JP2007098118A

JP2007098118A - 多孔質弾性複合材料の製造方法および多孔質弾性複合材料

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Publication number: JP2007098118A
Application number: JP2006225546A
Authority: JP
Inventors: Toshiyuki Ikoma; 俊之生駒; Shunji Yunoki; 俊二柚木; Masanori Kikuchi; 正紀菊池; Shinichi Saotome; 進一早乙女; Kenichi Shinomiya; 謙一四宮; Junzo Tanaka; 順三田中
Original assignee: National Institute for Materials Science
Current assignee: National Institute for Materials Science
Priority date: 2005-09-09
Filing date: 2006-08-22
Publication date: 2007-04-19

Abstract

【課題】優れた強度や使用時の操作性、生体適合性および骨誘導性を備えているとともに、変形の抑制効果を向上させ、細胞や組織の侵入性を向上させた弾性を有する新しい多孔質弾性複合材料と、この多孔質弾性複合材料を簡単な工程で、しかも手間とコストを抑えて製造できる新しい多孔質弾性複合材料の製造方法を提供する。
【解決手段】水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維と緩衝液との混合後、凍結乾燥することを特徴とする。
【選択図】図３

Description

本願発明は、多孔質弾性複合材料の製造方法および弾性を有する多孔質弾性複合材料に関するものである。

近年、再生医療の分野では、損傷を受けた組織や器官に代わる種々の人工生体材料の研究開発が盛んに進められている。また、骨欠損部の治療においては、人工骨材や人工骨充填材等のインプラントが用いられる。このようなインプラントには生体骨に類似の機械的特性はもちろん、生体適合性や骨誘導性が求められる。この骨誘導性とは、生体適用後に徐々に吸収されて、骨再生サイクルに取り込まれ、自身の骨に置換していく性質のことをいう。

脊椎動物の骨は、リン酸カルシウムの一種である水酸アパタイトと、タンパク質であるコラーゲンとからなる複合体である。これらは、生体骨中で水酸アパタイトが、そのｃ軸方向にコラーゲン繊維に沿って配向した特有の構造を形成し、この構造が骨に特有の機械的性質を与えていることが知られている。

そこで、硬いが脆くインプラント後に崩壊をきたすという強度の問題や、使用時の操作性が悪い等の問題を有していた、既存のリン酸カルシウムを使用した多孔体人工骨に代わって、上記のような生体骨に類似の構造組成を有する、水酸アパタイトとコラーゲンからなる複合生体材料が提案されている（たとえば、特許文献１、特許文献２）。この複合生体材料は、水酸アパタイト、コラーゲンおよびアルギン酸塩を含んでおり、水酸アパタイトのｃ軸がコラーゲン繊維に沿うように配向した微細構造を有するように製造することができるとしている。このような構成を有するため、この複合生体材料は、スポンジ状の弾力性を有し、従来の強度の問題や、使用時の操作性の問題を解消することはもちろん、生体適合性および骨誘導性にも優れた複合生体材料であるとされている。
ＷＯ２００３／０３５１２８号公報特開２００３−１９０２７１号公報

しかしながら、従来の上記特許文献１および特許文献２のような複合生体材料は、部位によっては周囲組織につぶされて変形するという強度の問題が依然として解消できないでいた。また、気孔の連通性が少ないため、細胞や組織の侵入性が不十分な場合があった。さらに、このような問題を解決しようとすると、たとえば、つなぎ材としてのコラーゲンを別途添加する工程や、ゲル化剤として、たとえば水酸化ナトリウムを添加する工程、ゲル化のためのインキュベーションする工程等が必要になる等、製造工程がさらに煩雑となり、手間とコストがかかるという問題があった。

そこで、本願発明は、以上のとおりの背景から、従来の問題点を解決すべく、優れた強度や使用時の操作性、生体適合性および骨誘導性を備えているとともに、変形の抑制効果を向上させ、細胞や組織の侵入性を向上させた弾性を有する新しい多孔質弾性複合材料と、この多孔質弾性複合材料を簡単な工程で、しかも手間とコストを抑えて製造できる新しい多孔質弾性複合材料の製造方法を提供することを課題としている。

本願発明は、前記の課題を解決するものとして、第１には、水酸アパタイト／コラーゲ
ン複合繊維と緩衝液との混合後、凍結乾燥することを特徴とする。

また、本願発明は、第２には、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維と緩衝液との混合後に、さらにインキュベーションすることを特徴とする。

