JP2006034252A - Combined environmental stress tolerance rice - Google Patents
Combined environmental stress tolerance rice Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006034252A JP2006034252A JP2004222758A JP2004222758A JP2006034252A JP 2006034252 A JP2006034252 A JP 2006034252A JP 2004222758 A JP2004222758 A JP 2004222758A JP 2004222758 A JP2004222758 A JP 2004222758A JP 2006034252 A JP2006034252 A JP 2006034252A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- resistance
- gene
- protein
- seq
- plant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title description 62
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title description 62
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title description 59
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 107
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 68
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 60
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 40
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 27
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 23
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 23
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 claims description 17
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 10
- 230000006750 UV protection Effects 0.000 claims description 10
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 claims 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 46
- 101150101112 7 gene Proteins 0.000 description 45
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 20
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 16
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 16
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 6
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 5
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 101150031317 HSP17.7 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 4
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 4
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000007914 freezing tolerance Effects 0.000 description 3
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 3
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 description 2
- 101100521097 Caenorhabditis elegans pri-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100353170 Caenorhabditis elegans pri-2 gene Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 2
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 2
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- 101100329226 Bacillus anthracis cpfC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- IXVMHGVQKLDRKH-VRESXRICSA-N Brassinolide Natural products O=C1OC[C@@H]2[C@@H]3[C@@](C)([C@H]([C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C(C)C)C)C)CC3)CC[C@@H]2[C@]2(C)[C@@H]1C[C@H](O)[C@H](O)C2 IXVMHGVQKLDRKH-VRESXRICSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 238000012218 Kunkel's method Methods 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 206010057362 Underdose Diseases 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- IXVMHGVQKLDRKH-KNBKMWSGSA-N brassinolide Chemical compound C1OC(=O)[C@H]2C[C@H](O)[C@H](O)C[C@]2(C)[C@H]2CC[C@]3(C)[C@@H]([C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)C(C)C)CC[C@H]3[C@@H]21 IXVMHGVQKLDRKH-KNBKMWSGSA-N 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002595 cold damage Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N desoxyabscisic acid Natural products OC(=O)C=C(C)C=CC1C(C)=CC(=O)CC1(C)C FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 230000008641 drought stress Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 description 1
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Cultivation Of Plants (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
【課題】複合環境ストレス条件下でも栽培可能な植物の提供。
【解決手段】以下の(a)〜(d)の少なくとも１つの遺伝子が導入された、複合環境ストレス耐性を有するトランスジェニックイネ科植物。 (a) 特定な配列の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子； (b) 特定な配列の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高温耐性付与活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子； (c) 特定な配列のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；及び (d) 特定な配列のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高温耐性付与活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【選択図】なしProvided is a plant that can be cultivated even under complex environmental stress conditions.
A transgenic gramineous plant having combined environmental stress resistance, into which at least one gene of (a) to (d) below is introduced. (a) a gene consisting of DNA consisting of a base sequence of a specific sequence; (b) encoding a protein which hybridizes with a DNA consisting of a base sequence of a specific sequence under stringent conditions and which has a high temperature resistance imparting activity A gene comprising DNA; (c) a gene encoding a protein comprising an amino acid sequence of a specific sequence; and (d) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the specific sequence And a gene encoding a protein having a high temperature resistance imparting activity.
[Selection figure] None
Description
本発明は、環境ストレス耐性植物及び植物の環境ストレス耐性の強化法に関する。 The present invention relates to an environmental stress resistant plant and a method for enhancing environmental stress tolerance of a plant.
イネの早期栽培及び直播栽培では、イネの生育初期において低温に遭遇しやすいため、しばしば著しい低温障害が発生する。また、アジア諸国では塩ストレスや乾燥ストレスによる被害も大きい。これらの被害を軽減するためには、環境ストレス耐性が複合的に強化された品種を栽培することが望ましい。 In early cultivation and direct sowing cultivation of rice, low temperature damage is likely to be encountered in the early stage of rice growth, and thus significant cold damage occurs frequently. In Asian countries, the damage caused by salt stress and drought stress is also great. In order to reduce these damages, it is desirable to cultivate varieties with enhanced environmental stress tolerance.
しかしながら、既存の遺伝資源を材料にした育種法では、環境ストレス耐性の大幅な向上を望むには限界があり、ましてや複数の環境ストレス耐性を同時に強化することは不可能に近い。そこで、複合的な環境ストレス耐性の強化法が必要とされている。 However, in the breeding method using existing genetic resources as a material, there is a limit to hope for a significant improvement in environmental stress tolerance, and it is almost impossible to simultaneously enhance multiple environmental stress tolerances. Therefore, there is a need for a combined method of enhancing environmental stress tolerance.
従前のイネの環境ストレス耐性強化法としては、環境ストレス耐性に優れた品種又は系統のイネを交配親に用いて交雑を行い、その交雑後代から環境ストレス耐性がより優れたイネ個体やイネ系統を選抜する方法がある。 As a conventional method for enhancing environmental stress tolerance of rice, breeding is carried out using rice of a variety or line having excellent environmental stress tolerance as a mating parent, and rice individuals and rice lines having better environmental stress tolerance from the progeny of the cross are used. There is a way to select.
近年では、活性酸素除去系酵素遺伝子を植物に導入して、植物の環境ストレス耐性を向上させる研究がなされている（特許文献１及び非特許文献１及び２）。しかしながら、活性酸素除去酵素の遺伝子の導入によって植物中で該酵素の発現量を増大させても、必ずしもストレス耐性が強化されないことも報告されている（非特許文献３）。 In recent years, studies have been made to improve environmental stress tolerance of plants by introducing an active oxygen removing enzyme gene into plants (Patent Document 1 and Non-Patent Documents 1 and 2). However, it has also been reported that stress tolerance is not necessarily enhanced even if the expression level of the enzyme is increased in a plant by introducing a gene for an active oxygen removal enzyme (Non-patent Document 3).
本発明は、複合的な環境ストレスに耐性を有する植物及び植物における複合的な環境ストレス耐性の強化法を提供することを目的とする。 It is an object of the present invention to provide a plant having tolerance to complex environmental stresses and a method for enhancing complex environmental stress tolerance in plants.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、sHSP17.7遺伝子を過剰発現させたトランスジェニックイネが複合環境ストレスに対して耐性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that transgenic rice overexpressing the sHSP17.7 gene exhibits resistance to complex environmental stress, and completes the present invention. It came to.
すなわち、本発明は以下の通りである。
[1] 以下の(a)〜(d)の少なくとも１つの遺伝子が導入された、複合環境ストレス耐性を有するトランスジェニックイネ科植物。
That is, the present invention is as follows.
[1] A transgenic gramineous plant having combined environmental stress tolerance, into which at least one of the following genes (a) to (d) is introduced.
(a) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNAからなる遺伝子；
(b) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高温耐性付与活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子；
(c) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；及び
(d) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高温耐性付与活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
この複合環境ストレス耐性は、高温耐性、紫外線耐性、乾燥耐性、耐塩性、耐冷性及び耐凍性からなる群より選択される少なくとも２つを含むことが好ましい。
[2] 乾燥条件、高塩濃度条件、低温条件及び凍結温度条件からなる群より選択される少なくとも１つを含む条件下での栽培用の、上記[1]に記載のトランスジェニックイネ科植物。
[3] 以下の(a)〜(d)の少なくとも１つの遺伝子をイネ科植物中で過剰発現させることを特徴とする、イネ科植物に複合環境ストレス耐性を付与する方法。
(a) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNAからなる遺伝子；
(b) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高温耐性付与活性を有するタンパク質をコードするDNA；
(c) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；及び
(d) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高温耐性付与活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
[4] 複合環境ストレス耐性が、高温耐性、紫外線耐性、乾燥耐性、耐塩性、耐冷性及び耐凍性からなる群より選択される少なくとも２つを含む、上記[3]に記載の方法。
[5] 上記[1]又は[2]に記載のトランスジェニックイネ科植物を使用することを特徴とする、乾燥条件、高塩濃度条件、低温条件及び凍結温度条件からなる群より選択される少なくとも１つを含む条件を含む環境ストレス条件下でのイネ科植物の栽培方法。
(a) a gene consisting of DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(b) a gene comprising a DNA that hybridizes with a DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a protein having a high-temperature resistance imparting activity;
(c) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; and
(d) a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having a high temperature resistance imparting activity. And at least two selected from the group consisting of high temperature resistance, ultraviolet resistance, drying resistance, salt resistance, cold resistance and frost resistance.
[2] The transgenic gramineous plant according to [1] above, which is used for cultivation under conditions including at least one selected from the group consisting of a drying condition, a high salt concentration condition, a low temperature condition, and a freezing temperature condition.
[3] A method for imparting combined environmental stress resistance to a gramineous plant, characterized by overexpressing at least one gene of the following (a) to (d) in the gramineous plant:
(a) a gene consisting of DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(b) a DNA that hybridizes with a DNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a protein having a high-temperature resistance imparting activity;
(c) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; and
(d) a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having a high temperature resistance imparting activity
[4] The method according to [3] above, wherein the combined environmental stress resistance includes at least two selected from the group consisting of high temperature resistance, ultraviolet resistance, drought resistance, salt resistance, cold resistance and frost resistance.
[5] Use of the transgenic Gramineae plant according to [1] or [2] above, at least selected from the group consisting of a drying condition, a high salt concentration condition, a low temperature condition, and a freezing temperature condition A method for cultivating gramineous plants under environmental stress conditions including conditions including one.
本発明の形質転換イネ科植物は、乾燥条件、高塩濃度条件、低温条件及び凍結温度条件などを含む各種の環境ストレス条件下に対して高い耐性を示す。従って本発明の形質転換イネ科植物を用いれば、複合的な環境ストレスが存在する条件であっても、環境ストレスによる枯死などの被害を軽減し、不適地でも十分な収量を得られる栽培が可能になる。本発明のイネ科植物における複合ストレス耐性の強化法を用いることにより、既存のイネ科植物に複合ストレス耐性を付与することができる。 The transformed gramineous plant of the present invention exhibits high resistance to various environmental stress conditions including dry conditions, high salt concentration conditions, low temperature conditions, freezing temperature conditions, and the like. Therefore, by using the transformed gramineous plant of the present invention, it is possible to cultivate with sufficient yield even in unsuitable land, reducing damage such as withering due to environmental stress even under conditions where complex environmental stress exists become. By using the method for enhancing the combined stress tolerance in the gramineous plant of the present invention, it is possible to impart the complex stress tolerance to the existing gramineous plant.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明は、イネ科植物から単離した熱ショックタンパク質sHSP17.7遺伝子をイネ科植物細胞中に導入し、恒常的に発現させて得られるトランスジェニックイネ科植物に関する。 The present invention relates to a transgenic gramineous plant obtained by introducing a heat shock protein sHSP17.7 gene isolated from a gramineous plant into a gramineous plant cell and constantly expressing it.
本発明はまた、通常は高温でのみ誘導され、タンパク質の変性を防ぐ活性（分子シャペロン機能）をもつ熱ショックタンパク質sHSP17.7の遺伝子を、イネ科植物に導入し、恒常的に高発現させることによって、イネ科植物の環境ストレス耐性を複合的に強化する方法にも関する。 The present invention also introduces the gene of the heat shock protein sHSP17.7, which is usually induced only at high temperatures and has an activity to prevent protein denaturation (molecular chaperone function), into a grass family plant to constantly express it high. In addition, the present invention relates to a method for enhancing the environmental stress tolerance of gramineous plants.
1. sHSP17.7遺伝子断片の調製
本発明に係るsHSP17.7遺伝子は、イネ科植物において高温条件で発現が誘導され、かつ高温耐性を付与する熱ショックタンパク質をコードする遺伝子である。
1. Preparation of sHSP17.7 Gene Fragment The sHSP17.7 gene according to the present invention is a gene encoding a heat shock protein that is induced in high temperature conditions in grasses and imparts high temperature resistance.
本発明に係るsHSP17.7遺伝子は、具体的には、以下の(a)〜(d)の遺伝子である。
(a) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNAからなる遺伝子。
(b) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高温耐性付与活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
(c) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
(d) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高温耐性付与活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
The sHSP17.7 gene according to the present invention is specifically the following genes (a) to (d).
(a) A gene consisting of DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(b) A gene comprising a DNA that hybridizes with a DNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a protein having a high temperature resistance imparting activity.
(c) A gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
(d) a gene encoding a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having a high temperature resistance imparting activity.
