JP2008061642A - Ｄ−アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、従来法より効率的なＤ−アミノ酸の製造方法の提供を課題とする。
【解決手段】また、Ｎ−サクシニルアミノ酸を原料として、Ｄ−アミノ酸を酵素的に製造する方法を提供する。Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニルアミノ酸をラセミ化する反応、およびＤ−アミノアシラーゼによるＤ体特異的加水分解反応を組合せることにより、医薬品原料などとして有用なＤ−アミノ酸を効率的に得ることができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、Ｄ−アミノアシラーゼを用いることを特徴とするＮ−サクシニルアミノ酸からＤ−アミノ酸を製造する方法に関する。本発明は更に、Ｎ−サクシニルアミノ酸を原料とし、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニルアミノ酸をラセミ化する反応、およびＤ−アミノアシラーゼを用いてＮ−サクシニルアミノ酸のＤ体を特異的に加水分解する反応を組み合わせることにより、Ｄ−アミノ酸を効率的に製造する方法に関する。

医薬品、農薬および食品などの分野で光学活性アミノ酸は多くの需要がある。光学的に純粋なアミノ酸、特に天然のアミノ酸として得ることが難しいＤ−アミノ酸を、いかにして効率的に合成または分割するかは、産業上重要な課題となっている。この課題に対して、Ｎ−アシルアミノ酸のラセミ体を合成した上で、酵素法によりＤ体およびＬ体を効果的に光学分割し、加水分解する手法が開発された。酵素法による光学分割は、Ｄ−アミノアシラーゼなどの酵素の特異性を利用してＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸を加水分解し、Ｎ−アセチルアミノ酸のラセミ体から必要なＤ−アミノ酸のみを特異的に生成させる方法である。光学的な純度に優れた生成物を容易に得ることができる（特許文献１、２）。

また、この方法ではラセミ体の半分、すなわちＮ−アセチル−Ｌ−アミノ酸が無駄になってしまう。そこで、Ｎ−アセチル−Ｌ−アミノ酸のラセミ化を触媒するラセマーゼ作用が有用となる。たとえば、Ｄ−トリプトファンは、医薬品原料などとして重要である。Ｄ−トリプトファンは、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの加水分解によって得ることができる。そして、残ったＮ−アセチル−Ｌ−トリプトファンをラセマーゼによりラセミ化して、生成したラセミ体中のＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンを加水分解する。この工程を一連の酵素反応として連続的に行うことにより、高収率でＤ−トリプトファンを得ることができる（特許文献３）。

このような用途に有効なラセマーゼとして、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼが知られている。この酵素は、アミノ酸には作用せず、Ｎ−アシルアミノ酸を特異的にラセミ化する酵素である。合成されたＮ−アセチルアミノ酸のラセミ体を原料とし、Ｄ−アミノアシラーゼとＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼを反応させることにより、Ｄ−アミノ酸を高収率で得ることができる。

しかし、この方法は実用化に大きな障害があった。それは、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼのＮ−アセチルアミノ酸への反応性が極めて低く、ラセマーゼ反応が律速となって効率が低下することにある。この問題を解決しない限り、該ラセマーゼを使用してＤ−アミノ酸を得ることは、コスト面で実用化に程遠い状況であった。

しかし最近になって、Ｎ−サクシニルアミノ酸を基質とし得るＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ、即ちサクシニルラセマーゼが同定され、当該酵素を用いることにより、効率的なＮ−アシルアミノ酸のラセミ化が可能になった（非特許文献１）。しかしながら、もう１つの主要な酵素反応であるＤ−アミノアシラーゼについては、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解するＤ−アミノアシラーゼの存在は知られていなかった。
特開２００６−２５４７８９号公報 ＷＯ２００４／０５５１７９ 特開２００１−４６０８８号公報 Ｓａｋａｉ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，４５（１４），４４５５−６２

