JP2006320208A - コハク酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 発酵法により、コハク酸を効率よく製造する。
【解決手段】 マレートデヒドロゲナセーゼ活性が増強するように改変された細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させ、コハク酸を生成させる。
【選択図】 なし
【解決手段】 マレートデヒドロゲナセーゼ活性が増強するように改変された細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させ、コハク酸を生成させる。
【選択図】 なし
Description
本発明は、コリネ型細菌等の細菌を用いたコハク酸の製造に関するものである。
コハク酸などの非アミノ有機酸を発酵により生産する場合、通常、Anaerobiospirillum属、Actinobacillus属等の嫌気性細菌が用いられている（特許文献１及び２、非特許文献１）。嫌気性細菌を用いる場合は、生産物の収率が高いが、その一方では、増殖するために多くの栄養素を要求するために、培地中に多量のＣＳＬ（コーンスティープリカー）などの有機窒素源を添加する必要がある。これらの有機窒素源を多量に添加することは培地コストの上昇をもたらすだけでなく、生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつながり経済的でない。
また、コリネ型細菌のような好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させた後、集菌、洗浄し、静止菌体として酸素を通気せずに非アミノ有機酸を生産する方法も知られている（特許文献３及び４）。この場合、菌体を増殖させるに当たっては、有機窒素の添加量が少なくてよく、簡単な培地で十分増殖できるため経済的ではあるが、目的とする有機酸の生成量、生成濃度、及び菌体当たりの生産速度の向上、製造プロセスの簡略化等、改善の余地があった。また、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性を増強させた細菌を用いた非アミノ有機酸の発酵生産などが報告されていたが（例えば、特許文献５参照）、マレートデヒドロゲナーゼの活性を増強させた細菌を用いて非アミノ有機酸を製造することは、これまで報告されていなかった。
米国特許第５，１４２，８３４号公報
米国特許第５，５０４，００４号公報
特開平１１−１１３５８８号公報
特開平１１−１９６８８８号公報
特開平１１−１９６８８７号公報
International Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49,207-216
本発明の課題は、より生産効率の高いコハク酸の製造方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、マレートデヒドロゲナーゼ活性が増強するように改変された細菌あるいはその処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることにより、有機原料の消費速度、コハク酸の生成速度、あるいは、収率が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１） マレートデヒドロゲナーゼ活性が増強するように改変された細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させてコハク酸を生成させ、該コハク酸を回収することを特徴とするコハク酸の製造方法。
（２） 細菌が、コリネ型細菌、バチルス属細菌、又はリゾビウム属細菌からなる群より選ばれるいずれかの細菌である、（１）の方法。
（３） 前記細菌が、さらに、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて１０％以下に低減化するように改変された細菌である、（１）または（２）の方法。
（４） 前記細菌が、さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された細菌であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５） 前記細菌が、さらに、フマル酸レダクターゼ活性が増強するように改変された細菌であることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかの方法。
（６） 有機原料を嫌気的雰囲気下で作用させることを特徴する（１）〜（５）のいずれかの方法。
（７） 有機原料が、グルコースである（１）〜（６）のいずれかの方法。
（８） （１）〜（７）のいずれかの方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
（１） マレートデヒドロゲナーゼ活性が増強するように改変された細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させてコハク酸を生成させ、該コハク酸を回収することを特徴とするコハク酸の製造方法。
（２） 細菌が、コリネ型細菌、バチルス属細菌、又はリゾビウム属細菌からなる群より選ばれるいずれかの細菌である、（１）の方法。
（３） 前記細菌が、さらに、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて１０％以下に低減化するように改変された細菌である、（１）または（２）の方法。
（４） 前記細菌が、さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された細菌であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５） 前記細菌が、さらに、フマル酸レダクターゼ活性が増強するように改変された細菌であることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかの方法。
（６） 有機原料を嫌気的雰囲気下で作用させることを特徴する（１）〜（５）のいずれかの方法。
（７） 有機原料が、グルコースである（１）〜（６）のいずれかの方法。
（８） （１）〜（７）のいずれかの方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
本発明の製造方法によれば、迅速かつ高効率でコハク酸を製造することができる。得られたコハク酸は食品添加物や医薬品、化粧品等に用いることができる。また、得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造することもできる。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の製造方法に用いることのできる細菌は、マレートデヒドロゲナーゼ活性が増強するように改変された細菌である。ここで、「マレートデヒドロゲナーゼ活性」とは、オギザロ酢酸を還元してリンゴ酸に変換する反応を触媒する活性をいい、「マレートデヒドロゲナーゼ活性が増強する」とは、マレートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較してマレートデヒドロゲナーゼ活性が増強していることをいう。マレートデヒドロゲナーゼ活性は、マレートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較して、単位菌体重量当たり1.5倍以上増強されていることが好ましく、２倍以上増強されていることがより好ましい。マレートデヒドロゲナーゼ活性は、後述するようなNADHの減少を測定する方法によって測定することができる。
マレートデヒドロゲナーゼ活性の増強は、例えば、マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた遺伝子組換え法などにより、親株である細菌株を改変することによって行うことができる。
本発明の製造法に使用できる細菌は、コハク酸の生産能を有すれば特に限定されないが、コリネ型細菌（coryneform bacterium）、バチルス属細菌、又はリゾビウム属細菌が好ましく、コリネ型細菌がより好ましい。
コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌又はアースロバクター属に属する細菌が挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に属する細菌が挙げられる。
コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌又はアースロバクター属に属する細菌が挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に属する細菌が挙げられる。
本発明の製造法に用いる細菌を得るために用いられる細菌の親株の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アン
モニアゲネス ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ３１８３１、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer, K. H., International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255-260）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株、及びその変異株ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株と同一の株であるものとする。
なお、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、1975年4月28日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM
P-3068として寄託され、1981年5月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-1497の受託番号で寄託されている。
モニアゲネス ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ３１８３１、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer, K. H., International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255-260）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株、及びその変異株ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株と同一の株であるものとする。
なお、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、1975年4月28日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM
P-3068として寄託され、1981年5月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-1497の受託番号で寄託されている。
バチルス属細菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・プミルス、バチルス・ステアロサーモフィルス等が挙げられる。
リゾビウム属細菌としては、例えば、リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）などがあげられる。
リゾビウム属細菌としては、例えば、リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）などがあげられる。
本発明の方法において親株として用いられる上記細菌は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
マレートデヒドロゲナーゼ（MDH）遺伝子を用いてマレートデヒドロゲナーゼ活性が増強するように改変する場合、用いることのできる遺伝子はマレートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、配列番号３２に示す塩基配列を有するブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株由来の遺伝子を挙げることができる。この遺伝子は、上記塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA、または上記塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAのようなホモログであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
また、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３以外の細菌、または他の微生物又は動植物由来のMDH遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のMDH遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基いてMDH活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法によりそのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって、取得することができる。
上記のようにして単離された、マレートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、マレートデヒドロゲナーゼ発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、マレートデヒドロゲナーゼ活性増強株を得ることができる。あるいは、マレートデヒドロゲナーゼ活性増強株は、相同組換えなどによって、宿主細菌の染色体ＤＮＡにマレートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを発現可能に組み込むことによっても得ることができる。なお、形質転換、相同組換えは当業者に知られた通常の方法に従って行うことができる。
マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入する場合には、適当なプロモーターを該遺伝子の５'-側上流に、より好ましくはターミネーターを３'-側下流にそれぞれ組み込む。このプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する細菌中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子自身のプロモーター及びターミネーターであってもよいし、他のプロモーター及びターミネーターに置換してもよい。これら各種細菌において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。
コリネ型細菌を使用する場合、MDH遺伝子を含むＤＮＡ断片を、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌内でMDHの発現増強が可能な組換えプラスミドを得ることができる。コリネ型細菌にMDH遺伝子を導入することができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。その具体例としては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１；Ｐｌａｓｍｉｄ vol.３６（１）
ｐ６２−６６（１９９６）に記載のｐＣ２又はその改変プラスミド等を挙げることができる。なお、MDH活性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上でMDH遺伝子を導入、置換、増幅、又は染色体上のMDH遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによって高発現化させることによっても行うことができる。
