JP2008032554A - βアミロイドオリゴマーを用いたバイオチップおよびアミロイドセンサーならびに生体試料中に存在するβアミロイドの検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】アルツハイマー病を早期発見するためのバイオチップおよびそのようなバイオチップを用いた簡便性、携帯性、開発コストの面で優れたバイオセンサーを提供する。
【解決手段】微細加工技術によって１または複数の微小センシング部を電極表面上に配列させ、これら１または複数の微小センシング部の各々にシードβアミロイド（Ａβ）を固定化したバイオ分子アレイチップを作製し、このシードＡβにターゲットＡβが相互作用したときの酸化還元電流値の変化を高感度で測定することによって、試料中のＡβの存在を検出する。
【選択図】図１６

Description

本発明は、βアミロイド（Ａβ）の自己組織化によるアミロイド線維形成を検出するためのバイオセンサーに関する。より詳しくは、本発明は、βアミロイド線維のシードとなるβシート状βアミロイドオリゴマーのマイクロアレイを有するバイオチップおよびその製造方法ならびにそのようなバイオチップを用いたアミロイドセンサーに関する。

高齢者にみられる痴呆症の一つにアルツハイマー病が挙げられる。アルツハイマー病が発症する原因として様々な説があるが、アミロイド仮説が現在最も支持されている。
アミロイド仮説とは、タンパク質の一種であるβアミロイド（Ａβ）が脳内に蓄積して老人斑を形成し、これが神経細胞を死滅させるという仮説である。
脳の神経細胞で産生されるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）がセクレターゼの働きにより切断され、４０または４２個のアミノ酸残基からなるＡβとなり、凝集して脳内で老人斑として蓄積される。４２残基のＡβ（Ａβ_１−４２）は４０残基のＡβ（Ａβ_１−４０）よりも凝集しやすく、そのため、細胞毒性も強い。
脳内でこれらＡβは定常的に合成分泌され、正常な状態では速やかに分解されて蓄積されないが、加齢によりこの分解能力が低下すると蓄積して老人斑を形成すると考えられている。

アルツハイマー病の根本治療として、セクレターゼ阻害剤、Ａβワクチン、Ａβ凝集を促進する銅や亜鉛イオンの除去剤の投与が考えられているが、これらの治療法はまだ確立されていない。現在、日本で唯一認知されたアルツハイマー病の改善薬として塩酸ドネペジルがあるが、痴呆の進行を遅らせる対症療法に過ぎず、軽症のうちから服用することが望まれる。

現段階で、最も多く用いられているアルツハイマー病の診断方法は、患者および家族に対する問診である。しかしながら、アルツハイマー病の症状が顕在化した時点では、脳内の老人斑による脳神経は、修復不能まで損傷している。

したがって、アルツハイマー病の症状が顕在化する前に早期発見するための方法が研究されている。早期発見の方法として、画像診断装置ＰＥＴ（陽電子放射断層撮影）による診断が開発されているが、診断には高額な費用が必要であり、簡便な方法とはいえない。
そこで、より安価で簡便にＡβの蓄積を早期に検出する方法が必要とされる。

生体試料中のＡβの検出方法として、ＥＬＩＳＡ法に代表される抗原抗体反応があげられる。現在では、組織抽出液、培養上清、脳脊髄液、血漿中のＡβ_１−４０およびＡβ_１−４２を高感度に測定することができるＥＬＩＳＡキットが市販されている。
しかしながら、抗原抗体反応を用いる場合、反応条件を厳密に制御しなければならず、また、研究施設で測定しなければならず、簡便ではない。

特表平１０−５０９５１０号公報には、Ａβアミロイドの形成を検出するための迅速な方法が開示されている。この方法によれば、アミロイド症の疑いがあるヒト患者由来の脳脊髄液、血液、血漿などのような生物学的液体を含む試料にＡβのアミノ酸６〜２８を含有するＡβペプチドおよびそれに結合し得る３００ｎＭ以上の重金属カチオンを添加した後、遠心分離によりＡβアミロイドをペレット化して回収する。このペレットを染色色素で染色し、顕微鏡観察によりアミロイド形成を確認する。
しかしながら、この方法では、試料中のＡβの存在量を測定することはできず、アルツハイマー病の早期発見に有効とはいえない。

