JP2008088103A - Reagent for measuring factor ii, vii, ix and x and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、外因系の血液凝固検査に用いられる、II、VII、IX、X因子測定用試薬、具体的には組換えウシ組織因子を含有するII、VII、IX、X因子測定用試薬、及び当該試薬に用いられる組換えウシ組織因子、並びに組換えウシ組織因子及び当該II、VII、IX、X因子測定用試薬の製造方法に関する。 The present invention relates to a reagent for measuring II, VII, IX, factor X, specifically, a reagent for measuring II, VII, IX, factor X, which contains recombinant bovine tissue factor, used for an exogenous blood coagulation test, And a recombinant bovine tissue factor used in the reagent, and a method for producing a recombinant bovine tissue factor and a reagent for measuring the II, VII, IX, and factor X.
血中のII因子、VII因子、IX因子、及びX因子の凝固能を総合的に調べる検査は、トロンボテストとも呼ばれている。この検査に用いられる試薬は、主要成分として、ウシ脳組織トロンボプラスチン、フィブリノゲン及び第V因子、カルシウム、リン脂質を含有している。 The test that comprehensively examines the coagulation ability of factor II, factor VII, factor IX, and factor X in the blood is also called a thrombotest. The reagent used for this test contains bovine brain tissue thromboplastin, fibrinogen and factor V, calcium, and phospholipid as main components.
主要成分のウシ脳組織トロンボプラスチンは、非特許文献1のFig.3で示されているように、N末端から213番目までの細胞外ドメイン(可溶性ドメイン)と214番目から236番目までの膜貫通ドメインと237番目から257番目までの細胞内ドメインからなる全アミノ酸257個の組織因子とよばれるタンパク質に、リン脂質が結合した複合体である。このような構成を有するトロンボプラスチンは、従来より、ウシ大脳を原料として、アセトン粉末あるいは生理食塩水を用いてトロンボプラスチンを抽出することにより製造される。 The main component of bovine brain tissue thromboplastin is described in FIG. 3, the total amino acid 257 consisting of the extracellular domain (soluble domain) from the N-terminal to the 213th, the transmembrane domain from the 214th to the 236th, and the intracellular domain from the 237th to the 257th It is a complex in which a phospholipid is bound to a protein called individual tissue factor. Conventionally, thromboplastin having such a structure is produced by extracting thromboplastin using acetone powder or physiological saline from bovine cerebrum as a raw material.
原料として用いられるウシ大脳は狂牛病(BSE)の高度感染部位の1つであることから、近年、製造現場において、原料として、ウシの大脳を使用しない製造方法が求められている。また、天然のウシ脳より抽出された粗製のトロンボプラスチンを含んだ試薬では、季節の変動、ロット間の変動が問題となる。また、天然のウシ大脳から抽出されたトロンボプラスチンを含む試薬には、トロンボプラスチン以外にもウシ大脳由来の成分が不純物として含まれている。そして、この不純物の影響により試薬の安定性が悪く不溶性物質が析出してくるという問題がある。さらに、ウシの血液由来の他の凝固因子も、不純物として含むため、測定対象の凝固因子に対して感度不足になるという問題がある。さらにまた、天然のウシ大脳から抽出されたトロンボプラスチンを含む試薬では、上述した不純物が試薬自体の濁りを引き起こす原因となる。試薬自体に濁りが生じた場合、凝固に伴う測定用試料の濁度等の光学的特性の変化の検出感度が低くなるため、光学的特性を測定して凝固時間を算出する測定器では、脂質の含有量が多い検体など、使用する検体によっては、正確な凝固時間を測定できないといった問題もある。 Since the bovine cerebrum used as a raw material is one of the highly infected sites of mad cow disease (BSE), in recent years, a manufacturing method that does not use bovine cerebrum as a raw material has been demanded. In addition, with a reagent containing crude thromboplastin extracted from natural bovine brain, seasonal variations and lot-to-lot variations become a problem. In addition, the reagent containing thromboplastin extracted from natural bovine cerebrum contains components derived from bovine cerebrum as impurities in addition to thromboplastin. And there exists a problem that the stability of a reagent is bad and an insoluble substance precipitates by the influence of this impurity. Furthermore, since other coagulation factors derived from bovine blood are included as impurities, there is a problem that the sensitivity to the coagulation factor to be measured becomes insufficient. Furthermore, in the reagent containing thromboplastin extracted from natural bovine cerebrum, the impurities described above cause turbidity of the reagent itself. When turbidity occurs in the reagent itself, the detection sensitivity of changes in optical properties such as turbidity of the measurement sample accompanying coagulation is reduced. There is also a problem that an accurate clotting time cannot be measured depending on a sample to be used, such as a sample having a high content of.
上記のような問題解決のために、遺伝子組換え技術により生産された組換え組織因子を使用することが検討されている。
ここで、組換え組織因子及びこれを用いた試薬に関する技術としては、以下のようなものが報告されている。
In order to solve the above problems, the use of recombinant tissue factor produced by genetic recombination techniques has been studied.
Here, the followings have been reported as techniques relating to recombinant tissue factor and reagents using the same.
例えば、特許文献1(特開平5−219957)には、ヒトの遺伝子組換え組織因子を大腸菌で発現させ、得られた組換えヒト組織因子を用いて、プロトロンビン時間測定試薬を調製することが提案されている。ここでは、組織因子高発現セルラインとしてRET−1CELLを選択し、発現ベクターとしてはファルマシア社から販売されているpKK233−2を使用し、ヒト組織因子としてアミノ酸1−219番配列のcDNAを発現させた実施例が記載されている。また、発現ベクターとして、動物細胞(CHO細胞)を用いた実施例も開示されている。しかしながら、ここで得られたヒト組織因子は、いずれも可溶性ドメインにとどまり、膜貫通ドメインを含む完全長の組織因子ではない。また、得られたヒト組織因子は、ベクターとして大腸菌を用いた場合、大腸菌を破壊し、SDSを含むTBSバッファーでタンパク質を抽出したものについて、血液凝固因子に対する結合アッセイを測定するにとどまり、プロトロンビン時間測定試薬の調製までは行なわれていない。同様に、発現ベクターとして動物細胞を用いた実施例では、上清を回収し、濃縮して得られた組織因子について、同様に血液凝固因子との結合アッセイを測定するに留まっている。すなわち、得られた組換えヒト組織因子の適用については、いずれも血液凝固因子に対する結合アッセイに留まり、II、VII、IX、X因子測定用試薬への適用は開示されていない。 For example, Patent Document 1 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-219957) proposes that a human recombinant tissue factor is expressed in E. coli, and a prothrombin time measurement reagent is prepared using the obtained recombinant human tissue factor. Has been. Here, RET-1CELL is selected as the tissue factor high expression cell line, pKK233-2 sold by Pharmacia is used as the expression vector, and cDNA of amino acid 1-219 sequence is expressed as human tissue factor. Examples have been described. Examples using animal cells (CHO cells) as expression vectors are also disclosed. However, all of the human tissue factors obtained here remain in the soluble domain and are not full-length tissue factors containing a transmembrane domain. In addition, when the obtained human tissue factor is Escherichia coli as a vector, only the binding assay for blood coagulation factor is measured for those obtained by destroying Escherichia coli and extracting the protein with TBS buffer containing SDS. The preparation of the measurement reagent has not been performed. Similarly, in the examples using animal cells as the expression vector, the tissue factor obtained by collecting and concentrating the supernatant is similarly measured for a binding assay with a blood coagulation factor. That is, as for the application of the obtained recombinant human tissue factor, all remain in the binding assay for blood coagulation factor, and the application to the reagent for measuring II, VII, IX and X is not disclosed.
また、特許文献2(特表平6−505562)に、ヒトの遺伝子組換え組織因子を大腸菌で発現させ、ヒト組織因子に対して指向性の固定化モノクローナル抗体上でのアフィニティクロマトグラフィを用いて精製した組換えヒト組織因子をプロトロンビン試薬に適用したことが開示されている。ここでは、Nemerson及びPabroskyの方法にしたがって、完全長並びに切断した組換え分子を使用できると記載され、実施例においても完全長組換えヒト組織因子及び切断組換え組織因子が開示されている。ここでは、得られた組換えヒト組織因子を用いて、リン脂質で脂質化することにより、トロンボプラスチン試薬を調製し、調製した試薬を用いて凝固時間を測定している。しかしながら、得られた組換えヒト組織因子を、II、VII、IX、X因子測定用試薬へ適用することについては開示されていない。 Further, in Patent Document 2 (Japanese Patent Publication No. 6-505562), human recombinant tissue factor is expressed in E. coli and purified using affinity chromatography on an immobilized monoclonal antibody directed against human tissue factor. It has been disclosed that the recombinant human tissue factor applied to a prothrombin reagent. Here, it is described that full-length and truncated recombinant molecules can be used according to the method of Nemerson and Pabrosky, and full-length recombinant human tissue factor and truncated recombinant tissue factor are also disclosed in the examples. Here, a thromboplastin reagent is prepared by phospholipidation using the obtained recombinant human tissue factor, and the clotting time is measured using the prepared reagent. However, it is not disclosed that the obtained recombinant human tissue factor is applied to reagents for measuring II, VII, IX, and factor X.
ウサギ組織因子については、Cheryl L Brucatolらが、非特許文献2(「Expression of recombinant rabbit tissue factor in Pichia pastoris,and its application in a prothrombin time reagent(Protein Expression and purification,26(2002),386-393))において、組換えウサギ組織因子(rTF)を酵母で発現させ、ヒスチジンタグを利用して精製し、得られた組換えウサギ組織因子をプロトロンビン時間測定試薬に適用したことが報告されている。発現させたウサギの組織因子は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインからなる完全長のものであると報告されている。 Regarding rabbit tissue factor, Cheryl L Brucatol et al., Non-Patent Document 2 ("Expression of recombinant rabbit tissue factor in Pichia pastoris, and its application in a prothrombin time reagent (Protein Expression and purification, 26 (2002), 386-393 )), It was reported that recombinant rabbit tissue factor (rTF) was expressed in yeast and purified using a histidine tag, and the obtained recombinant rabbit tissue factor was applied to a prothrombin time measurement reagent. The expressed rabbit tissue factor has been reported to be full length consisting of an intracellular domain, a transmembrane domain and an extracellular domain.