本発明のsHSP17.7遺伝子にコードされるタンパク質は、分子シャペロン機能を有すると考えられる。このHSP17.7タンパク質の高温耐性付与活性は、例えば次のようにして確認することができる。まず、そのsHSP17.7遺伝子を含む組換え発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体においてその組換えベクターからのタンパク質の発現を誘導した後、それに60℃で45分間の熱ショックを与える。熱ショック後、形質転換体を培養し、その細胞生存率を算出する。細胞生存率は、熱ショックを加えなかった形質転換体（対照サンプル）のコロニー形成数に対する、熱ショックを加えた形質転換体のコロニー形成数の比率として算出する。本発明においては、細胞生存率が34％以上、好ましくは34％〜76％である場合、そのsHSP17.7遺伝子にコードされるタンパク質は高温耐性付与活性を有するものとする。 The protein encoded by the sHSP17.7 gene of the present invention is considered to have a molecular chaperone function. The high temperature resistance imparting activity of the HSP17.7 protein can be confirmed, for example, as follows. First, E. coli was transformed with a recombinant expression vector containing the sHSP17.7 gene, and after the resulting transformant induced protein expression from the recombinant vector, it was incubated at 60 ° C. for 45 minutes. Give heat shock. After the heat shock, the transformant is cultured, and the cell viability is calculated. The cell viability is calculated as the ratio of the number of colonies formed by the transformant to which heat shock was applied to the number of colonies formed by the transformant to which heat shock was not applied (control sample). In the present invention, when the cell viability is 34% or more, preferably 34% to 76%, the protein encoded by the sHSP17.7 gene has high temperature tolerance imparting activity.
また本発明のsHSP17.7遺伝子にコードされるタンパク質（sHSP17.7タンパク質）の高温耐性付与活性は、sHSP17.7タンパク質とカタラーゼとを共存させて高温条件（例えば55℃）に曝露した場合に、カタラーゼの熱変性が抑制されることによっても確認できる。例えば、sHSP17.7タンパク質を、カタラーゼを含む50 mM Na2HPO4/NaH2PO4バッファー（pH 8.0）に加えた後、そのサンプルを55℃に加熱しながら、360nmでの吸光度を経時的に測定する。この360nmでの吸光度は、凝集したカタラーゼの相対量を示しており、この吸光度の値が高いほど、カタラーゼが熱変性した量が多いことを意味する。sHSP17.7タンパク質は、カタラーゼの1.5倍量加えることで変性抑制効果が認められるが、ほぼ完全に抑制するためには、３倍以上の量で加えることが好ましい。本発明では、sHSP17.7タンパク質をカタラーゼの３倍以上の量で加えた場合、添加から20分後の360nmでの吸光度の増加が有意に抑制される場合に、そのsHSP17.7タンパク質が高温耐性付与活性を有すると判断することもできる。
Moreover, the high temperature tolerance imparting activity of the protein (sHSP17.7 protein) encoded by the sHSP17.7 gene of the present invention is obtained when the sHSP17.7 protein and catalase coexist and exposed to high temperature conditions (for example, 55 ° C.). This can also be confirmed by suppression of thermal denaturation of catalase. For example, after adding sHSP17.7 protein to 50 mM Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 buffer (pH 8.0) containing catalase, the absorbance at 360 nm was measured over time while the sample was heated to 55 ° C. taking measurement. This absorbance at 360 nm indicates the relative amount of aggregated catalase, and the higher this absorbance value, the greater the amount of catalase thermally denatured. The sHSP17.7 protein can be denatured and suppressed by adding 1.5 times the amount of catalase, but in order to suppress it almost completely, it is preferably added in an amount of 3 times or more. In the present invention, when sHSP17.7 protein is added in an amount of 3 times or more of catalase, the increase in absorbance at 360
一実施形態としては、本発明に係るsHSP17.7遺伝子は、高温処理（例えば播種後10日後のイネ幼苗について50℃で2.5時間の処理）したイネ科植物由来の組織から常法により調製した全mRNAを鋳型として、sHSP17.7遺伝子の全長を増幅可能なように設計したプライマーを用いたPCR増幅によって完全長cDNAとして取得することができる。
In one embodiment, the sHSP17.7 gene according to the present invention is prepared by a conventional method from a tissue derived from a gramineous plant that has been subjected to high-temperature treatment (for example, treatment of
さらに別の実施形態としては、本発明に係るsHSP17.7遺伝子は、イネ科植物由来のcDNAライブラリーを鋳型として、sHSP17.7遺伝子の全長を増幅可能なように設計したプライマーを用いたPCR増幅によって取得することができる。 In yet another embodiment, the sHSP17.7 gene according to the present invention is obtained by PCR amplification using primers designed to amplify the full length of the sHSP17.7 gene using a cDNA library derived from a gramineous plant as a template. Can be obtained by:
sHSP17.7遺伝子の全長を増幅可能なように設計したプライマー対としては、例えば以下のものが挙げられる。プライマーPri-1（5'-ATGTCGCTGATCCGCCGCGG-3'[配列番号9]）及びプライマーPri-2（5'-GCCGGAGATCTGGATGGACT-3'[配列番号10]）。 Examples of primer pairs designed to amplify the full length of the sHSP17.7 gene include the following. Primer Pri-1 (5′-ATGTCGCTGATCCGCCGCGG-3 ′ [SEQ ID NO: 9]) and primer Pri-2 (5′-GCCGGAGATCTGGATGGACT-3 ′ [SEQ ID NO: 10]).
sHSP17.7遺伝子の全長を増幅するためのPCR反応液（20μl）組成としては、例えば、以下の組成を用いることができる。 As a PCR reaction solution (20 μl) composition for amplifying the full length of the sHSP17.7 gene, for example, the following composition can be used.
DNA 100ng
Pri-1 0.5μM
Pri-2 0.5μM
dNTPs 0.2mM
MgCl2 1.5mM
TaqDNAポリメラーゼ(GIBCO BRL社製)1U
総量 20μl
DNA 100ng
Pri-1 0.5μM
Pri-2 0.5μM
dNTPs 0.2mM
MgCl 2 1.5mM
TaqDNA polymerase (GIBCO BRL) 1U
Total volume 20μl
また、反応条件としては、94℃で1分、60℃で1分、72℃で1分のサイクルを１サイクルとしてこれを30サイクル行う方法を用いることができる。 Further, as reaction conditions, a method in which a cycle of 94 ° C. for 1 minute, 60 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1 minute is performed as 30 cycles can be used.
得られたsHSP17.7遺伝子を含むDNA断片については、塩基配列決定により塩基配列を確認することが好ましい。塩基配列決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例えばAloka社製DNAシークエンサーLIC-4200LS-2等）を用いて行えばよい。 The obtained DNA fragment containing the sHSP17.7 gene is preferably confirmed by nucleotide sequencing. The nucleotide sequence can be determined by a known method such as Maxam-Gilbert's chemical modification method or dideoxynucleotide chain termination method. Usually, an automatic nucleotide sequencer (eg, DNA sequencer LIC-4200LS-2 manufactured by Aloka) is used. You can use it.
さらに、得られたsHSP17.7遺伝子を含むDNA断片について、部位特定変異誘発等によって塩基配列を改変することもできる。DNAに変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutan-K(TAKARA社製）やMutan-G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異の導入が行われる。 Further, the base sequence of the obtained DNA fragment containing the sHSP17.7 gene can be modified by site-directed mutagenesis or the like. In order to introduce a mutation into DNA, a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method, or a method equivalent thereto can be employed. For example, using a mutagenesis kit (for example, Mutan-K (TAKARA) or Mutan-G (TAKARA)) using site-directed mutagenesis, or TAKARA LA PCR in vitro Mutagenesis Mutation is introduced using a series kit.
sHSP17.7遺伝子をイネ科植物に導入するためには、得られたsHSP17.7遺伝子を含むDNA断片を用いて組換え発現ベクターを構築することが好ましい。導入したイネ科植物中でsHSP17.7遺伝子を恒常的に発現させるためには、sHSP17.7遺伝子を含むDNA断片を、過剰発現プロモーターの下流に連結した状態でベクターに組み込むことが好ましい。使用可能な過剰発現プロモーターの例としては、CaMV35Sプロモーター、イネアクチンプロモーターが挙げられる。特に好適な過剰発現プロモーターを含む組換え発現ベクターの例としては、pMLH7133(Mitsuhara et al., Plant Cell Rhysiology 37:49-59, 1996)中のGUS遺伝子を、本発明のsHSP17.7遺伝子で置換したものが挙げられる。 In order to introduce the sHSP17.7 gene into a gramineous plant, it is preferable to construct a recombinant expression vector using the obtained DNA fragment containing the sHSP17.7 gene. In order to constantly express the sHSP17.7 gene in the introduced gramineous plant, it is preferable to incorporate a DNA fragment containing the sHSP17.7 gene into the vector in a state of being linked downstream of the overexpression promoter. Examples of the overexpression promoter that can be used include the CaMV35S promoter and the rice actin promoter. As an example of a recombinant expression vector containing a particularly suitable overexpression promoter, the GUS gene in pMLH7133 (Mitsuhara et al., Plant Cell Rhysiology 37: 49-59, 1996) is replaced with the sHSP17.7 gene of the present invention. The thing which was done is mentioned.
ベクターにsHSP17.7遺伝子を組み込むには、例えば、sHSP17.7遺伝子を含むDNA断片を適当な制限酵素で切断し、ベクター中の過剰発現プロモーター下流の適当な制限酵素部位にイン・フレームとなるように挿入すればよい。 In order to incorporate the sHSP17.7 gene into a vector, for example, a DNA fragment containing the sHSP17.7 gene is cleaved with an appropriate restriction enzyme so that it becomes in-frame at an appropriate restriction enzyme site downstream of the overexpression promoter in the vector. Insert it into
組換え発現ベクターには、さらに、エンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）などが含まれていてもよい。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。 The recombinant expression vector may further contain a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, a ribosome binding sequence (SD sequence) and the like. Examples of the selection marker include dihydrofolate reductase gene, ampicillin resistance gene, neomycin resistance gene and the like.
2. イネ科植物へのsHSP17.7遺伝子の導入
上記の通り作製したsHSP17.7遺伝子を含む組換えベクターをイネ科植物に導入することにより、イネ科植物の形質転換体を作製することができる。
2. Introduction of sHSP17.7 gene into gramineous plants By introducing a recombinant vector containing sHSP17.7 gene prepared as described above into gramineous plants, a transformant of gramineous plants can be produced. .
本発明において遺伝子を導入するイネ科植物は、イネ科に属する植物であれば特に限定されないが、イネ（Oryza sativa）、トウモロコシ（Zea mays）、コムギ（Triticum aestivum L.）、オオムギ（Hordeum vulgare L.）、ライ麦（Secale cereale）等が好ましい。好ましいイネ品種の例としては、「ほしのゆめ（Hoshinoyume）」、「きらら３９７(Kirara397)」，「ゆきひかり(Yukihikari)」、「ゆきまる(Yukimaru)」、「ほのか２２４(Honoka224)」，「どんとこい(Dontokoi)」、「コシヒカリ(Koshihikari)」、「ササニシキ(Sasanishiki)」、「ヒトメボレ(Hitomebore)」、「あきたこまち(Akitakomachi)」、「はえぬき(Haenuki)」、「キヌヒカリ(Kinuhikari)」、「むつほまれ(Mutsuhomare)」、「ヒノヒカリ(Hinohikari)」、「津軽おとめ(Tsugaruotome)」、「つがるロマン(Tsugaruroman)」、「ゆめあかり(Yumeakari)」、「ハナエチゼン(Hanaechizen)」、「夢つくし(Yumetsukushi)」、「ハツシモ(Hatsushimo)」、「どまんなか(Domannaka)」、「かけはし(Kakehashi)」、「いわてっこ(Iwatekko)」、「まなむすめ(Manamusume)」、「めんこいな(Menkoina)」、「チヨニシキ(Chiyonishiki)」、「ふくみらい(Fukumirai)」等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 In the present invention, the Gramineae plant into which the gene is introduced is not particularly limited as long as it belongs to the Gramineae family, but rice (Oryza sativa), maize (Zea mays), wheat (Triticum aestivum L.), barley (Hordeum vulgare L) .), Rye (Secale cereale) and the like are preferable. Examples of preferred rice varieties include “Hoshinoyume”, “Kirara 397”, “Yukihikari”, “Yukimaru”, “Honoka224”, “Donto” `` Dontokoi '', `` Koshihikari '', `` Sasanishiki '', `` Hitomebore '', `` Akitakomachi '', `` Haenuki '', `` Kinuhikari '', `` Mutsu `` Humare '' (Mutsuhomare), `` Hinohikari '', `` Tsugaruotome '', `` Tsugaruroman '', `` Yumeakari '', `` Hanaechizen '', `` Yumetsukushi '' ), `` Hatsushimo '', `` Domannaka '', `` Kakehashi '', `` Iwatekko '', `` Manamusume '', `` Menkoina '', `` Chiyonishiki "," Fukumira " (Fukumirai) "and the like, but not limited thereto.
