JP2006298844A - リポソーム内に医薬化合物を内包するリポソーム含有製剤 - Google Patents

Abstract

【課題】
医薬化合物の内包率が高いリポソーム含有製剤を提供すること。
【解決手段】
リポソーム含有製剤は、 脂質膜内外に医薬化合物および１種類以上の生理的に許容される製剤助剤を含有するリポソームを含み、実質的に有機溶剤を含まないことを特徴とし、そのリポソームは、実質的に１枚膜〜10枚膜の脂質膜からなり、その脂質膜構成成分には、40〜65℃の範囲に転移温度のあるリン脂質が少なくとも１種含まれ、超臨界二酸化炭素と該リポソーム膜構成成分、医薬化合物および製剤助剤とを混合し、該圧力容器内を減圧して二酸化炭素を排出することによりその医薬化合物が内包されたリポソームの水性分散液を得て、これをリン脂質の転移温度〜（該転移温度＋10）℃で、0.1〜3時間インキュベートし、一定の粒径分布とするろ過操作を経ることにより調製される。
【選択図】なし

Description

本発明は、医薬化合物の内包率が高いリポソームを含むリポソーム含有製剤およびその製造方法に関する。

リポソームは、脂質膜またはその膜内部に封入された物質を保持するカプセル構造を構築できることから、薬物送達システム（ＤＤＳ）への応用が盛んに研究されている。
封入物質が内包されたリポソームを調製するには、Bangham法や逆相蒸発法（REV法）などが用いられている。これらの方法では、素材としての安全性が高く、生体内で適度な分解性を有するリポソームの中に封入物質を内包させるにもかかわらず、その調製過程において、リン脂質等の溶剤として有機溶媒を使用する。そのため、上記方法で得られるリポソーム含有製剤においては有機溶媒の残留が避けられず、リポソームの特性、安定性に問題が残る（例えば、特許文献１参照）。さらにどうしても残存する溶剤の毒性があるという理由で実用化に至っていないのが現状である（特許文献２）。

また従来の方法では、リポソーム内に薬物を充分に内包させることができず、殊に製剤を大量に投与する必要がある場合には、患者に過度の負担を与えるのみならず副作用の懸念もあった。治療用薬剤に比べて投与量が多くなる診断用造影剤への応用を考えた場合、造影物質の内包率が高いリポソーム含有製剤が求められていた。

一方、特許文献３には、有機溶媒の代わりに超臨界二酸化炭素を用いて、リポソームを製造する方法が開示されている。この方法では製造条件を種々設定することが可能であり、従来のリポソームの製造方法に比べて比較的容易に粒径、構造などを調整することができる。体内の目標部位に取り込まれたリポソームが少量であったとしても、封入物質の内包率が高ければ所望の効果を得ることができるため、本方法はＤＤＳ製剤の調製方法として期待されている。しかし、超臨界二酸化炭素と脂質、封入物質の混和に際してエタノールなどの溶解助剤の使用が望まれており、有機溶媒を全く使用せずに内包率の高いリポソームは作製できない（非特許文献１参照）。薬物などをリポソーム内に内包させても、溶解助剤の残留のためにリポソーム膜の強度が低下し、時間経過とともに外部へ漏出する可能性も考慮されねばならない。したがって、薬剤を効率よくリポソームに内包させる方法とともに、経時安定的にそれを保持し、血中滞留性を改善することができる剤形、製剤組成の改良および製剤の安全性の向上について、引き続き特別の要求が存在する。
特許2619037号公報 特開平7-316079号公報 特開2003-119120号公報 Pharm Tech Japan 19巻、5号、91〜100（2003）

本発明は上記の要請に取り組むものであり、有機溶媒を全く使用しないで内部に医薬化合物を効率よく内包したリポソームを含有するリポソーム含有製剤およびその製造方法を提案する。特に本リポソーム含有製剤は、がん組織の良好な描出性および安全性の高いＸ線検査用造影剤として好適である。

本発明のリポソーム含有製剤は、
脂質膜内外に医薬化合物および１種類以上の生理的に許容される製剤助剤を含有するリポ
ソームを含み、
該リポソームが実質的に１枚膜〜10枚膜の脂質膜からなるリポソームであり、そのうち２枚膜〜数枚膜で構成されるリポソームが少なくとも７０％を占め、その脂質膜構成成分には、40〜65℃の範囲に転移温度のあるリン脂質が少なくとも１種含まれており、
実質的に有機溶剤を含まないことを特徴としている。

前記リポソームは、圧力容器内で40〜65℃、10〜30MPaの条件下、超臨界二酸化炭素と
該リポソーム膜構成成分、医薬化合物および製剤助剤とを混合し、該圧力容器内を減圧して二酸化炭素を排出することによりその医薬化合物が内包されたリポソームの水性分散液を得て、その後、前記リン脂質の転移温度〜（該転移温度＋10）℃で、0.1〜3時間インキュベートして調製されたリポソームであることが望ましい。
前記リポソームの粒径について、（平均粒径−５％）〜（平均粒径＋５％）の範囲を有する粒子の割合が、リポソーム粒子全体の５０〜９０％を占めて入ることが好ましい。

前記リン脂質は、好ましくはジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、水素添加大豆レシチン、水素添加大豆ホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンからなる群より1種以上選ばれる。

前記リン脂質には、ポリエチレングリコール（PEG）基を有するリン脂質が含まれても
よい。
前記リン脂質が、PEG-ジミリストイルホスファチジルコリンおよびPEG-ジパルミトイルホスファチジルコリンのうちの少なくとも１つであり、さらに該リポソーム内に非イオン型ヨウド系化合物および抗がん性化合物のうちの少なくとも１つを内包するリポソーム含有製剤も本発明に含まれる。

前記リポソーム膜構成成分として、好ましくは少なくともリン脂質、ＰＥＧ基を有する脂質およびステロール類を含む脂質を含み、リン脂質（ＰＥＧ-リン脂質を含まず）/ステロール類のモル比が100/60〜100/90、リン脂質（ＰＥＧ-リン脂質を含まず）/ポリエチレングリコール基を有するリン脂質のモル比が100/5〜100/25である。

前記脂質膜内外における医薬化合物および製剤助剤の濃度がそれぞれ実質的に同じであることが望ましい。
本発明による上記リポソーム製剤の製造方法は、
（i）圧力容器内で40〜65℃、10〜30MPaで、超臨界二酸化炭素、リポソーム膜構成成分、医薬化合物および製剤助剤を混合して懸濁液を得る工程、
（ii）次いで、系内を減圧して二酸化炭素を排出することにより、該医薬化合物が内包されたリポソームの水性分散液を調製する工程、
（iii）その後、該医薬化合物が内包されたリポソームの水性分散液を、前記リン脂質の
転移温度〜（該転移温度＋10）℃で、0.1〜3時間インキュベートし、次いで該医薬化合物が内包されたリポソームの水性分散液を50〜90℃、0.01〜0.8ＭＰaの圧力下で、ろ過して、平均粒径が0.05〜0.8μｍのリポソームに整粒する工程と、
を有することを特徴としている。

[発明の詳細な説明]
本発明のリポソーム含有製剤は、
脂質膜内外に医薬化合物および１種類以上の生理的に許容される製剤助剤を含有するリポソームを含み、
該リポソームが実質的に１枚膜〜10枚膜の脂質膜からなるリポソームであり、そのうち２枚膜〜数枚膜で構成されるリポソームが少なくとも７０％を占め、その脂質膜構成成分には、40〜65℃の範囲に転移温度のあるリン脂質が少なくとも１種含まれており、
実質的に有機溶剤を含まないことを特徴とするリポソーム含有製剤である。

また前記リポソームは、その平均粒径およびその粒径±５％の粒径を有する粒子の割合が、粒子全体の５０〜９０％を占めていることを特徴としている。
本明細書において、亜臨界状態を含めて超臨界状態とする。リポソーム膜を「脂質膜」ということもある。リポソーム内に「内包」されるとは、リポソーム内に封入されてそのリン脂質膜と会合しているか、またはリン脂質膜内部に閉じ込められている水相（内部水相）中に存在している状態の両方を含むものとする。ＰＥＧ-リン脂質とは、PEG基を有するリン脂質のことをいう。「抗がん性化合物」を単一物質の抗がん剤の意味で使用している。「がん」は、悪性腫瘍を指し、単に「腫瘍」ということもある。

封入物質
本発明のリポソーム含有製剤において、封入される医薬化合物は、特に限定されず、広く医薬品に使用される物質が挙げられる。例えば、造影化合物、抗がん性化合物、抗酸化化合物、抗菌化合物、抗炎症化合物、血行促進化合物、美白化合物、肌荒れ防止化合物、老化防止化合物、発毛促進化合物、保湿化合物、ホルモン剤、ビタミン類、色素、およびタンパク質類などが挙げられる。

