JP2006170710A

JP2006170710A - ピークの抽出方法および該方法を実行するためのプログラム

Info

Publication number: JP2006170710A
Application number: JP2004361561A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Aoshima; 健青島
Original assignee: Eisai Co Ltd; Mitsui Knowledge Industry Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd; Mitsui Knowledge Industry Co Ltd
Priority date: 2004-12-14
Filing date: 2004-12-14
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2024-12-14
Also published as: JP4621491B2

Abstract

【課題】ＭＳ／ＭＳスペクトルを用いたプロテオーム解析を効率的かつ的確に行うため、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおけるピークの抽出方法および該方法を実行するためのプログラムを提供する。
【解決手段】本発明は、複数のピークを有するスペクトルにおけるピークの抽出方法であって、（１）前記スペクトルを取得する工程と、（２）前記複数のピークから、ピークの高さの最大値の所定の割合以上の値の高さを有するピークが、少なくとも二つ連続している場合、前記少なくとも二つのピークを一つのピーク群として検出する工程と、（３）各ピーク群からそれぞれ、重み付け平均により一つの代表的ピークを算出するセントロイド工程と、を含む抽出方法を開示する。
【選択図】図５

Description

本発明は、プロテオーム解析に利用される質量分析スペクトルの解析に係り、より詳細には、プロテオーム解析に利用されるＭＳ／ＭＳスペクトルにおけるピークの抽出方法および該方法を実行するためのプログラムに関する。

現在、ヒトのゲノム解析が終了し、ポストゲノム時代をむかえている。ここで、「ゲノム」とは、たとえば、人のすべての遺伝子と遺伝子間領域を含む、一つの細胞に含まれる全ＤＮＡのことである。このポストゲノム時代では、生体内の生体分子として重要であるタンパク質を分離同定し、さらに定量することが、ますます重要となってきている。とりわけ、病気の診断・治療技術の研究開発には、多数のタンパク質の機能を解明することが必要である。

従来、細胞が発現するタンパク質のプロテオーム解析には、二次元電気泳動が用いられていた。ここで、「プロテオーム解析」とは、遺伝子情報と細胞内で複雑に相互作用している多様なタンパク質との関係を明らかにする解析のことをいう（たとえば、非特許文献１参照）。つまり、プロテオーム解析は、細胞を構成するすべてのタンパク質を網羅的に解析する手法をいう。

前述の二次元電気泳動では、発現したタンパク質をゲル展開し、対象とするタンパク質に対応したスポットの切り出しにより、その種類を総合的に同定することを可能にするものである。そのため、二次元電気泳動はプロテオーム解析における有用な定性的解析手段である。しかし、展開されるタンパク質の量が僅少であり、分析時の回収率に誤差が生じやすいことに起因して、二次元電気泳動ではタンパク質の定量的解析には不向きであることが指摘されている。

他方、もう一つの重要なタンパク質の解析技術として、質量分析法が利用されている。本方法は、質量分析装置を用いたタンパク質やペプチドの正確な質量を分析する方法である。この質量分析装置には、通例、タンパク質およびペプチドをイオン化する装置と、イオン化されたタンパクおよびペプチドの質量に応じて分離する質量分離部と、該質量を分析する質量分析計と、を備えている。そして、質量分析計とタンパク質のデータベース、およびそれらを結ぶ検索システムによって、今日では、タンパク質の同定は飛躍的に容易になったといえる。そのため、特定のタンパク質混合物（たとえば、ある複合体を形成するタンパク質複合体）を網羅的に同定することが可能である。

現在、タンパク質混合物の同定は、通例、ＭＳ／ＭＳ法が利用される。このＭＳ／ＭＳ法とは、複数の質量分析分離部を用い、試料中のタンパク質を第一の質量分離部（ＭＳ１）のイオン化室で生成したイオン種のうち一つを、前駆イオンの質量分析スペクトル（以下、「ＭＳスペクトル」と称する場合もある。）として選択し、第二の質量分離部（ＭＳ２）にて、その前駆イオンに、アルゴンなどの不活性ガスと衝突させて断片化して生じるプロダクトイオンのスペクトルを検出して、タンパク質の解析を行う方法である。ＭＳ/ＳＭ法では、このプロダクトイオンのスペクトル（以下、「ＭＳ／ＭＳスペクトル」と称する場合もある。）を測定し、NCBInr（ HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等のデータベースとの照合の結果から総合的に判断してタンパク質を同定する。そして、試料中に複数のタンパク質が混在しても、一つ一つの前駆イオンからタンパク質が特定できるという利点を有する。

図１は、タンパク質混合物の試料により得られるＭＳスペクトルおよびＭＳ／ＭＳスペクトルの概略図を示す。図１に示すように、ＭＳスペクトルおよびＭＳ／ＭＳスペクトルは、二次元電気泳動の結果から切り出されたバンドに対してゲル内消化した試料を、質量分析装置にて測定されたスペクトル結果を示す。前述のＭＳ１にて前記イオンのＭＳスペクトルを得て、次いで、各ＭＳスペクトルについて、ＭＳ２にてプロダクトイオンのＭＳ／ＭＳスペクトルを得る。その後、得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを、データベースと照合することによりタンパク質を同定することができる。図１に示す例では、タンパク質Ａとタンパク質Ｂとの混合物であると同定できる。
Karn, P. Science 270, pp 369-370, 1995

