JP2006208369A - 化合物の結晶化過程のモニター方法および結晶の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】結晶化過程、特に結晶核形成過程および結晶成長過程を経時的にモニターできる方法を提供し、合わせて、当該方法によって得られる知見をもとに、製造等に適した粒度を有する結晶の製造方法を提供する。
【解決手段】本発明の化合物の結晶化過程のモニター方法は、固体^１３Ｃ−ＮＭＲを用いて行うものであり、具体的には、化合物を融点以上に加熱して溶融状態とした後から一定の温度で保存して結晶化に至るまでの間、化合物の分子構造を構成する炭素原子由来の各部位のシグナル強度がどのように変化するかを、固体^１３Ｃ−ＮＭＲを用いて追跡することにより行われる。
【選択図】図１

Description

本発明は、化合物、特に低分子有機化合物の結晶化過程、特に結晶核形成過程および結晶成長過程を経時的にモニターする方法に関する。また、本発明は、結晶粒度の制御方法および粒度が制御された結晶の製造方法に関する。

医薬品原体等の化合物、特に低分子有機化合物の製造において晶出によって化合物を精製する際には、得られる結晶のろ過のし易さや取扱いを考慮して、製造に適した粒度（粒子径分布）を有する結晶を晶出させる必要がある。また、医薬品においては結晶の粒度が体内動態や薬効にも影響するため粉砕によって粒度を調整する場合が多いが、粉砕効率を向上させるためにも晶出によって得られる結晶の粒度を制御することが重要である。

従来、結晶の晶出過程においては、使用溶媒の種類を変えると同時に、温度変化や溶媒のｐＨを制御することにより、晶出される結晶の粒度調整を行っている。また、晶出させる結晶の粒子径の調整については、比較的高温で晶出させてその温度である程度の時間保つとか、ある温度条件下でゆっくり晶出させることによって結晶を成長させ、十分時間を置いてから、貧溶媒を滴下する等の手段で晶出させる場合もある。しかしながら、このような従来の結晶の粒子径調整は、科学的に証明された事実に裏付けされた条件設定ではなく、経験的な手法に頼っており、最適条件を設定できているとは言い難い。

晶出の際の粒度を制御するためには、結晶が成長する機構を詳細に把握する必要があり、特に結晶の粒度は結晶核形成およびそれに続く結晶成長が深く関与しているため、結晶核形成および結晶成長に関する知見、特にその分子構造レベルの解析ができれば、経験的な手法に頼ることなく、適した粒度の結晶を得るための最適な晶出条件を得ることができると考えられる。

従来、結晶形の確認法あるいは結晶の解析方法として主に、固体ＮＭＲ、粉末Ｘ線回折、熱分析、近赤外分光、赤外分光、ラマン分光測定が行なわれており、これらの手法は、結晶形の存在の有無や結晶化の程度および結晶多形を測定する目的で汎用されている。

例えばReneらの文献(非特許文献１)にはCarbamazepineの結晶多形につき、粉末Ｘ線回折を使用した結晶解析技術が開示されている。また、戸塚らの報告(非特許文献２)には、測定試料にSalicylamideを用いた、ＤＳＣ熱分析法による結晶や無晶形の状態解析技術が開示されているが、得られた結晶形を解析するものであり、結晶成長過程を捉えたものではない。また、これら結晶解析にＸ線を照射した際に得られる散乱Ｘ線を検出する粉末Ｘ線回折や、試料を加熱した際の熱量変化を測定する熱分析は、分子全体の動的変化を捉える測定法であり、分子構造に関する知見は得られ難い。

また例えば、Brittainの文献(非特許文献３)には、赤外分光法を用いた結晶多形や溶媒和物の測定手法が開示されているが、これも結晶成長過程を捉えたものではない。分光法による測定においては、赤外線やラマン光を試料に照射した際に吸収される度合いを各波数について測定する方法であり、化学構造や結晶形の程度や違いをある程度検出する能力を有した方法であるが、結晶状態で存在する分子を部分構造レベルで明確に議論するのは難しい。

結晶核形成および結晶成長に関して、例えば大塚らの文献(非特許文献４)には、粉末Ｘ線回折を用いたIndomethacinの無晶化状態からの結晶化に関する速度論的研究が開示されているが、結晶核形成と結晶成長を区別して解析したものではない。

また、Martiniらの文献(非特許文献５)においては、乳脂肪とひまわり油のブレンド油の結晶成長過程を粉末Ｘ線回析像、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）または顕微鏡でモニタリングしているが、結晶化に影響を及ぼす分子構造、外的要因に関する記載もない。

一方、固体ＮＭＲは、他のいずれの方法よりも分子の部分構造に起因するシグナルを独立して得られるため、分子構造を構成する官能基や芳香環といった部位毎について、結晶間における状態の違いを捉えることが可能である。例えば、Apperleyらの報告（非特許文献６）では、Sulfathiazoleの結晶多形の固体ＮＭＲ測定を実施し、構造の帰属を明らかにした情報を開示している。しかし、この文献は、結晶化過程の経時的挙動を捕らえたものではない。

