JP2006017745A - 免疫学的粒子凝集反応方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
本発明の課題は、ラテックスのような不溶性担体粒子による免疫学的粒子凝集反応におけるプロゾーン現象を抑制することである。また、試料の希釈機構を持たない分析装置であっても、高濃度域の測定を可能にする新しい技術の提供である。
【解決手段】
本発明は、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を組み合わせて用いる免疫学的粒子凝集反応、ならびに試薬であり、プロゾーン現象を効果的に抑制する。血清アミロイドＡのようなダイナミックレンジの広い抗原性成分でも、広い濃度範囲にわたって正しい測定値を得ることができる。高濃度域での定量レンジが広がるので、試料の希釈操作無しでも測定が可能である。
【選択図】
なし

Description

本発明は、抗原抗体反応に基づく免疫学的粒子凝集反応に関するものである。抗原抗体反応を利用した物質の測定方法には、様々な技術が知られている。本発明は、これらの免疫学的な測定方法の中で、免疫成分を不溶性担体粒子に固定して用い、抗原抗体反応によって生じる不溶性担体粒子の凝集を観察する免疫学的粒子凝集反応に関するものである。

免疫学的粒子凝集反応は、Ｂ／Ｆ分離が必要なＥＬＩＳＡやＲＩＡに比べて反応ステップが少ないため機械化に適している。このような特徴から早くから機械化が進み、種々の自動分析装置が商品化されている。また最近では専用の自動分析装置のみならず、酵素反応などに基づく他の測定項目とともに汎用の自動分析装置を利用して測定されるようになってきた。こうして免疫学的粒子凝集反応が広く普及するのに伴って、幅広い成分が測定対象として採用されるようになっている。測定対象成分には、たとえばイムノグロブリン、補体、ホルモン、ウイルス抗原、腫瘍マーカー、炎症マーカー、あるいは薬剤等が知られている。これらの測定対象成分が狭い濃度範囲にあれば、免疫学的粒子凝集反応によって正しい測定値を得ることができる。ところが実際には、もともと高い濃度で含まれている成分や、あるいは低濃度から非常に高い濃度まで広い濃度範囲にわたって濃度が変動するような成分については場合によって不正確な測定値を与えることがある。

血清中にもともと高い濃度で存在している成分としては、イムノグロブリンを挙げられる。特にＩｇＧはヒト血清中に７−１５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する主要な血漿蛋白質である。このような高い濃度は通常の測定操作では正確に測定することができない。測定対象成分が多量に存在する時には、抗原過剰となりプロゾーン現象と呼ばれる見かけの測定値が低くなる現象が現れるためである。したがって、あらかじめ試料を希釈して抗原濃度を下げる、あるいは遊離の抗体を同時に反応させて粒子上の抗体と競合させることによって抗原過剰の状態を緩和する（特許文献１）といった操作が必要であった。免疫学的粒子凝集反応におけるこのような問題点を解消するために、試料のサンプリング量を少なくする方法も考えられるが機械的な分注精度を維持できる範囲には限度がある。あるいは試料を希釈するにしても分注精度の影響は考慮しなければならないし、先に述べた汎用の分析装置においては予め試料を希釈する機構を持たないものも多い。また、たとえ希釈機構を備えていたとしても、多くの場合希釈操作は作業効率の低下につながるので歓迎されない。

このような背景から、モノクローナル抗体を利用することによって希釈操作を省略しうる方法が報告された。第一の方法ではモノクローナル抗体のみで免疫比濁法を実施している。またモノクローナル抗体のみでは非特異反応の原因となりやすい増感剤を多量に添加しなければならないため、ポリクローナル抗体をモノクローナル抗体と組み合わせることで試料を希釈することなく高い精度を達成した報告もある（特許文献２）。しかしこれらの報告はあくまでも粒子担体を利用しない免疫比濁法に基づくものであり、免疫学的粒子凝集反応に関してはこの種の改善策は知られていないのが現状である。一方これらの先行技術はいずれも免疫比濁法を採用しているので、抗体分子と抗原分子のみで光学的に検出可能な大きさの沈降物を生成しなければならない。したがって用いる抗体はいずれもＦｃと呼ばれる定常領域を備えた完全な分子形態を保っていた。Ｆｃを備えた抗体は、免疫学的粒子凝集反応に用いた場合にリウマチ因子や補体の干渉を受けて非特異的な凝集の原因となることが知られている。