sHSP17.7遺伝子の導入に使用できる植物試料としては、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等)、植物培養細胞（例えばカルス）等が挙げられる。 Plant samples that can be used for the introduction of the sHSP17.7 gene include whole plants, plant organs (e.g. leaves, petals, stems, roots, seeds, etc.), plant tissues (e.g. epidermis, phloem, soft tissue, xylem, fibers). Tube bundle, fence-like tissue, spongy tissue, etc.), plant cultured cells (for example, callus) and the like.
sHSP17.7遺伝子を含む上記組換えベクターは、植物の形質転換に用いられる方法、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法、エレクトロポレーション法等によって植物細胞中に導入することができる。例えばアグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)に導入し、この菌株をイネのカルスに接種して感染させ、トランスジェニック植物細胞を得ることができる。また、パーティクルガン法を用いる場合には、遺伝子導入装置（例えばPDS-1000(BIO-RAD社)等）を製造業者の説明書に従って使用して、植物試料に、sHSP17.7遺伝子を含む組換えベクターをまぶした金属粒子を打ち込むことができる。遺伝子導入装置による操作条件は植物又は試料により異なるが、通常は450〜2000psi程度の圧力、4〜12cm程度の距離で行う。植物試料としては、植物体、植物器官、又は植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。 The recombinant vector containing the sHSP17.7 gene can be introduced into plant cells by methods used for plant transformation, such as the Agrobacterium method, particle gun method, PEG method, electroporation method and the like. For example, when using the Agrobacterium method, the constructed plant expression vector is introduced into an appropriate Agrobacterium, such as Agrobacterium tumefaciens, and this strain is inoculated into rice callus to infect, Transgenic plant cells can be obtained. When using the particle gun method, use a gene transfer device (eg, PDS-1000 (BIO-RAD), etc.) according to the manufacturer's instructions to recombine the plant sample containing the sHSP17.7 gene. Metal particles coated with a vector can be implanted. The operating conditions of the gene transfer apparatus vary depending on the plant or sample, but are usually performed at a pressure of about 450 to 2000 psi and a distance of about 4 to 12 cm. As a plant sample, a plant body, a plant organ, or a plant tissue itself may be used as it is, or it may be used after preparing a section, or a protoplast may be prepared and used.
形質転換した腫瘍組織やシュート、毛状根等は、例えば従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などによって植物体に再生させることができる。 For transformed tumor tissue, shoots, hairy roots, etc., for example, conventionally known plant tissue culture methods are used, and plant hormones of appropriate concentrations (auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.) are used. It can be regenerated into a plant body by administration of
sHSP17.7遺伝子が目的のトランスジェニックイネ科植物に導入されたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロット法等を利用して行うことができる。例えば、トランスジェニック植物から全RNAを調製し、sHSP17.7遺伝子特異的プライマーを設計してPCR増幅を行う。増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。 Whether or not the sHSP17.7 gene has been introduced into the target transgenic gramineous plant can be confirmed using a PCR method, Southern hybridization method, Northern hybridization method, Western blot method, or the like. For example, total RNA is prepared from a transgenic plant, and PCR amplification is performed by designing sHSP17.7 gene-specific primers. The amplified product is transformed by performing agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis, etc., staining with ethidium bromide, SYBR Green solution, etc., and detecting the amplified product as a single band. Can be confirmed. Moreover, PCR can be performed using a primer previously labeled with a fluorescent dye or the like to detect an amplification product. Furthermore, it is possible to employ a method in which the amplification product is bound to a solid phase such as a microplate and the amplification product is confirmed by fluorescence or enzyme reaction.
sHSP17.7遺伝子が導入されたトランスジェニックイネ科植物については、sHSP17.7タンパク質が通常条件下でも発現されていることを確認することが好ましい。例えば、通常条件下で播種後10日間生育させた当該トランスジェニックイネ科植物について、その組織を切り取り、その試料から常法によって抽出したmRNAについて、sHSP17.7遺伝子に対する特異的プローブを用いたノーザンブロッティング解析を行い、sHSP17.7遺伝子からの発現を確認すればよい。sHSP17.7遺伝子に対する特異的プローブの設計は、導入するsHSP17.7遺伝子の塩基配列に基づいて、常法によって行うことができる。あるいはまた、通常条件下で播種後10日間生育させた当該トランスジェニックイネ科植物について、その組織を切り取り、その試料から常法によって抽出した全タンパク質を含む試料について、sHSP17.7タンパク質に対する特異的抗体を用いたウェスタンブロッティング解析を行い、sHSP17.7タンパク質の発現を確認してもよい。sHSP17.7タンパク質に対する特異的抗体としては、通常の組換え法によって作製したsHSP17.7タンパク質を、例えばマウスの腹腔内に注射して腹水を採取するか、又は皮下に注射して抗sHSP17.7血清を採取して、それを用いればよい。 For transgenic gramineous plants introduced with the sHSP17.7 gene, it is preferable to confirm that the sHSP17.7 protein is expressed even under normal conditions. For example, for the transgenic Gramineae plant grown for 10 days after seeding under normal conditions, the tissue was cut out, and mRNA extracted from the sample by a conventional method was used for Northern blotting using a specific probe for the sHSP17.7 gene. Analysis may be performed to confirm expression from the sHSP17.7 gene. Design of a specific probe for the sHSP17.7 gene can be performed by a conventional method based on the nucleotide sequence of the sHSP17.7 gene to be introduced. Alternatively, for the transgenic Gramineae plant grown for 10 days after seeding under normal conditions, the tissue is cut out, and a sample containing all the proteins extracted from the sample by a conventional method, a specific antibody against the sHSP17.7 protein Western blotting analysis may be performed to confirm the expression of sHSP17.7 protein. As a specific antibody against the sHSP17.7 protein, the sHSP17.7 protein produced by a usual recombinant method is injected into the peritoneal cavity of a mouse, for example, to collect ascites, or injected subcutaneously to obtain anti-sHSP17.7 protein. Serum may be collected and used.
本明細書において、「通常条件」とは、高温条件、紫外線照射条件、乾燥条件、高塩濃度条件、低温条件、及び凍結温度条件のいずれにも当てはまらない環境条件を意味する。典型的には、この通常条件は、15〜35℃、0〜1,000mJ cm-1の紫外線（UV-B）照射量、-1〜0 MPaの土壌の水ポテンシャル、0〜50 mMである培地中塩濃度の範囲内である。 In this specification, “normal conditions” means environmental conditions that do not correspond to any of high temperature conditions, ultraviolet irradiation conditions, drying conditions, high salt concentration conditions, low temperature conditions, and freezing temperature conditions. Typically, this normal condition is 15-35 ° C., 0-1,000 mJ cm −1 UV (B-B) irradiation dose, −1-0 MPa soil water potential, 0-50 mM medium Within the range of medium salt concentration.
以上のようにして作製される本発明のsHSP17.7遺伝子が導入されたトランスジェニックイネ科植物は、植物細胞内でsHSP17.7タンパク質を恒常的に生産し、高温耐性を有する。 The transgenic gramineous plant introduced with the sHSP17.7 gene of the present invention produced as described above constantly produces sHSP17.7 protein in plant cells and has high-temperature resistance.
3. sHSP17.7遺伝子を導入したトランスジェニックイネ科植物の複合環境ストレス耐性
本発明のトランスジェニックイネ科植物は、下記のような各種の環境ストレスに耐性を示す。本発明のトランスジェニックイネ科植物は、高温耐性、紫外線耐性、乾燥耐性、耐塩性、耐冷性及び耐凍性のうちの少なくとも２種の環境ストレス耐性、好ましくは高温耐性、紫外線耐性、乾燥耐性、耐塩性、耐冷性及び耐凍性の６種の環境ストレス耐性を含む、複合環境ストレス耐性を有する。本明細書において「複合環境ストレス耐性」とは、高温耐性、紫外線耐性、乾燥耐性、耐塩性、耐低性及び耐凍性、並びに一般に植物の生育を阻害するとされる他の任意の環境条件（例えば、強光、化学物質、農薬など）に対する耐性のうち、２種以上の異なる耐性を有することを言う。
3. Complex environmental stress tolerance of transgenic gramineous plants introduced with the sHSP17.7 gene The transgenic gramineous plants of the present invention are resistant to various environmental stresses as described below. The transgenic gramineous plant of the present invention has at least two kinds of environmental stress tolerance among high temperature tolerance, ultraviolet tolerance, drought tolerance, salt tolerance, cold tolerance and freezing tolerance, preferably high temperature tolerance, ultraviolet tolerance, drought tolerance, salt tolerance. It has combined environmental stress tolerance, including six environmental stress tolerances such as heat resistance, cold resistance and freezing resistance. As used herein, “complex environmental stress tolerance” refers to high temperature resistance, UV resistance, drought resistance, salt resistance, low resistance and frost resistance, and any other environmental conditions that are generally considered to inhibit plant growth (eg, , Strong light, chemical substances, pesticides, etc.) that have two or more different resistances.
(1) 高温耐性
本発明において「高温耐性」とは、限定するものではないが、例えば42℃以上の温度、好ましくは45℃〜50℃の高温条件下でも植物が生育可能であることを意味する。本発明における高温耐性は、標準的な高温耐性試験によって評価することができる。
(1) High temperature tolerance In the present invention, "high temperature tolerance" means, but not limited to, for example, that plants can grow even at a temperature of 42 ° C or higher, preferably 45 ° C to 50 ° C. To do. The high temperature resistance in the present invention can be evaluated by a standard high temperature resistance test.
本発明のトランスジェニックイネ科植物は、典型的には、播種後10日目の幼苗を50℃で2.5時間処理し、その7日後の生存率を調べた場合に、その生存率が10％〜100％、特に40％〜100％であることが好ましい。
The transgenic Gramineae plant of the present invention typically has a survival rate of 10% to 10% after treatment of
なお本発明において「生存率」は、高温処理後、25℃で１週間栽培した後の新葉展開（生育再開）個体を生存と判断し、新葉を転換せず生育を再開しない個体を枯死と判断し、生存率は、新葉展開個体数÷全個体数×100として算出する。 In the present invention, the “survival rate” means that an individual who has developed a new leaf (resumed growth) after being cultivated at 25 ° C. for 1 week after high temperature treatment is considered to be alive, and an individual who has not changed the new leaf and has not resumed growth died. Therefore, the survival rate is calculated as the number of newly developed individuals / total number of individuals × 100.
また、そのようにして算出した生存率が、sHSP17.7遺伝子を導入していない同品種のイネ科植物における生存率よりも高い場合、そのトランスジェニック植物において高温耐性が増強されたと判断することができる。 In addition, when the survival rate calculated in this way is higher than the survival rate in the same cultivar Gramineae that has not introduced the sHSP17.7 gene, it can be determined that high-temperature tolerance has been enhanced in the transgenic plant. it can.
本明細書は「高温条件」とは、気温が36℃以上、好ましくは40℃〜50℃、特に45℃〜50℃であることを言う。本発明における「気温」とは、最低気温もしくは最高気温を意味してもよく、最低気温から最高気温までの温度範囲を意味してもよく、平均気温を意味してもよい。本発明における高温条件の例としては、45℃〜50℃（例えば50℃）の気温に少なくとも2時間、好ましくは2.5時間以上曝露されることが挙げられる。 In the present specification, the “high temperature condition” means that the air temperature is 36 ° C. or higher, preferably 40 ° C. to 50 ° C., particularly 45 ° C. to 50 ° C. The “temperature” in the present invention may mean the lowest temperature or the highest temperature, may mean a temperature range from the lowest temperature to the highest temperature, or may mean an average temperature. Examples of the high temperature condition in the present invention include exposure to air temperature of 45 ° C. to 50 ° C. (for example, 50 ° C.) for at least 2 hours, preferably 2.5 hours or more.
(2) 紫外線耐性
本発明において「紫外線耐性」とは、限定するものではないが、例えばUV-A及び／又はUV-Bの照射量が1,500 mJ cm-1以上、好ましくは2,000 mJ cm-1〜 3,000 mJ cm-1の高線量紫外線照射条件下でも植物が生育可能であることを意味する。本発明における紫外線耐性は、標準的な紫外線ストレス耐性試験によって評価することができる。
(2) Ultraviolet resistance In the present invention, “ultraviolet resistance” is not limited, but, for example, the irradiation dose of UV-A and / or UV-B is 1,500 mJ cm −1 or more, preferably 2,000 mJ cm −1. It means that plants can grow even under high-dose UV irradiation conditions of ~ 3,000 mJ cm- 1 . The UV resistance in the present invention can be evaluated by a standard UV stress resistance test.