また、Henckらの報告(非特許文献７)では、ベンゾカインとピクリン酸の複合体における結晶多形の状態解析が固体ＮＭＲを使用してなされているが、結晶化過程やその速度論的な考察は記載されていない。
また、非特許文献８には、hectoriteの結晶化について固相^１３Ｃ−ＮＭＲでモニターしていることが記載されているが、速度論的な考察はなされていない。非特許文献９は、ポリマーの溶解について^１３ＣＰ／ＭＡＳ ＮＭＲを用いてモニターしていることが記載されているが、速度論的な考察はなされていない。非特許文献１０は、ゼオライトアナログの結晶化過程における組成・構造情報を得るために^１３ＣＰ／ＭＡＳ ＮＭＲを用いることが記載されているが、速度論的な考察はなされていない。また、これら非特許文献８〜１０は、医薬品などで一般に使用される低分子有機化合物とその結晶化機構が大きく異なる鉱物または高分子での検討である。

以上のように、結晶形の確認法あるいは結晶の解析方法については種々の文献が知られているが、これらの文献にも結晶核形成および結晶成長の過程を構造特異的に追跡できるとしたものはない。
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本発明の目的は、結晶化過程、特に結晶核形成過程および結晶成長過程を経時的にモニターできる方法を提供し、合わせて、当該方法によって得られる知見をもとに、製造等に適した粒度を有する結晶の製造方法を提供することである。

本発明者等は、上記目的を達成するため鋭意検討を行った。その結果、固体^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルによって結晶化する過程を経時的にモニターし、化合物、特に低分子有機化合物の分子構造を構成する官能基や芳香環といった部位毎に由来するシグナル強度の経時的変化を追跡し詳細に解析することにより、結晶核形成過程および結晶成長過程を明確に区別して把握することができることを見出した。さらに詳細に検討を重ねた結果、結晶核形成過程および結晶成長過程が温度によって影響を受け、温度を制御することにより結晶核の数および粒子径を制御し得ること、即ち、製造に適した粒度を有する結晶を製造し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の通りである。

［１］化合物の溶融状態から結晶化に至る間の、固体^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルのシグナル強度の経時的変化の速度定数を解析する、化合物の結晶化過程のモニター方法。
［２］結晶化過程が、結晶核形成過程である、上記［１］記載のモニター方法。
［３］低極性基由来のシグナル強度を追跡する、上記［２］記載のモニター方法。
［４］結晶化過程が、結晶成長過程である、上記［１］記載のモニター方法。
［５］極性基および低極性基由来のシグナル強度を追跡する、上記［４］記載のモニター方法。
［６］化合物の溶融状態から結晶化に至る間のシグナル強度の経時的変化の速度定数を解析して、化合物の結晶化過程をモニターするための固体^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル測定装置の使用。
［７］結晶化過程が、結晶核形成過程である、上記［６］記載の使用。
［８］低極性基由来のシグナル強度を追跡する、上記［７］記載の使用。
［９］結晶化過程が、結晶成長過程である、上記［６］のいずれかに記載の使用。
［１０］極性基および低極性基由来のシグナル強度を追跡する、上記［９］記載の使用。
［１１］化合物を溶融させた後、当該化合物を、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法にてモニターしたときに、結晶核形成に起因するシグナル強度変化の速度成分が認められる温度範囲内に制御することを特徴とする、結晶核数の制御方法。
［１２］化合物を溶融させた後、当該化合物を、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法にてモニターしたときに、結晶核形成に起因するシグナル強度変化の速度成分が認められる温度範囲内に制御することを特徴とする、結晶粒度の制御方法。
［１３］化合物を溶融させた後、当該化合物を、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法にてモニターしたときに、結晶核形成に起因するシグナル強度変化の速度成分が認められる温度範囲内に制御することを特徴とする、粒度が制御された結晶の製造方法。
［１４］温度が、化合物のガラス転移温度＋５０℃以下である、上記［１１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］π−π相互作用および／またはファンデルワールス相互作用を利用した結晶核形成により結晶晶出させることを特徴とする上記［１３］記載の製造方法。
［１６］化合物を溶融させた後、当該化合物を、化合物のガラス転移温度＋５０℃以下で結晶化させることを特徴とする、結晶の製造方法。
［１７］上記［１１］〜［１６］のいずれかの方法により製造されることを特徴とする、結晶。

固体^１３Ｃ−ＮＭＲを用いて結晶化過程の各シグナル強度の経時的変化を詳細に解析することにより、結晶核形成に起因する情報が化合物の部分構造単位で得られることから、化合物のどの部位の相互作用により結晶核が得られるかが明確に判るようになった。

即ち、結晶核形成に寄与しているのは、分子内の分極した部位で発生が予想されるイオン−双極子相互作用や水素結合といった強い相互作用ではなく、π−π相互作用やファンデルワールス力相互作用といった分子内の比較的弱い相互作用であり、また、結晶成長には、両方の相互作用が寄与していることが明らかとなった。

このように、本発明によれば、固体^１３Ｃ−ＮＭＲで結晶化過程をモニターすることにより、結晶核形成過程とそれに続く結晶成長過程を明確に区別して解析することができるようになった。