この他にモノクローナル抗体１種のみで粒子凝集阻止反応系を構成した報告が有るが、この報告は高濃度域の精度の改善を目的としたものではなくモノクローナル抗体の特異性を凝集反応系に活用するために１種の抗体による反応系を提案している。同じく感度や特異性を達成するためにモノクローナル抗体を逆受け身赤血球凝集反応用試薬に応用した報告や、凝集反応用の溶媒にモノクローナル抗体を加える技術も知られている。更に免疫学的粒子凝集反応に着目すれば、モノクローナル抗体のみで反応系を構成する試みも報告されているが（特許文献３）、高濃度域における定量性の改善をもたらすものではない。

血清中の成分には、イムノグロブリンのように高濃度で存在するもののみならず、低濃度から高濃度にいたる幅広い濃度範囲で存在する成分も知られている。炎症マーカーであるＣ反応性蛋白質（以下ＣＲＰと省略する）や血清アミロイドＡ（以下ＳＡＡと省略する）、あるいはアレルギー症状などの指標となるＩｇＥは、このようなダイナミックレンジの広い成分の代表的なものである。ＳＡＡは、ある種のアミロイドーシスにおいて組織に沈着するアミロイド蛋白Ａ（以下、ＡＡ蛋白と省略する）の前駆体蛋白とされる、分子量約１２０００の血清蛋白である。近年になって、このＳＡＡの血清値が炎症性疾患で上昇することが明らかにされ、鋭敏な炎症マーカーとして評価されている（非特許文献１）。ＳＡＡは血清中で通常は０．５−５０μg/ml程度の濃度範囲にある。しかし、急性期には１００−１００００μｇ／ｍＬにも達することのあるたいへんダイナミックレンジの広い成分である。この種の成分では、先に述べたような希釈操作を省略する方法では、特に高い濃度域で正確な測定結果を得られない可能性が有る。

たとえば、サンプリング量を減らしたり、あるいは遊離の抗体を共存させる方法では、結果的に感度を下げていることになり、低濃度域での精度を下げることになりかねない。この他にもＳＡＡの免疫学的な測定に関する報告は多いが、免疫学的粒子凝集反応法において広い濃度範囲にわたり高い測定精度を実現した報告はない。

具体的には、たとえばネフェロメトリックアッセイを利用した報告では、１−１３μｇ／ｍＬの間で直線性を確認している。ＥＬＩＳＡで１．５−３０μｇ／ｍＬ、あるいは５５−７５０ｎｇ／２００μＬを測定した報告が有る。また免疫学的ラテックス凝集法による測定例（非特許文献２）では、検出限界が０．５μｇ／ｍＬであるのに対して反応曲線は３０μｇ／ｍＬ付近で傾きを失っている。すなわちこの文献では６０倍程度の濃度差しか測定できていないことになる。この値は必ずしも不十分なものではない。しかし先に述べたようにＳＡＡの血中濃度は大きく変動するので、たくさんの検体を測定する場合には測定範囲の上限を越えることも少なからず観察される。ＳＡＡでは、ドットブロットと酵素標識抗体を組み合わせた特殊な反応系で１．２５−１６０μｇ／ｍＬという測定レンジを実現した報告も有る。しかしこの報告においては加熱処理によって抗原性を強める処理が必要であり、本発明のように試料を前処理無しで測定する方法とは区別される。また固相イムノラジオメトリックアッセイによって、試料の変性処理を行うことなく１０００倍に及ぶ測定範囲を実現した報告もある。ただしこの結果はＲＩ標識抗体を使い固相の洗浄工程を実施して得たものである。更に標準に利用されたＳＡＡの濃度が不明なので、測定範囲の評価を行うことができない。

一方本発明では、好ましい態様においてモノクローナル抗体の反応性を増強し、またリウマチ因子等の干渉を防ぐ目的で各種の変性処理を施す。ＩｇＧの抗体活性が、酸、加温、あるいは尿素のようなカオトロピック剤の処理によって高まる現象はＥＬＩＳＡで確認されている。しかしこれらの報告はＥＬＩＳＡ用の固相抗体に関するものであり、免疫学的粒子凝集反応において測定レンジの拡大が期待できることを示唆するものではない。
特開昭５９−４６８５６号公報 特開昭６３−２０６６５７号公報 特開昭５７−１１８１５９号公報 臨床検査、３２（２）、１６８、１９８８ Ａｎｎ． Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３０，７２−７６，１９９３

