JP2007244240A - 緑色カルス細胞の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】３種の特定のＤＮＡ配列、またはそれら等価物の１つを含む遺伝子を用いて、緑色カルス細胞、すなわちクロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂを合成する形質転換カルス細胞を製造する方法、および該製造方法によって得られる形質転換カルス細胞を提供すること。
【解決手段】（１）遺伝子構築物中の植物用の強力プロモーターに、特定の３種のＤＮＡ配列、またはそれら等価物の１つを含む遺伝子を作動的に連結し、遺伝子構築物を得ること、（２）（１）で得られた遺伝子構築物を用いて、植物細胞を形質転換し、形質転換植物細胞を得ること、および（３）（２）で得られた形質転換植物細胞を培養し、形質転換カルス細胞を得ること、を含む、クロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞の製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、配列番号１、２、３のＤＮＡ配列またはそれらの等価物の１つを含む遺伝子を用いた、緑色カルス細胞、すなわち、クロロフィルａおよび／またはｂ含有形質転換カルス細胞の製造方法に関するものである。

植物体を培養細胞（カルス細胞（脱分化細胞））として増殖した場合、カルス細胞は葉緑体を維持および合成できないためカルス細胞は黄白色となる。そのため、カルス細胞を培養する場合、植物体と異なり光合成によって成長または増殖することが出来ず、水、無機塩以外にも糖などの栄養成分を必要とする。また、葉緑体は、植物における多くの有用物質の生合成における前駆体物質を提供する場ともなっているため、多くの有用物質がカルス細胞においては合成できない。

これまで、カルス細胞を緑化させることの出来る遺伝子としてシロイヌナズナ由来のレセプター様キナーゼ遺伝子（The Arabidopsis Information Resource (TAIR)にAt3g16030として登録されている遺伝子、http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?name=AT3G16030&type=locus）が報告されていた（非特許文献１）。しかし、本発明のシロイヌナズナ由来の配列番号１のＤＮＡ配列（TAIR にAt3g05490として登録されている遺伝子、http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?name=AT3G05490&type=locus）、配列番号２のＤＮＡ配列（TAIR にAt3g59870として登録されている遺伝子、http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?type=gene&id=37998）、配列番号３のＤＮＡ配列（TAIR にAt3g59860として登録されている遺伝子、http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?name=AT3G59860&type=locus）については、これまでシロイヌナズナの全ゲノム配列が公開されているため公知であるが、その本来の機能も、本発明のカルス細胞の緑色化に利用出来ることも知られていなかった。

本発明者は、リブロースー１，５一ニリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）のＳサブユニットＤＮＡ配列（ＲＢＣＳ−３Ｂ）のプロモーターに薬剤耐性遺伝子またはレポーター遺伝子を連結させたキメラ遺伝子により形質転換したシロイヌナズナに、CaMV35S（カリフラワーモザイクウィルス35S）プロモーターのエンハンサーを用いたアクティベーションタギング法（非特許文献２）を施し、得られた緑色カルス細胞（非特許文献１）を解析することで、本発明に用いる、配列番号１のＤＮＡ配列、配列番号２のＤＮＡ配列および配列番号３のＤＮＡ配列が、カルス細胞を緑色化する原因遺伝子であることをはじめて見出した。そして、この配列番号１のＤＮＡ配列、配列番号２のＤＮＡ配列または配列番号３のＤＮＡ配列を含む遺伝子をカルス細胞中で強制発現させる本発明の緑色カルス細胞の製造方法を完成した。
小林裕和等、第４５回日本植物生理学会（東京）、講演要旨集p. 135(1pB15, 136）、2004年３月 後藤新悟等、蛋白質核酸酵素 Vol.50 No.14、p. 1921-1922（2005）

本発明は、配列番号１のＤＮＡ配列、配列番号２のＤＮＡ配列、配列番号３のＤＮＡ配列またはそれらの等価物の１つを含む遺伝子を用いて、緑色カルス細胞、すなわち、クロロフィルａおよび／またはｂ含有形質転換カルス細胞を製造する方法および該製造方法によって得られる形質転換カルス細胞を提供することにある。

１．本発明は、
（１）遺伝子構築物中の植物用の強力プロモーターに、配列番号１のＤＮＡ配列、配列番号２のＤＮＡ配列、配列番号３のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つを含む遺伝子を作動的に連結し、遺伝子構築物を得ること、
（２）（１）で得られた遺伝子構築物を用いて、植物細胞を形質転換し、形質転換植物細胞を得ること、および
（３）（２）で得られた形質転換植物細胞を培養し、形質転換カルス細胞を得ること、
を含む、クロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞の製造方法に関するものである。
２．本発明は、植物用の強力プロモーターが、カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーターまたはノパリン合成酵素遺伝子プロモーターである、１．に記載のクロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞の製造方法に関するものである。
３．本発明は、遺伝子構築物が、アグロバクテリウム用バイナリープラスミドである、１．に記載のクロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞の製造方法に関するものである。
４．本発明は、１．から３．のいずれか１つに記載の製造方法によって得られた、クロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞に関するものである。
５．本発明は、１．から３．のいずれか１つに記載の（１）で得られた遺伝子構築物に関するものである。
６．本発明は、１．から３．のいずれか１つに記載の（２）で得られた形質転換植物細胞に関するものである。

本発明の方法により、従来、クロロフィルａおよび／またはｂを含有できなかったカルス細胞（黄白色カルス細胞）において、クロロフィルａおよび／またはｂの含有が可能となった。

本発明で用いる「カルス細胞」とは、培地で培養されている脱分化した状態の植物細胞およびその塊を意味し、本発明で用いる「植物細胞」とは、植物体、葉、茎、根、胚などの器官、それらの細断片、または培地で培養されているが脱分化していない状態の植物細胞およびカルス細胞を意味する。ここで、分化とは、植物細胞が成長して、葉、茎、根、胚などの器官や植物体へと変化することを意味し、脱分化とは、植物体中の葉、茎、根、胚などに一旦特定された細胞がその性質を失い、再び葉、茎、根、胚、さらには植物体へと成長する能力をあらたに獲得することを意味する。

完全に脱分化したカルス細胞は、クロロフィルａおよび／またはｂを含有できないので、本発明で用いる「カルス細胞」は、クロロフィルａおよび／またはｂを含有していないものを意味する。しかし、脱分化前に存在していたクロロフィルａおよび／またはｂがカルス細胞中に残存している場合がある。よって、本発明で用いる「カルス細胞」には、脱分化前のクロロフィルａおよび／またはｂが残存しているカルス細胞も含む。

本発明で用いるカルス細胞は、植物体中の全ての細胞から誘導して得ることができるが、好ましくは、葉、茎、根、胚、より好ましくは、葉、茎、根、さらに好ましくは根から誘導して得たものである。カルス細胞は、植物体、例えば、葉、茎、根、胚を細かく切り刻んだ後、これら細断片をカルス細胞誘導培地で培養することにより植物細胞からカルス細胞に誘導することができる。すなわち、これら細断片をカルス細胞誘導培地で培養することで、これら細断片から脱分化した状態の植物細胞（カルス細胞）を増殖させることが出来る。よって、本発明で用いる「形質転換した植物細胞を培養し、形質転換カルス細胞を得ること」とは、植物細胞があらかじめ形質転換されている場合において、植物体の細断片または脱分化していない状態の培養植物細胞をカルス細胞誘導培地で培養することで、その植物体の細断片または脱分化していない状態の培養植物細胞から脱分化した植物細胞であるカルス細胞を増殖させることを意味する。また、植物細胞が、カルス細胞であった場合には、カルス細胞状態を維持しながら培養することを意味する。カルス細胞は、カルス細胞誘導培地でない培地で培養するとカルス細胞ではなくなるからである。

本発明で用いる、カルス細胞誘導培地とは、植物細胞をカルス細胞に誘導するための培地で、植物細胞培養培地、例えばＭＳ培地、Gamborg B5培地に、植物ホルモン、例えば、2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D)、カイネチン、ナフタレン酢酸、インドール酢酸、インドール酪酸、イソペンテニルアデニン、ベンジルアミノプリンなどの少なくとも１つを添加した、上記植物細胞培養培地を意味する。なお、カルス細胞誘導培地が、使用される植物により任意に選択されることは当業者にとっては周知である。本発明で用いる、好ましいカルス細胞誘導培地は、実施例に記載のカルス細胞誘導培地（ＣＩＭ）である。