さらに結晶化の温度を変化させて固体^１３Ｃ−ＮＭＲによる解析を行なったところ、比較的低い温度条件では、結晶核形成過程が長く、結晶核形成が優位に作用して結晶核の形成が促進され、結晶核数が多く形成する結果、粒子径の小さな結晶が得られ、一方、比較的高い温度条件では、結晶核形成過程が短く、結晶成長が優位に作用して、結晶核数が少なくなり、粒子径の大きな結晶が得られることが明確に判った。このような知見により、結晶核形成過程の温度を制御することにより、製造に適した粒子径を有する結晶を製造することができる方法を提供することができた。

本発明の化合物の結晶化過程のモニター方法は、固体^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（以下、固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルと略すこともある。）を用いて行うことを特徴とする。

本発明に用いられる固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、自体公知の固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルが測定可能な装置を特に制限なく用いることができ、市販の該測定装置としては、例えば、ブルカー・バイオスピン社製ＡＶＡＮＣＥシリーズ、日本電子製ＪＮＭ−ＣＭＸＰシリーズ、バリアン社製ＵＮＩＴＹ ＩＮＯＶＡシリーズなどが挙げられる。

本発明の方法の対象となる化合物は、特に限定されるものではなく、既に結晶として得られている化合物はもちろん、未だ結晶として得られていない、非晶質のアモルファス、油状の化合物をも包含する。また、既知化合物のみではなく、将来合成されるであろう新規化合物も含まれる。当該化合物としては、結晶粒度の制御の要請が高い、医薬品またはその合成中間体が好適な対象となり、特に低分子量の有機化合物が好ましい。
当該化合物の分子量としては特に制限はないが、一般的な医薬品に多くみられる８００以下が好ましく、５００以下がより好ましい。

本発明における「結晶化過程のモニター」とは、化合物が非晶質の状態から結晶化するまでの各時点の状態をモニターすることを意味し、結晶核形成過程および結晶成長過程を包含する。
結晶核形成過程とは、非晶質の状態から結晶の元になる核が形成される段階を意味し、結晶成長過程とは、形成された結晶核を種とし、結晶が大きくなっていく段階を意味する。

本発明の方法においては、具体的には、まず、化合物が結晶の場合は融点以上に加熱して、または、化合物が非晶質の場合は化合物のガラス転移点以上に加熱して、溶融状態にする。溶融するための加熱は、使用する固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル測定装置に適合するサンプルチューブ中で行なってもよく、または、予め溶融してから該サンプルチューブに注入してもよい。

次に、溶融した化合物が入った該サンプルチューブを、固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル測定装置、具体的には磁場のかかったプローブ内に挿入する。一定の温度または温度を変化させながら、結晶化に至るまでの間、経時的に固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定し、当該化合物の分子構造を構成する炭素原子由来の各部位のシグナル強度がどのように変化するかを追跡する。シグナル強度の解析を正確かつ容易に行なうためには、一定の温度で測定するのが好ましい。さらには、数点の異なる温度で測定することにより、さらに詳細な解析が可能になり、また、後述するように結晶粒度制御に関する有用な情報が得られる。

固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの「シグナル」とは、磁気プローブ内のサンプルに特定波長のラジオ波を照射したとき、化合物の分子構造を構成する各炭素原子の原子核のスピンが共鳴することによって吸収されるときに観測されるシグナルをいい、固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルのチャートにおいてピークとして記録される。化合物を構成する各炭素原子に由来するシグナルは、その電子状態を反映して、それぞれ特有の波長で共鳴し、テトラメチルシランの炭素原子の共鳴波長を基準（０ｐｐｍ、ここでｐｐｍとは共鳴波長の１００万分の１の単位を意味する。）として、それぞれ特有の化学シフト（δ、ｐｐｍ）で特定される。

化合物を構成する各炭素原子の化学シフトの帰属を容易するため、当該化合物について、予め、溶液^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定する、溶液ＮＭＲスペクトル予測ソフトを用いて得られる溶液^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを予測する、あるいはその両者を組み合わせて行い、各ピークの化学シフトに帰属される部分構造を特定しておくことが好ましい。

固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの測定では、感度、Ｓ／Ｎ比等を向上させるため、複数回測定したシグナルをフーリエ変換するのが好ましい。但し、積算回数を多くして、一回の測定時間が長くなりすぎると、結晶化過程を的確に解析できなくなる場合もある。また測定される対象化合物の種類にも関連するため、測定時間を特定することは困難であるが、一回の測定時間が数分〜数時間、好ましくは数分〜１、２時間程度の測定になるように、展開時間（ｔ１）や積算回数を適宜設定して行なうのが好ましい。

「シグナル強度」とは、測定によって得られるチャートの各ピークのベースラインからの高さを相対値で表したものをいう。シグナル強度を表すときの基準は特に限定されないが、本明細書においては便宜上、各ピークの経時的変化において、最も強度が大きな時を基準（１００％）として百分率で表すものとする。

本発明のモニター方法においては、固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル以外の他の結晶分析手段を適宜組み合わせて行なってもよい。例えば、固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル測定中のサンプルの一部または全部を採取して、粉末Ｘ線回折、熱分析、近赤外分光、赤外分光、ラマン分光測定等を行なうことによって、解析を総合的に行なうこともできる。