同様に、特許文献3(特表平11−514101)においても、完全長の組換えウサギ組織因子を酵母で発現させ、細胞外ドメイン、脂質結合ドメイン、細胞内ドメイン、及び組換え組織因子を選択的に富化するヒスチジンタグを利用して精製したウサギ組織因子をプロトロンビン時間測定試薬に適用したことが開示されている。 Similarly, in Patent Document 3 (Japanese Patent Publication No. 11-514101), full-length recombinant rabbit tissue factor is expressed in yeast, and the extracellular domain, lipid binding domain, intracellular domain, and recombinant tissue factor are selected. It has been disclosed that rabbit tissue factor purified using a histidine tag that is enriched in nature is applied to a prothrombin time measurement reagent.
しかしながら、いずれも、得られた組換えウサギ組織因子を、II、VII、IX、X因子測定用試薬へ適用することについては開示されていない。 However, none of them disclose the application of the obtained recombinant rabbit tissue factor to reagents for measuring II, VII, IX, and factor X.
また、組換え組織因子を、測定用試薬の原料として商業ベースで使用しようとする場合、大量に生産できるシステムを構築できる方法でなければならないが、上述した特許文献及び非特許文献において、大量生産可能な方法の開示はない。 In addition, when a recombinant tissue factor is to be used on a commercial basis as a raw material for a measurement reagent, it must be a method capable of constructing a system capable of mass production. In the above-mentioned patent literature and non-patent literature, mass production There is no disclosure of possible methods.
特許文献4(特開平11−225760)では、段落番号8で、プロトロンビン時間試薬に用いることができ、生物学的に活性な組織因子を得るためには、膜貫通ドメインを有する完全長の組織因子を得る必要があり、この点、酵母、バキュロウィルスをベクターとして用いた昆虫細胞、培養哺乳動物細胞、ヒト細胞系等の真核性システムで発現させることが原理的に適しているとする一方、これらのシステムは経費に関して問題があると説明している。そこで、前記特許文献4では、比較的大量の純粋な組織因子をパイロットプラント規模で調製するための方法として、周辺腔中に発現産物を向けるシグナル配列を含有するベクターに、完全長の組換え組織因子のcDNAを組換え、この発現ベクターをトランスフェクトさせた大腸菌を、成分を工夫した培地で培養する方法を採用することにより、プロトロンビン試薬に用いることができるような組織因子を大量に発現できたことが実施例で示されている。しかしながら、ここで用いられた組織因子が、具体的にどの生物に由来するものなのかということについては、一切記載されていない。さらに、得られた組織因子を、II、VII、IX、X因子測定用試薬へ適用することについては開示されていない。 In Patent Document 4 (Japanese Patent Laid-Open No. 11-225760), in paragraph No. 8, in order to obtain a biologically active tissue factor, a full-length tissue factor having a transmembrane domain can be used as a prothrombin time reagent. In this regard, expression in eukaryotic systems such as insect cells, cultured mammalian cells, and human cell systems using yeast and baculovirus as a vector is suitable in principle. They explain that these systems are problematic in terms of expenses. Therefore, in Patent Document 4, as a method for preparing a relatively large amount of pure tissue factor on a pilot plant scale, a full-length recombinant tissue is used in a vector containing a signal sequence for directing an expression product in the peripheral space. A large amount of tissue factor that can be used as a prothrombin reagent could be expressed by adopting a method in which Escherichia coli transfected with this expression vector was cultured in E. coli transfected with the factor cDNA. This is shown in the examples. However, it does not describe at all what specific tissue the tissue factor used here is derived from. Furthermore, it is not disclosed that the obtained tissue factor is applied to reagents for measuring II, VII, IX, and factor X.
ところで、II、VII、IX、X因子測定用試薬は、VII因子がVIIa因子に変換する反応による外因系凝固機構を利用しており、第VII因子に対する感受性については、ウシ組織因子が優れていることが知られている。従って、II、VII、IX、X因子測定用試薬に用いられる組織因子は、ウシ組織因子である必要がある。 By the way, the reagents for measuring factors II, VII, IX, and X utilize an extrinsic coagulation mechanism by a reaction in which factor VII is converted to factor VIIa, and bovine tissue factor is excellent in sensitivity to factor VII. It is known. Therefore, the tissue factor used in the reagent for measuring II, VII, IX, and factor X needs to be bovine tissue factor.
特許文献5(特開平11−160320)に、組換えウサギ組織因子又はウシ組織因子を再脂質化し、HEPES−tris緩衝液、吸着血漿、カルシウムを加えて、複合因子測定試薬を得ることが提案されている。また、この特許文献5には、使用される組換えウサギ組織因子又はウシ組織因子は、慣用の遺伝子工学的手法に準じて調製することができ、また市販されている組換えウサギまたはウシ組織因子タンパク質を使用してもよいと説明されている。しかしながら、遺伝子工学的手法を用いる場合の説明としては、「例えば、ウサギ組織因子又はウシ組織因子をコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主に組み込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体を培養後、その培養物(培養上清、培養細胞等)を慣用の蛋白質精製法に準じて精製することにより目的とする組換えウサギ組織因子又はウシ組織因子を得ることができる。宿主細胞としては、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞などを用いることができる」(段落番号7)との開示にとどまり、大量生産可能な方法については、記載されていない。尚、特許文献5に開示されているペルフリーズ社の市販品では、完全長の組換えウサギ組織因子が用いられている。 Patent Document 5 (Japanese Patent Laid-Open No. 11-160320) proposes to relipidate recombinant rabbit tissue factor or bovine tissue factor and add HEPES-tris buffer, adsorbed plasma and calcium to obtain a complex factor measurement reagent. ing. In Patent Document 5, the recombinant rabbit tissue factor or bovine tissue factor to be used can be prepared according to conventional genetic engineering techniques, and commercially available recombinant rabbit or bovine tissue factor. It has been described that proteins may be used. However, when using genetic engineering techniques, for example, “For example, a gene encoding rabbit tissue factor or bovine tissue factor is incorporated into an appropriate expression vector, this is incorporated into an appropriate host, and this is incorporated into an appropriate host. After inserting and transforming, transforming the transformant, purifying the culture (culture supernatant, cultured cells, etc.) according to a conventional protein purification method, the desired recombinant rabbit tissue factor or bovine Tissue factor can be obtained.For example, Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, filamentous fungi, plant or animal cells can be used as host cells. The method is not described. Note that the full-length recombinant rabbit tissue factor is used in Pelfreeze's commercial product disclosed in Patent Document 5.
実際のところ、遺伝子工学の技法を用いることにより、宿主に挿入されたcDNA配列を翻訳したタンパク質を生産することはできるものの、翻訳後のN末端、C末端切断等の翻訳後プロセッシング、糖鎖修飾、アミド化等の二次修飾、タンパク質のフォールディングなどについても宿主の影響を受けるため、生産されたタンパク質が天然のタンパク質と同等の生理活性を有していないといった問題がしばしば起る。さらに、生産性の点においても、宿主の影響は避けられず、実用化できる組換え組織因子の生産という観点においては、宿主の選択がかなり重要となる。 In fact, by using genetic engineering techniques, it is possible to produce a protein translated from the cDNA sequence inserted into the host, but post-translational processing such as post-translation N-terminal and C-terminal truncation, sugar chain modification, etc. In addition, secondary modifications such as amidation, protein folding, and the like are also affected by the host, and thus the problem that the produced protein does not have the same physiological activity as the natural protein often arises. Furthermore, in terms of productivity, the influence of the host is unavoidable, and selection of the host is quite important in terms of production of recombinant tissue factor that can be put into practical use.
組換えウシ組織因子を具体的に生産した報告としては、1992年生化学会で、重松欣克(九州大学、理学部)により、酵母を用いた発現系で、ウシ可溶性リコビナントの調製が報告されているだけである。この報告によれば、高榎ら(BBRC.181.1145−1150,1990年)がクローニングしたウシ組織因子のcDNAを用い、可溶性ヒト組織因子の発現に用いた方法に従って、pAM82にウシ組織因子の細胞外ドメイン(1−213)を挿入した発現ベクターを構築し、発現させたとある(非特許文献5)。重松欣克(九州大学、理学部)らは、ウシ組織因子の発現に先だって、酵母及び大腸菌を用いて、ヒト組織因子の発現を試み、全長のヒト組織因子DNAを大腸菌recAプロモータ下流に挿入したが、発現された組織因子は十分な活性を示さなかったこと、抑制性Acid phosphataseプロモータと酵母インベルターゼのシグナル配列の下流に、成熟組織因子に対応するDNAを挿入し、酵母AH22株を形質転換し、発現させた結果、活性ある組織因子が得られたと報告している。つまり、ヒトの遺伝子の組換え組織因子を大腸菌や酵母で発現させたところ、大腸菌では発現活性がでなかったが、酵母発現系を用いることにより、比活性が高い、可溶性ヒト組織因子の大量調製に成功したと報告している(非特許文献3,非特許文献4)。 As a specific report on the production of recombinant bovine tissue factor, the preparation of bovine soluble recombinants in an expression system using yeast was reported in 1992 by the Biochemical Society by Toshikatsu Shigematsu (Kyushu University, Faculty of Science). Only. According to this report, using bovine tissue factor cDNA cloned by Takatsuki et al. (BBRC. 181.1145-1150, 1990), pAM82 was transformed into bovine tissue factor according to the method used for expression of soluble human tissue factor. An expression vector into which the extracellular domain (1-213) has been inserted has been constructed and expressed (Non-patent Document 5). Katsumatsu Shigematsu (Kyushu University, Faculty of Science) et al. Tried to express human tissue factor using yeast and Escherichia coli prior to the expression of bovine tissue factor, and inserted full-length human tissue factor DNA downstream of the E. coli recA promoter. The expressed tissue factor did not show sufficient activity, the DNA corresponding to the mature tissue factor was inserted downstream of the inhibitory acid phosphatase promoter and the yeast invertase signal sequence, and the yeast AH22 strain was transformed, It is reported that active tissue factor was obtained as a result of expression. In other words, when recombinant tissue factor of human gene was expressed in E. coli or yeast, expression activity was not found in E. coli, but by using yeast expression system, a large amount of soluble human tissue factor with high specific activity was prepared. (Non-patent document 3, Non-patent document 4).