さらに、第３には、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維は、水酸アパタイトのc軸が
繊維軸方向に配向されているものであることを特徴とし、第４には、前記凍結乾燥における凍結温度を制御することで、多孔質弾性複合材料の気孔形状および気孔サイズを制御することを特徴とし、第５には、前記凍結乾燥後に、さらに真空熱処理することを特徴とする。

そして、第６には、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維の凝集体であって、多孔質を有することを特徴とし、第７には、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維は、水酸アパタイトのc軸が繊維軸方向に配向されているものであることを特徴とし、そして、第８には
、気孔率８０％以上であることを特徴とする。

本願第１から第５の発明によれば、優れた強度や使用時の操作性、生体適合性および骨誘導性を備えているとともに、変形の抑制効果を向上させ、細胞や組織の侵入性を向上させた多孔質弾性複合材料を、簡単な工程で、しかも手間とコストを抑えて製造できる。

第６、第７、第８の発明によれば、優れた強度や使用時の操作性、生体適合性および骨誘導性を備えているとともに、変形の抑制効果を向上させ、細胞や組織の侵入性を向上させることができる。

本願発明は、上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について詳しく説明する。

本願発明の多孔質弾性複合材料の製造方法は、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維（以下、ＨＡｐ／Ｃｏｌとすることがある）と緩衝液とを混合し、均一になるまで十分に混練し、これを任意の型に注入して、そして、凍結して固形化し、凍結乾燥する、すなわち、ＨＡｐ／Ｃｏｌの凝集体とすることを特徴としている。

なお、ＨＡｐ／Ｃｏｌの混合比率について説明すると、吸着水の重量を除いた重量比で、９０／１０〜６０／４０、特に８５／１５〜７０／３０の範囲で設定することが好ましい。この「吸着水の重量を除いた重量比」とは、大気下の熱重量測定によって、昇温速度２０℃／分において、室温（通常２５℃）〜２００℃の範囲の重量減少分を「吸着水」、２００〜６００℃の範囲の重量減少を「コラーゲン」、残り分を「水酸アパタイト」として算出することを示す。

また、本願発明は、ＨＡｐ／Ｃｏｌと緩衝液とを混合した後に、さらにインキュベーションしてコラーゲン繊維の再形成を促進させ、多孔質弾性複合材料の力学的強度や生体内安定性を高めることができる。このインキュベーションの条件としては、温度条件としては、たとえば、２３〜４２℃、好ましくは３０〜４０℃、時間条件としては、たとえば、６〜７２時間、好ましくは１２〜４８時間が採用できる。時間条件についてさらに説明すると、通常は、温度条件が高くなるほど、短い時間条件としてもよい。なお、ＨＡｐ／Ｃｏｌと緩衝液とを混合後、もしくは、インキュベーション後において、必要に応じて、上記のとおり、凍結して固形化して凍結乾燥してもよいし、あるいは、凍結までに至らない程度の温度での冷却処理（たとえば、４℃前後）を経てから、凍結して凍結乾燥してもよ
い。

このとき、ＨＡｐ／Ｃｏｌは、たとえば、水酸アパタイトのｃ軸がコラーゲン繊維軸に沿うように配向されている、生体骨に類似の微細構造を有する複合繊維体（たとえば、特開平１１−１９９２０９号公報参照）であることが望ましく、これをさらに凍結乾燥して、粉末状にしたものを使用することが、緩衝液の混合が容易となり、さらに望ましい。このような複合繊維体は、たとえば、水酸化カルシウム溶液とコラーゲンを含むリン酸塩水溶液を反応容器中に同時滴下し、生じた沈澱物を乾燥することにより得ることができる。ここで、用いられるコラーゲンは、特に限定されないが、分子量が大きいと立体障害のために複合体の強度が不十分となるため、単分子なコラーゲンを用いることが好ましい。特に、ペプシン処理したアテロコラーゲンはモノメリックであることに加え、抗原性が低いため、好ましい。

水酸アパタイトは、一般組成をCa₅(PO₄)₃OH、とする化合物であり、その反応の非化学
量論性によって、CaHPO₄、Ca₃(PO₄)₂、Ca₄O(PO₄)₂、Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂、CaP₄O₁₁、Ca(PO₃)₂、Ca₂P₂O₇、Ca(H₂PO₄)₂・H₂O等、リン酸カルシウムと称される１群の化合物を含んでいる。また、水酸アパタイトは、Ca₅(PO₄)₃OH、またはCa₁₀(PO₄)₆(OH)₂の組成式で示される化合物を基本成分とするもので、Ca成分の一部分は、Sr、Ba、MG、Fe、Al、Y、La、Na、K、H等から選ばれる１種以上で置換されてもよい。また、(PO₄)成分の一部分が、VO₄、BO₃、SO₄、CO₃、SiO₄等から選ばれる１種以上で置換されてもよいし、さらに、(OH)成分の一部分が、F、Cl、O、CO₃等から選ばれる１種以上で置換されてもよい。また、これらの各
成分の一部が欠失していてもよい。