近年、新薬開発プロセス、医療診断等などの分野において、バイオチップが注目され、研究開発が盛んに進められている。
バイオチップとは、固体表面上（固相化担体としては、シリコン基板、ガラス基板、高分子、金基板など）に、プローブ物質として、ＤＮＡのごとき核酸、酵素や抗体のごときタンパク質、ペプチド等のバイオ分子、あるいは細胞等を固定化し、固定化されたバイオ分子からなるプローブ物質に特定のターゲット物質が結合したときに生じる特異的な反応を検出するものである。特に、微量のサンプルを用いて大量にハイスループットな検出および解析ができるところから、大量かつ同時並行的な処理を要求されるポストゲノム時代のバイオ分子の機能解析技術にはバイオチップ関連技術が必須となっている。
また、医療現場での臨床検査としてポイント・オブ・ケア検査(Point-Of-Care Testing; POCT)の重要性が高まっており、ＰＯＣＴ装置の１つとして、リポソームを用いた携帯型バイオセンサーのような小型化された自動分析システムが有力になると考えられる。

バイオチップの代表例として、基板上にＤＮＡを高密度に固定化し、ハイブリダイゼーションにより相補的な配列の存在を検出するＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）や、タンパク質を固定化し相互作用するタンパク質を検出するタンパク質チップ（プロテインチップ）などがある。

特表平１０−５０９５１０号公報 Vestergaard et al., J. Am. Chem. Soc., 127 (2005) 11892-11893

本発明の目的は、アルツハイマー病を早期発見するためのバイオチップおよびそのようなバイオチップを用いた簡便性、携帯性、開発コストの面で優れたバイオセンサーを提供することにある。

Ａβは、モノマーで存在するときランダムコイル状であるが、自己組織化により凝集すると平面状に整列してβシート状のオリゴマーを形成し、これが成長してアミロイド線維となる（図１）。
また、Ａβに特異的に結合する蛍光色素チオフラビンＴ（ＴｈＴ）が、モノマー状態のＡβに結合すると、非常に弱い蛍光強度でしか発光しないが、オリゴマーまたはアミロイド線維を形成したＡβに結合すると、強い蛍光強度で発光することが知られている（図２）。

Vestergaardらは、Ａβ_１−４０またはＡβ_１−４２のＡβ溶液を炭素電極基板上でインキュベーションし、Ａβのチロシン残基（Ｔｙｒ）の酸化還元反応の時間経過を電気的手法で観察し、同時に、上記のＴｈＴの蛍光挙動を利用することによって、Ａβの自己組織化の過程を調べた研究を報告している［Vestergaard et al., J. Am. Chem. Soc., 127 (2005) 11892-11893］。
この報告から、Ａβ溶液のインキュベーション開始後、ＴｈＴ由来の蛍光強度が上昇し、最終的に蛍光強度が一定値に収束することが分かる（図３）。この方法によれば、蛍光強度の増大はＡβの自己組織化の度合いが高くなったことを示すので、インキュベーション時間に応じて、モノマーが結合してオリゴマーまたはアミロイド線維が形成されていく過程が分かる。
一方、酸化還元電流値はインキュベーション時間に応じて減少し、蛍光強度が一定値に収束したインキュベーション時間領域では、ほぼゼロになっている（図４）。
すなわち、Ａβのチロシン残基（Ｔｙｒ）の酸化還元電流を測定すれば、Ａβの自己組織化の程度を知ることができることを意味している。

そこで、本発明者らは、アルツハイマー病を早期発見するためのターゲットとしてＡβを用いることに着目し、試料中のＡβの自己組織化を検出することができるプローブをバイオチップの基板上に固定化し、酸化還元電流の測定によってアルツハイマー病を早期発見できるバイオチップを構築した。また、このバイオチップを用いることによって、安価かつ簡便なアミロイドセンサーを提供する。

より詳しくは、本発明は、１または複数のβシート状βアミロイドオリゴマーが固定化されているバイオチップであって、
基板；
前記基板上に形成された１または複数の電極配線；
前記１または複数の電極配線を被覆する絶縁膜；および
前記１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に形成された、電極表面に達する１または複数の孔を含み、
ここに、前記１または複数のβシート状βアミロイドオリゴマーは前記１または複数の孔の底部に露出した電極配線の表面に固定化されていることを特徴とするバイオチップを提供する。

本発明において、「βアミロイド」または「Ａβ」とは、脳の神経細胞で産生されるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からセクレターゼの働きにより切断され、遊離した約４０個のアミノ酸残基からなるタンパク質を意図し、４０残基のＡβをＡβ_１−４０と表記し、４２残基のＡβをＡβ_１−４２と表記する。