ｐ６２−６６（１９９６）に記載のｐＣ２又はその改変プラスミド等を挙げることができる。なお、MDH活性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上でMDH遺伝子を導入、置換、増幅、又は染色体上のMDH遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによって高発現化させることによっても行うことができる。
上記組み換えプラスミドまたは染色体上への組み込みにおいて、MDH遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いるMDH遺伝子自身のプロモーターであってもよい。プロモーターを適宜選択することによっても、MDH遺伝子の発現量の調節が可能である。以上、コリネ型細菌を用いる例を述べたが、他の細菌を用いる場合も同様の方法によって、MDH活性の増強を達成することができる。
バチルス属細菌を用いる場合においては、ベクターとしては、ｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどを挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α-アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーターなどが利用できる。
本発明の製造方法においては、MDH活性の増強に加えて、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性が低減化するように改変された細菌株を用いるとより有効である。ここで、「ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化された」とは、ラクテートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較してラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下していることをいう。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、ラクテートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較して、菌体当たり１０％以下に低減化されていることが好ましい。また、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性は完全に欠損していてもよい。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化されたことは、公知の方法（L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)）によ
りラクテートデヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。コリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ活性の低減化した変異株の具体的な製造方法としては、特開平１１−２０６３８５号公報に記載されている染色体への相同組換えによる方法、あるいは、本明細書実施例に記載のＳａｃＢ遺伝子を用いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）等によってラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊する方法が挙げられる。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を低減化させるために用いるラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子はラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である限り特に制限されないが、例えば、特開平１１−２０６３８５号公報に記載された遺伝子を用いることができる。
ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化されMDH遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌は、例えば後述の実施例２のようにして、LDH遺伝子が破壊された細菌を作製し、該細菌をMDH遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより得ることができる。ただし、LDH活性低減化のための改変操作とMDH活性増強のため改変操作はどちらを先に行ってもよい。
りラクテートデヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。コリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ活性の低減化した変異株の具体的な製造方法としては、特開平１１−２０６３８５号公報に記載されている染色体への相同組換えによる方法、あるいは、本明細書実施例に記載のＳａｃＢ遺伝子を用いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）等によってラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊する方法が挙げられる。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を低減化させるために用いるラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子はラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である限り特に制限されないが、例えば、特開平１１−２０６３８５号公報に記載された遺伝子を用いることができる。
ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化されMDH遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌は、例えば後述の実施例２のようにして、LDH遺伝子が破壊された細菌を作製し、該細菌をMDH遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより得ることができる。ただし、LDH活性低減化のための改変操作とMDH活性増強のため改変操作はどちらを先に行ってもよい。
また、本発明の製造方法においては、MDH活性の増強に加えて、ピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強するように改変された細菌を用いてもよい。「ピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強される」とは、ピルビン酸カルボキシラーゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して増加していることをいう。ピルビン酸カルボキシラーゼの活性は例えば、後述するようなNADHの減少を測定する方法により測定することができる。
ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）の活性が増強するように改変するために使用されるＰＣ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、もしくは、下記に示すような方法によりＰＣ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。
ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、微生物、動植物由来の染色体上に存在している。これらの供給源微生物、動植物からＰＣ遺伝子を調製するための基本操作を、配列が既知であるコリネ型細菌由来のものを一例として述べれば次のとおりである。ＰＣ遺伝子は、上記コリネ型細菌コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の染色体上に存在し（Peters-Wendisch, P.G. et al. Microbiology, vol.144 (1998) ｐ915-927）、それらの配列が既知であるため（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）（配列番号１５）、ＰＣＲ法により、単離・取得することができる。
Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）（配列番号１５）、ＰＣＲ法により、単離・取得することができる。
例えば、ＰＣＲに用いるプライマーとして、配列番号１３及び１４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、コリネバクテリウム・グルタミカム由来の染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、約３．７ｋｂからなるＰＣ遺伝子を増幅させることができる。このとき、ＰＣＲに使用するプライマーの５’末端に適当な制限酵素サイトを付加しておくことにより、後述するベクターの適当な部位に連結させることができ、得られる組換えベクターを用いてコリネ型細菌に導入することができる。
また、遺伝子配列が不明であっても、ＰＣ活性を指標に蛋白質を精製し、そのＮ末アミノ酸配列、部分分解配列よりプローブを合成し、通常用いられるハイブリダイゼーションの手法により遺伝子断片を単離できる。また、ＰＣ蛋白質間で保存されている領域のアミノ酸配列をもとにプローブまたはプライマーを合成し、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法により断片を取得することが可能である。取得した断片は通常の手法によりそのＤＮＡ塩基配列を決定することができる。
本発明においてＰＣ活性を増強させるために用いる上記ＰＣ遺伝子を包含するＤＮＡ断片は、コリネバクテリウム・グルタミカム染色体ＤＮＡから単離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されたものであってもよい。また、前記の如くコリネ型細菌染色体ＤＮＡから取得されるＰＣ遺伝子は、コードされるＰＣの機能、すなわち二酸化炭素固定に関与する性質を実質的に損なうことがない限り、配列番号１５の塩基配列において、一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく、又は削除されていてもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基配列の一部が転位されているものであってもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明に用いることができる。配列番号１５の塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA、または配列番号１５の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAであって、PC活性を有するタンパク質をコードするDNAも好適に用いることができる。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
また、コリネバクテリウム・グルタミカム以外の細菌、または他の微生物又は動植物由来のＰＣ遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す微生物または動植物由来のＰＣ遺伝子は、その配列が既知（以下に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイゼーンションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲＦ部分を増幅することによって、取得することができる。
ヒト ［Biochem.Biophys.Res.Comm., 202, 1009-1014, (1994)］
マウス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)］
ラット［GENE, 165, 331-332, (1995)］
酵母；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）
［DDBJ Accession No.; D78170］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
［GENE, 191, 47-50, (1997)］
リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）
［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］
ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、適当な発現プラスミド、例えばｐＵＣ１１８（宝酒造製）へ挿入し、適当な宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）へ導入することにより発現させることができる。発現したＰＣ遺伝子産物であるピルビン酸カルボキシラーゼ（配列番号１６）の活性の確認は、該形質転換体から粗酵素液&; Magasanikの方法[J.Bacteriol., 158, 55-62, (1984)]により直接ＰＣ活性を測定し、非形質転換株から抽出した粗酵素液のＰＣ活性と比較することにより、確認することができる。ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌内でＰＣの高発現可能な組換えプラスミドを得ることができる。ここで、上記組み換えプラスミドにおいて、ＰＣ遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌が保有するプロモーターであることができるが、それに限られるものではなく、ＰＣ遺伝子の転写を開始させるための塩基配列であればいかなるプロモーターであっても良い。例えば、後述の実施例３に記載するようなＴＺ４プロモーターが挙げられる。
マウス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)］
ラット［GENE, 165, 331-332, (1995)］
酵母；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）
［DDBJ Accession No.; D78170］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
［GENE, 191, 47-50, (1997)］
リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）
［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］
ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、適当な発現プラスミド、例えばｐＵＣ１１８（宝酒造製）へ挿入し、適当な宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）へ導入することにより発現させることができる。発現したＰＣ遺伝子産物であるピルビン酸カルボキシラーゼ（配列番号１６）の活性の確認は、該形質転換体から粗酵素液&; Magasanikの方法[J.Bacteriol., 158, 55-62, (1984)]により直接ＰＣ活性を測定し、非形質転換株から抽出した粗酵素液のＰＣ活性と比較することにより、確認することができる。ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌内でＰＣの高発現可能な組換えプラスミドを得ることができる。ここで、上記組み換えプラスミドにおいて、ＰＣ遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌が保有するプロモーターであることができるが、それに限られるものではなく、ＰＣ遺伝子の転写を開始させるための塩基配列であればいかなるプロモーターであっても良い。例えば、後述の実施例３に記載するようなＴＺ４プロモーターが挙げられる。
ＰＣ遺伝子を導入することができるプラスミドベクターとしては、上述したような、MDH遺伝子の導入に用いることのできるプラスミドベクターと同様のプラスミドベクターを
用いることができる。
用いることができる。