本発明では、このようにして得られたシグナル強度の経時的変化を解析することによって、結晶化過程、特に結晶核形成過程と結晶成長過程を区別して把握することが初めてできるようになった。以下、詳細に説明する。

シグナル強度の解析は、例えば、測定を開始してからの時間を横軸、シグナル強度を縦軸にして、各時点のシグナル強度をプロットしたグラフを用い（図１および２参照）、その経時的変化の速度論的解析（例えば、経時的変化の速度定数等）、または熱力学的解析（例えば、活性化エネルギー等）によって、行なうことができる。

速度定数の算出法は特に限定されず、例えば、反応速度式の変数を未知数とし、データを用いて最小二乗法または直線性フィッティングなどにより決定する方法等によって行なうことができる。
また、活性化エネルギーの算出法も限定されず、例えば、アレニウスプロット等によって行なうことができる。

このような解析を行うことにより、化合物の炭素原子由来の各部位のシグナルが、以下の２種類のグループに分類できるということが判明した。
（１）測定開始時点から経時的に強度が増加するシグナル（図１参照）
（２）測定開始時点では強度に経時的変化は見られないが、ある時点以降から経時的に強度が増加するシグナル（図２参照）

（１）の状態が確認できるのは、主として、低極性基、即ち、π-π相互作用、ファンデルワールス力といった比較的弱い相互作用が関与する部位（例えば、メチレン基、メチン基、フェニル基等）由来のシグナルであり、一方、（２）の状態が確認できるのは、主として、極性基、即ち、分極によるイオン−双極子相互作用や水素結合といった強い相互作用が関与する部位（例えば、カルボニル基、カルボキシル基等）由来のシグナルである。

（１）のシグナルに関して、その強度の経時的変化について、さらに速度論的な解析を行ったところ、測定開始直後に認められる速度成分（図１のＡ参照、以下、速度成分Ａともいう）とその後に認められる速度成分（図１のＢ参照、以下、速度成分Ｂともいう）の２つの成分から構成されていることが判明した。ここで、速度成分とは、特定の速度定数を示すシグナル強度の変化の速度成分を示す。

（２）のシグナル（ある時点以降から強度が増加するシグナル）に関しても速度論的な解析を行ったところ、その速度成分（図２のＣ参照、以下、速度成分Ｃともいう。）の速度定数が、（１）における速度成分Ｂの速度定数とほぼ同じであることも判明した。

これらのことから、（１）で確認される測定開始直後に認められる速度成分Ａは、結晶核形成に起因するものであり、（１）で確認される速度成分Ｂおよび速度成分Ｂの速度定数とほぼ同じである（２）で確認される速度成分Ｃは、共に結晶成長に起因するものである、と判断される。

また、結晶化の温度を変化させたところ、各温度における、結晶核形成に起因する速度成分Ａの速度定数と、結晶成長に起因する速度成分ＢおよびＣの速度定数は、炭素原子の由来にかかわらず、ほぼ同じであった。また、結晶化の温度が高くなるにつれ、その速度定数が増加する傾向があることが判明した。そこで、結晶核形成および結晶成長に起因する各速度定数について熱力学的解析を行ったところ、結晶核形成の活性化エネルギーは熱依存性がより高く、また結晶成長速度に比べ速度が遅い律速段階であることが判明した。このことは、（２）のグループのシグナル強度が、ある時点以降から比較的急激に増加することからも妥当であると思われる。

また、結晶化の温度を変化させたところ、結晶核形成に起因する速度成分Ａが認められる温度範囲と存在しない温度範囲があること、そして、結晶核形成に起因する速度成分Ａが認められる温度範囲においては、結晶化の温度により、形成される結晶核数と最終的な結晶の粒度が変化することが判明した。即ち、結晶核形成に起因する速度成分Ａが認められる温度範囲においては、結晶化の温度が低い程、結晶核形成過程が長く（結晶核形成速度が遅く）、結晶核形成が優位に作用し、結晶核の形成が促進される結果、結晶核数が多く最終的に粒度の小さい結晶が得られ、一方、結晶化の温度が高い程、結晶核形成過程が短く（結晶核形成速度が速く）、結晶成長が優位に作用し、結晶核数が少なく最終的に粒度の大きい結晶が得られる。つまり、結晶化の温度が結晶核形成過程に大きく関与することが判明した。

上記の結晶核形成に起因する速度成分が認められる温度範囲は、化合物にもよるが、具体的には、化合物のガラス転移温度＋５０℃以下である。結晶化の温度が高すぎると結晶核の形成が認められない。なお、温度が低すぎると結晶核の形成が認められるが結晶が成長し難いので、下限の温度は好ましくはガラス転移温度である。より好ましい温度範囲は、ガラス転移温度〜ガラス転移温度＋５０℃、特にガラス転移温度〜ガラス転移温度＋３０℃である。

上記の知見を利用すれば、結晶核形成に起因する速度成分Ａが認められる温度範囲内において結晶化の温度（結晶核形成過程の温度）を制御することにより、結晶核数（結晶核の大きさも）を制御して、最終的に得られる結晶の粒度を制御することができる。即ち、所望の粒度の結晶を得るためには、予め得られた上記の知見に基づき、化合物を溶融した後、結晶化の温度（結晶核形成過程の温度）を、結晶核形成に起因する速度成分Ａが認められる温度範囲内であって所望の粒度となるような温度に制御すればよい。このように、本発明の方法により、安定な結晶が得られる。

