JP2008032995A - 共焦点顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】走査機構の設計上の自由度が高く、好適な走査を行うことができ、且つ、光源からの光の利用効率が良く、高分解能な試料測定を好適に行うことができる共焦点顕微鏡を提供することである。
【解決手段】照射光を、対物レンズ１２を介して試料２２の焦点面に結像させ、当該照射光の結像点を走査し、当該試料２２の反射光から共焦点画像を得る共焦点顕微鏡１００において、ピンホールユニット８によって、レーザー光源１から出力された光をマルチ光源に変換し、ピンホールユニット８と対物レンズ１２との間に配置された第１オプティカルパラレル２４、第２オプティカルパラレル２６を、ガルバノメータ２５、２７によってそれぞれ傾けることにより、光を平行移動させ、平面走査を行う。
【選択図】図１

Description

本発明は、共焦点走査を行う顕微鏡に関する。

従来、共焦点走査を行う顕微鏡において、数多くの種類のものが提案され、大別するとシングルビーム方式とマルチビーム方式を用いた２種類に分類することができる。シングルビーム方式は、光源より発した光を集光レンズによって一点に集光し、集光した光を用いて走査機構により試料面を走査するので、照明効率が良い反面、試料面の走査に時間がかかるという問題がある。

そして、かかる走査時間の問題を解決する方法として、図９に示すような、マルチビーム方式であるニポーディスク方式の共焦点顕微鏡が知られている（特許文献１参照）。
しかし、ニポーディスク方式は、試料全面を高密度で走査測定し、走査時間を短縮することができる反面、光源から発せられた光の殆どが、図９（ｂ）に示すように、ニポーディスクの開口を有していない面で遮られてしまい、光の利用効率が悪い。また、ニポーディスクが高速回転しているので、振動の影響も考慮しなければならない。

また、図１０に示すように、対物レンズ２０７と物体Aとの間に位置する光透過性の平行平面２１１ａと、この平行平面２１１ａの光軸に対する角度を変化させるガルバノメータースキャナ２１１ｂとにより微小走査を行うマルチスリット型の共焦点顕微鏡が知られている（特許文献２参照）。
特表平０１−５０３４９３号公報 特開２０００−１８０１３９号公報

しかしながら、上記従来技術の場合、特許文献２のように、対物レンズと物体との間に、走査装置として、光透過性の平行平面が配置されているが、対物レンズと物体は、通常、近設しているため、かかる配置では設計上、自由度が低く、平行平面の角度変化が困難であり、そのため物体表面への走査にも限界があった。その結果として、高分解能な走査測定を行うことができなかった。

本発明の課題は、走査機構の設計上の自由度が高く、好適な走査を行うことができ、且つ、光源からの光の利用効率が良く、高分解能な試料測定を好適に行うことができる共焦点顕微鏡を提供することである。

以上の課題を解決するため、請求項１に記載の発明は、
照射光を、対物レンズを介して試料の焦点面に結像させ、当該照射光の結像点を走査し、当該試料の反射光から共焦点画像を得る共焦点顕微鏡において、
光源から出力された光をマルチ光源に変換するマルチ光源変換手段と、
前記マルチ光源変換手段によって変換された複数の光源に基づき平面走査を行う走査手段と、
を備え、
前記走査手段は、前記マルチ光源変換手段と対物レンズとの間に配置され、光透過性を有するオプティカルパラレルと、光軸に対する当該オプティカルパラレルの角度を変化させる角度変化手段と、を備えて構成されることを特徴とする。

請求項２に記載の発明は、
請求項１に記載の共焦点顕微鏡において、
前記オプティカルパラレルは、光軸方向に配置された、第１オプティカルパラレルとこの第１オプティカルパラレルと直交する第２オプティカルパラレルとにより構成されることを特徴とする。

請求項３に記載の発明は、
請求項１又は２に記載の共焦点顕微鏡において、
前記角度変化手段は、ガルバノメータであることを特徴とする。

請求項４に記載の発明は、
請求項１〜３の何れか一項に記載の共焦点顕微鏡において、
前記走査手段は、前記角度変化手段により試料に応じた分解能及び走査時間を可変可能であることを特徴とする。

請求項５に記載の発明は、
請求項１〜４の何れか一項に記載の共焦点顕微鏡において、
試料面の凹凸に応じて結像位置を可変するための可変焦点レンズユニットを備えることを特徴とする。