しかしながら、実際に測定されるＭＳ／ＭＳスペクトルは、特に、測定対象とする試料に複数のタンパク質が混合されている場合には非常に複雑なスペクトルである。そのため、ＭＳ／ＭＳスペクトルを用いたプロテオーム解析自体が効率的ではないという問題が指摘されている。
そこで、本発明は、上記事情に鑑み、ＭＳ／ＭＳスペクトルを用いたプロテオーム解析を効率的かつ的確に行うため、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおけるピークの抽出方法および該方法を実行するためのプログラムを提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、複数のピークを有するＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて、特定の関係式に基づくピーク抽出を行うことにより、効率的なプロテオーム解析を実現できるという知見を得て、本発明を完成するに至った。

すなわち、第一の態様では、本発明は、複数のピークを有するスペクトルにおけるピークの抽出方法であって、（１）前記スペクトルを取得する工程と、
（２）前記複数のピークから、ピークの高さの最大値の所定の割合以上の値の高さを有するピークが、少なくとも二つ連続している場合、前記少なくとも二つのピークを一つのピーク群として検出する工程と、（３）各ピーク群からそれぞれ、重み付け平均により一つの代表的ピークを算出するセントロイド工程と、を含む抽出方法を提供する。かかる方法により、ノイズ等の不必要なピークを解析対象から排除し、解析対象とすべきピークを絞ることができ、効率的な解析が実現される。

本発明に係る抽出方法の好ましい態様によれば、前記スペクトルは、生体分子に関連する、ｍ／ｚに対して強度で表示されるＭＳスペクトルおよび／またはＭＳ／ＭＳスペクトルを含み、前記工程（３）における前記重み付け平均は、下記式に従い実行される。

（ここで、ｍは生体分子の質量であり、ｚは生体分子の電荷であり、Ｉ_ijおよびｍ／ｚ_ijは、それぞれ、前記一つの代表的ピークの強度と、ｍ/ｚの値であり、kは、ピーク群に含まれるｍ／ｚを特定する値であり、iからjの値が含まれ、ｙ_kは、ｍ／ｚ_kに対する強度であり、h₀はピーク強度の最大値を示し、aは前記所定の割合を示す。）
かかる式を用いることで、ＭＳ／ＭＳスペクトルの解析が的確かつ迅速に行うことができる。

本発明に係る抽出方法の好ましい態様によれば、（４）前記ピーク群に含まれる各ピークのｍ／ｚの値と、前記ピーク群の前後に隣接するピークのｍ／ｚの値とを用いて、隣接するピークのｍ／ｚの値の間隔の最小値に対する最大値の割合を算出し、該割合が所定の値を超える場合、そのピーク群を除去する工程をさらに含む。ピーク群の検出が正しいか否かの判断を行うことにより、より精度の高いピーク抽出方法が実現される。

本発明に係る抽出方法の好ましい態様によれば、（５）各ピーク群ごとに算出された代表的ピークのｍ／ｚの値が特定の値以内にある複数の代表的ピークを一つのピークとするように、クラスタ処理する工程をさらに含み、前記特定の値は、生体分子の分子量に基づいて決定され、クラスタ処理後の前記一つのピークの強度は、クラスタ処理の対象となる代表的ピークの強度の総和として算出し、クラスタ処理後の前記一つのピークのｍ／ｚの値は、クラスタ処理の対象となる代表的ピークのｍ／ｚを、前記強度を重みとして加重平均して算出される。このようにして、解析対象とすべきピークを整理して、より効率的な解析が可能となる。

本発明に係る抽出方法の好ましい態様によれば、一つのＭＳ／ＭＳスペクトルがスペクトルに関する一つのデータセットを有し、前記工程（１）にて複数のＭＳ／ＭＳスペクトルを取得する場合、前記工程（２）に先立ち、（ａ）各ＭＳ／ＭＳスペクトルの前駆イオンのＭＳスペクトルのｍ／ｚの差が一定の範囲内にあり、かつ、各ＭＳ／ＭＳスペクトルのデータセットの取得タイミングの差が一定の範囲内にある複数のデータセットを結合するマージ処理をする工程をさらに含む。このように、ピーク群の検出前に、ＭＳ／ＭＳスペクトルのデータセットを調節することにより、効率的なピーク群の検出が可能となる。

本発明に係る抽出方法の好ましい態様によれば、前記工程（ａ）の後に、前記工程（２）〜（４）を実行する。マージ処理後に前記工程（２）〜（４）を実行することで、ピーク抽出の効率化を図ることができる。

また、第二の態様では、本発明は、［８］複数のピークを有するスペクトルにおけるピークの抽出方法を実行させるプログラムであって、（１）前記スペクトルを取得する工程と、（２）前記複数のピークから、ピークの高さの最大値の所定の割合以上の値の高さを有するピークが、少なくとも二つ連続している場合、前記少なくとも二つのピークを一つのピーク群として検出する工程と、（３）各ピーク群からそれぞれ、重み付け平均により一つの代表的ピークを算出するセントロイド工程と、を含む抽出方法を、コンピュータに実行させるプログラム、
［９］前記スペクトルは、生体分子に関連する、ｍ／ｚに対して強度で表示されるＭＳスペクトルおよび／またはＭＳ／ＭＳスペクトルを含み、前記工程（３）における前記重み付け平均は、下記式に従い実行される、