本発明のトランスジェニックイネ科植物は、典型的には、播種後10日目の幼苗にUV-B（302 nm）を3000 mJ cm-1照射し、その7日後の電解質漏出率（EC％）を測定した場合に、EC％が0％〜30％、特に0％〜20％であることが好ましい。 In the transgenic gramineous plant of the present invention, typically, seedlings on the 10th day after sowing are irradiated with 3000 mJ cm -1 of UV-B (302 nm), and the electrolyte leakage rate (EC%) after 7 days. EC% is preferably 0% to 30%, particularly preferably 0% to 20%.
電解質漏出率（EC％）は、UV-B照射前の導電率に対するUV-B照射の7日後の導電率の比率として算出する。それぞれの導電率は、イネ幼苗から葉の一部を切り取り、それを１mlの蒸留水中に入れて23℃で一晩放置し、次いで蒸留水中の導電率を、例えば導電率計（堀場製作所）を用いて測定することによって得られる。 The electrolyte leakage rate (EC%) is calculated as the ratio of the conductivity 7 days after UV-B irradiation to the conductivity before UV-B irradiation. For each conductivity, a part of the leaf is cut out from rice seedlings, placed in 1 ml of distilled water and left at 23 ° C. overnight, and then the conductivity in distilled water is measured using, for example, a conductivity meter (Horiba Seisakusho). It is obtained by using and measuring.
このようにして算出されるEC％がより低ければ、そのトランスジェニック植物は紫外線による膜ダメージをより受けにくく、すなわちより高い紫外線耐性を有すると判断される。 If the EC% calculated in this way is lower, it is judged that the transgenic plant is less susceptible to membrane damage due to ultraviolet rays, that is, has higher ultraviolet tolerance.
本明細書で「高線量紫外線照射条件」とは、UV-A及び／又はUV-Bの照射量が1,500 mJ cm-1以上、好ましくは2,000 mJ cm-1〜 3,000 mJ cm-1であることを意味する。 In this specification, “high-dose ultraviolet irradiation conditions” means that the irradiation dose of UV-A and / or UV-B is 1,500 mJ cm −1 or more, preferably 2,000 mJ cm −1 to 3,000 mJ cm −1. Means.
(3) 乾燥耐性
本発明において「乾燥耐性」とは、限定するものではないが、例えば６日間給水を停止し、土壌の水ポテンシャルが-15〜-19MPaの乾燥条件下でも植物が生育可能であることを意味する。本発明における乾燥耐性は、標準的な乾燥耐性試験によって評価することができる。
(3) Drought tolerance In the present invention, "dry tolerance" is not limited, but for example, plants can grow even under dry conditions where water supply is stopped for 6 days and the water potential of the soil is -15 to -19 MPa. It means that there is. The dry resistance in the present invention can be evaluated by a standard dry resistance test.
本発明のトランスジェニックイネ科植物は、典型的には、播種後10日目の幼苗を、6日間給水せずに乾燥状態で放置し、その後給水を再開してから7日目の生存率を調べた場合に、その生存率が70％〜100％、特に90％〜100％であることが好ましい。生存率の算出法は、高温耐性の場合と同じである。 The transgenic gramineous plant of the present invention typically has a seedling of 10 days after sowing, left in a dry state without supplying water for 6 days, and then resumed water supply and then the survival rate on the 7th day. When examined, the survival rate is preferably 70% to 100%, particularly 90% to 100%. The method for calculating the survival rate is the same as that for high temperature resistance.
また、そのようにして算出した生存率が、sHSP17.7遺伝子を導入していない同品種のイネ科植物における生存率よりも高い場合、そのトランスジェニック植物において乾燥耐性が増強されたと判断することができる。 In addition, if the survival rate calculated in this way is higher than the survival rate in the same cultivar Gramineae plant not introduced with the sHSP17.7 gene, it can be determined that drought tolerance has been enhanced in the transgenic plant. it can.
本明細書で「乾燥条件」とは、土壌の水ポテンシャルが-3〜-20MPa、例えば-15〜-19MPa下の状態であることを言う。 As used herein, “dry conditions” means that the water potential of the soil is in the range of −3 to −20 MPa, for example, −15 to −19 MPa.
(4) 耐塩性
本発明において「耐塩性」とは、限定するものではないが、例えば0.2 M以上の塩濃度、好ましくは0.3 〜 0.45 Mの高塩濃度条件下でも植物が生育可能であることを意味する。本発明における耐塩性は、標準的な塩ストレス耐性試験によって評価することができる。
(4) Salt tolerance In the present invention, the term “salt tolerance” is not limited, but for example, plants can grow even under salt conditions of 0.2 M or higher, preferably 0.3 to 0.45 M. Means. The salt tolerance in the present invention can be evaluated by a standard salt stress tolerance test.
本発明のトランスジェニックイネ科植物は、典型的には、播種後10日目の幼苗を0.45 MのNaCl溶液中に3日間浸漬した後、真水に戻して7日後の生存率を調べた場合に、その生存率が40％〜100％、特に70％〜100％であることが好ましい。生存率の算出法は、高温耐性の場合と同じである。
The transgenic gramineous plant of the present invention is typically obtained by immersing a
また、そのようにして算出した生存率が、sHSP17.7遺伝子を導入していない同品種のイネ科植物における生存率よりも高い場合、そのトランスジェニック植物において耐塩性が増強されたと判断することができる。 In addition, when the survival rate calculated as described above is higher than the survival rate of the same cultivar Gramineae that has not introduced the sHSP17.7 gene, it may be determined that the salt tolerance has been enhanced in the transgenic plant. it can.
本明細書で「高塩濃度条件」とは、塩濃度が0.2 M以上、例えば0.3 〜 0.45 Mであることを意味する。 In the present specification, the “high salt concentration condition” means that the salt concentration is 0.2 M or more, for example, 0.3 to 0.45 M.
(5) 耐冷性
本発明において「耐冷性」とは、限定するものではないが、例えば0℃〜12℃、好ましくは0℃〜5℃の低温条件下でも植物が生育可能であることを意味する。本発明における耐冷性は、標準的な耐冷性試験によって評価することができる。
(5) Cold resistance In the present invention, “cold resistance” is not limited, but means that plants can grow even under low temperature conditions of, for example, 0 ° C. to 12 ° C., preferably 0 ° C. to 5 ° C. To do. The cold resistance in the present invention can be evaluated by a standard cold resistance test.
本発明のトランスジェニックイネ科植物は、典型的には、播種後10日目の幼苗を5℃で13日間処理した後、25℃に戻して7日後の生存率を調べた場合に、その生存率が20％〜100％、特に30％〜100％であることが好ましい。生存率の算出法は、高温耐性の場合と同じである。 The transgenic Gramineae plant of the present invention typically has its survival when the seedlings on the 10th day after sowing were treated at 5 ° C for 13 days and then returned to 25 ° C and the survival rate after 7 days was examined. The rate is preferably 20% to 100%, particularly preferably 30% to 100%. The method for calculating the survival rate is the same as that for high temperature resistance.
また、そのようにして算出した生存率が、sHSP17.7遺伝子を導入していない同品種のイネ科植物における生存率よりも高い場合、そのトランスジェニック植物において耐冷性が増強されたと判断することができる。 In addition, if the survival rate calculated in this way is higher than the survival rate in the same cultivar Gramineae plant not introduced with the sHSP17.7 gene, it can be determined that the cold tolerance was enhanced in the transgenic plant. it can.
本明細書で「低温条件」とは、気温がO℃を超えて14℃以下、例えば0℃〜12℃であることを意味する。 In this specification, the “low temperature condition” means that the air temperature exceeds O ° C. and is 14 ° C. or less, for example, 0 ° C. to 12 ° C.
(6) 耐凍性
本発明において「耐凍性」とは、限定するものではないが、例えば0℃以下、好ましくは−6℃〜0℃の凍結温度条件下でも植物が生育可能であることを意味する。本発明における耐凍性は、標準的な耐凍性試験によって評価することができる。
(6) Freezing resistance In the present invention, “freezing resistance” is not limited, but means that plants can grow even under freezing temperature conditions of, for example, 0 ° C. or less, preferably −6 ° C. to 0 ° C. To do. The freezing resistance in the present invention can be evaluated by a standard freezing resistance test.
本発明のトランスジェニックイネ科植物は、典型的には、播種後10日目の幼苗を−6℃で1時間処理した後、25℃に戻して7日後の生存率を調べた場合に、その生存率が5％〜100％、特に15％〜100％であることが好ましい。生存率の算出法は、高温耐性の場合と同じである。
The transgenic gramineous plant of the present invention is typically treated by treating the
また、そのようにして算出した生存率が、sHSP17.7遺伝子を導入していない同品種のイネ科植物における生存率よりも高い場合、そのトランスジェニック植物において耐凍性が増強されたと判断することができる。 In addition, if the survival rate calculated in this way is higher than the survival rate in the same cultivar Gramineae that has not introduced the sHSP17.7 gene, it can be determined that the freezing tolerance has been enhanced in the transgenic plant. it can.
本明細書で「凍結温度条件」とは、気温がO℃以下、例えば-10℃〜0℃、特に-6℃〜0℃であることを意味する。 In this specification, the “freezing temperature condition” means that the air temperature is O ° C. or less, for example, −10 ° C. to 0 ° C., particularly −6 ° C. to 0 ° C.
4. 環境ストレス条件下でのトランスジェニックイネ科植物の栽培
本発明の熱ショックタンパク質sHSP17.7遺伝子を恒常的に発現させたトランスジェニックイネ科植物では、上記3に記載したような高温条件、高線量の紫外線照射条件、乾燥条件、高塩濃度条件、低温条件、及び凍結温度条件における環境ストレス耐性が複合的に強化され、それらの条件下での生存率が顕著に向上する。従ってこのトランスジェニックイネ科植物は、高温条件、高線量紫外線照射条件、乾燥条件、高塩濃度条件、低温条件、及び凍結温度条件のうちの少なくとも１つ、あるいはそれらの複合的なストレス条件下での栽培に適したイネ科植物として非常に有用である。このトランスジェニックイネ科植物は、特に乾燥条件、高塩濃度条件、低温条件、及び凍結温度条件における栽培用に好適である。本発明のトランスジェニックイネ科植物はまた、乾燥条件、高塩濃度条件、低温条件、及び凍結温度条件のうちの少なくとも１つ（例えば、このうちの２つ以上、あるいは３つ以上）の条件を含む複合環境ストレス条件下、例えば、乾燥条件＋低温条件、高塩濃度条件＋低温条件、乾燥条件＋凍結温度条件、高塩濃度条件＋凍結温度条件、乾燥条件＋高塩濃度条件、凍結温度〜低温の温度条件などの複合環境ストレス条件下での栽培に適している。複合環境ストレス条件とは、これらの複数のストレス条件が同時期に存在するものであってもよいし、栽培期間中の別々の時期に存在するものであってもよい。
4. Cultivation of transgenic gramineous plants under environmental stress conditions In transgenic gramineous plants in which the heat shock protein sHSP17.7 gene of the present invention is constitutively expressed, Environmental stress resistance under doses of ultraviolet irradiation conditions, drying conditions, high salt concentration conditions, low temperature conditions, and freezing temperature conditions is enhanced in combination, and the survival rate under these conditions is significantly improved. Therefore, the transgenic gramineous plant is subjected to at least one of a high temperature condition, a high-dose ultraviolet irradiation condition, a drying condition, a high salt concentration condition, a low temperature condition, and a freezing temperature condition, or a combined stress condition thereof. It is very useful as a gramineous plant suitable for cultivation. This transgenic gramineous plant is particularly suitable for cultivation under dry conditions, high salt concentration conditions, low temperature conditions, and freezing temperature conditions. The transgenic gramineous plant of the present invention also has at least one of a dry condition, a high salt concentration condition, a low temperature condition, and a freezing temperature condition (for example, two or more of these, or three or more). Including complex environmental stress conditions, for example, drying conditions + low temperature conditions, high salt concentration conditions + low temperature conditions, drying conditions + freezing temperature conditions, high salt concentration conditions + freezing temperature conditions, drying conditions + high salt concentration conditions, freezing temperature ~ Suitable for cultivation under complex environmental stress conditions such as low temperature conditions. The combined environmental stress condition may be one in which these multiple stress conditions exist at the same time, or may exist at different times in the cultivation period.
本発明のトランスジェニックイネ科植物は、これらの環境ストレス条件においてもより高い生存率を維持することができ、すなわちそれらの環境ストレス条件下において栽培することが可能である。本発明のトランスジェニックイネ科植物は、これらの環境ストレス条件下で栽培した場合に、既存のイネ科植物と比較して収量を大幅に増大させることができる。 The transgenic grasses of the present invention can maintain a higher survival rate even under these environmental stress conditions, that is, can be cultivated under these environmental stress conditions. When cultivated under these environmental stress conditions, the transgenic gramineous plant of the present invention can greatly increase the yield compared to existing gramineous plants.