本発明は、従来法より効率的なＤ−アミノ酸の製造方法の提供を課題とする。

本発明者らは、前記課題の解決のために鋭意検討し、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解するＤ-アミノアシラーゼを見出し、効率的なＤ-アミノ酸合成を可能にした。本発明者らは更に、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニルアミノ酸を非常に効率よくラセミ化する反応と、Ｄ-アミノアシラーゼによるＤ体を特異的に加水分解する反応とを組み合わせることにより、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程を含むことを特徴とする、Ｄ−アミノ酸を製造する方法。
〔２〕Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程が、Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸からＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸をラセミ化し、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を合成する工程をさらに含む、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕コハク酸およびアミノ酸からＮ−サクシニルアミノ酸を合成する工程をさらに含む、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５〕Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸をラセミ化し、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を合成する工程、ならびにコハク酸およびアミノ酸からＮ−サクシニルアミノ酸を合成する工程を含むことを特徴とする、Ｎ−サクシニルアミノ酸からＤ−アミノ酸を製造する方法。
〔６〕Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程が、Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸からＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程である、〔５〕に記載の方法。
〔７〕Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼが下記（ａ）または（ｂ）のいずれかである、〔３〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質；または
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質。
〔８〕Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼが下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の特徴を持つ、〔３〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）２価の金属イオンを０．１ｍＭ〜１Ｍの終濃度で反応させることで活性を持つ；
（ｂ）Ｍｎ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＮｉ^２＋のいずれか１つを０．１ｍＭ〜１Ｍの終濃度で反応させることで活性を持つ；および
（ｃ）Ｃｏ^２＋の終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍで反応させた時、相対活性でＭｎ^２＋の終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍで反応させた時の２倍以上の活性を有する。
〔９〕Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼが、下記の理化学的性質を有するタンパク質である、〔３〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）分子量：４２ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）；
（ｂ）基質特異性：Ｎ−サクシニルアミノ酸のうち、特にＮ−サクシニルメチオニン、Ｎ−サクシニルアラニン、Ｎ−サクシニルバリン、Ｎ−サクシニルロイシン、Ｎ−フェニルアラニンに対して相対活性でＮ−サクシニルトリプトファンの２倍以上の活性を有する；
（ｃ）温度安定性：３０分間熱処理した場合、７０℃では比較的安定であり７５℃以上では失活する；
（ｄ）至適温度：ｐＨ７．５で反応させる場合、温度６５℃において作用が至適である；および
（ｅ）至適ｐＨ：３０℃で６０分間反応させる場合、ｐＨ８において作用が至適である。
〔１０〕Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼが、下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の特徴を持つ、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物に由来するＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼである、〔３〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）２価の金属イオンを０．１ｍＭ〜１Ｍの終濃度で反応させることで活性を持つ；
（ｂ）Ｍｎ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＮｉ^２＋のいずれか１つを０．１ｍＭ〜１Ｍの終濃度で反応させることで活性を持つ；および
（ｃ）Ｃｏ^２＋の終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍで反応させた時、相対活性でＭｎ^２＋の終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍで反応させた時の２倍以上の活性を有する。
〔１１〕ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物を培養して得られるものであるＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼが、下記の理化学的性質を有する、〔３〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）分子量：４２ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）；
（ｂ）基質特異性：Ｎ−サクシニルアミノ酸のうち、特にＮ−サクシニルメチオニン、Ｎ−サクシニルアラニン、Ｎ−サクシニルバリン、Ｎ−サクシニルロイシン、Ｎ−フェニルアラニンに対して相対活性でＮ−サクシニルトリプトファンの２倍以上の活性を有する；
（ｃ）温度安定性：３０分間熱処理した場合、７０℃では比較的安定であり７５℃以上では失活する；
（ｄ）至適温度：ｐＨ７．５で反応させる場合、温度６５℃において作用が至適である；および
（ｅ）至適ｐＨ：３０℃で６０分間反応させる場合、ｐＨ８において作用が至適である。
〔１２〕Ｄ−アミノアシラーゼがＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解する微生物由来のＤ−アミノアシラーゼである、〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１３〕Ｄ−アミノアシラーゼが、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解する微生物を培養し、その培養物から精製したものである、〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１４〕Ｄ−アミノアシラーゼが、下記の理化学的性質を有する、デフルビバクター（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養して得られるものである、〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）作用：Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸に作用して、Ｄ−アミノ酸を生じる；
（ｂ）分子量：５５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）；
（ｃ）基質特異性：Ｎ−サクシニル−Ｄ−メチオニン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−バリン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アスパラギン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アラニンおよびＮ−サクシニル−Ｄ−ロイシンに作用し、Ｎ−サクシニル−Ｌ−メチオニン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ロイシン、およびＮ−サクシニル−Ｌ−バリンには作用しない；
（ｄ）温度安定性：ｐＨ８で３０分間熱処理した場合、４０℃では比較的安定であり５０℃以上では失活する；
（ｅ）至適温度：ｐＨ８で反応させる場合、温度３７℃において作用が至適である；
（ｆ）至適ｐＨ：３０℃で６０分間反応させる場合、ｐＨ８において作用が至適である；および
（ｇ）金属イオンの影響：Ｚｎ^２＋を０．１ｍＭ〜１Ｍの終濃度で反応させることで活性が増強または、安定化される。

これまで、Ｄ−アミノアシラーゼが、Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸を加水分解し、Ｄ−アミノ酸合成に使用できることは公知であったが、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解し、Ｄ−アミノ酸合成に使用できることは知られていなかった。本発明により、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解し、Ｄ−アミノ酸にすることが可能となる。

また、本発明により、Ｎ−アシルアミノ酸の効率的なラセミ化と加水分解が可能となり、医薬品原料などとして有用なＤ−アミノ酸を効率的に得ることが可能となる。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において使用するＮ−サクシニルアミノ酸を合成するには種々の公知の方法を用いることができる。例えば、アミノ酸と無水コハク酸とを下記の方法により反応させて合成することができる。
原料となるアミノ酸は、Ｌ体またはラセミ体が用いられる。アミノ酸の種類としては、天然に存在する２０種のアミノ酸およびその誘導体が広範囲に用いられる。好ましくは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンなどが挙げられる。より好ましくは、アラニン、バリン、ロイシンおよびトリプトファンなどが挙げられる。
アミノ酸と無水コハク酸とを反応させてＮ−サクシニルアミノ酸を合成する工程において、アミノ酸と無水コハク酸とを等モル濃度で反応させることが、コスト面で望ましい。用いるアミノ酸および無水コハク酸の濃度は特に限定されないが、０．０５〜５Ｍ程度が望ましい。反応温度は３７〜９０℃が好ましく、４５〜７０℃がより好ましい範囲である。

