JP2006292680A - 固体支持体上において相互作用した生体分子を分析する方法およびそのための固体支持体 - Google Patents

Abstract

【課題】 多数の試料を迅速に分析する手段を提供し、核酸およびタンパク質等の生体分子の相互作用の分析を迅速に実施する方法を提供する
【解決手段】 生体分子を分析する方法であって、（ａ）試料中の生体分子をゲル電気泳動で分離し、ゲル中に分離された生体分子を固体支持体上に転写することにより、試料中の生体分子を固体支持体上に固定化すること、（ｂ）固体支持体上に固定化された生体分子にさらなる生体分子を相互作用させること、および（ｃ）固体支持体上に固定化された生体分子および／または該生体分子に相互作用したさらなる生体分子を質量分析することを含む、前記方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、相互作用した生体分子を質量分析することにより分析および解析する方法、およびそのための固体支持体およびキットに関する。

ペプチド、タンパク質、核酸および糖鎖など生体分子の多くは比較的少数の構成単位が一定の規則で重合してできている。例えば、ペプチドやタンパク質は２０種のＬ-α-アミノ酸がペプチド結合でつながった分子である。これらの構成単位の分子の構造は既にほとんどが明らかになっており、当然、それらの正確な分子量も明らかとなっている。従って、生体分子やその断片の分子量を正確に測定できれば、その構造（配列など）や生体内で受ける様々な修飾反応の解析に大きく寄与しうることから、質量分析法は核酸およびタンパク質等の生体分子の構造解析に欠かせない手段として位置づけられている。質量分析法では、質量分析装置（ＭＳ）を用いて生体分子をイオン化し、得られたイオンを質量電荷比（ｍ／ｚ値）に従って分離し、その強度を測定することにより、質量を決定する。

質量分析による生体分子の構造解析／決定には、分析対象を多数の成分に分離精製する必要があり、非常に多数の試料を分析しなければならない。また、遺伝子診断等においては、多数の人間から得た試料を迅速に処理する必要がある。

それに対し市販されている一般的な質量分析装置は、精製したそれぞれの試料をサンプルボードに配置し、これを１個ずつ質量分析していくものである。従って、未精製の試料を電気泳動により分離した場合は、泳動後のゲルをバンドごとに切り出してそれぞれ精製してから１種類ずつ質量分析する必要があり、多数の試料を迅速に分析することは非常に困難であった。

また、電気泳動した生体分子をゲルからニトロセルロース等のメンブレン上に転写してこれを分析する方法も知られているが、メンブレン上の分析においては、抗原抗体反応や核酸ハイブリダイゼーションを利用した蛍光検出等に限られる。なぜなら、従来使用されているニトロセルロースやＰＶＤＦ等のメンブレンに、例えばレーザを照射するとメンブレン自体の分解が起きる可能性が高く、上記メンブレンから生体分子を直接イオン化することが困難だからである。すなわち、これらのメンブレン上に転写された生体分子をそのまま質量分析装置で分析することは困難である。

一方、生体分子の相互作用の解析は、生体分子の機能を調べる手段として重要であるが、その手段としては、一方の生体分子を固体表面上に固定化し、候補となる生体分子を接触させて、候補生体分子が固定化された生体分子に結合するかどうかを検出する方法が一般的である。このような方法において、相互作用の有無のみであれば蛍光分析等により検出することができるが、相互作用した生体分子を同定するために質量分析を利用する場合は、上記と同様に、試料から生体分子をそれぞれ精製し、これを固体表面に固定化する必要があるため、迅速な分析が困難であった。

本発明の課題は、多数の試料を迅速に分析する手段を提供し、核酸およびタンパク質等の生体分子の相互作用の分析を迅速に実施する方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、試料中の生体分子を電気泳動で分離した後、固体支持体上に固定化し、これを質量分析することにより、生体分子の相互作用を迅速に分析できることを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）生体分子を分析する方法であって、
（ａ）試料中の生体分子をゲル電気泳動で分離し、ゲル中に分離された生体分子を固体支持体上に転写することにより、試料中の生体分子を固体支持体上に固定化すること、
（ｂ）固体支持体上に固定化された生体分子にさらなる生体分子を相互作用させること、および
（ｃ）固体支持体上に固定化された生体分子および／または該生体分子に相互作用したさらなる生体分子を質量分析すること
を含む、前記方法。
（２）固体支持体が表面にカーボン層を有するものである（１）記載の方法。
（３）カーボン層が、ダイヤモンドライクカーボン層である（２）記載の方法。
（４）カーボン層が化学修飾されているものである（２）または（３）記載の方法。
（５）（ｂ）の工程の後（ｃ）の工程の前に、固体支持体上に固定化された生体分子および／または相互作用した生体分子を酵素で分解することをさらに含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）生体分子がペプチドであり、酵素がプロテアーゼである（５）記載の方法。
（７）質量分析を、レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析によって行う（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載の方法において使用するための表面にカーボン層を有する固体支持体。
（９）（１）〜（７）のいずれかに記載の方法において使用するためのキットであって、表面にカーボン層を有する固体支持体を含む前記キット。

本発明により、生体分子の相互作用の分析を迅速に実施することができる。
従って、本発明は、核酸およびタンパク質等の生体分子の機能解析において非常に有用な手段となる。

本発明において、分析の対象となる生体分子は生体に由来する分子であり、特に制限されないが、核酸、ペプチドおよび糖鎖、ならびにこれらの誘導体などが含まれる。本明細書において、核酸にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。本明細書においてペプチドには、オリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質ならびにそれらの複合体が含まれる。ペプチド誘導体としては、その他のペプチドと融合した融合ペプチド、ポリエチレングリコールなどのポリマーに結合させた化学修飾ペプチド、および翻訳後修飾されたペプチドなどが含まれる。ペプチドの翻訳後修飾としては、リン酸化、アセチル化、メチル化、ミリストイル化、グリコシル化、アミド化およびユビキチン化などが挙げられる。

これらの生体分子を含む分析対象となる試料としては、特に制限されないが、細胞抽出物、菌体抽出物、無細胞系合成産物、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）産物、酵素処理産物、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、合成ペプチド等が挙げられる。

生体分子を固定化するための固体支持体は、分析対象となる生体分子を固定化できるものであれば特に制限されず、公知のものを使用でき、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等の合金；上記金属とセラミックスとの積層体；ガラス；シリコン；繊維；木材；紙；ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック等からなるものが挙げられる。