本発明の課題は、ＳＡＡのようなダイナミックレンジの広い成分を免疫学的粒子凝集反応によって測定するための新しい技術を提供することに有る。より具体的には、測定対象成分のダイナミックレンジに応じた広い濃度範囲で高い精度を実現できる免疫学的粒子凝集反応を提案するものである。

本発明の課題は、不溶性担体粒子に固定した抗体を抗原と反応させ、抗原−抗体によって生じる不溶性担体粒子の凝集を観察することによって抗原を検出、または測定する方法であって、抗体として分析対象抗原に対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を用いる免疫学的粒子凝集反応方法によって達成される。

本発明のポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体には、分析対象抗原を認識する公知の抗体を利用することができる。これらの抗体は、それぞれを不溶性担体粒子に固定してから混合するか、あるいは抗体を混合したものを不溶性粒子に固定することによって利用される。測定性能を経験的に設定するには、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とを個別に固定した不溶性担体粒子を抗体固定後に混合する方が容易である。

不溶性粒子には、ポリスチレン等の合成重合体粒子（ラテックス粒子）、ゼラチン粒子、金属コロイド、顔料、動物の血球、細菌菌体、あるいはリポソーム等を利用することができる。これらの不溶性担体粒子へ抗体を固定する方法も公知である。基本的な方法では、ポリスチレン製のラテックス粒子に抗体溶液を接触させることによって抗体が物理吸着される。またＳＨ基、カルボキシル基、あるいはアミノ基のような官能基を導入したラテックス粒子には、化学的な結合によって抗体を固定することができる。いずれの方法を採用するにしろ、抗体を固定した粒子は十分に洗浄され、更に必要に応じてウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと省略する）、正常動物血清、乳タンパク成分等の不活性成分でブロックし、必要な濃度になるように適当な分散媒で希釈して抗体固定粒子懸濁乳液（以下、単に乳液とする）とし測定に利用する。

乳液を用いて測定対象抗原を測定するには、抗原を含む試料溶液と混合して粒子担体の凝集を観察すれば良い。凝集反応は、肉眼的に凝集塊の形成を確認する、あるいは凝集反応を光学的に追跡することによって観察する。たとえば不溶性担体としてポリスチレンラテックス粒子を利用した場合、免疫学的な粒子の凝集は、６００ｎｍ前後の近赤外部における吸収、あるいは散乱光強度の変化としてとらえることができる。光学測定は、たとえばＬＸ−３０００（栄研化学・アナリティカルインスツルメント製、商品名）等の免疫学的ラテックス凝集反応分析専用の免疫学的自動分析装置や、あるいは汎用の自動分析装置を利用して自動的に行わせることができる。本発明の測定方法は高濃度域での定量性に優れるので、試料の希釈機構を持たない汎用の自動分析装置でも容易に実施することができる。

本発明で測定対象とする抗原性の物質には、公知の免疫学的測定方法によって測定されていた多くの成分を挙げることができる。これらの公知の抗原性成分の中でも、ダイナミックレンジの広い、つまり抗原濃度の変動幅の大きい成分では特に本発明の効果が大きくなる。具体的には、先に紹介したＳＡＡ、あるいはＣＲＰやＩｇＥがダイナミックレンジの広い代表的な成分と言える。以下にＳＡＡを測定対象とする場合を例に本発明を具体的に説明する。

ＳＡＡを認識するポリクローナル抗体には公知の抗体を利用できる。これまでに報告されたＳＡＡに対するポリクローナル抗体は、ウサギ等を精製ＳＡＡで免疫して得たものである。免疫原とする精製ＳＡＡを得る方法は公知である。たとえば、ＳＡＡを豊富に含むヒト血清を出発原料とし、超遠心分離によって得た高比重リポ蛋白質（以下ＨＤＬと省略する）分画から疎水クロマトグラフィーやゲルろ過等の操作を経てＳＡＡを高度に精製した状態で得ることができる。あるいは同じくＨＤＬ分画をもとに、ゲルろ過や抗アポＡ１抗体等によるイムノアフィニティクロマトグラフィーを組み合わせて精製ＳＡＡを得る方法も公知である。また血清のみならず遺伝子組み換え体として発現させたＳＡＡも免疫原に利用することができる。免疫にはフロイントのコンプリートアジュバント（以下ＦＣＡと省略する）、百日咳トキソイド、あるいは結核死菌等のアジュバントを利用することにより良好な免疫応答を期待できる。たとえば結核死菌を増強したＦＣＡは、ＳＡＡの免疫にあたって凝集活性に優れた抗体を効率良く生成させるために有効なアジュバントである。必要に応じて追加免疫した後に、抗体価の上昇を確認してから採血し公知の方法で抗体を精製すれば本発明に用いるポリクローナル抗体を得ることができる。

