JP2006238772A - タンパク質の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】外来遺伝子を微生物等の宿主細胞で発現させ、タンパク質を生産する場合に、目的とするタンパク質を効率良く可溶化された状態で得るための新規な方法を提供すること。
【解決手段】外来遺伝子を組込んだ遺伝子組換え細胞を培養し、タンパク質を生産する方法において、該外来遺伝子発現誘導後、宿主の生育上限温度以下で宿主の生育上限温度マイナス５℃より高い温度の範囲、好ましくは宿主の生育上限温度以下で宿主の生育上限温度マイナス３℃以上の範囲、より好ましくは宿主の生育上限温度以下で宿主の生育上限温度マイナス１℃以上の範囲で培養する。
【選択図】図１
【解決手段】外来遺伝子を組込んだ遺伝子組換え細胞を培養し、タンパク質を生産する方法において、該外来遺伝子発現誘導後、宿主の生育上限温度以下で宿主の生育上限温度マイナス５℃より高い温度の範囲、好ましくは宿主の生育上限温度以下で宿主の生育上限温度マイナス３℃以上の範囲、より好ましくは宿主の生育上限温度以下で宿主の生育上限温度マイナス１℃以上の範囲で培養する。
【選択図】図１
Description
本発明は、タンパク質を製造する方法に関する。
タンパク質を製造する際、目的のタンパク質をコードする遺伝子を組込んだ発現ベクターを宿主細胞に導入して作製した遺伝子組換え細胞を用いて、タンパク質を大量に生産させる遺伝子組換え技術が発展してきた。特に、目的のタンパク質を大量に生産させ、かつ容易に回収するために、大腸菌、酵母、枯草菌、放線菌、及びカビ等の微生物を用いた発現系が利用されている。
しかし、微生物を用いた発現系で異種タンパク質を発現させると、目的のタンパク質は、その大部分もしくはそのすべてがインクルージョンボディ（inclusion body）と呼ばれる顆粒状の不溶性タンパク質として蓄積されることが多い。そこで、この不溶性のタンパク質を、活性のある可溶化された状態で単離できる方法が望まれている。
例えば、遺伝子組換え菌で製造され菌体中に不溶性塊として蓄積された不溶性ヒダントイナーゼを２−メルカプトエタノールや尿素を加えて可溶化した後、Ｍｎイオン共存下に活性化を行うことを特徴とする、遺伝子組換え菌で製造された不溶性ヒダントイナーゼの活性化方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
また、システイン含有タンパク質に変性剤および還元剤を加えて還元変性状態にして可溶化した後、還元剤を除去し、変性状態のまま酸化させて天然型のタンパク質のジスルフィド結合に相当する位置にジスルフィド結合を形成させ、変性剤を除去することによって本来の構造を復元させたタンパク質を分離精製する、タンパク質の復元方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。
これらのように本来の生理活性を有さない形態（三次構造）に折り畳まれている、顆粒状の不活性な不溶性タンパク質から、生理活性を有する目的のタンパク質を得るためには、塩酸グアニジンや尿素等の変性剤及びβ−メルカプトエタノール、システイン、グルタチオン等の還元剤を用いた変性溶液中で、その顆粒を処理（脱折り畳み）し、その顆粒中のポリペプチドを解きほぐした後、活性型のコンフォメーションを再形成させる処理（リフォールディング）を行う必要があった。
このような顆粒状の不溶性タンパク質を脱折り畳みし、その後リフォールディングする方法は、条件検討に多大な労力を必要とするだけでなく、透析、ゲルろ過等により、変性剤を除去する必要がある等、操作が煩雑であり、しかも再生効率が極めて低い場合もあった。
一方、外来遺伝子を誘導発現可能に導入した宿主を培養し、タンパク質を生産する方法において、誘導生長期に１２〜２５℃程度、好ましくは２１〜２５℃の低温で該外来遺伝子発現誘導をかけることで、効率良く目的とするタンパク質を可溶化し、活性のある状態で得る方法が開示されている（例えば、特許文献３参照）。
特開平６−３０７７２号公報
特許第２６６９８５９号公報
特開２００４−２４２４３号公報
本発明は、外来遺伝子を微生物等の宿主細胞で発現させ、タンパク質を生産する場合に、目的とするタンパク質を効率良く可溶化された状態で得る新規な方法を提供することを目的としてなされた。
本発明者らは、好熱菌由来のトランスアミナーゼ遺伝子を有する発現ベクターを導入した大腸菌を培養し、トランスアミナーゼを生産する際、トランスアミナーゼ遺伝子発現誘導後、大腸菌を４６℃で培養することにより、不溶性タンパク質を効率よく活性のある状態で回収することができることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
本発明は、以下によって構成される。
（１）外来遺伝子を導入した宿主細胞を培養し、該外来遺伝子がコードするタンパク質を生産する方法において、該外来遺伝子発現誘導後、該宿主細胞の生育上限温度以下で、宿主の生育上限温度マイナス５℃より高い温度の範囲で培養することを特徴とするタンパク質の製造方法。
（２）宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする（１）に記載の製造方法。