ＰＣ遺伝子を、上記したような好気性コリネ型細菌内で複製可能なプラスミドベクターの適当な部位に挿入して得られる組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)MJ-233株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を形質転換することにより、ＰＣ遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌が得られる。なお、PC活性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上でPC遺伝子を導入、置換、増幅等によって高発現化させることによっても行うことができる。得られた細菌を、MDH遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより、ＰＣ遺伝子及びMDH遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌が得られる。なお、MDH遺伝子とPC遺伝子の導入はどちらを先に行ってもよい。形質転換は、例えば、電気パルス法（Res. Microbiol., Vol.144, p.181-185, 1993）等によって行うことができる。
また、本発明の製造方法においては、ＭＤＨ活性の増強に加えて、フマル酸リダクターゼ活性が増強されるようにして改変された細菌を用いてもよい。
ここで、「フマル酸リダクターゼ活性」とは、フマル酸を還元してコハク酸に変換する反応を触媒する活性をいい、「フマル酸リダクターゼ活性が増強する」とは、フマル酸リダクターゼ非改変株と比較してフマル酸リダクターゼ活性が増強していることをいう。フマル酸リダクターゼ活性は、後述するようなK3Fe(CN)6の減少を測定する方法によって測定することができる。
ここで、「フマル酸リダクターゼ活性」とは、フマル酸を還元してコハク酸に変換する反応を触媒する活性をいい、「フマル酸リダクターゼ活性が増強する」とは、フマル酸リダクターゼ非改変株と比較してフマル酸リダクターゼ活性が増強していることをいう。フマル酸リダクターゼ活性は、後述するようなK3Fe(CN)6の減少を測定する方法によって測定することができる。
フマル酸リダクターゼ活性の増強は、例えば、フマル酸リダクターゼ遺伝子を用いた遺伝子組換え法などにより、親株である細菌株を改変することによって行うことができる。
フマル酸レダクターゼ遺伝子を用いた遺伝子組み換え法による改変は、上述したＭＤＨ遺伝子増強と同様の方法によって行うことができる。
なお、フマル酸レダクターゼ活性を増強させるために用いることのできるフマル酸レダクターゼ遺伝子の種類はフマル酸レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするものである限り特に制限されないが、例えば、配列番号１９の塩基配列又は該塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子を用いることができる。配列番号１９の塩基配列は大腸菌のフマル酸レダクターゼ遺伝子の塩基配列であるが、ＦＲＤを構成する４種類のサブユニット（配列番号２０，２１，２２，２３）をコードする。
なお、フマル酸レダクターゼ活性を増強させるために用いることのできるフマル酸レダクターゼ遺伝子の種類はフマル酸レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするものである限り特に制限されないが、例えば、配列番号１９の塩基配列又は該塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子を用いることができる。配列番号１９の塩基配列は大腸菌のフマル酸レダクターゼ遺伝子の塩基配列であるが、ＦＲＤを構成する４種類のサブユニット（配列番号２０，２１，２２，２３）をコードする。
なお、大腸菌フマル酸リダクターゼは、TCA回路の正回りで作用するコハク酸デヒドロゲナーゼの逆反応を担う酵素であるが、嫌気的条件下におけるフマル酸呼吸に関与しており、好気的条件下においては転写レベルでその遺伝子発現が抑制されていることが知られている（Jones, H. M., Gunsalus, R. P., J. Bacteriol., 1985, Vol. 164, p1100-1109）。従って、フマル酸リダクターゼはその活性が増強されすぎると、菌体の生育が悪くなることが考えられるため、本発明においては、フマル酸リダクターゼ活性は菌体の生育が大きく阻害されない程度に増強されていることが望ましい。
本発明の製造方法においては、マレートデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、フマル酸リダクターゼの活性が増強し、かつ、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化するように改変された細菌を用いると、コハク酸の製造に特に有効である。このような細菌は、例えば、LDH遺伝子が破壊されたコリネ型細菌を作製し、次いで、ＰＣ遺伝子、ＦＲＤ遺伝子、ＭＤＨ遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより得ることができる。なお、これらの遺伝子を用いた改変操作はいずれの操作を先に行ってもよい。
コハク酸の製造反応に上記細菌を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培
養したものを直接反応に用いても良いが、上記細菌を予め液体培地で培養（種培養）したものを用いるのが好ましい。このように種培養した細菌を有機原料を含む培地で増殖させながら、有機原料と反応させることによってコハク酸を製造することができる。
また、増殖させて得られた菌体を有機原料を含む反応液中で有機原料と反応させることによっても製造することができる。なお、好気性コリネ型細菌を本発明の方法に用いるためには、先ず菌体を通常の好気的な条件で培養した後用いることが好ましい。この場合、培養に用いる培地は、通常細菌の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収され、反応に用いられる。
養したものを直接反応に用いても良いが、上記細菌を予め液体培地で培養（種培養）したものを用いるのが好ましい。このように種培養した細菌を有機原料を含む培地で増殖させながら、有機原料と反応させることによってコハク酸を製造することができる。
また、増殖させて得られた菌体を有機原料を含む反応液中で有機原料と反応させることによっても製造することができる。なお、好気性コリネ型細菌を本発明の方法に用いるためには、先ず菌体を通常の好気的な条件で培養した後用いることが好ましい。この場合、培養に用いる培地は、通常細菌の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収され、反応に用いられる。
本発明では細菌の菌体の処理物を使用することもできる。菌体の処理物としては、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。
本発明の製造方法に用いる有機原料としては、本細菌が資化してコハク酸を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、グリセロールが好ましく、特にグルコースが好ましい。
また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用できる。上記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、コハク酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で反応が行われる。また、反応の進行に伴う上記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行っても良い。
上記有機原料を含む反応液としては特に限定されず、例えば、細菌を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよい。反応液は、窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本細菌が資化してコハク酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
コハク酸が生成するに伴い、反応液のｐＨが低下する。したがって、反応液のｐＨは、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を添加することによって調整することが好ましい。本反応におけるｐＨは、通常、ｐＨ５〜10、好ましくはｐＨ６〜9.5であることが好ましいので、反応中も必要に応じて反応液のｐＨはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。
本発明で用いる反応液としては、水、緩衝液、培地等が用いられるが、培地が最も好ま
しい。培地には、例えば上記した有機原料と炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸ガスを含有させ、好ましくは嫌気的条件で反応させることができる。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸又はこれらの塩或いは炭酸ガス（ＣＯ2）から供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、０．００１〜５Ｍ、好ましくは０．１〜３Ｍ、さらに好ましくは１〜２Ｍの濃度で添加する。炭酸ガスを含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ〜１０ｇの炭酸ガスを含有させる。
しい。培地には、例えば上記した有機原料と炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸ガスを含有させ、好ましくは嫌気的条件で反応させることができる。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸又はこれらの塩或いは炭酸ガス（ＣＯ2）から供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、０．００１〜５Ｍ、好ましくは０．１〜３Ｍ、さらに好ましくは１〜２Ｍの濃度で添加する。炭酸ガスを含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ〜１０ｇの炭酸ガスを含有させる。
本反応に用いる細菌の生育至適温度は、通常、２５℃〜３５℃である。反応時の温度は、通常、２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃である。反応に用いる菌体の量は、特に規定されないが、１〜７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２０〜４００ｇ／Ｌが用いられる。反応時間は１時間〜１６８時間が好ましく、３時間〜７２時間がより好ましい。
細菌を増殖させるための培養時には、通気、攪拌し酸素を供給することが必要である。一方、コハク酸の生成反応時は、通気、攪拌を行ってもよいが、嫌気的雰囲気にすることが好ましい。嫌気的雰囲気は、反応液への通気量を抑える、通気する気体の酸素濃度を下げる又は０にすることによって、酸素の供給量を抑制する又は酸素を供給しないことによって達成することができる。具体的には、例えば、容器を密閉して無通気状態にする、窒素ガス等の不活性ガスを通気する、炭酸ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法を用いることができる。この時の反応溶液中の溶存酸素濃度は低く抑えられているが、具体的には、溶存酸素濃度として通常０〜２ｐｐｍ、好ましくは０〜１ｐｐｍ、さらに好ましくは０〜０．５ｐｐｍにすることが望ましい。
反応液（培養液）中に蓄積したコハク酸は、常法に従って、反応液より回収することができる。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーによりコハク酸を分離・精製することができる。
さらに本発明においては、上記した本発明の方法によりコハク酸を製造した後に、得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造することができる。近年、環境に配慮した工業製品が数を増す中、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきており、本発明において製造されるコハク酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用いる事が出来る。コハク酸含有ポリマーとして具体的には、ブタンジオールやエチレングリコールなどのジオールとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリエステル、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミンとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリアミドなどが挙げられる。
また、本発明の製造法により得られるコハク酸または該コハク酸を含有する組成物は食品添加物や医薬品、化粧品などに用いることができる。
また、本発明の製造法により得られるコハク酸または該コハク酸を含有する組成物は食品添加物や医薬品、化粧品などに用いることができる。
［実施例］
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
＜遺伝子破壊用ベクターの構築＞
（Ａ）枯草菌ゲノムDNAの抽出
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを
蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
（Ａ）枯草菌ゲノムDNAの抽出
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを
蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
（Ｂ）ＰＣＲによるＳａｃＢ遺伝子の増幅およびクローニング
枯草菌ＳａｃＢ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、既に報告されている該遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ０２７３０）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で２分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ：ＳＴＲＡＴＥＧＥＮＥ製）のＥｃｏＲＶ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、次に５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。ＳａｃＢ遺伝子が大腸菌内で機能的に発現する株は、ショ糖含有培地にて生育不能となるはずである。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｌIおよびＰｓｔIで切断することにより、約２ｋｂの挿入断片が認められ、該プラスミドをｐＢＳ／ＳａｃＢと命名した。
枯草菌ＳａｃＢ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、既に報告されている該遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ０２７３０）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で２分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ：ＳＴＲＡＴＥＧＥＮＥ製）のＥｃｏＲＶ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、次に５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。ＳａｃＢ遺伝子が大腸菌内で機能的に発現する株は、ショ糖含有培地にて生育不能となるはずである。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｌIおよびＰｓｔIで切断することにより、約２ｋｂの挿入断片が認められ、該プラスミドをｐＢＳ／ＳａｃＢと命名した。