ここで、植物は、上記のような方法によりカルス細胞を形成できる全ての植物を意味し、好ましくは、ダイオウ(Rheum palmatum、R. tangusticum、R. officinale、R. coreanumまたはそれらの種間雑種)、マルバアサガオ（Ipomoea purpurea）、ラズベリー（Rubus idaeus）、ホップ（Humulus lupulus）、ニンジン（Daucus carota）、ムラサキイモ（Ipomoea batatas）、茶（Camellia sinensis）、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、より好ましくは、ニンジン、ムラサキイモ、茶、シロイヌナズナ、更に好ましくは、茶、シロイヌナズナである。

本発明で用いる、「遺伝子」とは、特に記載がない限り、デオキシリボヌクレオチドの２本鎖ポリマー、すなわちＤＮＡ鎖を意味する。また、本発明で用いる「ＤＮＡ」も、特に記載がない限り、ＤＮＡ鎖を意味する。「ＲＮＡ」および「ＲＮＡ鎖」は、特に記載がない限り、リボヌクレオチドの１本鎖ポリマーを意味する。本発明で用いる、「ＤＮＡ配列」とは、５’末端側から３’末端側へと読まれるＤＮＡ鎖のデオキシリボヌクレオチド配列を意味し、場合により、用語「遺伝子」と相互互換的に用いることが出来る。また、本発明で用いる、「ゲノム」とは、プラスミドを除く、生物が持っているＤＮＡ全体を意味する。

本発明で用いる、「配列番号１のＤＮＡ配列」とは、The Arabidopsis Information Resource (TAIR）にAt3g0549として登録されている、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）に由来する、配列番号１：
5'ATGACGAACACTCGCGCGATCTACGCCGTCATCGCGATCCTGGCGATAGTAATCTCAGCC
GTGGAATCAACCGGAGACTTCGGAGATTCGCTAGATTTCGTGAGAGCCGGATCTTCATCG
CTCTTCTCTGGATGCACAGGATCGATCGCAGAGTGTATAGCGGAAGAAGAAGAGATGGAG
TTCGATTCAGACATAAGCCGGCGTATATTAGCACAGAAGAAGTACATTAGCTACGGTGCT
ATGAGGAGGAACAGTGTGCCTTGTTCACGGCGTGGTGCGTCGTACTACAACTGCCAGCGT
GGAGCTCAGGCGAATCCTTACAGCCGTGGATGCAGCACCATCACTAGGTGCAGGCGTTGA3'
のＤＮＡ配列を意味する。

本発明で用いる、「配列番号１のＤＮＡ配列を含む遺伝子」とは、配列番号１のＤＮＡ配列が、その５’末端の上流と３’末端の下流に、任意に伸びたＤＮＡ配列（いわゆる、５’および３’フランキング領域）を有し、ＤＮＡ組換え技術に用いることができるようにその５’および３’フランキング領域に制限酵素部位が含まれていることを意味する。

本発明で用いる、「配列番号２のＤＮＡ配列」とは、The Arabidopsis Information Resource (TAIR)にAt3g59870として登録されている、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）に由来する、配列番号２：
5'ATGAGTTCGG CTCTACCTTT GAAGCTTTTG TTGCCTCTTA CAACAACTTC ATTGCTACCT
TCTCCTTTCC GATCGGATAA CCCTAACTTC TATCGCCGTC GTTCCTCTTC CTCTACTTCG
TGTTCTTCTC AATCCCAATC GTTTCAGCTT TTCTCTGTTA GACGACGCCG ATCCAGATCC
TCCTCTCCCT CTATTCCCAT GGTAATTTCT GATCACTCGC CTTCTTATTC TATTACTGCT
TTTTGATTCG AGATTGATTT TTTGAAGACT TTGTTAGCCA TTGGTATAGG TTGATTATGT
GGCCAATTGA TTACCTTCTC TTAAGAACTC AAATAGTTAT TCATTGCATT GAATAAGACG
ATGCACTCTT TTGATCGTCA ATGAATGAAA AGCTTAGTTT TCTCAGAACA TCAGCTTTGA
TTTGTCGAAG ATGTGGTGTG CCCTCTTTGT TTCGAGCTTA AATGCTCACA ACATACCAAT
AATCTATGTG TTATGAATTG CATTTGGGTT TTCACTAATG ATTTACTCCC AGGGGCTCTG
TTTCTATGTG ATGCTGTATA GTGCTTTCCT GAACAAACGA GAGATCAAGA CGACGTGGAT
AGTTGGGTGA ACAAAGAGGA CAATGTGACT TGTAGGTTTG ACTCAGATGA AGACACCACC
ACCACCGGAC TCCGGATTCC AACACAAGCT CAAGCTATCG TTGAAGGACC TGGTTCACTT
GCTGTGTCGG AGCTACAACG AGTCCCTGAT GTAGATTATA TACAAGTAAG TTAATCTAAA
TTTGACTGCC TAGATGATGG AAGACCAAAT GTTTTATCAG TCTTTTAGGT TGTAACCATA
TGCGAATTGG CAGGAACTGT TGGCTATACA GCAACAAGGA CCAAGAACAA TTGGCTTCTT
TGGAACTAGA AATATGGGTT TCATGCATCA AGAGCTCATT CAGATTCTTA GCTATGCTAT
GGTTATAACT GTAAGACATT TTGCCTACAA GGCTACAATT TCTGAACCAT ATGTTTGGTT
CACCACATCT TATAACCATC TCCCCTGTGA TTTATCTTGC AGAAAAACCA TATCTACACA
TCAGGTGCAG CTGGAACCAA TGCAGCTGTT ATAAGAGGTG CACTTAGAGC AGAGAGACCA
GAGCTTCTTA CAGTTATCTT ACCTCAAAGT TTGAAAAAGC AACCTCCTGA AAGCCAGGAA
CTACTGTCAA AAGTAAGAGA CTAGTTTCAA GATTTTCTTT TACTCCAACT GCATTGTCTT
AAATATCGAA ATGTTCACTT CTATCTGCTA TAAATCTGAA TATCATCCAT TCTTGGCTAT
GCTATAGTTC AACTGAGTCT CCTTTGTAAT GTCTGCAACA GGTACAAAAC GTGATAGAAA
AGCCTCACAA CGACCATTTA CCGTTATTAG AAGCCAGCAG GTTTGTCACT CACCACTCTT
TACCATACAC GGTAGCAAAA CCGAGAAAAG ATGGCTTATG AGATATAGTG AAACATTGTA
GAATCAATTT TCTGAGACGT ATCTCCAAGT AAGTAAAATG GTGATTGGTT TTGCAGGCTA
TGTAACATGG ATATCATATC ACAAGTGCAA CAAATCATTT GCTTTGCGTT TCATGATAGT
AAGCTTCTCA TGGAGACATG TCAAGAAGCT AGAAATCTCC GGAAGATTGT TACCCTCTTC
TACCTGGATT GA3'
のＤＮＡ配列を意味する。

本発明で用いる、「配列番号２のＤＮＡ配列を含む遺伝子」とは、上記の配列番号１のＤＮＡ配列の場合と同様にＤＮＡ組換え技術に用いることができるように制限酵素部位を含んだ５’および３’フランキング領域を有する配列番号２のＤＮＡ配列を意味する。

本発明で用いる、「配列番号３のＤＮＡ配列」とは、The Arabidopsis Information Resource (TAIR)にAt3g59860として登録されている、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）に由来する、配列番号３：
5'ATGGATAATC TCGTATTTAC TATGGTCGGT GAGTGGAGAT GCAAAGAAGA AAAATGGAAA
TTTGAACCAG AGGAAGACAT GTTTGGTCGT TGTGTACGTG TTAAGGAAAA CATGACGTAC
ACGGAATTTG TATGTACACT AAGCGAGACT TTCAGTTTGA AGTCCATAGA GATCAATCCC
ATGATTAGTT ACTGGATACC GGGAGTGATG TTAGTTATGT AGATACTAAA CGCCCTCCTG
TCTACATTGA CAGTCAAGTG AGGGTGGGAT ACGATTTTTT TTATTCGTGG TGGGTATCCT
TCTCTCAACT TGTTTGTCTC TTTCATTACA ACCGTCAATA CACTCGGAAA TAATGTCTCT
AGGACTCATG GTGACGATGC TGAAAGTGAC TGTGTGTGTG ATAGTGTTTT AATGTTGATG
AAAATAATGA GACCGTAGAT TAGCAAGACG ACATTGAAGA CGATAAAACA GATGAGGATG
AAGATGAGAG GACAACGAAG ATGGTGATGG GTATGATGAT TATCAGGGTG ACGATGGATC
TATGGGGGAA GTACCATCGA TCCTACTATT GATGGTAGTG AAAGTAGTGG CGAAGATTAT
GATTACAACA AGTGGAACGA TGAAATTGTA GAAGAATATG GAATAGGGAA TGTTGAGGAG
AACGTCATTC TCACACAGCT GACTGTTCAA CATCCAAGGG AATTCAGTCT TCTGTTGGCA
GAGTGTACGT AG3'
のＤＮＡ配列を意味する。