なお、水酸アパタイトは、通常の微結晶や非晶質、結晶体の他に、同型固溶体、置換型固溶体、侵入型固溶体であってもよく、非量子論的欠陥を含むものであってもよい。

コラーゲンは、現在では２０種類程度の分子種の異なるものが、哺乳動物に限らず、魚類を含む広範な動物の生体組織中に存在することが知られている。本願発明で用いられるコラーゲンは、その出発原料とする動物の種、組織部位、年齢等は特に限定されず、任意のものを用いることができるが、一般的には、哺乳動物（たとえば、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ネズミ等）や鳥類（たとえば、ニワトリ等）の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器等から得られるコラーゲンが用いられる。また、魚類（たとえば、タラ、ヒラメ、カレイ、サケ、マス、マグロ、サバ、タイ、イワシ、サメ等）の皮、骨、軟骨、ひれ、うろこ、臓器等から得られるコラーゲン様蛋白を出発原料として用いてもよい。さらには、上記のような動物組織からの抽出ではなく、遺伝子組み替え技術によって人工的に得られたコラーゲンを用いてもよい。

本願発明で用いられるコラーゲンは特に限定されないが、Ｉ型コラーゲン、コラーゲンタンパク質のアミノ酸残基を、アセチル化、コハク化、マレイル化、フタル化、ベンゾイル化、エステル化、アミド化、グアニジノ化等といった化学修飾したものを用いてもよい。

本願発明に用いられる緩衝液は、イオン種やイオン強度を制御した溶媒であり、たとえば、イオン種が、無機イオンであるリン酸緩衝液等、あるいは、有機イオンであるトリス緩衝液や酢酸緩衝液等、各種の緩衝液を使用することができる。また、イオン強度は、上記のとおりペースト状にした水酸アパタイト／コラーゲン複合物中の値として、０．０１〜０．５の範囲、特に０．０２〜０．２の範囲であることが好ましい。

また、本願発明は、凍結乾燥における凍結温度を制御することで、多孔質弾性複合材料の気孔形状および気孔サイズを制御することができ、たとえば、気孔率を８０％以上にす
ることができる。具体的には、たとえば、凍結温度が−２０℃（通常のフリーザー）の場合、多孔質弾性複合材料の気孔サイズを１００〜５００μｍとすることができ、また、たとえば、凍結温度が−８０℃（細胞等の保存に用いられるディープフリーザー）の場合、気孔サイズを５０〜２００μｍとすることができ、凍結温度が−１９６℃（液体窒素に浸漬）の場合、気孔サイズを５〜５０μｍとすることができる。このように、凍結時の温度が低いほど気孔サイズを小さくすることができる。なお、気孔の形状は、球状あるいは紡錘状とすることができる。図１（Ａ）には、凍結温度が−８０℃（ディープフリーザー）の場合の気孔構造を例示し、図１（Ｂ）には、凍結温度が−１９６℃（液体窒素）の場合の気孔構造を例示した。

さらに、この凍結乾燥後に、真空炉を使って減圧下で行う熱処理（真空熱処理）することで、脱水縮合を生じさせ、効率よく架橋を生成することができ、より弾性に富み、安定した多孔質弾性複合材料を製造することができる。真空熱処理の実施条件としては、コラーゲンにおける効率のよい架橋生成を考慮すると、温度は９０〜１７０℃の範囲、より好ましくは１００〜１５０℃の範囲であり、圧力（真空度）は気圧２０Ｐａ以下の減圧状態が好ましい。そして、処理時間は、温度によって変化する。具体的には、たとえば、処理温度が９０〜１１０℃の範囲の場合、処理時間は７２〜１６８時間が好ましく、処理温度が１１０〜１３０℃の範囲の場合、処理時間は２４〜１２０時間が好ましく、また、処理温度が１３０〜１５０℃の範囲の場合、処理時間は８〜４８時間以上が好ましく、さらに、処理温度が１５０〜１７０℃の範囲の場合、処理時間は３〜２４時間が好ましい。そして、コラーゲンの熱分解の進行をできるだけ抑制するために、コラーゲンに架橋が導入された後はできるだけ短時間に上記熱処理を終えることが好ましい。