以上のように、ウサギ組織因子、ヒト組織因子では、大腸菌、酵母、動物培養細胞系で発現できた実施例が報告されているが、ウシ組織因子では実際に発現させた例としては、重松欣克(九州大学、理学部)の報告がある程度であり、しかも可溶性ドメインだけの発現にとどまっているので、凝固活性は不十分であり、トロンボテスト用試薬に用いることはできない。さらに、遺伝子組換えの手法により、目的とする活性を有する組織因子を実用化できる大量生産レベルで成功したとの報告は、せいぜい、ヒト組織因子を酵母で生産する系、ヒト組織因子を大腸菌で生産する系、ウサギ組織因子を酵母で生産する系程度である。ましてや、組換えウシ組織因子については、II、VII、IX、X因子測定用試薬に用いることができる程度のものを実用化できるレベルで生産されたとの報告は見あたらない。 As described above, examples of rabbit tissue factor and human tissue factor that have been expressed in Escherichia coli, yeast, and animal cultured cell systems have been reported. Since Katsu (Kyushu University, Faculty of Science) reports to some extent and only soluble domains are expressed, the coagulation activity is insufficient and cannot be used as a reagent for thrombotest. Furthermore, reports of successful mass production levels that enable the practical use of tissue factor with the desired activity by genetic recombination techniques are, at best, a system that produces human tissue factor in yeast and human tissue factor in E. coli. The production system is about the system that produces rabbit tissue factor in yeast. In addition, there is no report that recombinant bovine tissue factor was produced at such a level that it can be used as a reagent for measuring factors II, VII, IX, and X.
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、天然ウシ脳由来抽出物のトロンボプラスチン(組織因子−リン脂質複合体)の代替えとなることができる十分な活性を有し、しかも実用化できる規模の大量生産が可能な組換えウシ組織因子及びこれを用いたII、VII、IX、X因子測定用試薬、並びにこれらの製造方法を提供することにある。 The present invention has been made in view of such circumstances, and its object is to provide a sufficient activity that can replace thromboplastin (tissue factor-phospholipid complex) of a natural bovine brain-derived extract. And a recombinant bovine tissue factor capable of mass production on a scale that can be put into practical use, a reagent for measuring II, VII, IX, and factor X using the same, and a method for producing them.
本発明のII、VII、IX、X因子測定用の組換えウシ組織因子は、少なくとも可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインを含むもの、あるいは配列番号1で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の1又は数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列からなるものである。これらは、宿主としてのカイコにおいて発現された組換えウシ組織因子であることが好ましい。 The recombinant bovine tissue factor for measuring factors II, VII, IX and X of the present invention includes at least a soluble domain and a transmembrane domain, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or one or several amino acid sequences. These amino acid sequences are substituted, added or deleted. These are preferably recombinant bovine tissue factors expressed in silkworms as hosts.
本発明のII、VII、IX、X因子測定用の組換えウシ組織因子複合体は、上記本発明の組換えウシ組織因子とリン脂質とからなる複合体である。 The recombinant bovine tissue factor complex for measuring factors II, VII, IX and X of the present invention is a complex comprising the recombinant bovine tissue factor of the present invention and a phospholipid.
本発明のII、VII、IX、X因子測定用試薬は、上記本発明のII、VII、IX、X因子測定用の組換えウシ組織因子複合体を含有するものである。 The reagent for measuring factors II, VII, IX, and X of the present invention contains the above-described recombinant bovine tissue factor complex for measuring factors II, VII, IX, and X of the present invention.
本発明のII、VII、IX、X因子測定用の組換えウシ組織因子の製造方法は、配列番号2で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の1又は数個のアミノ酸が置換、付加、又は欠失したアミノ酸配列をコードするcDNAをバキュロウィルスへ組み込んだ組換えバキュロウィルスをカイコに感染させる工程;前記カイコにおいて、前記cDNAから組換えウシ組織因子を発現させる工程;及び前記組換えウシ組織因子を抽出する工程;を含む。 In the method for producing recombinant bovine tissue factor for measuring factor II, VII, IX, and X of the present invention, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or one or several amino acids of the amino acid sequence is substituted, added, or missing. Infecting a silkworm with a recombinant baculovirus in which a cDNA encoding the lost amino acid sequence is incorporated into a baculovirus; expressing a recombinant bovine tissue factor from the cDNA in the silkworm; and Extracting.
本発明のII、VII、IX、X因子測定用試薬の製造方法は、配列番号2で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の1又は数個のアミノ酸が置換、付加、又は欠失したアミノ酸配列をコードするcDNAをバキュロウィルスへ組み込んだ組換えバキュロウィルスをカイコに感染させる工程;前記カイコにおいて、前記cDNAから組換えウシ組織因子を発現させる工程;前記組換えウシ組織因子を抽出する工程;及び前記組換えウシ組織因子とリン脂質とを混合して、ウシ組織因子−リン脂質複合体を形成させる工程;を含む。 The method for producing a reagent for measuring factor II, VII, IX, or X of the present invention comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence are substituted, added, or deleted. Infecting a silkworm with a recombinant baculovirus incorporating a coding cDNA into a baculovirus; expressing a recombinant bovine tissue factor from the cDNA in the silkworm; extracting the recombinant bovine tissue factor; and Mixing recombinant bovine tissue factor and phospholipid to form a bovine tissue factor-phospholipid complex.
前記ウシ組織因子−リン脂質複合体を形成させる工程において、前記組換えウシ組織因子と前記リン脂質とが、ニッケル存在下で混合されることが好ましい。 In the step of forming the bovine tissue factor-phospholipid complex, the recombinant bovine tissue factor and the phospholipid are preferably mixed in the presence of nickel.
本発明の組換えウシ組織因子は、少なくともII、VII、IX、X因子との反応に必要な部分を含むように、遺伝子組換えにより生産したものであり、本発明の組換えウシ組織因子複合体は、当該組換えウシ組織因子とのリン脂質複合体であるから、従来の天然のウシ大脳からの抽出により生産されるウシのトロンボプラスチンと比べて、不純物の混入が少なく、またロット間でのばらつきが少なく品質が安定している。従って、本発明の組換えウシ組織因子を用いたII、VII、IX、X因子測定用試薬は、従来の天然のウシトロンボプラスチンを用いる測定試薬に匹敵する測定感度を有している。しかもカイコを宿主として用いた系では大量生産が可能で、従来の天然物からの抽出法よりも生産性に優れている。 The recombinant bovine tissue factor complex of the present invention is produced by genetic recombination so as to contain at least a portion necessary for reaction with factors II, VII, IX, and X. Since the body is a phospholipid complex with the recombinant bovine tissue factor, compared to bovine thromboplastin produced by extraction from conventional natural bovine cerebrum, there is less contamination of impurities, and between lots There is little variation and the quality is stable. Therefore, the reagent for measuring II, VII, IX, and factor X using the recombinant bovine tissue factor of the present invention has measurement sensitivity comparable to that of a conventional measuring reagent using natural bovine thromboplastin. Moreover, a system using silkworms as a host can be mass-produced, and is superior in productivity to conventional extraction methods from natural products.
〔組換えウシ組織因子〕
本発明に係るII、VII、IX、X測定用組換えウシ組織因子は、リン脂質と複合体化することによりヒト血液中のVII因子を活性化するものであり、少なくとも天然のウシ組織因子の可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインを有する。組換えウシ組織因子の可溶性ドメインはVII因子と相互作用するのに必要なドメインであり、膜貫通ドメインはリン脂質との複合体を形成するのに必要なドメインである。
[Recombinant bovine tissue factor]
The recombinant bovine tissue factor for measuring II, VII, IX, X according to the present invention activates factor VII in human blood by complexing with phospholipid, and at least natural bovine tissue factor It has a soluble domain and a transmembrane domain. The soluble domain of recombinant bovine tissue factor is the domain necessary to interact with factor VII and the transmembrane domain is the domain necessary to form a complex with phospholipids.
II、VII、IX、X測定用組換えウシ組織因子としては、好ましくは、リン脂質との複合体を形成してVII因子を活性化する能力を損なわない範囲で、可溶性ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを有するものである。具体的には、配列番号1で示されるアミノ酸配列のうちの1又は数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失したものでII、VII、IX、X因子と反応活性を示すものである。 Recombinant bovine tissue factor for measuring II, VII, IX, X is preferably a soluble domain, a transmembrane domain, as long as it does not impair the ability to form a complex with phospholipid and activate factor VII. And having an intracellular domain. Specifically, one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are substituted, added, or deleted, and exhibit reaction activity with factors II, VII, IX, and X.
ここで、配列番号1は、非特許文献1のFig.3に示されている正常ウシ組織因子のアミノ酸配列であり、1番アミノ酸から213番アミノ酸までが可溶性ドメイン(細胞外ドメイン)に該当し、214番アミノ酸から236番目までが膜貫通ドメインに該当し、237番目から257番目までが細胞内ドメインに該当する。 Here, SEQ ID NO: 1 is shown in FIG. The amino acid sequence of normal bovine tissue factor shown in Fig. 3, wherein amino acids 1 to 213 correspond to the soluble domain (extracellular domain), and amino acids 214 to 236 correspond to the transmembrane domain. The 237th to 257th regions correspond to intracellular domains.
本発明に係るII、VII、IX、X因子測定用組換えウシ組織因子においては、糖鎖の有無は特に限定しないが、例えば、後述する製造方法により製造される組換えウシ組織因子の場合には、糖鎖がついている。 In the recombinant bovine tissue factor for measuring factor II, VII, IX, and X according to the present invention, the presence or absence of a sugar chain is not particularly limited. For example, in the case of a recombinant bovine tissue factor produced by the production method described later. Has a sugar chain.
〔ウシ組織因子−リン脂質複合体〕
本発明のウシ組織因子−リン脂質複合体は、上述した組換えウシ組織因子とリン脂質とからなる複合体で、天然のウシ組織トロンボプラスチン(リン脂質複合体型の天然ウシ組織因子)と同程度の血液凝固活性を有するものである。このような複合体は、組換えウシ組織因子とリン脂質とを、例えば、ニッケル存在下で混合することにより、製造することができる。
[Bovine tissue factor-phospholipid complex]
The bovine tissue factor-phospholipid complex of the present invention is a complex composed of the above-described recombinant bovine tissue factor and phospholipid, which is comparable to natural bovine tissue thromboplastin (a natural bovine tissue factor of the phospholipid complex type). It has blood coagulation activity. Such a complex can be produced, for example, by mixing recombinant bovine tissue factor and phospholipid in the presence of nickel.