また、上記の知見を利用すれば、結晶するかどうかが未知である化合物に対して、当該化合物が結晶化するかどうかを判別することもできる。即ち、固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの各部位のシグナル強度の速度論的な解析を行って、結晶核形成に起因する速度成分Ａが認められる温度範囲があるかどうかを調べることにより、当該化合物が結晶化するかどうかを判別できる。具体的には、種々の結晶化の温度において、化合物の低極性基（π-π相互作用、ファンデルワールス力等が関与する）のシグナル強度の経時的変化について速度論的な解析を行い、速度の遅い成分（速度成分Ａ）が認められるような温度範囲があれば、当該温度範囲にて結晶核が形成されるはずであるので、当該化合物がその温度範囲にて結晶化するであろうと判断できる。予めそのような知見を得ることができれば、当該化合物を溶融した後、当該温度範囲にて保存して結晶化させることにより、結晶を得ることができる。

このことを利用すれば、従来工業的スケールでの結晶化が困難であったが上記の知見により結晶化するはずであると判明した化合物に対しては、小スケールにて上記の操作を行って結晶を得、これを工業的スケールでの結晶化において種結晶として使用すれば、工業的スケールでの結晶化も可能となるのであり、工業的な利用価値が高いものと思われる。

なお、本発明の化合物の結晶化過程のモニター方法は、固体^１３Ｃ−ＮＭＲを用いて行えるが、溶液^１３Ｃ−ＮＭＲで行うことはほとんど不可能である。なぜなら溶液^１３Ｃ−ＮＭＲ装置と固体^１３Ｃ−ＮＭＲ装置では装置原理が大きく異なるので、実際に溶液の装置で固体状態のＮＭＲ測定はできないからである。結晶化過程は溶液から固体への相転移であるため、溶液状態でモニターすることは本質的に困難である。また、ＮＭＲ測定の主流は溶液ＮＭＲであり、構造決定を主目的とする場合が一般的である。この場合、長時間の測定を要しても正確な構造情報を得ることを重視する傾向が強いと考えられる。その点、固体ＮＭＲ測定では分解能の点で不利であり、十分な情報を得るにはさらに長時間の測定が必要とも言える。そこで、本発明では測定目的と測定法について発想の転換を行った。構造情報を得る目的に加え、経時変化を追跡するために測定時間の短縮化を狙った。本発明における固体^１３Ｃ−ＮＭＲ測定では、試料を溶融させることにより試料の体積が減少するため、固体のまま測定する固体^１３Ｃ−ＮＭＲ測定と比較してより多くの試料を用いて測定可能である。実際にセラトロダストの測定では、粉体状での充填に対し、溶融操作を加えることにより充填効率が向上した結果、１．５倍程度の感度上昇が得られたと考えられる。この試料量増加の効果として、数分〜数時間、好ましくは数分〜１、２時間程度という短時間の測定による結晶化過程のモニターを実現した。

以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ 固体 ^１３ Ｃ−ＮＭＲによる解析
＜試料＞
以下の構造を有するセラトロダスト（ＡＡ−２４１４）を使用した。

化学名：（±）−７−（３，５，６−トリメチル−１，４−ベンゾキノン−２−イル）−７−フェニルヘプタン酸
分子式：Ｃ_２２Ｈ_２６Ｏ_４
分子量：３５４．４５
融点：１２８．７℃
ガラス転移温度：−３℃

＜装置＞
溶液^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、日本電子社製ＪＥＯＬ ＪＮＭ-ＧＳＸ２７０型核
磁気共鳴装置、固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、ブルカー・バイオスピン社製ＡＶＡＮＣＥ ３００ＷＢ型核磁気共鳴装置をそれぞれ用いて測定した。

セラトロダストの溶液^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、重クロロホルム中で内部基準物質としてテトラメチルシランを用い、測定した。そのスペクトルを図３に、各シグナルの帰属を表１に示す。

セラトロダストの結晶約０．１ｇをＮＭＲ用サンプルチューブに充填し、固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル測定装置のプローブに挿入した。プローブ内温度を約１３０℃にして試料を溶融させた後、プローブ内温度を２０℃に設定した。プローブ内温度が２０℃になった後、一回の測定時間約４０分（ｔ１：１０秒、積算回数：２５６回）で連続的に固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。測定開始直後、１日後、２日後、３日後、４日後、５日後の、固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルのチャートを図４−１〜図４−６に示す。そして、各シグナル強度の経時的変化のグラフを図５−１〜図５−７に示す。なお、固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおける各部位のシグナルの表記（表２）は、図１および表１の結果を参考にして行なった。

図４−１〜図４−６から、結晶化が進む程ほとんどのシグナル強度が増加することが明らかとなった。このような現象は、これまでに無晶形と結晶多形の結晶形の違いを固体ＮＭＲで識別することにより経験的に知られていたが、本発明により初めて明確に確認できた。このようなシグナル強度の増強は、結晶化していないか、あるいは結晶化の程度が低い場合は、分子間の相互作用がランダムに起こるため、同一由来の炭素原子でも、その電子状態（電子密度）にばらつきが生じ、その結果、シグナルのピークがブロードになる一方、結晶化の程度が進むと結晶格子が規定されてくるため、各炭素原子の電子状態が均質化されてピークがシャープになるためであると考えられる。