以下、実施例及び図面を参照して本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated with reference to an Example and drawing, this invention is not limited to these Examples.
実施例１： 高温耐性付与遺伝子の単離
(1) イネのストレス処理
イネ品種「ほしのゆめ」（Oryza sativa L., cv Hoshinoyume）の種子を27℃で2日間水中に浸漬し、それを、直径9cmのプラスチック製ペトリ皿中に敷き詰めた湿ったバーミキュライト上に播種した。続いてペトリ皿を、25℃、80％相対湿度の育成チャンバー内に入れ、明所に16時間／暗所に8時間のサイクルに置いて発芽させた。
Example 1: Isolation of a gene conferring high temperature resistance
(1) Rice stress treatment The seeds of rice cultivar "Hoshi no Yume" (Oryza sativa L., cv Hoshinoyume) were soaked in water at 27 ° C for 2 days and then spread in a 9cm diameter plastic Petri dish. Sowing on vermiculite. The Petri dishes were then placed in a growth chamber at 25 ° C. and 80% relative humidity and allowed to germinate in a 16 hour light / 8 hour cycle in the dark.
播種後10日目まで生育させたイネ幼苗を、暗所、100％相対湿度、42℃にて、1、3、9及び24時間にわたって高温処理した。 Rice seedlings grown until the 10th day after sowing were subjected to high temperature treatment in the dark, 100% relative humidity, 42 ° C. for 1, 3, 9 and 24 hours.
続いて、UV-B耐性を調べるため、イネ幼苗にUV-B照射（302 nm; 3000 mJ cm-1）を施した。一方、対照用のイネ幼苗には、25℃にて同様のUV-B照射処理を施した。UV-B照射を行った後、それらのイネ幼苗を育成チャンバーに移し、さらに25℃で７日間生長させた。 Subsequently, in order to examine UV-B resistance, rice seedlings were irradiated with UV-B (302 nm; 3000 mJ cm −1 ). On the other hand, control rice seedlings were subjected to the same UV-B irradiation treatment at 25 ° C. After UV-B irradiation, the rice seedlings were transferred to a growth chamber and further grown at 25 ° C. for 7 days.
イネ幼苗のUV-B耐性は、導電率計（堀場製作所）を用いて電解質漏出を測定することにより評価した。UV-B照射前、及びUV-B照射の7日後のイネ幼苗の外植片から葉のサンプルを切り取り、それぞれについて、１mlの蒸留水中に入れて23℃で一晩放置し、蒸留水中の導電率を測定した。次いでUV-B照射前の導電率とUV-B照射の7日後の導電率から、電解質漏出率（EC％）を算出した。 The UV-B resistance of rice seedlings was evaluated by measuring electrolyte leakage using a conductivity meter (Horiba Seisakusho). Before UV-B irradiation and 7 days after UV-B irradiation, cut out leaf samples from the explants of rice seedlings, put them in 1 ml of distilled water and leave them at 23 ° C overnight. The rate was measured. Next, the electrolyte leakage rate (EC%) was calculated from the conductivity before UV-B irradiation and the conductivity 7 days after UV-B irradiation.
その結果、UV-Bを照射した対照イネ幼苗は、EC％の値は36.1であり、重大なUVダメージを示した。しかしながら、UV-B照射前の24時間にわたって42℃で高温処理したイネ幼苗においては、EC％の値が13.6であり、そのようなUVダメージは認められなかった。また3、6、9時間にわたり高温処理したイネ幼苗のEC％は、それぞれ43.1、32.4、28.4であった。このように、高温処理したイネ幼苗では、高温処理時間が長くなるにつれてUV-B耐性が増強された。特に42℃の温度に24時間曝露したイネ幼苗では、UVダメージへの耐性が劇的に増加することが示された。 As a result, the control rice seedlings irradiated with UV-B had an EC% value of 36.1 and showed serious UV damage. However, in rice seedlings treated at 42 ° C. for 24 hours before UV-B irradiation, the EC% value was 13.6, and such UV damage was not observed. The EC percentages of rice seedlings treated at high temperature for 3, 6 and 9 hours were 43.1, 32.4 and 28.4, respectively. As described above, in the rice seedlings subjected to the high temperature treatment, the UV-B resistance was enhanced as the high temperature treatment time was increased. In particular, rice seedlings exposed to a temperature of 42 ° C for 24 hours have been shown to dramatically increase resistance to UV damage.
(2) 高温耐性付与遺伝子の同定
播種後25℃で10日間生育させたイネ幼苗を、42℃で2時間、又は24時間にわたって高温処理し、さらに25℃で７日間生育させた。このイネ幼苗からシュートを切り取り、それぞれのサンプルから、Sato et al., J Exp Bot. 52: 145-51 (2001)に記載の方法に従って全RNAを抽出した。常磁性ビーズに結合したポリd[T]25Vオリゴヌクレオチドを用いて、100μgの全RNAからポリ(A)＋RNAを抽出した。cDNA Synthesis Module RPN1256 (Amersham)を用いて、ポリ(A)＋RNAから二本鎖cDNAを合成し、それをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールによって抽出し、エタノール沈殿し、再懸濁した。得られた二本鎖cDNAを制限酵素AseI及びTaqIを用いて処理し、AseI-TaqI断片を調製した。このAseI-TaqI断片を鋳型として用いて、Vos et al. Nucleic Acids Res. 23: 4407-14 (1995)に記載の方法に従い、非放射性の予備増幅反応、及び放射標識したAseIプライマーを用いる選択的AFLP(Amplified fragment length polymorphism)増幅反応を行った。この選択的増幅には１６組のプライマーを用いた。得られた増幅断片を電気泳動し、X線フィルムに曝露してオートラジオグラフを作製し、そこから高温処理時間が2時間のサンプルと24時間のサンプルとで示差的に現れたバンドを選び出し、そのバンドを含むゲル断片を切り出した。DNA断片をゲルから抽出し、プライマーPri-3（5'-GACGATGAGTCCTGACCGA-3'[配列番号15]）及びプライマーPri-4（5'-CTCGTAGACTGCGTACCTAAT-3'[配列番号16]）を用いて、以下の反応溶液中で、94℃で30秒、52℃で30秒、72℃で1分のサイクルを１サイクルとしてこれを15サイクル行うことで、目的のDNAを増幅した。
(2) Identification of genes to which high temperature tolerance was imparted Rice seedlings grown at 25 ° C. for 10 days after sowing were treated at 42 ° C. for 2 hours or 24 hours, and further grown at 25 ° C. for 7 days. Shoots were cut from the rice seedlings, and total RNA was extracted from each sample according to the method described in Sato et al., J Exp Bot. 52: 145-51 (2001). Poly (A) + RNA was extracted from 100 μg of total RNA using poly d [T] 25V oligonucleotide bound to paramagnetic beads. Double-stranded cDNA was synthesized from poly (A) + RNA using cDNA Synthesis Module RPN1256 (Amersham), extracted with phenol / chloroform / isoamyl alcohol, ethanol precipitated and resuspended. The obtained double-stranded cDNA was treated with restriction enzymes AseI and TaqI to prepare AseI-TaqI fragments. Using this AseI-TaqI fragment as a template, according to the method described in Vos et al. Nucleic Acids Res. 23: 4407-14 (1995), selective using a non-radioactive preamplification reaction and a radiolabeled AseI primer AFLP (Amplified fragment length polymorphism) amplification reaction was performed. Sixteen sets of primers were used for this selective amplification. The obtained amplified fragment was electrophoresed and exposed to X-ray film to produce an autoradiograph, from which a band that appeared differentially between a sample with a high temperature treatment time of 2 hours and a sample with 24 hours was selected, The gel fragment containing the band was cut out. The DNA fragment was extracted from the gel, and using the primer Pri-3 (5′-GACGATGAGTCCTGACCGA-3 ′ [SEQ ID NO: 15]) and the primer Pri-4 (5′-CTCGTAGACTGCGTACCTAAT-3 ′ [SEQ ID NO: 16]), the following The target DNA was amplified by performing 15 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 52 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute.
DNA 100ng
Pri-3 0.5μM
Pri-4 0.5μM
dNTPs 0.25mM
MgCl2 1.5mM
TaqDNAポリメラーゼ(GIBCO BRL社製)1U
総量 20μl
DNA 100ng
Pri-3 0.5μM
Pri-4 0.5μM
dNTPs 0.25mM
MgCl 2 1.5mM
TaqDNA polymerase (GIBCO BRL) 1U
Total volume 20μl
得られた未精製PCR産物を用いて、ベクターpCR 2.1（Invitrogen）中へクローニングした。得られたクローンについては、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）を使用して自動シークエンサー（Applied Biosystems）によりDNA塩基配列決定を行った。この塩基配列決定は、20個の増幅断片について行った。決定されたそれぞれの配列については、BLASTプログラム（Altschul et al. 1997）を用いてGenBankデータベース中の配列との比較を行った。得られた増幅断片のうちの１つが、159アミノ酸をコードすることが推定されるイネ由来のクラスI細胞質性sHSP17.7（OsHSP17.7; Genbankアクセッション番号 U83671; Guan et al. (1998)）として同定された。 The resulting crude PCR product was used for cloning into the vector pCR 2.1 (Invitrogen). The obtained clone was subjected to DNA base sequencing by an automatic sequencer (Applied Biosystems) using Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). This nucleotide sequence determination was performed on 20 amplified fragments. Each determined sequence was compared with sequences in the GenBank database using the BLAST program (Altschul et al. 1997). Rice-derived class I cytoplasmic sHSP17.7 (OsHSP17.7; Genbank Accession No. U83671; Guan et al. (1998)), one of the resulting amplified fragments is predicted to encode 159 amino acids. Was identified as
実施例２： sHSP17.7の導入によるイネの形質転換
以下のようにして、完全長sHSP17.7 cDNAを、Ti系ベクターであるPMLH7133（Mitsuhara et al., Plant Cell Physiol.37: 49-59(1996)）中のCaMV 35Sプロモーターの下流に、センス鎖方向で導入した（図１）。
Example 2: Transformation of rice by introduction of sHSP17.7 As described below, full-length sHSP17.7 cDNA was transformed into Ti-based vector PMLH7133 (Mitsuhara et al., Plant Cell Physiol. 37: 49-59 ( 1996)) was introduced downstream of the CaMV 35S promoter in the sense strand direction (FIG. 1).
完全sHSP17.7 cDNAを、実施例１に従って調製したcDNAから、プライマー5'-TCTAGACCATGTCGCTGATCCGCCGCG-3'（下線部はXbaI部位;配列番号3）及びプライマー5'-GAGCTCTAGCCGGAGATCTGGATGGAC-3'（下線部はSacI部位;配列番号4）を用いて増幅した。この増幅断片をXbaI及びSacIで処理し、XbaI-SacI断片を調製した。このsHSP17.7 cDNAを含むXbaI-SacI断片と、PMLH7133ベクターをXbaI及びSacIを用いて切断して得た断片とをライゲーションした。得られた構築物を、既報のプロトコール（Hiei et al., Plant J. 6: 271-282 (1994)）に従ってアグロバクテリウム法により、イネ（Oryza sativa L. cv, Hoshinoyume）のカルス中に導入した。形質転換されたカルスをMSRE培地に移植してハイグロマイシン耐性について選択し、さらにそれを再分化培地（N6SE）に移植し、明所で再分化させた。次に、再分化個体を検定培地（MSHF）に置床し、ハイグロマイシン耐性を検定した。同培地上で発根し、正常に生育した個体を馴化させ、ポットに移植することにより、トランスジェニック植物へと再生させた。再生されたトランスジェニック植物は、自家受粉によってT2世代までの交配を行った。使用した培地の組成は以下の通りである。 Complete sHSP17.7 cDNA was prepared from the cDNA prepared according to Example 1, using primer 5'- TCTAGA CCATGTCGCTGATCCGCCGCG-3 '(underlined XbaI site; SEQ ID NO: 3) and primer 5'- GAGCTC TAGCCGGAGATCTGGATGGAC-3' (underlined Amplified using the SacI site; SEQ ID NO: 4). This amplified fragment was treated with XbaI and SacI to prepare an XbaI-SacI fragment. The XbaI-SacI fragment containing this sHSP17.7 cDNA was ligated with the fragment obtained by cleaving the PMLH7133 vector with XbaI and SacI. The resulting construct was introduced into rice (Oryza sativa L. cv, Hoshinoyume) callus by the Agrobacterium method according to a previously reported protocol (Hiei et al., Plant J. 6: 271-282 (1994)). . Transformed callus was transplanted into MSRE medium to select for hygromycin resistance, which was then transplanted into redifferentiation medium (N6SE) and redifferentiated in the light. Next, the redifferentiated individuals were placed on an assay medium (MSHF) and tested for hygromycin resistance. An individual rooted on the same medium and grown normally was acclimated and transplanted into a pot to regenerate a transgenic plant. The regenerated transgenic plants, was bred up to T 2 generation by self-pollination. The composition of the medium used is as follows.