得られたＮ−サクシニルアミノ酸は、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼを用いてラセミ化することができる。本発明において使用するＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼは、Ｎ−サクシニルアミノ酸をラセミ化することができれば特に限定されないが、一例として、分子量が４２ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定）であり、Ｎ−サクシニルアミノ酸のうち、特にＮ−サクシニルメチオニン、Ｎ−サクシニルアラニン、Ｎ−サクシニルバリン、Ｎ−サクシニルロイシンまたはＮ−フェニルアラニンに対して、相対活性でＮ−サクシニルトリプトファンの２倍以上の活性を有する、という基質特異性を有するＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼが挙げられる。

Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼは、例えばＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸をＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸へと変換することができる。Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニルアミノ酸をラセミ化する反応は、例えば下記の条件でＮ−サクシニルアミノ酸、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼおよび緩衝剤を含む溶液中で混合させることにより行なう。当該反応において、反応温度は、使用するＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼが十分作用する温度であれば特に限定されないが、一般的には２５〜９０℃が好ましく、３７〜７０℃がより好ましい。当該反応において、反応時のｐＨは、使用するＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼが十分作用するｐＨであれば特に限定されないが、一般的にはｐＨ５〜９が好ましく、ｐＨ６．５〜８がより好ましい。本発明において使用するＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼの一例として、ｐＨ７．５において温度２５〜７０℃、好ましくは約６５℃で酵素活性が至適であり（至適温度６５℃）、３０℃で６０分間の反応においては、約ｐＨ８で酵素活性が至適（至適ｐＨ８）となるＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼが挙げられる。
また、本発明において、７０℃、３０分間の熱処理で比較的安定であり、７５℃、３０分間の熱処理で失活するＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼが好ましく用いられる。
ここで「比較的安定である」とは、Ｎ−サクシニルアミノ酸をラセミ化する能力、すなわちラセマーゼ活性を維持していれば、その程度は特に限定されないが、通常、熱処理する前に比べて３０％、好ましくは５０％以上の活性を維持していることを意味する。

本発明の反応で使用する緩衝剤としては、ｐＨ５〜９において充分な緩衝能力を有する任意の緩衝剤を使用することができる。このｐＨ範囲の緩衝剤としては、リン酸塩、トリス、ビス−トリスプロパン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）および３−〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）等が挙げられ、単独で用いても組み合わせて用いても良い。低価格かつ高い安定性を有するため、最も好ましい緩衝剤はリン酸塩であるが、トリスも汎用的な緩衝剤として好ましい。好ましい濃度範囲は、２０〜２００ｍＭであり、ｐＨ６．５〜８である。

Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼは、反応液中５〜５００ｍｇ／Ｌ（５００〜５００００Ｕ／Ｌ）の濃度で使用されることが好ましい。また、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニルアミノ酸をラセミ化する反応において、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼは、２価の金属イオンを０．１ｍＭ〜１Ｍの終濃度で添加することにより活性を持つ。添加する２価の金属イオンは、その添加によりＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性化が示されるものであれば特に限定しないが、このような金属の例としてはＭｎ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＮｉ^２＋が挙げられる。特にＣｏ^２＋を利用するのが最も好適である。Ｃｏ^２＋は終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍで反応させた時、相対活性でＭｎ^２＋の終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍで反応させた時の２倍以上の活性を有する。

Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼは、特に限定されないが、Ｎ−アセチルアミノ酸よりもＮ−サクシニルアミノ酸に対して１００倍以上高いラセミ化活性を持つものが好ましい。発明者らはＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼの基質特異性を網羅的に検討した訳ではなく、また、そのような検討には多大な時間と労力が必要であるため現実的ではないが、多くの微生物由来酵素が上記性質を有しているものと期待される。具体的に、このような酵素としては、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属などに属する種々の細菌ならびに放線菌、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）属およびサルフォロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属などに属する種々の始原菌などが生産するＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼが挙げられる。より好ましくは、ゲオバチルス属細菌の生産するＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼが挙げられる。さらに具体的には、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼが例示され、そのアミノ酸配列は配列表の配列番号２、当該アミノ酸配列をコードする遺伝子は配列番号１でそれぞれ示される。なお、配列番号２において、アミノ酸の表記は、メチオニンを１として番号付けされている。本発明の実施例では、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼとして、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスのＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼが使用されている。しかしながら、本発明はこれに限定されるものではない。また、本発明の実施例では、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が開示されているが、本発明のラセマーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列はこれに限定されず、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質あるいは配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含む。

上記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行なった後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行なう。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２％×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記もしくは他の要素（例えばプローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されるＤＮＡがコードするポリペプチドは、通常、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼと高い相同性を有する。高い相同性は、少なくとも４０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上（例えば９８〜９９％）の配列の相同性を指す。アミノ酸配列の同一性は、例えばＫａｒｋｌｉｎ ＡＮＤ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８，１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいてＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合にはパラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄ ｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。

また、本発明において使用するＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼは、ラセマーゼ活性を保持していれば、分子間または分子内架橋が施されたもの、糖鎖やその他の官能基により化学修飾されたもの、あるいは、ヒスチジンタグが付与されたもの、各種融合タンパク質などであっても、特に問題とならない。さらに、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼをコードする遺伝子をクローニングし、ラセマーゼの発現が向上させるように、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）などを変更したものを含みうる。