一方本発明に用いるモノクローナル抗体も、やはり公知の方法によって得ることができる。すなわち、マウスやラット等の免疫動物をポリクローナル抗体の免疫操作と同じように免疫し、抗体価の上昇を確認したところでその抗体産生細胞を回収する。回収した抗体産生細胞は、ミエローマとの細胞融合でハイブリドーマとする、あるいはＥＢＶトランスフォーム等により形質転換させ不死化する。これを抗体産生能でスクリーニングし、更に必要な活性を持つ抗体を産生する株をクローニングすれば抗体産生株を樹立することができる。抗体産生株は、マウスの腹腔に接種して培養すれば腹水としてモノクローナル抗体を得られる。またｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体産生株を大量に培養してモノクローナル抗体を製造する技術も公知である。

本発明で利用するモノクローナル抗体は、単独で用いても良いし複数のモノクローナル抗体を組み合わせて用いることもできる。複数種のモノクローナル抗体を利用する時には、抗体の混合物を不溶性担体粒子に結合する方法、別々に結合した後に混合する方法のいずれを採用してもよい。ただし試薬性能を抗体の混合割合で経験的に制御しようとすると、ポリクローナル抗体との混合と同じように別々に結合したものを後から混合する方が混合割合の変更を容易に行えるので有利である。

本発明で利用するモノクローナル抗体は、ＳＡＡを特異的に認識するものであれば特に限定されない。本発明者らの知見によればＳＡＡに関しては抗体の凝集活性には多くの要因が影響を与えている。そのためモノクローナル抗体の反応性を評価するための一般的な指標であるエピトープや親和性のみでは凝集活性の強弱を説明することができない。本発明者らは、ＳＡＡと反応させたときに様々な凝集活性を示すいくつかのモノクローナル抗体を得ているが、本発明の効果はいずれのモノクローナル抗体を用いても達成することができる。

本発明の好ましい態様によれば、ＳＡＡと反応して単独でも凝集を生じるモノクローナル抗体、あるいは他のモノクローナル抗体と組み合わせた時に強い凝集活性を示すモノクローナル抗体をポリクローナル抗体と組み合わせることによって、高濃度域における高い定量性を実現できる。このようなモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして本発明者らはＳＡＡ−１７およびＳＡＡ−２１を樹立している。ＳＡＡ−１７はＦＥＲＭ ＢＰ−５６１６として、またＳＡＡ−２１はＦＥＲＭ ＢＰ−５６１７として特許微生物寄託センターに寄託されている。ＳＡＡ−１７とＳＡＡ−２１は、ＳＡＡ高値のヒト血清からゲルろ過とイムノアフィニティクロマトグラフィーによって精製したＳＡＡを免疫原に用い、結核死菌と沈降精製百日咳ジフテリア破傷風混合ワクチンをアジュバントとしてラットを免疫し、その抗体産生細胞をマウス・ミエローマ細胞Ｘ−６３−Ａｇ８−６５３と細胞融合することによって樹立したものである。ＳＡＡ−１７は、ラテックス粒子に結合させてＳＡＡと反応させた時に単独でも明瞭な凝集を示す。一方ＳＡＡ−２１は単独で反応させた時の凝集は弱いが、ＳＡＡ−１７と組み合わせて反応させるときわめて強い凝集活性を示す。

本発明において利用する抗体は、リウマチ因子や補体による非特異的な影響を抑制することを目的として適当な酵素で消化した断片として用いることもできる。抗体断片としては、ペプシンによるＦ（ａｂ’）_２、プラスミンによるＦａｃｂ’等が知られている。このような酵素処理は、非特異的な反応を抑制するのみならず高濃度域における定量性の向上にも大きく貢献する。抗体の定常領域を酵素的に切断することが、どのような機序でこのような作用をもたらすのかは明らかでないが、本発明においては明らかに定量性の向上という効果の現れることを確認した。酵素処理にあたっては、処理後に必ずしも定常領域を分離しなくても良い。定常領域に起因する非特異的な反応は、酵素処理によって効果的に抑制することが可能で、定常領域を除去してしまう操作は必ずしも要求されない。

