JP2007222001A - 疎水性ドメインを有するヒトタンパク質及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents
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Abstract
【課題】疎水性ドメインを有するヒト蛋白質、それをコードしているｃＤＮＡ、このｃＤＮＡの発現ベクター、およびこのｃＤＮＡを発現させた真核細胞を提供する。
【解決手段】配列番号１から配列番号１０で表されるアミノ酸配列のいずれかを含む蛋白質、この蛋白質をコードするＤＮＡ、例えば配列番号１１から配列番号２０で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ、このｃＤＮＡの発現ベクター、およびこのｃＤＮＡを発現させた真核細胞。疎水性ドメインを有するヒト蛋白質をコードしているｃＤＮＡの組換え体を発現させることにより、この蛋白質並びにこの蛋白質を発現する真核細胞を提供することができる。
【選択図】 なし
【解決手段】配列番号１から配列番号１０で表されるアミノ酸配列のいずれかを含む蛋白質、この蛋白質をコードするＤＮＡ、例えば配列番号１１から配列番号２０で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ、このｃＤＮＡの発現ベクター、およびこのｃＤＮＡを発現させた真核細胞。疎水性ドメインを有するヒト蛋白質をコードしているｃＤＮＡの組換え体を発現させることにより、この蛋白質並びにこの蛋白質を発現する真核細胞を提供することができる。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、疎水性ドメインを有するヒト蛋白質、それをコードしているＤＮＡ、このＤＮＡの発現ベクター、およびこのＤＮＡを発現させた真核細胞に関する。本発明の蛋白質は、医薬品として、あるいはこの蛋白質に対する抗体を作製するための抗原として用いることができる。本発明のヒトｃＤＮＡは、遺伝子診断用プローブや遺伝子治療用遺伝子源として用いることができる。また、このｃＤＮＡがコードしている蛋白質を大量生産するための遺伝子源として用いることができる。これらの遺伝子を導入して分泌蛋白質や膜蛋白質を大量発現させた細胞は、対応するレセプターやリガンドの検出、新しい低分子医薬のスクリーニングなどに利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
細胞は多くの蛋白質を細胞外に分泌している。これらの分泌蛋白質は、細胞の増殖制御、分化誘導、物質輸送、生体防御などにおいて重要な役割を果たしている。分泌蛋白質は細胞内蛋白質と異なり細胞外で作用するので、注射や点滴などによる体内投与が可能であり、医薬としての可能性を秘めている。事実、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポイエチン、血栓溶解剤など、多くのヒト分泌蛋白質が現在医薬として使用されている。また、これら以外の分泌蛋白質についても臨床試験が進行中であり、医薬品を目指した用途開発がなされている。ヒト細胞は、まだ多くの未知の分泌蛋白質を生産していると考えられており、これらの分泌蛋白質並びにそれをコ−ドしている遺伝子が入手できれば、これらを用いた新しい医薬品開発が期待できる。
【０００３】
一方、膜蛋白質は、シグナルレセプター、イオンチャンネル、トランスポーターなどとして、細胞膜を介する物質輸送や情報伝達において重要な役割を担っている。例えば、各種サイトカインに対するレセプター、ナトリウムイオン・カリウムイオン・塩素イオン等に対するイオンチャンネル、糖・アミノ酸等に対するトランスポーターなどが知られており、その多くはすでに遺伝子もクローン化されている。これらの膜蛋白質の異常は、これまで原因不明であった多くの病気と関連していることがわかってきた。従って、新しい膜蛋白質が見い出せれば、多くの病気の原因解明につながるものと期待され、膜蛋白質をコードする新たな遺伝子の単離が望まれている。
【０００４】
従来、これらの分泌蛋白質や膜蛋白質は、ヒト細胞から精製することが困難なので、遺伝子の方からのアプローチによって単離されたものが多い。一般的な方法は、ｃＤＮＡライブラリーを真核細胞に導入して、ｃＤＮＡを発現させたのち、目的とする活性を有する蛋白質を分泌発現あるいは膜表面上に発現している細胞をスクリーニングする、いわゆる発現クローニング法である。しかしこの方法では機能のわかった蛋白質の遺伝子しかクローン化できない。
【０００５】
一般に分泌蛋白質や膜蛋白質は、蛋白質内部に少なくとも一個所疎水性ドメインを有しており、リボソームで合成された後、このドメインが分泌シグナルとして働いたり、リン脂質膜内に留まり膜にトラップされる。従って、完全長ｃＤＮＡの全塩基配列を決定してやり、そのｃＤＮＡがコードしている蛋白質のアミノ酸配列の中に疎水性の高い領域が存在すれば、そのｃＤＮＡは分泌蛋白質や膜蛋白質をコードしていると考えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、疎水性ドメインを有する新規のヒト蛋白質、この蛋白質をコードするＤＮＡ、このＤＮＡの発現ベクター、およびこのＤＮＡを発現しうる形質転換真核細胞を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究の結果、ヒト完全長ｃＤＮＡバンクの中から疎水性ドメインを有する蛋白質をコードするｃＤＮＡをクローン化し、本発明を完成した。すなわち、本発明は疎水性ドメインを有するヒト蛋白質である、配列番号１から配列番号１０で表されるアミノ酸配列のいずれかを含む蛋白質を提供する。また本発明は上記蛋白質をコードするＤＮＡ、例えば配列番号１１から配列番号３０で表される塩基配列のいずれかを含むｃＤＮＡ、並びにこのＤＮＡをインビトロ翻訳あるいは真核細胞内で発現しうる発現ベクタ−、及びこのＤＮＡを発現し上記蛋白質を生産しうる形質転換真核細胞を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の蛋白質は、ヒトの臓器、細胞株などから単離する方法、本発明のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいは本発明の疎水性ドメインをコードするＤＮＡを用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができるが、組換えＤＮＡ技術で取得する方法が好ましく用いられる。例えば、本発明のｃＤＮＡを有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによりインビトロで蛋白質を発現できる。また翻訳領域を公知の方法により適当な発現ベクターに組換えてやれば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞で、コードしている蛋白質を大量に発現させることができる。
【０００９】
本発明の蛋白質を、インビトロ翻訳でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、このｃＤＮＡの翻訳領域を、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに組換え、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含む、ウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加してやれば、本発明の蛋白質をインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７１８、ｐＴ７／３ １９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩなどが例示できる。また、反応系にイヌ膵臓ミクロソームなどを添加してやれば、本発明の蛋白質を分泌型あるいはミクロソーム膜に組み込まれた形で発現することができる。
【００１０】
本発明の蛋白質を、大腸菌などの微生物でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、本発明のｃＤＮＡの翻訳領域を組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養してやれば、このｃＤＮＡがコードしている蛋白質を微生物内で大量生産することができる。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加して発現させてやれば、任意の領域を含む蛋白質断片を得ることができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。この融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによってこのｃＤＮＡがコードする蛋白質部分のみを取得することもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【００１１】
本発明の蛋白質を、真核細胞でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、このｃＤＮＡの翻訳領域を、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに組換え、真核細胞内に導入してやれば、本発明の蛋白質を分泌生産あるいは膜蛋白質として細胞膜表面上で生産することができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＥＤ６ｄｐｃ２、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、本蛋白質を発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００１２】
本発明の蛋白質を原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的蛋白質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどがあげられる。
【００１３】