複合体化に用いられるリン脂質は、一般に12〜22の炭素原子を有する脂肪酸を含有するリン脂質であり、当該脂肪酸は飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸のいずれであってもよい。好ましいリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリンなどが例示される。これらのリン脂質は、天然物、合成品のいずれであってもよく、異なる種類の脂肪酸を有するリン脂質であってもよい。さらに、これらのリン脂質は、所望する性状、特性などに応じて2種以上を混合して複合体の形成に用いてもよい。 The phospholipid used for complexation is generally a phospholipid containing a fatty acid having 12 to 22 carbon atoms, and the fatty acid may be either a saturated fatty acid or an unsaturated fatty acid. Preferred phospholipids include phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylglycerol, phosphatidylserine and the like. These phospholipids may be natural products or synthetic products, and may be phospholipids having different types of fatty acids. Further, these phospholipids may be used in the formation of a complex by mixing two or more kinds according to desired properties and characteristics.
〔II、VII、IX、X因子測定用試薬〕
本発明のII、VII、IX、X因子測定用試薬とは、外因系の血液凝固検査に用いられる試薬で、血中の第II因子、第VII因子、第IX因子及びX因子の凝固能を総合的に調べることができる試薬のことをいう。
[Reagents for measuring II, VII, IX, and factor X]
The reagent for measuring II, VII, IX, and X of the present invention is a reagent used for a blood coagulation test of an exogenous system, and the coagulation ability of factor II, factor VII, factor IX and factor X in blood is measured. A reagent that can be examined comprehensively.
II、VII、IX、X因子測定用試薬は、上記本発明の組換えウシ組織因子−リン脂質複合体を含有するもので、具体的には、後述の製造方法により生産された組換えウシ組織因子をリン脂質で複合体化させてなるウシ組織因子−リン脂質複合体を含有する。 The reagent for measuring II, VII, IX, and factor X contains the above-described recombinant bovine tissue factor-phospholipid complex of the present invention. Specifically, the recombinant bovine tissue produced by the production method described later is used. It contains a bovine tissue factor-phospholipid complex obtained by complexing a factor with a phospholipid.
さらに、測定用試薬は、第I因子及び第V因子を含有することが好ましい。第I因子及び第V因子の添加に代えて、第II因子、第VII因子、第IX因子及びX因子を除去した血漿を用いてもよい。当該血漿としては、血漿、好ましくはウシ血漿を硫酸バリウムで吸着させて得られる硫酸バリウム吸着血漿を用いることが好ましい。硫酸バリウム吸着血漿は、血漿(好ましくはウシ血漿)に硫酸バリウムを添加混合後、硫酸バリウムを除去することにより調製することができる。 Furthermore, it is preferable that the measuring reagent contains Factor I and Factor V. Instead of the addition of factor I and factor V, plasma from which factor II, factor VII, factor IX and factor X have been removed may be used. As the plasma, barium sulfate-adsorbed plasma obtained by adsorbing plasma, preferably bovine plasma with barium sulfate, is preferably used. Barium sulfate-adsorbed plasma can be prepared by adding barium sulfate to plasma (preferably bovine plasma) and mixing it, and then removing the barium sulfate.
さらに、測定用試薬はカルシウムイオンを含有することが好ましい。カルシウムイオン源としては、通常、塩化カルシウム、乳酸カルシウムやグルコン酸カルシウム等から選ばれる。 Furthermore, the measuring reagent preferably contains calcium ions. The calcium ion source is usually selected from calcium chloride, calcium lactate, calcium gluconate and the like.
さらに、HEPES、TRIPS、MOPS、PIPES、BISTRIS、Glycineなどの群から選ばれる緩衝液を、pH5〜9、最終濃度約10〜100mMとなるように含有していてもよい。 Furthermore, you may contain the buffer solution chosen from groups, such as HEPES, TRIPS, MOPS, PIPES, BISTRIS, Glycine, so that it may become pH 5-9 and final concentration about 10-100 mM.
〔組換えウシ組織因子の製造方法〕
本発明に係るII、VII、IX、X因子測定用組換えウシ組織因子の製造方法は、ウシ組織因子をコードするcDNAをバキュロウィルスへ組み込んだ組換えバキュロウィルスをカイコに感染させる工程;前記カイコにおいて、前記cDNAから組換えウシ組織因子を発現させる工程を含む。
[Method for producing recombinant bovine tissue factor]
The method for producing recombinant bovine tissue factor for measuring factor II, VII, IX, and X according to the present invention comprises the step of infecting silkworm with a recombinant baculovirus in which a cDNA encoding bovine tissue factor is incorporated into baculovirus; In which a recombinant bovine tissue factor is expressed from the cDNA.
本発明で用いられるcDNAは、ウシ組織因子の可溶性ドメイン及び膜貫通ドメインをコードすることができる塩基配列を有するものである。好ましくはウシ組織因子の可溶性ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインをコードすることができる塩基配列を有するcDNAである。このようなcDNAとしては、具体的には配列番号2で示されるアミノ酸配列(AAB20755)又は当該アミノ酸配列の1又は数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列をコードすることができる塩基配列が好ましく用いられ、より具体的には、クローンテック社のcDNAライブラリー等から入手できるウシ組織因子のcDNAを用いることができる。 The cDNA used in the present invention has a nucleotide sequence capable of encoding the soluble domain and transmembrane domain of bovine tissue factor. A cDNA having a base sequence capable of encoding a soluble domain, a transmembrane domain and an intracellular domain of bovine tissue factor is preferable. As such cDNA, specifically, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (AAB20755) or a base that can encode an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence are substituted, added, or deleted The sequence is preferably used, and more specifically, bovine tissue factor cDNA available from Clontech's cDNA library or the like can be used.
上述したようなウシ組織因子cDNAを、バキュロウィルスへ組み込んで、組換えバキュロウィルスを作成する。
ここで、バキュロウィルスとしては、好ましくは核多角体病ウィルス(NPV:nucleopolyhedrovirus)が用いられる。NPVに感染した細胞では、ウィルス粒子とは直接関係していない多角体タンパク質のみを多量に合成しはじめる。従って、多角体プロモータの下流に、この多角体タンパク質をコードする遺伝子に代えて、ウシ組織因子のcDNAを挿入すると、ウシ組織因子を感染細胞内で多量に合成させることができる。
Bovine tissue factor cDNA as described above is incorporated into baculovirus to produce a recombinant baculovirus.
Here, preferably, a nuclear polyhedrosis virus (NPV) is used as the baculovirus. Cells infected with NPV begin to synthesize only polyhedron proteins that are not directly related to virus particles. Therefore, when bovine tissue factor cDNA is inserted downstream of the polyhedron promoter in place of the gene encoding this polyhedron protein, bovine tissue factor can be synthesized in a large amount in infected cells.
さらに、バキュロウィルスとしては、ウィルスが産生するシステインプロテアーゼによるタンパク質分解の影響を避けるため、システインプロテアーゼ遺伝子を人為的に欠損したバキュロウィルスが好ましく用いられる。 Further, as a baculovirus, a baculovirus in which the cysteine protease gene is artificially deleted is preferably used in order to avoid the influence of proteolysis by the cysteine protease produced by the virus.
バキュロウィルスに、目的のウシ組織因子のcDNAを挿入する方法としては、従来より公知の組換え技術を用いることができる。例えば、多角体タンパク質コード遺伝子を適当な制限酵素で切断除去したバキュロウィルスと、ウシ組織因子cDNAライブラリーから同制限酵素を用いて切断して得られたウシ組織因子のcDNA断片とを、常法にしたがって連結することにより、ウシ組織因子cDNAが挿入されたバキュロウィルスの組換え体を得ることができる。尚、必要に応じて、多角体タンパク質コード遺伝子だけでなく、さらにシステインプロテアーゼ遺伝子の一部又は全部を適当な制限酵素で切断除去したバキュロウィルスを用いてもよい。 As a method for inserting the target bovine tissue factor cDNA into baculovirus, conventionally known recombinant techniques can be used. For example, a baculovirus obtained by cleaving and removing a polyhedron protein-encoding gene with an appropriate restriction enzyme, and a bovine tissue factor cDNA fragment obtained by cleaving from the bovine tissue factor cDNA library using the same restriction enzyme, To obtain a recombinant baculovirus inserted with bovine tissue factor cDNA. If necessary, not only the polyhedron protein coding gene but also a baculovirus obtained by cleaving and removing a part or all of the cysteine protease gene with an appropriate restriction enzyme may be used.
次に、作成した組換えバキュロウィルスを、カイコに感染させる。カイコの種類は特に限定しないが、裸蛹系統のカイコが好ましく用いられる。裸蛹系統のカイコは、繭形成にかかる遺伝子が変異したもので、蛹化はしても繭をつくらない。このような裸蛹系統のカイコとしては例えば、Nd系、Ndb系、Nd−s系、Nd−t系等のカイコが知られている。 Next, silkworms are infected with the prepared recombinant baculovirus. Although the kind of silkworm is not specifically limited, the silkworm of a naked cocoon type | system | group is used preferably. Bare silkworm silkworms are mutated genes for cocoon formation and do not form cocoons even if they hatch. For example, Nd, Ndb, Nd-s, and Nd-t silkworms are known as such naked silkworm silkworms.
また、上述したようなカイコの蛹を用いることが好ましい。蛹は、カイコ幼虫の消化管に存在する、食物(桑)を分解するためのセリンプロテアーゼの活性が、カイコ虫体に比べてはるかに低いからである。これにより、カイコ内で発現されたタンパク質の分解を防止することができる。また、カイコ蛹は、バキュロウィルスに対する感受性が幼虫に比べても高く、容易に個体内でウィルスが増殖し、大量の組織因子の発現が可能となるからである。 It is also preferable to use silkworm cocoons as described above. This is because the activity of serine protease for decomposing food (mulberry) present in the digestive tract of silkworm larvae is much lower than that of silkworm worms. Thereby, degradation of the protein expressed in the silkworm can be prevented. Also, silkworm pupae are more sensitive to baculovirus than larvae, and the virus easily grows within individuals, allowing expression of a large amount of tissue factor.