但し、メチル基由来のシグナル強度は、測定開始直後が最もシグナル強度が強く、結晶化が進むにつれてシグナル強度が減少した。これは、メチル基等のような回転軸が一軸しかないような基に由来する炭素原子では、その自由回転による電子状態の均質化の寄与が分子間相互作用のそれよりも大きいため、結晶化が進むにつれて自由回転が障害されてシグナル強度が弱くなるためと考えられる。メチル基のシグナル強度の挙動も結晶化過程を反映しているため、解析は可能であるが、これはむしろ例外にあたるため、今回の解析からは除外し、結晶化の進行に従い強度が増強するシグナルのみを用いて解析を行った。

図５−１〜図５−７より、セラトロダストの各部位のシグナルが、以下の２種類のグループに分類できた。
（１）測定開始時点から経時的にシグナル強度が増加する、メチレン基、メチン基、フェニル基等のπ-π相互作用、ファンデルワールス力といった比較的弱い相互作用が関与す
る部位由来のシグナル
（２）測定開始時点では強度に経時的変化は見られないが、ある時点以降から経時的にシグナル強度が増加する、カルボニル基、カルボキシル基等の分極によるイオン−双極子相互作用や水素結合といった強い相互作用が関与する部位由来のシグナル
なお、カルボニル部位についても、測定開始時点から穏やかに増加する傾向が見られたが直線性が悪く、メチレン基、メチン基、フェニル基等のような直線的な相関性がないと思われた。

次いで、（１）および（２）のシグナル強度の経時的変化を速度論的に解析した。（１）のシグナルは、測定開始直後に認められる速度の遅い成分とその後に認められる速度の速い成分の２つの速度成分から構成され、（２）のシグナルの速度成分の速度定数は（１）における速度の速い成分の速度定数とほぼ同じであった。

これらのことから、（１）における速度の遅い成分は結晶核形成に起因するものであり、（１）における速度の速い成分および（２）における速度成分は共に結晶成長に起因するものであることがわかった。図５−１〜図５−７の直線性フィッティングから算出した各速度成分の速度定数を表３に示す。

次に、結晶化の温度を２５℃、３０℃または３５℃と変えて、２０℃の場合と同様の方法により各速度成分の速度定数を算出した。その結果を表４に示す。

表３、４より、各温度において結晶核形成に起因する速度成分と結晶成長に起因する速度成分は、炭素原子の由来にかかわらず、ほぼ一致していた。また、温度が高くなるにつれて各速度定数が増加していく傾向がみられた。

また、３５℃においては、遅い速度成分は観測されず、速い速度成分が測定開始直後から観測された。これは、結晶核形成段階があまりにも短いため、1回目の測定時間(約４０分)の前に結晶成長に移行したためと考えられる。但し、結晶成長に起因する速い速度成分の前に結晶核形成に起因する遅い速度成分が存在していたことは明らかであるから、本発明においては、結晶成長に起因する速度成分が観測された場合は、結晶核形成に起因する速度成分も観測されたものとして取り扱うものとする。

次に、速度定数の自然対数を温度の逆数に対してプロットするアレニウスプロットから、各過程における活性化エネルギーを算出した。この時、各シグナルについての速度定数の平均値をある温度における速度定数として解析に用いた。結晶核形成に起因する速度成分および結晶成長に起因する速度成分のそれぞれのアレニウスプロットを図６−１〜図６−２に示す。また、アレニウスプロットにおいて、両速度成分共に良好な直線性が得られた。直線の傾きから算出した活性化エネルギーを表５に示す。

表５から、結晶核形成過程の方が活性化エネルギーが高く、この過程が律速段階であることがわかった。この結果は（２）のグループのシグナル強度が、ある時点以降で比較的急激に増加する挙動からも妥当であると考えられる。

実施例２ 結晶形成の観察
＜試料＞
セラトロダスト（ＡＡ−２４１４）を使用した。
＜装置＞
実体顕微鏡 Ｎｉｋｏｎ ＳＭＺ１５００
＜測定条件＞
接眼レンズ：１０倍 対物レンズ：１倍 ズーム：０．７５倍 計：７．５倍
＜顕微鏡画像解析＞
得られた結晶の粒子径（直径）は、顕微鏡画像をＰＣに取り込み、画像解析ソフト「Ｗｉｎ ＲＯＯＦ ｖｅｒ．３．５１（ＭＩＴＡＮＩ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）」を用いて測定した。楕円型になっている結晶については長径を測定した。解析ソフトから得られた粒子径の生データは、定規を同様に顕微鏡撮影し、画像解析して得られた長さを比較対象としてｍｍ単位に換算した。

＜方法＞
セラトロダストを１５０℃で溶融し、ガラスプレートに間に挟んだ後、種々の温度（１０〜３０℃）に１日間保存し、得られた結晶につき、実体顕微鏡を用いて観察を行った。その結果を図７−１〜図７−５に示す。また得られた結晶について画像解析粒子径を算出した。その結果を表６および図８に示す。