（３）外来遺伝子を導入した大腸菌を培養し、該外来遺伝子がコードするタンパク質を生産する方法において、該外来遺伝子発現誘導後、４２℃より高く、４７℃以下で培養することを特徴とするタンパク質の製造方法。
（４）前記外来遺伝子が好熱菌由来であることを特徴とする（３）に記載の製造方法。
なお、本明細書において、好熱菌とは、生育最適温度が５０℃以上であり、４０℃以下ではほとんど増殖しない微生物をいう。このうち、生育最適温度が５０〜７０℃である微生物を中等度好熱菌、７０℃以上である微生物を高度好熱菌、さらにそのうち、生育最適温度が８０℃以上である微生物を超好熱菌という。また、中温菌とは、生育温度が通常の温度環境にある微生物のことであり、特に生育最適温度が２０〜４０℃である微生物をいう。低温菌とは、生育最適温度が２０℃以下である微生物をいう。
本発明によって、外来遺伝子を微生物等の宿主細胞で発現させ、タンパク質を生産する場合に、目的とするタンパク質を効率良く可溶化された状態で得る新規な方法を提供することが可能になった。
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
本発明は、外来遺伝子を導入した宿主細胞を培養し、タンパク質を生産する方法において、該外来遺伝子発現誘導後、該宿主細胞の生育上限温度以下で、宿主の生育上限温度マイナス５℃より高い温度の範囲で培養することを特徴とするタンパク質の製造方法である。
この方法において、宿主細胞は特に限定されず、様々な真核細胞や原核細胞から適宜選択することができる。特に、誘導剤で発現誘導できる少なくとも一つのプロモーターによって、目的タンパク質の発現が調節されるシステムを有する宿主細胞が好ましい。大腸菌、バチルス属の細菌、及び酵母は、特に好ましい宿主であり、なかでも大腸菌は、培養が容易であり、ゲノム情報が公知であり、菌株の特性がよく知られており、組換え体のタンパク発現量が多く、様々な宿主-ベクター系があることなどの点から、宿主として特に好ましい。
外来遺伝子及びそれがコードするタンパク質に関しては、例えば、超好熱菌、高度好熱菌及び中等度好熱菌等の好熱菌、中温菌、低温菌由来の遺伝子があげられるが、特に限定するものではなく、本発明はどのような遺伝子及びタンパク質に対しても適用しうる。
本発明のタンパク質の製造方法は、発現誘導後の培養温度が宿主生育上限温度付近であることから、宿主として大腸菌、枯草菌及び酵母等の中温菌を用いる場合には、外来遺伝子の由来として、超好熱菌、高度好熱菌及び中等度好熱菌等の好熱菌、及び中温菌が好ましく、超好熱菌、高度好熱菌及び中等度好熱菌等の好熱菌がさらに好ましい。
目的のタンパク質をコードする外来遺伝子を組込んだ発現ベクターは、特に制限されず、公知のものを使用することができる。例えば、ｐＥＴ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系等の大腸菌由来のプラスミド、ｐＵＢ１１０系、ｐＣ１９４系等の枯草菌由来のプラスミド、ｐＰＩＣ６やｐＡＵＲ１２３ＤＮＡ等の酵母由来のプラスミド、アデノウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター等に外来遺伝子発現用の各種プロモーターを組み込んだベクターをあげることができる。
これらの発現ベクターは、必要に応じて、選択マーカー、シャペロニンなどの共発現させるタンパク質をコードする遺伝子を含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を例示することができる。
外来遺伝子を発現ベクターに組み込む方法は特に制限されず、公知の方法を使用することができる。例えば、上記の外来遺伝子を制限酵素で切断し、同種の制限酵素で切断した発現ベクターに挿入して結合させる方法等をあげることができる。外来遺伝子の種類、発現ベクターの種類等に応じて最適な手法を選択することができる。
発現ベクターを宿主細胞へ導入する方法は限定されず、宿主細胞の種類、用いるベクターの種類等に応じて、適宜選択することができる。例えば、エレクトロポレーション法、ヒートショック法等を挙げることができる。
以上のような構成を有する発現系において、以下のような方法で、目的のタンパク質を発現させる。
まず、目的のタンパク質をコードした外来遺伝子を有する発現ベクターを導入した遺伝子組換え細胞を培養する。遺伝子組換え細胞を培養する培地は特に制限されず、用いる宿主によって適宜選択される。本方法では遺伝子組換え細胞に対して培養時に発現誘導をかけることが必要であるが、発現誘導をかける時期としては、例えば大腸菌を宿主に用いた場合、培養時の細胞濃度が６６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６６０）で０．０５から３．０のとき、好ましくは０．５０から１．０の時が適している。