感染方法としては、蛹に組換えバキュロウィルスを含有するウィルス液を注入する注射法、針に微量のウィルス液を塗布し蛹に接種する微量接種法等を適用することができる。あるいは、組換えバキュロウィルスをカイコ培養細胞にコトランスフェクトし、次いでコトランスフェクトされたカイコ培養細胞を所定期間培養して組換えバキュロウィルスを増殖させ、増殖した組換えバキュロウィルスをカイコに接種することにより行なっても良い。 As an infection method, an injection method in which a virus solution containing recombinant baculovirus is injected into a sputum, a microinoculation method in which a small amount of virus solution is applied to a needle and inoculated into a sputum can be applied. Alternatively, the recombinant baculovirus is co-transfected into silkworm cultured cells, then the co-transfected silkworm cultured cells are cultured for a predetermined period to proliferate the recombinant baculovirus, and the grown recombinant baculovirus is inoculated into the silkworm It may be performed depending on the situation.
カイコ蛹への組換えウィルスの接種は、組換えバキュロウィルスに感染したカイコを5〜10日間飼育することにより行なうことができる。飼育中に、カイコ体内で、組換えバキュロウィルスに挿入されたcDNAが発現して、組換えウシ組織因子が産生され、カイコ体液中に分泌される。ここでカイコ体液中で分泌される組換えウシ組織因子は、配列番号2のアミノ酸配列で示されるタンパク質がさらに翻訳後のプロセッシングによりN末端が切断されたもので、配列番号1で示されるものである。所定期間の飼育後、生産された組換えウシ組織因子を、カイコから抽出する。 Inoculation of the silkworm silkworm with the recombinant virus can be performed by breeding silkworms infected with the recombinant baculovirus for 5 to 10 days. During breeding, the cDNA inserted into the recombinant baculovirus is expressed in the silkworm body, recombinant bovine tissue factor is produced and secreted into the silkworm body fluid. Here, the recombinant bovine tissue factor secreted in the silkworm body fluid is the protein represented by SEQ ID NO: 2 which is further cleaved at the N-terminus by post-translational processing, and is represented by SEQ ID NO: 1. is there. After breeding for a predetermined period, the produced recombinant bovine tissue factor is extracted from silkworms.
組換えウシ組織因子のカイコからの抽出は、組換えウシ組織因子を発現したカイコを破砕して得られる破砕物を含む溶液から、固形成分を除去することにより、前記組換えウシ組織因子を含む溶液を採取することにより行なう。 Extraction of recombinant bovine tissue factor from silkworms includes the recombinant bovine tissue factor by removing solid components from a solution containing crushed material obtained by crushing silkworms expressing recombinant bovine tissue factor. This is done by collecting the solution.
カイコ又はカイコの蛹の破砕は、ミキサー、ホモジナイザー、ブレンダーなどを用いて機械的に破砕すればよい。破砕に際しては、例えば、適当な緩衝液を加えて行なうことが好ましい。緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液などが挙げられる。このようにして破砕物を含む溶液を得る。 The silkworm or silkworm cocoon may be crushed mechanically using a mixer, a homogenizer, a blender or the like. For crushing, for example, it is preferable to add an appropriate buffer. Examples of the buffer include Tris buffer and phosphate buffer. In this way, a solution containing crushed material is obtained.
破砕物を含む溶液から固形成分を除去して固形成分除去液を得る。固形成分の除去は、濾過、遠心分離、又はこれらを適宜組み合わせて行なうことができる。固形成分除去液としては、具体的には、破砕物を含む溶液を濾過することにより得られる濾液、破砕物を含む溶液を遠心分離することにより得られる上清などが挙げられる。そして、このような固形成分除去液を、組換えウシ組織因子を含む溶液(組換えウシ組織因子含有液)として用いることができる。なお、得られた固形成分除去液には、組換えウシ組織因子とともに、遺伝子導入に使用したバキュロウィルスも含まれている。ゆえに、固形成分除去液に界面活性剤を加えてウィルスを不活化し、それを組換えウシ組織因子含有液として使用することが好ましい。 A solid component removing liquid is obtained by removing the solid component from the solution containing the crushed material. The removal of the solid component can be performed by filtration, centrifugation, or an appropriate combination thereof. Specific examples of the solid component removing liquid include a filtrate obtained by filtering a solution containing a crushed product, and a supernatant obtained by centrifuging a solution containing a crushed product. And such a solid component removal liquid can be used as a solution (recombinant bovine tissue factor containing liquid) containing recombinant bovine tissue factor. The obtained solid component removal solution contains baculovirus used for gene transfer together with recombinant bovine tissue factor. Therefore, it is preferable to add a surfactant to the solid component removal solution to inactivate the virus and use it as a recombinant bovine tissue factor-containing solution.
上記界面活性剤としては、ノニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤のいずれを用いてもよいが、殺ウィルス性の観点からノニオン系界面活性剤を用いることが好ましい。また、ノニオン系界面活性剤の添加は、固形成分除去液に含まれている組換えウシ組織因子の可溶化にも役立つ。組換えウシ組織因子を界面活性剤で、固形成分除去液に可溶化することで、最終的に得られる組換えウシ組織因子含有液の透明度を向上させたり、含有される組換えウシ組織因子の富化を図ることができる。 As the surfactant, any of a nonionic surfactant, a cationic surfactant, and an anionic surfactant may be used, but a nonionic surfactant is preferably used from the viewpoint of virucidal properties. The addition of a nonionic surfactant is also useful for solubilizing recombinant bovine tissue factor contained in the solid component removal solution. By solubilizing recombinant bovine tissue factor in a solid component removal solution with a surfactant, the transparency of the final recombinant bovine tissue factor-containing solution can be improved, or the contained recombinant bovine tissue factor Enrichment can be achieved.
本発明のII、VII、IX、X因子測定用組換えウシ組織の製造方法は、さらに、上述した固形成分除去液を、HEPES等の緩衝液(pH6〜7)等を外液として、透析してもよい。また、上述した固形成分除去液を、硫酸アンモニウム等を用いて塩析してもよい。透析、塩析を適宜組み合わせることで、組換えウシ組織因子が濃縮された組換えウシ組織因子含有液が得ることができ、ひいては不純物の含有量が少ない組換えウシ組織因子含有液を得ることができる。さらに、組換えウシ組織因子含有液における組換えウシ組織因子の富化のために、上述した固形成分除去液を、カイコ個体由来のタンパク質に特異的な抗体などを固相に結合させたカラムクロマトグラフィーに通してもよい。また、ヒスチジンタグなどのアフィニティタグを利用して、組換えウシ組織因子を精製してもよい。これらを組み合わせることによって、純度95%以上のウシ組織因子を製造することが可能となる。 In the method for producing recombinant bovine tissue for measuring factor II, VII, IX, and X of the present invention, the solid component removal solution described above is further dialyzed using a buffer solution (pH 6-7) such as HEPES as an external solution. May be. Moreover, you may salt out the solid component removal liquid mentioned above using ammonium sulfate etc. By appropriately combining dialysis and salting-out, a recombinant bovine tissue factor-containing solution enriched with recombinant bovine tissue factor can be obtained, and thus a recombinant bovine tissue factor-containing solution with a low content of impurities can be obtained. it can. Furthermore, in order to enrich the recombinant bovine tissue factor in the recombinant bovine tissue factor-containing solution, the above-described solid component removal solution is subjected to column chromatography in which antibodies specific for proteins derived from silkworm individuals are bound to a solid phase. You may go through the graphy. Alternatively, recombinant bovine tissue factor may be purified using an affinity tag such as a histidine tag. By combining these, bovine tissue factor with a purity of 95% or more can be produced.
ここで、ヒスチジンタグによる精製を利用する場合、遺伝子組換えに使用するウシ組織因子のcDNAのC末端又はN末端にヒスチジンをコードするヌクレオチドを連結させておき、カイコにおいて、ヒスチジンタグが連結した組換えウシ組織因子を発現させればよい。 Here, when using purification with a histidine tag, a nucleotide encoding histidine is linked to the C-terminus or N-terminus of the bovine tissue factor cDNA used for gene recombination, and the histidine tag is linked in silkworms. A replacement bovine tissue factor may be expressed.
本発明のウシ組織因子の製造方法によれば、ウシ大脳から抽出されるウシ組織因子と同等の生物活性、凝固活性を有する。しかも製造現場において、BSEをはじめとする危険がない。さらに、製造の生産設備や生産コストの点においても、従来の生産方法と比べて低減することができる。また、本発明の製造方法で得られるウシ組織因子含有液は、可溶化された透明度の高いものであることから、光学的手法を利用して凝固時間を測定するのに用いられるII、VII、IX、X因子測定用試薬に好適に用いることができる。 According to the method for producing bovine tissue factor of the present invention, it has the same biological activity and coagulation activity as bovine tissue factor extracted from bovine cerebrum. Moreover, there is no danger such as BSE at the manufacturing site. Furthermore, it can reduce compared with the conventional production method also in terms of production equipment and production cost. Further, since the bovine tissue factor-containing solution obtained by the production method of the present invention is solubilized and highly transparent, II, VII, which are used for measuring the clotting time using an optical technique, It can be suitably used as a reagent for measuring IX and factor X.