（Ｃ）クロラムフェニコール耐性ＳａｃＢベクターの構築
大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ３９６（宝酒造：クロラムフェニコール耐性マーカー）５００ｎｇに制限酵素ＰｓｈＢI１０ｕｎｉｔｓを３７℃で一時間反応させた後、フェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿により回収した。これを、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造製）により両末端を平滑化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いてＭｌｕIリンカー（宝酒造）を連結、環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンから常法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素ＭｌｕIの切断部位を有するクローンを選抜し、ｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕと命名した。
一方、上記（B）にて構築したｐＢＳ／ＳａｃＢを制限酵素ＳａｌIおよびＰｓｔIで切断した後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化した。これにライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いてＭｌｕIリンカーを連結したのち、０．７５％アガロースゲル電気泳動によりＳａｃＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を分離、回収した。このＳａｃＢ遺伝子断片を、制限酵素ＭｌｕI切断後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：宝酒造）にて末端を脱リン酸化したｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕ断片とライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。こうして得られたコロニーを、次に３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法によりプラスミドＤＮＡを精製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＭｌｕI切断により解析した結果、約２．０ｋｂの挿入断片を持つことが確認され、これをｐＣＭＢ１と命名した。
大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ３９６（宝酒造：クロラムフェニコール耐性マーカー）５００ｎｇに制限酵素ＰｓｈＢI１０ｕｎｉｔｓを３７℃で一時間反応させた後、フェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿により回収した。これを、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造製）により両末端を平滑化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いてＭｌｕIリンカー（宝酒造）を連結、環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンから常法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素ＭｌｕIの切断部位を有するクローンを選抜し、ｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕと命名した。
一方、上記（B）にて構築したｐＢＳ／ＳａｃＢを制限酵素ＳａｌIおよびＰｓｔIで切断した後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化した。これにライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いてＭｌｕIリンカーを連結したのち、０．７５％アガロースゲル電気泳動によりＳａｃＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を分離、回収した。このＳａｃＢ遺伝子断片を、制限酵素ＭｌｕI切断後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：宝酒造）にて末端を脱リン酸化したｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕ断片とライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。こうして得られたコロニーを、次に３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法によりプラスミドＤＮＡを精製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＭｌｕI切断により解析した結果、約２．０ｋｂの挿入断片を持つことが確認され、これをｐＣＭＢ１と命名した。
（Ｄ）カナマイシン耐性遺伝子の取得
カナマイシン耐性遺伝子の取得は、大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ２９９（宝酒造：カナマイシン耐性マーカー）のＤＮＡを鋳型とし、配列番号３および配列番号４で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ０．１μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．５μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６２℃で１５秒、７２℃で１分２０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．１ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した。
カナマイシン耐性遺伝子の取得は、大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ２９９（宝酒造：カナマイシン耐性マーカー）のＤＮＡを鋳型とし、配列番号３および配列番号４で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ０．１μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．５μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６２℃で１５秒、７２℃で１分２０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．１ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した。
（Ｅ）カナマイシン耐性ＳａｃＢベクターの構築
上記（Ｃ）で構築したｐＣＭＢ１を制限酵素Ｖａｎ９１ＩおよびＳｃａＩで切断して得られた約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。これを上記（Ｄ）で調製したカナマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
このカナマイシン含有培地上で生育した株は、ショ糖含有培地にて生育不能であること
が確認された。また、同株から調製したプラスミドＤＮＡは、制限酵素ＨｉｎｄIII消化により３５４、４７３、１８０７、１９９７ｂｐの断片を生じたことから、図１に示した構造に間違いがないと判断し、該プラスミドをｐＫＭＢ１と命名した。
上記（Ｃ）で構築したｐＣＭＢ１を制限酵素Ｖａｎ９１ＩおよびＳｃａＩで切断して得られた約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。これを上記（Ｄ）で調製したカナマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
このカナマイシン含有培地上で生育した株は、ショ糖含有培地にて生育不能であること
が確認された。また、同株から調製したプラスミドＤＮＡは、制限酵素ＨｉｎｄIII消化により３５４、４７３、１８０７、１９９７ｂｐの断片を生じたことから、図１に示した構造に間違いがないと判断し、該プラスミドをｐＫＭＢ１と命名した。
＜ＬＤＨ遺伝子破壊株の作製＞
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株ゲノムＤＮＡの抽出
Ａ培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５Ｈ2Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を上記実施例１の（Ａ）に示す方法にてゲノムＤＮＡを調製した。
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株ゲノムＤＮＡの抽出
Ａ培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５Ｈ2Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を上記実施例１の（Ａ）に示す方法にてゲノムＤＮＡを調製した。
（Ｂ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
ＭＪ２３３株ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、特開平１１−２０６３８５に記載の該遺伝子の塩基配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、５５℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃIおよびＳｐｈIで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨと命名した。
ＭＪ２３３株ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、特開平１１−２０６３８５に記載の該遺伝子の塩基配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、５５℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃIおよびＳｐｈIで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨと命名した。
（Ｃ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドの構築
上記（Ｂ）で作製したｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで切断することにより約０．２５ｋｂからなるラクテートデヒドロゲナーゼのコーディング領域を切り出した。残った約３．７ｋｂのＤＮＡ断片の末端をクレノウフラグメントにて平滑化し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃIおよびＳｐｈIで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたクローンを選抜し、これをｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨと
命名した。
次に、上記ｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨを制限酵素ＳａｃIおよびＳｐｈIにて切断して生じる約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収し、欠損領域を含むラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子断片を調製した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃIおよびＳｐｈIにて切断した実施例１にて構築したｐＫＭＢ１と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃIおよびＳｐｈIで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨと命名した（図２）。
上記（Ｂ）で作製したｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで切断することにより約０．２５ｋｂからなるラクテートデヒドロゲナーゼのコーディング領域を切り出した。残った約３．７ｋｂのＤＮＡ断片の末端をクレノウフラグメントにて平滑化し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃIおよびＳｐｈIで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたクローンを選抜し、これをｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨと
命名した。
次に、上記ｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨを制限酵素ＳａｃIおよびＳｐｈIにて切断して生じる約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収し、欠損領域を含むラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子断片を調製した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃIおよびＳｐｈIにて切断した実施例１にて構築したｐＫＭＢ１と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃIおよびＳｐｈIで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨと命名した（図２）。
（Ｄ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株由来ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨを用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）は、常法（Wolf H et al., J. Bacteriol. 1983, 156(3) 1165-1170、Kurusu Y et al., Agric Biol Chem. 1990, 54(2) 443-7）に従って内在性プラスミドを除去（キュアリング）し、得られたプラスミドキュアリング株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株を以後の形質転換に用いた。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株の形質転換は、電気パルス法（Res.Microbiol., Vol.144, p.181-185, 1993）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
この培地上に生育した株は、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨがブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびＳａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
次に、上記相同組み換え株をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約１０個得た。
この様にして得られた株の中には、そのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子がｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号７および配列番号８）を用いて分析すると、野生型では７２０ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では４７１ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。
