JP2007093370A

JP2007093370A - 蛍光分光分析装置

Info

Publication number: JP2007093370A
Application number: JP2005282686A
Authority: JP
Inventors: Junichi Nishimura; 淳一西村
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2005-09-28
Filing date: 2005-09-28
Publication date: 2007-04-12
Also published as: CN101278191B; CN101278191A

Abstract

【課題】クロストークによる測定誤差の影響を受けない蛍光分光装置を提供する。
【解決手段】蛍光分光分析装置１００は、励起光学系１１０と励起光制御部１３０と蛍光検出部１４０と信号処理部１５０と演算部１６０とを有している。励起光学系１１０は、励起光を生成する励起光照射部１２０を有し、励起光制御部１３０は、異なる波長の励起光が時間をずらして排他的に試料Ｓに照射されるように励起光照射部１２０を制御する。励起光照射部１２０は、異なる波長の励起光を試料Ｓ上の同一部位に照射する。蛍光検出部１４０は、励起光の照射に応じて試料Ｓから発生する蛍光を検出する。信号処理部１５０は、蛍光検出部１４０で得られる蛍光強度を反映した信号を処理する。演算部１６０は、励起光制御部１３０による試料Ｓに照射される励起光の波長の変化と、蛍光検出部１４０の検出結果とに基づいて、異なる波長ごとの蛍光のゆらぎの相関分析を行なう。
【選択図】図１

Description

本発明は、蛍光分光分析装置に関する。

蛍光相関分光分析法（ＦＣＳ法）は、顕微鏡視野の微小観測領域内で蛍光分子のブラウン運動が作り出す光の揺らぎを解析することにより、蛍光強度の自己相関関数を求め、分子毎の拡散時間や平均分子数を解析する手法であり、例えば非特許文献１に詳述されている。

蛍光相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）は、異なる蛍光信号間の相互相関関数を求めることにより、両者の関連性を解析する手法で、２色の蛍光色素で標識された分子間の相互作用の解析に用いられ、例えば非特許文献２と非特許文献３に詳述されている。蛍光相互相関分光分析法は拡散時間の少ない蛋白質の相互作用などには適している。同様の解析法に共焦点蛍光コインシデンス分析（ＣＦＣＡ法）があり、これは非特許文献４に詳述されている。
「蛍光相関分光法による１分子検出」金城著、蛋白質核酸酵素、1999, vol. 44N09 1431-1438 "Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy for Multicomponent Diffusional Analysis in Solution", Petra. Schwille et al, Biophysical Journal 1997, 72, 1878-1886 Adynamic view of cellular processes by in vivo fluorescence auto- and cross-correlation spectroscopy, Petra. Schwille et al, Methods 29 (2003) 74-85 Confocal fluorescence coincidence analysis (CFCA), Winkler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 1375-1378, 1999

相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）において、蛍光スペクトルに重なりがある２つの蛍光色素を用いた場合、クロストークによる測定誤差の影響を受け、正確に相互相関演算することができない。

本発明は、このような実状を考慮してなされたものであり、その目的は、クロストークによる測定誤差の影響を受けずに正確に相互相関演算できる蛍光分光装置を提供することである。

本発明による蛍光分光分析装置は、異なる波長の励起光を試料上の同一部位に照射可能な励起光学手段と、前記異なる波長の励起光が時間をずらして排他的に前記試料に照射されるように前記励起光学手段を制御する励起光制御手段と、前記励起光の照射に応じて前記試料から発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、前記励起光制御手段による前記試料に照射される励起光の波長の変化と、前記蛍光検出手段の検出結果とに基づいて、前記異なる波長ごとの前記蛍光のゆらぎの相関分析を行なう演算手段とを備えている。