（ここで、ｍは生体分子の質量であり、ｚは生体分子の電荷であり、Ｉ_ijおよびｍ／ｚ_ijは、それぞれ、前記一つの代表的ピークの強度と、ｍ/ｚの値であり、kは、ピーク群に含まれるｍ／ｚを特定する値であり、iからjの値が含まれ、ｙ_kは、ｍ／ｚ_kに対する強度であり、h₀はピーク強度の最大値を示し、aは前記所定の割合を示す。）
前記［８］に記載のプログラム、
［１０］（４）前記ピーク群に含まれる各ピークのｍ／ｚの値と、前記ピーク群の前後に隣接するピークのｍ／ｚの値とを用いて、隣接するピークのｍ／ｚの値の間隔の最小値に対する最大値の割合を算出し、該割合が所定の値を超える場合、そのピーク群を除去する工程をさらに、コンピュータに実行させる、前記［８］または［９］に記載のプログラム、
［１１］（５）各ピーク群ごとに算出された代表的ピークのｍ／ｚの値が特定の値以内にある複数の代表的ピークを一つのピークとするように、クラスタ処理する工程をさらに、コンピュータに実行させる、前記［８］ないし［１０］のうち何れか一に記載のプログラム、
［１２］前記特定の値は、生体分子の分子量に基づいて決定され、クラスタ処理後の前記一つのピークの強度は、クラスタ処理の対象となる代表的ピークの強度の総和として算出し、クラスタ処理後の前記一つのピークのｍ／ｚの値は、クラスタ処理の対象となる代表的ピークのｍ／ｚを、前記強度を重みとして加重平均して算出される、前記［１１］に記載のプログラム、
［１３］一つのＭＳ／ＭＳスペクトルがスペクトルに関する一つのデータセットを有し、前記工程（１）にて複数のＭＳ／ＭＳスペクトルを取得する場合、前記工程（２）に先立ち、（ａ）各ＭＳ／ＭＳスペクトルの前駆イオンのＭＳスペクトルのｍ／ｚの差が一定の範囲内にあり、かつ、各ＭＳ／ＭＳスペクトルのデータセットの取得タイミングの差が一定の範囲内にある複数のデータセットを結合するマージ処理をする工程をさらに、コンピュータに実行させる、前記［８］ないし［１２］のうち何れか一に記載のプログラム、
「１４」前記工程（ａ）の後に、前記工程（２）〜（４）をコンピュータに実行させる、前記［８］ないし［１３］のうち何れか一に記載のプログラム、等を提供する。

なお、本発明に係るプログラムは、本発明による抽出方法の各工程をコンピュータ上で実行させる。本発明に係るプログラムは、ＣＤ−ＲＯＭ、磁気ディスク、半導体メモリなどの各種の記録媒体を通じて、または通信ネットワークを介してダウンロードすることにより、コンピュータにインストールまたはダウンロードすることができる。

本発明によるピーク抽出方法および該方法を実行するプログラムによれば、質量分析スペクトルの解析を、より効率的に行うことができる。特に、本発明に係るピーク抽出方法は、Ｑｑ−ＴＯＦＭＳ／ＭＳ装置において、ピーク抽出として優れている。

本発明の実施の形態について、図面を参照しつつ説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施することができる。

図２は、本発明の対象とする複数のピークを有するスペクトルとして、生体分子、たとえば、タンパク質の質量分析スペクトルの一例を示す。図２に示すスペクトルは、ＭＳ／ＭＳスペクトルであり、ノイズを含め、多くのピークを有するため、その後の解析が容易ではないこと予想される。

図３は、本発明に係るピーク抽出方法を実行する装置１０のハードウエア構成図を示す。図３に示すように、本発明にて用いる装置１０は、ＣＰＵ１２とマウスやキーボードなどの入力装置１４と、ＣＲＴなどから構成される表示装置１６と、ＲＡＭ（Random Access Memory）１８、ＲＯＭ（Read Only Memory）２０と、ＣＤ−ＲＯＭやＤＶＤ−ＲＯＭなどの可搬式記録媒体２３にアクセスする可搬式記録媒体ドライバ２２と、ハードディスク装置２４と、外部とのデータ授受を制御する通信制御インターフェース（Ｉ／Ｆ）２６とを備える。本発明に用いる装置１０は、入出力制御Ｉ／Ｆを介して、質量分析装置３０に接続され、質量分析装置３０にて得られたデータと、本発明に用いる装置１０にて解析等されたデータとの通信を行うことができる。図３に示すように、本実施の形態に係る装置１０としては、パーソナルコンピュータなどを利用することができる。

なお、本発明に係るピーク抽出方法は、質量分析装置３０にて得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを例示して説明するが、本発明は、ＭＳ／ＭＳスペクトルのみに限定されるものではない。

本発明で用いる質量分析装置３０としては、少なくとも２つの質量分離部を結合したタンデム型のＭＳ／ＭＳ法を測定する装置などを挙げることができる。タンデム型のＭＳ／ＭＳ法では、第一の質量分析装置と第二の質量分析装置との間に衝突室を設け、第一の質量分析装置における分解で生じた前駆イオンを不活性ガスと衝突させてプロダクトイオンを発生させる。

具体的には、２台の質量分離部を例として説明すると、本発明の好ましい態様では、第一の質量分析装置の質量分離部をＱフィルタ型にし、第二の質量分析装置の質量分離部にＴＯＦ型を配した、Ｑｑ−ＴＯＦＭＳ／ＭＳ装置を利用する。なお、Ｑフィルタ型の質量分析装置は、平行に並べた４本の円柱電極を用いて、その間に直流電流と交流電流を印加して得られる四重極電場により、イオンを質量分離する方式の質量分析装置である。四重極にかける電圧を変動させてスキャンすることで質量分析スペクトルが得られ、電圧を固定することにより、特定のｍ／ｚの値のイオンだけを通過、いわゆるマスフィルタさせることができる。一方、ＴＯＦ型の質量分析装置は、イオンのｍ／ｚの違いによって、イオンが一定の長さの真空分析管を通過するのに必要な時間が異なることを利用した、イオンを質量分離する方式の質量分析装置である。

