、ＦＡＳＴシステムのようなスキャナシステムへ供給される。ＦＡＳＴシステムは、単一の光源、及び少なくとも２つの検出チャネルを含むように構成することが好ましい（ステップ１２４）。次いで、単一のレーザ源がサンプルを励起し（ステップ１２６）、単一プローブへの反応に従うサンプルからの光の放出、及び塵埃粒子、スライドの不完全性等に起因する自己蛍光をもたらす（ステップ１２８）。生成された光はスプリットされ（ステップ１３０）、少なくとも２つの別個の入力または検出チャネル内に集められる（ステップ１３２）。第１の検出チャネルは光源周波数により近いように配列されており、第２の検出チャネルは単一プローブの放出周波数により近いように配列されている。次いで、第１のチャネル及び第２のチャネル内に集められた光が調べられる（ステップ１３４）。例えば、光は、それぞれ第１及び第２のチャネルの第１及び第２の光路に沿って、それぞれ第１及び第２の出力／検出領域へ伝えられる。一実施の形態では、これらの出力／検出領域は光検出器であることができる。

一実施の形態では、この調査は、第１のチャネルの光信号を第２のチャネルの光信号から減算することを含む。別の実施の形態では、この調査は、各チャネル内の値の比較を含む。調査の後に、調査に基づく出力信号が生成される（ステップ１３６）。詳述すれば、第２チャネル内の光信号の残りが“実体ヒット”を表すものとして決定され、この信号に関連するデータが表示される。別の実施の形態、即ち比較実施の形態では、第２のチャネルの全光信号が“実体ヒット”を表示するために使用される。

図６は、応用の別の実施の形態を理解し易くするために使用されるシステムの簡易図である。例えば488ｎｍのような単一の周波数で動作する単一のレーザ６２からの光ビーム６４は、回転多角形スキャナ配列１４０へ供給される。図示システムのスキャナ配列１４０は、電動機１４０ｂによって回転する多面鏡１４０ａ、及びフライホイール１４０ｃからなっている。電動機及びフライホイールが滑らかな回転を可能にし、信号のジッタを排除する。図示のように、このスキャナ配列は、オプションのレンズ配列７０を通してレーザビームでサンプル１２を走査する。

サンプル１２の単一プローブからの誘導蛍光が受信され、光路１４２に沿って第１のレンズ８０へ伝えられる。光路１４２からの集束された光ビーム８２は二色鏡８４によってスプリットされ、スプリットされた光ビームの選択的部分が第１の検出チャネル８８及び第２の検出チャネル９０によって受信される。各チャネルは、ブロッキングフィルタ８８ａ及び９０ａ、第２のレンズ配列８８ｂ及び９０ｂ、及び光検出器８８ｃ及び９０ｃをそれぞれ含むように図示されている。この配列によって、光検出器の１つ（例えば、光検出器９０ｃ）は単一プローブからの蛍光、並びに両チャネルからの自己蛍光を検出することができ、検出された強度レベルを制御ユニット９２へ送る。制御ユニット９２は、ディスプレイ９４上に表示またはイメージするための処理を開始する。

以上に、幾つかの実施の形態を特に細胞識別に関連して説明したが、この概念はこのような応用に限定されるものではない。添付図面に示したイメージャ装置の構成は特色を識別、または探知する多くのイメージング応用に適している。１つのこのような応用は、典型的に10乃至１万のＤＮＡ要素がアレイに配列されている（当分野においては、ＤＮＡチップとして知られている）生物学的分野に見出される。ＤＮＡ要素は、選択された要素が蛍光タグを含むように処理される。図示した実施の形態は、多数のＤＮＡ要素を含むＤＮＡチップ内のタグ付きＤＮＡ要素を識別するのに適している。上述した概念を実現することにより、イメージング装置は、既存技術の数倍も速くサンプルにアクセスすることができる。

好ましい実施の形態の特色を組入れるのに適するイメージング装置の斜視図である。 別の実施の形態の側面図であって、モーフされた光ファイバ束の第１の端付近を拡大して示している。 複数プローブを使用する場合の励起放射及びその結果として誘導された放射のプロットである。 単一のプローブだけを使用する場合の励起放射及びその結果として誘導された放射のプロットである。 本発明の概念による動作を説明するフローチャートである。 さらなる実施の形態の特色の概要図である。