本発明においては、基板の表面にカーボン層を有する固体支持体を用いるのが好ましい。さらに、カーボン層に特定の化学修飾を施したものが好ましい。特定の化学修飾を施すことにより分析対象となる生体分子を保持しやすくなり、また安定に固定化できるからである。

本発明において基板とはカーボン層を形成させるもととなる基材を意味し、このような基材としては、特に制限されないが、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等の合金；上記金属とセラミックスとの積層体；ガラス；シリコン；繊維；木材；紙；ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック；およびプラスチックと上記金属、セラミックス、ダイヤモンド等との混合体を挙げることができる。ガラスまたはプラスチック等の表面にプラチナ、チタン等からなる金属層を形成させたものを使用することもできる。金属層の形成は、スパッタリング、真空蒸着、イオンビーム蒸着、電気めっき、無電解めっき等により実施することができる。

固定化された生体分子について、レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析等によって質量分析を行う場合、固体支持体に高電圧がかかるため、基板は導電性を有するもの、例えば、ステンレス、アルミニウム、チタン等の金属が好ましい。

本発明において基板上に形成させるカーボン層としては、特に制限されないが、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、無定形炭素、グラファイト、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロムまたは炭化バナジウム等からなる層を挙げることができ、ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）層が好ましい。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾や分析対象物質との結合における反応に耐えることができる点、分析対象物質と静電結合によって結合するためその結合が柔軟性を持っている点、ＵＶ吸収がないため検出系ＵＶに対して透明性である点、およびエレクトロブロッティングの際に通電可能な点において有利である。また、分析対象物質との結合反応において、非特異的吸着が少ない点においても有利である。

本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。

高周波プラズマＣＶＤ法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基板上にＤＬＣ（ダイヤモンドライクカーボン）層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス１〜９９体積％と残りメタンガス９９〜１体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりＤＬＣ層を形成してもよい。

アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。

レーザ蒸着法では、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。

本発明の固体支持体表面のカーボン層の厚さは、通常、単分子層〜１００μｍ程度であり、薄すぎると下地基板の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚くなると生産性が悪くなるので、好ましくは２ｎｍ〜1μｍ、より好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍである。なお、固体支持体のすべてが炭素材料で構成されていてもよい。

質量分析を行うため、本発明の固体支持体の形状は平板状であることが好ましい。そのサイズは、特に制限されないが、通常は、幅１０〜２００ｍｍ×長さ１０〜２００ｍｍ×厚み０．１〜２０ｍｍ程度である。

生体分子を固定化するためには、カーボン層が形成された基板の表面を化学修飾することが好ましい。このような化学修飾は、当業者であれば適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基および活性化エステル基を導入することが挙げられる。また、ニッケルキレート、コバルトキレート等の金属キレートを導入することも有効である。

アミノ基の導入は、例えば、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。または、カーボン層を塩素ガス中で紫外線を照射して塩素化し、さらにアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。または、メチレンジアミン、エチレンジアミン等の多価アミン類ガスを、塩素化したカーボン層と反応させることによって実施することもできる。

カルボキシル基の導入は、例えば、上記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価カルボン酸を反応させることにより実施できる。

エポキシ基の導入は、例えば、上記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価エポキシ化合物を反応させることによって実施できる。あるいは、カーボン層が含有する炭素＝炭素２重結合に有機過酸を反応させることにより得ることができる。有機過酸としては、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸などが挙げられる。

ホルミル基の導入は、例えば、上記のようにアミノ化したカーボン層に、グルタルアルデヒドを反応させることにより実施できる。

ヒドロキシル基の導入は、例えば、上記のように塩素化したカーボン層に、水を反応させることにより実施できる。

活性化エステル基の導入は、例えば、塩素ガス中でカーボン層に紫外線を照射して表面を塩素化し、ついで、アンモニアガス中で紫外線を照射してアミノ化した後、適当な酸クロリドまたはジカルボン酸無水物を用いてカルボキシル化し、末端のカルボキシル基をカルボジイミドまたはジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと脱水縮合することにより実施できる。この処理により、アミド結合を介して炭化水素基の末端に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基等の活性化エステル基が結合した基を形成することができる（特開２００１−１３９５３２）。

ＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸を保持する場合は、アミノ基、カルボジイミド基、エポキシ基、ホルミル基または活性化エステル基を導入するのが好ましい。

ペプチドを保持する場合は、アミノ基、カルボジイミド基、エポキシ基、ホルミル基、金属キレートまたは活性化エステル基を導入するのが好ましい。金属キレートを導入した固体支持体を使用すると、ポリヒスチジン配列等の金属イオンと親和性のある標識を有するペプチドを効果的かつ安定に固定化することができる。金属キレートの導入は、例えば、カーボン層が形成された基板を塩素化し、次いでこれをアミノ化した後、クロロ酢酸等のハロカルボン酸を添加してキレート配位子を導入することにより実施できる。ポリヒスチジン配列等の標識は、当業者に公知の方法により導入することができる。

また、上記化学修飾は、表面カーボン層上に静電層を形成することにより行ってもよい。該静電層は、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。

前記アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ_２）、または炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えばエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、またはこれらの重合体（例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン）や共重合体；４,４’,４”-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられる。

静電層は、基板またはカーボン層と共有結合させずに形成してもよく、基板またはカーボン層と共有結合させて形成してもよい。

静電層を基板またはカーボン層と共有結合させずに形成する場合には、例えば、カーボン層を製膜する際に前記アミノ基含有化合物を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有する炭素系皮膜を製膜する。製膜装置内に導入する化合物として、アンモニアガスを用いてもよい。また、表面処理層は、密着層を形成した後にアミノ基を含有する皮膜を形成するといった、複層であってもよく、この場合もアンモニアガスを含んだ雰囲気で行ってもよい。製膜は、例えばプラズマ法によって実施できる。

また、静電層を基板またはカーボン層と共有結合させずに形成する場合には、静電層と基板またはカーボン層との親和性、即ち密着性を高める点で、基板上に、前記の非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物および炭素化合物を蒸着させることが好ましい。ここで用いる炭素化合物としては、気体として供給することができれば特に制限はないが、例えば常温で気体であるメタン、エタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオン化蒸着法が好ましく、イオン化蒸着法の条件としては、作動圧が０．１〜５０Ｐａ、そして加速電圧が２００〜１０００Ｖの範囲であることが好ましい。

静電層を基板またはカーボン層と共有結合させて形成する場合には、例えば、基板またはカーボン層を施した基板に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記ｒアミノ基含有化合物のうち、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４,４',４”-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基板と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。