このようにして、本発明で用いる質量分析装置３０にて得られたＭＳ／ＭＳスペクトルデータを、本発明で用いる装置１０へ送り、所望の動作や解析等を行う。

前述の可搬式記録媒体２３には、本発明にて用いられるピーク抽出方法を実行するプログラム等が記憶されている。したがって、可搬式記録媒体ドライブ２２が、可搬式記録媒体２３から、上記プログラムを読み出し、これをハードディスク装置２４に記憶して、これを起動することにより、パーソナルコンピュータが、本発明にて用いて装置１０として作動することが可能となる。あるいは、インターネット等の外部ネットワークを介して、上記プログラムをダウンロードしてもよい。

図４は、本発明による装置１０の要部の機能ブロック図である。装置１０は、質量分析装置３０にて測定されたＭＳスペクトルおよび／またはＭＳ／ＭＳスペクトル等を取得する入出力部５１と、前記ＭＳスペクトルおよび／またはＭＳ／ＭＳスペクトルを保存するデータ記憶部５２と、を備える。さらに、本発明に用いる装置１０は、本発明に係るピーク抽出方法を実行するための、ピーク群検出部５４、セントロイド処理部５５、ピーク群除去部５６と、クラスタ処理部５７とを備える。本発明の好ましい態様では、前記装置１０は、マージ処理部５３とさらに備える。

まず、本発明に用いる装置１０では、質量分析装置３０にて測定されたＭＳスペクトルおよび／またはＭＳ／ＭＳスペクトルを、入出力部５１にて取得する。取得した各種のスペクトルデータを、必要に応じて、データ記憶部に保存し、後述する本発明に係るピーク抽出方法に利用できる。

以下、本発明に係るピーク抽出方法を、ＭＳ／ＭＳスペクトルデータを用いて説明する。通例、図２に例示したように、ＭＳ／ＭＳスペクトルは、複数のピークを有する。そこで、本発明に係る抽出方法を行うことで、ＭＳ／ＭＳスペクトルの効率的な抽出を行い、プロテオーム解析の的確性および迅速性に役立つ。

図５は、本発明によるピーク抽出方法の概略を示すフローチャートを示す。図５に示すように、工程Ｓ１０にて、質量分析装置３０にて測定されたＭＳスペクトルおよび／またはＭＳ／ＭＳスペクトルを取得する。このように取得したスペクトルを、工程Ｓ１１において、一定の規則に基づきピーク群検出部５４にてピーク群検出を行う。次いで、検出された各ピーク群に対して、セントロイド処理部５５にて、後述するセントロイド処理を行い、各ピーク群から代表的ピークを算出する（図５の工程Ｓ１２参照）。その後、前述のピーク群検出の妥当性を評価するため、工程Ｓ１３では、ピーク群除去部５６にて、検出されたピーク群の前後のピークとの対比から不必要なピーク群を除去する工程を実行する。除去後に残ったピーク群に対して、ピーク群をさらに整理するため、各ピーク群ごとに算出されたｍ／ｚの値の値に基づいて、クラスタ処理部５７にて各ピーク群ごとを集団化させるクラスタ処理を施し（工程Ｓ１４参照）、効率的に解析対象とすべきピークを抽出する。本発明の好ましい態様では、図５では不図示であるが、工程Ｓ１１に先立ち、後述するマージ処理を行うことが好ましい。以下では、各工程Ｓ１０〜Ｓ１４とマージ処理工程について詳述する。

（ピーク群検出部５４におけるピーク群検出工程）
ピーク群検出部５４では、複数のピークを有するＭＳ／ＭＳスペクトルデータから、一定の関係式から、解析対象とすべき複数のピークを一つにまとめてピーク群を検出する工程である。図６は、本発明に係るピーク抽出方法におけるピーク群検出を説明する図であり、図２のＡ領域を拡大概略図である。図６に示すＭＳ／ＭＳスペクトルは、入出力部５１で取得したＭＳ／ＭＳスペクトルであって、該スペクトルはｘ軸をｍ／ｚで、ｙ軸は強度で表示されるスペクトルである。

第一に、一つのＭＳ／ＭＳスペクトル中にて最大のピーク高さ（ｈ₀）、図６の例では最大の強度を有するピークを求める。第二に、該高さ、つまり強度の所定の割合以上の値の高さ（強度）を有するピークに着目する。ここで、最大のピークを基準にしたのは、ピークの中ではノイズ等の影響が最も少なく、ピーク自体に信頼性があると推測されるからである。また、所定の割合は、その後の解析の精度に鑑みるに、適宜選択可能な割合である。第三に、所定の割合以上の値の強度を有するピークが少なくとも二つ連続している場合、この少なくとも二つのピークを一つのピーク群として検出する。図６の例では、前記所定の割合を０．５として、Ｐ₀で囲まれるピークを一つのピーク群として検出する。

（セントロイド処理部５５におけるセントロイド処理）
工程Ｓ１２で示されるセントロイド処理は、前述のピーク群として検出されたものを一つの代表的ピークとして算出する処理である。Ｓ１２工程では、ピーク群に含まれるｘ軸およびｙ軸の値から、ピーク群の代表的ピークの算出を、重み付け平均というセントロイド処理により行い、以降のスペクトル解析に利用する。本発明で用いる「セントロイド処理」は、下記式に基づき、ピーク群の代表的ピークを算出する処理である。

（ここで、ｍは生体分子の質量であり、ｚは生体分子の電荷であり、Ｉ_ijおよびｍ／ｚ_ijは、それぞれ、前記一つの代表的ピークの強度と、ｍ／ｚの値であり、kは、ピーク群に含まれるｍ／ｚを特定する値であり、iからjの値が含まれ、ｙ_kは、ｍ／ｚ_kに対する強度であり、aは前記所定の割合を示し、図６および図７では０．５として表示されている。）