上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨと命名した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨを用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）は、常法（Wolf H et al., J. Bacteriol. 1983, 156(3) 1165-1170、Kurusu Y et al., Agric Biol Chem. 1990, 54(2) 443-7）に従って内在性プラスミドを除去（キュアリング）し、得られたプラスミドキュアリング株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株を以後の形質転換に用いた。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株の形質転換は、電気パルス法（Res.Microbiol., Vol.144, p.181-185, 1993）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
この培地上に生育した株は、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨがブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびＳａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
次に、上記相同組み換え株をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約１０個得た。
この様にして得られた株の中には、そのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子がｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号７および配列番号８）を用いて分析すると、野生型では７２０ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では４７１ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。
上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨと命名した。
（Ｅ）ラクテートデヒドロゲナーゼ活性の確認
上記（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株をＡ培地に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、ナトリウム−リン酸緩衝液［組成：50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)］で洗浄した。
次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上記ナトリウム−リン酸緩衝液２ｍＬに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−ＥＳ株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性測定に供した。
ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性の確認は、両粗酵素液について、ピルビン酸を基質とした乳酸の生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ+に酸化されるのを、３４０ｎｍの吸光度変化として測定した［L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)］。反応は、５０ｍＭ カリウム−リン酸緩衝液(pH7.2)、１０ｍＭ ピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在下、３７℃にて行った。その結果、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−ＥＳ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性に対し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、１０分の１以下であった。
上記（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株をＡ培地に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、ナトリウム−リン酸緩衝液［組成：50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)］で洗浄した。
次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上記ナトリウム−リン酸緩衝液２ｍＬに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−ＥＳ株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性測定に供した。
ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性の確認は、両粗酵素液について、ピルビン酸を基質とした乳酸の生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ+に酸化されるのを、３４０ｎｍの吸光度変化として測定した［L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)］。反応は、５０ｍＭ カリウム−リン酸緩衝液(pH7.2)、１０ｍＭ ピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在下、３７℃にて行った。その結果、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−ＥＳ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性に対し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、１０分の１以下であった。
＜コリネ型細菌発現ベクターの構築＞
（Ａ）コリネ型細菌用プロモーター断片の調製
コリネ型細菌で強力なプロモーター活性を有することが報告された特開平７−９５８９１の配列番号４に記載のＤＮＡ断片（以降ＴＺ４プロモーターと称する）を利用することとした。本プロモーター断片の取得は、実施例２の（Ａ）で調製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ゲノムＤＮＡを鋳型とし、特開平７−９５８９１の配列番号４に記載の配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号９および配列番号１０）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
増幅産物の確認は、２．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．２５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１９（宝酒造）のＳｍａI部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成した６クローンについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製し、塩基配列を決定した。これ中でＴＺ４プロモーターがｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターと逆方向に転写活性を有するように挿入されたクローンを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４と命名した。
次に、ｐＵＣ／ＴＺ４を制限酵素ＢａｍＨIおよびＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡ
断片に、５’末端がリン酸化された合成ＤＮＡ（配列番号１１および配列番号１２）から成り、両末端にそれぞれＢａｍＨIとＰｓｔIに対する粘着末端を有するＤＮＡリンカーを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。本ＤＮＡリンカーには、リボソーム結合配列（ＡＧＧＡＧＧ）およびその下流に配したクローニングサイト（上流から順に、ＰａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＡｐａI）が含まれている。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤと命名した。
この様にして構築したｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤを制限酵素ＰｓｔＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することにより生じた約０．３ｋｂのプロモーター断片を、２．０％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。
（Ａ）コリネ型細菌用プロモーター断片の調製
コリネ型細菌で強力なプロモーター活性を有することが報告された特開平７−９５８９１の配列番号４に記載のＤＮＡ断片（以降ＴＺ４プロモーターと称する）を利用することとした。本プロモーター断片の取得は、実施例２の（Ａ）で調製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ゲノムＤＮＡを鋳型とし、特開平７−９５８９１の配列番号４に記載の配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号９および配列番号１０）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
増幅産物の確認は、２．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．２５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１９（宝酒造）のＳｍａI部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成した６クローンについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製し、塩基配列を決定した。これ中でＴＺ４プロモーターがｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターと逆方向に転写活性を有するように挿入されたクローンを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４と命名した。
次に、ｐＵＣ／ＴＺ４を制限酵素ＢａｍＨIおよびＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡ
断片に、５’末端がリン酸化された合成ＤＮＡ（配列番号１１および配列番号１２）から成り、両末端にそれぞれＢａｍＨIとＰｓｔIに対する粘着末端を有するＤＮＡリンカーを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。本ＤＮＡリンカーには、リボソーム結合配列（ＡＧＧＡＧＧ）およびその下流に配したクローニングサイト（上流から順に、ＰａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＡｐａI）が含まれている。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤと命名した。
この様にして構築したｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤを制限酵素ＰｓｔＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することにより生じた約０．３ｋｂのプロモーター断片を、２．０％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。
（Ｂ）コリネ型細菌発現ベクターの構築
コリネ型細菌にて安定的に自立複製可能なプラスミドとして、特開平１２―９３１８３記載のｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを利用する。本プラスミドは、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１４４株が保有する天然型プラスミドｐＢＹ５０３の複製領域および安定化機能を有する領域と大腸菌ベクターｐＨＳＧ２９８（宝酒造）に由来するカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌の複製領域を備える。ｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを制限酵素ＳｓｅＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することによって調製したＤＮＡを、上記（Ａ）で調製したＴＺ４プロモーター断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、該プラスミドをｐＴＺ４と命名した（図３に構築手順を示した）。
コリネ型細菌にて安定的に自立複製可能なプラスミドとして、特開平１２―９３１８３記載のｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを利用する。本プラスミドは、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１４４株が保有する天然型プラスミドｐＢＹ５０３の複製領域および安定化機能を有する領域と大腸菌ベクターｐＨＳＧ２９８（宝酒造）に由来するカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌の複製領域を備える。ｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを制限酵素ＳｓｅＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することによって調製したＤＮＡを、上記（Ａ）で調製したＴＺ４プロモーター断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、該プラスミドをｐＴＺ４と命名した（図３に構築手順を示した）。
＜ピルベートカルボキシラーゼ活性増強株の作製＞
（Ａ）ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得は、＜実施例２＞の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１３および配列番号１４）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で４分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を０．１μＬ加え、さらに７２℃で３０分保温した。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）
を用いて行った。
回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭ／ＭＪＰＣと命名した。
ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビックダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列を配列番号１５に記載する。本アミノ酸配列はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株由来のそれと極めて高い相同性（９９．４％）を示すことから、ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来のピルベートカルボキシラーゼ遺伝子であると断定した。