本発明は、バイオセンサー上でＡβが自己組織化によりアミロイド線維を形成する際の電気信号を測定し、この電気信号の変化を基にして試験試料中のＡβの存在を検出する。
本発明において、微細加工技術によって１または複数の孔、好ましくは微小ウェルを電極表面上に配列させ、これら１または複数の孔の各々の底部に露出した電極表面にアミロイド線維形成のシードとなるβシート状のＡβオリゴマーを固定化して、バイオ分子アレイチップを作製し、このシードＡβにターゲットＡβが結合したときの酸化還元電流値の変化を高感度で検出する。
すなわち、本発明において、前記１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に形成された、電極表面に達する１または複数の孔が、試料中のアミロイドを感知するセンシング部として機能する。

本発明によるバイオチップにおいて、βシート状Ａβオリゴマーをアミロイド線維形成のシードとして用い、このシードをプローブとしてバイオチップのセンシング部に固定する。このβシート状Ａβオリゴマーの幅は１００から１５０ｎｍである。この範囲の大きさのシードであれば、測定直後から試料中のＡβが結合したときの酸化還元電流に変化が生じるため、測定時間を短縮できる。
また、この範囲の大きさのシードは、アミロイド線維に超音波照射することによって、作製することができる。

本発明のバイオチップにおいて、絶縁膜に設けた１または複数の孔の直径がβシート状Ａβオリゴマーの幅と同程度であり、１の孔には１のβシート状Ａβオリゴマーが固定化されていることを特徴とする。
１の孔の底部に露出した電極配線の表面に１または複数のβシート状Ａβオリゴマーのシードを固定化することができるが、このように、１の孔の底部に露出した電極配線の表面にプローブとなるＡβオリゴマーのシードを一つづつ個別に固定化することによって、試料中のＡβを確実にシードと結合させることができ、センシングの精度を向上させることができる。

本発明のバイオチップにおいて、１または複数のβシート状Ａβオリゴマーは、自己組織化単分子（ＳＡＭ）膜を介して間接的に電極配線の露出表面に固定化される。
ＳＡＭ膜の形成には、チオ基またはジチオ基などの電極配線を形成する金属と反応し、結合し易い官能基、および、カルボキシル基またはアミノ基などのタンパク質と結合する官能基を−（ＣＨ_２）−基または−（ＣＨ_２Ｏ）−基で結合した分子を用いることができる。このような分子を含む溶液に電極配線を浸漬することによって、その表面上に容易にＳＡＭ膜を形成することができる。

さらに、本発明は、少なくとも、作用電極、対極および参照電極を含むアミロイドセンサーを提供する。本発明のバイオチップを前記作用電極として用いる。

さらに、本発明は、本発明のアミロイドセンサーを用いて、試験溶液中に存在するβアミロイドを検出する方法も提供する。より詳しくは、本発明による方法は、本発明のアミロイドセンサーの作用電極、対極および参照電極を、被検試料を含有しない対照溶液に浸漬し、前記作用電極を処理する前に、前記作用電極の第１の電気的信号を測定し；
前記アミロイドセンサーの作用電極、対極および参照電極を、被検試料を含有する試験溶液に浸漬し、前記作用電極を被検試料で処理した後、前記作用電極の第２の電気的信号を測定し；次いで、
第１の電気的信号と第２の電気的信号との強度差から、試験溶液中に存在するβアミロイドを検出する方法である。

ここで、「処理」とは、作用電極に固定化されたシードＡβに試料中のＡβが自己組織化により結合するようにする操作をいう。試料中にターゲットＡβが存在していれば、この処理によって、シードＡβにターゲットＡβが結合する。本発明のバイオチップに上記の処理を行う前後で電気的信号を測定し、電気的信号に変化があれば、試料中に、ターゲットＡβが存在していたことを確認することができる。

本発明の方法に用いることができる被検試料は、組織抽出液、培養上清、脳脊髄液および血漿よりなる群から選択される生体試料である。
これらの被検試料は、アルツハイマー病の診断対象の個人から容易に採取することができ、この中に存在するＡβを検出することによって、アルツハイマー病の早期診断が可能となる。

本発明において、特に、電気的信号として酸化還元電流値を用いる。
すなわち、本発明によれば、ターゲットＡβのシードＡβへの結合の有無をバイオチップのバイオ分子アレイ上の酸化還元状態の変化から検出する。
すなわち、ターゲットＡβ中のチロシン残基（Ｔｙｒ）の酸化還元反応に起因する酸化還元電流値を測定するだけでＡβの自己組織化を検出できるので、迅速かつ簡便な測定が可能となる。

実施例１：蛍光法によるＡβ自己組織化の過程の観察（１）
Vestergaardらの方法と同様に、蛍光色素チオフラビンＴ（ＴｈＴ）の蛍光強度を測定することによって、Ａβ_１−４０の自己組織化の過程を観察した。