定量性の向上という効果は、酵素処理の他に抗体を各種の変性条件にさらすことによっても得ることができる。変性処理には、先に述べたような酸を始めとするいくつかの処理技術が知られている。たとえば酸性処理した抗体による免疫学的な測定は、先行技術として紹介したＥＬＩＳＡの他に甲状腺刺激ホルモンのＲＩＡ、逆受け身凝集反応への応用が知られている。しかし酸処理のみでは抗体の定常領域を残すおそれが有り、実際の血清試料と接触した時にはリウマチ因子や補体の影響を受けて非特異的な反応の原因となる可能性が有る。したがって、非特異反応の防止と高濃度域における定量性の向上という２つの効果をもたらす酵素処理が本発明のより望ましい態様ということができる。

本発明は、前記免疫学的粒子凝集反応方法を実施するのに必要な、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を組み合わせた新規な試薬を提供する。本発明の試薬には、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を結合した粒子の他に公知の成分を組合せることができる。すなわち、免疫反応に必要なｐＨを与える緩衝剤、免疫反応を促進する反応増強剤、非特異反応を抑制する反応安定剤やブロッカー、試薬の保存性を高めるアジ化ナトリウムのような防腐剤等を組合せても良い。

緩衝剤としては、次のようなものが利用されている。
ＧＯＯＤ緩衝剤
３−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（3-[N、N-Bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-hydroxypropanesulfonic acid、ＤＩＰＳＯと省略する）
２−ヒドロキシエチルピペラジン−３−プロパンスルホン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-3-propanesulfonic acid、ＥＰＰＳと省略する）
トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid、ＴＥＳと省略する）
ヒドロキシエチルピペラジン−２−エタンスルホン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid 、ＨＥＰＥＳと省略する）
２−ヒドロキシエチルピペラジン−２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-hydroxypropane-3-sulfonic acid、ＨＥＰＰＳＯと省略する）
ピペラジン−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（Pioerazine-N、N'-bis(2-hydroxypropanesulfonic acid)、ＰＯＰＳＯと省略する）
N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid 、ＴＡＰＳと省略する）
トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid、ＴＡＰＳＯと省略する）
その他の緩衝剤
２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１、３−プロパンジオール（2-Amino-2-hydroxymethyl-1、3-propanediol）、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris(hydroxymethyl)aminomethane）とも呼ばれる
リン酸緩衝液
アンモニウム緩衝液
これらの緩衝剤の中でもＨＥＰＥＳ等のＧＯＯＤ緩衝剤は、免疫反応に有利なｐＨを与えるのみならず、蛋白質への影響が小さいので特に好ましい緩衝剤として挙げられる。

更に反応安定剤やブロッカーとしては、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、動物血清、ＩｇＧ、ＩｇＧ断片（ＦａｂやＦｃ）、アルブミン、乳蛋白、アミノ酸、ポリアミノ酸、コリン、ショ糖等の多糖類、ゼラチン、ゼラチン分解物、カゼイン、グリセリン等の多価アルコール等が免疫反応において反応の安定化や非特異反応の抑止に有効なことが知られている。

これらの各種成分を含む本発明による試薬は、溶液状態で、あるいは乾燥状態で供給することができる。溶液状態で流通させるには、粒子担体の分散状態の維持や蛋白の安定性を高めることを目的として、更に各種界面活性剤、糖、不活性蛋白等を加えても良い。これらの安定化剤は、試薬を乾燥するときにも安定剤として、あるいは賦形剤として有効である。

本発明でポリクローナル抗体と組み合わせて用いるモノクローナル抗体は、ダイナミックレンジの大きな測定対象成分に対して高濃度域におけるプロゾーン現象を抑制し、結果として定量レンジを拡大する作用を持つ。公知のポリクローナル抗体のみで構成された免疫学的粒子凝集反応方法では、試料を希釈しなければ測定することができなかった濃度域であっても、モノクローナル抗体を結合した粒子を組み合わせることによって希釈すること無く測定することが可能である。

モノクローナル抗体との組み合わせによる高濃度域での測定範囲拡大効果は、先行技術として知られている免疫比濁法におけるモノクローナル抗体の応用で得られるものとよく似ている。しかし本発明では、ポリクローナル抗体もモノクローナル抗体も不溶性担体粒子に結合された形で利用している。免疫比濁法と不溶性担体粒子を用いた免疫学的な凝集反応は基本的に異なった反応原理に基づく分析方法である。したがって、一方で得られる効果が他方でも容易に実現するとは限らない。特にモノクローナル抗体を利用する場合には、等価な抗体結合部位を抗原分子上に複数備えた特殊な構造の抗原でなければ凝集は起きないものと認識されている。そのモノクローナル抗体を粒子に結合してポリクローナル抗体による粒子凝集反応系に組み合わせた時に、予想を越えてプロゾーン現象の抑制作用の得られることを確認し本発明にいたったものである。