MSRE培地（pH5.8）
MS無機塩
MSビタミン
30g/l ショ糖
30g/l ソルビトール
2mg/l カザミノ酸
1mg/l NAA
2mg/l BAP
250mg/l カルベニシリン
50mg/l ハイグロマイシン
4g/l ゲルライト
MSRE medium (pH 5.8 )
MS inorganic salt
MS vitamins
30g / l sucrose
30g / l sorbitol
2mg / l casamino acid
1mg / l NAA
2mg / l BAP
250mg / l carbenicillin
50mg / l hygromycin
4g / l Gelrite
N6SE培地（pH5.8）
N6無機塩
N6ビタミン
30g/l ショ糖
2mg/l 2,4-D
2g/l ゲルライト
500mg/l カルベニシリン
50mg/l ハイグロマイシン
N6SE medium (pH5.8)
N6 inorganic salt
N6 vitamin
30g / l sucrose
2mg /
2g / l Gelrite
500mg / l carbenicillin
50mg / l hygromycin
MSHF培地（pH5.8）
MS無機塩
MSビタミン
30g/l ショ糖
50mg/l ハイグロマイシン
8g 寒天
MSHF medium (pH 5.8)
MS inorganic salt
MS vitamins
30g / l sucrose
50mg / l hygromycin
8g agar
それらのトランスジェニック植物からシュートを切り取り、常法によりDNAを抽出し、それを鋳型としてCaMV 35Sプロモーターに特異的なプライマー（5'-ATGACGCACAATCCCACTATC-3'; 配列番号5）、及びHSP17.7 cDNAに特異的なプライマー（5'-CTAGCCGGAGATCTGGATGG-3'; 配列番号6）を用いて、T0世代、T1世代及びT2世代植物のPCRスクリーニングを行い、ホモ接合系統を選抜した。 Cut shoots from these transgenic plants, extract DNA by a conventional method, and use it as a template for primers specific to the CaMV 35S promoter (5'-ATGACGCACAATCCCACTATC-3 '; SEQ ID NO: 5), and HSP17.7 cDNA Using specific primers (5′-CTAGCCGGAGATCTGGATGG-3 ′; SEQ ID NO: 6), PCR screening of T 0 generation, T 1 generation and T 2 generation plants was performed, and homozygous lines were selected.
実施例３： sHSP17.7を導入したトランスジェニックイネの発現解析
実施例２においてアグロバクテリウム法での形質転換により得られたHSP17.7ホモ接合性のトランスジェニック系統のイネ品種「ほしのゆめ」（T2世代、30系統）について、以下の通り、CaMV 35Sプロモーターの制御下でsHSP17.7を過剰発現させた際のsHSP17.7発現の解析を行った。
Example 3 Expression Analysis of Transgenic Rice Introduced with sHSP17.7 Rice cultivar “Hoshi no Yume” of HSP17.7 homozygous transgenic line obtained by transformation by Agrobacterium method in Example 2 ( T 2 generation, the 30 strains), as follows, was analyzed sHSP17.7 expression when overexpressed sHSP17.7 under the control of the CaMV 35S promoter.
(1) 組換えsHSP17.7タンパク質の作製とそれに対する抗体の作製
イネ幼苗由来の成熟sHSP17.7をコードするcDNA（OsHSP17.7; Genbankアクセッション番号 U83671, Guan et al., 1998）を、実施例１に従って調製したcDNAを鋳型として、プライマー 5'-GAATTCATGTCGCTGCTGATCCGCCGCGGCAAC-3'（下線部はEcoRI部位; 配列番号7）及び5'-GTCGACGCCGGAGATCTGGATGGACTTGAC-3'（下線部はSalI部位; 配列番号8）を用いたPCRにより増幅した。PCR産物をEcoRI及びSalIで処理し、その切断断片を精製して、発現ベクターpASK-IBA6（SIGMA）中のstrept-tag IIのＮ末端側にイン・フレームとなるようにライゲーションした。得られたベクターを大腸菌株DH5α中に導入した。この大腸菌株を、IPTGを添加した培地で37℃で一晩培養し、発現ベクターから融合タンパク質を発現させた。培養物から、StrepTactin Sepharose Column（SIGMA）を用いて融合タンパク質を精製した。精製した融合タンパク質のサイズは、SDS-PAGEにより、23kDaであることを確認した。このサイズは融合タンパク質の推定サイズと一致した。
(1) Production of recombinant sHSP17.7 protein and production of antibodies against it Production of a cDNA encoding mature sHSP17.7 derived from rice seedlings (OsHSP17.7; Genbank accession number U83671, Guan et al., 1998) Using the cDNA prepared according to Example 1 as a template, primers 5'-GAATTCATGTCGCTGCTGATCCGCCGCGGCAAC-3 '(underlined portion is EcoRI site; SEQ ID NO: 7) and 5'-GTCGACGCCGGAGATCTGGATGGACTTGAC-3' (underlined portion is SalI site; SEQ ID NO: 8) Amplified by PCR. The PCR product was treated with EcoRI and SalI, and the cleaved fragment was purified and ligated to be in-frame with the N-terminal side of strept-tag II in the expression vector pASK-IBA6 (SIGMA). The resulting vector was introduced into E. coli strain DH5α. This E. coli strain was cultured overnight at 37 ° C. in a medium supplemented with IPTG to express the fusion protein from the expression vector. The fusion protein was purified from the culture using a StrepTactin Sepharose Column (SIGMA). The size of the purified fusion protein was confirmed to be 23 kDa by SDS-PAGE. This size was consistent with the estimated size of the fusion protein.
得られた組換えsHSP17.7を含む融合タンパク質を、マウスに腹腔内注射し、腹水中にsHSP17.7タンパク質に対する抗体を生成させた。腹水を採取し、それを後の実験でsHSP17.7に対する抗体として使用した。 The resulting fusion protein containing recombinant sHSP17.7 was injected intraperitoneally into mice to generate antibodies against sHSP17.7 protein in ascites. Ascites was collected and used as an antibody against sHSP17.7 in later experiments.
(2) SDS-PAGE及びウェスタンブロット解析
実施例２で作製したT2世代のホモ接合系統のトランスジェニック植物を、発芽後25℃で10日間生長させた後、シュートを切り取った。このシュート組織を抽出バッファー（50 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA）中で粉砕し、これを1.5 mLのチューブに入れて、予冷した机上微量遠心分離機で10,000gにて10分間にわたる遠心分離を2回行って細胞破片を除去した。上清を別のチューブに移し、これをタンパク質サンプルとした。このサンプルについては、Bio-Radタンパク質アッセイキット（Bio-Rad Laboratories）を用いて、BSAを標準物質としてタンパク質濃度を測定した。
(2) SDS-PAGE and the T 2 generation of transgenic plants homozygous lines produced by Western blot analysis in Example 2, was allowed to grow for 10 days at 25 ° C. after germination were cut shoots. This shoot tissue was pulverized in extraction buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA), placed in a 1.5 mL tube, and pre-cooled on a desktop microcentrifuge at 10,000 g for 10 minutes. Centrifugation was performed twice to remove cell debris. The supernatant was transferred to another tube and used as a protein sample. For this sample, the protein concentration was measured using BSA as a standard substance using a Bio-Rad protein assay kit (Bio-Rad Laboratories).
このタンパク質サンプル30μgを、Bio-Radミニゲルシステムを使用して15％（w/v）ポリアクリルアミドSDS-PAGEゲル上で分離し、次いで分離したタンパク質を、Bio-Rad TranBlotを使用し、100Vで1時間かけて、トランスファーバッファー（3.03g/L Tris塩基、14.4g/L Gly、100 mL/L 100% [v/v]メタノール）中でPVDFメンブレン（Amersham Pharmacia Biotech）に転写した。このメンブレンを0.1%（v/v）Tween 20（TBST）及び5%（w/v）脱脂粉乳を含むTBS中で1時間かけてブロッキングした。TBST中のメンブレンに一次抗体（sHSP17.7抗体の10,000希釈物）を添加し、室温で1時間インキュベートした。TBST中、5分間の洗浄を３回行った後、ロバ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Amersham Pharmacia Biotech）を、TBST中、1:20,000の希釈物としてメンブレンに添加し、インキュベートした。TBST中、5分間の洗浄を3回行った後、ケミルミネッセンス（ECL）しＫステム（Amersham Pharmacia Biotech）を用いてシグナルを検出した。
30 μg of this protein sample was separated on a 15% (w / v) polyacrylamide SDS-PAGE gel using a Bio-Rad minigel system, and the separated protein was then separated using a Bio-Rad TranBlot at 1 Over time, it was transferred to a PVDF membrane (Amersham Pharmacia Biotech) in transfer buffer (3.03 g / L Tris base, 14.4 g / L Gly, 100 mL /
その結果、約50％のトランスジェニック植物においてsHSP17.7タンパク質レベルの顕著な増加が示された。６つのトランスジェニック系統を以後の解析のために選択した。これらのトランスジェニック系統におけるsHSP17.7タンパク質の発現レベルを、図２に示した。トランスジェニック系統47-2及び21-3は、sHSP17.7タンパク質を高レベルで発現した。53-4系統及び13-5系統は、47-2系統及び21-3系統と比較するとより低いレベルでsHSP17.7タンパク質を発現した。40-2系統におけるsHSP17.7タンパク質の発現レベルは53-4系統及び13-5系統よりも低かった。52-3系統ではsHSP17.7タンパク質を全く発現していなかった（図２）。なお、原品種のほしのゆめにおいては、sHSP17.7タンパク質は全く発現されなかった。 The results showed a significant increase in sHSP17.7 protein levels in about 50% of the transgenic plants. Six transgenic lines were selected for further analysis. The expression level of sHSP17.7 protein in these transgenic lines is shown in FIG. Transgenic lines 47-2 and 21-3 expressed sHSP17.7 protein at high levels. Lines 53-4 and 13-5 expressed sHSP17.7 protein at lower levels compared to lines 47-2 and 21-3. The expression level of sHSP17.7 protein in line 40-2 was lower than that in lines 53-4 and 13-5. The 52-3 line did not express sHSP17.7 protein at all (FIG. 2). In the original cultivar Hoshino Yume, no sHSP17.7 protein was expressed.
(3) ノーザンブロット解析
これらの６つのトランスジェニック系統についてノーザンブロット解析を行った。
sHSP17.7 mRNAを検出するためのプローブ（完全長プローブ及び3'非翻訳領域（UTR）プローブ）は、実施例１において調製した24時間の高温処理を行ったイネ幼苗の葉に由来するcDNAから、Taq DNAポリメラーゼ（GIBCO BRL）を用いたPCR増幅によって作製した。完全長プローブについては、プライマー5'-ATGTCGCTGATCCGCCGCGG-3'（配列番号9）及び5'-GCCGGAGATCTGGATGGACT-3'（配列番号10）を用いて増幅した。3'非翻訳領域（UTR）プローブについては、5'-AGAGCCCCGTTTGTTTATTC-3'（配列番号11）及び5'-TTTATTTCCCGTACATAAAC-3'（配列番号12）を用いて増幅した。各増幅断片については配列決定してsHSP17.7遺伝子の配列と一致することを確認した。これらの増幅断片は、ゲル精製した後、それぞれランダムヘキサマープライミング法（Amersham Phaemacia Biotech）を用いて32P-dCTP標識したものを、以下でプローブとして用いた。
(3) Northern blot analysis Northern blot analysis was performed on these six transgenic lines.
Probes for detecting sHSP17.7 mRNA (full-length probe and 3 ′ untranslated region (UTR) probe) were prepared from cDNA derived from leaves of rice seedlings that had been subjected to high-temperature treatment for 24 hours prepared in Example 1. This was prepared by PCR amplification using Taq DNA polymerase (GIBCO BRL). The full-length probe was amplified using
実施例１で調製した全RNAを、1.2％アガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロースゲルフィルターに転写した。このフィルターをRapid-Hybバッファー（Amersham Pharmacia Biotech）中で1時間かけてプレハイブリダイゼーションに供し、次いで上記で作製したプローブのいずれかを添加して65℃で16時間かけてハイブリダイズさせた。このフィルターについて、2×SSC、0.1％ SDS中、15分間、室温での洗浄を２回行い、さらに0.2×SSC、0.1％ SDS中、65℃で30分間の洗浄を１回行った。フィルターのオートラジオグラフは、Imaging Plate Scanner BAS1000（Fuji Film）を使用して可視化した。 The total RNA prepared in Example 1 was electrophoresed on a 1.2% agarose gel and transferred to a nitrocellulose gel filter. This filter was subjected to prehybridization in Rapid-Hyb buffer (Amersham Pharmacia Biotech) for 1 hour, and then any of the probes prepared above was added and hybridized at 65 ° C. for 16 hours. This filter was washed twice in 2 × SSC, 0.1% SDS for 15 minutes at room temperature, and further washed once in 0.2 × SSC, 0.1% SDS at 65 ° C. for 30 minutes. The autoradiograph of the filter was visualized using Imaging Plate Scanner BAS1000 (Fuji Film).