本発明のＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を特異的に加水分解する反応は、化学的な光学分割反応を利用することもできるが、通常は、アシル化Ｄ−アミノ酸を特異的に加水分解する反応を触媒する酵素を利用する。そのような酵素としては、Ｄ−アミノアシラーゼが好適に例示される。Ｄ−アミノアシラーゼはＮ−アシル−Ｄ−アミノ酸をＤ−アミノ酸と有機酸に加水分解する反応を触媒する酵素であり、Ｄ体に対して極めて高い特異性を有する。種々の給源、例えば細菌、始原菌および糸状菌のＤ−アミノアシラーゼを本発明に利用することができる。本発明に利用するＤ−アミノアシラーゼは限定されないが、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌（特開昭５５−４２５３４号公報）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属放線菌（特公昭５３−３６０３５号公報）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属細菌（特開昭６４−５４８８号公報）、アースロバクター(Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ)属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エシェリヒア(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ)属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ)属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ)属、プロタミノバクター（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属（以上特開平１１−１１３５９２号公報）、セベキア（Ｓｅｂｅｋｉａ）属（特開平１１−３１８４４２号公報）、またはデフルビバクター（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ）属（ＷＯ２００４／０５５１７９）などに属する微生物を培養して得られるＤ−アミノアシラーゼを使用する。

具体的には例えば、特開平１１−１１３５９２号公報に開示されている、アースロバクター・パラフィニス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）のＡＴＣＣ１５５９０、ＡＴＣＣ１５５９１、ＡＴＣＣ１９０６４もしくはＡＴＣＣ１９０６５、アースロバクター・ ハイドロカーボグルタミカス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）のＡＴＣＣ１５５８３、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｐｈｉｌｕｍ）のＡＴＣＣ３７３、コリネバクテリウム・キセロシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｒｏｓｉｓ）のＡＴＣＣ１３８７０、エセリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＡＪ２６０６（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７７）、エセリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＡＴＣＣ１３０７１、エルビニア・アミロボア（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）のＩＦＯ１２６８７、フラボバクテリウム・スワネンセ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｅｗａｎｅｎｓｅ）のＡＪ２４７６（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７６）、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）のＡＴＣＣ３３１８、プロタミノバクター・アルボフラブス（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｌｂｏｆｌａｖｕｓ）のＡＴＣＣ８４５８、ロドコッカス・エリスリポラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｉｐｏｌｉｓ）のＡＴＣＣ１１０４８、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）のＡＴＣＣ１５５９２、キサントモナス・シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ）のＡＪ２７８５（ＦＥＲＭ Ｐ−３３９６）など、特開平１１−３１８４４２号公報に開示されているセベキア・ベニハナ（Ｓｅｂｅｋｉａ ｂｅｎｉｈａｎａ）のＩＦＯ１４３０ＹまたはＷＯ２００４／０５５１７９に開示されているデフルビバクター・エスピー（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）のＡ１３１−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５６３）を入手し、当該微生物を適宜培養および精製することによりＤ−アミノアシラーゼを調製することができる。

本発明において使用するＤ−アミノアシラーゼはＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解してＤ−アミノ酸とすることができるものであれば特に限定されないが、一例として、分子量が５３ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）であり、Ｎ−サクシニル−Ｄ−メチオニン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−バリン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アスパラギン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アラニンおよびＮ−サクシニル−Ｄ−ロイシンに作用し、Ｎ−サクシニル−Ｌ−メチオニン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ロイシン、およびＮ−サクシニル−Ｌ−バリンには作用しないという基質特異性を持つＤ−アミノアシラーゼが挙げられる。当該反応において、反応温度は使用するＤ−アミノアシラーゼが十分作用する温度であれば特に限定されないが、一般的には５〜５０℃が好ましく、１５〜４５℃がより好ましい。当該反応において反応時のｐＨは、使用するＤ−アミノアシラーゼが十分作用するｐＨであれば特に限定されないが、一般的にはｐＨ６．５〜１０．５が好ましく、ｐＨ７．５〜１０がより好ましい。本発明において使用するＤ−アミノアシラーゼの一例として、ｐＨ８において温度２０〜４０℃、好ましくは約３７℃で酵素活性が至適であり（至適温度３７℃）、３０℃で６０分間の反応においては約ｐＨ８で酵素活性が至適（至適ｐＨ８）となるＤ−アミノアシラーゼが挙げられる。
また、本発明において、４０℃、３０分間（ｐＨ８）の熱処理で比較的安定であり、５０℃、３０分間（ｐＨ８）の熱処理で失活するＤ−アミノアシラーゼが好ましく用いられる。ここで「比較的安定である」とは、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解する能力、すなわちアシラーゼ活性を維持していれば、その程度は特に限定されないが、通常、熱処理する前に比べて３０％、好ましくは５０％以上の活性を維持していることを意味する。