更に本発明ではモノクローナル抗体として酵素処理を施した特殊なものを利用することで、より確実な定量レンジの拡大効果を実現した。免疫学的粒子凝集反応において、変性処理を施したモノクローナル抗体をポリクローナル抗体と組み合わせたときに広い定量レンジを期待できることは新規な知見である。

本発明によって、ＳＡＡやＣＲＰといったダイナミックレンジの大きな測定対象成分を希釈操作無しで広い濃度範囲にわたって測定することが可能となる。試料の希釈機構を持たない、あるいは希釈操作によって処理能力が低下する自動分析装置であっても、本発明を利用すれば処理能力を犠牲にすることなく正しい測定値を得ることができる。たとえばＳＡＡにおいては、３３μｇ／ｍＬを越える検体が平均すると４０−５０％程度の確率で存在する。このような検体は公知の免疫学的粒子凝集反応法では確実に測定範囲をオーバーする。その結果、半数近い試料は希釈再測定を行わざるをえず、著しい作業能率の低下をもたらす恐れが有る。本発明によって３３０μｇ／ｍＬまで定量レンジを拡大（１０倍）した場合、測定可能レンジの上限を越える試料に遭遇する確率は理論的には１０％程度にまで減少する。この程度の確率であれば、その他の測定項目で発生する日常的な再測定の頻度と大差が無く許容範囲と言える。

以下の実施例では、ポリクローナル抗体を固定したラテックス粒子とモノクローナル抗体を固定したラテックス粒子を別々に調製後、両者を混合することによって本発明によるポリクローナル抗体−モノクローナル抗体混合試薬とする方法を採用した。そして本発明による定量レンジを、ポリクローナル抗体のみで構成される従来の試薬と比較した。
１．ＳＡＡ免疫原の調製
ＳＡＡ高値血清（１００μｇ／ｍＬ）１Ｌを出発原料とし、まず超遠心法により比重１．２３の上層部を採取、次いで比重１．０６３の下層部を採取し、冷却下メタノール／エーテル (１：３）で脱脂後、セファデックスＧ−２００カラム（６Ｍ尿素、０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．６で平衡化）にアプライし、更にブロムシアンで活性化したセファロース４Ｂ（ファルマシア）に常法により、抗ＡｐｏＡ−１抗体、抗ＡｐｏＣ３抗体、および抗ヒト血清アルブミン抗体を結合させたカラムに通して夾雑蛋白を除去し、１Ｌの血清より精製ＳＡＡ３０ｍｇが得られた。精製ＳＡＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分子量１２０００の位置に単一のバンドを示し、他のアポリポ蛋白抗体とは反応しなかった。また、アミノ酸配列はＮ末端からSer Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala Arg Asp Met Trp Arg Ala Tyr であり、データベース検索から、ダウレット他の報告によるＮ末端のArg を欠いたｆｏｒｍ２、４と同一であることがわかった。

２．モノクローナル抗体を使ったラテックス乳液
２−１．ラットの免疫
１で精製したＳＡＡ１００μｇ／頭とヒト型結核死菌４ｍｇ／ｍＬを加えたＦＣＡで常法によりエマルジョンを作製し、９週齢のＷＫＡＨ／ＨＫｍラットのメスに免疫した。同時に沈降精製百日咳ジフテリア破傷風混合ワクチン（武田薬品工業製）１００μl/頭を左後肢腿に筋肉注射した。この後３週おきにＳＡＡ５０μｇ／頭をＦＣＡと常法によりエマルジョンとしたものを免疫原として腹腔内注射し、定期的に採血してＥＬＩＳＡで抗体価を測定した。ＥＬＩＳＡの操作は次のとおりである。

２−２．ＳＡＡ抗体のＥＬＩＳＡ
抗体価の測定と抗原特異的抗体活性の確認は、ＥＬＩＳＡで行った。ブロック、コンジュゲート希釈、血清希釈には１％のＢＳＡを加えた０．１５ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、以下ＢＳＡ−ＰＢＳと省略する）を用いた。精製ＳＡＡを１０μｇ／ｍＬとなるように２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、以下ＰＢＳと省略する）に溶解し住友ベークライトメディカル社製６０穴テラサキプレート（ＭＳ−３１６００）に１０μＬ／ｗｅｌｌ入れ３７℃で２時間感作し、ＰＢＳで洗浄後１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１０μＬ／ｗｅｌｌ入れ、３７℃で２時間ブロックし、４℃で保存する。