このような製造方法によって、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維の凝集体であって、多孔質を有することで、スポンジ様の弾性（粘弾性）を有することを特徴とした、優れた強度や使用時の操作性、生体適合性および骨誘導性を備えているとともに、変形の抑制効果を向上させ、細胞や組織の侵入性を向上させることができる多孔質弾性複合材料を、簡単な工程で、しかも手間とコストを抑えて製造することができる。さらに、このとき水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維は、水酸アパタイトのc軸が繊維軸方向に配向されて
いるものであること、さらにまた、気孔率が８０％以上とすることによって、さらに効率よく、多孔質弾性複合材料の上記作用効果を実現できる。

そして、このような製造方法で製造された多孔質弾性複合材料は、生体骨類似体として、たとえば、骨欠損部の治療における人工骨材や人工骨充填材等のインプラントに活用することができる。

以下に、実施例を例示しながら、さらに詳しく本願発明の多孔質弾性複合材料の製造方法および弾性を有する多孔質弾性複合材料について説明する。もちろん、以下の例によって本願発明が限定されることはない。

＜試験例と比較例＞
１−Ａ．多孔質弾性複合材料の作成
（１）水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維体（ＨＡｐ／Ｃｏｌ：混合比率は、８０／２０）１ｇと、リン酸緩衝液（１００ｍＭ, ｐＨ６．８）８ｍＬとを、均一になるまで混合し、インキュベーションしてゲル状とした。
（２）ゲル状の混合物を、型（細胞培養用Φ５３ｍｍのポリスチレンディッシュや細胞培養用２４穴プレート等、適宜に選択することができる）に注入した。
（３）次いで、−２０℃のフリーザーに静置し、ゲル内に氷晶を成長させ凍結させた。（４）凍結完了後、凍結乾燥を行った。
（５）そして、１４０℃、１２時間真空熱処理を行い、脱水縮合を生じさせて、ＨＡｐ／Ｃｏｌを含む多孔質弾性複合材料を作成した。
１−Ｂ．比較対照物の作成
作成条件は、上記１−Ａ．の「多孔質弾性複合材料の作成」とほぼ同じであり、リン酸緩衝液を、蒸留水に代えた点で相違する。
２．多孔質弾性複合材料の外観
作成した多孔質弾性複合材料と、比較対照物の外観をそれぞれ確認した。型として、細胞培養用Φ５３ｍｍのポリスチレンディッシュを用いた。

結果は、比較対照物においては、図２（Ａ）に示したとおり、収縮が起こり、型崩れを起こし、外観が悪かった。一方、本願発明の多孔質弾性複合材料は、図２（Ｂ）のとおり、型崩れを起こすことなく、型どおりの多孔質弾性複合材料を作成することができた。
３．走査型電子顕微鏡（SEM）による観察
作成した多孔質弾性複合材料をカッターで切断し、切断面を白金コーティングした。そして、この切断面から気孔構造に確認をＳＥＭで行った。

結果は、比較対照物では、図３（Ａ）のとおり、気孔構造は確認されなかった。その一方、多孔質弾性複合材料では、図３（Ｂ）のとおり、気孔構造を確認することができた。４．圧縮強度試験
型として、細胞培養用２４穴プレートを用い、多孔質弾性複合材料をΦ１６ｍｍ×１０ｍｍの円柱状に成形した。この円柱状の多孔質弾性複合材料を、３７℃のリン酸緩衝液に浸漬し、テクスチャーアナライザーを用いて押し込み速度０．１ｍｍ／ｓで押し込み、また、３０％圧縮時の応力を圧縮強度として、圧縮強度試験を行った。

結果は、図４に示したとおり、高い圧縮強度を示した。少なくとも５日間は、その強度を保持することが確認できた。
５．動的粘弾性試験
厚さ１．５ｍｍのシリコンシートに、Φ２０ｍｍの穴を設けて、多孔質弾性複合材料用の型とし、多孔質弾性複合材料をΦ２０ｍｍ×１．５ｍｍの円柱状に成形した。