〔II、VII、IX、X因子測定用試薬の製造方法〕
本発明のII、VII、IX、X因子測定用試薬の製造方法は、ウシ組織因子をコードするcDNAをバキュロウィルスへ組み込んだ組換えバキュロウィルスをカイコに感染させる工程;前記カイコにおいて、前記cDNAから組換えウシ組織因子を発現させる工程;前記組換えウシ組織因子を抽出する工程;及び前記組換えウシ組織因子とリン脂質とを混合して、ウシ組織因子−リン脂質複合体を形成させる工程を含む。要するに、本発明のII、VII、IX、X因子測定用試薬の製造方法は、上記組換えウシ組織因子の製造方法により得られた組換えウシ組織因子とリン脂質とを混合して、ウシ組織因子−リン脂質複合体を形成させ、さらに、当該試薬に必要な成分を適宜添加混合する方法である。
[Method for producing reagent for measuring II, VII, IX, factor X]
The method for producing a reagent for measuring factor II, VII, IX, or X of the present invention comprises the step of infecting a silkworm with a recombinant baculovirus obtained by incorporating a cDNA encoding bovine tissue factor into a baculovirus; Expressing recombinant bovine tissue factor; extracting the recombinant bovine tissue factor; and mixing the recombinant bovine tissue factor and phospholipid to form a bovine tissue factor-phospholipid complex. Including. In short, the method for producing the reagent for measuring factors II, VII, IX, and X of the present invention comprises mixing the recombinant bovine tissue factor obtained by the above-described recombinant bovine tissue factor production method and phospholipid, and bovine tissue. In this method, a factor-phospholipid complex is formed, and components necessary for the reagent are added and mixed as appropriate.
ウシ組織因子−リン脂質複合体の形成は、常法に準じて行なうことができ(Methods Enzymol.,222,p173,1993などを参照)、好ましくは、上記組換えウシ組織因子製造方法により得られた組換えウシ組織因子含有液とリン脂質溶液とを、ニッケル存在下で混合することにより行なう。 The bovine tissue factor-phospholipid complex can be formed according to a conventional method (see Methods Enzymol., 222, p173, 1993, etc.), preferably obtained by the above-described method for producing recombinant bovine tissue factor. The recombinant bovine tissue factor-containing solution and the phospholipid solution are mixed in the presence of nickel.
組換えウシ組織因子含有液としては、組換えウシ組織因子の製造方法にもよるが、上述したような、破砕物を含む溶液から固形成分を除去しただけの固形成分除去液を使用してもよいし、さらに、当該固形成分除去液から界面活性剤による処理、透析、塩析、クロマトグラフィ等を行なって得られる高純度の組換えウシ組織因子含有液を用いてもよい。 As the recombinant bovine tissue factor-containing solution, although depending on the method for producing recombinant bovine tissue factor, a solid component removing solution obtained by removing solid components from a solution containing crushed material as described above may be used. Further, a high-purity recombinant bovine tissue factor-containing solution obtained by subjecting the solid component removal solution to treatment with a surfactant, dialysis, salting out, chromatography, or the like may be used.
リン脂質溶液としては、複合体化に使用するリン脂質、すなわち炭素数12〜22の脂肪酸又は不飽和脂肪酸を有するリン脂質が好ましく用いられる。具体的には、前述のウシ組織因子−リン脂質複合体で例示したリン脂質を用いることができる。組換えウシ組織因子含有液とリン脂質液とのモル比率が約1:10〜2×107の範囲、より好ましくは1:3000〜15000の範囲で使用するのが好ましい。 As the phospholipid solution, a phospholipid used for complexing, that is, a phospholipid having a fatty acid having 12 to 22 carbon atoms or an unsaturated fatty acid is preferably used. Specifically, the phospholipid exemplified in the aforementioned bovine tissue factor-phospholipid complex can be used. The molar ratio of the recombinant bovine tissue factor-containing solution to the phospholipid solution is preferably in the range of about 1:10 to 2 × 10 7 , more preferably 1: 3,000 to 15000.
ニッケルとしては、通常、塩化ニッケル、硫酸ニッケル等のニッケル塩水溶液、あるいは緩衝液にニッケル塩を溶解させてなる溶液が用いられる。
リン脂質との複合体化は、以上のような組換えウシ組織因子含有液、リン脂質溶液、ニッケル塩溶液を混合攪拌し、1〜2時間ほど反応させればよい。複合体形成後、透析等を行なうことにより、ウシ組織因子−リン脂質複合体を富化してもよい。
As nickel, a nickel salt aqueous solution such as nickel chloride or nickel sulfate or a solution obtained by dissolving a nickel salt in a buffer solution is usually used.
For complexation with phospholipid, the above-described recombinant bovine tissue factor-containing solution, phospholipid solution, and nickel salt solution may be mixed and stirred and reacted for about 1 to 2 hours. After the complex formation, the bovine tissue factor-phospholipid complex may be enriched by dialysis or the like.
製造しようとするII、VII、IX、X因子測定用試薬が、第I因子及び第V因子を含有する場合には、第I因子及び第V因子を添加する。第I因子及び第V因子の添加に代えて、第II因子、第VII因子、第IX因子及びX因子を除去した血漿を用いてもよい。当該血漿としては、血漿、好ましくはウシ血漿を硫酸バリウムで吸着させて得られる硫酸バリウム吸着血漿を用いてもよい。硫酸バリウム吸着血漿の調製は、特に限定しないが、例えば、Charlesら「One-stage Prothrombin Time techniques (Thrombosis and Bleeding Disorders Theory and Method, 1971, p92-97)」に記載されているOwrenらの方法により調製できる。 When the reagent for measuring II, VII, IX, and X to be produced contains Factor I and Factor V, Factor I and Factor V are added. Instead of the addition of factor I and factor V, plasma from which factor II, factor VII, factor IX and factor X have been removed may be used. As the plasma, barium sulfate-adsorbed plasma obtained by adsorbing plasma, preferably bovine plasma with barium sulfate, may be used. The preparation of the barium sulfate-adsorbed plasma is not particularly limited, but for example, by the method of Owren et al. Described in Charles et al. “One-stage Prothrombin Time techniques (Thrombosis and Bleeding Disorders Theory and Method, 1971, p92-97)”. Can be prepared.
また、製造しようとするII、VII、IX、X因子測定用試薬がカルシウムイオンを含有する場合には、カルシウムイオン源として、塩化カルシウム、乳酸カルシウムやグルコン酸カルシウム等を添加する。 Moreover, when the reagent for measuring II, VII, IX, and factor X to be produced contains calcium ions, calcium chloride, calcium lactate, calcium gluconate, or the like is added as a calcium ion source.
さらに必要に応じて、HEPES、TRIPS、MOPS、PIPES、BISTRIS、Glycineなどの群から選ばれる緩衝液を、pH5〜9、最終濃度約10〜100mMとなるように添加してもよい。 Furthermore, if necessary, a buffer solution selected from the group of HEPES, TRIPS, MOPS, PIPES, BISTRIS, Glycine, etc., may be added so as to have a pH of 5 to 9 and a final concentration of about 10 to 100 mM.
必要に応じて添加される第I因子及び第V因子(又は硫酸バリウム吸着血漿など)、カルシウムイオン源、緩衝剤は、ウシ組織因子−リン脂質複合体形成前に添加してもよいし、同複合体形成後に添加してもよい。また、第I因子及び第V因子、カルシウムイオン源、緩衝剤の添加順序も特に限定しない。 Factor I and factor V (or barium sulfate-adsorbed plasma, etc.), a calcium ion source, and a buffer added as necessary may be added before the bovine tissue factor-phospholipid complex is formed. You may add after complex formation. Further, the addition order of the factor I and factor V, the calcium ion source, and the buffering agent is not particularly limited.
以上のようにして製造されるII、VII、IX、X因子測定用試薬は、保存安定性の観点から、通常凍結乾燥して保存され、使用時に精製水又は適当な緩衝液で溶解して使用する。
The reagents for measuring II, VII, IX, and factor X produced as described above are usually stored by freeze-drying from the viewpoint of storage stability, and are used by dissolving in purified water or an appropriate buffer at the time of use. To do.
〔組換えウシ組織因子の製造〕
ウシ大脳のcDNAライブラリー(クローンテック社)を、非特許文献1の方法に基づいて、PCRによりウシ組織因子の遺伝子を増幅させ、ウシ組織因子の可溶性ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインをコードする完全長のウシ組織因子コード遺伝子をクローニングした。PCR法での増幅に際しては、forwardプライマーとしてBgIII切断配列を有するプライマー(5’−agatctatggcgacccccaacgggcc)を使用し、backwardプライマーとしてEcoRI切断配列を有するプライマー(5’−acttaagaatacgtcgcaactcgccgc)を使用した。クローニングした遺伝子の塩基配列を、シーケンサー(4200型、ライカ)で調べたところ、配列番号2のアミノ酸配列をコードするcDNAであることが確認できた。
[Production of recombinant bovine tissue factor]
Based on the method of Non-Patent Document 1, a bovine cerebral cDNA library (Clontech) was used to amplify the bovine tissue factor gene by PCR and encode the bovine tissue factor soluble domain, transmembrane domain, and intracellular domain. The full-length bovine tissue factor encoding gene was cloned. In the amplification by the PCR method, a primer having a BgIII cleavage sequence (5′-agatctattggcgacccccacacggggc) was used as a forward primer, and a primer having an EcoRI cleavage sequence (5′-acttagaatacgtcgcaactcgccgc) was used as a backward primer. When the nucleotide sequence of the cloned gene was examined with a sequencer (type 4200, Leica), it was confirmed that it was cDNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
クローニングしたcDNAを、システインプロテアーゼ欠損ウィルス(片倉工業、pYNG)のクローニングサイトに挿入して、ウシ組織因子組換えバキュロウィルス発現系を樹立させた。 The cloned cDNA was inserted into a cloning site of a cysteine protease deficient virus (Katakura Kogyo, pYNG) to establish a bovine tissue factor recombinant baculovirus expression system.
ウシ組織因子組換えバキュロウィルスを、カイコの蛹にウィルス感染させ、5℃下で7日間放置し、十分に感染させた。感染後のカイコの蛹は−30℃で一昼夜凍結保存された。なお、クローニングしたウシ組織因子のcDNAのバキュロウィルスへの挿入からカイコ蛹へのバキュロウィルスの感染までの工程は、片倉工業(株)の「Superworm」サービスを利用した。 Bovine tissue factor recombinant baculovirus was infected with silkworm pupae and allowed to stand at 5 ° C. for 7 days for complete infection. Silkworm cocoons after infection were stored frozen at -30 ° C overnight. The process from the insertion of the cloned bovine tissue factor cDNA into baculovirus to the infection of silkworm silkworm with baculovirus was carried out using the “Superworm” service of Katakura Industry Co., Ltd.