封入される上記医薬化合物は、水溶性化合物であるか、あるいは水溶性塩の形態または可溶性化剤の添加により水溶性にされた形態であることが望ましい。疎水性または脂溶性の化合物であってもよい。

本発明のリポソーム含有製剤は、特に造影剤、または抗がん剤として用いることが望ましい。中でも造影物質が好適であり、特に好ましい造影物質は、水溶性の非イオン型ヨウド系化合物である。

本発明のリポソーム含有製剤において、造影物質としてリポソームの脂質膜内に水溶性ヨウド系化合物が内包されている。水溶性ヨウド化合物は、造影性があればイオン性、非イオン性を問わず、特に規定されない。一般的には非イオン性ヨウド化合物の方が、イオン性ヨウド化合物よりも浸透圧が低く、投与された人体に対する負荷が小さいためにより望ましい。水溶性の非イオン性ヨウド化合物としてヨウ化フェニルを含み、例えば2,4,6
−トリヨードフェニル基を少なくとも1個有する非イオン性ヨウド化合物が好適である。

そのような非イオン性ヨウド化合物として、具体的には、イオヘキソール(Iohexol)、
イオパミドール（Iopamidol）、イオメプロール(Iomeprol)、イオペントール(Iopentol)
、イオプロミド（Iopromide）、イオシミド(Iosimide)、イオベルソール(Ioversol)、イ
オトロラン(Iotrolan)、イオタズル(Iotasul)、イオジキサノール(Iodixanol)、イオデシノモール(Iodecimol)、イオキシラン（Ioxilan）などが挙げられる。高度に親水性であり、かつ高濃度でも浸透圧が高くならない非イオン性の好適なヨウド化合物として、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオキシラン、イオトロラン、イオジキサノールが特に好ましい。このような非電解質物質も本発明による超臨界二酸化炭素法により調製すると、リポソーム内に効率良く内包することができる。これらの化合物は単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。またその例示に限定されるものではない。なお本明細書において、化合物は遊離形態の化合物の他に、その塩、水和物なども含めて言及することがある。

造影物質以外の封入物質として、造影剤の用途によっては抗がん性化合物、光線力学療法用物質などを含めてもよい。抗がん性化合物は、がんの化学療法に用いられている化学物質であればよく、特に限定されるものではない。アドリアマイシン、ビラルビシン、ビンクリスチン、タキソール、シスプラチン、マイトマイシン、５−フルオロウラシルから
少なくとも１種選ばれる化合物が好ましく用いられるが、その例示に限定されるものではない。

リポソーム膜構成成分
本発明のリポソームの脂質膜構成物質は、膜構成成分として一般に使用されるものであれば特に限定されない。通常は、リポソーム用脂質としてリポソーム形成能を有するリン脂質および糖脂質のうち、少なくとも１つを必須の主要成分とし、それ以外に任意成分として共存させる物質がある。任意成分には、脂質膜安定化物質としてのステロール類、グリコール類などのほか、荷電物質としての脂肪酸またはその塩、脂質混合乳化物など、従来から小胞体の形成成分として用いられているものも含まれる。

本発明のリポソームの脂質膜を構成する脂質膜成分には、少なくともリン脂質、糖脂質、ステロール類、グリコール類、ポリエチレングリコール（PEG）基を有する脂質（例え
ばＰＥＧ-リン脂質）などが含まれる。本発明のリポソーム含有製剤に含まれるリポソー
ムの脂質膜成分として、一般にリン脂質および／または糖脂質が好ましく使用される。好ましい中性リン脂質として、大豆、卵黄などから得られるレシチン、リゾレシチンおよび／またはこれらの水素添加物、水酸化物の誘導体を挙げることができる。

その他のリン脂質として、卵黄、大豆またはその他の動植物に由来するか、または半合成のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、合成により得られるホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジミリストリルホスファチジルコリン（DMPC）、ジオレイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジステアロイルホスファチジルセリン（DSPS）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPＧ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（DPPI）、
ジステアロイルホスファチジルイノシトール（DSPI）、ジパルミトイルホスフチジン酸（DPPA）、ジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）などが挙げられる。

本発明のリポソームを構成する脂質膜のリン脂質類には、必要に応じてPEG基を有し、
かつ、22〜70℃、好ましくは40〜65℃の範囲に転移温度のあるリン脂質が少なくとも含まれている。リン脂質の「（相）転移温度」とは、リン脂質がとり得るゲルと液晶との両状態間の相転移を生じる温度である。その測定は、示差走査熱量計（ＤＳＣ）を使用する示差熱分析による。22〜70℃の範囲にある相転移点を有するリン脂質として、ジミリストイルホスファチジルコリン（転移温度、以下同じ、23〜24℃）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（41.0〜41.5℃）、水素添加大豆レシチン（53℃）、水素添加大豆ホスファチジルコリン（54℃）、ジステアロイルホスファチジルコリン（54.1〜58.0℃）などが例示される。特にこれらのリン脂質にＰＥＧ基を結合させたリン脂質を本発明に使用することができる。

これらの相転移温度を有するリン脂質は、脂質の全質量に対して２０〜１００質量％、好ましくは３０〜９０質量％、さらに好ましくは４０〜８０質量％となる量で用いることが望ましい。この相転移温度を有するリン脂質を上記の量で用いることにより、後述する混合温度において封入する医薬物質の内包率が高く、しかも生体内での安定性に優れたリポソームを調製することができる。

本発明で用いられるリン脂質は、通常、転移温度を有するリン脂質を少なくとも含有するが、その他のリン脂質を１種または２種以上併用してもよい。ただし２種以上の荷電リン脂質を使用する場合には、負電荷のリン脂質同士または正電荷のリン脂質同士で使用することが、リポソームの凝集防止の観点から望ましい。

これらのリン脂質は通常、単独で使用されるが、２種以上併用してもよい。ただし２種以上の荷電リン脂質を使用する場合には、負電荷のリン脂質同士または正電荷のリン脂質同士で使用することが、リポソームの凝集防止の観点から望ましい。中性リン脂質と荷電リン脂質を併用する場合、重量比として通常、２００：１〜３：１、好ましくは１００：１〜４：１、より好ましくは４０：１〜５：１である。

糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステルなどのグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4などのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができる。

リポソーム膜の構成成分として、上記脂質の他に必要に応じて他の物質を加えることもできる。例えば、脂質膜安定化剤として作用するステロール類、例えばコレステロール、ジヒドロコレステロール、コレステロールエステル、フィトステロール、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、コレスタノール、またはラノステロールなどが挙げられる。また１−Ｏ−ステロールグルコシド，１−Ｏ−ステロールマルトシドまたは１−Ｏ−ステロールガラクトシドといったステロール誘導体もリポソームの安定化に効果があることが示されている（特開平5-245357号公報）。これらの中で、特にコレステロールが好ましい。

リポソーム膜中のコレステロールは、ポリアルキレンオキシド導入用のアンカーにもなり得る。特開平09−3093号公報には、ポリオキシアルキレン鎖の先端に、種々の機能性物質を共有結合により固定化することができ、リポソーム形成用の成分として利用することができる新規なコレステロール誘導体が開示されている。

ステロール類の使用量として、リン脂質（ＰＥＧ-リン脂質を含まず）/ステロール類のモル比が100/60〜100/90、好ましくは100/70〜100/85である。このモル比は、ＰＥＧ-リ
ン脂質を除くリン脂質量を基準としている。モル比が100/60未満であると混合脂質の分散性を向上させるステロール類による安定化が充分に発揮されない。

上記ステロール類の他にリポソーム膜の構成成分として、グリコール類を加えてもよい。リポソームを作製する際に、リン脂質などともにグリコール類を添加すると、リポソーム内での水溶性ヨウド系化合物の保持効率が上昇する。グリコール類として、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリメチレングリコール、1,4-ブタンジオールなどが挙げられる。グリコール類の使用量として、脂質全質量に対して0.01〜20質量％、好ましくは0.5〜10質量％の割合が望ましい。