プレートをＰＢＳで１回洗浄後、抗体活性を調べようとする検体１０μＬをテラサキプレートに採り３７℃で３０分インキュベートした。このプレートをＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０，０００倍に希釈した市販の抗ラットＩｇＧ−ＰＯＤコンジュゲート（Ｃａｐｐｅｌ社製）１０μＬを入れ、３７℃３０分インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄後、ＯＰＤと過酸化水素を含む基質液１０μＬを加え３７℃で３０分インキュベートして発色を測定した。陰性対照として１％ＢＳＡ−ＰＢＳを、陽性対照として１０^２に希釈した免疫ラット血清１０μＬを用意し、検体にかえて同じ操作を行った。

２−３．細胞融合とクローニング
ＥＬＩＳＡによる抗体価が１０^４に上昇したことを確認したところで、生理食塩水に溶解したＳＡＡ５０μｇを腹腔内注射し３日後に脾臓を摘出した。脾細胞を採取してＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、マウスミエローマ細胞Ｘ−６３−Ａｇ８−６５３とポリエチレングリコール（以下ＰＥＧと省略する）法によって細胞融合させた。融合条件は次のとおりである。すなわち、脾細胞：ミエローマ細胞が３：１となるように遠心管に分注し、５０％ＰＥＧ溶液１ｍＬを加え、更に加温した５０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０をゆっくり加えてＰＥＧを希釈した。次いで遠心してＰＥＧを除き、脾細胞として７．１×１０^５／ｗｅｌｌとなるようにＨＡＴ培地に分散し、これを９６穴プレートにプレーティングした。ＨＡＴセレクション後にほとんどのウエルでコロニーが観察された。各ウエルの培養上清はＰＯＤ標識抗ラットIｇＧ抗体を用いてＥＬＩＳＡでスクリーニングし、発色した３０ウエルからクローニングを始め、３回から４回の限界希釈法によるクローニングを行い、最終的にＳＡＡとの反応性を示すＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を産生する１３クローンを確立した。

２−４．モノクローナル抗体による試薬の調製
２−３で得たハイブリドーマ１３クローンを、それぞれプリスタン処理したヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ）の腹腔に接種し２週間後腹水を採集した。この腹水を遠心（３０００ｒｐｍ、５分）後、上清から硫安分画によってモノクローナル抗体を沈殿させた。沈殿を回収してＰＢＳに溶解し、同じＰＢＳに対して透析し抗ＳＡＡモノクローナル抗体（１０ｍｇ／ｍＬ）とした。用いたモノクローナル抗体のサブクラスは以下のとおりである。サブクラスは、Ｂｅｔｈｙｌ社製抗ラットサブクラス抗血清と精製モノクローナル抗体とのオクテロニー法で決定した。
クローン ３：ＩｇＧ_２ａ
クローン ６：ＩｇＧ_２ｂ
クローン ７：ＩｇＧ_２ａ
クローン１４：ＩｇＧ_２ｃ
クローン１５：ＩｇＧ_２ａ
クローン１６：ＩｇＧ_２ａ
クローン１７：ＩｇＧ_１
クローン１８：ＩｇＧ_２ａ
クローン２０：ＩｇＧ_２ａ
クローン２１：ＩｇＧ_２ａ
クローン２２：ＩｇＧ_２ａ
クローン２５：ＩｇＧ_２ａ
クローン２７：ＩｇＧ_２ａ
このモノクローナル抗体を公知の方法に基づいてプラスミン処理した。すなわち、１００ｍＬのモノクローナル抗体（１０ｍｇ／ｍＬ）を塩酸でｐＨ２．８に調整し、プラスミン（ＳＩＧＭＡ製）を５Ｕ添加して３０℃で１時間反応させた。反応後ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整し、３７℃で２時間放置してプラスミン処理ＩｇＧとした。この状態では、反応液中にＦａｃｂとｐＦｃとが混在している状態にある。また酸処理による効果を確認するために、プラスミンを添加しないで同じ操作を行うことにより酸処理したモノクローナル抗体を調製した。