本発明の反応で使用する緩衝剤としては、ｐＨ６．５〜１０．５において、好ましくはｐＨ７．５〜１０において十分な緩衝能力を有する任意の緩衝剤を使用することができる。上記Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼの反応に用いる緩衝剤と同様のものが挙げられ、所望のｐＨ範囲に設定される。Ｄ−アミノアシラーゼは、反応液中５〜５０００ｍｇ／Ｌ（５００〜５０００００Ｕ／Ｌ）の濃度で使用されることが好ましい。また、Ｄ−アミノアシラーゼを用いる反応において、Ｄ−アミノアシラーゼの安定性および活性に好影響を与えるため、２価の金属イオンを０．１ｍＭ〜１Ｍの終濃度で添加して反応させることが好ましい。添加する２価の金属イオンは、該Ｄ−アミノアシラーゼの安定性および活性に好影響を与えるものであれば特に限定しないが、このような金属の例としてはＺｎ^２＋が挙げられる。特にＺｎ^２＋を終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍで反応させた時、活性が最も増強または安定化される。

Ｄ−アミノアシラーゼは、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸をＤ−アミノ酸と有機酸に加水分解することができる。
本発明では、まずＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸またはＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸のうちＤ体のみがＤ−アミノアシラーゼにより脱アシル化（加水分解）され、目的のＤ−アミノ酸が生成する。Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼはＮ−アシルアミノ酸のＬ体をＤ体に変換する反応とＤ体をＬ体に変換する反応の両方を触媒してその比率をほぼ等しくする（ラセミ化）方向に働く。基質のＤ体が消費されるとラセミ状態が解消されるため、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼはＬ体からＤ体への反応をより促進する。Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼにより生成したＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アミノアシラーゼにより順次Ｄ−アミノ酸へと分解される。この原理で、理論的にはすべてのＮ−サクシニルアミノ酸をＤ−アミノ酸に変換することができる。

前記のラセミ化反応および加水分解反応は、同時に行われることが好ましい。反応条件としては、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼおよびＤ−アミノアシラーゼが活性を発揮する条件の範囲内であれば特に限定しないが、より好適には基質濃度０．０１〜５０％、ｐＨ５〜９、温度２０〜５０℃で行う。本発明において、ラセミ化反応および加水分解反応に要する時間は、原料として用いるＮ−サクシニルアミノ酸が、所望する量のＤ−アミノ酸へと変換し得るまでの時間であれば特に制限されず、仕込み量によっても異なるが、通常１０〜３００分程度で反応は終結する。

本発明のＤ−アミノ酸の製造方法において、不活性タンパク質を、酵素反応の安定性を増すために添加してもよい。不活性タンパク質は、大豆タンパク質および小麦タンパク質などの植物性タンパク質、硬タンパク質類ならびに繊維性タンパク質類を含む。好ましいタンパク質は、硬タンパク質類であり、特にコラーゲンおよびゼラチンなどが好ましい。不活性タンパク質の反応液全量における濃度として好ましくは０．０５〜１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）である。より低い濃度は有用であり得る。酵素分解を起こすであろうプロテアーゼ不純物を含まない不活性タンパク質が好ましい。

本発明において使用するＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼの「ラセマーゼ活性（「ラセミ化活性」または「活性」とも表記する。）」は以下の方法により測定することができる。
基質となるＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸またはＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を適当な濃度に調製し、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼを加えて適当な温度条件およびｐＨ条件で静置もしくは攪拌する。酵素反応の前後における溶液の旋光度を旋光度計（堀場製作所製ＳＥＰＡ−２００、日本分光製Ｐ−１０１０−ＳＴなど）で測定し、旋光度の変化を見ることにより、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸またはＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸へのラセミ化の度合いを直接定量することができる。

あるいは、基質となるＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸またはＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸溶液を適当な濃度に調製し、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ、Ｌ−（もしくはＤ−）アミノアシラーゼ、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼが活性を発現するのに必要な２価の金属イオンを添加し、適当な温度条件およびｐＨ条件で静置もしくは攪拌する。添加したアミノアシラーゼがＬ−アミノアシラーゼの場合であれば、まずＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸のうちＬ体のみがＬ−アミノアシラーゼにより脱アシル化され、目的のＬ−アミノ酸が生成する。Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼはＮ−アシルアミノ酸のＬ体をＤ体に変換する反応と、Ｄ体をＬ体に変換する反応の両方を触媒してその比率をほぼ等しくする（ラセミ化）方向に働く。基質のＬ体が消費されるとラセミ状態が解消されるため、よりＤ体からＬ体への反応が促進される。このように生成したＮ−アシル−Ｌ−アミノ酸はＬ−アミノアシラーゼにより順次Ｌ−アミノ酸へと分解される。このような原理で、理論的にはすべてのＮ−アシルアミノ酸をＬ−アミノ酸に変換することができる。同様に添加するアミノアシラーゼがＤ−アミノアシラーゼであれば理論的にはすべてのＮ−アシルアミノ酸をＤ−アミノ酸に変換することができる。

具体的なＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性の測定は、例えば以下の条件で行う。
＜反応試薬＞
緩衝液、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノアシラーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、アニリン系色原体および塩化コバルトを含む。
＜測定条件＞
反応試薬を３７℃で５分間予備加温した後、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ溶液を添加し、ゆるやかに混和する。水を対照とし、３７℃に制御された分光光度計で吸光度変化を記録し、その吸光度変化を測定する。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。