本発明で用いる、「配列番号３のＤＮＡ配列を含む遺伝子」とは、上記の配列番号１のＤＮＡ配列の場合と同様にＤＮＡ組換え技術に用いることができるように制限酵素部位を含んだ５’および３’フランキング領域を有する配列番号３のＤＮＡ配列を意味する。

また、「それら等価物の１つを含む遺伝子」という意味も上記の同様で、以下に記載する配列番号１、２、３のＤＮＡ配列の等価物が、制限酵素部位を含む５’および３’フランキング領域を有することを意味する。

かかるＤＮＡ配列は、例えば、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡと適当なプライマーを用いてＰＣＲ（Polymerase chain reaction）により得ることが出来る。ＰＣＲとは、鋳型となるＤＮＡと適当なプライマーを用いる遺伝子増幅方法であり、当業者には周知である。ＰＣＲは当業者に周知の標準的な条件で実施できる。ＰＣＲに必要な試薬、器具類はすべて市場より入手できる。

配列番号１、２、３のＤＮＡ配列とは同一ではないが、配列番号１、２、３のＤＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列が、シロイヌナズナと異なる植物においても存在することは当業者にとっては周知なことである。よって、配列番号１、２、３のＤＮＡ配列と異なっていても、１、２、３のＤＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列は、本発明で用いる、「それら等価物」に含まれる。

ここで、配列番号１、２、３のＤＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列とは、６０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上のＤＮＡ配列の同一性を有するＤＮＡ配列であって、配列番号１のＤＮＡ配列と同様な機能を有するＤＮＡ配列を意味する。ここで、ＤＮＡ配列の同一性とは、２つのＤＮＡ配列間におけるデオキシヌクレオチドの一致率を意味する。ＤＮＡ配列の同一性は、当業者に周知である公開のソフトウェアであるCLASTL W（http://align.genome.jp/）を用いて行なうことが出来る。また、同様な機能とは、クロロフィルａおよび／またはｂを含有していないカルス細胞を、クロロフィルａおよび／またはｂを含有する本発明の形質転換カルス細胞に形質転換する、配列番号１、２、３のＤＮＡ配列の機能を意味する。

また、配列番号１、２、３のＤＮＡ配列に１つ以上のデオキシヌクレオチドの欠失および／または置換および／または付加があっても、その機能が失われないことは当業者にとって周知である。よって、配列番号１、２、３のＤＮＡ配列から少なくとも１つのデオキシヌクレオチドの欠失および／または置換および／または挿入によって誘導された誘導体（または変異体）であって、配列番号１、２、３のＤＮＡ配列と同様な機能を有するＤＮＡ配列は、本発明で用いる「それら等価物」に含まれる。

また、上記の配列番号１、２、３のＤＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列における同様な誘導体（または変異体）も本発明で用いる「それら等価物」に含まれる。

本発明に用いる「遺伝子構築物」とは、特定の意味を有する遺伝子の２つ以上を人為的に連結することにより構築した遺伝子産物を意味する。ここで、特定の意味を有する遺伝子とは、例えば、特定のアミノ酸配列をコードしている遺伝子、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、複製起点、Ｔ−ＤＮＡなどを意味する。なお、これら特定の意味を有する遺伝子は、それらの５’末端の上流と３’末端の下流に、遺伝子構築物を構築するための、制限酵素部位を含む３’および５’フランキング領域を有していてもよい。

本発明に用いる「遺伝子構築物」は、植物用の強力プロモーターのほかに、転写終結のための植物用のターミネーターを含む。さらにアグロバクテリウム法による植物の染色体への組み込みを希望する場合には、Ｔ−ＤＮＡを含む。また、さらに大腸菌とアグロバクテリウムにおけるＤＮＡ組換え操作のため、大腸菌とアグロバクテリウム用複製起点、プロモーター、リボソーム結合部位、抗生物質耐性遺伝子、ターミネータ−を有してもよい。また、形質転換カルス細胞の選別を容易にするために植物用抗生物質耐性遺伝子やそのための植物用の強力プロモーター、植物用のターミネーター、さらに、転写活性の測定を容易にするレポーター遺伝子や転写活性を増強させるエンハンサー（例えば、CaMV35Sプロモーターのエンハンサー）などを有していても良い。

本発明に用いる「遺伝子構築物」の好ましい形態は、配列番号１のＤＮＡ配列、配列番号２のＤＮＡ配列、配列番号３のＤＮＡ配列またはそれら等価物を除く先に記載の構築物成分をあらかじめ適切な配置で保有しているベクター（すなわち、ＤＮＡ組換え技術に用いる遺伝子を運ぶための遺伝子）である。ベクターには、プラスミド、プラスミド由来のベクター（例えば、ファージミドやコスミド）、またはウイルスもしくはファージ由来のベクターなどがある。より好ましくは、プラスミドまたはプラスミド由来のベクター、さらに好ましいのは、アグロバクテリウム用バイナリープラスミドである。

ここで、プラスミドとは、ＤＮＡ組換え技術における、ベクターのうち環状ＤＮＡであって、宿主の細胞内において自己増幅できるものを意味する。よって、本発明に用いるプラスミドは、宿主の細胞内における自己増幅機能を備えたものを意味する。ここで、宿主とは、好ましくは大腸菌（Escherichia coli）を意味する。プラスミドまたプラスミド由来のベクターは、種々のプラスミドを市場より入手可能である。例えば、pBR322, pUC18, pBS, pGEMなどが挙げられる。好ましいのはpUC18, pBSである。また、プラスミド由来のベクターには、pTH2, P1, BACなどが挙げられる。好ましいのはpTH2である。さらに、市場より入手可能なプラスミドまたはプラスミド由来のベクターを、本発明に適したプラスミドまたはプラスミド由来のベクターに自分で改良してもよい。

アグロバクテリウム用バイナリープラスミドとは、大腸菌（Escherichia coli)とアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）の両方を宿主とし、それら両細胞において自己増幅が可能であり、さらにアグロバクテリウムを介する植物の形質転換法に用いられるプラスミドを意味する。

ここで、アグロバクテリウムを介する植物の形質転換法とは、アグロバクテリウムを植物に感染させた時、アグロバクテリウムが自己の遺伝子の一部（Ｔ−ＤＮＡと呼ばれるＤＮＡ配列）を切り離し、Ｔ−ＤＮＡ内、すなわちＴ−ＤＮＡのライトボーダーとレフトボーダーの間に存在する遺伝子をＴ−ＤＮＡとともに植物の染色体中に組み込み、組み込んだ当該遺伝子を染色体から転写および翻訳させることで植物の形質を変化させる方法を意味する。

よって、本発明に用いるアグロバクテリウム用バイナリープラスミドとは、大腸菌（Escherichia coli)とアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）における自己増幅機能と、Ｔ−ＤＮＡを有し植物の形質を変化させる機能を備えたプラスミドを意味する。

アグロバクテリウム用バイナリープラスミドは、種々のアグロバクテリウム用バイナリープラスミドを市場より入手可能である。また、当業者から入手することもできる。例えば、pBI101, pBI121, pBCH1などが挙げられる。また、市場より入手可能なアグロバクテリウム用バイナリープラスミドを、本発明に適したアグロバクテリウム用バイナリープラスミドに自分で改良してもよい。好ましいアグロバクテリウム用バイナリープラスミドは、pBCH1である。

本発明で用いる、配列番号１、２、３のＤＮＡ配列は、シロイヌナズナの染色体にもともと存在する遺伝子であるが、CaMV35Sプロモーターのエンハンサーによるアクティベーションタギング法により緑色化したカルス細胞の原因遺伝子として見出された。このことから、配列番号１、２、３のＤＮＡ配列は、脱分化した状態にあるカルス細胞では、カルス細胞を緑色化できるほど通常転写されていない遺伝子である。よって、本発明で用いる、「植物用の強力プロモーター」とは、配列番号１のＤＮＡ配列、配列番号２のＤＮＡ配列、配列番号３のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つを含む遺伝子を、カルス細胞中で転写させることにより、そのカルス細胞を緑色化、すなわち本発明のクロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞へと形質転換させるのに十分な転写活性を有する植物用のプロモーターを意味する。