基板を、非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより、静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基板との密着性に優れ、生体分子の固定化量がより向上する。アミノ基含有化合物とともにシランカップリング剤が共存する溶液に基板を浸漬することにより、静電層を形成することもできる。
静電層の厚みは、１ｎｍ〜５００μｍであることが好ましい。

本発明の生体分子の分析方法においては、
（ａ）試料中の生体分子をゲル電気泳動で分離し、ゲル中に分離された生体分子を固体支持体上に転写することにより、試料中の生体分子を固体支持体上に固定化すること、
（ｂ）固体支持体上に固定化された生体分子にさらなる生体分子を相互作用させること、および
（ｃ）固体支持体上に固定化された生体分子および／または該生体分子に相互作用したさらなる生体分子を質量分析すること
により、生体分子を分析する。

試料の分離に使用できるゲル電気泳動法としては、特に制限されないが、例えば、アガロースゲル電気泳動法、ｓｉｅｖｉｎｇアガロースゲル電気泳動法、変性アガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法、等電点ゲル電気泳動法および二次元電気泳動法などを挙げることができる。当業者であれば、分離の対象となる物質の種類および分子量等から使用する電気泳動法の種類を適宜選択することができる。

アガロースゲル電気泳動法は、核酸を分離するために最もよく利用される手法である。アガロースゲルはポリアクリルアミドゲルと比較してゲルの網目構造が大きいため、数十〜数百ＫｂｐのＤＮＡフラグメントを長さや分子構造の違いで分離することができる。ＤＮＡフラグメント全体の荷電状態は主にリン酸基の数に依存するため、移動度はＤＮＡフラグメントの大きさに比例する。電場方向を断続的に変化させて泳動すると酵母染色体などの巨大ＤＮＡを分離することもできる（パルスフィールド電気泳動）。

核酸のポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ＤＮＡフラグメントの解析に主に用いられ、ポリアクリルアミドゲルの微細な網目構造を利用して、アガロースゲル電気泳動の場合に比較して短鎖（〜１Ｋｂｐ）のフラグメントを長さと構造に基づいて分離する手法である。ＤＮＡの立体構造（コンフォメーション）の影響を強く受けるため、ＤＮＡ鎖長の推定は二本鎖ＤＮＡを泳動する場合に限られる。一本鎖ＤＮＡは様々な構造を取ることが予想されるので移動度とそのＤＮＡ鎖長との間に相関は見られず、しばしば複数のバンドとして検出されることもある。ＤＮＡ塩基のわずかな違いでも構造変化がおこり、泳動パターンに反映される。これを利用したＤＮＡフラグメント解析手法（ＳＳＣＰ：Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）も開発され遺伝子変異解析に利用されている。特殊な配列（繰返し配列や塩基の偏りなど）を含む二本鎖ＤＮＡフラグメントはＤＮＡ構造を歪めることが知られており、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法はＤＮＡの構造・機能解析にも使用できる。また、尿素などを含む変性ゲル中では、一本鎖ＤＮＡも構造の影響を受けることなく鎖長に応じて分離できる。

ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）は、目的タンパク質の高次構造を変性して分子量の違いにより分離する手法である。ポリアクリルアミドゲルは、ゲル中の細孔径が密なため１００〜２００ＫＤａ以下のタンパク質やポリペプチドを分離するのに適している。操作が簡便で再現性が高いので、タンパク質の電気泳動では最もよく用いられている手法である。通常は、泳動サンプルの調製時にβ-メルカプトエタノールやＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）などの還元剤を添加してタンパク質のＳ−Ｓ結合（ジスルフィド結合）を切断する。ＳＤＳの結合量によって分子の電荷がほぼ決まるため、電気泳動によりポリペプチド分子を分子量に従って分離することができる。ＳＤＳは強力な陰イオン界面活性剤なので、膜タンパク質などの不溶性タンパク質の可溶化にも適している。

等電点電気泳動は、タンパク質の等電点（ｐＩ）の違いを利用して分離し、目的タンパク質の等電点測定や分析を行う泳動手法である。タンパク質を構成しているアミノ酸側鎖やアミノ末端、カルボキシル末端の電荷はｐＨ条件によって変化し、電荷の総和がゼロになるｐＨの値が等電点となる。等電点電気泳動を行うには、泳動ゲル中にｐＨ勾配を作る必要がある。サンプルを泳動ゲルに添加して電場をかけると、それぞれのタンパク質は固有のｐＩと同じｐＨに向かってｐＨ勾配を形成したゲル中を移動する。ｐＨ勾配ゲルの作製には、両性担体（キャリアアンフォライト）をゲルに添加して電場をかけてｐＨ勾配を形成する手法と、様々なｐＩの側鎖を持つアクリルアミド誘導体を用いてゲル作製と同時にｐＨ勾配を形成する手法（ＩＰＧ法：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔ）とがあり、プロテオミクス研究では、分離能、再現性、添加許容量ともに優れるＩＰＧ法が主に用いられている。ＩＰＧ法専用のプレキャストゲル（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ＤｒｙＳｔｒｉｐ Ｇｅｌ）が市販されている。キャリアアンフォライトを用いる等電点泳動の分離能は０．０１〜０．０２ｐＨ単位で、ＩＰＧ法では０．００１ｐＨ単位の違いでも分離することができる。

二次元電気泳動法は、二段階の電気泳動によりタンパク質を二次元に分離する方法である。一般的に一次元目は等電点電気泳動によりタンパク質を分離し、二次元目はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子量で分離する。いずれの手法も分離能が非常に高いので、細胞全タンパク質を数千以上にもおよぶスポットに分離することができる。再現性と解像度に優れた固定化ｐＨ勾配法（ＩＰＧ法）を一次元目泳動に用いることが一般的である。また、より多くのスポットを得るために、幅広いｐＨレンジの分離結果を基にしてＮａｒｒｏｗ ｐＨ ＩＰＧゲルで目的ｐＨ部分のみを分離したり、２０ｃｍ以上の大型ゲルを用いて二次元目電気泳動を行うこともできる。

本発明においては、核酸を分離する場合は、アガロースゲル電気泳動法を使用するのが好ましく、ペプチドを分離する場合は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法および二次元電気泳動法を使用するのが好ましい。