凍結保存された感染後のカイコ蛹を、片倉工業(株)より入手した。カイコ蛹1匹あたりに、緩衝液(20mMトリス塩酸、150mM塩化ナトリウム、10mMベンザミジン、1mM PMSF、1mM DDT、1mM EDTA、1mM EGTA、pH7.5)10mLを加えて、氷冷下、ポリトロンホモジナイザー(回転数12000rpm、5分間)を用いてカイコ蛹を破砕し、破砕物を含む溶液(破砕液)を得た。この破砕液を滅菌したガーゼで濾過することにより、破砕液から固形成分を除去した後、さらに、テフロンホモジナイザー(アズワン、回転数5000rpmで10ストローク)を用いて破砕した。得られた破砕液を遠心分離(3000×g、8℃、10分)し、上清を回収し、この上清を固形成分除去液とした。固形成分除去液8容量に対して、10%NP−40界面活性剤(カルビオケム)を2容量加えて、30℃で3時間インキュベートして、バキュロウィルスを不活性化するとともに、組換えウシ組織因子を可溶化させた。 The silkworm silkworm after infection that was cryopreserved was obtained from Katakura Industry Co., Ltd. 10 ml of a buffer solution (20 mM Tris-HCl, 150 mM sodium chloride, 10 mM benzamidine, 1 mM PMSF, 1 mM DDT, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 7.5) is added to each silkworm cocoon, and the polytron homogenizer (rotation) is performed under ice cooling. The silkworm cocoon was crushed using several 12,000 rpm for 5 minutes to obtain a solution (crushed liquid) containing crushed material. The crushed liquid was filtered with a sterilized gauze to remove solid components from the crushed liquid, and further crushed using a Teflon homogenizer (As One, 10 strokes at a rotation speed of 5000 rpm). The obtained crushed liquid was centrifuged (3000 × g, 8 ° C., 10 minutes), the supernatant was recovered, and this supernatant was used as a solid component removing liquid. 2 volumes of 10% NP-40 surfactant (Calbiochem) is added to 8 volumes of the solid component removal solution and incubated at 30 ° C. for 3 hours to inactivate baculovirus and recombinant bovine tissue factor Was solubilized.
バキュロウィルスの不活性化の確認は、界面活性剤で処理された固形成分除去液のウィルス力価を、Reed−Muench法(Reed,L.J.and Muench,H.:Amer.J.Hyg.,27,493(1938))に基づいて、顕微鏡で目視により96穴のウィルス感染の有無を観察することにより行なった。 Confirmation of inactivation of baculovirus was carried out using the Reed-Münch method (Reed, LJ and Muench, H .: Amer. J. Hyg. , 27, 493 (1938)), the presence or absence of 96-hole virus infection was visually observed with a microscope.
界面活性剤で処理された固形成分除去液を遠心分離(3000×g、8℃、30分)して、リポタンパク質や脂質分画が除去された上清を得た。次に、得られた上清を、20mM HEPES(150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.2))を用いて透析(透析膜用セルロースチューブ、三光純薬(株))を行なった。透析後、透析チューブ内の溶液に、30%飽和濃度となるまで硫酸アンモニウムを添加し、遠心分離して上清を回収した。続いて、この上清に、飽和濃度60%となるまで硫酸アンモニウムを添加して、組換えウシ組織因子を含む沈殿を生成させた。沈殿が生成した溶液を、20mM HEPES緩衝液(pH7.2、150mM塩化ナトリウム含有)で透析(透析膜:透析膜用セルロースチューブ、三光純薬(株))し、透析後の透析チューブ内の溶液を回収し、これを組換えウシ組織因子含有液とした。得られた組換えウシ組織因子含有液の組換えウシ組織因子の純度を電気泳動(SDS−PAGE)により調べたところ、約70%であった。この組換えウシ組織因子含有液を、さらにセファクリルS200ゲルクロマトグラフィに供して、最終的に、組換えウシ組織因子の純度が約95%の組換えウシ組織因子含有液を得た。 The solid component removal solution treated with the surfactant was centrifuged (3000 × g, 8 ° C., 30 minutes) to obtain a supernatant from which lipoproteins and lipid fractions were removed. Next, the obtained supernatant was dialyzed (cellulose tube for dialysis membrane, Sanko Junyaku Co., Ltd.) using 20 mM HEPES (150 mM sodium chloride buffer (pH 7.2)). After dialysis, ammonium sulfate was added to the solution in the dialysis tube until the saturation concentration reached 30%, and the supernatant was recovered by centrifugation. Subsequently, ammonium sulfate was added to the supernatant to a saturation concentration of 60% to produce a precipitate containing recombinant bovine tissue factor. The solution in which the precipitate was formed was dialyzed against 20 mM HEPES buffer (pH 7.2, containing 150 mM sodium chloride) (dialysis membrane: cellulose tube for dialysis membrane, Sanko Junyaku Co., Ltd.), and the solution in the dialysis tube after dialysis Was collected and used as a recombinant bovine tissue factor-containing solution. The purity of the recombinant bovine tissue factor in the obtained recombinant bovine tissue factor-containing solution was examined by electrophoresis (SDS-PAGE) and found to be about 70%. This recombinant bovine tissue factor-containing solution was further subjected to Sephacryl S200 gel chromatography to finally obtain a recombinant bovine tissue factor-containing solution having a recombinant bovine tissue factor purity of about 95%.
〔ウシ組織因子−リン脂質複合体の作製〕
0.25%デオキシコール酸ナトリウムDOC(20mL)にベイシス大豆レシチン0.4g(日清製油(株))を溶解する。ローテータで室温下、完全に溶解させ、これに1,2−オレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DOPE)0.1g及び1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−L−セリン(DOPS)0.3g(Avanti polar lipid、Inc.)を懸濁させてリン脂質溶液を調製した。
[Preparation of bovine tissue factor-phospholipid complex]
Dissolve 0.4 g of Basis soy lecithin (Nisshin Oil Co., Ltd.) in 0.25% sodium deoxycholate DOC (20 mL). Dissolve completely at room temperature with a rotator, and 0.1 g of 1,2-oleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) and 1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phospho-L- A phospholipid solution was prepared by suspending 0.3 g of serine (DOPS) (Avanti polar lipid, Inc.).
このリン脂質溶液37.5mLに、0.5M塩化ニッケル溶液を5mL、10mHEPES緩衝液(pH7.3)2.5mL、上記で精製した組換えウシ組織因子含有溶液2.5mLを添加し、ボルテックスで30秒間攪拌した。攪拌後、BRANSON#2210型超音波装置で、37℃、15分間反応させた後、37℃、1時間放置した。この溶液を透析膜(透析用セルロースチューブ、三光純薬(株))に移して、10mM HEPES(pH7.3、0.15M 塩化ナトリウム含有)で透析を3回行ない、透析後の透析チューブ内の溶液をウシ組織因子−リン脂質複合体含有液として得た。 To 37.5 mL of this phospholipid solution, add 5 mL of 0.5 M nickel chloride solution, 2.5 mL of 10 m HEPES buffer (pH 7.3), and 2.5 mL of the recombinant bovine tissue factor-containing solution purified above, and vortex Stir for 30 seconds. After stirring, the mixture was reacted at 37 ° C. for 15 minutes using a BRANSON # 2210 type ultrasonic device, and then allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. This solution was transferred to a dialysis membrane (dialysis cellulose tube, Sanko Junyaku Co., Ltd.) and dialyzed 3 times with 10 mM HEPES (pH 7.3, containing 0.15 M sodium chloride). The solution was obtained as a bovine tissue factor-phospholipid complex-containing solution.
〔II、VII、IX、X因子測定用試薬の調製〕
(1)硫酸バリウム吸着血漿の調製
クエン酸を添加したウシ血漿に、ウシ血漿の30w/v%量の硫酸バリウム、及びウシ血漿の20v/v%量の生理食塩水を、60分間ローテータで攪拌した。この混合液を、4℃、5000rpm、15分間遠心分離した後、上清を回収した。この上清に、当該上清の30w/v%の硫酸バリウムを少しずつ添加混合して、硫酸バリウムに血漿中のII、VII、IX、X因子を吸着させた。その後、遠心分離して上清を回収した。その上清を、透析チューブ(透析用セルロースチューブ、三光純薬(株))にいれ、生理食塩水を外液として、2〜8℃で透析を行なった。透析後の透析チューブ内の溶液を0.45μmのフィルターで濾過した濾液を、硫酸バリウム吸着血漿として、以下の試薬の調製に用いた。
[Preparation of reagents for measuring II, VII, IX, and factor X]
(1) Preparation of barium sulfate-adsorbed plasma Bovine plasma supplemented with citric acid was stirred with 60 w / v% barium sulfate in bovine plasma and 20 v / v% physiological saline in bovine plasma with a rotator for 60 minutes. did. After the mixture was centrifuged at 4 ° C. and 5000 rpm for 15 minutes, the supernatant was recovered. To this supernatant, 30 w / v% barium sulfate of the supernatant was added little by little and mixed to adsorb the II, VII, IX, and X factors in plasma to the barium sulfate. Thereafter, the supernatant was collected by centrifugation. The supernatant was placed in a dialysis tube (dialysis cellulose tube, Sanko Junyaku Co., Ltd.) and dialyzed at 2-8 ° C. using physiological saline as an external solution. The filtrate obtained by filtering the solution in the dialysis tube after dialysis with a 0.45 μm filter was used as barium sulfate-adsorbed plasma for the preparation of the following reagents.
(2)II、VII、IX、X因子測定用試薬の調製
上記で調製したウシ組織因子−リン脂質複合体含有液と、硫酸バリウム吸着血漿と、40mHEPES緩衝液(pH7.3、4mMの乳酸カルシウム含有)とを1:2:1の比率で混合して攪拌し、II、VII、IX、X因子測定用試薬を調整した。
(2) Preparation of reagents for measuring II, VII, IX, and factor X Bovine tissue factor-phospholipid complex-containing liquid prepared above, barium sulfate-adsorbed plasma, 40 mHEPES buffer (pH 7.3, 4 mM calcium lactate) Containing) was mixed at a ratio of 1: 2: 1 and stirred to prepare reagents for measuring II, VII, IX, and factor X.