誘導剤としては、公知のものを使用することができ、プロモーターの種類や宿主細胞の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、宿主が大腸菌の場合、trpプロモーターに対してはＩＡ（３−β−インドールアクリル酸）の添加が、lacプロモーター、tacプロモーターに対してはＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）等の添加が有効である。また、宿主が酵母の場合、AOX1プロモーター、AUGプロモーターに対してはメタノール等の添加が有効である。
発現誘導後、遺伝子組換え細胞は、宿主の生育上限温度以下で、宿主の生育上限温度マイナス５℃より高い温度範囲、好ましくは宿主の生育上限温度以下で、宿主の生育上限温度マイナス３℃以上の温度範囲、より好ましくは宿主の生育上限温度以下で、宿主の生育上限温度マイナス１℃以上の温度範囲で培養する。例えば生育上限温度が４７℃の大腸菌の場合、４２℃〜４７℃の温度範囲、好ましくは４４℃〜４７℃の温度範囲、より好ましくは４６℃〜４７℃の温度範囲で培養する。このような条件下で宿主細胞を増殖させることによって、効率良く目的とするタンパク質を活性のある状態で得ることができるのである。
発現させた目的のタンパク質は、公知の方法により単離、精製することができる。例えば超音波、ホモジナイザー等で細胞破砕後、遠心分離等により細胞を除去し、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等により単離、精製することができる。また、目的タンパク質にHisタグ、GSTタグ、Flagタグ等のタグを付加した場合は、それぞれNiカラム等の適切なカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、単離、精製することができる。あるいは目的によっては、培養液や細胞破砕液をそのまま用いてもよい。
以下、実施例によって更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞
１．外来遺伝子を組込んだ遺伝子組換え細胞の作成方法
外来遺伝子としては、超好熱菌エアロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＡＰＥ２２４８）を用いた。 超好熱菌エアロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）は京都大学らが平成５年６月、鹿児島県十島村・小宝島の浅海底熱水噴出域から採取した好気性の超好熱菌であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構がゲノム情報を公開している。
１．外来遺伝子を組込んだ遺伝子組換え細胞の作成方法
外来遺伝子としては、超好熱菌エアロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＡＰＥ２２４８）を用いた。 超好熱菌エアロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）は京都大学らが平成５年６月、鹿児島県十島村・小宝島の浅海底熱水噴出域から採取した好気性の超好熱菌であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構がゲノム情報を公開している。
まず、配列番号１に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡを、エアロパイラム・ペルニクスのゲノムからＰＣＲ反応で増幅した。ＰＣＲ反応のためのプライマーには配列番号２および３に示すものを用いた。ＰＣＲ反応は、KOD plus polymerase（東洋紡績株式会社製）を用い、同酵素のプロトコールに従った。反応終了後、GFX PCR and Gel Band Purification Kit（Amercham製）を用いて、キットのプロトコールに従い、増幅したＤＮＡ断片を精製し、5μg/μlのＤＮＡ溶液を得た。
次に、制限酵素EcoRI 1μl、NdeI 1μl、10×H Buffer 5μl（以上、タカラバイオ株式会社製）及び上記で得たＤＮＡ溶液43μlを混合し、３７℃で、一晩酵素消化を行った。
一方、pET21a(+)（0.5μg/μl）（Novagen製）2μl、EcoRI 1μl、NdeI 1μl及び10×H Buffer 5μl（以上、タカラバイオ株式会社製）を混合し、３７℃で、一晩酵素消化を行った。こうして得られた制限酵素消化したゲノムＤＮＡ及びプラスミドをアガロース電気泳動で精製し、GFX PCR and Gel Band Purification Kit (Amercham製)を用いてゲルから回収したＤＮＡをDNA Ligation Kit ver.2（タカラバイオ株式会社製）を用いて、キットのプロトコールに従って結合し、得られた組換えプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株をエレクトロポレーション法により形質転換した。
形質転換したコンピテントセルを50μg/mlアンピシリンを含むＬＢ平板寒天培地（１Ｌ中にトリプトン 10g、酵母エキス 5g、ＮａＣｌ 10gを含む）に播種し、３７℃で、一晩培養した。寒天培地上に形成されたシングルコロニーの中から、コロニーを無作為にいくつか選択し、選択した各コロニーを直接反応溶液に懸濁し、コロニーダイレクトＰＣＲを行うことで目的の断片をもつクローンのスクリーニングを行った。コロニーダイレクトＰＣＲは以下の反応液を調整し、水を加えて、全量50μlとした。