本発明の蛋白質には、配列番号１から配列番号１０で表されるアミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペプチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれる。これらのペプチド断片は抗体を作製するための抗原として用いることができる。また、本発明の蛋白質の中でシグナル配列を有するものは、シグナル配列が除去された後、成熟蛋白質の形で分泌される。したがって、これらの成熟蛋白質は本発明の蛋白質の範疇にはいる。成熟蛋白質のＮ末端アミノ酸配列は、シグナル配列切断部位決定法［特開平８ー１８７１００］を用いて容易に求めることができる。また、いくつかの膜蛋白質は、細胞表面でプロセシングを受けて分泌型となる。このような分泌型となった蛋白質あるいはペプチドも本発明の蛋白質の範疇にはいる。アミノ酸配列の中に糖鎖結合部位が存在すると、適当な真核細胞で発現させれば糖鎖が付加した蛋白質が得られる。したがって、このような糖鎖が付加した蛋白質あるいはペプチドも本発明の蛋白質の範疇にはいる。
【００１４】
本発明のＤＮＡには、上記蛋白質をコードするすべてのＤＮＡが含まれる。このＤＮＡは、化学合成による方法、ｃＤＮＡクローニングによる方法などを用いて取得することができる。
【００１５】
本発明のｃＤＮＡは、例えばヒト細胞由来ｃＤＮＡライブラリーからクローン化することができる。ｃＤＮＡはヒト細胞から抽出した ポリ（Ａ）+ＲＮＡを鋳型として合成する。ヒト細胞としては、人体から手術などによって摘出されたものでも培養細胞でも良い。ｃＤＮＡは、岡山−Ｂｅｒｇ法［Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ． ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２：１６１−１７０（１９８２）］、Ｇｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ法［Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ． ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ ２５：２６３−２６９（１９８３）］などいかなる方法を用いて合成してもよいが、完全長クローンを効率的に得るためには、実施例にあげたようなキャッピング法［Ｋａｔｏ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １５０：２４３−２５０（１９９４）］を用いることが望ましい。また市販のヒトｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。ｃＤＮＡライブラリーから本発明のｃＤＮＡをクローン化するには、本発明のｃＤＮＡの任意の部分の塩基配列に基づいてオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとして用いて、公知の方法によりコロニーあるいはプラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行えばよい。また、目的とするｃＤＮＡ断片の両末端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして用いて、ヒト細胞から単離したｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により、本発明のｃＤＮＡ断片を調製することもできる。
【００１６】
本発明のｃＤＮＡは、配列番号１１から配列番号２０で表される塩基配列あるいは配列番号２１から配列番号３０で表される塩基配列のいずれかを含むことを特徴とするものである。それぞれのクローン番号（ＨＰ番号）、ｃＤＮＡクローンが得られた細胞、ｃＤＮＡの全塩基数、コードしている蛋白質のアミノ酸残基数をそれぞれ表１にまとめて示した。
【００１７】
【表１】
表１
【００１８】
なお、配列番号１１から配列番号３０のいずれかに記載のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、本発明で用いたヒト細胞株やヒト組織から作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明のｃＤＮＡと同一のクローンを容易に得ることができる。
【００１９】
一般にヒト遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従って配列番号１１から配列番号３０において、１又は複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／又は他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡも本発明の範疇にはいる。
【００２０】
同様に、これらの変更によって生じる、１又は複数個のアミノ酸の付加、欠失および／又は他のアミノ酸による置換がなされている蛋白質も、配列番号１から配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するそれぞれの蛋白質の活性を有する限り、本発明の範疇に入る。
【００２１】
本発明のｃＤＮＡには、配列番号１１から配列番号２０で表される塩基配列あるいは配列番号２１から配列番号３０で表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含むｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）も含まれる。また、センス鎖およびアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片もこの範疇にはいる。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプローブとして用いることができる。
【００２２】
【実施例】
次に実施例により発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。ＤＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、文献［”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９］に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記載の無い場合宝酒造社製のものを用いた。各酵素反応の緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。ｃＤＮＡ合成は文献［Ｋａｔｏ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １５０：２４３−２５０（１９９４）］に従った。
【００２３】
（１）疎水性ドメインを有する蛋白質をコードしているｃＤＮＡの選別
ｃＤＮＡライブラリーとして、フィブロサルコ−マ細胞株ＨＴ−１０８０ｃＤＮＡライブラリー（ＷＯ９８／１１２１７）、骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ−２ｃＤＮＡライブラリー（ＷＯ９７／３３９９３）、類表皮癌細胞株ＫＢｃＤＮＡライブラリー（ＷＯ９８／１１２１７）、手術によって摘出された肝臓組織ｃＤＮＡライブラリー（ＷＯ９８／２１３２８）を用いた。個々のライブラリーから完全長ｃＤＮＡクローンを選択し、その全塩基配列決定を行い、完全長ｃＤＮＡクローンからなるホモ・プロテインｃＤＮＡバンクを構築した。ホモ・プロテインｃＤＮＡバンクに登録された完全長ｃＤＮＡクローンがコードしている蛋白質について、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法［Ｋｙｔｅ，Ｊ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５７：１０５−１３２（１９８２）］により、疎水性／親水性プロフィールを求め、疎水性ドメインの有無を調べた。コードしている蛋白質のアミノ酸配列中に分泌シグナルや膜貫通ドメインと思われる疎水的な領域があるクローンを候補クローンとして選別した。
【００２４】
（２）インビトロ翻訳による蛋白質合成
本発明のｃＤＮＡを有するプラスミドベクターを用いて、ＴNＴウサギ網状赤血球溶解物キット（プロメガ社製）によるインビトロ転写／翻訳を行なった。この際［35Ｓ］メチオニンを添加し、発現産物をラジオアイソトープでラベルした。いずれの反応もキットに付属のプロトコールに従って行なった。プラスミド２μｇを、ＴNＴウサギ網状赤血球溶解物１２．５μｌ、緩衝液（キットに付属）０．５μｌ、アミノ酸混合液（メチオニンを含まない）２μｌ、［35Ｓ］メチオニン（アマーシャム社）２μｌ（０．３７ＭＢｑ／μｌ）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ０．５μｌ、ＲＮａｓｉｎ２０Ｕを含む総量２５μｌの反応液中で３０℃で９０分間反応させた。また、膜系存在下の実験は、この反応系に、イヌ膵臓ミクロソ−ム画分（プロメガ）２．５μｌを添加して行った。反応液３μｌにＳＤＳサンプリングバッファー（１２５ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ６．８、１２０ｍＭ２−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ溶液、０．０２５％ブロモフェノールブルー、２０％グリセロール）２μｌを加え、９５℃３分間加熱処理した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。オートラジオグラフィーを行ない、翻訳産物の分子量を求めた。
【００２５】
（３）ＣＯＳ７による発現
本発明の蛋白質の発現ベクターを有する大腸菌を１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有２ｘＹＴ培地２ｍｌ中で３７℃２時間培養した後、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（５０μｌ）を添加し、３７℃で一晩培養した。遠心によって分離した上澄からポリエチレングリコール沈殿によって一本鎖ファージ粒子を得た。これを１００μｌの１ｍＭトリス−０．１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８（ＴＥ）に懸濁した。
【００２６】