０．０２％のアンモニア溶液にＡβを４℃にて溶解させて、５００μＭのＡβ溶液を調製し、５０ｍＭのリン酸バッファー、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）でこのＡβ溶液を希釈して、５０μＭのＡβバッファー溶液を調製した。
これとは別に、５０ｍＭのグリシン−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ８．５）にＴｈＴを４℃で溶解させて、５μＭのＴｈＴ溶液を調製した。
５０μＭのＡβバッファー溶液を３７℃でインキュベートし、インキュベート前およびインキュベート開始から１時間毎にＡβバッファー溶液１０μＬを取り出し、９９０μＬのＴｈＴ溶液に添加し、十分に攪拌した後、ＴｈＴ由来の蛍光強度を測定した。励起波長４４０ｎｍ、検出波長４８２ｎｍで蛍光測定を行った結果を図５に示す。
この図によれば、インキュベーション開始から２時間までは蛍光強度に変化がなく、その後蛍光強度が上昇し、インキュベーション開始から１０時間程度で蛍光強度は一定値になったことが分かる。

Ａβの自己組織化の状態を確認するために、原子力間顕微鏡（ＡＦＭ；セイコーインスツルメンツ株式会社ＳＰＩ３８００）を用いてタッピングモードで、インキュベーション開始から２時間後、６時間後および１０時間後の各段階での試料を観察した（図６）。
インキュベーション開始から２時間後、主に、１００ｎｍ〜１５０ｎｍ程度のＡβのオリゴマーが多数形成されていることが確認された（図６ａ）。アミロイド線維の形成も確認された。
インキュベーション開始から６時間後、数μｍ程度のＡβのアミロイド線維の形成が確認された（図６ｂ）。
インキュベーション開始から１０時間後、複雑に絡み合ったＡβのアミロイド線維の形成が確認された（図６ｃ）。

インキュベーション開始から２時間でアミロイド線維が形成され始めるが、この時間領域では、蛍光強度の変化がない。
オリゴマーが形成された２時間以降の時間領域では、蛍光強度は急激に増大する。このことから、オリゴマーの存在が、アミロイド形成を促進するものと考えられる。
したがって、１００ｎｍ〜１５０ｎｍ程度のＡβオリゴマーをシードとして用いることによって、Ａβ自己組織化の過程を測定開始直後から観察でき、これにより、測定時間の短縮を図ることができる。

実施例２：蛍光法によるＡβ自己組織化の過程の観察（２）
Ａβオリゴマーを作製し、これをシードとして、Ａβの自己組織化の過程を蛍光法により観察した。

Ａβオリゴマーの作製は、モノマーとなるＡβを組織化してＡβオリゴマーとすることができるが、この方法では得られたＡβオリゴマーのサイズを制御することが困難であった。
そこで、本発明では、十分にインキュベートすることによって形成したアミロイド線維を切断して、均一なサイズのＡβオリゴマーを作製した。具体的には、以下の手順によりシードとなるＡβオリゴマーを作製した。
実施例１で調製した５０μＭのＡβバッファー溶液を３７℃にて１０時間インキュベートした。この溶液をガラス基板上に滴下し、原子力間顕微鏡（ＡＦＭ；セイコーインスツルメンツ株式会社ＳＰＩ３８００）を用いてタッピングモードで、試料を観察した。
このＡＦＭ像から、Ａβは自己組織化してアミロイド線維を形成していることが分かる（図７ａ）。
このアミロイド線維溶液に２０分間超音波照射を行い、この溶液をガラス基板上に滴下し、上記同様にＡＦＭ像を得た。
このＡＦＭ像から、Ａβのアミロイド線維は、１００〜１５０ｎｍの幅を有するオリゴマーに切断されていることが分かる（図７ｂ）。このオリゴマーをＡβチップに固定化するシードとする。
すなわち、本発明によれば、形成したアミロイド線維を超音波照射により切断してシードとなるＡβオリゴマーを安定して作製することができる（図８）。

このようにして得られたＡβオリゴマー（シードＡβ）の溶液とＡβモノマー溶液とを混合し、シードＡβ濃度が５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬの４種類の混合溶液を調製した。この実施例では、各溶液とも、Ａβモノマー濃度を５０μＭと一定にした。

各混合溶液を、混合直後から３７℃にて１４０分間インキュベートした。混合直後および所定時間経過後に取り出した混合溶液を、実施例１と同様に、ＴｈＴ溶液に添加し、十分に攪拌した後、ＴｈＴ由来の蛍光強度を測定した。励起波長４４０ｎｍ、検出波長４８２ｎｍで蛍光測定を行った結果を図９に示す。
各溶液とも、混合直後から、蛍光強度が増大し、１４０分間でほぼ蛍光強度が一定値に収束した。
すなわち、１００〜１５０ｎｍ程度のＡβオリゴマーをシードとして用いれば、実施例１のように、蛍光強度に変化が観察されない時間領域は存在せず、また、短時間で、アミロイド線維形成までの自己組織化の過程を検出することができることが確認された。