本発明のリポソーム含有製剤の意図する目的に応じて、高分子鎖であるポリアルキレンオキシド（ポリオキシアルキレン鎖）（ＰＡＯ）基または類似の基を有するリン脂質または化合物を、リポソーム膜の一成分として使用してもよい。ポリアルキレンオキシド基またはＰＥＧ基をリポソーム膜表面に付けることにより、崩壊、凝集といったリポソーム自体の不安定性が解決され、水性分散液における経時安定性も改善される。さらに新たな機能をリポソームに付与することができる。例えば、ＰＥＧ化リポソームには免疫系から認識されにくくなる効果が期待できる。さらにリポソームは、ＰＥＧ基の導入により溶媒の水分子とＰＥＧ基とが相互作用をして水和層が形成され、親水的傾向を示す。このことからリポソームの水性分散液での安定性が増すとともに、血中での安定性も増して長時間にわたり血液中の濃度を維持できることが明らかになっている（Biochim. Biophys. Acta.,
1066, 29-36(1991)）。よって−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−ＨであらわされるＰＥＧ基のオキ
シエチレン単位の長さと導入する割合を適宜変えることにより、その機能を調節することができる。ＰＥＧ基として、オキシエチレン単位が10〜3,500、好ましくは100〜2,000の
ポリエチレングリコールが好適である。ポリエチレングリコールを使用する場合の使用量は、該リポソームを構成する脂質に対して1〜40質量％、好ましくは5〜25質量％含むのがよい。リポソームのＰＥＧ化には、公知の技術を利用することができる（たとえば、特開平１−２４９７１７号公報、FEBS letters, 268, 235(1990)）。また、ＰＥＧが結合するアンカー（たとえばコレステロールなど）を膜構成成分であるリン脂質と混ぜてリポソームを作製し、そのアンカーに活性化ＰＥＧを結合させてもよい。
より好ましくはＰＥＧ−リン脂質を、ポリエチレングリコール基を有する脂質として用いる。これは、リン脂質などを超臨界二酸化炭素に混合する際に、PEG-リン脂質が溶解助剤的な作用も示すからである。20〜70℃、好ましくは40〜65℃の範囲に転移温度を有するリン脂質にＰＥＧ基を付したものがさらに望ましい。

このようなリン脂質として、例えばジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンまたはジステアロイルホスファチジルコリンにＰＥＧ基を付加したものが最も好ましい。特に、ジミリストイルホスファチジルコリン（転移温度、23〜24℃）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（転移温度、41.0〜41.5℃）の使用によって、温度感受性リポソームを形成することができる。患部を42℃前後に加温するがんの温熱療法では、このような温度感受性リポソームに抗がん性化合物および造影物質を内包することによりそれらの集中送達が可能となる。

他に添加できる化合物として、負荷電物質であるジセチルホスフェートといったリン酸ジアルキルエステルなど、正電荷を与える化合物としてステアリルアミンなどの脂肪族アミンが例示される。
・リポソーム
本発明のリポソーム含有製剤は、医薬化合物をマイクロキャリヤーとしてのリポソーム内に封入した形態で使用することにより、標的の臓器、組織の病巣へ効率よく送達させることを図っている。すなわち、医薬化合物を内包するリポソームの粒径およびその脂質膜を適切に設計することによりターゲティング機能を付与することができる。受動的ターゲティングは、リポソームの粒径、脂質組成、荷電などの調整を通じてその生体内挙動を制御することができる。リポソーム粒径を狭い範囲に揃える調整もまた容易に行うことができる。リポソーム膜表面の設計では、リン脂質の種類と組成、共存物質を変えることにより所望の特性を付与することができる。さらに投与されたリポソームの体内移動と分布に関して、より高度な送達選択性と集積性を可能とする能動的ターゲティングの採用もまた検討されるべきである。一例として、リポソーム膜表面に上記のポリアルキレンオキシド高分子鎖または高分子鎖のPEG基を導入することは、標的部位への誘導を制御し得るため
に有益である。

他方、がん組織などの患部に到達しなかったリポソームは、正常な組織には集積することなく、比較的速やかに分解されて体外に排泄される。これはリポソームを設計する際にその安定性を体外排出時間との関係で適切にコントロールすることにより可能である。そうしたクリアランスの制御により、遊離形態では副作用が皆無ではない医薬化合物をリポソームに内包させるＤＤＳ剤形のもう一つの効果が期待できる。例えば水溶性の非イオン型ヨウド系化合物をリポソームに内包させると、ヨウド系化合物が肝臓、腎臓などに非特異的に沈着して、分解・排泄に時間がかかる事態に陥りにくくなる。このため徒に体内に留まることによる弊害、遅発性の副作用などを防止できる。

本発明のリポソーム含有製剤において、微細粒子としてのリポソームのサイズとその分布の調整は、高い薬剤の内包率、ターゲティング性、送達効率と密接に関わっている。粒径（粒子径）は医薬化合物を内包するリポソームを含む分散液を凍結し、その後破砕した
界面をカーボン蒸着し、このカーボンを電子顕微鏡で観察すること（凍結破砕ＴＥＭ法）により測定することができる。ここで「平均粒径」とは、観察されたリポソーム粒子の一定の個数、例えば20個の径の単純平均を指している。これは粒径分布で最も出現頻度の高い粒径を言う「中心粒径」と、通常一致するか、または概ね近似している。

受動的ターゲティング能力をリポソームに持たせるには、リポソームを作製する際に、その粒径のサイズを適切に揃えて調製することが必要になる。特許2619037号公報には、
粒径3μm以上のリポソームを排除することにより、肺の毛細血管におけるリポソームの不都合な滞留が回避されると記載されている。しかし、0.5〜3μmの粒径範囲のリポソーム
は、必ずしも自然に向腫瘍性とはならない。本発明のリポソーム含有製剤においては、その用途に応じて平均粒径を、好ましくは0.05〜0.8μmの範囲内で適宜調整してリポソームを作製する。

例えば、肝臓の撮像を目的とするX線造影用のリポソーム含有製剤の場合、リポソーム
の好ましい平均粒径は、0.2μｍ〜0.8μｍである。水溶性ヨウド系化合物を内包するリポソームがこの範囲のサイズであれば、非腫瘍組織に多い細網系内皮細胞による捕獲貪食の対象になり、腫瘍組織とのコントラストが明瞭となるためである。なお肝臓用の造影剤に使用するリポソームは、その表面にあるＰＥＧは、なるべく少ない方が望ましい。

血流を利用する「ＥＰＲ効果（Enhanced permeability and retention、透過性の亢進
および滞留）」に基づいてリポソームを向腫瘍性とするためには、その平均粒径を0.1〜0.2μm 、より好ましくは0.11〜0.13μmとすることが望ましい。例えばリポソームの平均
粒径を0.11〜0.13μm の範囲に揃えることにより、リポソーム含有製剤をがん組織へ選択的に集中させることが可能となる。

リポソームの製造方法
リポソームを作製する方法として、これまで種々の方法が提案されている。作製方法が異なると、最終的にでき上がったリポソームの形態および特性も著しく異なることが多い（特開平6-80560号公報）。そのため所望するリポソームの形態、特性に応じて製造方法
が選択される。一般にリポソームの調製は、まずリン脂質、カチオン性脂質、ステロールといった脂質膜成分を、ほとんど例外なく有機溶媒（例えばクロロホルム、ジクロロメタン、エチルエーテル、四塩化炭素、酢酸エチル、ジオキサン、THFなど）とともに容器中
で混合、溶解することから始まる。特にクロル系溶媒がよく用いられている。このようなリポソームの調製品は、必ず有機溶媒を含んでいる。

他方、超臨界二酸化炭素を利用してリポソームを調製する方法は、二酸化炭素の臨界温度が31.1℃、臨界圧力が7.38 ＭＰa と比較的扱いやすく、不活性なガスゆえ残存しても
人体に無害であり、高純度流体が安価で容易に入手できるなどの理由により魅力ある製造方法であると言える。しかしながら、有機溶媒を使用しないとする従来の超臨界二酸化炭素法でも、脂質類を超臨界二酸化炭素に効率よく分散させるためにエタノールなどの使用が推奨されていた（非特許文献１参照）。残存するこれらの有機溶媒を除去するために、複数の工程および長時間の処理を要しているのが現状である。そうした残留する有機溶媒、特にクロル系有機溶媒については、生体に及ぼす悪影響、例えば副作用が懸念される。

本発明の製造方法は、通常の医薬品と比べてとりわけ投与量の多い造影剤用に最適な形態、構造を有するリポソームをも製造できる方法である。すなわち、超臨界二酸化炭素を用いる方法により作製されたリポソームは、実質的にクロル系溶剤、エタノールおよびその他の有機溶媒を含有せず、医薬化合物を内包するのに種々の好ましい特性、すなわち、従来法に比べて封入する薬物の内包率、内包されている薬物のリポソーム内の保持率が高いことが示されている。なお「実質的に」とは、リポソーム含有製剤における残存有機溶
媒の濃度の上限値が10μg/Ｌであることを意味する。