本発明によれば、クロストークによる測定誤差の影響を受けずに正確に相互相関演算できる蛍光分光装置が提供される。

以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。

本発明の実施形態について説明する前に、まず、図７を参照しながら、相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）におけるクロストーク発生のしくみについて説明する。図７は、蛍光スペクトルに重なりがある２つの蛍光色素においてクロストークが発生している場合の様子を表している。図７において、第１励起スペクトルを持つ第１蛍光色素に第１励起光を照射すると、第１蛍光スペクトルを持つ第１蛍光が第１蛍光色素から発生する。第１蛍光は、フィルターを用いて第１光信号検出範囲内の波長の光を選択的に検出することにより検出される。また、第２励起スペクトルを持つ第２蛍光色素に第２励起光を照射すると、第２蛍光スペクトルを持つ第２蛍光が第２蛍光色素から発生する。第２蛍光は、フィルターを用いて第２光信号検出範囲内の波長の光を選択的に検出することにより検出される。図７から明らかなように、第１蛍光スペクトルの右すそが第２光信号検出範囲に重なっている。このため、第２蛍光を検出する際に第１蛍光も一緒に検出されてしまい、これがクロストークとなる。その結果、相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）においては、クロストークによる測定誤差の影響を受け、正確に相互相関演算することができない。

＜第一実施形態＞
図１は、本発明の第一実施形態の蛍光分光分析装置を概略的に示している。図１に示されるように、蛍光分光分析装置１００は、励起光学系１１０と蛍光検出部１４０と信号処理部１５０と演算部１６０とを有している。励起光学系１１０は、励起光を生成する励起光照射部１２０と、試料Ｓが載せられるステージ１１２と、対物レンズ１１４と、励起光と蛍光を分離するダイクロイックミラー１１６とを有している。

蛍光分光分析装置１００はさらに、異なる波長の励起光が時間をずらして排他的に試料Ｓに照射されるように励起光照射部１２０を制御する励起光制御部１３０を有している。従って、励起光照射部１２０は、異なる波長の励起光を試料Ｓ上の同一部位に所定のタイミングで繰り返し照射し得る。

試料Ｓは、異なる波長の励起光が照射される部位に、異なる波長の励起光にそれぞれ反応して蛍光を発する異なる色素を含んでいる。異なる色素の蛍光スペクトルは少なくとも一部重なっている。

蛍光検出部１４０は、励起光の照射に応じて試料Ｓから発生する蛍光を検出する。

信号処理部１５０は、蛍光検出部１４０で得られる蛍光強度を反映した信号を処理する。演算部１６０は、励起光制御部１３０による試料Ｓに照射される励起光の波長の変化と、蛍光検出部１４０の検出結果とに基づいて、異なる波長ごとの蛍光のゆらぎの相関分析を行なう。例えば演算部１６０は、それぞれの蛍光に対応した出力信号同士の比較に基づいて自己相関分析または相互相関分析または共焦点蛍光コインシデンス分析解析する。

図２は、励起光照射部１２０の構成例を示している。この例では、励起光照射部１２０は、第１光源１２２ａと、第２光源１２２ｂと、ミラー１２４ａと、ダイクロイックミラー１２４ｂと、音響光学素子（ＡＯＴＦ）１２６とから構成されている。第１光源１２２ａと第２光源１２２ｂは互いに波長帯域が異なる第１励起光と第２励起光をそれぞれ発する。ミラー１２４ａは第１光源１２２ａから発せられた第１励起光を図１の対物レンズ１１４に向けて反射する。ダイクロイックミラー１２４ｂは、ミラー１２４ａで反射された第１励起光を透過し、第２光源１２２ｂから発せられた第２励起光を図１の対物レンズ１１４に向けて反射する。第１光源１２２ａと第２光源１２２ｂは連続的に駆動され、第１励起光と第２励起光をそれぞれ発し続ける。音響光学素子１２６は、第１励起光と第２励起光が通過する共通の光路中に配置されていて、通過帯域を制御可能であり、図１の励起光制御部１３０から供給される励起光操作信号に応じて、第１励起光と第２励起光のいずれか一方を選択的に透過する。つまり音響光学素子１２６は、第１光源１２２ａと第２光源１２２ｂの発する異なる波長の光の中から試料Ｓに照射される光を選択する。励起光操作信号は時系列的に変化する信号であり、音響光学素子１２６は第１励起光と第２励起光を交互に透過する。