動的粘弾性試験装置の円形プローブを高さ１．０ｍｍに押し込み、応力５０Ｐａでの周波数スウイープ（Ｈｚ）を行った。

結果は、図５に示したとおり、本願発明の多孔質弾性複合材料は、含水状態で粘弾性を示した。なお、多孔質弾性複合材料の弾性率に対する寄与は、その殆どが水酸アパタイトによるものだと考えられる。
６．インキュベーション効果試験
６−１．インキュベーション時間変化による圧縮強度試験
上記１−Ａの方法で作製した多孔質弾性複合材料について、インキュベーション時間による圧縮強度変化を、テクスチャーアナライザー（ＴＡ−ＸＴ２ｉ）にて測定した。ここで、シリンダー型プローブ（Φ５ｍｍ）を用いて０．１ｍｍ／ｓの速度で押し込み、３０％圧縮時の応力を圧縮強度として、圧縮強度試験を行った。

結果は、図６に示したとおり、インキュベーション時間の増加に伴って、圧縮強度が上昇し、インキュベーション時間が２４時間程度で、圧縮強度がほぼ最大に到達することが確認された。
６−２．インキュベーションによる構造変化の観察
上記１−Ａの方法で２４時間インキュベーションして作製した多孔質弾性複合材料を、グルタールアルデヒドで固定した後、２００ｍＭＥＤＴＡと２０ｍＭリス塩酸緩衝液にて脱灰させた後、脱水を完全に行った。その後、ｔ−ブタノールで置換して、真空で昇
華、乾燥させた。そして、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）（ＳＰＭ−９５００）にてその構造を観察した。

結果は、図７に示したとおり、コラーゲン線維特有の６７ｎｍ程度の周期構造が観察された。この観察結果から、リン酸緩衝溶液に分散させて、インキュベーションすることによって、コラーゲン線維が形成されていることが確認され、また、コラーゲン線維が形成したことによって、上記６−１のように圧縮強度が向上したと考えられる。
６−３．インキュベーションによる生体内安定性
ラット大腿骨にΦ３×３ｍｍの大きさの骨欠損を作製し、上記１−Ａの方法で０時間と２４時間インキュベーションして作製した多孔質弾性複合材料を移植した。そして、移植から４週間後に摘出して、ＨＥ染色により組織観察を行った。

結果を図８に示した。（ａ）が２４時間インキュベーションした試料であり、（ｂ）がインキュベーションしていない試料である。図８中の黒三角（▲）は多孔質弾性複合材料、白三角（△）は侵入組織、矢印（→）は新生骨を示すものである。この観察結果より、インキュベーションすることで生体内分解特性が制御でき、移植４週間でも気孔構造が残っていることが確認された。また、インキュベーションしていない試料でも良好な骨再生が生じていることが確認された。

本願発明の多孔質弾性複合材料の気孔構造を例示した図であり、（Ａ）は凍結温度が−８０℃（ディープフリーザー）の場合の気孔構造、（Ｂ）は凍結温度が−１９６℃（液体窒素）の場合の気孔構造である。比較対照物（Ａ）と、本願発明の多孔質弾性複合材料（Ｂ）それぞれの外観を例示した図である。比較対照物（Ａ）と、本願発明の多孔質弾性複合材料（Ｂ）それぞれの切断面における気孔構造を例示した図である。本願発明の多孔質弾性複合材料の圧縮強度試験の結果を示した図である。本願発明の多孔質弾性複合材料の動的粘弾性試験の結果を示した図である。本願発明の多孔質弾性複合材料のインキュベーション時間を変化（０〜６０時間）させた時の圧縮強度試験の結果を示した図である。本願発明の多孔質弾性複合材料（２４時間インキュベーション）を脱灰した試料のＡＦＭ像である。ラット大腿骨の骨欠損に、本願発明の多孔質弾性複合材料（２４時間（ａ）、０時間（ｂ）インキュベーション）を移植して、４週間後に摘出した試料の組織観察結果を示した図である。

Claims

水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維と緩衝液との混合後、凍結乾燥することを特徴とする多孔質弾性複合材料の製造方法。
水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維と緩衝液との混合後に、さらにインキュベーションすることを特徴とする請求項１の製造方法。
水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維は、水酸アパタイトのc軸が繊維軸方向に配向さ
れているものであることを特徴とする請求項１または２の製造方法。
前記凍結乾燥における凍結温度を制御することで、多孔質弾性複合材料の気孔形状および気孔サイズを制御することを特徴とする請求項１から３いずれかの製造方法。
前記凍結乾燥後に、さらに真空熱処理することを特徴とする請求項１から４いずれかの製造方法。
水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維の凝集体であって、多孔質を有することを特徴とする多孔質弾性複合材料。
水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維は、水酸アパタイトのc軸が繊維軸方向に配向さ
れているものであることを特徴とする請求項６の多孔質弾性複合材料。
気孔率８０％以上であることを特徴とする請求項６または７の多孔質弾性複合材料。