本発明によるリポソーム含有製剤の製造方法において、リポソームは超臨界二酸化炭素を混和媒体としたリポソームの調製方法（以下、超臨界二酸化炭素法）に基づき、実質的に溶解助剤を用いない方法により調製される。その際に医薬化合物および製剤助剤をリポソーム膜内に内包させる。そのリポソーム膜の構成成分には、少なくとも40〜65℃で転移温度を有するリン脂質を含むことを特徴としている。すなわち、前記リポソームは、圧力容器内で40〜65℃、10〜30MPaの条件下（好ましくはリポソーム膜構成成分として転移温
度のあるリン脂質が融解している条件下）、超臨界二酸化炭素と該リポソーム膜構成成分、医薬化合物および製剤助剤とを好ましくは強撹拌下で混合し、該圧力容器内を減圧して二酸化炭素を排出することによりその医薬化合物が内包されたリポソームの水性分散液を得て、その後、前記リン脂質の転移温度〜（該転移温度＋10）℃で、0.1〜3時間インキュベートして調製されるリポソームである
本発明によるそのリポソームの製造方法において、第１工程および第2工程は次の通り
である。
（i）圧力容器内で40〜65℃の下、リポソーム膜構成成分と超臨界二酸化炭素とを混合し
て懸濁液を得る第１工程、
（ii）次いで、該懸濁液に医薬化合物および製剤助剤を含む溶液もしくは分散液を添加して混合する第２工程
あるいは次に示す順序でもよく、特に封入される医薬化合物が疎水性または脂溶性の化合物である場合に好適である。封入する医薬化合物の性質に応じて、これらの混合順序を使い分けてもよい。
（i）リポソーム膜構成成分と、医薬化合物および製剤助剤を含む溶液もしくは分散液と
を混合することにより得られた懸濁液を圧力容器内に収容し、その後に液化二酸化炭素を供給する第１工程、
（ii）次いで、前記の懸濁液と液化二酸化炭素とを混合させながら、該圧力容器内を30〜65℃の下、加圧して液化二酸化炭素を超臨界二酸化炭素とする第２工程
さらに次の第３工程および第４工程が続く。
（iii）その後圧力容器内を減圧して二酸化炭素を排出し、医薬化合物および製剤助剤を
内部に含有するリポソームの水性分散液を作製する第３工程、
（iv）前記の第３工程の後で、前記リン脂質の転移温度〜（該転移温度＋10）℃で、0.1
〜3時間インキュベートし、次いで0.1〜1μｍの孔径を有するろ過膜を装着した静圧式押
出し装置で、50〜90℃、0.01〜0.8ＭＰaの圧力下、該医薬化合物が内包されたリポソームの水性分散液をろ過して、平均粒径が0.05〜0.8μｍのリポソームに整粒する第４工程。

これらの工程によりリン脂質（ＰＥＧ-リン脂質を含まず）/ステロール類のモル比が100/60〜100/90、リン脂質（ＰＥＧ-リン脂質を含まず）/ポリエチレングリコール基を有するリン脂質のモル比が100/5〜100/25であり、脂質膜が２〜10枚膜で構成されるリポソー
ムが少なくとも70％を占めていることを特徴とするリポソーム含有製剤が得られる。
・第１工程および第２工程
第１および第２工程では、圧力容器内で、リポソーム膜構成成分と、液化二酸化炭素と、薬剤溶液もしくは分散液（医薬化合物および製剤助剤を含有する）とを混合するが、その添加順序に基づいて２方法に別れる。

圧力容器にリポソーム膜を構成する脂質成分としてリン脂質類および脂質膜の安定化作用を有する物質を加え、さらに液化二酸化炭素を添加して、好ましくは強撹拌条件下で混合する。脂質膜の安定化作用を有する物質として、ポリエチレングリコール基を有する脂質、ステロール類などを加える。リン脂質類としては、４０〜６５℃の範囲に転移温度を有する少なくとも1種以上のリン脂質を含む各種のリン脂質が好ましい。後記の範囲にあ
る圧力および温度のもとに液化二酸化炭素を超臨界状態もしくは亜臨界状態にする。リポ
ソーム膜構成成分と超臨界（もしくは亜臨界）状態の二酸化炭素とを充分に混合して、溶解または分散させる。または予め圧力容器内にある液化二酸化炭素に、これらの化合物を加えて混合し、次いで温度、圧力を調整して超臨界状態にして混合してもよい。引き続き生成したリン脂質および脂質膜安定化物質などを含有する超臨界二酸化炭素中に、内包させる医薬化合物、例えば非イオン型ヨウド系化合物および製剤助剤を含む薬剤溶液もしくは分散液を導入することによりミセルを形成させる。

あるいは、リポソーム膜構成成分として少なくともリン脂質、ポリエチレングリコール基を有する脂質およびステロール類と、医薬化合物および製剤助剤を含む薬剤水溶液とを混合した懸濁液を収容している圧力容器内に、液化二酸化炭素を供給し、好ましくは強撹拌下で、混合し分散させ、次いで加温加圧して液化二酸化炭素を超臨界状態とし、さらに強撹拌下で混合することによりミセルを形成させてもよい。前記懸濁液は圧力容器内でリポソーム膜構成成分と薬剤溶液とを混合して調製されるが、代わりにそうした懸濁液を別途に調製して、次いで圧力容器内に供給してもよい。

封入物質のリポソーム内への内包化効率は、リポソーム膜用脂質の全脂質量と、超臨界二酸化炭素との比率、封入物質などを含む溶液もしくは分散液との比率によっても左右される。ここでいう全脂質量とは、リポソーム膜を構成するリン脂質類、ステロール類、その他の添加した脂質類すべてを対象とした総和の質量である。大部分のリポソームが１枚膜よりはむしろ数枚膜のリポソームとして形成させるために、添加する脂質量は、従来の超臨界二酸化炭素法で使用されている脂質量よりも1.5〜2.5倍多くしてもよい。具体的には強撹拌下で、最終的に二酸化炭素、１重量部に対して、脂質、0.075〜0.125重量部、好ましくは0.08〜0.1重量部の割合で混合し分散させることが望ましい。本発明による製造
方法においてはリポソームの形成が効率的に行われ、ある量までは脂質量を多くするほど内包率も増加する傾向にあった。

脂質量が多すぎると、リポソーム作成時には脂質の溶け残りが生じるおそれがある。しかしながら撹拌当初は上記脂質を含む脂質相が存在してもよく、次のような強撹拌により、脂質分子が配列するＣＯ₂／水界面を多数生じさせて脂質の小ミセルが多数形成される
と内包率も上昇することとなる。脂質と超臨界二酸化炭素との乳化は、エタノールなどを添加しなくとも下記のようにＰＥＧ基を有する脂質の存在で促進される。

「強撹拌」とは、混合溶液の容量や撹拌手段によって好ましい範囲が異なる。例えば、混合溶液の容量が１０〜１００ｍL程度の場合において、長さ１５ｍｍ、直径５ｍｍの略
円柱状の撹拌子を用い、マグネチックスターラーで回転数400〜4000ｒｐｍ、好ましくは1000〜1500ｒｐｍ、特に好ましくは1200〜1400ｒｐｍで撹拌することを意味する。なお、
混合溶液の容量や撹拌手段が上記とは異なる場合も、混合液量、脂質量に応じて適宜設定する。また、強撹拌の時間は、１〜１２０分間、好ましくは５〜６０分間であることが望ましく、強撹拌の時間には薬剤溶液を供給する時間も含む。

このような条件の強撹拌下で、リポソーム膜構成成分と、超臨界二酸化炭素とを所定の時間混合することにより、リポソームの生成効率が良くなり、しかも医薬化合物の内包率がより高いリポソームを含有する水性分散液を得ることができる。

リン脂質、コレステロールを含む脂質類は、そもそも超臨界二酸化炭素、水のいずれにも溶けにくいし、分散もしにくい。所望する形態のリポソームが効率的に形成されるためには、脂質類が超臨界二酸化炭素中に良好に分散し、両者間の乳化が進んで均質な状態を形成することが重要な鍵である。そのための溶解助剤（または助溶剤、分散促進剤）として、ヒドロキシル基を有する少なくとも1種の化合物を利用して溶解、分散または混合を
することが好ましい。

ヒドロキシル基を有する化合物（すなわちヒドロキシル基含有化合物）には、親水性基として例えば、ヒドロキシル基、ポリオール基、ポリアルキレングリコールエーテル基、またはポリオール／ポリグリコールエーテル基などの組み合わせを有する化合物が含まれる。実際に溶解助剤として使用できるヒドロキシル基含有化合物としては、リン脂質、コレステロールなどの脂質膜成分と親和性を示し、これらと充分混合するものが望ましい。

上記のヒドロキシル基を有する化合物において、さらに残存する溶解助剤の毒性をも懸念する場合には、安全性の観点から、エタノールなどの低級アルコールなどを用いないことが望ましい。したがって、効力および安全性を考慮してより好ましい溶解助剤は、ポリエチレングリコールまたはPEG基を有する化合物である。PEG基を有する化合物として、具体的にはＰＥＧ基を有する脂質、例えばＰＥＧ−リン脂質が好ましい。そのオキシエチレン単位が10〜3,500、好ましくは100〜2,000のポリエチレングリコールが適する。

このようなヒドロキシル基を有する化合物を1種または2種以上併用することは、内包率を向上させるために望ましい。ヒドロキシル基を有する化合物を、超臨界状態もしくは亜臨界状態にする二酸化炭素の0.01〜1質量％、好ましくは、0.1〜0.8質量％の割合で溶解
助剤として使用するのがよい。ヒドロキシル基を有する化合物が、ＰＥＧ基を有する脂質である場合、リン脂質（ＰＥＧ-リン脂質を含まず）/ポリエチレングリコール基を有するリン脂質のモル比が100/5〜100/25、好ましくは100/5〜100/10である。