〔II、VII、IX、X因子測定用試薬の凝固活性〕
上記調製方法に基づいて、II、VII、IX、X因子測定用試薬を3ロット調製した(試薬ロットNo.1〜3)。この測定用試薬(試薬ロットNo.1〜3)を用いて、2種類の正常血漿(正常血漿1,2)、5種類のワルファリン投与血漿(ワルファリン血漿1〜5)の凝固活性(%)を、全自動血液凝固分析装置コアグレックス800(島津製作所(株))を用いて、測定した。
尚、活性値(%)の算出に用いる検量線の作成には、血液凝固試験用標準ヒト血漿(シスメックス(株))を用いた。また、正常血漿には、コアグトロールN(シスメックス(株))及びコアグトロールI(シスメックス(株))を用い、ワルファリン投与患者血漿は、Multi−Coumadin Set(George King Biomedical社)を用いた。さらに、対照試薬には、ウシ組織因子−リン脂質複合体として天然ウシ大脳トロンボプラスチンを用いた市販品のトロンボテスト試薬である複合因子T「コクサイ」(シスメックス(株))を用いた。
結果を表1に示す。
[Coagulation activity of reagents for measuring II, VII, IX, and factor X]
Based on the above preparation method, three lots of reagents for measuring II, VII, IX, and factor X were prepared (reagent lots No. 1 to 3). Using this measurement reagent (reagent lot Nos. 1 to 3), the clotting activity (%) of two types of normal plasma (normal plasma 1, 2) and five types of warfarin-administered plasma (warfarin plasma 1-5) was determined. The measurement was performed using a fully automatic blood coagulation analyzer Coagrex 800 (Shimadzu Corporation).
Incidentally, standard human plasma for blood coagulation test (Sysmex Corp.) was used to prepare a calibration curve used for calculating the activity value (%). In addition, Coagtrol N (Sysmex Corp.) and Coagtrol I (Sysmex Corp.) were used as normal plasma, and Multi-Coumadin Set (George King Biomedical) was used as the warfarin-administered patient plasma. Furthermore, as a control reagent, composite factor T “Kokusai” (Sysmex Corporation), which is a commercially available thrombotest reagent using natural bovine cerebral thromboplastin as a bovine tissue factor-phospholipid complex, was used.
The results are shown in Table 1.
表1から、正常血漿及びワルファリン血漿のいずれに対しても、本実施例の測定用試薬は、天然のウシ脳組織トロンボプラスチンを用いた測定試薬と同程度の凝固活性を示すことが確認できた。 From Table 1, it was confirmed that for both normal plasma and warfarin plasma, the measurement reagent of the present example showed the same level of coagulation activity as the measurement reagent using natural bovine brain tissue thromboplastin.
〔II、VII、IX、X因子測定用試薬の感度〕
上記で調製したII、VII、IX、X因子測定用試薬(調製ロットNo.1〜3)及び既知ISI値が算出されている対照試薬(複合因子T「コクサイ」)について、予めEQUSTAサーベイサンスでINR表示値が決定された4種類のAKキャリブラント(AK−A、AK−B、AK−C、AK−D、いずれもImmuno社)の凝固時間(秒)及び国際標準感度指標(ISI値)を、全自動血衛凝固分析装置コアグレックス800(島津製作所(株))で測定した。結果を表2に示す。
[Sensitivity of reagents for measuring II, VII, IX, and factor X]
For the II, VII, IX, and X factor measurement reagents (preparation lot Nos. 1 to 3) prepared above and the control reagent (complex factor T “Kokusai”) for which a known ISI value has been calculated, an EUSSTA survey was conducted in advance. Coagulation time (seconds) and international standard sensitivity index (ISI value) of four types of AK calibrants for which INR display values were determined (AK-A, AK-B, AK-C, and AK-D are all Immuno) Was measured with a fully automatic blood coagulation analyzer Coagrex 800 (Shimadzu Corporation). The results are shown in Table 2.
試薬ロットNo.1〜3のいずれも、キャリブラントAK−A〜AK−Dについて、対照試薬と同程度の凝固時間、感度を示すことが確認できた。 Reagent lot No. It was confirmed that all of 1 to 3 showed clotting times and sensitivities similar to those of the control reagent for calibrants AK-A to AK-D.
〔II、VII、IX、X因子測定用試薬の検査精度(再現性)〕
上記で調製したII、VII、IX、X因子測定用試薬(試薬ロットNo.1〜3)及び対照試薬(複合因子T「コクサイ」)を用いて、ワルファリン投与患者血漿の凝固時間を、全自動血液凝固分析装置コアグレックス800(島津製作所(株))で、10回ずつ測定し、測定値のばらつきを調べた。各試薬を用いた場合の凝固時間(測定値及び平均値)、標準偏差、CV値を、表3に示す。
[Test accuracy (reproducibility) of reagents for measuring II, VII, IX, and factor X]
Using the reagents for measuring II, VII, IX, and X factor (reagent lots No. 1 to 3) and the control reagent (complex factor T “Kokusai”) prepared above, the clotting time of warfarin-treated patient plasma is fully automated. The blood coagulation analyzer Coagrex 800 (Shimadzu Corporation) was used to measure 10 times, and the variation of the measured values was examined. Table 3 shows the coagulation time (measured value and average value), standard deviation, and CV value when each reagent was used.
表3からわかるように、本発明の測定用試薬は、10回の測定のばらつきは、従来の対照試薬と同程度であり、従来の対照試薬に匹敵する測定精度(再現性)を有することが確認できた。 As can be seen from Table 3, the measurement reagent of the present invention has the same measurement accuracy (reproducibility) as that of the conventional control reagent, with the variation of 10 measurements being similar to that of the conventional control reagent. It could be confirmed.
〔従来の対照試薬との活性の相関性〕
正常血漿及びワルファリン投与患者血漿(N=198)について、上記で調製で調製したII、VII、IX、X因子測定用試薬及び対照試薬(複合因子T「コクサイ」(シスメックス(株))の凝固活性(%)を、全自動血液凝固分析装置コアグレックス800(島津製作所(株))で測定した。各血漿試料について、対照試薬を用いたときの活性値と本実施例の測定用試薬を用いたときの活性値の関係を図1に示す。図1中、横軸は、対照試薬を用いて測定したときの活性値(%)を示しており、縦軸は本実施例の測定用試薬を用いて測定したときの活性値(%)を示している。
[Correlation of activity with conventional control reagents]
Coagulation activity of II, VII, IX, factor X measurement reagent and control reagent (combined factor T “Kokusai” (Sysmex Corp.)) prepared in the above for normal plasma and plasma of warfarin-treated patient plasma (N = 198) (%) Was measured with a fully automatic blood coagulation analyzer Coagrex 800 (Shimadzu Corp.) For each plasma sample, the activity value when the control reagent was used and the measuring reagent of this example were used. The relationship of the activity values is shown in Fig. 1. In Fig. 1, the horizontal axis shows the activity value (%) when measured using the control reagent, and the vertical axis shows the measurement reagent of this example. It shows the activity value (%) when measured using.
図1から明らかなように、組換えウシ組織因子−リン脂質複合体を用いた本実施例のII、VII、IX、X因子測定用試薬の活性値(%)と従来の対照試薬の活性値(%)との間には高い相関性があることが確認できた。 As is apparent from FIG. 1, the activity values (%) of the reagents for measuring factors II, VII, IX and X of this example using the recombinant bovine tissue factor-phospholipid complex and the activity values of the conventional control reagent It was confirmed that there was a high correlation with (%).
本発明のII、VII、IX、X因子測定用試薬は、従来の天然ウシ組織大脳由来の組織因子を用いた同因子測定用試薬と同程度の凝固性能、測定精度を有しているので、従来のII、VII、IX、X因子測定用試薬の代替品として利用できる。
しかも、本発明のII、VII、IX、X因子測定用試薬は、カイコを宿主として産生した遺伝子組換えウシ組織因子を用いているので、従来の天然ウシ組織大脳からの抽出作業を要する試薬の製造方法と比べて、安全で、簡便化されるので、生産コストの低減化を図ることができる。
Since the reagent for measuring factor II, VII, IX, and X of the present invention has the same coagulation performance and measurement accuracy as the reagent for measuring factor using the tissue factor derived from the conventional natural bovine tissue cerebrum, It can be used as an alternative to conventional reagents for measuring II, VII, IX, and X factors.
In addition, since the reagent for measuring factors II, VII, IX, and X of the present invention uses genetically engineered bovine tissue factor produced using silkworm as a host, a reagent that requires extraction from a conventional natural bovine tissue cerebrum is used. Compared with the manufacturing method, it is safe and simplified, so that the production cost can be reduced.
Claims (8)
前記カイコにおいて、前記cDNAから組換えウシ組織因子を発現させる工程;及び
前記組換えウシ組織因子を抽出する工程;
を含むII、VII、IX、X因子測定用の組換えウシ組織因子の製造方法。 A step of infecting a silkworm with a recombinant baculovirus in which a cDNA encoding an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence is substituted, added, or deleted is incorporated into a baculovirus ;
Expressing the recombinant bovine tissue factor from the cDNA in the silkworm; and extracting the recombinant bovine tissue factor;
A method for producing recombinant bovine tissue factor for measuring factors II, VII, IX, and X
前記カイコにおいて、前記cDNAから組換えウシ組織因子を発現させる工程;
前記組換えウシ組織因子を抽出する工程;及び
前記組換えウシ組織因子とリン脂質とを混合して、ウシ組織因子−リン脂質複合体を形成させる工程;
を含むII、VII、IX、X因子測定用試薬の製造方法。 A step of infecting a silkworm with a recombinant baculovirus in which a cDNA encoding an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence are substituted, added, or deleted is incorporated into a baculovirus ;
Expressing recombinant bovine tissue factor from the cDNA in the silkworm;
Extracting the recombinant bovine tissue factor; and mixing the recombinant bovine tissue factor and phospholipid to form a bovine tissue factor-phospholipid complex;
A method for producing a reagent for measuring II, VII, IX, and factor X containing
前記組換えウシ組織因子と前記リン脂質とが、ニッケル存在下で混合される請求項7に記載のII、VII、IX、X因子測定用試薬の製造方法。
In the step of forming the bovine tissue factor-phospholipid complex,
The method for producing a reagent for measuring factor II, VII, IX, or factor X according to claim 7, wherein the recombinant bovine tissue factor and the phospholipid are mixed in the presence of nickel.
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