サル腎臓由来培養細胞ＣＯＳ７は、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培地中、５％ＣＯ2存在下、３７℃で培養した。１ｘ１０5個のＣＯＳ７細胞を６穴プレート（ヌンク社、穴の直径３ｃｍ）に植え、５％ＣＯ2存在下、３７℃で２２時間培養した。培地除去後、リン酸緩衝液で細胞表面を洗浄し、さらに５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）を含むＤＭＥＭ（ＴＤＭ ＥＭ）で再度洗浄した。この細胞に一本鎖ファージ懸濁液１μｌ、ＤＭＥＭ 培 地０．６ｍｌ、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭTM（ＩＢＦ社）３μｌを懸濁したものを添加し、５％ＣＯ2存在下、３７℃で３時間培養した。サンプル液を除去後、 ＴＤＭＥＭで細胞表面を洗浄し、１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭを１穴あたり２ｍｌ加え、５％ＣＯ2存在下、３７℃にて２日間培養した。培地を［35Ｓ］システインあるいは［35Ｓ］メチオニンを含む培地に交換した後、１時間培養した。遠心分離によって、培地と細胞を分けたあと、培地画分と細胞膜画分の蛋白質をＳＤＳーＰＡＧＥにかけた。
【００２７】
（４）クローン例
＜ＨＰ０２５３９＞（配列番号１、１１、２１）
ヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ−２ｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ０２５３９のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、１８８ｂｐの５’非翻訳領域、１９４４ｂｐのＯＲＦ、２３５３ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは６４７アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、Ｎ末端に推定分泌シグナルが、Ｃ末端側に６箇所の推定膜貫通ドメインが存在した。図１にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。
【００２８】
本蛋白質のアミノ酸配列を用いてプロテインデータベースを検索したところ、マウスｆｒｉｚｚｌｅｄ−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０５４６２３）と類似性を有していた。表２に、本発明のヒト蛋白質（ＨＰ）とマウスｆｒｉｚｚｌｅｄ−１（ＭＭ）のアミノ酸配列の比較を示す。−はギャップを、＊は本発明の蛋白質と同一アミノ酸残基を、．は本発明の蛋白質と類似アミノ酸残基をそれぞれ表す。全領域にわたって、９０．４％の相同性を有していた。
【００２９】
【表２】
表２
【００３０】
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号ＡＡ０１００２０）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００３１】
＜ＨＰ０２７７０＞（配列番号２、１２、２２）
ヒトフィブロサルコ−マ細胞株ＨＴ−１０８０ｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ０２７７０のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、２５２ｂｐの５’非翻訳領域、１０５３ｂｐのＯＲＦ、２０４ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは３５０アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、２箇所の推定膜貫通ドメインが存在した。図２にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。インビトロ翻訳の結果、ＯＲＦから予想される分子量３８，２７４よりやや大きい４２ｋＤａの翻訳産物が生成した。
【００３２】
本蛋白質のアミノ酸配列を用いてプロテインデータベースを検索したところ、ヒトＲＩＮＧ亜鉛フィンガ−蛋白質（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０３７２０４）と類似性を有していた。表３に、本発明のヒト蛋白質（ＨＰ）とヒトＲＩＮＧ亜鉛フィンガ−蛋白質（ＺＮ）のアミノ酸配列の比較を示す。−はギャップを、＊は本発明の蛋白質と同一アミノ酸残基を、．は本発明の蛋白質と類似アミノ酸残基をそれぞれ表す。全領域にわたって、５６．０％の相同性を有していた。
【００３３】
【表３】
表３
【００３４】
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号ＡＡ４３４３１２）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００３５】
＜ＨＰ０２８６９＞（配列番号３、１３、２３）
ヒト類表皮癌細胞株ＫＢｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ０２８６９のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、２２９ｂｐの５’非翻訳領域、６２１ｂｐのＯＲＦ、２２０９ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは２０６アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、２箇所の推定膜貫通ドメインが存在した。図３にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。インビトロ翻訳の結果、ＯＲＦから予想される分子量２２，３６７とほぼ同じ２２ｋＤａの翻訳産物が生成した。
【００３６】
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号ＡＡ２７８２４７）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００３７】
＜ＨＰ０２９５６＞（配列番号４、１４、２４）
ヒト類表皮癌細胞株ＫＢｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ０２９５６のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、６８ｂｐの５’非翻訳領域、６４２ｂｐのＯＲＦ、１６５７ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは２１３アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、３箇所の推定膜貫通ドメインが存在した。図４にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。インビトロ翻訳の結果、ＯＲＦから予想される分子量２３，９０２とほぼ同じ２２ｋＤａの翻訳産物が生成した。
【００３８】
本蛋白質のアミノ酸配列を用いてプロテインデータベースを検索したところ、ヒトテトラスパンＮＥＴ−４（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号あＦ０６５３８９）と類似性を有していた。表４に、本発明のヒト蛋白質（ＨＰ）とヒトテトラスパンＮＥＴ−４（ＴＳ）のアミノ酸配列の比較を示す。−はギャップを、＊は本発明の蛋白質と同一アミノ酸残基を、．は本発明の蛋白質と類似アミノ酸残基をそれぞれ表す。Ｃ末端側１１９アミノ酸残基が、５８．８％の相同性を有していた。
【００３９】
【表４】
表４
【００４０】
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号Ｔ０５２７９）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００４１】
＜ＨＰ０２９６２＞（配列番号５、１５、２５）
ヒト類表皮癌細胞株ＫＢｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ０２９６２のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、１９ｂｐの５’非翻訳領域、１７８８ｂｐのＯＲＦ、５４８ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは５９５アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、Ｎ末端に推定分泌シグナルが存在した。図５にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。インビトロ翻訳の結果、ＯＲＦから予想される分子量６７，５４９よりやや大きい７０ｋＤａの翻訳産物が生成した。この際、ミクロソ−ムを添加すると、糖鎖が付加されたと考えられる８５ｋＤａの産物が生成した。分泌シグナル配列切断部位予測法である（−３、−１）規則を適用すると、成熟蛋白質は２３番目のアラニンから始まると予想される。なお、この蛋白質のアミノ酸配列の中には、Ｎ−グリコシレ−ションが起こる可能性がある部位が４箇所（７５番目Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ、１５３番目Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ、２３７番目Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ、３６０番目Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）存在する。
【００４２】
本蛋白質のアミノ酸配列を用いてプロテインデータベースを検索したところ、ヒト仮想蛋白質ＫＩＡＡ０５８４（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＢ０１１１５６）と類似性を有していた。表５に、本発明のヒト蛋白質（ＨＰ）とヒト仮想蛋白質ＫＩＡＡ０５８４（ＫＩ）のアミノ酸配列の比較を示す。−はギャップを、＊は本発明の蛋白質と同一アミノ酸残基を、．は本発明の蛋白質と類似アミノ酸残基をそれぞれ表す。全領域にわたって、５２．９％の相同性を有していた。
【００４３】
【表５】
表５
【００４４】
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号ＡＡ３５８８９６）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００４５】
＜ＨＰ０３０１４＞（配列番号６、１６、２６）
ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ３０１４のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、２６ｂｐの５’非翻訳領域、７９５ｂｐのＯＲＦ、２０３ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは２６４アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、１箇所の推定膜貫通ドメインが存在した。図６にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。インビトロ翻訳の結果、ＯＲＦから予想される分子量２８，４７１よりやや大きい３１ｋＤａの翻訳産物が生成した。
【００４６】
本蛋白質のアミノ酸配列を用いてプロテインデータベースを検索したところ、マウスＷＷドメイン結合蛋白質１（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ４０８２５）と類似性を有していた。表６に、本発明のヒト蛋白質（ＨＰ）とマウスＷＷドメイン結合蛋白質１（ＭＭ）のアミノ酸配列の比較を示す。−はギャップを、＊は本発明の蛋白質と同一アミノ酸残基を、．は本発明の蛋白質と類似アミノ酸残基をそれぞれ表す。全領域にわたって、８５．１％の相同性を有していた。
【００４７】
【表６】
表６
【００４８】
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号Ｗ２４５７５）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００４９】
＜ＨＰ１０６０８＞（配列番号７、１７、２７）
ヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ−２ｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ１０６０８のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、２３ｂｐの５’非翻訳領域、１０３２ｂｐのＯＲＦ、１８２ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは３４３アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、５箇所の推定膜貫通ドメインが存在した。図７にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。インビトロ翻訳の結果、ＯＲＦから予想される分子量４０，５８４よりやや小さい３７ｋＤａの翻訳産物が生成した。
【００５０】
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号Ｔ３５４０６）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００５１】
＜ＨＰ１０６０９＞（配列番号８、１８、２８）
ヒト類表皮癌細胞株ＫＢｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ１０６０９のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、３８ｂｐの５’非翻訳領域、７３５ｂｐのＯＲＦ、５５９ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは２４４アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、Ｎ末端に１箇所の推定膜貫通ドメインが存在した。図８にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。インビトロ翻訳の結果、ＯＲＦから予想される分子量２７，７５６とほぼ同じ２７ｋＤａの翻訳産物が生成した。
【００５２】
本蛋白質のアミノ酸配列を用いてプロテインデータベースを検索したところ、ヒト結核菌仮想蛋白質Ｒｖ１１４７（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｚ９５５８４）と類似性を有していた。表７に、本発明のヒト蛋白質（ＨＰ）とヒト結核菌仮想蛋白質Ｒｖ１１４７（ＭＴ）のアミノ酸配列の比較を示す。−はギャップを、＊は本発明の蛋白質と同一アミノ酸残基を、．は本発明の蛋白質と類似アミノ酸残基をそれぞれ表す。全領域にわたって、３１．７％の相同性を有していた。
【００５３】
【表７】
表７
【００５４】
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号Ｔ６０９８１）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００５５】
＜ＨＰ１０６１１＞（配列番号９、１９、２９）
ヒト類表皮癌細胞株ＫＢｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ１０６１１のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、３７ｂｐの５’非翻訳領域、９１２ｂｐのＯＲＦ、９８３ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは３０３アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、Ｎ末端に推定分泌シグナルが存在した。図９にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。インビトロ翻訳の結果、ＯＲＦから予想される分子量３３，８５６よりやや小さい３１ｋＤａの翻訳産物が生成した。この際、ミクロソ−ムを添加すると、３６ｋＤａの産物が生成した。分泌シグナル配列切断部位予測法である（−３、−１）規則を適用すると、成熟蛋白質は３４番目のロイシンから始まると予想される。
【００５６】
本蛋白質のアミノ酸配列を用いてプロテインデータベースを検索したところ、Ｃ末端２１８アミノ酸残基がヒトグルコシダ−ゼＩＩ（ＳＷＩＳＳーＰＲＯＴアクセション番号Ｑ０６００３）と一致していた。しかし、Ｎ末端側は類似性を示さなかった。
【００５７】
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号Ｈ１４０５４）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００５８】
＜ＨＰ１０６１７＞（配列番号１０、２０、３０）
ヒトフィブロサルコ−マ細胞株ＨＴ−１０８０ｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ１０６１７のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、７２ｂｐの５’非翻訳領域、４８３ｂｐのＯＲＦ、５６９ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは１６０アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、４箇所の推定膜貫通ドメインが存在した。図１０にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。インビトロ翻訳の結果、高分子量の翻訳産物が生成した。
【００５９】
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号Ｈ６７６７２）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００６０】
【発明の効果】
本発明は疎水性ドメインを有するヒト蛋白質、それをコードしているＤＮＡ、このＤＮＡの発現ベクター、およびこのＤＮＡを発現させた真核細胞を提供する。本発明の蛋白質は、いずれも分泌されるかあるいは細胞膜に存在するので、細胞の増殖や分化を制御している蛋白質と考えられる。したがって、本発明の蛋白質は、細胞の増殖や分化の制御に関わる制癌剤などの医薬品として、あるいはこの蛋白質に対する抗体を作製するための抗原として用いることができる。本発明のＤＮＡは、遺伝子診断用プローブや遺伝子治療用遺伝子源として用いることができる。また、このＤＮＡを用いることにより、この蛋白質を大量に発現することができる。これら遺伝子を導入してこの蛋白質を発現させた細胞は、対応するレセプターやリガンドの検出、新しい低分子医薬のスクリーニングなどに利用できる。
【００６１】
【配列表】
【００６２】
【００６３】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【００６７】
【００６８】
【００６９】
【００７０】
【００７１】
【００７２】
【００７３】
【００７４】
【００７５】
【００７６】
【００７７】
【００７８】
【００７９】
【００８０】
【００８１】
【００８２】
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【００９２】
【００９３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 クローンＨＰ０２５３９がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
【図２】 クローンＨＰ０２７７０がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
【図３】 クローンＨＰ０２８６９がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
【図４】 クローンＨＰ０２９５６がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
【図５】 クローンＨＰ０２９６２がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
【図６】 クローンＨＰ０３０１４がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
【図７】 クローンＨＰ１０６０８がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
【図８】 クローンＨＰ１０６０９がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
【図９】 クローンＨＰ１０６１１がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