溶解助剤としてエタノールなどを用いる従来の超臨界二酸化炭素法では、エタノールが、超臨界二酸化炭素中へ脂質類が溶解もしくは分散することを促進する。その結果、コレステロールとリン脂質などを含有する二酸化炭素領域と、主にＰＥＧ化リン脂質および医薬化合物を含有する水の領域からなる２相系を形成し、これが撹拌されると超臨界二酸化炭素の乳化が進行し、脂質のミセルが形成される。最終的には、１枚膜の脂質膜を有するリポソームが主として調製されている。

これに対し本発明の方法では、リポソーム膜構成成分としてのＰＥＧ基を有する脂質（例えばＰＥＧ−リン脂質）が、エタノールなどの溶解助剤に代わって乳化促進作用をする。医薬化合物およびＰＥＧ化リン脂質が水相に溶解もしくは分散して水の表面張力を下げるとともに、リン脂質およびコレステロールなどが集まった脂質相もまた形成され、脂質類をほとんど含まない超臨界二酸化炭素の相との３相系の状態となる。撹拌により超臨界二酸化炭素の乳化が進行するが、界面を従来法よりも多く形成することとなり、そうした多数の界面に脂質分子が配列して脂質単膜を形成する。特に脂質量を多くして上記の強撹拌を行なう条件下では、ミセルが均一で小さいものが多数生成する。

結局、エタノールなどが存在してもしなくとも、超臨界二酸化炭素の乳化が起きて脂質ミセルが形成されることは同じである。しかし特に強撹拌を行なう方法では、均一な微小ミセルが効率的に形成されるため、その後の二酸化炭素の排出により誘発され、脂質単膜から脂質二分子膜が形成される過程において、医薬化合物が内包される率は、例えば17％から21％へと高くなる。エタノールなどを用いる従来の超臨界二酸化炭素法では、主に１枚膜リポソームが形成されるのに対し、本発明の方法では、脂質量を増やすと２枚膜から10枚膜までの多重膜リポソームが主体に形成される。このような多重膜リポソームについては、整粒工程で再び内包率の上昇が観察され、膜の再構成が起きていることが示唆される。

本発明の製造方法で使用する超臨界状態（亜臨界状態を含む）の二酸化炭素の温度は、一般には33〜70℃に設定されるが、好ましくは40〜65℃である。リポソーム膜構成成分に上記範囲の転移温度を有するリン脂質が含まれる場合、「該転移温度＋１０℃」以下、好
ましくは「該転移温度＋５℃」以下、さらに好ましくは「ほぼその転移温度」となるように設定することが望ましい。リン脂質の転移温度以上に加温すると、転移温度を有するリン脂質は、「融解」し、具体的には、ゲル状態から液晶状態へと相転移する。これによって脂質の流動性が高まり、リン脂質が超臨界二酸化炭素と効率良く混合される。したがって、リポソーム膜は円滑に形成されるとともに、その内部への医薬化合物などの取り込みもまた促進され、内包率が向上する。本発明の製造方法では、好適な条件に設定することにより医薬化合物のリポソームへの内包率を25〜35％まで上昇させている。超臨界二酸化炭素との混合がより良好となるとともに流動性が高まったリン脂質が規則的に配列してリポソーム膜が生成されるために、形成されるリポソームの粒径は揃っており、その粒径分布の幅は比較的小さくなる。特にこの傾向はインキュベーションの過程を加えることにより一層強化される。

超臨界状態の二酸化炭素の温度を、上記のようにリン脂質の転移温度付近または比較的低い温度に設定しているために、リン脂質に過度の熱がかからないため変性することがなく、とりわけ乳化促進のために強撹拌の操作を行なう状況下では、局所的過熱を軽減する意味からも上記の温度範囲を採用することが望ましい。また、超臨界状態の二酸化炭素の好適な圧力は、上記温度範囲に対応して適宜選択されるが、5〜50 MPa、好ましくは10〜30 MPaである。
・第３工程
第３工程では、リポソーム膜構成成分と、超臨界二酸化炭素と、薬剤溶液（医薬化合物および製剤助剤を含有する）とを充分に混合した後に、系内に必要であれば水を加えて、圧力容器内を減圧する。この混合溶液から二酸化炭素を排出することにより、医薬化合物などが内包されたリポソームの水性分散液が調製される。この過程でリポソームは水相に転相していると推定されるため、二酸化炭素を排出するだけで、医薬化合物を内包するリポソームが分散している水性分散液が生成する。リポソーム内部にも上記水溶液が封入されているため、医薬化合物はリポソームの外部水相のほかにリポソーム内部の水相に存在し、「内包」の状態にある。

上記のようにして得られ、医薬化合物が内包されたリポソームの水性分散液を、その後、前記リン脂質の転移温度〜（該転移温度＋10）℃、すなわちリン脂質の転移温度以上、“該転移温度＋１０℃”までの温度に一定時間、加温することが好ましい。この「該転移温度＋１０℃」とは、用いるリン脂質の種類と組成にもよるが、３５℃から６５℃程度である。加温時間として、0.1〜3時間、好ましくは10〜60分間インキュベートすることが望ましい。

上述のように調製されたリポソームの水性分散液を加温するインキュベーションは、好ましくは撹拌しながら所定の時間、一定温度で維持する。具体的には次のろ過工程の前にリポソーム分散液を有する耐圧容器内で行なってもよく、耐圧容器に備えられた加熱装置によって所定の温度まで加熱し、さらにその状態を所定の時間維持することによりリポソームの水性分散液のインキュベーション処理を行う。あるいは、リポソームの分散液を別容器に移した後に、上記条件で同処理を行ってもよく、例えばリポソームの分散液のろ過に先立って、ろ過容器を上記温度範囲に加熱することにより行なってもよい。

上記条件下でリン脂質の転移温度以上に加温してインキュベーションを行なうことにより、転移温度を有するリン脂質は液晶状態となり、リン脂質分子が極めて可撓性となり、従って脂質膜の流動性が高まる。かかる追加操作により、凝集して塊状になったリポソームの離反、分散化が促進される。これにより作製されるリポソームが、全体として比較的均一な分布の粒子集団になりやすい状況が形成される。後述するように、均一な分布とは、リポソーム粒子のサイズ（すなわち粒径）および構造（例えば脂質膜の枚数）の両方から言及される。

したがって次工程のろ過操作の間に、流動性が増した脂質分子の脂質膜内での再配置が起こって、より安定な膜構造が効率的に形成されるとともに、医薬化合物の内包も促進され、内包率の向上をもたらすことが期待される。このような効果が得られる理由は明らかではないが、多重層膜からなるリポソームにおいてリン脂質膜が再構築され、複数枚の膜からなるリポソームやＳＵＶ（single unilamellar vesicle）タイプのリポソームが生成しているためと推測される。さらに、脂質膜内で構成分子の再配置も起こり、より安定な膜構造が形成される。これらが、封入物質の内包率向上につながると考えられる。
・第４工程
リポソームの粒径の調整は、処方またはプロセス条件を変更することにより行なうことができる。例えば、上記の超臨界状態の圧力を大きくすると形成されるリポソームの粒径は小さくなる。作製するリポソームの粒径分布をより狭い範囲に揃えるには、ポリカーボネート膜、セルロース系の膜などでろ過してもよい。このため第４工程では、圧力容器内を空気などの導入により大気圧に調整すること（第３工程）により得られたリポソームの水性分散液を、0.1〜1.0μmの孔径を有する複数のろ過膜を通す。ろ過膜の孔径は大きい
ものから小さいものへと順次小さくしていくことが好ましく、最終的には0.05〜0.4μｍ
、好ましくは0.1〜0.4μｍ、さらに好ましくは0.15〜0.2μｍの範囲まで孔径を小さくし
ていくことが望ましい。押出しろ過の操作は、50〜90℃、好ましくは55〜85℃で、0.01〜1.0ＭＰa、好ましくは0.01〜0.8ＭＰaの圧力下で行なわれる。本発明の製造方法において、リポソームを構成する脂質膜のリン脂質類には、転移温度を有するリン脂質が少なくとも含まれているため、リン脂質の転移温度以上に加温すると、転移温度を有するリン脂質は液晶状態となり、流動性が高まる。

整粒のための操作は、例えばろ過膜を装着した各種の静圧式押出し装置、例えば「エクストルーダ」（商品名、日油リポソーム製）などを使用して、フィルターを強制的に通過させる。静圧式押出し装置に通すことにより、粒径分布が狭い範囲に揃ったリポソームを効率よく調製することができる。ろ過操作は、必要であれば繰り返し実施される。この押出しろ過法については、例えばBiochim. Biophys.Acta 557巻,9ページ(1979)に記載され
ている。