式（１）は、ｙ軸である強度の算出法であり、式（２）はｘ軸のｍ／ｚの算出法である。このようにして、各ピーク群に対してその代表的ピークを算出することができる。なお、ｙ軸の強度は、ピーク群に含まれるピーク強度の総和であり、ｘ軸のｍ／ｚは、ピーク群に含まれるｍ／ｚの加重平均の値となっている。また、本発明で用いるセントロイド処理は、前述のように、検出された各ピーク群から代表的ピークを算出する処理であればよく、前述の算出法は例示であり、式（１）および（２）の算出法に限定されるものではない。

図７は、本発明に係るピーク抽出方法におけるセントロイド処理により算出された、ピーク群からの代表的ピーク算出の一例を示す。図７の例示から、工程Ｓ１１にて検出された一つのピーク群に対するセントロイド処理の内容が容易に理解できる。具体的には、ピーク群Ｐ₀の最大強度は２２であり、前述のａの値を０．５とすると、ｍ／ｚ₁〜ｍ／ｚ₇の範囲のピーク強度は、最大強度の５０％である１１以上として連続する。そして、このｍ／ｚ₁〜ｍ／ｚ₇の範囲のピーク強度を、座標Ｓ₁〜Ｓ₇で表示する。最大強度の５０％である強度１１を基準として縦軸に新たなｖ軸を作成し、ｍ／ｚ₁〜ｍ／ｚ₇の範囲のピーク強度を、再計算すると、ｖ１＝１、・・・、Ｖ７＝６と再計算される（図７参照）。その後、ｖ軸で表示される強度の総和Ｉ（Ｐ₀）を算出し、ｍ／ｚ軸は加重平均することによりｍ／ｚ（Ｐ₀）が算出される。このようにして、本発明で用いるセントロイド処理により、検出されたピーク群の代表的ピークを算出することができる。

（ピーク群除去部５６におけるピーク除去処理）
前述にように、工程１３は、検出されたピーク群の代表的ピークを算出した後、ピーク群の検出の妥当性を評価し、不必要なピーク群を除去する工程である。本発明では、検出されたピーク群に含まれる各ピークのｍ／ｚの値と、前記ピーク群の前後に隣接するピークのｍ／ｚの値とを用いて、ピーク除去処理を行う。

図８は、本発明に係るピーク抽出方法におけるピーク除去工程を説明する図である。図８では、Ｐで表示されるピーク群に含まれる各ピークのｍ／ｚは、ｍ／ｚ₁〜ｍ／ｚ₄であり、かかるピーク群に含まれない、ピーク群の前後に隣接するピークのｍ／ｚは、ｍ／ｚ₀とｍ／ｚ₅で表されている。そして、本発明では、ピーク除去の一例として、ｍ／ｚ₀〜ｍ／ｚ₅において隣接するｍ／ｚの値の間隔をｄで表し、以下の式（３）により、ピーク群を除去するか否かの判断をする。

（ここで、ｌは、各ピーク群に含まれるｍ／ｚの値と、前記各ピーク群の前後に隣接するｍ／ｚの値を表す。）
式（３）に基づき、前記ｄの値の最小値に対する最大値の割合εが、所定の値を超える場合、かかるピーク群Ｐは除去する。ここで、εの値が大きい場合とは、ピーク群に包含される各ピーク間隔が不規則であり、ピーク自体の信頼性が低いと予想されるため、かかるピーク群を除去する。εの値としては、その後の解析の精度に鑑みるに、適宜選択可能な割合である。かかるピーク群除去により、より精度の高いピーク抽出が可能となる。なお、本発明で用いるピーク群除去処理は、前述のように、ピーク群の検出の妥当性を評価し、不必要なピーク群を除去する処理をいい、前述の算出法は例示であり、式（３）の算出法に限定されるものではない。

（クラスタ処理部５７におけるクラスタ処理）
前述のピーク群除去処理により残った各ピーク群について、一定の関係にあるピーク群を集団化するクラスタ処理を行う。ここで、各ピーク群とは、たとえば、図２で示すＡ領域およびＢ領域においてピーク検出され、その後のピーク群除去処理により残ったピーク群である。また、一定の関係とは、各ピーク群の代表的ピークのｍ／ｚの値に基づいて行われ、本発明では、たとえば、代表的ピークのｍ／ｚの値の差が２Ｄａ（Ｄａ：生体分子の質量を表示するダルトンを意味する）の場合には、かかる各ピーク群の代表的ピークを一つのピークとなるように、クラスタ処理する。これは、代表的ピークが隣接していることは、ＭＳ／ＭＳスペクトルの前駆イオンが同一または非常に近似していると考えられることから、クラスタ処理すること精度の高いピーク抽出を可能とする。

本発明におけるクラスタ処理した場合、代表的ピークをクラスタ処理されたピークの強度と、ｍ／ｚの値は、それぞれ、クラスタ処理の対象となった代表的ピーク強度の総和と、前記強度を重みとして加重平均して得られるｍ／ｚとして算出される。このようにして抽出されたピークを、前記代表的ピーク強度の総和と、前記強度を重みとして加重平均して得られるｍ／ｚの値を用いて、ピークリストとして表示することができる。なお、本発明で用いるクラスタ処理は、前述のように、代表的ピークを集団化させる処理であればよく、代表的ピークが隣接していることを示唆するパラメータならば、前駆イオンの性質に限定されるものではない。