（Ａ）ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得は、＜実施例２＞の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１３および配列番号１４）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で４分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を０．１μＬ加え、さらに７２℃で３０分保温した。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）
を用いて行った。
回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭ／ＭＪＰＣと命名した。
ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビックダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列を配列番号１５に記載する。本アミノ酸配列はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株由来のそれと極めて高い相同性（９９．４％）を示すことから、ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来のピルベートカルボキシラーゼ遺伝子であると断定した。
（Ｂ）ピルベートカルボキシラーゼ活性増強用プラスミドの構築
上記（Ａ）で作製したｐＧＥＭ／ＭＪＰＣを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより生じる約３．７ｋｂからなるピルベートカルボキシラーゼ遺伝子断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。
このＤＮＡ断片を、制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩにて切断した＜実施例３＞にて構築したｐＴＺ４と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＭＪＰＣ１と命名した（図４）。
上記（Ａ）で作製したｐＧＥＭ／ＭＪＰＣを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより生じる約３．７ｋｂからなるピルベートカルボキシラーゼ遺伝子断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。
このＤＮＡ断片を、制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩにて切断した＜実施例３＞にて構築したｐＴＺ４と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＭＪＰＣ１と命名した（図４）。
（Ｃ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株内で複製可能なｐＭＪＰＣ１による形質転換用のプラスミドＤＮＡは、上記（Ｂ）で形質転換した大腸菌（ＤＨ５α株）から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Vol.144, p.181-185, 1993）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
この培地上に生育した株から、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素切断による解析を行った結果、同株がｐＭＪＰＣ１を保持していることを確認し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と命名した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株内で複製可能なｐＭＪＰＣ１による形質転換用のプラスミドＤＮＡは、上記（Ｂ）で形質転換した大腸菌（ＤＨ５α株）から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Vol.144, p.181-185, 1993）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
この培地上に生育した株から、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素切断による解析を行った結果、同株がｐＭＪＰＣ１を保持していることを確認し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と命名した。
（Ｄ）ピルベートカルボキシラーゼ酵素活性
上記（Ｃ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株をグルコース２％、カナマイシン25mg/Lを含むA培地１００ｍｌで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（pH7.5）50mlで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍｌに再度懸濁させた。懸濁液にをＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いピルベートカルボキシラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は100mM Tris/H
Cl緩衝液（pH7.5）、 0.1mg/10mlビオチン、5mM 塩化マグネシウム、50mM 炭酸水素ナトリウム、5mM ピルビン酸ナトリウム 、5mM アデノシン３リン酸ナトリウム、0.32 mM NADH、20units/1.5mlリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（WAKO製、酵母由来）及び酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。1Uは１分間に１μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とした。ピルベートカルボキシラーゼを発現させた無細胞抽出液における比活性は 0.2U/mg蛋白質であった。なお親株であるMJ233/ΔＬＤＨ株をA培地を用いて同様に培養した菌体では、本活性測定方法によりピルベートカルボキシラーゼ活性は検出されなかった。
上記（Ｃ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株をグルコース２％、カナマイシン25mg/Lを含むA培地１００ｍｌで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（pH7.5）50mlで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍｌに再度懸濁させた。懸濁液にをＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いピルベートカルボキシラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は100mM Tris/H
Cl緩衝液（pH7.5）、 0.1mg/10mlビオチン、5mM 塩化マグネシウム、50mM 炭酸水素ナトリウム、5mM ピルビン酸ナトリウム 、5mM アデノシン３リン酸ナトリウム、0.32 mM NADH、20units/1.5mlリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（WAKO製、酵母由来）及び酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。1Uは１分間に１μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とした。ピルベートカルボキシラーゼを発現させた無細胞抽出液における比活性は 0.2U/mg蛋白質であった。なお親株であるMJ233/ΔＬＤＨ株をA培地を用いて同様に培養した菌体では、本活性測定方法によりピルベートカルボキシラーゼ活性は検出されなかった。
＜大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子のクローニング＞
（Ａ）大腸菌ＤＮＡ抽出
ＬＢ培地１０ｍＬに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を上記実施例１の（Ａ）に示す方法にてゲノムＤＮＡを調製した。
（Ａ）大腸菌ＤＮＡ抽出
ＬＢ培地１０ｍＬに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を上記実施例１の（Ａ）に示す方法にてゲノムＤＮＡを調製した。
（Ｂ）大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子のクローニング
大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ０００９６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１７および配列番号１８）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製ＰＴＣ−２００を用い、９４℃で２０秒、６８℃で４分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を０．１μＬ加え、さらに７２℃で３０分保温した。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．８ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＫｐｎIで切断することにより、約３．９ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＦＲＤ６．０と命名した。
ｐＦＲＤ６．０の挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビッグダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列を配列番号１９，２０〜２３に記載する。
大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ０００９６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１７および配列番号１８）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製ＰＴＣ−２００を用い、９４℃で２０秒、６８℃で４分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を０．１μＬ加え、さらに７２℃で３０分保温した。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．８ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＫｐｎIで切断することにより、約３．９ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＦＲＤ６．０と命名した。
ｐＦＲＤ６．０の挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビッグダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列を配列番号１９，２０〜２３に記載する。
＜ピルベートカルボキシラーゼおよびフマレートレダクターゼ活性増強株の作製＞
（Ａ）ｐＭＪＰＣ１の制限酵素部位改変
実施例３にて構築したｐＭＪＰＣ１を制限酵素ＫｐｎＩにて完全に切断した後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：宝酒造）を反応させて５’末端を脱リン酸化処理して調製したＤＮＡ断片に、 ５’末端がリン酸化された合成ＤＮＡ（配列番号２４および配列番号２５）から成るＤＮＡリンカーを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡから制限酵素ＮｄｅIによって切断されるものを選抜し、これをｐＭＪＰＣ１．１と命名した。
（Ａ）ｐＭＪＰＣ１の制限酵素部位改変
実施例３にて構築したｐＭＪＰＣ１を制限酵素ＫｐｎＩにて完全に切断した後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：宝酒造）を反応させて５’末端を脱リン酸化処理して調製したＤＮＡ断片に、 ５’末端がリン酸化された合成ＤＮＡ（配列番号２４および配列番号２５）から成るＤＮＡリンカーを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡから制限酵素ＮｄｅIによって切断されるものを選抜し、これをｐＭＪＰＣ１．１と命名した。
（Ｂ）ピルベートカルボキシラーゼおよびフマレートレダクターゼ活性増強用プラスミドの構築
実施例５にて作製したｐＦＲＤ６．０を制限酵素Hind IIIで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎIで切断して生じた約３．９ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。この様にして調製した大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子を含む断片を、上記（Ａ）で作製したｐＭＪＰＣ１．１を制限酵素ＮｄｅIで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎIで切断することによって調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素Hind III消化により５０５、２１３２、２６７５、３７７５、４１９３ｂｐの断片を生じたことから、図５に示した構造に間違いがないと判断し、該プラスミドをｐＦＲＰＣ１．１と命名した。
実施例５にて作製したｐＦＲＤ６．０を制限酵素Hind IIIで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎIで切断して生じた約３．９ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。この様にして調製した大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子を含む断片を、上記（Ａ）で作製したｐＭＪＰＣ１．１を制限酵素ＮｄｅIで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎIで切断することによって調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素Hind III消化により５０５、２１３２、２６７５、３７７５、４１９３ｂｐの断片を生じたことから、図５に示した構造に間違いがないと判断し、該プラスミドをｐＦＲＰＣ１．１と命名した。
（Ｃ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換
ｐＦＲＰＣ１．１を用いたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は、実施例４の（Ｃ）に記載の方法にて行い、プラスミドｐＦＲＰＣ１．１を保持することが確認された株を得、これをブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と命名した。
ｐＦＲＰＣ１．１を用いたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は、実施例４の（Ｃ）に記載の方法にて行い、プラスミドｐＦＲＰＣ１．１を保持することが確認された株を得、これをブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と命名した。