【図１０】 クローンＨＰ１０６１７がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、疎水性ドメインを有するヒト蛋白質、それをコードしているＤＮＡ、このＤＮＡの発現ベクター、およびこのＤＮＡを発現させた真核細胞に関する。本発明の蛋白質は、医薬品として、あるいはこの蛋白質に対する抗体を作製するための抗原として用いることができる。本発明のヒトｃＤＮＡは、遺伝子診断用プローブや遺伝子治療用遺伝子源として用いることができる。また、このｃＤＮＡがコードしている蛋白質を大量生産するための遺伝子源として用いることができる。これらの遺伝子を導入して分泌蛋白質や膜蛋白質を大量発現させた細胞は、対応するレセプターやリガンドの検出、新しい低分子医薬のスクリーニングなどに利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
細胞は多くの蛋白質を細胞外に分泌している。これらの分泌蛋白質は、細胞の増殖制御、分化誘導、物質輸送、生体防御などにおいて重要な役割を果たしている。分泌蛋白質は細胞内蛋白質と異なり細胞外で作用するので、注射や点滴などによる体内投与が可能であり、医薬としての可能性を秘めている。事実、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポイエチン、血栓溶解剤など、多くのヒト分泌蛋白質が現在医薬として使用されている。また、これら以外の分泌蛋白質についても臨床試験が進行中であり、医薬品を目指した用途開発がなされている。ヒト細胞は、まだ多くの未知の分泌蛋白質を生産していると考えられており、これらの分泌蛋白質並びにそれをコ−ドしている遺伝子が入手できれば、これらを用いた新しい医薬品開発が期待できる。
【０００３】
一方、膜蛋白質は、シグナルレセプター、イオンチャンネル、トランスポーターなどとして、細胞膜を介する物質輸送や情報伝達において重要な役割を担っている。例えば、各種サイトカインに対するレセプター、ナトリウムイオン・カリウムイオン・塩素イオン等に対するイオンチャンネル、糖・アミノ酸等に対するトランスポーターなどが知られており、その多くはすでに遺伝子もクローン化されている。これらの膜蛋白質の異常は、これまで原因不明であった多くの病気と関連していることがわかってきた。従って、新しい膜蛋白質が見い出せれば、多くの病気の原因解明につながるものと期待され、膜蛋白質をコードする新たな遺伝子の単離が望まれている。
【０００４】
従来、これらの分泌蛋白質や膜蛋白質は、ヒト細胞から精製することが困難なので、遺伝子の方からのアプローチによって単離されたものが多い。一般的な方法は、ｃＤＮＡライブラリーを真核細胞に導入して、ｃＤＮＡを発現させたのち、目的とする活性を有する蛋白質を分泌発現あるいは膜表面上に発現している細胞をスクリーニングする、いわゆる発現クローニング法である。しかしこの方法では機能のわかった蛋白質の遺伝子しかクローン化できない。
【０００５】
一般に分泌蛋白質や膜蛋白質は、蛋白質内部に少なくとも一個所疎水性ドメインを有しており、リボソームで合成された後、このドメインが分泌シグナルとして働いたり、リン脂質膜内に留まり膜にトラップされる。従って、完全長ｃＤＮＡの全塩基配列を決定してやり、そのｃＤＮＡがコードしている蛋白質のアミノ酸配列の中に疎水性の高い領域が存在すれば、そのｃＤＮＡは分泌蛋白質や膜蛋白質をコードしていると考えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、疎水性ドメインを有する新規のヒト蛋白質、この蛋白質をコードするＤＮＡ、このＤＮＡの発現ベクター、およびこのＤＮＡを発現しうる形質転換真核細胞を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究の結果、ヒト完全長ｃＤＮＡバンクの中から疎水性ドメインを有する蛋白質をコードするｃＤＮＡをクローン化し、本発明を完成した。すなわち、本発明は疎水性ドメインを有するヒト蛋白質である、配列番号１から配列番号１０で表されるアミノ酸配列のいずれかを含む蛋白質を提供する。また本発明は上記蛋白質をコードするＤＮＡ、例えば配列番号１１から配列番号３０で表される塩基配列のいずれかを含むｃＤＮＡ、並びにこのＤＮＡをインビトロ翻訳あるいは真核細胞内で発現しうる発現ベクタ−、及びこのＤＮＡを発現し上記蛋白質を生産しうる形質転換真核細胞を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の蛋白質は、ヒトの臓器、細胞株などから単離する方法、本発明のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいは本発明の疎水性ドメインをコードするＤＮＡを用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができるが、組換えＤＮＡ技術で取得する方法が好ましく用いられる。例えば、本発明のｃＤＮＡを有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによりインビトロで蛋白質を発現できる。また翻訳領域を公知の方法により適当な発現ベクターに組換えてやれば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞で、コードしている蛋白質を大量に発現させることができる。
【０００９】
本発明の蛋白質を、インビトロ翻訳でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、このｃＤＮＡの翻訳領域を、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに組換え、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含む、ウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加してやれば、本発明の蛋白質をインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７１８、ｐＴ７／３ １９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩなどが例示できる。また、反応系にイヌ膵臓ミクロソームなどを添加してやれば、本発明の蛋白質を分泌型あるいはミクロソーム膜に組み込まれた形で発現することができる。
【００１０】
本発明の蛋白質を、大腸菌などの微生物でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、本発明のｃＤＮＡの翻訳領域を組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養してやれば、このｃＤＮＡがコードしている蛋白質を微生物内で大量生産することができる。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加して発現させてやれば、任意の領域を含む蛋白質断片を得ることができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。この融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによってこのｃＤＮＡがコードする蛋白質部分のみを取得することもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【００１１】
本発明の蛋白質を、真核細胞でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、このｃＤＮＡの翻訳領域を、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに組換え、真核細胞内に導入してやれば、本発明の蛋白質を分泌生産あるいは膜蛋白質として細胞膜表面上で生産することができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＥＤ６ｄｐｃ２、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、本蛋白質を発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００１２】
本発明の蛋白質を原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的蛋白質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどがあげられる。
【００１３】
本発明の蛋白質には、配列番号１から配列番号１０で表されるアミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペプチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれる。これらのペプチド断片は抗体を作製するための抗原として用いることができる。また、本発明の蛋白質の中でシグナル配列を有するものは、シグナル配列が除去された後、成熟蛋白質の形で分泌される。したがって、これらの成熟蛋白質は本発明の蛋白質の範疇にはいる。成熟蛋白質のＮ末端アミノ酸配列は、シグナル配列切断部位決定法［特開平８ー１８７１００］を用いて容易に求めることができる。また、いくつかの膜蛋白質は、細胞表面でプロセシングを受けて分泌型となる。このような分泌型となった蛋白質あるいはペプチドも本発明の蛋白質の範疇にはいる。アミノ酸配列の中に糖鎖結合部位が存在すると、適当な真核細胞で発現させれば糖鎖が付加した蛋白質が得られる。したがって、このような糖鎖が付加した蛋白質あるいはペプチドも本発明の蛋白質の範疇にはいる。
【００１４】
本発明のＤＮＡには、上記蛋白質をコードするすべてのＤＮＡが含まれる。このＤＮＡは、化学合成による方法、ｃＤＮＡクローニングによる方法などを用いて取得することができる。
【００１５】