（マージ処理部５３によるマージ処理）
本発明に係るピークの抽出方法の好ましい態様では、工程Ｓ１１のピーク群検出の前に、以下に説明するマージ処理を行う。マージ処理とは、一つのＭＳ／ＭＳスペクトルがスペクトルに関する一つのデータセットを有し、複数のＭＳ／ＭＳスペクトルを取得した場合、
前述のピーク群検出前に、前記複数のＭＳ／ＭＳスペクトルの各々のデータセットを一定の条件下で結合する処理である。ここで用いる「データセット」とは、図２に示すＭＳ／ＭＳスペクトルについて、ｍ／ｚ軸と強度を座標として表示されたものであり、一つのＭＳ／ＭＳスペクトルに関する一つのデータセットとは、図２に示すＭＳ／ＭＳスペクトルを、前記座標で表示された一連のデータをいう。そのため、ＭＳ／ＭＳスペクトルが異なれば、当然、ＭＳ／ＭＳスペクトルが有するデータセットも異なる。

本発明で用いる前述の一定の条件とは、各ＭＳ／ＭＳスペクトルの前駆イオンに着目し、前駆イオンのｍ／ｚの値の差が一定の範囲内にあり、かつ、各ＭＳ／ＭＳスペクトルのデータセットの取得タイミングの差が一定の範囲内にある場合に、データセットを結合する処理である。ここで、前駆イオンのｍ／ｚの値の差が一定の範囲内にあるとは、たとえば、その差がダルトンに基づく値が一定の範囲内であり、各ＭＳ／ＭＳスペクトルのデータセットの取得タイミングの差が一定の範囲内にあるとは、たとえば、前駆イオンである親ピークを共通として、ＭＳ／ＭＳスペクトルを取得した時間が一定の範囲内にあることをいう。このマージ処理を行うことで、ＭＳ／ＭＳスペクトルの前駆イオンが共通するスペクトルを結合することにより、より効率的なピーク抽出が可能となる。なお、本発明で用いるマージ処理は、ＭＳ／ＭＳスペクトルが生じる前の前駆イオンに基づいてＭＳ／ＭＳスペクトルを結合する処理であればよく、前述の前駆イオンのｍ／ｚの値の差やＭＳ／ＭＳスペクトルのデータセットの取得タイミングの差に基づく条件により行われる処理に限定されるものではない。

工程Ｓ１１におけるマージ処理の後、前述の工程Ｓ１１〜Ｓ１４を行うことで、より精度の高いピーク抽出が実現される。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を何等限定するものではない。

１．細胞溶解物（cell lysate）の調製
¹³Ｃ₆−ロイシン（Cambridge Isotope Laboratories、アンドーバ、マサチューセッツ州）を含有するRPMI-1640培地（Gibco BRL、グランドアイランド、ニューヨーク州）は、OngらのSILAC プロトコール（S.E. Ong, B. Blagoev, I. Kratchmarova, D.B. Kristensen, H. Steen, A. Pandey, M. Mann, Mol Cell Proteomics 1 (2002) 376.）に従って調製した。マウス神経芽細胞腫neuro2a細胞を、¹³Ｃ₆−ロイシン標識のために、前記培地にて培養した。二つのディシュ（dish）（直径１５ｃｍ、８０％ confluent）にプロテアーゼインヒビターカクテル（Roche Diagnostics社、バーゼル、スイス）を含むリン酸塩緩衝液を加えて掻きだし、超音波を利用してタンパク質を抽出した。

２．LCMSMSのためのペプチド混合物の調製
細胞からのタンパク質を乾燥し、8M 尿素を含有した50 mM Tris-HCl 緩衝液（pH9.0）にて再懸濁させた。その後、これらの混合物を還元し、アルキル化し、Lys-C（和光、大阪、日本）により消化し、50 mM 炭酸水素アンモニウム水溶液で4倍に希釈した後トリプシン（プロメガ社、マディソン、ワイオミング州、米国）により消化した。消化溶液をTFAで酸性にし、脱塩し、C18-Stage Tips (J. Rappsilber, Y. Ishihama, M. Mann, Anal Chem 75 (2003) 663.)により濃縮した。

３．ナノLC-MS/MS解析
Shimadzu LC10A グラディエントポンプと、HTC-PAL オートサンプラー（CTC Analytics AG、チューリンゲン、スイス）と、150 μm ポートを有するValco C2バルブとを備えるQSTAR Pulsar I (ABI/MDS-Sciex、トロント、カナダ)を利用して、すべてのサンプルをナノLC-MS/MSにより解析した。"stone-arch"frit(Y. Ishihama, J. Rappsilber, J.S. Andersen, M. Mann, J Chromatogr A 979 (2002) 233.)を備える解析カラムニードルを調製するため、窒素による圧力印加されたカラムローダセル（日京テクノス社製、東京、日本）により、self-pulled needle (100 μm ID, 6μm 開口、150 mm 長)へ、ReproSil C18充填剤（3μm, Dr. Maisch, Ammerbuch, ドイツ）を充填した。テフロン（登録商標）被覆カラムホルダ（日京テクノス社製、東京、日本）に磁石付Velco 金属コネクターに取り付けたカラムニードルを装着し、スプレー位置を調節可能なProxeon x-y-z nanospray インターフェース（Odense、デンマーク）に搭載した。注入体積は、3 μＬであり、三方スプリッター後の流速は250 nL/minであった。移動相は、（A）０．５％酢酸と、（B）０．５％酢酸と８０％アセトニトリルを用いた。グラジエント条件は、初期濃度をＢ５％とし、最初の５分間で５％から１０％、次の６０分間で１０％から３０％、続く５分間３０％から１００％と最後の１０分間の１００％というリニアーグラディエントを採用した。金属コネクターを介して2400 Vのスプレー電圧を印加した。ＭＳスキャン(1秒)で、強度順に最大三つピークを選択し、その後、それぞれの親イオンに対しＭＳＭＳスキャンを、０．６秒ごとに実行した。Information Dependent Acquisition (IDA)機能は、先にスキャンした親ピークイオンを排除するように、３分間設定した。スキャン範囲は、ｍ／ｚ350・−・1400であった。