請求項１に記載の発明によれば、マルチ光源変換手段によって、光源から出力された光をマルチ光源に変換することができ、走査手段によって、前記マルチ光源変換手段によって変換された複数の光源に基づき平面走査を行うことができる。
従って、光源からの光の利用効率が良く、高分解能な試料測定を好適に行うことができる。
また、走査手段は、マルチ光源変換手段と対物レンズとの間に配置され、無限遠補正光学系を構成することとなり、走査機構の設計上の自由度が高く、好適な走査を行うことができる。
さらに、走査手段として、オプティカルパラレルを用いることにより、走査位置に関して高い再現性が期待できる。

請求項２に記載の発明によれば、請求項１に記載の発明と同様の効果が得られることは無論のこと、第１のオプティカルパラレルと、この第１のオプティカルパラレルと直交する第２のオプティカルパラレルを用いることによって、光を前後左右に走査できることとなり、試料の全面に対して、縦、横何れも高い分解能を有し、好適に試料測定を行うことができる。

請求項３に記載の発明によれば、請求項１又は２に記載の発明と同様の効果が得られることは無論のこと、角度変化手段として、ガルバノメータを用いることにより、高精度の光走査を行うことができる。

請求項４に記載の発明によれば、請求項１〜３の何れか一項に記載の発明と同様の効果が得られることは無論のこと、走査手段は、角度変化手段により、試料に応じた分解能及び走査時間を可変可能にすることができる。
従って、例えば、生物を試料とする場合には、走査時間を早め、また、試料からの光の反射率が低い場合には、走査時間を遅くするなど、試料に応じて、好適な測定を行うことができる。

請求項５に記載の発明によれば、請求項１〜４の何れか一項に記載の発明と同様の効果が得られることは無論のこと、可変焦点レンズユニットを用いることによって、試料面の凹凸に応じて結像位置を合わせることができる。

以下に、本発明に係る共焦点顕微鏡について、図面を用いて具体的な態様を説明する。
図１に示すように、共焦点顕微鏡１００は、レーザー光源１と、ビームエキスパンダを構成するレンズ２及びレンズ３と、照射光と反射光を分離するビームスプリッタ６と、光の偏光方向を変える１／４λ板７と、レーザー光源１から出力された光をマルチ光源に変換するピンホールユニット８と、マルチ光源を集光して平行光に変換するリレーレンズ９と、光を左右に走査する第１オプティカルパラレル２４と、第１オプティカルパラレル２４の光軸に対する角度を変化させるガルバノメータ２５と、当該ガルバノメータ２５を駆動する駆動アンプ１５と、光を前後に走査する第２オプティカルパラレル２６と、第２オプティカルパラレル２６の光軸に対する角度を変化させるガルバノメータ２７と、当該ガルバノメータ２７を駆動する駆動アンプ１６と、焦点距離を可変するための可変焦点レンズユニット１０と、当該可変焦点レンズユニット１０を駆動する駆動アンプ１７と、試料２２の表面に光を結像するための結像レンズ１１、及び対物レンズ１２と、試料２２からの反射光を結像する撮像レンズ１３と、撮像レンズ１３を通過し、焦点の合った光のみを通過させるためのピンホール２３と、ピンホール２３を通過した光の結像を検出するイメージセンサ１４と、駆動アンプ１５、駆動アンプ１６、及び駆動アンプ１７を制御する制御装置１８と、イメージセンサ１４からの映像信号と可変レンズユニット１０からの位置信号を入力、及び制御装置１８に制御信号を発する演算装置１９と、演算装置１９で処理した画像信号を蓄積する記憶装置２０と、記憶装置２０に記憶された映像を表示する表示装置２１とを備えてなる。

上記構成の共焦点顕微鏡１００において、例えば、図１に示すように、レーザー光源１から照射された光は、レンズ２で光束の径が拡大され、レンズ３で平行光に変換される。そして、かかる平行光は、ビームスプリッタ６を通過して、１／４λ板７に入射し、さらに、ピンホールユニット８に入射し、マルチ光源に変換される。