図３は、励起光照射部１２０の別の構成例を示している。この例では、励起光照射部１２０は、第１光源１２２ａと、第２光源１２２ｂと、ミラー１２４ａと、ダイクロイックミラー１２４ｂと、切替器１２８とから構成されている。第１光源１２２ａと第２光源１２２ｂとミラー１２４ａとダイクロイックミラー１２４ｂの機能は図２の例と同様である。さらに第１光源１２２ａと第２光源１２２ｂはオンオフ制御可能である。切替器１２８は、図１の励起光制御部１３０から供給される励起光操作信号に応じて、第１光源１２２ａと第２光源１２２ｂのいずれか一方を選択的にオンにし、他方を選択的にオフにする。つまり切替器１２８は、発光する光源を選択する。励起光操作信号は時系列的に変化する信号であり、第１光源１２２ａと第２光源１２２ｂが交互にオンされる。その結果、試料Ｓに第１励起光と第２励起光が交互に照射される。つまり切替器１２８は、第１光源１２２ａと第２光源１２２ｂの発する異なる波長の光の中から試料Ｓに照射される光を選択する。

図１に戻り、蛍光検出部１４０は、ダイクロイックミラー１４２と、第１蛍光フィルター１４４ａと、第２蛍光フィルター１４４ｂと、第１受光素子１４６ａと、第２受光素子１４６ｂとから構成されている。第１蛍光フィルター１４４ａは第１蛍光を選択的に透過し、第２蛍光フィルター１４４ｂは第２蛍光を選択的に透過する。第１受光素子１４６ａは第１蛍光の波長帯域に感度を有し、第２受光素子１４６ｂは第２蛍光の波長帯域に感度を有している。つまり、第１受光素子１４６ａと第２受光素子１４６ｂは、異なる波長帯域に感度を有している。

以下、図４のフローチャートを参照しながら、本実施形態の蛍光分光分析装置の動作について説明する。

励起光制御部１３０は励起光操作信号を生成し、これを励起光照射部１２０に出力する。励起光操作信号は、図５に示されるように、周期的に変化する「０」と「１」の二値信号である。

励起光照射部１２０が図２の構成の場合、音響光学素子１２６は、励起光操作信号が「０」のときに第１励起光を選択的に透過し、励起光操作信号が「１」のときに第２励起光を選択的に透過する。

また励起光照射部１２０が図３の構成の場合、切替器１２８は、励起光操作信号が「０」のときに第１光源１２２ａを選択的にオンし、励起光操作信号が「１」のときに第２光源１２２ｂを選択的にオンにする。

その結果、試料Ｓに照射される励起光は、図５に示されるように、第１励起光と第２励起光が交互に切り替わるものとなる。

励起光の照射に応じて試料Ｓから蛍光が発生する。第１受光素子１４６ａは、第１励起光の照射に応じて試料Ｓから発生する第１蛍光を検出し、図５に示される第１蛍光検出信号を信号処理部１５０に出力する。第２受光素子１４６ｂは、第２励起光の照射に応じて試料Ｓから発生する第２蛍光を検出し、図５に示される第２蛍光検出信号を信号処理部１５０に出力する。

信号処理部１５０は、蛍光検出部１４０の第１受光素子１４６ａと第２受光素子１４６ｂからそれぞれ供給される第１蛍光検出信号と第２蛍光検出信号を一定時間ごとの蛍光強度信号に変換し、その蛍光強度信号と励起光制御信号を最適な形で組み合わせて演算用データを生成し、これを演算部１６０に出力する。

演算部１６０は、信号処理部１５０から供給される演算用データに基づいて自己相関分析または相互相関分析または共焦点蛍光コインシデンス分析を実施する
本実施形態では、異なる波長の第１励起光と第２励起光とが時間をずらして排他的に試料Ｓに照射される。第１励起光と第２励起光の照射に応じて試料Ｓからそれぞれ発生する第１蛍光と第２蛍光は、それぞれ、蛍光検出部１４０の第１受光素子１４６ａと第２受光素子１４６ｂによって検出される。このため、クロストークによる測定誤差の影響を受けずに正確な相互相関演算を行なえる。