（Ｄ）ＦＲＤ酵素活性測定
上記（Ｂ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株をグルコース２％、カナマイシン25mg/Lを含むA培地１００ｍｌで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（pH7.5）50mlで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍｌに再度懸濁させた。懸濁液をＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いフマレートリダクターゼ活性を測定した。酵素活性の測定は33mM Tris塩酸緩衝液(pH7.5)、 0.1mM EDTA、20mM コハク酸Na、2mM K3Fe(CN)6及び酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。1Uは１分間に２μmolのK3Fe(CN)6の減少を触媒する酵素量とした。プラスミドpFRPC1.1を発現させた無細胞抽出液におけるフマレートリダクターゼ比活性は0.02U/mg-蛋白質であった。なお親株であるMJ233/ΔＬＤＨ株をA培地を用いて同様に培養した菌体では、比活性は0.01U/mg-蛋白質であった。
上記（Ｂ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株をグルコース２％、カナマイシン25mg/Lを含むA培地１００ｍｌで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（pH7.5）50mlで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍｌに再度懸濁させた。懸濁液をＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いフマレートリダクターゼ活性を測定した。酵素活性の測定は33mM Tris塩酸緩衝液(pH7.5)、 0.1mM EDTA、20mM コハク酸Na、2mM K3Fe(CN)6及び酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。1Uは１分間に２μmolのK3Fe(CN)6の減少を触媒する酵素量とした。プラスミドpFRPC1.1を発現させた無細胞抽出液におけるフマレートリダクターゼ比活性は0.02U/mg-蛋白質であった。なお親株であるMJ233/ΔＬＤＨ株をA培地を用いて同様に培養した菌体では、比活性は0.01U/mg-蛋白質であった。
＜ｐＴＺ４と和合性を有するコリネ型細菌発現ベクターの構築＞
（Ａ）ストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子の導入
ｐＴＺ４と共存可能なコリネ型細菌ベクターは、ｐTZ４と和合性を示す複製領域を持つプラスミドベクターｐＣ３（Ｐｌａｓｍｉｄ ３６ ６２（１９９６）のカナマイシン耐性遺伝子をストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子に置き換えることによって構築した。
ストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子（大腸菌Ｔｎ７）の取得は、同遺伝子を有する植物形質転換用バイナリーベクターｐＬＡＮ４２１（Plant Cell Reports 10 286 (1991)）を鋳型としたPCRによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１０ng、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）
０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、（配列番号２６および配列番号２７で示した合成DNA）、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で６０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
増幅産物の確認は、０．８％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、９３７ｂｐの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、回収後同ＤＮＡ断片を、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した。
ｐＣ３を制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＮｒｕＩで切断後、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造製）により両末端を平滑化したＤＮＡ断片の末端を、上記で調製したストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて結合した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンをＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたコロニーから、液体培養後、定法によりプラスミドＤＮＡを調製し、配列番号２６および配列番号２７の合成DNA をプライマーとした上記PCRによって解析した結果、ストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されていることが確認され、これをｐＣ３と命名した。
次に、ｐＣ３を制限酵素ＢａｍＨIおよびＰｖｕIIで切断して調製したＤＮＡ断片をクレノウフラグメントにて末端を平滑化し、これにｐBglIIリンカー（宝酒造：CAGATCTG）を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたコロニーから、液体培養後、定法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素BglIIにて切断されるプラスミドを選抜し、これをｐＣ３.1と命名した。
（Ａ）ストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子の導入
ｐＴＺ４と共存可能なコリネ型細菌ベクターは、ｐTZ４と和合性を示す複製領域を持つプラスミドベクターｐＣ３（Ｐｌａｓｍｉｄ ３６ ６２（１９９６）のカナマイシン耐性遺伝子をストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子に置き換えることによって構築した。
ストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子（大腸菌Ｔｎ７）の取得は、同遺伝子を有する植物形質転換用バイナリーベクターｐＬＡＮ４２１（Plant Cell Reports 10 286 (1991)）を鋳型としたPCRによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１０ng、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）
０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、（配列番号２６および配列番号２７で示した合成DNA）、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で６０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
増幅産物の確認は、０．８％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、９３７ｂｐの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、回収後同ＤＮＡ断片を、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した。
ｐＣ３を制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＮｒｕＩで切断後、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造製）により両末端を平滑化したＤＮＡ断片の末端を、上記で調製したストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて結合した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンをＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたコロニーから、液体培養後、定法によりプラスミドＤＮＡを調製し、配列番号２６および配列番号２７の合成DNA をプライマーとした上記PCRによって解析した結果、ストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されていることが確認され、これをｐＣ３と命名した。
次に、ｐＣ３を制限酵素ＢａｍＨIおよびＰｖｕIIで切断して調製したＤＮＡ断片をクレノウフラグメントにて末端を平滑化し、これにｐBglIIリンカー（宝酒造：CAGATCTG）を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたコロニーから、液体培養後、定法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素BglIIにて切断されるプラスミドを選抜し、これをｐＣ３.1と命名した。
（Ｂ）マルチクローニングサイトの導入
大腸菌プラスミドｐＴ7Ｂｌｕｅ（Novagen社）を鋳型としてLacZマルチクローニングサイトを含むα−ペプチド遺伝子を配列番号２８および配列番号２９で示す合成DNAをプライマーとしたPCRにより調製した。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１０ng、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）
０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭ
ＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、５７７７ｂｐの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、回収後同ＤＮＡ断片を、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した。
ｐＣ３．１を制限酵素PstＩおよびHpaＩで切断後、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造製）により末端を平滑化したDNA断片を、上記で調製したα−ペプチドの遺伝子断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて結合した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬX-Galおよび５０μｇ／ｍLスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたコロニーの中から青色を呈するもの選抜し、液体培養後、定法によりプラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドDNAは、挿入したLacZマルチクローニングサイトに由来するEcoRVの切断部位を有することが確認され、これをｐＣ３.1４と命名した（図６に構築手順を示す）。
大腸菌プラスミドｐＴ7Ｂｌｕｅ（Novagen社）を鋳型としてLacZマルチクローニングサイトを含むα−ペプチド遺伝子を配列番号２８および配列番号２９で示す合成DNAをプライマーとしたPCRにより調製した。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１０ng、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）
０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭ
ＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、５７７７ｂｐの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、回収後同ＤＮＡ断片を、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した。
ｐＣ３．１を制限酵素PstＩおよびHpaＩで切断後、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造製）により末端を平滑化したDNA断片を、上記で調製したα−ペプチドの遺伝子断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて結合した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬX-Galおよび５０μｇ／ｍLスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたコロニーの中から青色を呈するもの選抜し、液体培養後、定法によりプラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドDNAは、挿入したLacZマルチクローニングサイトに由来するEcoRVの切断部位を有することが確認され、これをｐＣ３.1４と命名した（図６に構築手順を示す）。
（Ａ）ＭＤＨ遺伝子のクローニングおよびＭＤＨ増強用プラスミドの構築
プロモーター領域を含むブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得は実施例２の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号３０および配列番号３１）を用いたＰＣＲによって行った。
これら合成ＤＮＡにはそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＶまたはＳａｃＩの認識配列が含まれる。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で１分２０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの６８℃での保温は３分とした。
増幅産物はＲａｐｉｄ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍａｌｉｇｅｎ製）を用いて精製後、制限酵素ＥｃｏＲVおよびＳａｃＩで切断した。これによって生じた約１．２ｋｂのＤＮＡ断片は０．８％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで検出し、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍａｌｉｇｅｎ製）を用いてゲルから回収した。このＤＮＡ断片に実施例７に記載のプラスミドｐＣ３．１４を制限酵素ＥｃｏＲVおよびＳａｃＩで切断することによって調製したＤＮＡを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。この様にして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断することにより、約１ｋｂのＤＮＡ断片が認められたものを選抜し、これをｐＣ３−ＭＤＨと命名した（図７）。
ｐＣ３−ＭＤＨの挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビッグダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列を配列番号７に記載する。
プロモーター領域を含むブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得は実施例２の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号３０および配列番号３１）を用いたＰＣＲによって行った。