ピンホールユニット８は、例えば、図２に示すように、ガラス基板８０３の上面に、平面視において略円形のマイクロレンズアレイ８０１が規則的に並べて設けられ、図３の断面図に示すように、ガラス基板８０３上のマイクロレンズアレイ８０１が設けられていない部分には、遮光膜８０４が形成されている。また、ガラス基板８０３の下面には、ピンホールアレイ８０２が規則的に並べて設けられている。これにより、入射した平行光は、各マイクロレンズアレイ８０１に分割集光され、下面の各ピンホールアレイ８０２から出射される。
このように、ピンホールユニット８は、マイクロレンズアレイ８０１、及びピンホールアレイ８０２を備えることによって、マルチ光源変換手段として機能する。
尚、ピンホールユニット８は、図２に示したものに限らず、マイクロレンズアレイ８０１を、図４、又は図５に示すような、形、配列に設計しても良い。
具体的には、例えば、図４に示すように、マイクロレンズの各縦の配列を一列おきにずらして配置させたり、また、図５に示すように、各マイクロレンズの形状を平面視略円形ではなく、平面視略四角形に設計する。これにより、マイクロレンズの面密度を上げ、光の変換効率を向上させることができる。

ピンホールユニット８によってマルチ光源に変換された光は、リレーレンズ９で平行光に変換される。そして、リレーレンズ９を通過した平行光は、第１オプティカルパラレル２４、及び第２オプティカルパラレル２６の傾きにより、屈曲されて出力される。

第１オプティカルパラレル２４は、例えば、図１に示すように、角度変化手段であるガルバノメータ２５に取り付けられており、駆動アンプ１５により、光軸に対する第１オプティカルパラレル２４の角度が変化される。また、同様に第１オプティカルパラレル２４と平面視において直交する第２オプティカルパラレル２６は、角度変化手段であるガルバノメータ２７に取り付けられており、駆動アンプ１６により、光軸に対する第２オプティカルパラレル２６の角度が変化される。そして、かかる構成を備えることによって、走査手段として機能する。

第１オプティカルパラレル２４、及び第２オプティカルパラレル２６による光の平面走査は、例えば、図６に示すように、第１オプティカルパラレル２４に取り付けられたガルバノメータ２５によって光軸に対する第１オプティカルパラレル２４の角度θを変化させ、入射した光を左右に平行移動させる。同様に、第２オプティカルパラレル２６に取り付けられたガルバノメータ２７によって光軸に対する第２オプティカルパラレル２６の角度を変化させ、入射した光を前後に平行移動させることによって、平面走査を行う。
より具体的に、第１オプティカルパラレル２４、及び第２オプティカルパラレル２６による光の平面走査を、図７を用いて説明する。図７は、ピンホールユニット８によってマルチ光源に変換された各光の平面走査される状態を示す図であり、図中に用いられている同じ番号は、同時に照射される光を示す。具体的には、まず、図中の番号１の位置に各光が照射されており、第１オプティカルパラレル２４を傾けることにより、各光は図中の番号２の位置に走査される。次いで、第２オプティカルパラレル２６を傾けることにより、図中の番号３の位置に走査され、同様にして、第１オプティカルパラレルを、前回の位置に戻すことにより、図中の番号４の位置に走査される。
尚、図７で示した平面走査の軌跡は１例であり、これに限らず、図中の番号を１、４、３、２の順に走査させ、また、走査密度を試料に応じて変化させても良い。

第１オプティカルパラレル２４、及び第２オプティカルパラレル２６によって、平面走査された光は、可変焦点レンズユニット１０によって、試料２２に対して光軸に沿った上下方向に走査される。具体的には、図１に示すように、可変焦点レンズユニット１０のレンズを上下させることによって、対物レンズ１２に入射する光の広がり角を変化させる。そして、図８に示すように、光の広がり角を調整することによって、平行光の場合には、標準焦点位置に結像させ、収束する様な光の場合、より近い近接焦点位置に結像させ、逆に、発散する様な光の場合には、遠方焦点位置に結像させることができる。そのため、第１オプティカルパラレル２４、及び第２オプティカルパラレル２６によって平面走査を行い、可変焦点レンズユニット１０のレンズを上下方向に走査する毎に、各焦点位置が演算装置１９によって算出され、各焦点位置における共焦点像を取り込むことができる。このことから、演算装置１９によって算出された共焦点像の各焦点位置に基づき試料２２の表面の三次元像を構築することができる。

可変焦点レンズユニット１０を通過した光は、結像レンズ１１、及び対物レンズ１２を介して、試料２２の表面に結像する。そして、試料２２の表面からの反射光は、逆の光路を通り、ビームスプリッタ６に戻る。かかる場合、図１に示すように、戻り光は、１／４λ板７を２度通過するので、偏光方向が９０°変化してビームスプリッタ６を通過せずに反射して、撮像レンズ１３に集光し、ピンホール２３を介して、イメージセンサ１４に像を結ぶ。尚、このとき、ピンホール２３を介することにより、Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。