このような「押出し」操作を取り入れることにより、リポソームの粒径は、先のインキュベーションによる効果と相まって、その分布が比較的狭い範囲に落ち着くように揃えられる。リポソームの粒径について、平均粒径の±５％である範囲内の粒径分布、すなわち（平均粒径−５％）〜（平均粒径＋５％）の範囲を有する粒子の割合が、リポソーム粒子全体の30〜95％、好ましくは50〜90％、さらに好ましくは70〜90％を占めていることが望ましい。

実際、リポソームの平均粒径およびその粒径±５％の粒径を有する粒子の割合が、最終的に粒子全体の80％を占める状態が、インキュベーションの過程を組み込むことにより、３回のろ過操作の反復で済むが、インキュベーションがないと、９回のろ過操作を繰り返しても達成できない。

本発明者らは上記サイジングに加えて、医薬化合物の内包率が上昇することを見出した。さらにリポソーム用脂質が、規則正しい配向を有する均一な脂質膜を構成する好ましい態様では、比較的粘度の高いリポソーム懸濁液であっても、フィルターの目詰まりを起こすことなく粒径の揃ったリポソームを作製することができる。

第１工程において脂質量を通常よりも多く使用した場合、形成されるリポソームは既に報告されているような1枚膜（非特許文献１）ではなく多重層膜が多い。上記の押出しろ
過により、多重層膜からなるリポソームにおいても、脂質膜の再構成を含む膜構造の再構
築および整粒化が起きて、２枚〜10枚膜からなるリポソームが生成しているためと推測される。

本発明の条件下で製造されたリポソームは、多重層膜が多く存在し、これが本工程のろ過操作の間に、多重層膜の外殻層が破壊されて剥がれたり、あるいはリポソームの膜が破壊され、膜断片どうしが接合して再度リポソーム構造を構成するものと考えられる。ろ過時にリポソーム全体が崩壊しても、膜構造を形成していた構造断片が再結合して新たなリポソームを形成することも考えられる。

したがって上記インキュベーションを組み込んでリン脂質の転移温度またはそれ以上の温度で一定時間保つことにより脂質膜の流動性を高めて、リポソームおよび脂質の分散を促進し、上記のような膜構造の再構築に良好な影響をもたらすと考えられる。

このような処理を行うことにより、実質的にエタノールなどの有機溶媒系の溶解助剤を用いなくても、封入物質のリポソーム内への内包率が向上するとともに、リポソームを微細粒子化することができる。さらに、残存する溶解助剤により膜強度が低下するおそれもないため、リポソームの保存安定性に優れる。
・濃縮工程
リポソームの水性分散液を上記のようにろ過膜でろ過し、必要に応じてさらに限外ろ過、遠心分離、ゲルろ過などの方法により、リポソーム内に内包されなかった薬剤を除去して精製してもよい。本発明の方法では、医薬化合物が内包されたリポソームの水性分散液を前記の第３工程または第４工程の後に、限外ろ過を行なうことにより濃縮することが好ましい。限外ろ過は、通常の限外ろ過膜および装置を使用して行なうことができる。本発明による製造方法では、これらのろ過操作を行なうことにより、医薬化合物のリポソームへの内包率を25〜35％まで上昇させることができる。限外ろ過法による濃縮を第３工程の後に実施してもよく、この場合には続いて行なわれるエクストルーダなどを用いる、第４工程となる押出しろ過のための濃縮操作の意味をもつ。また、リポソームの水性分散液を濃縮して容量を減らしてからリポソームを凍結乾燥させて、粉末形態のリポソームを効率よく得ることもできる。リポソームを凍結乾燥した場合には、使用直前に水性媒体などで再懸濁させて用いる。さらに前記限外ろ過の後、115〜125℃、好ましくは118〜123℃、より好ましくは121℃で蒸気滅菌してもよい。これによって無菌調製品が得られる。

本発明の方法により製造されるリポソームは、実質的に１枚膜〜10枚膜、好ましくは２枚膜〜数枚膜（例えば3枚、4枚、5枚または６枚の膜）からなるリポソームである。この
ようなリポソームは、上記工程（i）〜（v）による製造方法において主成分として生成する。「実質的に」とは、本発明のリポソーム含有製剤において、２枚から１０枚の膜で構成されるリポソームを、造影剤中に含まれる全リポソームのうち、少なくとも60％、好ましくは70％以上を占めることを意味し、8５〜98％含むことがより好ましい。特に好まし
くは、２枚膜〜数枚膜で構成されるリポソームが少なくとも70％、好ましくは75〜90％を占める。

これに対して１枚膜のリポソームは、リン脂質二重層が一層としてなる膜で構成されるリポソームである。これは凍結かつ断（Freeze fracture）レプリカ法による透過型電子
顕微鏡（ＴＥＭ）による観察において、レプリカが概ね1つの層として認められるリン脂
質二重層により構成されているものである。すなわち、観察したカーボン膜に残された粒子の跡について段差がないものが１枚膜と判定され、２つ以上の段差が認められるものは「多重層膜」と判定される。２枚もしくは３枚の膜で構成されるリポソームは、１枚膜リポソームよりも相対的に強度が増しており、上記の第４工程で実施される整粒処理でも壊れない。

１枚膜リポソームは、脂質膜成分の溶媒として超臨界二酸化炭素を使用し、水による相分離方式により生成することが知られ、特にエタノールを溶解助剤として用いると、効率よく作製できる。これに対して従来のBangham法や逆相蒸発法（REV法）などによるリポソーム作製方法によると、極めて様々なサイズ、形態の多重層膜（multilamellar vesicles; ＭＬＶ）からなるリポソームが、不均一な分布で形成される傾向にある。１枚膜または数枚膜のリポソームは、ＭＬＶと比較して、リポソームの投与量、換言すると投与脂質量が大きくならないという利点もある。

リポソーム膜の脂質膜枚数が少ない数枚膜のリポソーム、特に粒径の大きい１枚膜リポソームであるＬＵＶ（Large unilamellar vesicles）は、多重層膜リポソームに比べて、大きい内包容量を提供するという利点がある。反面、医薬化合物の内包率が良好な１枚膜または数枚膜のリポソームでも、内包する化合物の重量が相対的に多過ぎるとリポソームの安定性は低下する。特にイオン強度の急激な変化には脆弱である傾向が観察されていた。本発明の製剤に使用するリポソームの作製では、主として２枚膜〜10枚膜構造のリポソーム、好ましくは２枚膜〜数枚膜（例えば3枚、4枚、5枚または６枚の膜）のリポソーム
が効率よく形成されるように超臨界二酸化炭素法およびその後の整粒工程を改良している。さらにリポソーム膜にポリアルキレンオキシド基を有するリン脂質、ステロール類、グリコールなどを含有させて、脂質膜の安定化を図っている。その結果、作製されたリポソームは、塩ショックに対しても安定的であることが判明した。

リポソーム含有製剤の製造
本発明のリポソーム含有製剤は、リポソームの脂質膜内部の水相およびリポソームを懸濁する水性媒体中に、医薬化合物とともに１種類以上の生理的に許容され得る製剤助剤を含有している。この製剤助剤は、リポソームの製剤化に際し、医薬化合物とともに添加される物質であり、これまでの製剤技術に基づいて各種の物質が必要に応じて使用される。具体的には生理学的に許容される各種の緩衝剤、エデト酸系キレート化剤（例えばＥＤＴＡNa₂−Ca、ＥＤＴＡNa₂など）、無機塩類、薬理的活性物質（例えば血管拡張剤、凝固抑制剤など）、さらには浸透圧調節剤、安定化剤、抗酸化剤（例えばα‐トコフェロール、アスコルビン酸）、粘度調節剤、保存剤などが挙げられる。好ましくは、アミン系緩衝剤およびキレート化剤をともに含めるのがよい。ｐＨ緩衝剤として、水溶性アミン系緩衝剤および炭酸塩系緩衝剤が好ましく用いられる。特に好ましくはアミン系緩衝剤であり、中でもトロメタモールが望ましい。キレート化剤は好ましくは、ＥＤＴＡNa₂−Ca（エデト
酸カルシウム２ナトリウム）である。

また「水性媒体」とは、医薬化合物（例えば非イオン型ヨウド系化合物）、製剤助剤などを溶解もしくは懸濁する水をベースとする溶媒である。その水は、滅菌した発熱物質を含まない水を使用する。リポソーム脂質膜内部の水相以外の水溶液（すなわち該リポソームを懸濁する水性媒体）にも上記の医薬化合物および製剤助剤が含まれている場合、脂質膜内外の水相に医薬化合物および製剤助剤が実質的に同一の濃度で含有されている態様が好ましい。そうした場合には該膜内外で著しい浸透圧差が生じることはなく、リポソームの構造安定性が保たれる。