これら合成ＤＮＡにはそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＶまたはＳａｃＩの認識配列が含まれる。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で１分２０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの６８℃での保温は３分とした。
増幅産物はＲａｐｉｄ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍａｌｉｇｅｎ製）を用いて精製後、制限酵素ＥｃｏＲVおよびＳａｃＩで切断した。これによって生じた約１．２ｋｂのＤＮＡ断片は０．８％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで検出し、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍａｌｉｇｅｎ製）を用いてゲルから回収した。このＤＮＡ断片に実施例７に記載のプラスミドｐＣ３．１４を制限酵素ＥｃｏＲVおよびＳａｃＩで切断することによって調製したＤＮＡを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。この様にして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断することにより、約１ｋｂのＤＮＡ断片が認められたものを選抜し、これをｐＣ３−ＭＤＨと命名した（図７）。
ｐＣ３−ＭＤＨの挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビッグダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列を配列番号７に記載する。
（Ｂ）ＭＤＨ増強株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株の形質転換に用
いるプラスミドＤＮＡはｐＣ３−ＭＤＨを用いて形質転換した大腸菌ＭＪ１１０株から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Vol. 144, p. 181-185, 1993）によって行い、得られた形質転換体を２５μｇ／ｍＬカナマイシンおよび１０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース２０ｇ、および寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。この培地上に生育した株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＭＤＨ／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨと命名した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株の形質転換に用
いるプラスミドＤＮＡはｐＣ３−ＭＤＨを用いて形質転換した大腸菌ＭＪ１１０株から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Vol. 144, p. 181-185, 1993）によって行い、得られた形質転換体を２５μｇ／ｍＬカナマイシンおよび１０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース２０ｇ、および寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。この培地上に生育した株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＭＤＨ／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨと命名した。
（Ｃ）ＭＤＨ活性の測定
上記（Ｂ）で得られた形質転換株をグルコース２％、カナマイシン25mg/L及びストレプトマイシン10mg/Lを含むA培地１００ｍｌで終夜培養を行った。得られた培養液10mlを集菌後、５ｍＭのMgCl2を含む５０ｍＭ Hepes/NaOH緩衝液（pH7.5）10mlで２回洗浄し、4.5Mのグルセロール及び5mMのMgCl2を含む５０ｍＭ Hepes/NaOH緩衝液（pH7.5）２ｍｌに再度懸濁させた。懸濁液をバイオラプター（コスモバイオ製）で破砕し、10,000gX15分間の遠心分離を行い上清を分離した。得られた上清については更に40,000rpmX60minの超遠心分離を行い、超遠心後の上清を用いてマレートデヒドロゲナーゼ活性を測定した。
酵素活性の測定は100mM Tris/HCl緩衝液（pH7.5）、5mM MgCl2、5mM オキサル酢酸 、0. 32mM NADH、及び酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。1Uは１分間に１μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とした。
上記測定法によるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＭＤＨ／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨのMDH比活性は20.39U/mg-蛋白質であった。なお親株であるブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株をグルコース２％、カナマイシン25mg/Lを含むA培地を用いて同様に培養した菌体では、MDH活性は1.22U/mg-蛋白質であり、増強株では約１７倍にMDH活性が増加していることが確認された。
上記（Ｂ）で得られた形質転換株をグルコース２％、カナマイシン25mg/L及びストレプトマイシン10mg/Lを含むA培地１００ｍｌで終夜培養を行った。得られた培養液10mlを集菌後、５ｍＭのMgCl2を含む５０ｍＭ Hepes/NaOH緩衝液（pH7.5）10mlで２回洗浄し、4.5Mのグルセロール及び5mMのMgCl2を含む５０ｍＭ Hepes/NaOH緩衝液（pH7.5）２ｍｌに再度懸濁させた。懸濁液をバイオラプター（コスモバイオ製）で破砕し、10,000gX15分間の遠心分離を行い上清を分離した。得られた上清については更に40,000rpmX60minの超遠心分離を行い、超遠心後の上清を用いてマレートデヒドロゲナーゼ活性を測定した。
酵素活性の測定は100mM Tris/HCl緩衝液（pH7.5）、5mM MgCl2、5mM オキサル酢酸 、0. 32mM NADH、及び酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。1Uは１分間に１μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とした。
上記測定法によるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＭＤＨ／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨのMDH比活性は20.39U/mg-蛋白質であった。なお親株であるブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株をグルコース２％、カナマイシン25mg/Lを含むA培地を用いて同様に培養した菌体では、MDH活性は1.22U/mg-蛋白質であり、増強株では約１７倍にMDH活性が増加していることが確認された。
＜菌体反応（炭酸マグネシウム中和反応）＞
１００ｍＬの種培養培地（尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬ）を５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ、無菌濾過した５％カナマイシン水溶液を５０μＬ、２％ストレプトマイシン水溶液を５０μＬ添加し、実施例８（Ｂ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＭＤＨ／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を接種して２４時間３０℃にて種培養した。但し、実施例６（Ｂ）で作製した対象株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を培養する場合は、ストレプトマイシン添加は除いた。
得られた全培養液を１００００ｇ、５分の遠心分離により集菌し、菌体懸濁培地（硫酸マグネシウム・７水和物：１ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：４０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：４００μｇ、塩酸チアミン：４００μｇ、リン酸一アンモニウム：０．８ｇ、リン酸二アンモニウム：０．８ｇ、塩化カリウム：０．３ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬ）にＯＤ６６０の吸光度が８０になるように懸濁した。４ｍｌ反応器に前記の菌体懸濁液０．５ｍｌに、基質溶液（グルコース：２００ｇ、炭酸マグネシウム：１９４ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬ）０．５ｍＬを加えて、２０％炭酸ガス、８０％窒素雰囲気下、３５℃で１８時間反応させた。尚、本反応条件では、培地中のグルコースは残存していた。
反応後、上述の条件で遠心分離し、上清のコハク酸濃度を分析した結果、ブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株では、８３．４ｇ／Ｌ、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＭＤＨ／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株では、９７．６ｇ／Ｌであり、ＭＤＨの増強によってコハク酸生産性が約２割向上することが示された。
１００ｍＬの種培養培地（尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬ）を５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ、無菌濾過した５％カナマイシン水溶液を５０μＬ、２％ストレプトマイシン水溶液を５０μＬ添加し、実施例８（Ｂ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＭＤＨ／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を接種して２４時間３０℃にて種培養した。但し、実施例６（Ｂ）で作製した対象株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を培養する場合は、ストレプトマイシン添加は除いた。
得られた全培養液を１００００ｇ、５分の遠心分離により集菌し、菌体懸濁培地（硫酸マグネシウム・７水和物：１ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：４０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：４００μｇ、塩酸チアミン：４００μｇ、リン酸一アンモニウム：０．８ｇ、リン酸二アンモニウム：０．８ｇ、塩化カリウム：０．３ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬ）にＯＤ６６０の吸光度が８０になるように懸濁した。４ｍｌ反応器に前記の菌体懸濁液０．５ｍｌに、基質溶液（グルコース：２００ｇ、炭酸マグネシウム：１９４ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬ）０．５ｍＬを加えて、２０％炭酸ガス、８０％窒素雰囲気下、３５℃で１８時間反応させた。尚、本反応条件では、培地中のグルコースは残存していた。
反応後、上述の条件で遠心分離し、上清のコハク酸濃度を分析した結果、ブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株では、８３．４ｇ／Ｌ、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＭＤＨ／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株では、９７．６ｇ／Ｌであり、ＭＤＨの増強によってコハク酸生産性が約２割向上することが示された。
＜菌体反応（炭酸水素アンモニウム中和反応）＞
実施例９で示した方法に従って培養、集菌した菌体をＯＤ６６０の吸光度が４０になるようにして調製した菌体懸濁液０．５ｍｌに、基質溶液（グルコース：４０ｇ、炭酸水素アンモニウム：６３ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬ）０．５ｍＬを加えて、２０％炭酸ガス、８０％窒素雰囲気下、３５℃で３時間反応させた。尚、本反応条件では、培地中のグルコースは残存していた。
反応後、上述の条件で遠心分離し、上清のコハク酸濃度を分析した結果、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株では、１３．１ｇ／Ｌ、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＭＤＨ／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株では、１４．９ｇ／Ｌであり、炭酸マグネシウム中和と同様に、炭酸水素アンモニウム中和においてもＭＤＨの増強がコハク酸生産性向上に有効であることが示された。
実施例９で示した方法に従って培養、集菌した菌体をＯＤ６６０の吸光度が４０になるようにして調製した菌体懸濁液０．５ｍｌに、基質溶液（グルコース：４０ｇ、炭酸水素アンモニウム：６３ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬ）０．５ｍＬを加えて、２０％炭酸ガス、８０％窒素雰囲気下、３５℃で３時間反応させた。尚、本反応条件では、培地中のグルコースは残存していた。
反応後、上述の条件で遠心分離し、上清のコハク酸濃度を分析した結果、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株では、１３．１ｇ／Ｌ、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＭＤＨ／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株では、１４．９ｇ／Ｌであり、炭酸マグネシウム中和と同様に、炭酸水素アンモニウム中和においてもＭＤＨの増強がコハク酸生産性向上に有効であることが示された。
Claims (8)
- マレートデヒドロゲナーゼ活性が増強するように改変された細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させてコハク酸を生成させ、該コハク酸を回収することを特徴とするコハク酸の製造方法。
- 細菌が、コリネ型細菌、バチルス属細菌、及びリゾビウム属細菌からなる群より選ばれるいずれかの細菌である、請求項１に記載の方法。
- 前記細菌が、さらに、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が、非改変株に比べて１０％以下に低減化するように改変された細菌であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
- 前記細菌が、さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された細菌であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細菌が、さらに、フマル酸リダクターゼ活性が増強するように改変された細菌であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法
- 有機原料を嫌気的雰囲気下で作用させることを特徴する請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
- 有機原料が、グルコースである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
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