以上のノーザンブロット解析の結果、sHSP17.7タンパク質のレベルに差が見られた上記6つのトランスジェニック植物においては、sHSP17.7 mRNAの発現レベルがsHSP17.7タンパク質のレベルに正比例していることが示された（図２）。 As a result of the above Northern blot analysis, in the above six transgenic plants in which a difference was found in the level of sHSP17.7 protein, the expression level of sHSP17.7 mRNA was directly proportional to the level of sHSP17.7 protein. Was shown (FIG. 2).
実施例４： トランスジェニックイネの高温耐性
標準的な高温耐性アッセイを用いて、６つのトランスジェニック系統（53-4、13-5、47-2、21-3、40-2及び52-3）及び野生型の原品種「ほしのゆめ」の高温耐性を評価した。
Example 4: High Temperature Resistance of Transgenic Rice Six transgenic lines (53-4, 13-5, 47-2, 21-3, 40-2 and 52-3) using a standard high temperature resistance assay And the high temperature tolerance of the wild type original cultivar "Hoshi no Yume" was evaluated.
播種後10日目の６つの系統及び原品種「ほしのゆめ」のイネ幼苗（各20個体ずつ2反復を実験に用いた）を、それぞれ50℃で2.5時間処理し、7日後の生存率を調べた（図３）。 Six lines on the 10th day after sowing and rice seedlings of the original cultivar “Hoshi no Yume” (20 individuals were used in each experiment for 2 repetitions) were treated at 50 ° C. for 2.5 hours, and the survival rate after 7 days was examined. (FIG. 3).
高温処理後、原品種「ほしのゆめ」は７日以内に死滅した。またsHSP17.7タンパク質の発現がほとんど認められない52-3系統は、原品種「ほしのゆめ」と同様に全ての個体が7日以内に枯死した。一方、52-3系統を除く他の５つの系統（53-4、13-5、47-2、21-3及び40-2）では、それぞれ45.0％、40.0％、100％、95.0％、10.0％の生存率を示した通り、有意に高温耐性が高かった。特に、sHSP17.7の発現量の多い47-2系統と21-3系統では、90％以上が生存しており、高温耐性が顕著に高かった。 After the high temperature treatment, the original cultivar “Hoshino Yume” died within 7 days. In addition, as for the 52-3 line in which the expression of sHSP17.7 protein was hardly observed, all individuals died within 7 days, similar to the original cultivar "Hoshino Yume". On the other hand, in the other five systems (53-4, 13-5, 47-2, 21-3 and 40-2) excluding the 52-3 system, 45.0%, 40.0%, 100%, 95.0% and 10.0 respectively. % High-temperature tolerance was significantly higher. In particular, in the 47-2 and 21-3 lines, where the expression level of sHSP17.7 is high, more than 90% survived and the high-temperature tolerance was remarkably high.
実施例５： トランスジェニックイネの紫外線ストレス耐性
播種後10日目の６つの系統（53-4、13-5、47-2、21-3、40-2及び52-3）及び原品種「ほしのゆめ」のイネ幼苗（各20個体ずつ2反復を実験に用いた）にUV-B（302nm、3000mJcm-1）を照射し、７日後の電解質漏出率（EC％）を測定することによりUV-B耐性を調べた（図４）。
Example 5: Six lines (53-4, 13-5, 47-2, 21-3, 40-2 and 52-3) of the
52-3系統及び原品種「ほしのゆめ」は、それぞれ40.5％、40.0％のEC％を示した。このように、sHSP17.7を構成的に発現していない52-3系統は、UVストレスに対する耐性を示さなかった。一方、52-3系統を除く５つの系統で示されたEC％の値は、53-4系統が10.4％、13-5系統が10.1％、47-2系統が19.0％、21-3系統が10.4％、40-2系統が25.0％であり、原品種と比較して紫外線に対する耐性が有意に高かった。 The 52-3 line and the original variety “Hoshi no Yume” showed EC% of 40.5% and 40.0%, respectively. Thus, the 52-3 line not constitutively expressing sHSP17.7 did not show resistance to UV stress. On the other hand, the EC% values shown in the five systems except 52-3 are 10.4% for 53-4, 10.1% for 13-5, 19.0% for 47-2, and 21-3 10.4% and 40-2 lines were 25.0%, and the tolerance to ultraviolet rays was significantly higher than the original variety.
実施例６： トランスジェニックイネの乾燥耐性
播種後10日目の６つの系統（53-4、13-5、47-2、21-3、40-2及び52-3）及び原品種「ほしのゆめ」のイネ幼苗（各20個体ずつ2反復を実験に用いた）を６日間乾燥処理した後、復水し、７日目の生存率を調べた（図５）。
Example 6: Six lines (53-4, 13-5, 47-2, 21-3, 40-2 and 52-3) and the original cultivar "Hoshi no Yume" on the 10th day after drought tolerance seeding of transgenic rice The rice seedlings (20 individuals, 2 replicates were used for the experiment) were dried for 6 days, then condensated, and the survival rate on the 7th day was examined (FIG. 5).
52-3系統及び原品種「ほしのゆめ」の生存率は、それぞれ60.0％、61.4％であった。一方、52-3系統を除く５つのトランスジェニック系統の生存率は、53-4系統が100％、13-5系統が100％、47-2系統が94.7％、21-3系統が100％、40-2系統が100％であり、原品種と比較して乾燥耐性が有意に高かった。 The survival rates of the 52-3 line and the original variety “Hoshi no Yume” were 60.0% and 61.4%, respectively. On the other hand, the survival rate of 5 transgenic lines excluding 52-3 lines is 100% for 53-4 lines, 100% for 13-5 lines, 94.7% for 47-2 lines, 100% for 21-3 lines, The 40-2 line was 100%, and drought tolerance was significantly higher than that of the original variety.
実施例７： トランスジェニックイネの塩ストレス耐性
播種後10日目の６つの系統（53-4、13-5、47-2、21-3、40-2及び52-3）及び原品種「ほしのゆめ」のイネ幼苗（各20個体ずつ2反復を実験に用いた）を0.45MのNaCl溶液中に３日間浸漬した後、真水に戻して、７日後の生存率を調べた（図６）。
Example 7: Six lines (53-4, 13-5, 47-2, 21-3, 40-2 and 52-3) on
52-3系統及び原品種「ほしのゆめ」の生存率は、それぞれ31.8％、25.8％であった。一方、52-3系統を除く５つのトランスジェニック系統の生存率は、53-4系統が100％、13-5系統が97.8％、47-2系統が50.0％、21-3系統が86.4％、40-2系統が77.3％であった。53-4系統、13-5系統、21-3系統、及び40-2系統では原品種と比較して乾燥耐性が有意に高く、47-2系統でも原品種と比較して乾燥耐性が高い傾向が認められた。 The survival rates of the 52-3 line and the original variety “Hoshi no Yume” were 31.8% and 25.8%, respectively. On the other hand, the survival rate of 5 transgenic lines excluding 52-3 lines is 100% for 53-4 lines, 97.8% for 13-5 lines, 50.0% for 47-2 lines, 86.4% for 21-3 lines, 40-2 lines were 77.3%. 53-4, 13-5, 21-3, and 40-2 lines have significantly higher drought tolerance compared to the original variety, and 47-2 lines also have higher drought tolerance than the original variety Was recognized.
実施例８： トランスジェニック植物の耐冷性
播種後10日目の６つの系統（53-4、13-5、47-2、21-3、40-2及び52-3）及び原品種「ほしのゆめ」のイネ幼苗（各20個体ずつ2反復を実験に用いた）を５℃で13日間処理し、その後25℃に戻して７日後の生存率を調べた（図７）。
Example 8: Six lines (53-4, 13-5, 47-2, 21-3, 40-2 and 52-3) and the original variety “Hoshi no Yume” on the 10th day after cold-tolerant sowing of transgenic plants The rice seedlings (20 individuals, 2 repetitions each were used in the experiment) were treated at 5 ° C. for 13 days, and then returned to 25 ° C. to examine the survival rate after 7 days (FIG. 7).
それぞれの生存率は、53-4系統が15.0％、13-5系統が25.0％、47-2系統が30.0％、21-3系統が20.0％、40-2系統が50.0％、52-3系統が5.0％であった。原品種「ほしのゆめ」の生存率は17.5％であった。40-2系統では耐冷性が有意に高かった。また13-5系統、47-2系統でも原品種と比較して耐冷性が高い傾向が認められた。 Each survival rate is 15.0% for 53-4 lines, 25.0% for 13-5 lines, 30.0% for 47-2 lines, 20.0% for 21-3 lines, 50.0% for 40-2 lines, 52-3 lines Was 5.0%. The survival rate of the original cultivar "Hoshi no Yume" was 17.5%. The 40-2 line had significantly higher cold resistance. The lines 13-5 and 47-2 also showed a tendency to be more resistant to cold than the original variety.
実施例９： トランスジェニック植物の耐凍性
播種後10日目の６つの系統（53-4、13-5、47-2、21-3、40-2及び52-3）及び原品種「ほしのゆめ」のイネ幼苗（各20個体ずつ2反復を実験に用いた）を−６℃で１時間処理し、その後25℃に戻して7日後の生存率を調べた（図８）。
Example 9: Six lines (53-4, 13-5, 47-2, 21-3, 40-2 and 52-3) on the 10th day after sowing of the transgenic plants and the original variety “Hoshi no Yume” The rice seedlings (20 individuals, 2 replicates were used in the experiment) were treated at −6 ° C. for 1 hour, and then returned to 25 ° C. to examine the survival rate after 7 days (FIG. 8).
それぞれの生存率は、53-4系統が6.8％、13-5系統が36.4％、47-2系統が7.7％、21-3系統が15.3％、40-2系統が0％、52-3系統が2.3％であった。原品種「ほしのゆめ」の生存率は2.4％であった。13-5系統では耐凍性が有意に高かった。また53-4系統、47-2系統及び21-3系統でも原品種と比較して耐凍性が高い傾向が認められた。 Each survival rate is 6.8% for 53-4 lines, 36.4% for 13-5 lines, 7.7% for 47-2 lines, 15.3% for 21-3 lines, 0% for 40-2 lines, 52-3 lines Was 2.3%. The survival rate of the original cultivar “Hoshi no Yume” was 2.4%. The freezing resistance was significantly higher in lines 13-5. The 53-4, 47-2 and 21-3 lines also showed a tendency to have higher freezing resistance than the original variety.