アミロイド線維形成が十分に行われ、蛍光強度が一定になったときの値（収束蛍光強度）をシードＡβ濃度に対してプロットしたグラフを図１０に示す。
この図によれば、シードＡβ濃度と、収束蛍光強度とは線形関係にあり、シードＡβ濃度により、検出感度を調節することができることが分かる。

実施例３：蛍光法によるＡβ自己組織化の過程の観察（３）
実施例２と同様に、Ａβの自己組織化の過程を蛍光法により観察した。
シードＡβ溶液とＡβモノマー溶液を混合し、Ａβモノマー濃度が１μＭ、５μＭ、１０μＭ、３０μＭ、５０μＭの５種類の混合溶液を調製した。この実施例では、各溶液とも、シードＡβ濃度を１０μｇ／ｍＬと一定にした。

各混合溶液を、混合直後から３７℃にて１４０分間インキュベートした。混合直後および所定時間経過後に取り出した混合溶液を、実施例１と同様に、ＴｈＴ溶液に添加し、十分に攪拌した後、ＴｈＴ由来の蛍光強度を測定した。励起波長４４０ｎｍ、検出波長４８２ｎｍで蛍光測定を行った結果を図１１に示す。
各溶液とも、混合直後から、蛍光強度が増大し、１４０分間でほぼ蛍光強度が一定値に収束した。

アミロイド線維形成が十分に行われ、蛍光強度が一定になったときの値（収束蛍光強度）をＡβモノマー濃度に対してプロットしたグラフを図１２に示す。
この図によれば、Ａβモノマー濃度と、収束蛍光強度とは比例関係にあることが分かる。かくして、プローブとしてＡβオリゴマーを固定化したバイオチップ（Ａβチップ）を作製すれば、溶液中のＡβモノマー濃度を測定することの可能性が示された。

また、蛍光強度が実質的に収束したインキュベーション１４０分後の各溶液をガラス基板上に滴下し、原子力間顕微鏡（ＡＦＭ；セイコーインスツルメンツ株式会社ＳＰＩ３８００）を用いてタッピングモードで、試料を観察した（図１３）。
Ａβ濃度が１０μＭ、３０μＭおよび５０μＭの溶液において、針状のアミロイド線維が形成されていることが分かる。一方、Ａβ濃度が５μＭの溶液においては、針状のアミロイド線維は形成されていないが、アミロイド凝集が確認された。
Ａβ濃度が５μＭの溶液の場合、蛍光実験では、蛍光強度の上昇が少ないが（図１１）、アミロイド凝集が発生していることから、試料中のＡβ濃度が５μＭ程度の低い濃度でも、酸化還元電位測定によるアミロイド形成の確認は可能であると予測された。

実施例４：Ａβチップの作製
本発明によるＡβチップの上面図を図１４に示す。この実施例では、ガラス基板１０上に８本の電極配線１３を形成し、一度に８点測定が可能なＡβチップ１を形成した。
電極配線１３の一方の端部にはバイオ分子アレイ領域１３１が形成され、他方の端部にはバイオ分子アレイ領域で検出した電気的信号を取り出すためのパッド１３２が形成されている。
図１５にバイオ分子アレイ領域１３１の拡大上面図を示す。バイオ分子アレイ領域１３１上には絶縁性レジスト膜１４が形成され、この絶縁膜に１または複数の孔を設けることによって、バイオ分子を固定化するための１または複数のセンシング部１３１ａが形成されている。
バイオ分子アレイ領域１３１には、センシング部１３１ａの直径が５μｍ以上の場合、図１５ａに示すように単一のセンシング部を形成することができ、センシング部１３１ａの直径がサブミクロン以下２０ｎｍ程度までの場合、図１５ｂに示すように複数のセンシング部を配列させることができる。

バイオ分子アレイ領域１３１の断面図を図１６ａに示す。この実施例では、ガラス基板１０上に、まず、Ｔｉ薄膜１３ａを形成し、その上にＡｕ薄膜１３ｂを形成することによって、Ａｕ／Ｔｉ積層薄膜からなる電極配線１３を形成した。Ａｕ薄膜を直接ガラス基板に形成することもできるが、Ａｕ薄膜の接着強度が弱いので、Ａｕ薄膜の剥離を防止し、バイオチップの信頼性を向上させるためにＴｉ薄膜を用いた。Ｔｉ以外にＣｒを用いることもできる。