＜第二実施形態＞
図６は、本発明の第二実施形態の蛍光分光分析装置を概略的に示している。本実施形態の蛍光分光分析装置２００は、蛍光検出部２４０のほかは、第一実施形態の蛍光分光分析装置１００と同様である。

蛍光検出部２４０は、マルチバンドフィルター２４２と受光素子２４４とから構成されている。マルチバンドフィルター２４２は第１蛍光と第２蛍光を選択的に透過する。受光素子２４４は第１蛍光と第２蛍光を検出可能な受光帯域を有している。つまり、受光素子２４４は、異なる励起光による異なる波長の蛍光を検出可能な受光帯域を有している。

本実施形態では、異なる波長の第１励起光と第２励起光とが時間をずらして排他的に試料Ｓに照射される。第１励起光と第２励起光の照射に応じて試料Ｓからそれぞれ発生する第１蛍光と第２蛍光は、ひとつの蛍光検出部２４０の受光素子２４４によって時分割に検出される。このため、クロストークによる測定誤差の影響を受けずに正確な相互相関演算を行なえる。

これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。

本発明の第一実施形態の蛍光分光分析装置を概略的に示している。図１に示された励起光照射部の構成例を示している。図１に示された励起光照射部の別の構成例を示している。図１に示された蛍光分光分析装置の動作のフローチャートを示している。図１に示された蛍光分光分析装置における信号のタイムチャートを示している。本発明の第二実施形態の蛍光分光分析装置を概略的に示している。蛍光スペクトルに重なりがある２つの蛍光色素においてクロストークが発生する様子を表している。

符号の説明

１００…蛍光分光分析装置、１１０…励起光学系、１１２…ステージ、１１４…対物レンズ、１１６…ダイクロイックミラー、１２０…励起光照射部、１２２ａ…光源、１２２ｂ…光源、１２４ａ…ミラー、１２４ｂ…ダイクロイックミラー、１２６…音響光学素子、１２８…切替器、１３０…励起光制御部、１４０…蛍光検出部、１４２…ダイクロイックミラー、１４４ａ…蛍光フィルター、１４４ｂ…蛍光フィルター、１４６ａ…受光素子、１４６ｂ…受光素子、１５０…信号処理部、１６０…演算部、２００…蛍光分光分析装置、２４０…蛍光検出部、２４２…マルチバンドフィルター、２４４…受光素子。

Claims

異なる波長の励起光を試料上の同一部位に照射可能な励起光学手段と、
前記異なる波長の励起光が時間をずらして排他的に前記試料に照射されるように前記励起光学手段を制御する励起光制御手段と、
前記励起光の照射に応じて前記試料から発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、
前記励起光制御手段による前記試料に照射される励起光の波長の変化と、前記蛍光検出手段の検出結果とに基づいて、前記異なる波長ごとの前記蛍光のゆらぎの相関分析を行なう演算手段とを具備することを特徴とする蛍光分光分析装置。
前記試料は、前記異なる波長の励起光が照射される部位（前記同一部位）に、前記異なる波長の励起光にそれぞれ反応して蛍光を発する異なる色素を含んでおり、当該異なる色素の蛍光スペクトルは少なくとも一部重なっていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
前記励起光学手段は、異なる波長の励起光を所定のタイミングで繰り返し前記試料に対して照射することを特徴とする請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
前記励起光学手段は、異なる波長の光を発する複数の光源と、当該光源の発する異なる波長の光の中から前記試料に照射される光を選択する手段と、を含むことを特徴とする請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
前記照射される光を選択する手段は、前記異なる波長の複数の光が通過する共通の光路中に配置されることを特徴とする請求項４に記載の蛍光分光装置。
前記照射される光を選択する手段は、発光する光源を選択する光源切替手段または通過帯域を制御可能な音響光学素子であることを特徴とする請求項４に記載の蛍光分光装置。
前記蛍光検出手段は、異なる波長帯域に感度を有する複数の受光素子で構成されていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
前記蛍光検出手段は、前記異なる励起光による異なる波長の蛍光を検出可能な受光帯域を有するひとつの受光素子で構成されていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光分光装置。