実施例１０： 組換えsHSP17.7タンパク質の高温耐性付与活性
(1) 組換えsHSP17.7タンパク質の作製
イネ幼苗由来の、成熟sHSP17.7タンパク質をコードするcDNA（OsHSP17.7; Genbankアクセッション番号 U83671, Guan et al., 1998）を、実施例１に従って調製したcDNAを鋳型として、プライマー 5'-CATATGTCGCTGATCCGCCGC-3'（下線部はNdeI部位; 配列番号13）及び5'-CTCGAGGCCGGAGATCTGGAT-3'（下線部はXhoI部位; 配列番号8）を用いたPCRにより増幅した。このPCR産物を、pCR 2.1ベクター（Invitrogen）中にライゲーションした。次いで得られたプラスミドをNdeI及びXhoIで処理し、その切断断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、精製断片を発現ベクターpET-42b(+)（Novagen）中のNdeI-XhoI部位に挿入した。得られたベクターを大腸菌株BL21(DE3)pLysS中に導入し、プラスミドクローンpET-HSPを得た。pET-42b(+)ベクターのインサート領域の配列は塩基配列決定により確認した。このpET-HSPを有する大腸菌株を、カナマイシンを添加したLB培地に接種し、37℃で一晩培養した。続いてこの培養物を１Lの新鮮なLB/カナマイシン培地で1/10に希釈し、さらに２時間培養してから、IPTGを終濃度１mMにて添加した。IPTGを添加した後、さらに４時間の培養を行って発現ベクターからHSP17.7タンパク質を発現させてから、その培養物を10,000gで15分間遠心分離した。得られた細胞ペレットを10 mlのPBSバッファー中に再懸濁し、次いで超音波破砕した。この試料を遠心分離して採取した上清を、HisTrapカラム（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて精製した。得られたsHSP17.7タンパク質の純度は、SDS-PAGE及びウェスタンブロット解析によって確認した。
Example 10: High temperature tolerance imparting activity of recombinant sHSP17.7 protein
(1) Production of recombinant sHSP17.7 protein A cDNA encoding a mature sHSP17.7 protein (OsHSP17.7; Genbank accession number U83671, Guan et al., 1998) derived from rice seedlings was prepared according to Example 1. PCR using primers 5'- CATATG TCGCTGATCCGCCGC-3 '(underlined NdeI site; SEQ ID NO: 13) and 5'- CTCGAG GCCGGAGATCTGGAT-3' (underlined XhoI site; SEQ ID NO: 8) Amplified by This PCR product was ligated into the pCR 2.1 vector (Invitrogen). The resulting plasmid was then treated with NdeI and XhoI, the digested fragment was purified by agarose gel electrophoresis, and the purified fragment was inserted into the NdeI-XhoI site in the expression vector pET-42b (+) (Novagen). The obtained vector was introduced into Escherichia coli strain BL21 (DE3) pLysS to obtain a plasmid clone pET-HSP. The sequence of the insert region of pET-42b (+) vector was confirmed by sequencing. The Escherichia coli strain having pET-HSP was inoculated into LB medium supplemented with kanamycin and cultured at 37 ° C. overnight. Subsequently, this culture was diluted 1/10 with 1 L of fresh LB / kanamycin medium, further cultured for 2 hours, and then IPTG was added at a final concentration of 1 mM. After adding IPTG, the culture was further performed for 4 hours to express the HSP17.7 protein from the expression vector, and then the culture was centrifuged at 10,000 g for 15 minutes. The resulting cell pellet was resuspended in 10 ml PBS buffer and then sonicated. The supernatant obtained by centrifuging this sample was purified using a HisTrap column (Amersham Pharmacia Biotech). The purity of the obtained sHSP17.7 protein was confirmed by SDS-PAGE and Western blot analysis.
(2) 組換えsHSP17.7タンパク質との共存によるカタラーゼの熱変性の抑制
上記のようにして得られた組換え精製sHSP17.7タンパク質を、カタラーゼ（ウシ肝臓由来；ナカライテスク社）を添加した50 mM Na2HPO4/NaH2PO4バッファー（pH 8.0）に加えた。このサンプルを55℃に加熱し、その後、360nmでの吸光度を経時的に測定することにより、カタラーゼの凝集量を求めた。吸光度測定にはUV-2100S Shimadzu spectrophotometerを使用した。
(2) Inhibition of thermal denaturation of catalase by coexistence with recombinant sHSP17.7 protein Recombinant purified sHSP17.7 protein obtained as described above was supplemented with catalase (derived from bovine liver; Nacalai Tesque) 50 mM Na 2 were added to the HPO 4 / NaH 2 PO 4 buffer (pH 8.0). The sample was heated to 55 ° C., and then the absorbance at 360 nm was measured over time to determine the amount of catalase aggregation. UV-2100S Shimadzu spectrophotometer was used for absorbance measurement.
この結果を図９に示す。図中、Aはカタラーゼ110μg/mlに対してsHSP17.7タンパク質無添加で55℃20分間処理、Bは150μg/ml添加で55℃20分間処理、Cは300μg/ml添加で55℃20分間処理、Dは無添加で25℃で20分間処理したものである。 The result is shown in FIG. In the figure, A is treated with catalase 110 μg / ml without addition of sHSP17.7 protein at 55 ° C. for 20 minutes, B is treated with 150 μg / ml at 55 ° C. for 20 minutes, and C is treated with 300 μg / ml at 55 ° C. for 20 minutes. , D is treated without addition and treated at 25 ° C. for 20 minutes.
sHSP17.7タンパク質を加えなかったカタラーゼでは、55℃での加熱を開始してから3分後には凝集が始まったが、sHSP17.7タンパク質を150μg/mlあるいは300μg/ml加えたカタラーゼでは凝集が認められなかった（図9のA）。55℃での加熱20分後では、sHSP17.7タンパク質150μg/mlをカタラーゼに加えたサンプルでは、カタラーゼの凝集は半分以下に抑制され、300μg/mlを加えたサンプルでは、凝集がほとんど起こらなかった（図9のB,C）。なお、sHSP17.7タンパク質の代わりにBSAを添加した場合には、カタラーゼの凝集は抑制されなかった。 In catalase without sHSP17.7 protein added, aggregation started 3 minutes after starting heating at 55 ° C, but aggregation was observed in catalase added with 150 μg / ml or 300 μg / ml sHSP17.7 protein. (A in FIG. 9). After heating at 55 ° C for 20 minutes, catalase aggregation was suppressed to less than half in the sample added with 150 μg / ml sHSP17.7 protein and almost no aggregation occurred in the sample added with 300 μg / ml. (B, C in FIG. 9). When BSA was added instead of sHSP17.7 protein, catalase aggregation was not suppressed.
このように、sHSP17.7タンパク質は基質タンパク質の熱変性を有効に抑制することから、高温耐性付与活性を有することが示された。 Thus, the sHSP17.7 protein effectively inhibits thermal denaturation of the substrate protein, and thus was shown to have high temperature resistance imparting activity.
本発明の形質転換イネ科植物は、乾燥条件、高塩濃度条件、低温条件及び凍結温度条件などを含む複合的な環境ストレスが存在する条件下にある不適地での栽培用に用いることができる。また本発明のイネ科植物における複合ストレス耐性の強化法は、既存のイネ科植物について複合的な環境ストレス条件下での栽培を可能にする目的で、その既存のイネ科植物に複合ストレス耐性を付与するために用いることができる。 The transformed gramineous plant of the present invention can be used for cultivation on unsuitable grounds under conditions where there are complex environmental stresses including dry conditions, high salt concentration conditions, low temperature conditions, freezing temperature conditions, and the like. . In addition, the method for enhancing the combined stress tolerance in the gramineous plant of the present invention is to provide the existing gramineous plant with complex stress tolerance for the purpose of enabling the cultivation of the existing gramineous plant under complex environmental stress conditions. Can be used to grant.
配列番号3〜16の配列は、プライマーである。 The sequences of SEQ ID NOs: 3 to 16 are primers.
Claims (6)
(a) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNAからなる遺伝子；
(b) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高温耐性付与活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子；
(c) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；及び
(d) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高温耐性付与活性を有するタンパク質をコードする遺伝子 A transgenic gramineous plant having combined environmental stress tolerance, into which at least one gene of the following (a) to (d) is introduced.
(a) a gene consisting of DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(b) a gene comprising a DNA that hybridizes with a DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a protein having a high-temperature resistance imparting activity;
(c) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; and
(d) a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having a high temperature resistance imparting activity
(a) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNAからなる遺伝子；
(b) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高温耐性付与活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子；
(c) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；及び
(d) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高温耐性付与活性を有するタンパク質をコードする遺伝子 A method for imparting combined environmental stress tolerance to a grass family, comprising overexpressing at least one gene of the following (a) to (d) in the grass family plant:
(a) a gene consisting of DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(b) a gene comprising a DNA that hybridizes with a DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a protein having a high-temperature resistance imparting activity;
(c) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; and
(d) a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having a high temperature resistance-imparting activity
At least 1 selected from the group consisting of a drying condition, a high salt concentration condition, a low temperature condition, and a freezing temperature condition, characterized in that the transgenic gramineous plant according to any one of claims 1 to 3 is used. For cultivating gramineous plants under conditions that include two.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004222758A JP2006034252A (en) | 2004-07-30 | 2004-07-30 | Combined environmental stress tolerance rice |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004222758A JP2006034252A (en) | 2004-07-30 | 2004-07-30 | Combined environmental stress tolerance rice |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006034252A true JP2006034252A (en) | 2006-02-09 |
Family
ID=35899904
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004222758A Pending JP2006034252A (en) | 2004-07-30 | 2004-07-30 | Combined environmental stress tolerance rice |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2006034252A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109874708A (en) * | 2019-04-09 | 2019-06-14 | 北京市水生野生动植物救护中心 | A kind of method for culturing seedlings of land envelope type cherry salmon triploid seed |
| JP2022061995A (en) * | 2016-06-14 | 2022-04-19 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | Abiotic stress tolerance |
| CN116046977A (en) * | 2022-11-30 | 2023-05-02 | 湖南杂交水稻研究中心 | Method and detection kit for detecting high temperature tolerance of rice |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10510998A (en) * | 1995-02-02 | 1998-10-27 | カー・ベー・エス・クラインバンツエレベナー・ザートツフト・アー・ゲー・フオール・マーリツヒ・ラベテーゲ・ウント・ギーゼツケ | Stress-tolerant plant and method for producing the plant |
| JP2001078603A (en) * | 1999-09-07 | 2001-03-27 | Kureha Chem Ind Co Ltd | Transgenic plant containing dnak gene or hsp70 gene |
| US20040123343A1 (en) * | 2000-04-19 | 2004-06-24 | La Rosa Thomas J. | Rice nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement |
-
2004
- 2004-07-30 JP JP2004222758A patent/JP2006034252A/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10510998A (en) * | 1995-02-02 | 1998-10-27 | カー・ベー・エス・クラインバンツエレベナー・ザートツフト・アー・ゲー・フオール・マーリツヒ・ラベテーゲ・ウント・ギーゼツケ | Stress-tolerant plant and method for producing the plant |
| JP2001078603A (en) * | 1999-09-07 | 2001-03-27 | Kureha Chem Ind Co Ltd | Transgenic plant containing dnak gene or hsp70 gene |
| US20040123343A1 (en) * | 2000-04-19 | 2004-06-24 | La Rosa Thomas J. | Rice nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022061995A (en) * | 2016-06-14 | 2022-04-19 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | Abiotic stress tolerance |
| CN109874708A (en) * | 2019-04-09 | 2019-06-14 | 北京市水生野生动植物救护中心 | A kind of method for culturing seedlings of land envelope type cherry salmon triploid seed |
| CN116046977A (en) * | 2022-11-30 | 2023-05-02 | 湖南杂交水稻研究中心 | Method and detection kit for detecting high temperature tolerance of rice |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12173300B2 (en) | Plants having increased tolerance to heat stress | |
| EP1807519B1 (en) | Stress tolerant cotton plants | |
| US20130019334A1 (en) | Corn event mzdt09y | |
| US20040058427A1 (en) | Herbicide resistant plants | |
| EP2123753B1 (en) | Plant having increased yield of seeds | |
| EP2687085B1 (en) | Acetyl-coa carboxylase herbicide resistant sorghum | |
| CN100537768C (en) | Preparation of plants with improved growth under nitrogen limitation | |
| JP4998809B2 (en) | Polypeptides for improving plant iron deficiency tolerance and use thereof | |
| CN110684088A (en) | Application of protein ZmbZIPa3 and its encoding gene in regulating plant growth, development and stress tolerance | |
| CN101278049B (en) | Protoporphyrinogen oxidase having activity of conferring resistance to acifluorfen and gene thereof | |
| CN119120524A (en) | OsPIGL gene and method for regulating rice grain length, 1000-grain weight and drought tolerance | |
| JP2006034252A (en) | Combined environmental stress tolerance rice | |
| HUP0303658A2 (en) | Increased expression of phosphoenol-pyruvate carboxylase | |
| WO2004092372A1 (en) | Gene capable of imparting salt stress resistance | |
| EP4408860A1 (en) | Wheat plants with an increased yield | |
| JP5648822B2 (en) | Modification of rice anthranilate synthase using homologous recombination | |
| RU2235778C2 (en) | Isolated polynucleotide able to confer to plant resistance or tolerance to glyfosate herbicide, vector, method for preparing plants with tolerance or resistance to glyfosate herbicide, method for regeneration of transformed plant and method for selective control of weeds | |
| CN116157526A (en) | Increased productivity of C3 plants | |
| CN112592392A (en) | Application of pleiotropic gene SbSnf4 in improvement of cane sugar yield, plant height, fresh weight of stems and/or juice amount | |
| JP2005229823A (en) | Plant whose dormant period is shortened, and method for creating the same | |
| CN100469884C (en) | Method for improving GGT activity of plant and method for preparing plant with improved GGT activity | |
| US20090055972A1 (en) | Glutathione-s-transferase gene from proposis juliflora confers abiotic stress tolerance in plants | |
| KR101436211B1 (en) | COLD STRESS RESISTANT PLANT WITH AtPrx GENE AND METHOD FOR PREPARING COLD STRESS RESISTANT PLANT | |
| JP2003199582A (en) | Plant-derived promoter | |
| US20130217019A1 (en) | Corn event mzdt09y |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20060825 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20060825 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070222 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20070223 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100105 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100427 |