図７、８および表６から、結晶化の温度が高い程、大きな粒子の結晶が得られ、逆に、結晶化の温度が低い程、細かな粒子の結晶が数多く得られる傾向がわかった。但し、結晶化の温度が低すぎる（１０℃）場合、１５℃よりも少ない結晶しか得られなかった。これは、結晶核は多く形成するものの、温度が低いために結晶成長速度が遅く、観察できる大きさにまで結晶が成長していないことに起因すると考えられる。

実施例３ 固体^１３Ｃ−ＮＭＲによる解析
＜試料＞
インドメタシン〔和光純薬（生化学用）、Lot No. CEF2523〕
化学名：［1-(4-Chlorobenzoyl)-5-methoxy-2-methyl-1H-indol-3-yl］acetic acid
構造式：

分子式： Ｃ_１９Ｈ_１６ＣｌＮＯ_４
分子量： ３５７．７９

＜装置＞
固体の核磁気共鳴スペクトルはブルカー・バイオスピン社製 ＤＳＸ−３００（ＡＶＡＮＣＥ ３００ＷＢ型）核磁気共鳴装置を用いて測定した。

＜溶液^１３Ｃ−核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル予測＞
溶液ＮＭＲスペクトル予測ソフト（ACD/ChemSketch ver. 8.08、Advanced Chemistry Development Inc.製）を用いて、構造式から予測した溶液^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルおよび各シグナルの帰属を予測した。それぞれ図９及び表７に示す。

図９及び表７の結果から、固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおける各部位のシグナルの表記を表８のようにした。

インドメタシンの結晶を約１６５℃で融解させた後（インドメタシンの融点：１５５〜１６２℃）、３５℃で放冷すると結晶化が進行した。ＮＭＲ測定温度は３５℃に恒温制御し、試料回転数１００００ｒｐｍの状態で、経時的にインドメタシンの固体ＮＭＲ測定を行った。結晶化の経時変化について、測定開始直後、約１０００分後、および約５０００分後の固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルのチャートを図１０−１〜１０−３に、それらを重ね合わせたチャートを図１１にそれぞれ示す。

得られた固体ＮＭＲスペクトルについて各部位のシグナル強度の経時変化を評価したところ、以下の２つのグループに分類できることがわかった。
（１）測定開始時点より経時的に強度が増加するシグナル
（２）測定開始から強度変化がないシグナル
（１）の状態が確認できたシグナルは１１５ｐｐｍ付近のインドール骨格のフェニル部位および１３０ｐｐｍ付近のフェニル部位のみであった。他のシグナルはイニシャルから変化ない、（２）の状態であった。
また、既にシグナルが観測されている溶融直後のインドメタシンについて粉末Ｘ線回折測定を行ったところ、ハローパターンが得られたことから、無晶形であることを確認した。

インドメタシンはアモルファス状態においてもカルボン酸部位の水素結合によりダイマーを形成していることが報告されている（P. Tong and G. Zografi, Pharm. Res., 16, 1186 (1999).）ことから、固体ＮＭＲ測定においてイニシャル時点から観測されているシグナルは、アモルファス中で形成されているインドメタシンダイマーに由来すると考えられる。
以上のことから、水素結合を形成しているカルボニル部位とその結合に伴い束縛される部位は溶融直後から構造が比較的固まっているために、観測されるシグナルの強度は、結晶化過程の初期において変化しないと推測した。その上で、フェニル部位とインドール骨格との２軸によって分子構造の傾向が決まり、結晶核形成が進んでいる、という可能性が示唆された。

有意な強度変化が観測されたインドール骨格のフェニル部位およびフェニル部位について、シグナル強度の経時変化を図１２および１３に示す。

シグナル変化量をより明確に議論するために、シグナル強度増加分を解析した。さらに（１）のグループのシグナルにつき速度論的な考察を試みた結果、測定開始後に認められる速度の速い成分とその後に認められる速度の遅い成分の２つの成分から構成されていることがわかった。２段階の速度で進行していることから、前半の速度定数は結晶核の形成に起因する速度定数であり、後半で確認される速度定数は結晶成長に起因する速度定数であると考えられる。図１２および１３の直線性フィッティングから算出した速度定数を表９に示す。

反応速度定数は結晶核形成段階の方が、結晶成長段階よりも約７〜９倍程度大きい結果が得られた。先にセラトロダストで得られた結果から推測すると、結晶成長段階の速度は結晶核形成段階よりも大きいと予想されたが、本系では逆に結晶成長段階の速度の方が小さいという結果であり、アモルファス中におけるダイマー形成が結晶核の速やかな形成に寄与している可能性が示唆された。

固体^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを用いて化合物の結晶化過程をモニターすることにより得られた知見を利用すれば、製造に適した粒子径を有する結晶を製造することができる。また、結晶するかどうかが未知の化合物について判別でき、そして、結晶化できると判別した場合には、結晶化できる温度を予測でき、結晶を得ることが可能となる。