ここで、「転写」とは、ＤＮＡ鎖がその配列に相補的なＲＮＡ鎖に合成されることを意味する。そして、「プロモーター」とは、特定のアミノ酸配列をコードしている遺伝子の転写開始位置の上流に位置し、その遺伝子の転写を制御する特定のＤＮＡ配列を意味する。なお、ここで、上流または下流とは、遺伝子またはＤＮＡ配列における５’→３’方向において、５’側を上流、３’側を下流と呼ぶ。

したがって、本発明で用いる、「植物用の強力プロモーターに、配列番号１のＤＮＡ配列、配列番号２のＤＮＡ配列、配列番号３のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つを含む遺伝子を作動的に連結する」とは、配列番号１のＤＮＡ配列、配列番号２のＤＮＡ配列、配列番号３のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つを含む遺伝子が、植物用の強力プロモーターによって転写され、そして翻訳されるように、植物用の強力プロモーターおよび植物用のターミネ−ターと隣接して結合することを意味する。

本発明でも用いる「植物用の強力プロモーター」は、カルス細胞を本発明のクロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞へと形質転換させるのに十分な転写活性を有する植物用のプロモーターであれば限定されないが、例えば、カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーター、またはノパリン合成酵素遺伝子プロモーターが挙げられる。よって、本発明でも用いる「植物用の強力プロモーター」には、カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーターまたはノパリン合成酵素遺伝子プロモーターの転写活性と同等以上の転写活性を有する植物用プロモーターも含まれる。

さらに、通常においては転写活性の弱いプロモーター（例えば、本発明の配列番号１、２、３の遺伝子、またはそれら等価物を本来制御しているプロモーター）が、エンハンサーと組み合わさることによって、カルス細胞を本発明のクロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞へと形質転換するのに十分な転写活性、または、カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーターもしくはノパリン合成酵素遺伝子プロモーターと同等以上の転写活性を有するようになった場合、その転写活性の弱いプロモーターとエンハンサーの組合せは、本発明でも用いる「植物用の強力プロモーター」に含まれる。

本発明の好ましい植物用の強力プロモーターは、カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーターである。これらのプロモーターは、プラスミドなどに含有される形で市場より入手しても、公知の配列に基づいて自分でＰＣＲ等を用いて入手してもよい。

本発明でも用いる「ターミネーター」とは、転写される遺伝子の下流に位置し、その遺伝子の転写を終結させる特定のＤＮＡ配列を意味する。

本発明に用いる「植物用のターミネーター」は、植物において遺伝子の転写を終結させる働きをする植物用のターミネーターであれば限定されないが、好ましくは、植物、植物ウイルス、またはアグロバクテリウムのＴｉプラスミドやＲｉプラスミドにコードされている遺伝子に由来するターミネーターである。ここで、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミドとは、アグロバクテリウムがもともと保有している巨大なプラスミド（２０万塩基対前後）で、このなかにはＴ−ＤＮＡ配列が含まれており、ノパリン合成酵素遺伝子などの遺伝子もコードされている。植物用のターミネーターには、例えば、市場より入手可能なノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター、カリフラワーモザイクウィルスの遺伝子に由来するターミネーターなどが挙げられるが、これらには限定されない。好ましいものは、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターである。これらの植物用のターミネーターは、プラスミドなどに含有される形で市場より入手しても、公知の配列に基づいて自分でＰＣＲを用いて入手してもよい。

本発明に用いる「Ｔ−ＤＮＡ」とは、アグロバクテリウムが遺伝子を植物の染色体中に組み込む時に使用する特定のＤＮＡ配列を意味する。このＴ−ＤＮＡを利用すると、植物の染色体中への遺伝子の組み込み効率がよくなる。このＴ−ＤＮＡを利用して、遺伝子を植物の染色体中に組み込ませるためには、その遺伝子が、Ｔ−ＤＮＡ内、すなわちＴ−ＤＮＡのライトボーダーとレフトボーダーの間に存在する必要がある。

したがって、Ｔ−ＤＮＡを利用して、植物の染色体中に植物用の強力プロモーター、配列番号１、２、３のＤＮＡ配列またはその等価物の１つを含む遺伝子、植物用のターミネーターなどを組み込む時には、これら遺伝子が、Ｔ−ＤＮＡのライトボーダーとレフトボーダーの間に存在する必要がある。なお、Ｔ−ＤＮＡは、プラスミドなどに含有される形で市場より入手しても、公知の配列に基づいて自分でＰＣＲを用いて入手してもよい。

また、形質転換カルス細胞を、選別しやすくするために、植物用抗生物質耐性遺伝子を遺伝子構築物に含んでもよい。この場合、植物用抗生物質耐性遺伝子を機能させるために、植物用の強力プロモーターや植物用のターミネーターを有する必要がある。植物用抗生物質耐性遺伝子は、カルス細胞に抗生物質耐性を付与できるものであれば限定されない。また、植物用抗生物質耐性遺伝子のための植物用の強力プロモーターや植物用のターミネーターは、配列番号１、２、３のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つの転写とその終結のために用いられるものと同じであっても異なっていても良い。

本発明でも用いる「植物用抗生物質耐性遺伝子」には、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子が挙げられるが、好ましくは、ハイグロマイシン耐性遺伝子である。これらの植物用抗生物質耐性遺伝子は、プラスミドなどに含有される形で市場より入手できる。

本発明に用いる「遺伝子構築物中の植物用の強力プロモーターに、配列番号１のＤＮＡ配列、配列番号２のＤＮＡ配列、配列番号３のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つを含む遺伝子を作動的に連結すること」は、次のように実施することが出来る。

なお、先に記載したように、ＤＮＡ組換え操作を行なうには、制限酵素部位が必要であるので、配列番号１、２、３のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つを含む遺伝子、植物用の強力プロモーター、植物用のターミネーターや植物用抗生物質耐性遺伝子などの本発明の遺伝子構築物の構築に用いられる遺伝子は、ＤＮＡ組換え操作が実施可能なようにそれらの５’フランキング領域および３’フランキング領域に制限酵素部位を有していてもよい。

例えば、遺伝子構築物中の植物用の強力プロモーターの下流と配列番号１、２、３のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つを含む遺伝子の上流とを、そして遺伝子構築物中の植物用のターミネーターの上流と配列番号１、２、３のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つを含む遺伝子の下流とをそれぞれの制限酵素部位において連結することにより、遺伝子構築物中の植物用の強力プロモーターに、配列番号１、２、３のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つを含む遺伝子を作動的に連結することができる。

かかる連結操作後の、[（植物用の強力プロモーター）３’−５’（配列番号１、２、３のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つを含む遺伝子）３’−５’（植物用のターミネーター）]を含む遺伝子構築物を、本発明の植物細胞の形質転換に用いてもよいが、該遺伝子構築物が、プラスミドまたはアグロバクテリウム用バイナリープラスミドである場合には、かかる連結操作後に、大腸菌に形質転換を行い、形質転換された大腸菌から得られる組換えプラスミドまたはアグロバクテリウム用バイナリープラスミドを、本発明の植物細胞の形質転換に用いることが好ましい。

また、かかる大腸菌の形質転換体より得られた組換えプラスミドから、[（植物用の強力プロモーター）３’−５’（配列番号１、２、３のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つを含む遺伝子）３’−５’（植物用のターミネーター）]を含む部分（または断片）を制限酵素やＰＣＲを用いて取り出して、本発明の植物細胞の形質転換に用いてもよい。

同様に、かかる大腸菌の形質転換体により得られた組換えアグロバクテリウム用バイナリープラスミドから、[（Ｔ−ＤＮＡのライトボーダーまたはレフトボーダー）３’−５’（場合により、存在する抗生物質耐性遺伝子などの他の遺伝子）３’−５’（植物用の強力プロモーター）３’−５’（配列番号１、２、３のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つを含む遺伝子）３’−５’（植物用のターミネーター）３’−５’（場合により、存在する抗生物質耐性遺伝子など他の遺伝子）３’−５’（Ｔ−ＤＮＡのライトボーダーまたはレフトボーダー）]を含む部分（または断片）を制限酵素やＰＣＲを用いて取り出して、本発明の植物細胞の形質転換に用いてもよい。

さらに、かかる大腸菌の形質転換体より得られた組換えアグロバクテリウム用バイナリープラスミドをアグロバクテリウムに導入し、アグロバクテリウム用バイナリープラスミドを有するようになったアグロバクテリウムの形質転換体を用いて、本発明の植物細胞を形質転換してもよい。