電気泳動後、ゲルを、固体支持体に載る大きさに切り出し、ゲルと固体支持体とを密着させて、ゲル中に分離された生体分子を本発明の固体支持体上に転写する。固体支持体への転写方法としては、特に制限されず、当技術分野で通常用いられる方法を使用することができる。例えば、毛細管現象を利用したキャピラリー式ブロッティング、ポンプにより吸引するバキューム式ブロッティングおよび電気的手法を用いるエレクトロブロッティングが挙げられる。核酸を転写する場合は、キャピラリー式ブロッティングを使用するのが好ましく、ペプチドを転写する場合は、エレクトロブロッティングを使用するのが好ましい。

エレクトロブロッティングにおいては、タンク式、セミドライ式およびセミウェット式のいずれも使用することができるが、バッファー使用量の少なさや、反応時間の短さ等の観点からセミドライ式エレクトロブロッティングを使用するのが好ましい。ブロッティング装置としては、当技術分野で通常用いられているエレクトロブロッティング装置を使用することができる。エレクトロブロッティングにおける通電条件は、定電圧、２００Ｖ以下、好ましくは０．１〜１０Ｖで、１〜５００分間、好ましくは５〜１００分間が好ましい。ただし、電圧を金属基板の酸化電位より高くすると金属の溶出がおこるため、基板金属の酸化電位より低い電圧で行うのが好ましい。

以下に、試料中のペプチドを分析する場合の本発明における電気泳動および転写の一態様を示す。まず、試料中のペプチドを可溶化する。すなわち、試料に存在するペプチド分解酵素を失活させるとともに、ＳＤＳとβ−メルカプトエタノールによってペプチドを効果的に変性させる目的で沸騰水中で一定時間熱処理する。次にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの各レーンに一定量注入し、ＳＤＳを含むグリシン−トリスバッファーを泳動用バッファーとして、一定電圧で一定時間泳動させる。泳動後、ゲルをあらかじめ冷却しておいたメタノールを含むグリシン−トリスバッファー（転写用バッファー）に一定時間浸漬し、平衡化する。

続いて、ゲルを陰極側、転写用固体支持体を陽極側としてエレクトロブロッティング装置に装着する。転写槽には転写用バッファーを加え、氷冷下、定電圧で一定時間転写を行う。このとき、転写効率を上げる観点から、陰極とゲルの間、および陽極と固体支持体の間に、バッファーやイオン交換水を含ませたろ紙を配置するのが好ましい。陰極側のろ紙に含ませるバッファーとしては、ホウ酸、Ｔｒｉｓ、ε−アミノカプロン酸、酢酸、ＥＤＴＡ、リン酸、酒石酸、ＳＤＳ等を含むものが挙げられる。ホウ酸、Ｔｒｉｓおよびε−アミノカプロン酸を含むバッファーを用いる場合、ε−アミノカプロン酸の濃度は通常、１０００ｍＭ以下、好ましくは１μＭ〜１０００ｍＭ、より好ましくは１〜３００ｍＭである。陽極側のろ紙には、イオン交換水を含ませるのが好ましい。また、陽極側のろ紙は、存在しなくてもよい。

さらなる生体分子の相互作用は、上記のようにして生体分子が固定化された固体支持体上に、相互作用する可能性のある生体分子を含む試料を接触させることにより実施することができる。相互作用させた後は、相互作用しないその他の生体分子を除去するため、固体支持体を洗浄する。

本発明の生体分子の分析方法は、ゲル中に分離された生体分子を固体支持体上に直接転写する場合だけでなく、メンブレンを介して転写する場合も包含する。従って、本発明の分析方法の一実施形態においては、ゲル中に分離された生体分子をメンブレン上に転写し、該メンブレン上に転写された生体分子を固体支持体上に転写することにより、試料中の生体分子を固体支持体上に固定化することもできる。すなわち、生体分子のゲルから固体支持体への転写において、固体支持体に直接転写するのではなく、一度生体分子をメンブレン上に転写し、該メンブレン上に転写された生体分子を固体支持体上に転写してもよい。

この場合に使用できるメンブレンの材質としては、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、ナイロンおよびポジティブチャージナイロン等が挙げられる。タンパク質の転写においては、タンパク質の結合能力が最も高いＰＶＤＦを使用するのが好ましく、核酸の転写においても核酸の非特異吸着が少ないＰＶＤＦを使用するのが好ましい。泳動物質のゲルからメンブレンへの転写およびメンブレンから固体支持体への転写は、上記と同様の方法により実施できる。ゲルからメンブレンへの転写においては、エレクトロブロッティングを使用するのが好ましく、エレクトロブロッティングにおける通電条件は、０．１〜５０Ｖで、５〜１２０分間程度が好ましい。メンブレンから固体支持体への転写においても、エレクロトブロッティングを利用するのが好ましい。

本発明の一実施形態では、固体支持体上に固定化された生体分子にさらなる生体分子を相互作用させた後、質量分析する前に、固体支持体に固定化された生体分子および／または該生体分子に相互作用した生体分子を酵素で分解する。そして酵素分解により得られた分解物を質量分析してもよい。

質量分析装置において分析できる生体分子の分子量には制限があるため、高分子量の生体分子を解析するには、上記のように酵素分解を行うのが好ましい。高分子量の生体分子、例えば高分子量ペプチド、すなわちタンパク質を特定のプロテアーゼで分解し、得られたペプチド断片を質量分析し、得られたデータと公知の断片データとを比較することによりペプチドを同定することができる。このような方法は、マスフィンガープリンティング法とも称される。当該方法は、高分子量の生体分子、例えば分子量５〜２００ｋＤａ、好ましくは５〜１００ｋＤａの生体分子の分析において特に好適である。また、相互作用させる生体分子が高分子である場合に特に好適である。