本発明のｃＤＮＡは、例えばヒト細胞由来ｃＤＮＡライブラリーからクローン化することができる。ｃＤＮＡはヒト細胞から抽出した ポリ（Ａ）+ＲＮＡを鋳型として合成する。ヒト細胞としては、人体から手術などによって摘出されたものでも培養細胞でも良い。ｃＤＮＡは、岡山−Ｂｅｒｇ法［Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ． ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２：１６１−１７０（１９８２）］、Ｇｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ法［Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ． ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ ２５：２６３−２６９（１９８３）］などいかなる方法を用いて合成してもよいが、完全長クローンを効率的に得るためには、実施例にあげたようなキャッピング法［Ｋａｔｏ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １５０：２４３−２５０（１９９４）］を用いることが望ましい。また市販のヒトｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。ｃＤＮＡライブラリーから本発明のｃＤＮＡをクローン化するには、本発明のｃＤＮＡの任意の部分の塩基配列に基づいてオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとして用いて、公知の方法によりコロニーあるいはプラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行えばよい。また、目的とするｃＤＮＡ断片の両末端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして用いて、ヒト細胞から単離したｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により、本発明のｃＤＮＡ断片を調製することもできる。
【００１６】
本発明のｃＤＮＡは、配列番号１１から配列番号２０で表される塩基配列あるいは配列番号２１から配列番号３０で表される塩基配列のいずれかを含むことを特徴とするものである。それぞれのクローン番号（ＨＰ番号）、ｃＤＮＡクローンが得られた細胞、ｃＤＮＡの全塩基数、コードしている蛋白質のアミノ酸残基数をそれぞれ表１にまとめて示した。
【００１７】
【表１】
表１
なお、配列番号１１から配列番号３０のいずれかに記載のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、本発明で用いたヒト細胞株やヒト組織から作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明のｃＤＮＡと同一のクローンを容易に得ることができる。
【００１９】
一般にヒト遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従って配列番号１１から配列番号３０において、１又は複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／又は他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡも本発明の範疇にはいる。
【００２０】
同様に、これらの変更によって生じる、１又は複数個のアミノ酸の付加、欠失および／又は他のアミノ酸による置換がなされている蛋白質も、配列番号１から配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するそれぞれの蛋白質の活性を有する限り、本発明の範疇に入る。
【００２１】
本発明のｃＤＮＡには、配列番号１１から配列番号２０で表される塩基配列あるいは配列番号２１から配列番号３０で表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含むｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）も含まれる。また、センス鎖およびアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片もこの範疇にはいる。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプローブとして用いることができる。
【００２２】
【実施例】
次に実施例により発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。ＤＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、文献［”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９］に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記載の無い場合宝酒造社製のものを用いた。各酵素反応の緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。ｃＤＮＡ合成は文献［Ｋａｔｏ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １５０：２４３−２５０（１９９４）］に従った。
【００２３】
（１）疎水性ドメインを有する蛋白質をコードしているｃＤＮＡの選別
ｃＤＮＡライブラリーとして、フィブロサルコ−マ細胞株ＨＴ−１０８０ｃＤＮＡライブラリー（ＷＯ９８／１１２１７）、骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ−２ｃＤＮＡライブラリー（ＷＯ９７／３３９９３）、類表皮癌細胞株ＫＢｃＤＮＡライブラリー（ＷＯ９８／１１２１７）、手術によって摘出された肝臓組織ｃＤＮＡライブラリー（ＷＯ９８／２１３２８）を用いた。個々のライブラリーから完全長ｃＤＮＡクローンを選択し、その全塩基配列決定を行い、完全長ｃＤＮＡクローンからなるホモ・プロテインｃＤＮＡバンクを構築した。ホモ・プロテインｃＤＮＡバンクに登録された完全長ｃＤＮＡクローンがコードしている蛋白質について、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法［Ｋｙｔｅ，Ｊ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５７：１０５−１３２（１９８２）］により、疎水性／親水性プロフィールを求め、疎水性ドメインの有無を調べた。コードしている蛋白質のアミノ酸配列中に分泌シグナルや膜貫通ドメインと思われる疎水的な領域があるクローンを候補クローンとして選別した。
【００２４】
（２）インビトロ翻訳による蛋白質合成
本発明のｃＤＮＡを有するプラスミドベクターを用いて、ＴNＴウサギ網状赤血球溶解物キット（プロメガ社製）によるインビトロ転写／翻訳を行なった。この際［35Ｓ］メチオニンを添加し、発現産物をラジオアイソトープでラベルした。いずれの反応もキットに付属のプロトコールに従って行なった。プラスミド２μｇを、ＴNＴウサギ網状赤血球溶解物１２．５μｌ、緩衝液（キットに付属）０．５μｌ、アミノ酸混合液（メチオニンを含まない）２μｌ、［35Ｓ］メチオニン（アマーシャム社）２μｌ（０．３７ＭＢｑ／μｌ）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ０．５μｌ、ＲＮａｓｉｎ２０Ｕを含む総量２５μｌの反応液中で３０℃で９０分間反応させた。また、膜系存在下の実験は、この反応系に、イヌ膵臓ミクロソ−ム画分（プロメガ）２．５μｌを添加して行った。反応液３μｌにＳＤＳサンプリングバッファー（１２５ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ６．８、１２０ｍＭ２−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ溶液、０．０２５％ブロモフェノールブルー、２０％グリセロール）２μｌを加え、９５℃３分間加熱処理した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。オートラジオグラフィーを行ない、翻訳産物の分子量を求めた。
【００２５】
（３）ＣＯＳ７による発現
本発明の蛋白質の発現ベクターを有する大腸菌を１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有２ｘＹＴ培地２ｍｌ中で３７℃２時間培養した後、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（５０μｌ）を添加し、３７℃で一晩培養した。遠心によって分離した上澄からポリエチレングリコール沈殿によって一本鎖ファージ粒子を得た。これを１００μｌの１ｍＭトリス−０．１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８（ＴＥ）に懸濁した。
【００２６】
サル腎臓由来培養細胞ＣＯＳ７は、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培地中、５％ＣＯ2存在下、３７℃で培養した。１ｘ１０5個のＣＯＳ７細胞を６穴プレート（ヌンク社、穴の直径３ｃｍ）に植え、５％ＣＯ2存在下、３７℃で２２時間培養した。培地除去後、リン酸緩衝液で細胞表面を洗浄し、さらに５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）を含むＤＭＥＭ（ＴＤＭ ＥＭ）で再度洗浄した。この細胞に一本鎖ファージ懸濁液１μｌ、ＤＭＥＭ 培 地０．６ｍｌ、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭTM（ＩＢＦ社）３μｌを懸濁したものを添加し、５％ＣＯ2存在下、３７℃で３時間培養した。サンプル液を除去後、 ＴＤＭＥＭで細胞表面を洗浄し、１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭを１穴あたり２ｍｌ加え、５％ＣＯ2存在下、３７℃にて２日間培養した。培地を［35Ｓ］システインあるいは［35Ｓ］メチオニンを含む培地に交換した後、１時間培養した。遠心分離によって、培地と細胞を分けたあと、培地画分と細胞膜画分の蛋白質をＳＤＳーＰＡＧＥにかけた。
【００２７】
（４）クローン例
＜ＨＰ０２５３９＞（配列番号１、１１、２１）
ヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ−２ｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ０２５３９のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、１８８ｂｐの５’非翻訳領域、１９４４ｂｐのＯＲＦ、２３５３ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは６４７アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、Ｎ末端に推定分泌シグナルが、Ｃ末端側に６箇所の推定膜貫通ドメインが存在した。図１にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。
【００２８】