実施例１ Ｎ−サクシニルトリプトファンの合成
７．２ｇのＬ−トリプトファンと８ｇの無水コハク酸および８０ｍＬの酢酸を混合し、反応液を調製した。反応液中のＬ−トリプトファン濃度および無水コハク酸濃度は、それぞれ約１Ｍとなる。反応液を６０℃で５時間処理し、生じたＮ−サクシニル−Ｌ−トリプトファンをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させ、クロロホルム：メタノール＝７：１の溶媒にて溶出させることにより、Ｎ−サクシニル−Ｌ−トリプトファンを精製した。精製収率は、約６０％であった。

実施例２ Ｄ−トリプトファンの製造
実施例１で調製したＮ−サクシニル−Ｌ−トリプトファンを、原料として使用した。Ｎ−サクシニル−Ｌ−トリプトファンを１ｇ、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ（実施例４に調製方法記載）を５ｍｇ、Ｄ−アミノアシラーゼ（アマノ製）を５００ｍｇ、それぞれ１００ｍＬの２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５：Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼの補因子として０．１ｍＭの塩化マンガンを含む）に溶解し、混合して反応液を調製した。該反応液を４０℃で２時間反応させ、反応液中に析出、沈殿したＤ−トリプトファンを濾過に回収したところ、その収量は０．１１ｇであった。精製したＤ−トリプトファンの光学活性は旋光度計（ＳＥＰＡ：堀場製作所製）で確認することができた。
同条件で、原料としてＮ−アセチル−Ｌ−トリプトファンを使用した場合、Ｄ−トリプトファンの収量は０．００２５ｇであった。したがって、本発明により高効率にＤ−アミノ酸を製造し得ることが示された。

実施例３ Ｎ−サクシニル−Ｌ−バリンの合成
Ｌ−バリン（ナカライテスク製、４．７ｇ）と無水コハク酸（ナカライテスク製、４．０ｇ）を４０ｍＬの酢酸（ナカライテスク製）に溶解した。溶液を５０〜６０℃に熱し、溶媒を揮発させて結晶化した。次に、結晶化した白い沈殿を集めて、酢酸エチル２０ｍＬとメタノール２０ｍＬの混合液にて再結晶化した。沈殿を乳鉢で破砕し、乾燥させ、Ｎ−サクシニル−Ｌ−バリンの粉末を得た。詳細は非特許文献１に記載されている。

実施例４ Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼの調製
バチルス・ステアロサーモフィラスＮＣＡ１５０３株由来のＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ遺伝子（配列番号１）を、ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いたＰＣＲにて取得した。クローニングキットＴａｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、組換え発現プラスミドｐＮＡＲＢＳ１を取得した。ｐＢＳＮＡＲ１を用いて、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製）を形質転換し、該形質転換体を取得した。得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９(ｐＢＳＮＡＲ１)と命名した。
５００ｍＬのＴＢ培地を２Ｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンおよびイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドを、それぞれ終濃度が１００μｇ／ｍＬと０．１ｍＭになるように添加した。この培地に１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９(ｐＢＳＮＡＲ１)の培養液を５ｍＬ接種し、３７℃で２４時間通気攪拌培養を行った。培養終了より菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、５０℃、１時間の熱処理後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析を行った。更にＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）およびオクチルセファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）の各カラムクロマトグラフィーにより分離および精製することにより、精製酵素標品を得た。本方法により得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、単一であることが確認された。

実施例５ ２段階反応Ｄ−アミノ酸合成試薬の調製
Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼによるラセミ化とＤ−アミノアシラーゼによる加水分解反応を第１反応、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼによるＤ−アミノ酸の酸化とペルオキシダーゼによる過酸化水素を利用した発色反応を第２反応とする、２段階反応を利用したＤ−アミノ酸合成測定系を構築した。
＜第１反応試薬＞
１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９
１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２溶液
１５０ｍＭ Ｎ−サクシニル−Ｌ−バリン（実施例３で調製）
Ｄ−アミノアシラーゼ溶液（第一化学薬品製、２６００Ｕ／ｍＬ）
Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ溶液（実施例４で調製）
上記、１Ｍ ＨＥＰＥＳ１．０ｍＬ、１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２溶液０．０５ｍＬ、Ｄ−アミノ酸アシラーゼ溶液０．１２５ｍＬ、１５０ｍＭ Ｎ−サクシニル−Ｌ−バリン０．５ｍＬ、実施例４で調製したＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ溶液０．１ｍＬおよび水３．２２５ｍＬを混合して計５．０ｍＬの第１反応試薬とする。
＜第２反応試薬＞
４−アミノアンチピリン溶液（第一化学薬品製、６．１ｍｇ／ｍＬ）
ＴＯＯＳ溶液（同仁化学研究所製、３２．２ｍｇ／ｍＬ）
ペルオキシダーゼ溶液（東洋紡製ＰＥＯ−３０１、３００Ｕ／ｍＬ）
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ溶液（バイオザイム社製、５０Ｕ／ｍＬ）
上記、４−アミノアンチピリン溶液０．０２５ｍＬ、ＴＯＯＳ溶液０．０２５ｍＬ、ペルオキシダーゼ溶液０．０２５ｍＬ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ溶液０．２ｍＬおよび水３．３２５ｍＬを混合して計４．０ｍＬの第２反応試薬とする。