図９は、本発明による実施例により得られた一つのＭＳスペクトル（図９（Ａ））と、そのＭＳスペクトルから得られた一つのＭＳ／ＭＳスペクトル（図９（Ｂ））を示す。一方、図１０は、本発明による実施例から得られた一つのＭＳ／ＭＳスペクトルのデータを、本発明に係るピーク抽出方法により解析した結果を示す。図１０（Ａ）は、本発明による実施例から得られた生データのピークのｍ／ｚの値に対する強度を示す。図１０（Ｂ）は、図１０（Ａ）に示す結果から、本発明によりピーク群検出と、前記式（１）および（２）に従って、算出された代表的ピークを示す。なお、前記式（１）および（２）による本発明のセントロイド処理では、ａを０．５（５０％）として算出した。図１０（Ｃ）は、図１０（Ｂ）にて得られた結果から、前記式（３）に従って、ピーク群除去を行った結果を示す。なお、前記式（３）におけるεの値は２．９を採用した。

最後に、図１０（Ｃ）にて得られた結果から、本発明におけるクラスタ処理により、ピーク抽出を行った。図１０（Ｄ）は、ピーク群除去され残ったピーク群である、図１０（Ｃ）で得られた結果から、各ピーク群の代表的ピークのｍ／ｚの値の差が２Ｄａ以内である場合、その各ピーク群を一つのピーク群とするクラスタ処理後の結果を示す。なお、図１０（Ｄ）に示す値は、代表的ピークをクラスタ処理されたピークの強度とｍ／ｚの値は、それぞれ、クラスタ処理の対象となった代表的ピーク強度の総和と、前記強度を重みとして加重平均して得られるｍ／ｚとして算出した。

以上の結果より、本発明に係るピーク抽出方法およびそれをコンピュータに実行させるプログラムによれば、質量分析スペクトルにおける有用なピークを抽出することにより、質量分析スペクトルの解析のより効率的な実行を実現させることができる。

図１は、タンパク質混合物の試料により得られるＭＳスペクトルおよびＭＳスペクトルの概略図を示す。図２は、本発明の対象とする複数のピークを有するスペクトルとして、生体分子、たとえば、タンパク質の質量分析スペクトルの一例を示す。図３は、本発明に係るピーク抽出方法を実行する装置１０のハードウエア構成図を示す。図４は、本発明による装置１０の要部の機能ブロック図である。図５は、本発明によるピーク抽出方法の概略を示すフローチャートを示す。図６は、本発明に係るピーク抽出方法におけるピーク群検出を説明する図であり、図２のＡ領域を拡大概略図である。図７は、本発明に係るピーク抽出方法におけるセントロイド処理により算出された、ピーク群からの代表的ピーク算出の一例を示す。図８は、本発明に係るピーク抽出方法におけるピーク除去工程を説明する図である。図９は、（Ａ）本発明による実施例により得られた一つのＭＳスペクトル、（Ｂ）そのＭＳスペクトルから得られた一つのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。なお、図９（Ｂ）に示すＭＳ／ＭＳスペクトルは、前駆イオンのＭＳスペクトルのｍ／ｚの値が６８８．９であり、リテンションタイムが８２．５６２分であるピークを、ＭＳ／ＭＳ処理して得られたＭＳ／ＭＳスペクトルである。図１０は、本発明による実施例から得られたＭＳ／ＭＳスペクトルのデータを、本発明によるピーク抽出方法により解析した結果を示す。図１０（Ａ）は、オリジナルのＭＳ／ＭＳスペクトルのデータを示す。図１０（Ｂ）は、前記オリジナルのＭＳ／ＭＳスペクトルデータについて、本発明に係るピーク抽出方法におけるピーク群検出された代表的ピークの値の結果を示す。図１０（Ｃ）は、図１０（Ｂ）にて得られた結果から、前記式（３）に従って、ピーク群除去を行った結果を示す。図１０（Ｄ）は、ピーク群除去され残ったピーク群である、図１０（Ｃ）で得られた結果から、各ピーク群の代表的ピークのｍ／ｚの値の差が２Ｄａ以内である場合、その各ピーク群を一つのピーク群とするクラスタ処理後の結果を示す。

符号の説明

１０：本発明に係るピーク抽出方法を実行する装置、１２：ＣＰＵ、１４：入力装置、１６：表示装置、１８：ＲＡＭ、２０：ＲＯＭ、２２：可搬式記録媒体ドライバ、２３：可搬式記録媒体、２４：ディスク装置、２６：通信制御インターフェース、３０：質量分析装置

Claims

複数のピークを有するスペクトルにおけるピークの抽出方法であって、
（１）前記スペクトルを取得する工程と、
（２）前記複数のピークから、ピークの高さの最大値の所定の割合以上の値の高さを有するピークが、少なくとも二つ連続している場合、前記少なくとも二つのピークを一つのピーク群として検出する工程と、
（３）各ピーク群からそれぞれ、重み付け平均により一つの代表的ピークを算出するセントロイド工程と、
を含む抽出方法。
前記スペクトルは、生体分子に関連する、ｍ／ｚに対して強度で表示されるＭＳスペクトルおよび／またはＭＳ／ＭＳスペクトルを含み、
前記工程（３）における前記重み付け平均は、下記式に従い実行される、