Ex Taqポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製） 0.5μl
緩衝液（10×Ex Taq Buffer、タカラバイオ株式会社製） 5μl
ｄＮＴＰ（各2.5mM、タカラバイオ株式会社製） 4μl
配列番号４のプライマーＤＮＡ（１００ ｐｍｏｌ／μｌ） 0.5μl
配列番号５のプライマーＤＮＡ（１００ ｐｍｏｌ／μｌ） 0.5μl
各コロニー中の大腸菌 微量
Ex Taqポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製） 0.5μl
緩衝液（10×Ex Taq Buffer、タカラバイオ株式会社製） 5μl
ｄＮＴＰ（各2.5mM、タカラバイオ株式会社製） 4μl
配列番号４のプライマーＤＮＡ（１００ ｐｍｏｌ／μｌ） 0.5μl
配列番号５のプライマーＤＮＡ（１００ ｐｍｏｌ／μｌ） 0.5μl
各コロニー中の大腸菌 微量
市販の温度サイクリング装置（RoboCycler、STRATAGENE社製）を用いて９４℃、で３分恒温後、〔９４℃、６０秒−５６℃、６０秒−７２℃、１４０秒〕のサイクルを２５回繰り返した。反応終了後、１％アガロース電気泳動により、目的の断片の増幅が行われていることを確認し、陽性コロニーから、目的のトランスアミナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドを調製した。組換えプラスミドに含まれる目的のＤＮＡ断片は、塩基配列を決定し、ＤＮＡ配列に誤りがないことを確認した。
こうして得られた組換えプラスミドを用いて、Rosetta（ＤＥ３）株の形質転換を行った。形質転換した大腸菌は、50μg/mlのアンピシリンと34μg/mlのクロラムフェニコールを含むＬＢ平板寒天培地に植菌し、３７℃で培養した。
２．タンパク質の発現誘導
１．で得られた組換え大腸菌は、50μg/mlアンピシリンと34μg/mlのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地５ｍｌに植菌し、一晩３７℃で前培養した。次に、50μg/mlアンピシリンと34μg/mlのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地5mlに、前培養した菌液50μlを植菌し、３７℃でＯＤ６６０が１．０になるまで本培養した。
１．で得られた組換え大腸菌は、50μg/mlアンピシリンと34μg/mlのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地５ｍｌに植菌し、一晩３７℃で前培養した。次に、50μg/mlアンピシリンと34μg/mlのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地5mlに、前培養した菌液50μlを植菌し、３７℃でＯＤ６６０が１．０になるまで本培養した。
ここにＩＰＴＧを終濃度1mMになるように添加し、各温度（１５℃、２５℃、３７℃、４３℃〔生育上限温度マイナス４℃に対応〕、４６℃〔生育上限温度マイナス１℃に対応〕）で１時間、３時間、５時間、７時間、９時間、２０時間、３０時間、及び４４時間、誘導培養した。培養後、菌液3mlを集菌し、20mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）で洗菌し、1mMのピリドキサールリン酸を含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）に懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕後遠心分離し、上清を無細胞抽出液とした。この無細胞抽出液を８０℃で３０分熱処理することにより大腸菌由来のアミノトランスフェラーゼを失活させ、遠心して不溶物を除き、上清を粗酵素液とした。
３．酵素活性の確認方法
30mMのＬ−フェニルアラニン、60mMの２−オキソグルタル酸、0.5mMのピリドキサールリン酸、100mMのリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）及び上記粗酵素液50μlを含む反応液200μlを用い８０℃で３０分間反応後、３０％トリクロロ酢酸水溶液50μlを加えて反応を停止した。反応系中に生成したグルタミン酸は、Ｍａｒｆｅｙ‘ｓ試薬を用いて誘導体化し、ＨＰＬＣで定量した。
酵素活性の測定結果を図１に示した。
30mMのＬ−フェニルアラニン、60mMの２−オキソグルタル酸、0.5mMのピリドキサールリン酸、100mMのリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）及び上記粗酵素液50μlを含む反応液200μlを用い８０℃で３０分間反応後、３０％トリクロロ酢酸水溶液50μlを加えて反応を停止した。反応系中に生成したグルタミン酸は、Ｍａｒｆｅｙ‘ｓ試薬を用いて誘導体化し、ＨＰＬＣで定量した。