実施例６ ２段階Ｄ−アミノ酸合成反応測定条件
第１反応試薬５．０ｍＬを室温で１６時間反応させる。第２反応試薬４．０ｍＬを３７℃で５分間予備加温を行う。１６時間反応させた第１反応試薬から１．０ｍＬを抜き取り、第２反応試薬４．０ｍＬに添加し緩やかに混和し、３７℃で５分間反応させる。反応後、３７℃に制御された分光光度計で、水を対照に用いて５５５ｎｍの吸光度を測定する。盲検はＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ溶液の代わりに５０ｍＭ Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．１ｍＬを第１反応試薬に加えて同様に吸光度を測定したもの、Ｄ−アミノアシラーゼ溶液の代わりに５０ｍＭ Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．１２５ｍＬを第１反応試薬に加えて同様に吸光度を測定したものの２つを用意した。
結果を図１に示す。
ラセマーゼとアシラーゼを加えたサンプルのみに５５５ｎｍの吸光度上昇が特異的に観察された。ラセマーゼを添加しないサンプル、アシラーゼを添加しないサンプルでは吸光度の上昇が観察されなかった。これは、ラセマーゼによるラセミ化反応とアシラーゼによる加水分解反応とが組み合わさることによって、Ｄ−アミノ酸が合成された事を意味する。

実施例７ １段階反応Ｄ−アミノ酸合成試薬の調製
次に、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼによるラセミ化とＤ−アミノアシラーゼによる加水分解反応とが速やかに進行しＤ−アミノ酸が合成される事を確かめるため、１段階反応Ｄ−アミノ酸合成測定系を構築した。
＜試薬混合液＞
１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９
１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２溶液
４−アミノアンチピリン溶液（第一化学薬品製、６．１ｍｇ／ｍＬ）
ＴＯＯＳ溶液（同仁化学研究所製、３２．２ｍｇ／ｍＬ）
ペルオキシダーゼ溶液（東洋紡製ＰＥＯ−３０１、３００Ｕ／ｍＬ）
Ｄ−アミノアシラーゼ溶液（東洋紡製、１３００Ｕ／ｍＬ）
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ溶液（バイオザイム社製、５０Ｕ／ｍＬ）
５０ｍＭ Ｎ−サクシニル−Ｌ−バリン（実施例３で調製）
上記１Ｍ ＨＥＰＥＳ２．０ｍＬ、１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２溶液０．１ｍＬ、４−アミノアンチピリン溶液０．０５ｍＬ、ＴＯＯＳ溶液０．０５ｍＬ、ペルオキシダーゼ溶液０．０５ｍＬ、Ｄ−アミノアシラーゼ溶液１．０ｍＬ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ溶液０．４ｍＬ、５０ｍＭ Ｎ−サクシニル−Ｌ−バリン１．０ｍＬと水５．３５ｍＬを混合して計１０ｍＬの試薬混合液とする。この試薬混合液２．９ｍＬを３７℃で５分間予備加温する。Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ溶液（実施例４で調製）０．１ｍＬを添加し緩やかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、５５５ｎｍの吸光度変化を１０分間記録し、その吸光度変化を測定する。盲検はラセマーゼ溶液の代わりに５０ｍＭ Ｋ−リン酸緩衝液 ｐＨ７．５を試薬混合液に加えて同様に吸光度変化を測定する。
結果を図２に示す。
同様な実験を２回行い、反応１および反応２とした。盲検に比べ、反応１と反応２では吸光度の上昇が観察された。よって、本酵素反応系により短時間でＤ−アミノ酸の合成が起こることがわかった。

実施例８ Ｎ−サクシニル−Ｌ−アラニンの合成
Ｌ−アラニン（ナカライテスク製、３．６ｇ）と無水コハク酸（ナカライテスク製、４．０ｇ）を４０ｍＬの酢酸（ナカライテスク製）に溶解した。溶液を５０〜６０℃に熱し、溶媒を揮発させて結晶化した。次に、結晶化した白い沈殿を集めて、酢酸エチル２０ｍＬとメタノール２０ｍＬの混合液にて再結晶化した。沈殿を乳鉢で破砕し、乾燥させ、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アラニンの粉末を得た。詳細は非特許文献１に記載されている。

実施例９ ２段階Ｄ−アミノ酸合成反応
実施例６と同様にして、実施例８のＮ−サクシニル−Ｌ−アラニンを用いてＤ−アラニンの合成反応を行い、吸光度を測定した。
ラセマーゼとアシラーゼを加えたサンプルのみに５５５ｎｍの吸光度上昇が特異的に観察された。ラセマーゼを添加しないサンプル、アシラーゼを添加しないサンプルでは吸光度の上昇が観察されなかった。これは、ラセマーゼによるラセミ化反応とアシラーゼによる加水分解反応とが組み合わさることによって、Ｄ−アミノ酸が合成された事を意味する。

本発明によって、医薬品原料などとして有用なＤ−アミノ酸の製造効率が飛躍的に向上する。

図１は、２段階Ｄ−アミノ酸合成反応を測定した結果を示す。Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼとＤ−アミノアシラーゼを加えたサンプルのみに５５５ｎｍの吸光度上昇が特異的に観察された。Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼを添加しないサンプル、Ｄ−アミノアシラーゼを添加しないサンプルでは吸光度の上昇が観察されなかった。 図２は、１段階反応Ｄ−アミノ酸合成を測定した結果を示す。盲検に比べ、反応１と反応２では吸光度の上昇が観察された。