したがって、本発明に用いる、「（１）で得られた遺伝子構築物を用いて」には、
（ｉ）上記のような連結操作により得られた、[（植物用の強力プロモーター）３’−５’（配列番号１、２、３のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つを含む遺伝子）３’−５’（植物用のターミネーター）]を含む遺伝子構築物、
（ii）遺伝子構築物が、プラスミドまたはアグロバクテリウム用バイナリープラスミドである場合には、さらに上記の遺伝子構築物を大腸菌に形質転換してその形質転換体より得られた組換えプラスミドまたはアグロバクテリウム用バイナリープラスミド、あるいは、
（iii）上記の形質転換体より得られた、組換えプラスミドから取り出された、[（植物用の強力プロモーター）３’−５’（配列番号１、２、３のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つを含む遺伝子）３’−５’（植物用のターミネーター）]を含む部分（または断片）、または、組換えアグロバクテリウム用バイナリープラスミドから取り出された、[（Ｔ−ＤＮＡのライトボーダーまたはレフトボーダー）３’−５’（場合により、存在する抗生物質耐性遺伝子など他の遺伝子）３’−５’（植物用の強力プロモーター）３’−５’（配列番号１、２、３のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つを含む遺伝子）３’−５’（植物用のターミネーター）３’−５’（場合により、存在する抗生物質耐性遺伝子など他の遺伝子）３’−５’（Ｔ−ＤＮＡのライトボーダーまたはレフトボーダー）]を含む部分（または断片）を用いることだけでなく、さらに
（iv）上記のようにして得られた組換えアグロバクテリウム用バイナリープラスミドにより形質転換されて、組換えアグロバクテリウム用バイナリープラスミドを有するようになったアグロバクテリウムの形質転換体を用いること
も含まれる。

本発明の植物細胞の形質転換に用いるのに好ましい「（１）で得られた遺伝子構築物」は、上記（ii）の組換えプラスミドまたは組換えアグロバクテリウム用バイナリープラスミド、または上記（iv）の組換えアグロバクテリウム用バイナリープラスミドを有するアグロバクテリウムの形質転換体である。さらに好ましいのは、上記（iv）のアグロバクテリウムの形質転換体である。

本発明で用いる、「植物細胞を形質転換する」とは、外部からＤＮＡを植物細胞の染色体に組込み、植物細胞の形質を変換することを意味する。植物細胞を形質転換する方法には、アグロバクテリウムを介するアグロバクテリウム法、または、金やタングステン粒子にコーティングしたＤＮＡをヘリウムガス圧で植物細胞に打ちこむパーティクルガン法などがあるが、植物細胞を形質転換する方法であればこれらに限定されない。

本発明に用いる「（１）で得られた遺伝子構築物」が、上記（ｉ）〜（iii）のいずれかである場合には、パーティクルガン法により、植物細胞を形質転換することが好ましい。

一方、本発明に用いる「（１）で得られた遺伝子構築物」が、上記の（iv）の組換えアグロバクテリウム用バイナリープラスミドを有するアグロバクテリウムの形質転換体である場合には、アグロバクテリウム法により、植物細胞を形質転換することが好ましい。アグロバクテリウムは、市場から入手することができるし、当業者から入手することもできる。

本発明の「植物細胞を形質転換すること」で用いられる好ましい形質転換方法は、形質転換効率がより高いので、上記の（iv）の組換えアグロバクテリウム用バイナリープラスミドを有するアグロバクテリウムの形質転換体を用いるアグロバクテリウム法である。

本発明で用いる「クロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞」は、形質転換後の植物細胞をカルス細胞誘導培地で培養することにより、緑色を呈してきたカルス細胞を選別することで得ることが出来る。

植物細胞の形質転換の際、植物用抗生物質耐性遺伝子が、植物細胞の染色体に組み入れられている場合には、形質転換処理した植物細胞のカルス細胞誘導培地における培養において、その植物用抗生物質耐性遺伝子を形質転換カルス細胞の選別のために利用することができる。

なお、上記した本発明で用いるＤＮＡ組換え技術や培養技術等は、すべて当業者には周知であり、標準的な試薬、器具、条件および方法を用いることで実施できる（ＤＮＡ組換え技術および培養技術の教科書、例えば、Sambrook, J., et al.（1989）Molecular Cloning 2nd Edition.やAusubel, F. M., et al.（1987）Current Protocol In Molecular Biology., J. Wiley and Sons, New Yorkを参照）。また、本発明において用いるＤＮＡ組換え技術や培養技術に必要な試薬、細菌、細胞、器具、場合により、遺伝子も市場より入手できる。

本発明で用いる「クロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞」とは、先に記載したように、植物用の強力プロモーターに作動的に連結した配列番号１、２、３のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つを含む遺伝子構築物により、形質転換されることで、クロロフィルａおよび／またはｂを含有するようになった形質転換カルス細胞、または、該遺伝子構築物で形質転換される前と比較し、クロロフィルａおよび／またはｂの含有量が３倍、好ましくは５倍、更に好ましくは１０倍増加した形質転換カルス細胞を意味する。したがって、クロロフィルａおよび／またはｂが残存しているカルス細胞とは、形質転換によりクロロフィルａおよび／またはｂの含有量が上記のような増加を示す前の形質転換前のカルス細胞を意味する。

本発明で用いる「クロロフィルａ」および「クロロフィルｂ」とは、植物の光合成の明反応において光エネルギーを吸収するために利用される化合物で、次式で表される化合物を意味する。

本発明で用いる、カルス細胞中のクロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂの含有量は、新鮮なカルス細胞をホモジネート後、アセトン、好ましくは８０％アセトンで、カルス細胞ホモジネートの緑色が消失するまで抽出し、そのアセトン抽出液の７１０、６６３、および６４５nmにおける吸光度を測定し、次式に当てはめることで定量できる。

クロロフィルａ（μg/ml）= 12.7（A 663 - A 710）- 2.59（A 645 - A 710）
クロロフィルｂ（μg/ml）= 22.9（A 645 - A 710）- 4.67（A 663 - A 710）
総クロロフィル（μg/ml）= 8.05（A 663 - A 710）+ 20.29（A 645 - A 710）
なお、計算式中のA 710、A 663、A 645は、７１０、６６３、６４５nmの吸光度を意味する。

そして、本発明で用いる「クロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞」とは、３０日間、好ましくは４５日間、より好ましくは６０日間培養した形質転換カルス細胞を、上記の測定方法によって測定した場合に、クロロフィルａ量、クロロフィルｂ量、またはクロロフィルａとｂの合計量（総クロロフィル）が、新鮮形質転換カルス細胞１ｇ重量あたり、１μg以上、好ましくは３μg以上、より好ましくは１０μg以上含有するものを意味する。

以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。また、下記の実施例で、特に実施条件等を記載していないＤＮＡ組換え技術や培養技術等は、当業者に周知の、標準的な試薬、器具、条件を用いることで実施できる（ＤＮＡ組換え技術および培養技術の教科書、例えば、Sambrook, J., et al.（1989）Molecular Cloning 2nd Edition.やAusubel, F. M., et al.（1987）Current Protocol In Molecular Biology., J. Wiley and Sons, New Yorkを参照）。

配列番号１の遺伝子（At3g05490）を用いたクロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞の製造
材料および方法
１．植物およびアグロバクテリウムと培地組成
ａ．植物
シロイヌナズナは、The Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC)より入手したArabidopsis Columbiaの種子を使用した。
種子を次亜塩素酸ナトリウムにより滅菌後、ＭＳ固形培地に播き、４℃で低温処理をして発芽時期を揃えた。２２℃の連続光下で１週間生育させた植物体１５〜２０個体をＭＳ液体培地２００mlに移した。ロータリー式震盪培養機を用いて２２℃の連続光下、１００回転／分の回転速度で２週間震盪培養を行った。

震盪培養後のシロイヌナズナ植物体から、メスを用いて根を切り取り、ピンセットで緑色組織をできるだけ取り除いた。さらに、メスで根を約３mmの長さに細かく切り刻んだ後、ＣＩＭプレート上で２０℃、弱光下（約１００ルクス）で３日間培養を行い、形質転換に用いる根の細断片を得た。

ｂ．培地
ＭＳ液体培地
１Lあたり、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地用混合塩類（SIGMA）４．６ｇ、ショ糖（和光）２０ｇ、１０００×ビタミンストック（チアミン塩酸塩（和光）３００mg、ニコチン酸（和光）５００mg、ピリドキシン酸（和光）５００mgに滅菌水を加え１００mlに調製したもの）１mlに、滅菌水を加えメスアップし、２Ｎ ＫＯＨでｐＨを５．８に調製後、１２１℃で、２０分間オートクレーブした。

ＭＳ固形培地
液体培地と同じ組成に、１Lあたりジェライト（三栄原エフ・エフ・アイ）３ｇを加え１２１℃で、２０分間オートクレーブ後、シャーレ一枚あたり約５０mlずつ分注した。