酵素活性の測定結果を図１に示した。
４．電気泳動
誘導温度が１５℃、２５℃、３７℃、４６℃の各場合で、誘導培養時間が２０時間のサンプルにつき、粗酵素液を等量のサンプル緩衝液（0.1Mトリス塩酸（pH6.8）、４％ＳＤＳ、１２％βメルカプトエタノール、２０％グリセロール、ここに微量のブロモフェノールブルーを含む）と混合し、含まれる可溶タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した。また、超音波破砕後の沈殿物を２倍に希釈したサンプル緩衝液に懸濁し、不溶性タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した。
電気泳動の結果を図２に示す。
誘導温度が１５℃、２５℃、３７℃、４６℃の各場合で、誘導培養時間が２０時間のサンプルにつき、粗酵素液を等量のサンプル緩衝液（0.1Mトリス塩酸（pH6.8）、４％ＳＤＳ、１２％βメルカプトエタノール、２０％グリセロール、ここに微量のブロモフェノールブルーを含む）と混合し、含まれる可溶タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した。また、超音波破砕後の沈殿物を２倍に希釈したサンプル緩衝液に懸濁し、不溶性タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した。
電気泳動の結果を図２に示す。
＜実施例２＞
外来遺伝子として、超好熱菌パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｉｉ）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＰＨ１４２３）を用いた他は、実施例１に準じて組替え大腸菌を得、タンパク質を発現誘導し、粗酵素液を得た。ここで用いたＰＨ１４２３のヌクレオチド配列を配列番号６に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号７および８に示した。なお、ここで用いたＰＨ１４２３のヌクレオチド配列を配列番号６に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号７および８に示した。パイロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikosii）ＯＴ３は、潜水艇「しんかい 2000」を用いた「DeepStar計画」によって沖縄海溝内の熱水鉱床付近から単離された嫌気性の超好熱細菌であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構がゲノム情報を公開している。
外来遺伝子として、超好熱菌パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｉｉ）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＰＨ１４２３）を用いた他は、実施例１に準じて組替え大腸菌を得、タンパク質を発現誘導し、粗酵素液を得た。ここで用いたＰＨ１４２３のヌクレオチド配列を配列番号６に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号７および８に示した。なお、ここで用いたＰＨ１４２３のヌクレオチド配列を配列番号６に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号７および８に示した。パイロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikosii）ＯＴ３は、潜水艇「しんかい 2000」を用いた「DeepStar計画」によって沖縄海溝内の熱水鉱床付近から単離された嫌気性の超好熱細菌であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構がゲノム情報を公開している。
40mMのＬ−オルニチン、60mMの２−オキソグルタル酸、0.5mMのピリドキサールリン酸、100mMのリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）及び上記粗酵素液10μlを含む反応液20μlを用い、８０℃で１０分間反応後、３０％トリクロロ酢酸水溶液50μlを加えて反応を停止させ、実施例１と同様にして酵素活性を測定した。酵素活性の測定結果を図３に示した。
また、実施例１と同様の手法で可溶タンパク質、及び不溶タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した。電気泳動の結果を図４に示した。
＜実施例３＞
外来遺伝子として、超好熱菌エアロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＡＰＥ０４５７）を用いた他は、実施例１に準じて組替え大腸菌を得、タンパク質を発現誘導し、粗酵素液を得た。ここで用いたトランスアミナーゼ遺伝子（ＡＰＥ０４５７）のヌクレオチド配列を配列番号９に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号１０および１１に示す。