（ここで、ｍは生体分子の質量であり、ｚは生体分子の電荷であり、Ｉ_ijおよびｍ／ｚ_ijは、それぞれ、前記一つの代表的ピークの強度と、ｍ／ｚの値であり、kは、ピーク群に含まれるｍ／ｚを特定する値であり、iからjの値が含まれ、ｙ_kは、ｍ／ｚ_kに対する強度であり、h₀はピーク強度の最大値を示し、aは前記所定の割合を示す。）
請求項１に記載の抽出方法。
（４）前記ピーク群に含まれる各ピークのｍ／ｚの値と、前記ピーク群の前後に隣接するピークのｍ／ｚの値とを用いて、隣接するピークのｍ／ｚの値の間隔の最小値に対すると最大値の割合を算出し、該割合が所定の値を超える場合、そのピーク群を除去する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の抽出方法。
（５）各ピーク群ごとに算出された代表的ピークのｍ／ｚの値が特定の値以内にある複数の代表的ピークを一つのピークとするように、クラスタ処理する工程をさらに含む、請求項１ないし３のうち何れか一項に記載の抽出方法。
前記特定の値は、生体分子の分子量に基づいて決定され、クラスタ処理後の前記一つのピークの強度は、クラスタ処理の対象となる代表的ピークの強度の総和として算出し、クラスタ処理後の前記一つのピークのｍ／ｚの値は、クラスタ処理の対象となる代表的ピークのｍ／ｚを、前記強度を重みとして加重平均して算出される、請求項４に記載の抽出方法。
一つのＭＳ／ＭＳスペクトルがスペクトルに関する一つのデータセットを有し、前記工程（１）にて複数のＭＳ／ＭＳスペクトルを取得する場合、前記工程（２）に先立ち、
（ａ）各ＭＳ／ＭＳスペクトルの前駆イオンのＭＳスペクトルのｍ／ｚの差が一定の範囲内にあり、かつ、各ＭＳ／ＭＳスペクトルのデータセットの取得タイミングの差が一定の範囲内にある複数のデータセットを結合するマージ処理をする工程をさらに含む、請求項１ないし５のうち何れか一項に記載の抽出方法。
前記工程（ａ）の後に、前記工程（２）〜（４）を実行する、請求項１ないし６のうち何れか一項に記載の抽出方法。
複数のピークを有するスペクトルにおけるピークの抽出方法を実行させるプログラムであって、
（１）前記スペクトルを取得する工程と、
（２）前記複数のピークから、ピークの高さの最大値の所定の割合以上の値の高さを有するピークが、少なくとも二つ連続している場合、前記少なくとも二つのピークを一つのピーク群として検出する工程と、
（３）各ピーク群からそれぞれ、重み付け平均により一つの代表的ピークを算出するセントロイド工程と、
を含む抽出方法を、コンピュータに実行させるプログラム。
前記スペクトルは、生体分子に関連する、ｍ／ｚに対して強度で表示されるＭＳスペクトルおよび／またはＭＳ／ＭＳスペクトルを含み、
前記工程（３）における前記重み付け平均は、下記式に従い実行される、

（ここで、ｍは生体分子の質量であり、ｚは生体分子の電荷であり、Ｉ_ijおよびｍ／ｚ_ijは、それぞれ、前記一つの代表的ピークの強度と、ｍ/ｚの値であり、kは、ピーク群に含まれるｍ／ｚを特定する値であり、iからjの値が含まれ、ｙ_kは、ｍ／ｚ_kに対する強度であり、h₀はピーク強度の最大値を示し、aは前記所定の割合を示す。）
請求項８に記載のプログラム。
（４）前記ピーク群に含まれる各ピークのｍ／ｚの値と、前記各ピーク群の前後に隣接するピークのｍ／ｚの値とを用いて、隣接するピークのｍ／ｚの値の間隔の最小値に対する最大値の割合を算出し、該割合が所定の値を超える場合、そのピーク群を除去する工程をさらに、コンピュータに実行させる、請求項８または９に記載のプログラム。
（５）各ピーク群ごとに算出された代表的ピークのｍ／ｚの値が特定の値以内にある複数の代表的ピークを一つのピークとするように、クラスタ処理する工程をさらに、コンピュータに実行させる、請求項８ないし１０のうち何れか一項に記載のプログラム。
前記特定の値は、生体分子の分子量に基づいて決定され、クラスタ処理後の前記一つのピークの強度は、クラスタ処理の対象となる代表的ピークの強度の総和として算出し、クラスタ処理後の前記一つのピークのｍ／ｚの値は、クラスタ処理の対象となる代表的ピークのｍ／ｚを、前記強度を重みとして加重平均して算出される、請求項１１に記載のプログラム。
一つのＭＳ／ＭＳスペクトルがスペクトルに関する一つのデータセットを有し、前記工程（１）にて複数のＭＳ／ＭＳスペクトルを取得する場合、前記工程（２）に先立ち、
（ａ）各ＭＳ／ＭＳスペクトルの前駆イオンのＭＳスペクトルのｍ／ｚの差が一定の範囲内にあり、かつ、各ＭＳ／ＭＳスペクトルのデータセットの取得タイミングの差が一定の範囲内にある複数のデータセットを結合するマージ処理をする工程をさらに、コンピュータに実行させる、請求項８ないし１２のうち何れか一項に記載のプログラム。
前記工程（ａ）の後に、前記工程（２）〜（４）をコンピュータに実行させる、請求項８ないし１３のうち何れか一項に記載のプログラム。