ＣＩＭ（カルス細胞誘導培地）
ＭＳ固形培地に2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D)（最終濃度５００ng/ml、和光）、カイネチン（最終濃度５０ng/ml、和光）を加え１２１℃で、２０分間オートクレーブ後シャーレに分注した。

アグロバクテリウム用培地
１Lあたり、Yeast Extract（オリエンタル酵母工業）５ｇ、ポリペプトン（和光）１０ｇ、塩化ナトリウム（和光）１０ｇを加え滅菌水でメスアップし、５Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７．５に調節後、１２１℃で、２０分間オートクレーブを行った。その後５０℃に冷やし、リファンピシリン（最終濃度５０μg／ml、第一製薬）を加えた。

２．緑色カルス作製用ベクターの構築
ａ．バイナリープラスミドpBCH1への遺伝子のクローニング
鋳型として用いたシロイヌナズナＤＮＡは、ISOPLANT（日本ジーン）を用いて調製した。配列番号１の遺伝子（At3g05490）とコントロールとして用いる配列番号４の遺伝子（At3g28730）をKOD-plus（東洋紡）によりＰＣＲで増幅した。増幅には、滅菌水３０．５μl、１０×ｂｕｆｆｅｒ ５μl、２５ｍＭ ＭｇＳＯ_４２μl、遺伝子特異的プライマー４μl（最終濃度２０pmol）、シロイヌナズナＤＮＡ（１ｎｇ）、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ １μlを用いた。ＰＣＲ反応は９４℃で２分間処理の後、９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃２４秒の３ステップを３５サイクル、続けて６８℃５分で行った。

コントロールとして用いた配列番号４の遺伝子（TAIRにAt3g28730として登録されている遺伝子、 http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?name=AT3G28730&type=locus）：
atggcggacg gccactcctt caataatatc tctctcagcg gtcgcggtgg aaaggtacca 60
tcttctctct ctgtctcctt ctatctctca agatctttca attccttcaa agttttcacc 120
ttttcctctt ccttcgaaaa ccctaatctc ctttctctgt atcccctttt gcttccgccg 180
ctcgattctt aaagaactca atgagtcaaa tttagggtta aaaaaaagat tgtcgctttc 240
atttttcagt tgtgttgttt tcttgtttac aattgttaaa gctgcggtag tttttagggt 300
tttcttaagg ctaattaggg tttcaatttt ggttttttag aacccgggtt tacttaaaat 360
caattctgga ggaattcaat ggaagaaaca aggtggtgga aaagctgtgg aagttgatag 420
atctgatatt gtaagtgtta gttggacgaa agtgacaaag agtaatcaat tgggagtcaa 480
aaccaaagat ggattgtact acaagttcgt tggatttcga gatcaggttt gtgtgtgtat 540
atctttttta tttgatttga tattgtaatg tttgtgcttg ttctgattcc tttgttttgt 600
aggatgttcc aagtctgtct agctttttcc aaagttctta tggaaaaaca ccggatgaga 660
agcaattatc agttagtggt cgtaattggg gagaggtgga tttacacggt gagagttctt 720
atagctttta ggctttactt gtggttgtct agtttcattt gtggatctaa agggagaatt 780
ttttgtttct ttgtgtaggg aatacactaa cctttttggt tggatcaaaa caagcttttg 840
aagtatcttt agctgatgtt tcacagactc agcttcaagg gaaaaatgat gttactttgg 900
agtttcatgt tgatgatact gctggtgcta atgaggtact ggtttctttt gatatgtaat 960
ctctaggctg ttatgtatgt acatttactg atttatattc tacgtgttta cagaaagact 1020
cgctgatgga gattagtttt catattccta attccaacac tcagtttgtt ggtgatgaaa 1080
accgtccacc ttctcaagtg agttcccaaa ctattttcat tatatgtatg tgcctcaagt 1140
atatattttt ttctgttgat gctaaaagaa tgtctcaggt tttcaatgac acaatcgttg 1200
caatggctga tgttagtcct ggagttgagg atgcggtcgt cacatttgag agtattgcaa 1260
tcctcacacc caggtaaaga gttgattact taaacatttg ttgcactatt gtatggcttc 1320
atcttgtcat gactaaatga tttggttgtt tctatcacag gggtcggtac aatgtggaac 1380
ttcacctttc tttcttacga ttgcaaggac aagctaatga ctttaaaatc cagtacagta 1440
gcgttgtccg tttgttcttg cttccaaagg taattctttt ttaagcatat ctcagggcag 1500
ttacctatgt tagcagtcat cagattaaag ggattatcgt attatgatca ctgaatcgtg 1560
ttcacattaa ttgagttcgt attttttttt atatgcctga gcagtcaaac caaccacaca 1620
cgtttgttgt tatctctcta gacccaccaa tccggaaagg tcagacaatg tacccccaca 1680
ttgttatgca ggtaaacatt acttacattt ttccttccat ttcaattttc tatgtataat 1740
tttcgttttt ttactctgat ttacataact gtttttgcat cttctccagt ttgaaacaga 1800
caccgttgtc gaaagtgaac tgtcaattag tgatgaactt atgaatacaa agttcaagga 1860
caagctggag cgatcatata aggtttctgt ctggtctgca cttacattat tgttcctgaa 1920
taaaaaaatt tatacatacg ctgaattgta tgaattttca gggtctcatt catgaagtat 1980
tcaccaccgt gttgcgttgg ctgtctggtg caaagatcac taaacctggg aagttccgca 2040
gttcccaaga tgggtttgca gtgaaatcgt ctctcaaggc agaagatggg gttctttatc 2100
cactcgagaa gggatttttc ttcttaccta aacctccaac gcttatactt cacgatgagg 2160
taaattatgg ttattaagga ttggagattt tttataggct ttgagataga gttgggtttt 2220
ctaacctgtt tttttttcgt ttttagattg actatgtcga gtttgaaagg catgctgctg 2280
gtggtgctaa catgcattac tttgatcttc tcataagact gaaaactgac catgaacatc 2340
tgttccgtaa cattcaaaga aatgagtatc acaatctcta taccttcata aggttagcgc 2400
ggattatttc attgtctccg tctatattta ctgagtgcat ttaagatttg tggtgaatat 2460
tccttatgtt ttcttgctgc agctctaagg gtttgaagat tatgaacctt ggaggtgcgg 2520
gtaccgcaga cggtgttgct gctgttcttg gggataatga tgatgatgat gctgttgacc 2580
ctcatcttac gcgtatcaga aaccaagctg ctgatgagag tgatgaggag gcaagtactt 2640
tatgtctgac cgaattactt catattctaa tgatcatgtg tttgataatc gagactttta 2700
atttatgaag gacgaagact ttgttatggg tgaggatgat gatggtggtt caccaactga 2760
tgattctggc ggggacgact ctgatgctag tgaaggcggt gtaggagaga taaaagaggt 2820
aaacttttgt cgcattcatt cgaactcttt cagcagcagt atttgtttct catatcttcc 2880
tgtcattgac ttgttataga aatctatcaa gaaggaacct aagaaagagg cttcgtcatc 2940
gaaaggattg cctcctaaga ggaaaactgt agccgcagac gaaggcagta gtaagaggaa 3000
gaagccgaag aagaagaagg atcccaacgc accaaaaaga gcaatgtctg gtttcatgtt 3060
cttttcccaa atggaaagag atgtgagttc ttctctcctt tcttttactt ttacctctat 3120
gatgtaggct aagttgcgaa atggagtatc ctcggtctat tacatacatg agagcaaaca 3180
attaacagac aaacttagca cattcctgat tatgtcattt tccatttgtg aactgaacag 3240
aacataaaga aggaacaccc aggaatagca tttggagagg tgggaaaggt gcttggagat 3300
aagtggcgtc aaatgtctgg taaaaaattt gaagatcctt ttcaaaagta aatacattac 3360
ttggttttac tttatcatgt gaatgtgttt taattcccca accgtgtgta tgtatagctg 3420
atgataaaga gccatatgaa gccaaggctc aagtcgacaa gcagcgatac aaggatgaga 3480
tcagtgatta caagaaccct cagccgatga atgtggactc aggaaacgat tccgatagta 3540
actaa