この図が示すように、絶縁性レジスト膜に形成された孔は、下部層の電極配線の表面にまで達している。すなわち、バイオ分子アレイ領域に形成されたセンシング部の側面は絶縁性レジスト膜１４により定められ、センシング部の底部は電極配線１３の表面により定められている。
この構成を用いて、図１６ｂに示すように、センシング部１３１ａの底部の露出した電極表面上にＳＡＭ膜２を形成し、その上にシード３となるＡβオリゴマーを固定化する。
本発明において、このシード３にターゲット４であるＡβモノマーが結合したときの酸化還元電位の変化を検出する。

本発明のＡβチップを作製するために、半導体製造技術で用いられているフォトファブリケーション技術およびナノファブリケーション技術を用いた。ここでは、「ナノファブリケーション技術」なる用語は、ナノインプリンティング技術、蒸着技術、エッチング技術などを組み合わせた技術を意味する。ナノファブリケーション技術はすでにＩＣやＬＳＩ製造技術の１つとして確立されているため、従来のＤＮＡチップのように小型化や製造工程の自動化が可能で、チップの大量生産や低コスト化につながる。
「ナノインプリンティング技術」なる用語は、ナノサイズのパターンのモールドを用いて、レジスト膜にパターンを転写する技術を意味し、レジストにモールドを圧接した後、光照射によりレジストを硬化させる光ナノインプリンティング技術；および、加熱により軟化させたレジストにモールドを圧接し、冷却によりレジストを硬化させる熱ナノインプリンティング技術を含む。

図１７ないし図２０は、本発明のＡβチップを作製する工程を示す概略図である。例として、直径５μｍ以上の単一センシング部を作製する工程について説明する。
まず、基板１０上にスピンコーターを用いて感光性材料であるフォトレジスト１１を塗布し、９０℃にて２分間ベーキングする（図１７ａ,１７ｂ）。この実施例ではガラス基板を用いたが、アルミナ基板、シリコン基板、または、シリコーン樹脂のごとき樹脂製基板等のいずれの材質の基板も用いることができる。
次いで、フォトマスク１２ａを用いて紫外線１２ｂで２０秒間露光し（図１７ｃ）、フォトレジスト１１を現像して電極配線１３用の配線パターンを形成する（図１７ｄ）。フォトレジストには、露光によって結合が分解して現像液に溶解するもの（ポジ型）と、逆に重合して溶解しないもの（ネガ型）があるが、ここではフォトレジスト１１としてポジ型レジスト（ＡＺ１５００：クラリアントジャパン株式会社）を用いた。

その後、真空蒸着やＲＦスパッタリングなどの蒸着技術によって基板上に電極配線となる金属薄膜を形成する（図１８ａ）。
さらに、これをアセトンのごとき有機溶媒中に浸漬して、レジスト１１を剥離することによって、ガラス基板１０上に電極配線１３を形成する（図１８ｂ）。
電極配線１３が形成されたチップの概略上面図を図２１ａに示す。この図には、一方の端部に円形のバイオ分子アレイ領域１３１が形成され、他方の端部には電気的信号を取り出すための角型パッド１３２が形成された電極配線が示されているが、これは電極配線の一例であって、この形状に限定されるものではない。当業者であれば、バイオセンサーに搭載されるバイオチップとして使用できるいずれの形状にも変形することができる。
また、電極配線の本数も、使用の形態に適合させて、適宜増減することができる。

次に、スピンコーターを用いて電極配線１３が形成された基板上に絶縁性レジスト１４を塗布する（図１９ａ）。レジスト１４は、熱ナノインプリンティング技術に用いることができる樹脂であればよく、ここでは、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）を用いる。
次いで、ＰＭＭＡのガラス転移点以上の温度に基板１０を加熱して、レジスト１４を軟化させ、ナノインプリンティング用モールド１５をレジスト１４に圧接する（図１９ｂ,１９ｃ）。モールド１５をレジスト１４に圧接した状態で、ＰＭＭＡのガラス転移点より低い温度に冷却し、レジスト１４を硬化させた後、モールド１５を外す。この状態では、パターンの底部にレジスト残渣１４ａが残存しているので、Ａｒイオン１６の照射による反応性イオンエッチングにより除去する（図１９ｄ,図２０ａ）。
電極配線１３上に絶縁性レジスト１４が形成されたチップの概略上面図を図２１ｂに示す。この図には、絶縁性レジスト１４に孔を設けることによってバイオ分子アレイ領域１３１に形成された単一のセンシング部１３１ａが示されているが、これはセンシング部の一例であって、この形状に限定されるものではない。当業者であれば、バイオセンサーに搭載されるバイオチップとして使用できるいずれの形状にも変形することができる。