生体分子を分解するための酵素は、マスフィンガープリンティング法で使用できるものであれば特に制限されず、当業者であれば、分析対象となる生体分子に応じて選択することができる。核酸を分析する場合は、酵素としてヌクレアーゼ、特に制限酵素（例えば、ＲＥＢＡＳＥのデータベースに記載のもの）を使用する。ヌクレアーゼとしては、例えば、Ｓ１ ヌクレアーゼ、蛇毒ヌクレアーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、マングマメヌクレアーゼ、アカパンカビヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｈ、膵臓ＤＮａｓｅI、Ｂａｌ３１、ＥｘｏI、ＥｘｏIII、ＥｘｏVII、λエキソヌクレアーゼ、ＡａｒI、ＡａｔII、ＡｃｃI、ＡｃｅIII、ＡｃｉI、ＡｃｌI、ＡｃｙI、Ｈｉｎ１I、ＡｆｌII、ＡｆｌIII、ＡｇｅI、ＡｈａIII、ＡｌｆI、ＡｌｏI、ＡｌｕI、ＡｌｗＮI、ＡｐａI、ＡｐａＢI、ＡｐａＬI、ＡｐｏI、ＡｓｃI、ＡｓｐＣＮI、ＡｓｕI、Ｃｆｒ１３I、ＡｓｕII、ＢｓｐＴ１０４I、ＡｖａI、ＡｖａII、ＶｐａＫ１１ＢI、ＥｃｏＴ２２I、ＢｌｎI、ＢｂｖII、ＢｂｖＣI、ＢｃｃI、ＢｃｅｆI、Ｂｃｅ８３I、ＢｃｇI、ＢｃｉＶI、ＦｂａI、ＢｅｔI、ＢｆｉI、ＢｇｌI、ＢｇｌII、ＢｉｎI、ＢｍｇI、ＢｐｌI、Ｂｐｕ１０I、ＢｓａＡI、ＢｓａＢI、ＢｓａＸI、ＢｓｂI、ＢｓｃＧI、ＢｓｅＭII、ＢｓｅＰI、ＢｓｅＲI、ＢｓｅＳI、ＢｓｅＹI、ＢｓｇI、ＢｓｉＹI、ＢｓｍI、ＢｓｍＡI、ＢｓｐＧI、ＢｓｐＨI、ＢｓｐＬＵ１１I、ＢｓｐＭI、ＢｓｐＧII、ＢｓｐＮＣI、Ｂｓｐ２４I、Ｂｓｐ１４０７I、ＢｓｒI、ＢｓｒＢI、ＢｓｒＤI、ＢｓｔＥII、ＢｓｔＰI、ＥｃｏＯ６５I、ＢｓｔＸI、ＢｔｇＺI、ＢｔｒI、ＢｔｓI、Ｃａｃ８I、ＣａｕII、ＢｃｎI、ＣｄｉI、ＣｆｒI、ＥａｅI、Ｃｆｒ１０I、ＣｊｅI、ＣｊｅＰI、ＣｌａI、ＣｖｉＪI、ＣｖｉＲI、ＣｄｅI、ＤｐｎI、ＤｒａII、ＤｒａIII、ＤｒｄI、ＤｒｄII、ＤｓａI、Ｅａｍ１１０５I、ＥｃｏＮI、ＥｃｉI、ＥｃｏＮI、ＥｃｏＲI、ＥｃｏＲII、ＭｖａI、ＥｃｏＲＶ、Ｅｃｏ３１I、Ｅｃｏ４７III、Ａｏｒ５１ＨI、Ｅｃｏ５７I、Ｅｃｏ５７ＭI、ＥｓｐI、Ｂｐｕ１１０２I、Ｅｓｐ３I、ＦａｌI、ＦａｕI、ＦｉｎI、ＦｎｕＤII、ＡｃｃII、Ｆｎｕ４ＨI、ＦｏｋI、ＦｓｅI、ＦｓｐＡI、ＧｄｉII、ＧｓｕI、ＨａｅI、ＨａｅII、ＨａｅIII、ＨａｅIV、ＨｇａI、ＨｇｉＡI、ＨｇｉＣI、ＢｓｐＴ１０７I、ＨｇｉＥII、ＨｇｉＪII、ＢａｎII、ＨｈａI、ＨｉｎｄII、ＨｉｎｃII、ＨｉｎｄIII、ＨｉｎｆI、Ｈｉｎ４I、Ｈｉｎ４II、ＨｐａI、ＨｐａII、ＨａｐII、ＭｓｐI、ＨｐｈI、Ｈｐｙ９９I、Ｈｐｙ１７８III、Ｈｐｙ１８８I、ＫｐｎI、Ｋｓｐ６３２I、ＭａｅI、ＸｓｐI、ＭａｅII、ＭａｅIII、ＭｂｏI、Ｓａｕ３ＡI、ＭｂｏII、ＭｃｒI、ＭｆｅI、ＭｕｎI、ＭｊａIV、ＭｌｕI、ＭｍｅI、ＭｎｌI、ＭｓｔI、ＮｓｂI、ＭｗｏI、ＮａｅI、ＮａｒI、ＢｂｅI、ＮｃｏI、ＮｄｅI、ＮｈｅI、ＮｌａIII、ＮｌａIV、ＮｏｔI、ＮｒｕI、ＮｓｐI、ＮｓｐＢII、ＯｌｉI、ＰａｃI、ＰｆｌＭI、Ｐｆｌ１１０８I、ＰｆｏI、ＰｌｅI、ＰｍａＣI、ＰｍｅI、ＰｐｉI、ＰｐｕＭI、ＰｓｈＡI、ＰｓｉI、ＰｓｒI、ＰｓｔI、ＰｖｕI、ＰｖｕII、ＲｌｅＡI、ＲｓａI、ＡｆａI、ＲｓｒII、ＣｐｏI、ＳａｃI、ＳａｃII、ＳａｌI、ＳａｎＤI、ＳａｐI、ＳａｕI、Ｅｃｏ８１I、ＳｃａI、ＳｃｒＦI、ＳｄｕI、Ｂｓｐ１２８６I、ＳｅｃI、ＳｅｘＡI、ＳｆａＮI、ＳｆｅI、ＳｆｉI、ＳｇｆI、ＳｇｒＡI、ＳｉｍI、ＳｍａI、ＳｍｌI、ＳｎａI、ＳｎａＢI、ＳｐｅI、ＳｐｈI、ＳｐｌI、ＳｒｆI、Ｓｓｅ８３８７I、Ｓｓｅ８６４７I、ＳｓｐI、Ｓｔｈ１３２I、ＳｔｕI、ＳｔｙI、ＥｃｏＴ１４I、ＳｗａI、ｔａｑI、ｔａｑII、ｔａｔI、ＴａｕI、ＴｆｉI、ＴｓｅI、ＴｓｐＤＴI、ＴｓｐＥI、ＴｓｐＧＷI、ＴｓｐＲI、Ｔｓｐ４ＣI、Ｔｓｐ４５I、Ｔｔｈ１１１I、Ｔｔｈ１１１II、ＵｂａＤI、ＵｂａＥI、ＵｂａＧI、ＵｂａＨI、ＵｂａＮI、ＵｂａＰI、ＶｓｐI、ＰｓｈＢI、ＸｂａI、ＸｃｍI、ＸｈｏI、ＸｈｏII、ＭｆｌI、ＸｍａIII、Ｅｃｏ５２IおよびＸｍｎI等が挙げられる。