本蛋白質のアミノ酸配列を用いてプロテインデータベースを検索したところ、マウスｆｒｉｚｚｌｅｄ−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０５４６２３）と類似性を有していた。表２に、本発明のヒト蛋白質（ＨＰ）とマウスｆｒｉｚｚｌｅｄ−１（ＭＭ）のアミノ酸配列の比較を示す。−はギャップを、＊は本発明の蛋白質と同一アミノ酸残基を、．は本発明の蛋白質と類似アミノ酸残基をそれぞれ表す。全領域にわたって、９０．４％の相同性を有していた。
【００２９】
【表２】
表２
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号ＡＡ０１００２０）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００３１】
＜ＨＰ０２７７０＞（配列番号２、１２、２２）
ヒトフィブロサルコ−マ細胞株ＨＴ−１０８０ｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ０２７７０のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、２５２ｂｐの５’非翻訳領域、１０５３ｂｐのＯＲＦ、２０４ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは３５０アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、２箇所の推定膜貫通ドメインが存在した。図２にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。インビトロ翻訳の結果、ＯＲＦから予想される分子量３８，２７４よりやや大きい４２ｋＤａの翻訳産物が生成した。
【００３２】
本蛋白質のアミノ酸配列を用いてプロテインデータベースを検索したところ、ヒトＲＩＮＧ亜鉛フィンガ−蛋白質（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０３７２０４）と類似性を有していた。表３に、本発明のヒト蛋白質（ＨＰ）とヒトＲＩＮＧ亜鉛フィンガ−蛋白質（ＺＮ）のアミノ酸配列の比較を示す。−はギャップを、＊は本発明の蛋白質と同一アミノ酸残基を、．は本発明の蛋白質と類似アミノ酸残基をそれぞれ表す。全領域にわたって、５６．０％の相同性を有していた。
【００３３】
【表３】
表３
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号ＡＡ４３４３１２）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００３５】
＜ＨＰ０２８６９＞（配列番号３、１３、２３）
ヒト類表皮癌細胞株ＫＢｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ０２８６９のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、２２９ｂｐの５’非翻訳領域、６２１ｂｐのＯＲＦ、２２０９ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは２０６アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、２箇所の推定膜貫通ドメインが存在した。図３にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。インビトロ翻訳の結果、ＯＲＦから予想される分子量２２，３６７とほぼ同じ２２ｋＤａの翻訳産物が生成した。
【００３６】
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号ＡＡ２７８２４７）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００３７】
＜ＨＰ０２９５６＞（配列番号４、１４、２４）
ヒト類表皮癌細胞株ＫＢｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ０２９５６のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、６８ｂｐの５’非翻訳領域、６４２ｂｐのＯＲＦ、１６５７ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは２１３アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、３箇所の推定膜貫通ドメインが存在した。図４にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。インビトロ翻訳の結果、ＯＲＦから予想される分子量２３，９０２とほぼ同じ２２ｋＤａの翻訳産物が生成した。
【００３８】
本蛋白質のアミノ酸配列を用いてプロテインデータベースを検索したところ、ヒトテトラスパンＮＥＴ−４（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号あＦ０６５３８９）と類似性を有していた。表４に、本発明のヒト蛋白質（ＨＰ）とヒトテトラスパンＮＥＴ−４（ＴＳ）のアミノ酸配列の比較を示す。−はギャップを、＊は本発明の蛋白質と同一アミノ酸残基を、．は本発明の蛋白質と類似アミノ酸残基をそれぞれ表す。Ｃ末端側１１９アミノ酸残基が、５８．８％の相同性を有していた。
【００３９】
【表４】
表４
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号Ｔ０５２７９）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００４１】
＜ＨＰ０２９６２＞（配列番号５、１５、２５）
ヒト類表皮癌細胞株ＫＢｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ０２９６２のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、１９ｂｐの５’非翻訳領域、１７８８ｂｐのＯＲＦ、５４８ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは５９５アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、Ｎ末端に推定分泌シグナルが存在した。図５にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。インビトロ翻訳の結果、ＯＲＦから予想される分子量６７，５４９よりやや大きい７０ｋＤａの翻訳産物が生成した。この際、ミクロソ−ムを添加すると、糖鎖が付加されたと考えられる８５ｋＤａの産物が生成した。分泌シグナル配列切断部位予測法である（−３、−１）規則を適用すると、成熟蛋白質は２３番目のアラニンから始まると予想される。なお、この蛋白質のアミノ酸配列の中には、Ｎ−グリコシレ−ションが起こる可能性がある部位が４箇所（７５番目Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ、１５３番目Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ、２３７番目Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ、３６０番目Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）存在する。
【００４２】
本蛋白質のアミノ酸配列を用いてプロテインデータベースを検索したところ、ヒト仮想蛋白質ＫＩＡＡ０５８４（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＢ０１１１５６）と類似性を有していた。表５に、本発明のヒト蛋白質（ＨＰ）とヒト仮想蛋白質ＫＩＡＡ０５８４（ＫＩ）のアミノ酸配列の比較を示す。−はギャップを、＊は本発明の蛋白質と同一アミノ酸残基を、．は本発明の蛋白質と類似アミノ酸残基をそれぞれ表す。全領域にわたって、５２．９％の相同性を有していた。
【００４３】
【表５】
表５
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号ＡＡ３５８８９６）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００４５】
＜ＨＰ０３０１４＞（配列番号６、１６、２６）
ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ３０１４のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、２６ｂｐの５’非翻訳領域、７９５ｂｐのＯＲＦ、２０３ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは２６４アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、１箇所の推定膜貫通ドメインが存在した。図６にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。インビトロ翻訳の結果、ＯＲＦから予想される分子量２８，４７１よりやや大きい３１ｋＤａの翻訳産物が生成した。
【００４６】
本蛋白質のアミノ酸配列を用いてプロテインデータベースを検索したところ、マウスＷＷドメイン結合蛋白質１（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ４０８２５）と類似性を有していた。表６に、本発明のヒト蛋白質（ＨＰ）とマウスＷＷドメイン結合蛋白質１（ＭＭ）のアミノ酸配列の比較を示す。−はギャップを、＊は本発明の蛋白質と同一アミノ酸残基を、．は本発明の蛋白質と類似アミノ酸残基をそれぞれ表す。全領域にわたって、８５．１％の相同性を有していた。
【００４７】
【表６】
表６
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号Ｗ２４５７５）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００４９】
＜ＨＰ１０６０８＞（配列番号７、１７、２７）
ヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ−２ｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ１０６０８のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、２３ｂｐの５’非翻訳領域、１０３２ｂｐのＯＲＦ、１８２ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは３４３アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、５箇所の推定膜貫通ドメインが存在した。図７にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。インビトロ翻訳の結果、ＯＲＦから予想される分子量４０，５８４よりやや小さい３７ｋＤａの翻訳産物が生成した。
【００５０】
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号Ｔ３５４０６）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００５１】
＜ＨＰ１０６０９＞（配列番号８、１８、２８）
ヒト類表皮癌細胞株ＫＢｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ１０６０９のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、３８ｂｐの５’非翻訳領域、７３５ｂｐのＯＲＦ、５５９ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは２４４アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、Ｎ末端に１箇所の推定膜貫通ドメインが存在した。図８にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。インビトロ翻訳の結果、ＯＲＦから予想される分子量２７，７５６とほぼ同じ２７ｋＤａの翻訳産物が生成した。
【００５２】
本蛋白質のアミノ酸配列を用いてプロテインデータベースを検索したところ、ヒト結核菌仮想蛋白質Ｒｖ１１４７（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｚ９５５８４）と類似性を有していた。表７に、本発明のヒト蛋白質（ＨＰ）とヒト結核菌仮想蛋白質Ｒｖ１１４７（ＭＴ）のアミノ酸配列の比較を示す。−はギャップを、＊は本発明の蛋白質と同一アミノ酸残基を、．は本発明の蛋白質と類似アミノ酸残基をそれぞれ表す。全領域にわたって、３１．７％の相同性を有していた。
【００５３】
【表７】
表７
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号Ｔ６０９８１）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００５５】
＜ＨＰ１０６１１＞（配列番号９、１９、２９）
ヒト類表皮癌細胞株ＫＢｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ１０６１１のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、３７ｂｐの５’非翻訳領域、９１２ｂｐのＯＲＦ、９８３ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは３０３アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、Ｎ末端に推定分泌シグナルが存在した。図９にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。インビトロ翻訳の結果、ＯＲＦから予想される分子量３３，８５６よりやや小さい３１ｋＤａの翻訳産物が生成した。この際、ミクロソ−ムを添加すると、３６ｋＤａの産物が生成した。分泌シグナル配列切断部位予測法である（−３、−１）規則を適用すると、成熟蛋白質は３４番目のロイシンから始まると予想される。
【００５６】
本蛋白質のアミノ酸配列を用いてプロテインデータベースを検索したところ、Ｃ末端２１８アミノ酸残基がヒトグルコシダ−ゼＩＩ（ＳＷＩＳＳーＰＲＯＴアクセション番号Ｑ０６００３）と一致していた。しかし、Ｎ末端側は類似性を示さなかった。
【００５７】
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号Ｈ１４０５４）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００５８】
＜ＨＰ１０６１７＞（配列番号１０、２０、３０）
ヒトフィブロサルコ−マ細胞株ＨＴ−１０８０ｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンＨＰ１０６１７のｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、７２ｂｐの５’非翻訳領域、４８３ｂｐのＯＲＦ、５６９ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた。ＯＲＦは１６０アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、４箇所の推定膜貫通ドメインが存在した。図１０にＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法で求めた本蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す。インビトロ翻訳の結果、高分子量の翻訳産物が生成した。
【００５９】
また、本ｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に、９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号Ｈ６７６７２）が登録されていたが、部分配列なので本発明の蛋白質と同じ蛋白質をコードしているかどうかは判定できない。
【００６０】
【発明の効果】
本発明は疎水性ドメインを有するヒト蛋白質、それをコードしているＤＮＡ、このＤＮＡの発現ベクター、およびこのＤＮＡを発現させた真核細胞を提供する。本発明の蛋白質は、いずれも分泌されるかあるいは細胞膜に存在するので、細胞の増殖や分化を制御している蛋白質と考えられる。したがって、本発明の蛋白質は、細胞の増殖や分化の制御に関わる制癌剤などの医薬品として、あるいはこの蛋白質に対する抗体を作製するための抗原として用いることができる。本発明のＤＮＡは、遺伝子診断用プローブや遺伝子治療用遺伝子源として用いることができる。また、このＤＮＡを用いることにより、この蛋白質を大量に発現することができる。これら遺伝子を導入してこの蛋白質を発現させた細胞は、対応するレセプターやリガンドの検出、新しい低分子医薬のスクリーニングなどに利用できる。
【００６１】
【配列表】
【００６２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 クローンＨＰ０２５３９がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
【図２】 クローンＨＰ０２７７０がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
【図３】 クローンＨＰ０２８６９がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
【図４】 クローンＨＰ０２９５６がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
【図５】 クローンＨＰ０２９６２がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
【図６】 クローンＨＰ０３０１４がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
【図７】 クローンＨＰ１０６０８がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
【図８】 クローンＨＰ１０６０９がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
【図９】 クローンＨＰ１０６１１がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
【図１０】 クローンＨＰ１０６１７がコードする蛋白質の疎水性／親水性プロフィールを示す図である。
Claims (6)
- 配列番号１から配列番号１０で表されるアミノ酸配列のいずれかを含む蛋白質。
- 請求項１記載の蛋白質のいずれかをコードするＤＮＡ。
- 配列番号１１から配列番号２０で表される塩基配列のいずれかを含むｃＤＮＡ。
- 配列番号２１から配列番号３０で表される塩基配列のいずれかからなる、請求項３記載のｃＤＮＡ。
- 請求項２から請求項４のいずれかに記載のＤＮＡをインビトロ翻訳あるいは真核細胞内で発現しうる発現ベクター。
- 請求項２から請求項４のいずれかに記載のＤＮＡを発現し、請求項１記載の蛋白質を生産しうる形質転換真核細胞。
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|---|---|---|---|
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003505350A (ja) * | 1999-07-20 | 2003-02-12 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 免疫関連疾患の治療のための組成物と方法 |
| JP2003531811A (ja) * | 1999-03-08 | 2003-10-28 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 血管形成及び心臓血管新生の促進又は阻害 |
-
1998
- 1998-11-17 JP JP32625598A patent/JP2007222001A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003531811A (ja) * | 1999-03-08 | 2003-10-28 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 血管形成及び心臓血管新生の促進又は阻害 |
| JP2003505350A (ja) * | 1999-07-20 | 2003-02-12 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 免疫関連疾患の治療のための組成物と方法 |
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