上記溶液もしくは懸濁液の好ましいｐＨ範囲は、室温で6.5〜8.5、さらに好ましくは6.8〜7.8である。医薬化合物が水溶性ヨウド系化合物である場合、好ましい緩衝液は、米国特許第4278654号に記載されているような負の温度係数を有する緩衝液である。このタイ
プの緩衝液はオートクレーブ温度で低いｐＨを有し、このことがオートクレーブ中のリポソーム含有製剤の安定性を増し、他方、室温では生理的に許容されるｐＨに戻る。上記アミン系緩衝液はこのような要求を満たす性質を有している。したがって、注射用無菌製剤を製造するために、リポソーム調製物をオートクレーブ滅菌できることは好都合であり、貯蔵安定性なども確保できる。本発明の製剤は、好ましくは滅菌した形態として提供され
、その場合、滅菌ろ過、オートクレーブ滅菌または加熱滅菌により無菌製剤を得る。

本発明において、医薬化合物の内包効率および内包の安定性に加えてリポソームの膜脂質の重量も考慮されねばならない。リポソームの膜脂質の重量が多くなると製剤の粘度が高くなる。リポソーム内への薬剤（医薬化合物および製剤助剤）の封入量として、リポソーム内に封入された水溶液中に、すべての薬剤がリポソーム膜脂質に対して、1〜8、好ましくは3〜8、より好ましくは5〜8の重量比（g/g）で含有されていることが望ましい。リ
ポソーム内に内包された全薬剤の重量比が１未満であると、比較的多量の脂質を含有することとなり、製剤の粘度は増大し、結果的に薬剤の送達効率が悪くなる。１枚膜もしくは数枚膜のリポソームは、内包容積および送達効率に優れるため有利である。反対に、リポソーム膜脂質に対する全薬剤の封入重量比が８を超えると、リポソームは構造的にも不安定となり、リポソーム膜外への薬剤の拡散、漏出は、貯蔵中または生体内に注入された後でも避けられない。

リポソーム含有製剤
本発明のリポソーム含有製剤は、特に限定されず、造影剤、内服薬、皮膚外用剤、化粧料などに応用することができる。特にX線造影剤に好適に用いることができる。

本発明のリポソーム含有製剤の好ましい態様は、造影物質が非イオン型ヨウド系化合物であり、かつ、１種類以上の生理的に許容される製剤助剤を含有するリポソーム含有造影剤である。造影物質および製剤助剤を内包するために用いられるリポソームは、リポソーム含有製剤用に好適なリポソームとして設計された形態、構造を有する。そのようなリポソームでは、脂質膜が実質的に数枚膜で構成されるために経時的な安定性および血中での安定性が改善されている。しかも造影物質の内包率を高めているため、造影剤としての造影性能も向上している。

医薬物質のＤＤＳにおいては、リポソーム内に封入することにより副作用が軽減され、内包化により得る利益を一層増すために、内包されていない医薬物質を分離除去して製剤を調製することも多い。実際には、ほぼ100％の封入が達成されたリポソームが分離され
ても、その後、リポソーム懸濁製剤の封入成分が時間とともに漏失する例が報告されている（Betageri, G. V. Drug Devel. Ind. Pharm. 19, 531-539(1993)）。またＷＯ88/09165のリポソーム調製物のように、リポソーム内部のみにＸ線造影物質を有する造影剤を
オートクレーブ滅菌すると、造影物質がリポソーム外に漏れ出てしまうことが報告されている（特許文献２）。逆に内包化されていない遊離の造影物質を含む製剤の診断的意義が論じられた（特表平9-505821号公報）。これは造影剤独特の使用態様に基づくものである。

上記のリポソーム含有造影剤は、通常、リポソームに内包されていないヨウド系化合物もまた含む。このような造影剤にあっては、リポソーム内に内包されている造影物質の割合（内包率）も考慮されねばならない。本発明のリポソーム含有製剤では、前記水溶性ヨウド系化合物の65〜80質量％が、リポソームに内包されていない形態にあり、リポソームを懸濁する水性媒体中に存在することを特徴としている。

本発明のリポソーム含有製剤において、ヨウド系化合物を効率的に内包するとともに、これを担持するリポソームの経時的不安定化を防止するために、リポソーム内に封入されるヨウド系化合物の量は、むしろ限定的である。リポソーム内に封入されたヨウド系化合物の量は、リポソーム含有製剤における全ヨウド系化合物の5〜40質量％、好ましくは10
〜35質量％、より好ましくは10〜30質量％、特に好ましくは15〜25質量％である。この内包化率はリポソーム粒子の細密充填の限界を下回るため、リポソームにおける造影物質の保持安定性は損なわれない。したがって、ヨウド系化合物をカプセル化したリポソームの
浸透圧効果による不安定化を防止でき、リポソームにおける造影物質の経時的な保持安定性は向上する。このことは、リポソーム含有製剤でも製剤調製時におけるヨウド系化合物の内包率と使用時における内包率が実質的に同一に保たれることを意味し、その造影性能、品質管理の観点からも好ましい。

本発明のリポソーム含有製剤は、ヨウド含有量として、通常、想定される製剤の投与量、10〜300mLでは、40〜450mgI／mLであり、好ましくは70〜400mgI／mL、リポソーム内へ
の造影物質を内包する効率の観点からは 100〜350mgI／mL、特に好ましくは、150〜300mgI／mLの範囲である。また、前記脂質膜内外の水相に、医薬化合物および製剤助剤がそれ
ぞれ実質的に同一の濃度で含有されることが好ましい。

本発明によるリポソーム含有製剤は、全身または局所の投与いずれにも使用される。好ましくは注射剤または点滴注入剤として全身的に静注投与される。その投与量および濃度は、撮像の目的、部位、造影剤中の化合物の性質および患者の状態に依存し、必要に応じて調節することができる。このためリポソーム内外の医薬化合物の総量が、従来の投与量と同程度になるようにしてもよい。投与時の注入抵抗を少なくして患者の苦痛を軽減し、血管外漏出の危険を回避するため、本発明のリポソーム分散液の粘度（オストワルド法で測定した場合）は、３７℃で、30 mPa・ｓ以下、好ましくは25 ｍＰa・ｓ以下、より好ましくは20 mPa・ｓ以下である。このような範囲内では実用上、特に問題ないとされる（特許文献１）。

上記局所投与の一例として、上記の温度感受性リポソームをがんの温熱療法に使用する態様が挙げられる。この場合光線力学療法用物質を併用することも可能である。光線力学療法用物質としては、多数の公知の化合物が存在する。
［発明の効果］
本発明のリポソーム含有製剤には、内部に医薬化合物を内包するリポソームを含有し、該リポソーム膜構成成分には、40〜65℃の範囲に転移温度のあるPEG-リン脂質が少なくとも含まれている。該リン脂質が融解する転移温度付近の温度で超臨界二酸化炭素法により作製されるため、25〜35%の高い内包率で造影物質を安定的に内包させているため、その
低用量化を可能とする。

本発明の造影剤は、毒性の高いクロル系溶剤およびその他の有機溶剤を全く使用せずに製造されるため、従来のリポソーム含有製剤に比べて毒性および副作用が軽減されている。

本発明を以下の実施例によって、具体的に説明する。しかし、実施例は実例を挙げて説明しようとするものであり、本発明の範囲を何ら限定しようとする意図のものではない。[評価]
＜リポソームの平均粒径＞
粒径（粒子径）は、ヨウド系化合物を内包するリポソームを含む分散液を液体窒素にて急速に凍結し、その後破砕した界面をカーボン蒸着し、形成されたこのカーボンを透過型電子顕微鏡で観察すること（凍結破砕ＴＥＭ法）により測定した。粒径は、観察されたリポソーム粒子、２０個の径の単純平均とした。
＜リポソームの薬剤透過性の評価＞
作成した試料5mLに対して、内包されていないヨウド系化合物を遠心分離による洗浄を3回行ない、生理食塩水中に分散することで、ヨウド系化合物がリポソーム内のみに存在する試料5mLを調製した。この試料を23℃、、相対湿度55％の雰囲気で、暗所にて３ヶ月間
、保管した。その後、その試料を生理食塩水で透析し、透析終了後にエタノールを添加してリポソームを破壊して、吸光度の測定によりリポソーム内のヨウド化合物量を求めた。