ペプチド、特にタンパク質を分析する場合は、酵素としてプロテアーゼを使用する。プロテアーゼとしては、例えば、トリプシン、ＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒプロテアーゼI（ＡＰI、リジルエンドペプチダーゼ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｖ８ プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、トロンビン、アミノペプチダーゼＭ、ブロメライン、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＰ、カルボキシペプチダーゼＹ、カテプシンＣ、キモトリプシンＡ、クロストリパイン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｎｅｕｔｒａｌ）、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（プロテアーゼＶ８）、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、Ｘａ因子、フィシン、ロイシンアミノペプチダーゼ、パパイン、ペプシン、プラスミン、プロナーゼ、プロテイナーゼＫ、ピログルタメートアミノペプチダーゼ、スブチリシン、サーモリシン、トロンビンを使用することができる。タンパク質をプロテアーゼで分解する場合、通常２５〜４２℃、より好ましくは３５〜３９℃で、１〜２４時間反応を行う。

ここで分解物とは、生体分子を酵素で分解することによって得られる小分子を意味し、長鎖核酸分子を酵素分解して得られる核酸断片、およびポリペプチド、オリゴペプチドまたはタンパク質を酵素分解して得られるペプチド断片が包含される。

酵素分解では、塩はイオン化を阻害するため、塩濃度を薄くするか、揮発性の塩を使用するのが好ましい。また、酵素分解反応中の溶液乾燥は切断反応を停止させるため、湿度を保って乾燥を防ぐのが好ましい。

本発明では、マスフィンガープリント法により、固体支持体上に固定化された生体分子をおよび／または該生体分子と相互作用した生体分子を同定することができる。すなわち、生体分子の酵素分解物に含まれる多数の消化断片に由来するイオンの質量を測定し、既知のデータベースと比較することにより、生体分子を同定することができる。さらに、低分子化処理により、ＭＡＬＤＩ特有のポストソースディケイ（ＰＳＤ）解析ができるようになるためＭＳ／ＭＳ解析で容易にアミノ酸配列等を決定できる。このため、データベースサーチにＭＳ／ＭＳ解析のデータを使ったデータベース検索ができる。

ペプチドを同定するためのデータベースとしては、例えば、Ｍａｓｃｏｔ、ＭＳ−Ｔａｇ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅａｒｃｈ、ＰｅｐＦｒａｇ、ＳＥＱＵＥＳＴなどが挙げられる（実験医学別冊、ポストゲノム時代の実験講座２、プロテオーム解析法、羊土社（２０００））。

既に述べたような方法により、タンパク質が固体支持体上に固定化される場合は、該タンパク質に対する抗体または抗体断片を反応させて複合体を形成し、タンパク質に結合した抗体または複合体をイオン化することにより質量分析を行うことができ、該タンパク質に対する特異的な抗体の同定や抗体のエピトープ部位を決定することができる。また、抗体断片が固体支持体上に固定化される場合は、タンパク質（抗原）を反応させて複合体を形成し、タンパク質または複合体をイオン化することにより質量分析を行うこともできる。

さらに、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸が固体支持体上に固定化される場合は、該核酸に対して相補的な核酸を固体支持体上の核酸にハイブリダイズさせ、形成した二本鎖をイオン化して質量分析を行うことができる。その他の相互作用としては、例えば、リガンドと受容体の相互作用、酵素と基質の反応、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用等が挙げられる。相互作用によって形成した複合体または相互作用した生体分子の質量分析を行うことにより、プローブ分子に特異的に相互作用したターゲット分子を同定し、その塩基配列またはアミノ酸配列を解析することができる。

本発明の別の態様においては、生体分子の相互作用を分析することを目的として、溶液中で相互作用する生体分子の複合体を形成した後、これを電気泳動に付し、電気泳動によって分離された複合体を固体支持体上に固定化し、固体支持体上の複合体をイオン化することによって質量分析を行うこともできる。このような分析方法は、溶液中で複合体形成を行うものであるため、タンパク質の分析など、分析対象分子の立体構造を高度に保持する必要がある解析に有利である。

質量分析方法として、電気的相互作用を利用して原子・分子のイオンを質量の違いによって分析する手法を使用できる。このような質量分析方法は、イオンの生成・分離・検出の３つの工程を含む。

固体支持体上に固定化された生体分子の酵素分解物を質量分析する方法としては、特に制限されず、当技術分野で公知のものを使用できる。質量分析する際に使用できるイオン化法の様式としては、レーザー脱離法、特にマトリックス補助レーザ脱離（ＭＡＬＤＩ）法、電子衝撃によるイオン化（ＥＩ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、光イオン化法、放射性同位体から放射されるＬＥＴの大きなαまたはβ線を使用するイオン化法、２次イオン化法、高速原子衝突イオン化法、電界電離イオン化法、表面電離イオン化法、化学イオン化（ＣＩ）法、フィールドイオン化（ＦＩ）法、火花放電によるイオン化法等が挙げられ、マトリックス補助レーザ脱離（ＭＡＬＤＩ）法が好ましい。また、分離様式としては、線形または非線形反射飛行時間型（ＴＯＦ）、単一または多重四重極型、単一または多重磁気セクター型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）型、イオン捕獲型、高周波型ならびにイオン捕獲／飛行時間型等が挙げられ、線形または非線形反射飛行時間（ＴＯＦ）型、高周波およびイオン捕獲／飛行時間型を用いるものが好ましい。上記のようなイオン化法と分離様式、電気的記録ならびに写真記録のような検出様式とを組み合わせることにより質量分析を実施することができる。具体的には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、ＥＳＩ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ、ＭＡＬＤＩ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ等が挙げられる。生体分子などの高分子物質をイオン化し、固体支持体上の複数の分子を分析するという観点からは、レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析、特にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを利用するのが好ましい。

以下に本発明の一態様として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いたペプチドの質量分析の手順を説明する。