従来の半導体製造技術を用いれば、基板上にセンシング部を形成することができるので、上記の条件に限定されることなく、適宜、当業者によく知られた他の条件でセンシング部を形成することができる。
また、センシング部の大きさや個数も、使用の形態に適合させて、適宜増減することができる。
このセンシング部は、シードＡβのサイズと同等の開口を有するウェル形状とすることができる。センシング部をこのようなナノサイズのウェル形状とすることで、１のセンシング部に単一のシードＡβを固定化し、試料中のＡβが確実にシードＡβと結合するように制御することができる。１００ｎｍ〜１５０ｎｍのサイズのシードＡβに対して、例えば、ウェルの直径を１μｍ以下、好ましくは８００ｎｍ以下、より好ましくは５００ｎｍ〜８００ｎｍとする。

次に、絶縁性レジスト１４の表面にＡβなどの生体分子が結合しないように、酸素プラズマ１７の照射により、ＰＭＭＡの表面を親水化する（図２０ｂ）。酸素プラズマ照射により、センシング部の底部に露出した電極表面上の不純物質も除去される。
その後、基板を３,３’−ジチオジプロピオン酸（ＤＴＤＰＡ）の１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬してＤＴＤＰＡをその−Ｓ−Ｓ−基を介して電極表面に結合させてＳＡＭ膜２を形成する（図２０ｃ）。
センシング部の底部にのみシードＡβのプローブ３が固定化されるように、前記のレジスト１４はＤＴＤＰＡの−Ｓ−Ｓ−基が結合しない材料であることが必要である。

次いで、ジオキサンおよび水（９：１［ｖ／ｖ］）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（１ｍＭ））および１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）（１ｍＭ）の混合溶液にチップを３０分間浸漬して、ＤＴＤＰＡのカルボキシル基を活性化する。
ここに、実施例２の手順と同様に作製したシードＡβの５μｇ／ｍＬ溶液にチップを１時間浸漬することによって、そのＮＨ_２基を介して活性化ＤＴＤＰＡのＳＡＭ膜２上にシードＡβのプローブ３を連結させる（図２０ｄ）。リン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）で洗浄することによって、センシング部の底部に固定化されていない未結合のシードＡβを除去して、Ａβチップを作製する。

実施例５：ＡβチップのＡβ自己組織化検出能力の評価
実施例４におけるＡβチップの作製の各段階で、サイクリックボルタンメトリーによって、Ａβチップの酸化還元電位を測定し（図２２）、これから電流電位曲線を得た（図２３）。また、測定は２５℃にて行い、電位の掃引速度は５０Ｖ／秒とした。

具体的には、センシング部の底部の電極表面にＡｕ薄膜１３ｂが露出している段階Ａ、センシング部を１ｍＭのＤＴＤＰＡ溶液に１時間浸漬してＳＡＭ膜２を形成した段階Ｂ、ＳＡＭ膜２上にシードＡβのプローブ３を結合した段階Ｃ、およびシードＡβのプローブ３を結合したセンシング部をターゲット４であるＡβモノマーの１０μＭ溶液に２時間浸漬した後の段階Ｄの各段階で電流電位曲線を得た（図２３）。
この図によれば、Ａｕ薄膜１３ｂがＤＴＤＰＡ溶液と接触することによって、酸化還元電流値が大きく低減し、Ａｕ薄膜上にＳＡＭ膜２が形成されたことが確認された。
次に、ＳＡＭ膜上にシードＡβを結合しても酸化還元電流値にはほとんど変化がなかった。これにより、ＳＡＭ膜上へのＡβの結合は、酸化還元電流値に影響を与えないことが分かった。
さらに、シードＡβが結合されたセンシング部をＡβモノマー溶液に接触させると、酸化還元電流値は大きく減少し、ほぼゼロとなった。このことは、ＡβモノマーがシードＡβに結合し、酸化還元電流値を減少させたことを示す。