プライマーは、配列番号１の遺伝子（At3g05490）の増幅のためには、
F22F7.6Fw 32bp：5'-TTTCCATGGACCATGACGAACACTCGCGCGAT-3'（配列番号５）とF22F7.6Rv 34bp：5'-ACTGCGGCCGCTCAACGCCTGCACCTAGTGATGG-3'（配列番号６）
を使用し、
配列番号４の遺伝子（At3g28730）の増幅のためには、
T19N8.2Fd 31bp：5'-CTCAAGAGCTCACCATGGCGGACGGCCACTC-3（配列番号１１）と
T19N8.2Rv 31bp：5'-AGAATTGATCATTAGTTACTATCGGAATCGT-3'（配列番号１２）
を使用した。いずれのプライマーも（株）インビトロジェンに合成を依頼し入手した。なお、上記プライマーの下線部分は、クローニング用に人工的に付加した制限酵素部位を含むリンカー配列の部分を示す。

増幅したＰＣＲ産物を、３％アガロースゲル電気泳動にて分離し、配列番号１と配列番号４の遺伝子を回収した。回収した配列番号１と配列番号４の遺伝子は、あらかじめEcoRＶ（日本ジーン）で消化したＰＣＲ産物サブクローニング用プラスミドpGEM5-5Zf(+)（プロメガ）とライゲーション後、大腸菌DH5α（東洋紡）に形質転換した。形質転換体を培養し、そこからプラスミドを精製し、配列番号１または配列番号４の遺伝子が導入された組換えプラスミドpGEM5-5Zf(+)を得た。

次いで、pGEM-5Zf(+)へサブクローニングされた配列番号１または配列番号４の遺伝子は、そこから目的遺伝子のみが切り出され、アグロバクテリウム用バイナリープラスミドpBCH1（pBCH1は、遺伝学研究所の伊藤幸博博士より分与された。Ito et al., KNOX homeobox genes are sufficient in maintaining cultured cells in an undifferentiated state in rice. Genesis 30, 231-238, 2001、図１）にクローニングされた。

pGEM-5Zf(+)へサブクローニングされた配列番号１または配列番号４の遺伝子をアグロバクテリウム用バイナリープラスミドpBCH1にクローニングするために、配列番号１の遺伝子については、配列番号１の遺伝子を有する組換えpGEM5-5Zf(+)をSacII（日本ジーン）で消化後、T4 DNA polymerase（日本ジーン）で平滑末端にし、さらにSpeＩ（日本ジーン）で消化することで、組換えpGEM5-5Zf(+)から切り出し、pBCH1バイナリープラスミドについては、SacＩで消化後、T4 DNA polymeraseで平滑末端にし、SpeＩで消化した。
配列番号４の遺伝子については、配列番号４の遺伝子を有する組換えpGEM5-5Zf(+)を同様にSacIIで消化後、T4 DNA polymeraseで平滑末端化し、さらにSacＩで消化することで、組換えpGEM5-5Zf(+)から切りだし、pBCH1バイナリープラスミドについては、SpeＩで消化後、T4 DNA polymeraseで平滑末端にし、SacＩで消化した。

この消化された各々のpBCH1バイナリープラスミドと切り出された配列番号１の遺伝子また配列番号４の遺伝子をSpeＩとSacＩの位置において、2×Ligation Mix（日本ジーン）を用いてライゲーションを行い、大腸菌DH5αに形質転換した。形質転換体を培養し、精製することで、配列番号１の遺伝子または配列番号４の遺伝子（コントロール用の遺伝子）を有するアグロバクテリウム用組換えバイナリープラスミドpBCH1を得た。

ｂ．アグロバクテリウムへの形質転換
エレクトロポレーションに用いるアグロバクテリウム(Koncz博士より分与されたAgrobacterium tumefaciens GV3101株、Koncz C, Schell J (1986) The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue specific expression of chimeric genes by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet 204:383-396)の調製は、アグロバクテリウム用培地５００mlを用い、３０℃でＯＤ_６００が０．６〜０．９に達するまで培養後、５分間氷上で静置し、次いで４℃、６０００rpm、５分間の遠心後、沈殿を滅菌水４００mlに懸濁し、この懸濁液を１０％グリセリンに置換するために、さらに３回の遠心と沈殿の懸濁を繰り返し、最後に１mlの１０％グリセリンに懸濁することで行なった。

配列番号１の遺伝子または配列番号４の遺伝子を有する組換えバイナリープラスミドpBCH1による、調製したアグロバクテリウムの形質転換をエレクトロポレーションを用いて行なった。エレクトロポレーションは、アグロバクテリウム (GV3101株) の懸濁液４０μlと、配列番号１の遺伝子または配列番号４の遺伝子を有するバイナリープラスミドpBCH1（０．５μg/μl）を滅菌水で100倍希釈したもの１μlとをエレクトロポレーション用キュベット（バイオラッド）に移し、ジーンパルサー（バイオラッド）を用い、１．８ｋＶ、２５μＦ、２００Ωの導入条件にて行った。導入後、キュベット内の菌液をＬＢ液体培地１mlに移し、３０℃、２０分間、約１５０rpmで培養を行った。培養後、ハイグロマイシン５０μg／ml（和光）、リファンピシリン５０μg／ml（シグマ）、ゲンタマイシン２５μg／ml（シェリング・プラウ）を含むＬＢ固形培地に播種し、２８℃二晩培養し、目的のアグロバクテリウムの形質転換体を得た。

c. 形質転換されたアグロバクテリウムの根の細断片への感染
アグロバクテリウム培養培地１０mlに２ｂで得られたアグロバクテリウムの形質転換体を植菌し、１晩培養（ＯＤ_６００ ０．１５〜０．２）後、３０００rpmで１５分遠心後ＣＩＭ液体培地（ショ糖無添加）２０mlに再懸濁した。１ａにおいて培養した根の細断片を、懸濁したアグロバクテリウムの形質転換体に１分間浸すことにより感染を行った。アグロバクテリウムを感染させた根の細断片は滅菌した紙タオルでよく水分を除いた後、ＣＩＭプレートに置き４８時間共存培養を行った。

ｄ．根の細断片の洗浄
48時間共存培養を行った根の細断片をクラフォラン（セフォタキシム）（最終濃度１００μg／ml、アベンティス ファーマ株式会社）を含むＭＳ液体培地４０mlに移し、ロータリー式震盪培養機で２０℃、１８０回転／分の条件で洗浄した。１時間おきにＭＳ液体培地を交換し、計１２回洗浄を行った。

e.薬剤含有培地における根の細断片のカルス細胞への培養
洗浄後に滅菌した紙タオルを用いて余分な水分を感染後の根の細断片から除いた。続いて、感染後の根の細断片をカルス細胞化させるために、２．４−Ｄ ５００ｎｇ／ml、カイネチン５０ｎｇ／ml、バンコマイシン１００μg／ml、セフォタキシム１００μg／ml、ハイグロマイシン３０μg／mlもしくは２５μg／mlを含むＣＩＭプレートに置いて２０℃、弱光下（約１００ルクス）で培養し、緑色を呈すカルス細胞になるかどうかを判定した。

３．緑色カルス細胞中のクロロフィルａまたはｂの定量
クロロフィルａまたはｂの定量は、Lichtenthaler らの方法に基づいて実施した（Lichtenthaler, H., Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes, Methods Enzymol., 148:350-382, 1987）。
定量には、配列番号１の遺伝子で形質転換した根の細断片をカルス誘導培地で２ヶ月間培養して増殖してきた緑色を呈する形質転換カルス細胞を用いた。対照として、同様に配列番号４の遺伝子で形質転換して増殖してきた形質転換カルス細胞および形質転換していないカルス細胞を用いた。

乳鉢に約１００mgの新鮮カルス細胞を取り、８０％アセトン４００μlを加えホモジナイズし、１．５mlチューブに移した。ボルテックスで撹拌後、６，０００rpm、１０分で遠心し、アセトン抽出液を別のチューブに移した。沈殿に８０％アセトン２００μlを加え再度撹拌、遠心し、得られたアセトン抽出液を先の抽出液のチューブに加えた。沈殿から緑色が消えるまでこの８０％アセトン抽出操作を繰り返した。抽出液を８０％アセトンで１mlにメスアップし、サンプル液とした。

氷上で遮光状態にして保管し、Bio Spec-mini（島津製作所）を用いてサンプル液の７１０、６６３、６４５nmの吸光度（対照は、８０％アセトン液）を測定し、次式よってクロロフィル量を算出した。

クロロフィルａ（μg/ml）= 12.7（A 663 - A 710）- 2.59（A 645 - A 710）
クロロフィルｂ（μg/ml）= 22.9（A 645 - A 710）- 4.67（A 663 - A 710）
総クロロフィル（μg/ml）= 8.05（A 663 - A 710）+ 20.29（A 645 - A 710）
なお、計算式中のA 710、A 663、A 645は、７１０、６６３、６４５nmの吸光度における測定値を意味する。