外来遺伝子として、超好熱菌エアロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＡＰＥ０４５７）を用いた他は、実施例１に準じて組替え大腸菌を得、タンパク質を発現誘導し、粗酵素液を得た。ここで用いたトランスアミナーゼ遺伝子（ＡＰＥ０４５７）のヌクレオチド配列を配列番号９に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号１０および１１に示す。
実施例２と同様の手法で酵素活性を測定した。酵素活性の測定結果を図５に示す。
また、実施例１と同様の手法で可溶タンパク質、及び不溶タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した。電気泳動の結果を図６に示す。
＜実施例４＞
外来遺伝子として、超好熱菌スルホロバス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＳＴ１２２５）を用いた他は、実施例１に準じて組替え大腸菌を得、タンパク質を発現誘導し、粗酵素液を得た。ここで用いたＳＴ１２２５のヌクレオチド配列を配列番号１２に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号１３および１４に示した。なお、スルホロバス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）は大分県別府温泉から採取された、単独で硫化水素を分解する特徴を有した好気性、好酸性の好熱菌であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構がゲノム情報を公開している。
外来遺伝子として、超好熱菌スルホロバス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）のトランスアミナーゼ遺伝子（ＳＴ１２２５）を用いた他は、実施例１に準じて組替え大腸菌を得、タンパク質を発現誘導し、粗酵素液を得た。ここで用いたＳＴ１２２５のヌクレオチド配列を配列番号１２に、ＰＣＲ反応のためのプライマーを配列番号１３および１４に示した。なお、スルホロバス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）は大分県別府温泉から採取された、単独で硫化水素を分解する特徴を有した好気性、好酸性の好熱菌であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構がゲノム情報を公開している。
実施例１と同様の手法で酵素活性を測定した。酵素活性の測定結果を図７に示す。
また、実施例１と同様の手法で可溶タンパク質、及び不溶タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した。電気泳動の結果を図８に示した。
＜結果及び考察＞
図１、３、５及び７より、誘導培養温度を１５℃、２５℃または３７℃とした場合に比べ、本出願の方法では、酵素活性が著しく上昇していることがわかる。
図１、３、５及び７より、誘導培養温度を１５℃、２５℃または３７℃とした場合に比べ、本出願の方法では、酵素活性が著しく上昇していることがわかる。
全ての実施例において、コントロールである、誘導培養温度が１５℃、２５℃または３７℃の場合と比較して、誘導培養温度４６℃では、５倍から１０倍の活性を示すことがわかった。また、図７に示すように、発現させるタンパク質によっては、誘導培養温度４３℃において、１５℃、２５℃または３７℃のときと比較して、３倍から４倍の活性を示すことがわかった。
また、全ての実施例において、１５℃、及び２５℃で誘導培養したものは、可溶タンパク質、不溶タンパク質ともにごくわずかしか認められず、３７℃で誘導培養したものは、可溶タンパク質がわずかしか認められず、不溶タンパク質が多量に認められたのに対し、４６℃で誘導培養したものは、可溶タンパク質のバンドがはっきりと認められ、不溶タンパク質は比較的少ないことが確認できた。
以上より、本出願の方法を用いると、目的のタンパク質をその活性を保ったまま可溶化できることが示された。
Claims (4)
- 外来遺伝子を導入した宿主細胞を培養し、該外来遺伝子がコードするタンパク質を生産する方法において、該外来遺伝子発現誘導後、該宿主細胞の生育上限温度以下で、宿主の生育上限温度マイナス５℃より高い温度の範囲で培養することを特徴とするタンパク質の製造方法。
- 宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
- 外来遺伝子を導入した大腸菌を培養し、該外来遺伝子がコードするタンパク質を生産する方法において、該外来遺伝子発現誘導後、４２℃より高く、４７℃以下で培養することを特徴とするタンパク質の製造方法。
- 前記外来遺伝子が好熱菌由来であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
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