かくして、本発明により、溶液中のＡβモノマーの存在を検出するバイオチップおよびバイオセンサーが提供された。

Ａβモノマーが自己組織化して、オリゴマーからアミロイド線維を形成する概略図。 Ａβに結合したＴｈＴの蛍光発光挙動を示す概略図。 Ａβに結合したＴｈＴの蛍光強度とインキュベーション時間との関係を示すグラフ。 Ａβの酸化還元電流値とインキュベーション時間との関係を示すグラフ。 Ａβに結合したＴｈＴの蛍光強度とインキュベーション時間との関係を示すグラフ。 Ａβオリゴマーからアミロイド線維形成までの各段階のＡＦＭ像。 アミロイド線維およびＡβオリゴマーのＡＦＭ像。 アミロイド線維から本発明のシードＡβを作製する概略図。 一定濃度のＡβモノマーおよび種々の濃度のシードＡβを含む溶液中のＴｈＴ由来の蛍光強度とインキュベーション時間との関係を示すグラフ。 収束蛍光強度とシードＡβ濃度との関係を示すグラフ。 一定濃度のシードＡβおよび種々の濃度のＡβモノマーを含む溶液中のＴｈＴ由来の蛍光強度とインキュベーション時間との関係を示すグラフ。 収束蛍光強度とＡβモノマー濃度との関係を示すグラフ。 一定濃度のシードＡβおよび種々の濃度のＡβモノマーを含む溶液から得られたアミロイド線維のＡＦＭ像。 本発明のＡβチップの上面図。 本発明のＡβチップのバイオ分子アレイ領域の上面図。 本発明のバイオ分子アレイ領域の断面図。 本発明のＡβチップの製造工程を説明する概略断面図。 本発明のＡβチップの製造工程を説明する概略断面図。 本発明のＡβチップの製造工程を説明する概略断面図。 本発明のＡβチップの製造工程を説明する概略断面図。 本発明のＡβチップの製造工程を説明する概略上面図。 本発明のＡβチップを用いて得られたサイクリックボルタノグラム。 本発明のＡβチップを用いて測定した電流電位曲線。

符号の説明

１・・・バイオチップ（Ａβチップ）、１０・・・基板、１１・・・レジスト、１２ａ・・・フォトマスク、１２ｂ・・・紫外線、１３・・・電極配線、１３１・・・バイオ分子アレイ領域、１３１ａ・・・センシング部、１３２・・・パッド、１４・・・絶縁性レジスト、１５・・・ナノインプリンティング用モールド、１６・・・反応性イオン、１７・・・酸素プラズマ、２・・・ＳＡＭ膜、３・・・プローブ、４・・・ターゲット。

Claims (8)

1. １または複数のβシート状βアミロイドオリゴマーが固定化されているバイオチップであって、
   基板；
   前記基板上に形成された１または複数の電極配線；
   前記１または複数の電極配線を被覆する絶縁膜；および
   前記１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に形成された電極表面に達する１または複数の孔を含み、
   ここに、前記１または複数のβシート状βアミロイドオリゴマーは前記１または複数の孔の底部に露出した電極配線の表面に固定化されていることを特徴とするバイオチップ。
2. βシート状βアミロイドオリゴマーの幅が１００から１５０ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ。
3. 絶縁膜に設けた１または複数の孔の直径がβシート状βアミロイドオリゴマーの幅と同程度であり、１の孔の底部に露出した電極配線の表面には１のβシート状βアミロイドオリゴマーが固定化されていることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ。
4. １または複数のβシート状βアミロイドオリゴマーが、自己組織化単分子膜を介して前記１または複数の孔の底部に露出した電極配線の表面に固定化されていることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ。
5. 少なくとも、作用電極、対極および参照電極を含むアミロイドセンサーであって、
   ここに、前記作用電極は、１または複数のβシート状βアミロイドオリゴマーが固定化されているバイオチップであって、
   基板；
   前記基板上に形成された１または複数の電極配線；
   前記１または複数の電極配線を被覆する絶縁膜；および
   前記１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に形成された電極表面に達する１または複数の孔を含み、
   ここに、前記１または複数のβシート状βアミロイドオリゴマーは前記１または複数の孔の底部に露出した電極配線の表面に固定化されていることを特徴とするバイオチップであることを特徴とするアミロイドセンサー。
6. 請求項５に記載のアミロイドセンサーの作用電極、対極および参照電極を、被検試料を含有しない対照溶液に浸漬し、前記作用電極を処理する前に、前記作用電極の第１の電気的信号を測定し；
   前記アミロイドセンサーの作用電極、対極および参照電極を、被検試料を含有する試験溶液に浸漬し、前記作用電極を被検試料で処理した後、前記作用電極の第２の電気的信号を測定し；次いで、
   第１の電気的信号と第２の電気的信号との強度差から、試験溶液中に存在するβアミロイドを検出する方法。
7. 被検試料が、組織抽出液、培養上清、脳脊髄液および血漿よりなる群から選択される生体試料であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. 第１および第２の電気的信号が、酸化還元電流値である請求項６に記載の方法。
   

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