クロロフィルａ量、またはクロロフィルｂ量、またはクロロフィルａとｂの合計量が、新鮮カルス細胞１ｇ重量あたり１０μg以上であるものを、本発明のクロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有する形質転換カルス細胞、すなわち緑色カルス細胞とした。

４．結果
配列番号１の遺伝子で形質転換した根の細断片をカルス誘導培地で培養した場合、増殖してきた形質転換カルス細胞は、２０日目ごろから緑色を呈してきた。一方、同様に配列番号４の遺伝子で形質転換し、カルス細胞誘導培地で培養して増殖してきた形質転換カルス細胞、および、形質転換せずにカルス細胞誘導培地（ただし、上記の薬剤を含まないＣＩＭ培地）で培養して増殖してきたカルス細胞は、培養期間中、緑色を呈することはなかった。

カルス細胞中のクロロフィルａまたはクロロフィルｂを測定した結果、緑色を呈した配列番号１の遺伝子で形質転換したカルス細胞では、新鮮形質転換カルス細胞１ｇ当たり、クロロフィルａが、約４３μg、そしてクロロフィルｂが約１５μg測定された。一方、形質転換していない従来のカルス細胞および配列番号４の遺伝子で形質転換した形質転換カルス細胞では、クロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂを検出しなかった。

配列番号２の遺伝子（At3g59870）を用いたクロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞の製造
実施例１と同様に配列番号２の遺伝子（At3g59870）を用いたクロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞の製造をおこなった。配列番号１の遺伝子の代わりに配列番号２の遺伝子を用いることによる違いを除いて、製造方法は、実施例１と同様である。

配列番号２の遺伝子（At3g59870）の増幅のためのプライマーは、
G16.140 Fw 34bp 5'-TACCCGCGGTCTAGAACCATGAGTTCGGCTCTAC-3'（配列番号７）とG16.140 Rv 34bp 5'-GAACCGCGGGGTACCTCAATCCAGGTAGAAGAGG-3'（配列番号８）
を使用した。なお、上記プライマーの下線部分は、実施例１と同様にクローニング用に人工的に付加した制限酵素部位を含むリンカー配列の部分を示す。

増幅した配列番号２の遺伝子（At3g59870）は、実施例１と同様にpGEM5-5Zf(+)にサブクローニングし、配列番号２の遺伝子が導入された組換えプラスミドpGEM5-5Zf(+)を得た。

配列番号２の遺伝子は、配列番号２の遺伝子を有する組換えpGEM5-5Zf(+)を、NotI（日本ジーン）で消化後、T4 DNA polymerase（日本ジーン）で平滑末端にし、さらにXbaＩ（日本ジーン）で消化することで切り出された。pBCH1バイナリープラスミドについては、SmaＩとXbaＩで消化された。

この消化されたpBCH1バイナリープラスミドと切り出された配列番号２の遺伝子をSmaＩとXbaＩの位置において、ライゲーションを行い、大腸菌DH5αに形質転換し、配列番号２を有するアグロバクテリウム用組換えバイナリープラスミドpBCH1を得た。

この配列番号２を有するアグロバクテリウム用組換えバイナリープラスミドpBCH1で形質転換したアグロバクテリウムを用い、実施例１と同様に培養した根の細断片を形質転換し、その後カルス細胞誘導培地で培養することで緑色の形質転換カルス細胞を得た。ただし、クロロフィルａまたはｂの定量は行なわなかった。

結果
実施例１の場合と同様に、配列番号２の遺伝子で形質転換された後に増殖してきた形質転換カルス細胞は、２０日目ごろから緑色を呈してきた。

配列番号３の遺伝子を用いたクロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞の製造
実施例１と同様に配列番号３の遺伝子を用いたクロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞の製造をおこなった。配列番号１の遺伝子の代わりに配列番号３の遺伝子を用いることによる違いを除いて、製造方法は、実施例１と同様である。

プライマーは、配列番号３の遺伝子（At3g59860）の増幅のためには、
G16.130 Fw 34bp 5'- ATGACTAGTCTAGACC ATGGATAATCTCGTATTT -3'（配列番号９）とG16.130 Rv 34bp 5'- TACACTAGTGGTACC CTACGTACACTCTGCCAAC -3'（配列番号１０）
を使用した。なお、上記プライマーの下線部分は、実施例１と同様にクローニング用に人工的に付加した制限酵素部位を含むリンカー配列の部分を示す。

増幅した配列番号３の遺伝子（At3g59860）は、実施例１と同様にpGEM5-5Zf(+)にサブクローニングし、配列番号３の遺伝子が導入された組換えプラスミドpGEM5-5Zf(+)を得た。

配列番号３の遺伝子は、配列番号３の遺伝子を有する組換えpGEM5-5Zf(+)を、実施例２と同様にNotI（日本ジーン）で消化後、T4 DNA polymerase（日本ジーン）で平滑末端にし、さらにXbaＩ（日本ジーン）で消化することで切り出された。pBCH1バイナリープラスミドについては、実施例２と同様にSmaＩとXbaＩで消化された。

この消化されたpBCH1バイナリープラスミドと切り出された配列番号３の遺伝子を実施例２と同様にライゲーションを行い、配列番号３を有するアグロバクテリウム用組換えバイナリープラスミドpBCH1を得た。

この配列番号３を有するアグロバクテリウム用組換えバイナリープラスミドpBCH1で形質転換したアグロバクテリウムを用い、実施例１と同様に培養した根の細断片を形質転換し、その後カルス細胞誘導培地で培養することで緑色の形質転換カルス細胞を得た。ただし、クロロフィルａまたはｂの定量は行なわなかった。

結果
実施例１の場合と同様に、配列番号３の遺伝子で形質転換された後に増殖してきた形質転換カルス細胞は、２０日目ごろから緑色を呈してきた。

本発明の形質転換カルス細胞により、従来のカルス細胞（黄白色カルス細胞）では生産できなかった有用物質の生産が可能となる。また、カルス細胞を培養して有用物質を生産する場合に、糖などを添加せずとも水と無機塩から光合成により有用物質の合成が可能となり、有用物質の生産コストの軽減を図ることができる。

アグロバクテリウム用バイナリープラスミドpBCH1と遺伝子の挿入部位を示す。pBCH1中のRBはＴ−ＤＮＡのライトボーダーを、Pnはノパリン合成酵素遺伝子プロモーターを、NPTIIはカナマイシン耐性遺伝子を、Tnはノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターを、P35Sはカリフラワーモザイクウイルス35Ｓプロモーターを、HPTはハイグロマイシン耐性遺伝子を、そして、LBはＴ−ＤＮＡのレフトボーダーを意味する。 バイナリープラスミドpBCH1中のカリフラワーモザイクウイルス35Ｓプロモーター（P35S）の下流にある制限酵素部位SacI（平滑化処理済）とノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター（Tn）の上流にある制限酵素部位SpeIまたはXbaIを利用して、配列番号１、２、３の遺伝子の上流にある制限酵素部位SacI（平滑化処理済）と下流にある制限酵素部位SpeIまたはSmaIをそれぞれ連結する。コントロール用の配列番号４の遺伝子も同じ制限酵素部位を利用してpBCH1中に連結する。 配列番号１の遺伝子により形質転換されたカルス細胞、配列番号４の遺伝子により形質転換されたカルス細胞および形質転換前のカルス細胞中のクロロフィルａとクロロフィルｂの含有量（μg／ｇ新鮮カルス細胞重量）を示す。

Claims (6)

1. （１）遺伝子構築物中の植物用の強力プロモーターに、配列番号１のＤＮＡ配列、配列番号２のＤＮＡ配列、配列番号３のＤＮＡ配列またはそれら等価物の１つを含む遺伝子を作動的に連結し、遺伝子構築物を得ること、
   （２）（１）で得られた遺伝子構築物を用いて、植物細胞を形質転換し、形質転換植物細胞を得ること、および
   （３）（２）で得られた形質転換植物細胞を培養し、形質転換カルス細胞を得ること、
   を含む、クロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞の製造方法。
2. 植物用の強力プロモーターが、カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーターまたはノパリン合成酵素遺伝子プロモーターである、請求項１に記載のクロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞の製造方法。
3. 遺伝子構築物が、アグロバクテリウム用バイナリープラスミドである、請求項１に記載のクロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞の製造方法。
4. 請求項１から３のいずれか１項に記載の製造方法によって得られたクロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂ含有形質転換カルス細胞。
5. 請求項１から３のいずれか１項に記載の（１）で得られた遺伝子構築物。
6. 請求項１から３のいずれか１項に記載の（２）で得られた形質転換植物細胞。

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