固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおけるシグナル強度の経時的変化のグラフの一態様を示す模式図である。 固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおけるシグナル強度の経時的変化のグラフの一態様を示す模式図である。 セラトロダストの溶液^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。 セラトロダストを約１３０℃で溶融し２０℃雰囲気中で保存した時の測定開始直後における固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。 セラトロダストを約１３０℃で溶融し２０℃雰囲気中で保存した時の１日後における固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。 セラトロダストを約１３０℃で溶融し２０℃雰囲気中で保存した時の２日後における固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。 セラトロダストを約１３０℃で溶融し２０℃雰囲気中で保存した時の３日後における固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。 セラトロダストを約１３０℃で溶融し２０℃雰囲気中で保存した時の４日後における固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。 セラトロダストを約１３０℃で溶融し２０℃雰囲気中で保存した時の５日後における固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。 セラトロダストの固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおけるメチル部位のシグナル強度の経時的変化を示すグラフである。 セラトロダストの固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおけるメチレン部位のシグナル強度の経時的変化を示すグラフである。 セラトロダストの固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおけるメチン部位のシグナル強度の経時的変化を示すグラフである。 セラトロダストの固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおけるフェニル部位のシグナル強度の経時的変化を示すグラフである。 セラトロダストの固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおけるキノン部位のシグナル強度の経時的変化を示すグラフである。 セラトロダストの固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおけるカルボン酸部位のシグナル強度の経時的変化を示すグラフである。 セラトロダストの固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおけるカルボニル部位のシグナル強度の経時的変化を示すグラフである。 結晶核形成段階のアレニウスプロットである。 結晶成長段階のアレニウスプロットである。 セラトロダストを溶融し、３０℃で１日間保存して得られた結晶の実体顕微鏡写真である。 セラトロダストを溶融し、２５℃で１日間保存して得られた結晶の実体顕微鏡写真である。 セラトロダストを溶融し、２０℃で１日間保存して得られた結晶の実体顕微鏡写真である。 セラトロダストを溶融し、１５℃で１日間保存して得られた結晶の実体顕微鏡写真である。 セラトロダストを溶融し、１０℃で１日間保存して得られた結晶の実体顕微鏡写真である。 図７−１〜図７−５の実体顕微鏡写真の画像解析により算出された温度と粒子径の関係を示すグラフである。 インドメタシンの構造式から予測される溶液^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。 インドメタシンを約１６５℃で溶融し３５℃雰囲気中で保存した時の測定開始直後における固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。 インドメタシンを約１６５℃で溶融し３５℃雰囲気中で保存した時の約１０００分後における固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。 インドメタシンを約１６５℃で溶融し３５℃雰囲気中で保存した時の約５０００分後における固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。 インドメタシンを約１６５℃で溶融し３５℃雰囲気中で保存した時の経時変化を示す固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。シグナル強度変化比較のために、Ｘ軸を２０ｐｐｍずつずらして表示させた。 インドメタシンの固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおけるインドール骨格のフェニル部位のシグナル強度の経時的変化を示すグラフである。 インドメタシンの固体^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおけるフェニル部位のシグナル強度の経時的変化を示すグラフである。

Claims (17)

1. 化合物の溶融状態から結晶化に至る間の、固体^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルのシグナル強度の経時的変化の速度定数を解析する、化合物の結晶化過程のモニター方法。
2. 結晶化過程が、結晶核形成過程である、請求項１記載のモニター方法。
3. 低極性基由来のシグナル強度を追跡する、請求項２記載のモニター方法。
4. 結晶化過程が、結晶成長過程である、請求項１記載のモニター方法。
5. 極性基および低極性基由来のシグナル強度を追跡する、請求項４記載のモニター方法。
6. 化合物の溶融状態から結晶化に至る間のシグナル強度の経時的変化の速度定数を解析して、化合物の結晶化過程をモニターするための固体^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル測定装置の使用。
7. 結晶化過程が、結晶核形成過程である、請求項６記載の使用。
8. 低極性基由来のシグナル強度を追跡する、請求項７記載の使用。
9. 結晶化過程が、結晶成長過程である、請求項６のいずれかに記載の使用。
10. 極性基および低極性基由来のシグナル強度を追跡する、請求項９記載の使用。
11. 化合物を溶融させた後、当該化合物を、請求項１〜５のいずれかに記載の方法にてモニターしたときに、結晶核形成に起因するシグナル強度変化の速度成分が認められる温度範囲内に制御することを特徴とする、結晶核数の制御方法。
12. 化合物を溶融させた後、当該化合物を、請求項１〜５のいずれかに記載の方法にてモニターしたときに、結晶核形成に起因するシグナル強度変化の速度成分が認められる温度範囲内に制御することを特徴とする、結晶粒度の制御方法。
13. 化合物を溶融させた後、当該化合物を、請求項１〜５のいずれかに記載の方法にてモニターしたときに、結晶核形成に起因するシグナル強度変化の速度成分が認められる温度範囲内に制御することを特徴とする、粒度が制御された結晶の製造方法。
14. 温度が、化合物のガラス転移温度＋５０℃以下である、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
15. π−π相互作用および／またはファンデルワールス相互作用を利用した結晶核形成により結晶晶出させることを特徴とする請求項１３記載の製造方法。
16. 化合物を溶融させた後、当該化合物を、化合物のガラス転移温度＋５０℃以下で結晶化させることを特徴とする、結晶の製造方法。
17. 請求項１１〜１６のいずれかの方法により製造されることを特徴とする、結晶。