分析対象が固定化された本発明の固体支持体にマトリックス溶媒を添加し、乾燥させる。マトリックス溶媒としては、α-シアノヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸などを含むものを使用できる。本発明においては、０．５〜８０％、好ましくは１〜５０％のα-シアノヒドロキシ桂皮酸、１〜８０％、好ましくは２０〜７０％のアセトニトリルを含むマトリックス溶媒を用いるのが好ましい。マトリックス溶媒はさらにトリフルオロ酢酸を含んでいてもよい。このようなマトリックスを用いることによりマトリックス溶媒がレーザーのエネルギーを効果的に吸収して、そのエネルギーが間接的にペプチドに伝わり、イオン化が起こる。次ぎに該固体支持体を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのフラットターゲットに設置する。そして、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウエア等を用いて質量分析を開始する。ＭａｓｓＬｙｎｘによって測定と解析の全てをコントロールすることができる。測定時に、自動測定のパラメーターファイルと、測定後に行うデータプロセスおよびデータベース解析のプロセスファイル、ならびに試料リストなどを作成する。データプロセシングは、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘソフトウエアを用いてＭａｓｓＬｙｎｘ上で行うことができる。取り込まれたデータから質量スペクトルを作成し、作成されたスペクトルは、ＭａｘＥｎｔ ３ソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社）により、精度を高めた後、モノアイソトピック・ピークデータに変換する。続いてキャリブレーションを行い質量誤差約５０ｐｐｍの最終データとする。

固体支持体にペプチドが固定化され、該ペプチドにさらなるペプチドが相互作用で結合している場合、質量分析に続いてペプチドのアミノ酸配列分析および同定を行うことができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの分析モードをポストソースディケイ(ＰＳＤ)スペクトルを検出できるモードにし、ペプチドのアミノ酸配列を分析する。続いて、アミノ酸配列データを基にＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースを検索し、ペプチドを同定する。あるいは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳやＭＡＬＤＩ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳにペプチドが固定化された固体支持体を設置してアミノ酸配列を分析し、ペプチドを同定することができる。

本発明はまた、上記の生体分子の分析方法において使用するためのキットであって、表面にカーボン層を有する固体支持体を含むキットに関する。本発明のキットは、表面にカーボン層を有する固体支持体を含み、本発明の分析方法に使用するためのものであることを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。表面にカーボン層を有する固体支持体に加え、例えば、生体分子を分解するための酵素、緩衝液、マトリックス溶媒、洗浄バッファー、試料希釈液、反応停止液、標準物質等を含みうる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）タンパク質−ペプチド間の相互作用の検出
ステンレス基板にダイヤモンドライクカーボン層を形成した。ステンレス基板は、平滑性と蛍光バックグラウンドを下げるために、予めバフ研磨後、更に電解研磨を施した。ダイヤモンドライクカーボン層の形成はイオン化蒸着法により以下の条件で行った。生成したダイヤモンドライクカーボン層の厚みは、２０ｎｍであった。また、アンモニアプラズマ処理することによりアミノ基を導入し固体支持体を作成した。

ダイズ由来の４３ｋＤａプロテイン（Basic 7S Globulin Precursor、ＮＣＢＩアクセッション番号：Ｓ０６７５０）は細胞膜付近に局在しており、４ｋＤａペプチド（leginsulin precursor、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＢＡＡ０４２１９）やインスリンと結合することが知られている（Possible physiological function and the tertiary structure of a 4-kDa peptide in legumes. Eur. J. Biochem. 270, 1269-1276, 2003.を参照）。ダイズから精製した４３ｋＤａプロテイン（１μｇ及び１００ｎｇ、ＳＩＧＭＡ社製）を上記固体支持体にスポットした。湿箱にて３７℃で３０分間反応させ、超純水で洗浄し、乾燥させた。

４ｋＤａペプチド（１００μｇ、ＳＩＧＭＡ社製）を相互作用バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）３ｍＬに溶かし、４３ｋＤａプロテインを固定化した固体支持体と３時間相互作用させた。洗浄バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）にて１０分間を２回洗浄して、超純水で洗浄し、乾燥させた。マトリックス溶媒（１ｍｇ／ｍＬ α−シアノヒドロキシ桂皮酸、５０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）をスポットし、自然乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定を行った。検出されたシグナルは質量スペクトルより４ｋＤａペプチド由来のものであることが確認された。

（実施例２）タンパク質−ペプチド間の相互作用の検出
Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ（カルモジュリン）は細胞内で他のタンパク質やペプチドとカルシウム依存的な相互作用を示すことが知られている。カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）はカルモジュリンとの結合部位認識部位を持つペプチドである。カルモジュリン（１μｇ及び１００ｎｇ、ＳＩＧＭＡ社製）を実施例１で作成した固体支持体にスポットした。湿箱にて３７℃で３０分間反応させ、超純水で洗浄し、乾燥させた。

ＣＢＰ（１００μｇ、東レリサーチセンター社製）を相互作用バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）３ｍＬに溶かし、カルモジュリンを固定化した固体支持体と３時間相互作用させた。洗浄バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）にて１０分間を２回洗浄して、超純水で洗浄し、乾燥させた。マトリックス溶媒（１ｍｇ／ｍＬ α−シアノヒドロキシ桂皮酸、５０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）をスポットし、自然乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定した。検出されたシグナルは質量スペクトルよりＣＢＰ由来のものであることが確認された。

（実施例３）タンパク質−ペプチド間の相互作用の検出
ダイズから精製した４３ｋＤａプロテイン（１μｇ及び１００ｎｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（日本エイドー社製 ＮＡ−１０１０型）による電気泳動に付した。泳動用のゲルとしては、１０％ポリアクリルアミドゲルを使用した。泳動用バッファーは０.１％ＳＤＳを含むグリシン―トリスバッファーを用い、泳動は１５０Ｖで６０分間行った。

泳動後のゲルを取り出し、実施例１で作成した固体支持体に載る大きさに切った後、１０％メタノールでゲルを洗浄後、新しい１０％メタノールに交換し、更に３０秒洗浄した。洗浄後、続いて、気泡が入らないように実施例１の固体支持体にゲルを載せ、その上に透析膜、１Ｍ Ｈ_３ＢＯ_３バッファー（ｐＨ８．０）を含むろ紙を載せ、ゲル側を陰極、固体支持体側を陽極として、セミドライブロッティング装置に設置した。そして、２Ｖで６０分間通電し、４３ｋＤａプロテインを固体支持体に転写した。ブロッティング後の固体支持体からゲル、透析膜、ろ紙を取り除き、超純水で洗浄し、乾燥させた。

４ｋＤａペプチド（１００μｇ、ＳＩＧＭＡ社製）を相互作用バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）３ｍＬに溶かし、４３ｋＤａプロテインが固定化された固体支持体と３時間相互作用させた。洗浄バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）にて１０分間を２回洗浄して、超純水で洗浄し、乾燥させた。
マトリックス溶媒（１ｍｇ／ｍＬ α−シアノヒドロキシ桂皮酸、５０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）をスポットし、自然乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定した。検出されたシグナルは質量スペクトルより４ｋＤａペプチド由来のものであることが確認された。