符号の説明

１０ イメージング装置（イメージャ）
１２ サンプル
１４ 生物学的スミア
１６ スライド
２０ 並進運動ステージ（スライドホールダ）
２２ トラック
２４ 電動機
２６ 伝導装置
２８、２９ 並進方向
４０ 光ファイバ束
４２ 第１の端
４４ 第２の端
４６ 第１のファイバ端
４８ 入力開口
５０ 第２のファイバ端
５２ 出力開口
６０ 走査放射（光）源
６２ レーザ
６４ 励起光（放射ビーム）
６６ ガルバノメータ
６８ 回転方向
７０ 集束レンズ
７２ 走査方向
７４ 線形軌道
８０ 第１のレンズ
８２ 出力光ビーム
８４ ビームスプリッタ
８６ 平行化光ビーム
８８、９０ 検出チャネル
９２ 電子制御ユニット
９８ 反射器
１００ 透過％
１０２ 波長
１０４ 第１のレーザ波長
１０６ ピーク放出波長
１０８ 放出フィルタ透過範囲
１１０ 第２のＲ−ＰＥプローブ
１１２ 第２の放出フィルタ
１１４ 第２のレーザ波長
１１８ 自己蛍光信号
１４０ 回転多面鏡スキャナ
１４２ 光路

Claims (4)

1. イメージング方法であって、
   単一のプローブを付着させたサンプル上の経路に沿って単一の放射ビームを掃引させるステップと、
   上記単一の放射ビームと上記サンプルとのビーム相互作用によって発生した光を集めるステップと、
   上記集められた光をスプリットするステップと、
   上記第１の集められた光を第１の光路に沿って伝送するステップであって、上記第１の光路は上記集められた光を選択された第１の出力領域へ伝え(channeling)、
   上記第２の集められた光を第２の光路に沿って伝送するステップ、
   を更に含み、上記第２の光路は上記集められた光を選択された第２の出力領域へ伝え、
   上記第１の光を上記第１の出力領域において検出するステップと、
   上記第２の光を上記第２の出力領域において検出するステップと、
   上記第１の検出された光及び上記第２の検出された光を調査するステップと、
   上記調査ステップに基づいて出力信号を得るステップと、
   を更に含むことを特徴とする方法。
2. 上記調査ステップは上記第１のチャネルの光信号の値を上記第２のチャネルの光信号の値から減算して残り信号値を求めるステップを含み、上記第２のチャネルの光信号の値が上記第１のチャネルの光信号の値よりも大きい時に上記第２のチャネルの残り信号値を使用してイメージを生成することを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 上記調査ステップは、上記比較ステップが上記第２のチャネル内の光値が上記第１のチャネル内の光値よりも大きいことを決定するときに、上記第１のチャネルの光信号の値と上記第２のチャネルの光信号の値を比較して上記第２のチャネル内の光値が所望の信号であることを決定するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 単一のプローブを付着させたサンプルをイメージングする走査イメージャであって、
   上記単一のプローブで上記サンプルを支持するイメージャステージと、
   上記イメージャステージ上の上記サンプルを見る近接入力開口、及び遠端出力開口を有する収集光路と、
   上記入力開口に対して固定された相対位置(relative position)に配列され、上記入力開口のビューイング領域内の上記サンプル上に放射ビームを走査させる単一の走査放射源であって、上記放射ビームは上記サンプルと相互作用して光信号を発生させ、上記発生した光信号は上記入力開口によって受信され、上記収集光路を介して上記出力開口へ伝えられ、
   上記収集チャネルからの光を受けてスプリットするように位置決めされている光スプリッタと、
   上記スプリットされた光の第１の部分を受けるように構成されている第１の検出チャネルと、
   上記スプリットされた光の第２の部分を受けるように構成されている第２の検出チャネルと、
   上記第１の検出チャネル及び上記第２の検出チャネルに動作的に組合されているコンパレータまたは減算器の一方と、
   上記コンパレータまたは減算器の動作に基づいてイメージを表示するように配列されているディスプレイと、
   を更に含むことを特徴とするイメージャ。

Images