イメージセンサ１４によって結像された像は、演算装置１９で信号処理され、処理された画像データは、記憶装置２０に蓄積される。そして、試料２２を平面走査する度に、画像データが蓄積され、かかる画像データを合成して、表示装置２１に試料２２の画像が拡大表示される。

このように、照射光を、対物レンズ１２を介して試料２２の焦点面に結像させ、当該照射光の結像点を走査し、当該試料２２の反射光から共焦点画像を得る共焦点顕微鏡１００において、ピンホールユニット８によって、レーザー光源１から出力された光をマルチ光源に変換することができ、ガルバノメータ２５、２７によって第１オプティカルパラレル２４、第２オプティカルパラレル２６のそれぞれを傾けることにより、ピンホールユニット８によって変換された複数の光源に基づき平面走査を行うことができる。
従って、光源からの光の利用効率が良く、高分解能な試料測定を好適に行うことができる。
また、第１オプティカルパラレル２４、及び第２オプティカルパラレル２６は、ピンホールユニット８と対物レンズ１２との間の無限遠補正光学系に配置されることとなり、走査機構の設計上の自由度が高く、好適な走査を行うことができる。
さらに、走査手段として、オプティカルパラレルを用いることにより、走査位置に関して高い再現性が期待できる。

なお、本発明は、以上の実施の形態に限定されるものではなく、ビームスプリッタの代わりに、ダイクロックミラーを用いる設計であっても良い。これにより、試料が微生物である場合に蛍光を発するように処理をすれば、微生物の観察を好適に行うことができる。
また、試料の焦点位置合わせを、駆動アンプ、及び駆動アンプを制御する制御装置に接続された試料台を上下させることにより調整することができる設計であっても良い。
また、その他、具体的な細部構造等についても適宜に変更可能であることは勿論である。

本発明に係る共焦点顕微鏡を示す全体構成図である。 本発明に係るピンホールユニットを示す構成図である。 本発明に係るピンホールユニットの断面を示す構成図である。 本発明に係るピンホールユニットの他の実施例を示す図である。 本発明に係るピンホールユニットの他の実施例を示す図である。 本発明に係る走査機構を説明する図である。 本発明に係る共焦点顕微鏡における走査軌跡を示す図である。 本発明に係る可変焦点レンズによる焦点合わせを説明する図である。 従来例の基本構成図である。 他の従来例の基本構成図である。

符号の説明

１ レーザー光源
８ ピンホールユニット（マルチ光源変換手段）
８０１ マイクロレンズアレイ（マルチ光源変換手段）
８０２ ピンホールアレイ（マルチ光源変換手段）
１０ 可変焦点レンズユニット
１２ 対物レンズ
１５ 駆動アンプ（走査手段、角度変化手段）
１６ 駆動アンプ（走査手段、角度変化手段）
１７ 駆動アンプ
１８ 制御装置（走査手段、角度変化手段）
２２ 試料
２４ 第１オプティカルパラレル（走査手段）
２５ ガルバノメータ（走査手段、角度変化手段）
２６ 第２オプティカルパラレル（走査手段）
２７ ガルバノメータ（走査手段、角度変化手段）
１００ 共焦点顕微鏡

Claims (5)

1. 照射光を、対物レンズを介して試料の焦点面に結像させ、当該照射光の結像点を走査し、当該試料の反射光から共焦点画像を得る共焦点顕微鏡において、
   光源から出力された光をマルチ光源に変換するマルチ光源変換手段と、
   前記マルチ光源変換手段によって変換された複数の光源に基づき平面走査を行う走査手段と、
   を備え、
   前記走査手段は、前記マルチ光源変換手段と対物レンズとの間に配置され、光透過性を有するオプティカルパラレルと、光軸に対する当該オプティカルパラレルの角度を変化させる角度変化手段と、を備えて構成されることを特徴とする共焦点顕微鏡。
2. 前記オプティカルパラレルは、光軸方向に配置された、第１オプティカルパラレルとこの第１オプティカルパラレルと直交する第２オプティカルパラレルとにより構成されることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
3. 前記角度変化手段は、ガルバノメータであることを特徴とする請求項１又は２に記載の共焦点顕微鏡。
4. 前記走査手段は、前記角度変化手段により試料に応じた分解能及び走査時間を可変可能であることを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の共焦点顕微鏡。
5. 試料面の凹凸に応じて結像位置を可変するための可変焦点レンズユニットを備えることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の共焦点顕微鏡。

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