（実施例４）タンパク質−ペプチド間の相互作用の検出
カルモジュリン（１μｇ及び１００ｎｇ、ＳＩＧＭＡ社製）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（日本エイドー社製 ＮＡ−１０１０型）による電気泳動に付した。泳動用のゲルとしては、１０％ポリアクリルアミドゲルを使用した。泳動用バッファーは０.１％ＳＤＳを含むグリシン―トリスバッファーを用い、泳動は１５０Ｖで６０分間行った。

泳動後のゲルを取り出し、実施例１で作成した固体支持体に載る大きさに切った後、１０％メタノールでゲルを洗浄後、新しい１０％メタノールに交換し、更に３０秒洗浄した。洗浄後、続いて、気泡が入らないように、実施例１の固体支持体にゲルを載せ、その上に透析膜、１Ｍ Ｈ_３ＢＯ_３バッファー（ｐＨ８．０）を含むろ紙を載せ、ゲル側を陰極、固体支持体側を陽極として、セミドライブロッティング装置に設置した。そして、２Ｖで６０分間通電し、タンパク質複合体を固体支持体に転写した。ブロッティング後の固体支持体からゲル、透析膜、ろ紙を取り除き、超純水で洗浄し、乾燥させた。

ＣＢＰ（１００μｇ、東レリサーチセンター社製）を相互作用バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）３ｍＬに溶かし、カルモジュリンを固定化した固体支持体と３時間相互作用させた。洗浄バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）にて１０分間を２回洗浄して、超純水で洗浄し、乾燥させた。マトリックス溶媒（１ｍｇ／ｍＬ α−シアノヒドロキシ桂皮酸、５０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）をスポットし、自然乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定した。検出されたシグナルは質量スペクトルよりＣＢＰ由来のものであることを確認した。

（実施例５）タンパク質−タンパク質間相互作用の検出
Ｃｙ３−プロテインＡ（１μｇ、ＳＩＧＭＡ社製）とＬＭＷ分子量マーカー（１０μｇ、ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｉｃｅｎｃｅ社製）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（日本エイドー社製 ＮＡ−１０１０型）により電気泳動に付した。泳動用のゲルとしては、１０％ポリアクリルアミドゲルを使用した。泳動用バッファーは０.１％ＳＤＳを含むグリシン―トリスバッファーを用い、泳動は１５０Ｖで６０分間行った。

泳動後のゲルを取り出し、実施例１で作成した固体支持体に載る大きさに切った後、１０％メタノールでゲルを洗浄後、新しい１０％メタノールに交換し、更に３０秒洗浄した。洗浄後、続いて、気泡が入らないように、実施例１の固体支持体にゲルを載せ、その上に透析膜、１Ｍ Ｈ_３ＢＯ_３バッファー（ｐＨ８．０）を含むろ紙を載せ、ゲル側を陰極、固体支持体側を陽極として、セミドライブロッティング装置に設置した。そして、２Ｖで６０分間通電し、タンパク質を固体支持体に転写した。ブロッティング後の固体支持体からゲル、透析膜、ろ紙を取り除き、超純水で洗浄し、乾燥させた。

リジルエンドペプチダーゼ消化液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、１ｕｇ／ｍＬ リジルエンドペプチダーゼ）をスポットし、３７℃で５時間にわたり酵素消化した。マトリックス溶媒（１ｍｇ／ｍＬ α−シアノヒドロキシ桂皮酸、５０％アセトニトリル、０．１％ ＴＦＡ）をスポットし、自然乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定した。それぞれのエリアから得られた質量スペクトルを用い、Ｍａｓｃｏｔにてデータベースサーチを行ったところ、プロテインＡ、アルブミン、オブアルブミン、カーボニックアンヒドラーゼ、トリプシンインヒビター、αラクトアルブミン由来のものであることが明らかになり、固体支持体に転写されたタンパク質の同定を行うことができた。

更に、Ｃｙ５−ＩｇＧ（１００μｇ、ＳＩＧＭＡ社製）を相互作用バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）３ｍＬに溶かし、Ｃｙ３−プロテインＡが固定化された固体支持体（酵素消化する前のもの）と３時間相互作用させた。洗浄バッファー（２０ｍＭ リン酸バッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ）にて１０分間を２回洗浄して、超純水で洗浄し、乾燥させた。

リジルエンドペプチダーゼ消化液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、１ｕｇ／ｍＬ リジルエンドペプチダーゼ）をスポットし、３７℃で５時間にわたり酵素消化した。マトリックス溶媒（１ｍｇ／ｍＬ α−シアノヒドロキシ桂皮酸、５０％アセトニトリル、０．１％ ＴＦＡ）をスポットし、自然乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定した。それぞれのエリアから得られた質量スペクトルを用い、Ｍａｓｃｏｔにてデータベースサーチを行ったところ、ＩｇＧ由来のものであると同定された。すなわち、本発明の方法により固体支持体上で相互作用したタンパク質を検出および同定できることが示された。

Claims (9)

1. 生体分子を分析する方法であって、
   （ａ）試料中の生体分子をゲル電気泳動で分離し、ゲル中に分離された生体分子を固体支持体上に転写することにより、試料中の生体分子を固体支持体上に固定化すること、
   （ｂ）固体支持体上に固定化された生体分子にさらなる生体分子を相互作用させること、および
   （ｃ）固体支持体上に固定化された生体分子および／または該生体分子に相互作用したさらなる生体分子を質量分析すること
   を含む、前記方法。
2. 固体支持体が表面にカーボン層を有するものである請求項１記載の方法。
3. カーボン層が、ダイヤモンドライクカーボン層である請求項２記載の方法。
4. カーボン層が化学修飾されているものである請求項２または３記載の方法。
5. （ｂ）の工程の後（ｃ）の工程の前に、固体支持体上に固定化された生体分子および／または相互作用した生体分子を酵素で分解することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 生体分子がペプチドであり、酵素がプロテアーゼである請求項５記載の方法。
7. 質量分析を、レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析によって行う請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
8. 請求項１〜７のいずれか１項記載の方法において使用するための表面にカーボン層を有する固体支持体。
9. 請求項１〜７のいずれか１項記載の方法において使用するためのキットであって、表面にカーボン層を有する固体支持体を含む前記キット。