薬物の透過性を保持率として、（3ヶ月後の内包率）／（作成時の内包率）で表した。
＜平均リポソーム膜数の評価＞
平均粒径測定の際に、あわせて観察した。
[実施例１]
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）368.4mgと、コレステロール147.4mg、ＰＥＧ基を有するリン脂質（日本油脂株式会社製、SUNBRIGHT DSPE-020CN）111.5mgの混合
物をステンレス製の特製オートクレーブに仕込み、次いで液体二酸化炭素13gを加えて、50℃、12 MPaの超臨界状態とした。次いで容器内を撹拌しながら、さらに造影剤溶液（日
局イオヘキソール溶液（ヨウド濃度300mg/mL）、トロメタモールを1mg/mL、エデト酸カルシウム２ナトリウム0.1mg/mLを含有し、適量の塩酸および水酸化ナトリウムでｐＨを７前後に調整）10mLを定量ポンプで連続的に注入した。注入終了後、系内を減圧して二酸化炭素を排出し、造影剤溶液を含有するリポソームの分散液を得た。得られた分散液を44℃にて2時間インキュベートした後、80℃まで加熱し、アドバンテック社製のポリカーボネー
ト・フィルター、0.80μmで加圧濾過した。続いて、同様に80℃まで加熱し、アドバンテ
ック社製のポリカーボネート・フィルター、0.40μmで加圧濾過し、リポソーム含有造影
剤を得た。
[実施例２]
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）368.4mgと、コレステロール147.4mg、ＰＥＧ基を有するリン脂質（日本油脂株式会社製、SUNBRIGHT DSPE-020CN）111.5mgの混合
物をステンレス製の特製オートクレーブに仕込み、次いで液体二酸化炭素13gを加えて、50℃、12 MPaの超臨界状態とした。次いで容器内を撹拌しながら、さらに造影剤溶液（日
局イオヘキソール溶液（ヨウド濃度300mg/mL）、トロメタモールを1mg/mL、エデト酸カルシウム２ナトリウム0.1mg/mLを含有し、適量の塩酸および水酸化ナトリウムでｐＨを７前後に調整）10mLを定量ポンプで連続的に注入した。注入終了後、系内を減圧して二酸化炭素を排出し、造影剤溶液を含有するリポソームの分散液を得た。得られた分散液を44℃にて30分間インキュベートした後、80℃まで加熱し、アドバンテック社製のポリカーボネート・フィルター、0.80μmで加圧濾過した。続いて、同様に80℃まで加熱し、アドバンテ
ック社製のポリカーボネート・フィルター、0.40μmで加圧濾過し、リポソーム含有造影
剤を得た。
[実施例３]
水素添加大豆ホスファチジルコリン（HSPC）394.0mgと、コレステロール147.4mg、ＰＥＧ基を有するリン脂質（日本油脂株式会社製、SUNBRIGHT DSPE-020CN）111.5mgの混合物
をステンレス製の特製オートクレーブに仕込み、次いで液体二酸化炭素13gを加えて、60
℃、12 MPaの超臨界状態とした。次いで容器内を撹拌しながら、さらに造影剤溶液（日局イオヘキソール溶液（ヨウド濃度300mg/mL）、トロメタモールを1mg/mL、エデト酸カルシウム２ナトリウム0.1mg/mLを含有し、適量の塩酸および水酸化ナトリウムでｐＨを７前後に調整）10mLを定量ポンプで連続的に注入した。注入終了後、系内を減圧して二酸化炭素を排出し、造影剤溶液を含有するリポソームの分散液を得た。得られた分散液を60℃にて2時間インキュベートした後、80℃まで加熱し、アドバンテック社製のポリカーボネート
・フィルター、0.80μmで加圧濾過した。続いて、同様に80℃まで加熱し、アドバンテッ
ク社製のポリカーボネート・フィルター、0.40μmで加圧濾過し、リポソーム含有造影剤
を得た。
[実施例４]
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）368.4mgと、コレステロール147.4mg、ＰＥＧ基を有するリン脂質（日本油脂株式会社製、SUNBRIGHT DSPE-020CN）111.5mgの混合
物をステンレス製の特製オートクレーブに仕込み、次いで液体二酸化炭素13gを加えて、50℃、12 MPaの超臨界状態にした。次いで容器内を撹拌しながら、さらに造影剤溶液（日
局イオヘキソール溶液（ヨウド濃度300mg/mL）、トロメタモールを1mg/mL、エデト酸カルシウム２ナトリウム0.1mg/mLを含有し、適量の塩酸および水酸化ナトリウムでｐＨを７前
後に調整）10mLを定量ポンプで連続的に注入した。注入終了後、系内を減圧して二酸化炭素を排出し、造影剤溶液を含有するリポソームの分散液を得た。得られた分散液を80℃まで加熱し、アドバンテック社製のポリカーボネート・フィルター、0.80μmで加圧濾過し
た。続いて、同様に80℃まで加熱し、アドバンテック社製のポリカーボネート・フィルター、0.40μmで加圧濾過し、リポソーム含有造影剤を得た。
[比較例１]
（Bangham法）
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）368.4mgと、コレステロール147.4mg、ＰＥＧ−リン脂質（日本油脂株式会社製、SUNBRIGHT DSPE-020CN）111.5mgの混合物をクロ
ロホルムとエタノールと水との混合物（重量比 100：20：0.1）10mLをメスフラスコ中で
混合した。この混合物を湯浴（65℃）上で加熱し、溶液をロータリー・エバポレータで溶媒を蒸発させた。残渣をさらに２時間、真空乾燥して、脂質フィルムを形成させた。ここに、さらに上記造影剤溶液10mLを混合し、この混合物を65℃に加熱しながらミキサーで約10分間撹拌した。さらに撹拌することにより造影剤溶液を含有するリポソームの分散液を得た。この混合物を80℃まで加熱し、アドバンテック社製のポリカーボネート・フィルター、0.80μmで加圧濾過した。続いて、同様に80℃まで加熱し、アドバンテック社製のポ
リカーボネート・フィルター、0.40μmで加圧濾過し、リポソーム含有造影剤を得た。

Claims (9)

1. 脂質膜内外に医薬化合物および１種類以上の生理的に許容される製剤助剤を含有するリポソームを含み、
   該リポソームが実質的に１枚膜〜10枚膜の脂質膜からなるリポソームであり、そのうち２枚膜〜数枚膜で構成されるリポソームが少なくとも７０％を占め、その脂質膜構成成分には、40〜65℃の範囲に転移温度のあるリン脂質が少なくとも１種含まれており、
   実質的に有機溶剤を含まないことを特徴とするリポソーム含有製剤。
2. 前記リポソームは、圧力容器内で40〜65℃、10〜30MPaの条件下、超臨界二酸化炭素と
   該リポソーム膜構成成分、医薬化合物および製剤助剤とを混合し、該圧力容器内を減圧して二酸化炭素を排出することによりその医薬化合物が内包されたリポソームの水性分散液を得て、その後、前記リン脂質の転移温度〜（該転移温度＋10）℃で、0.1〜3時間インキュベートして調製されたリポソームであることを特徴とする請求項１に記載のリポソーム含有製剤。
3. 前記リポソームの粒径について、（平均粒径−５％）〜（平均粒径＋５％）の範囲を有する粒子の割合が、リポソーム粒子全体の５０〜９０％を占めることを特徴とする請求項１または２に記載のリポソーム含有製剤。
4. 前記リン脂質が、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、水素添加大豆レシチン、水素添加大豆ホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンからなる群より1種以上選ばれることを特徴とする請求項１〜
   ３のいずれかに記載のリポソーム含有製剤。
5. 前記リン脂質には、ポリエチレングリコール（PEG）基を有するリン脂質が含まれるこ
   とを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のリポソーム含有製剤。
6. 前記リン脂質が、PEG-ジミリストイルホスファチジルコリンおよびPEG-ジパルミトイルホスファチジルコリンのうちの少なくとも１つであり、さらに該リポソーム内に非イオン型ヨウド系化合物および抗がん性化合物のうちの少なくとも１つを内包することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のリポソーム含有製剤。
7. 前記リポソーム膜構成成分として、少なくともリン脂質、ＰＥＧ基を有する脂質およびステロール類を含む脂質を含み、リン脂質（ＰＥＧ-リン脂質を含まず）/ステロール類のモル比が100/60〜100/90、リン脂質（ＰＥＧ-リン脂質を含まず）/ポリエチレングリコール基を有するリン脂質のモル比が100/5〜100/25であることを特徴とする請求項1〜６のいずれかに記載のリポソーム含有製剤。
8. 前記脂質膜内外における医薬化合物および製剤助剤の濃度がそれぞれ実質的に同じであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のリポソーム含有製剤。
9. （i）圧力容器内で40〜65℃、10〜30MPaで、超臨界二酸化炭素、リポソーム膜構成成分、医薬化合物および製剤助剤を混合して懸濁液を得る工程、
   （ii）次いで、系内を減圧して二酸化炭素を排出することにより、該医薬化合物が内包されたリポソームの水性分散液を調製する工程、
   （iii）その後、該医薬化合物が内包されたリポソームの水性分散液を、前記リン脂質の
   転移温度〜（該転移温度＋10）℃で、0.1〜3時間インキュベートし、次いで該医薬化合物が内包されたリポソームの水性分散液を50〜90℃、0.01〜0.8ＭＰaの圧力下で、ろ過して、平均粒径が0.05〜0.8μｍのリポソームに整粒する工程と、
   を有することを特徴とするリポソーム含有製剤の製造方法。