Claims (14)

1. Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程を含むことを特徴とする、Ｄ−アミノ酸を製造する方法。
2. Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程が、Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸からＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程である、請求項１に記載の方法。
3. Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸をラセミ化し、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を合成する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
4. コハク酸およびアミノ酸からＮ−サクシニルアミノ酸を合成する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸をラセミ化し、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を合成する工程、ならびにコハク酸およびアミノ酸からＮ−サクシニルアミノ酸を合成する工程を含むことを特徴とする、Ｎ−サクシニルアミノ酸からＤ−アミノ酸を製造する方法。
6. Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程が、Ｄ−アミノアシラーゼを用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸からＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程である、請求項５に記載の方法。
7. Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼが下記（ａ）または（ｂ）のいずれかである、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法：
   （ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質；または
   （ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質。
8. Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼが下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の特徴を持つ、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法：
   （ａ）２価の金属イオンを０．１ｍＭ〜１Ｍの終濃度で反応させることで活性を持つ；
   （ｂ）Ｍｎ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＮｉ^２＋のいずれか１つを０．１ｍＭ〜１Ｍの終濃度で反応させることで活性を持つ；および
   （ｃ）Ｃｏ^２＋の終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍで反応させた時、相対活性でＭｎ^２＋の終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍで反応させた時の２倍以上の活性を有する。
9. Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼが、下記の理化学的性質を有するタンパク質である、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法：
   （ａ）分子量：４２ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）；
   （ｂ）基質特異性：Ｎ−サクシニルアミノ酸のうち、特にＮ−サクシニルメチオニン、Ｎ−サクシニルアラニン、Ｎ−サクシニルバリン、Ｎ−サクシニルロイシン、Ｎ−フェニルアラニンに対して相対活性でＮ−サクシニルトリプトファンの２倍以上の活性を有する；
   （ｃ）温度安定性：３０分間熱処理した場合、７０℃では比較的安定であり７５℃以上では失活する；
   （ｄ）至適温度：ｐＨ７．５で反応させる場合、温度６５℃において作用が至適である；および
   （ｅ）至適ｐＨ：３０℃で６０分間反応させる場合、ｐＨ８において作用が至適である。
10. Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼが、下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の特徴を持つ、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物に由来するＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼである、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法：
    （ａ）２価の金属イオンを０．１ｍＭ〜１Ｍの終濃度で反応させることで活性を持つ；
    （ｂ）Ｍｎ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＮｉ^２＋のいずれか１つを０．１ｍＭ〜１Ｍの終濃度で反応させることで活性を持つ；および
    （ｃ）Ｃｏ^２＋の終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍで反応させた時、相対活性でＭｎ^２＋の終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍで反応させた時の２倍以上の活性を有する。
11. ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物を培養して得られるものであるＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼが、下記の理化学的性質を有する、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法：
    （ａ）分子量：４２ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）；
    （ｂ）基質特異性：Ｎ−サクシニルアミノ酸のうち、特にＮ−サクシニルメチオニン、Ｎ−サクシニルアラニン、Ｎ−サクシニルバリン、Ｎ−サクシニルロイシン、Ｎ−フェニルアラニンに対して相対活性でＮ−サクシニルトリプトファンの２倍以上の活性を有する；
    （ｃ）温度安定性：３０分間熱処理した場合、７０℃では比較的安定であり７５℃以上では失活する；
    （ｄ）至適温度：ｐＨ７．５で反応させる場合、温度６５℃において作用が至適である；および
    （ｅ）至適ｐＨ：３０℃で６０分間反応させる場合、ｐＨ８において作用が至適である。
12. Ｄ−アミノアシラーゼがＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解する微生物由来のＤ−アミノアシラーゼである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
13. Ｄ−アミノアシラーゼが、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解する微生物を培養し、その培養物から精製したものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
14. Ｄ−アミノアシラーゼが、下記の理化学的性質を有する、デフルビバクター（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養して得られるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法：
    （ａ）作用：Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸に作用して、Ｄ−アミノ酸を生じる；
    （ｂ）分子量：５５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）；
    （ｃ）基質特異性：Ｎ−サクシニル−Ｄ−メチオニン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−バリン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アスパラギン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アラニンおよびＮ−サクシニル−Ｄ−ロイシンに作用し、Ｎ−サクシニル−Ｌ−メチオニン、Ｎ−サクシニル−Ｌ−ロイシン、およびＮ−サクシニル−Ｌ−バリンには作用しない；
    （ｄ）温度安定性：ｐＨ８で３０分間熱処理した場合、４０℃では比較的安定であり５０℃以上では失活する；
    （ｅ）至適温度：ｐＨ８で反応させる場合、温度３７℃において作用が至適である；
    （ｆ）至適ｐＨ：３０℃で６０分間反応させる場合、ｐＨ８において作用が至適である；および
    （ｇ）金属イオンの影響：Ｚｎ^２＋を０．１ｍＭ〜１Ｍの終濃度で反応させることで活性が増強または、安定化される。

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