プラスミン処理、または酸処理した抗ＳＡＡモノクローナル抗体（０．５％）をポリスチレンラテックス（平均粒径０．１０９μｍ）に３７℃で１時間物理吸着させ、最終的にラテックス濃度０．４％となるように分散媒（１％ＢＳＡを含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４）に懸濁させてモノクローナル抗体感作ＳＡＡラテックス凝集反応用試薬（以下モノクローナル抗体感作乳液と呼ぶ）を得た。これらモノクローナル抗体感作乳液には、ＳＡＡと反応させたときに単独でも凝集するもの、単独では凝集しないが他の乳液の凝集を増強するもの、複数種を組み合せたときに始めて凝集を認められるものといった様々な反応性を持つものが含まれていた。

３．ポリクローナル抗体による試薬の調製
３−１．ポリクローナル抗体
１で得た精製ＳＡＡ（２ｍｇ／ｍＬ生理食塩水）をヒト型結核死菌を加えたＦＣＡ（ＦＣＡ１ｍＬに対して結核死菌を４ｍｇ）と等量混合し、じゅうぶんに乳化させた後に１ｍＬを家兎の四肢に免疫した。同時に百日咳ワクチンを後足基部に筋注した。免疫は２週間ごとに行った。４ヶ月後に一部採血して得られる抗血清について、ＳＡＡに対する反応性をオクテロニー法によって確認した。高い抗体価が確認された個体の抗血清をヒトＨＤＬで吸収してから４０％硫安分画してＩｇＧを回収し、ＰＢＳに対して透析して抗ＳＡＡ抗体（１０ｍｇ／ｍＬ）を得た。更に得られた抗体をモノクローナル抗体と同様に公知の方法に基づいてプラスミン処理してプラスミン処理ＩｇＧとした。この状態では、反応液中にＦａｃｂとｐＦｃとが混在している状態にある。

３−２．ポリクローナル抗体による試薬の調製
３−１で得た抗ＳＡＡ・プラスミン処理ＩｇＧ（０．５％）をポリスチレンラテックス（平均粒径０．１０９μｍ）に３７℃で１時間物理吸着させた後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄し、最終的にラテックス濃度０．４％となるように分散媒（１％ＢＳＡを含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４）に懸濁させてＳＡＡラテックス凝集反応用試薬（以下単に乳液と呼ぶ）を得た。

４．本発明によるポリクローナル抗体−モノクローナル抗体混合試薬
２で調製したモノクローナル抗体感作乳液と、３で得た乳液とを１：４となるように混合して本発明によるモノクローナル抗体・ポリクローナル抗体混合感作ラテックス（以下、混合乳液と称する）とした。モノクローナル抗体感作乳液としては、ＳＡＡと反応させたときに単独でも強い凝集を示したＳＡＡ−１７から調製したものを利用した。比較に用いた従来の試薬には、３で得たポリクローナル抗体による乳液をそのまま用いた。

５．定量レンジの比較
本発明の混合乳液によって得られるＳＡＡの免疫学的測定試薬の直線性を、従来の抗体によって得られる試薬と比較した。０−２８００μｇ／ｍＬのＳＡＡを含む希釈系列を用意し、４で得た乳液による測定を試みた。操作は次のとおりである。希釈系列は、あらかじめ濃度を検定したＳＡＡを高濃度で含む血清をＳＡＡ濃度が２８００μｇ／ｍＬとなるように馬血清（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４で１０倍に希釈したもの）で濃度を調整し、更に倍々希釈して作成した。希釈液には、０．５％ＢＳＡ、１２％塩化コリン、および０．９％ＮａＣｌを含む０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４、以下、希釈液と記載する）を用いた。希釈液２２５μＬと各濃度のＳＡＡ含有溶液３μＬを測定セルに分注し、５分後に乳液７５μＬを添加して更に１分後−５分後にかけて波長６６０ｎｍで吸光度を測定し各測定点の間の吸光度変化量を求めた。測定には全自動分析装置日立７０７０（日立製作所製）を用いた。

結果は、図１（プラスミン処理）、および図２（酸処理）に示した。図から明らかなように、本発明の抗体を利用した試薬では０．５２〜２８００μｇ／ｍＬまで測定値が増加し続けている。この濃度範囲においては、本発明によって同じ条件の基で測定が可能となることを示している。一方ポリクローナル抗体のみで構成された従来の試薬を用いた場合、測定値が濃度に応じて変化している範囲は７００μｇ／ｍＬ程度までである。従来の抗体による測定範囲も不十分なものではなく、むしろサンプルボリュームが小さいために従来の定量レンジに比べればかなり高濃度までカバーできていると言うべきかもしれない。しかしそれでも本発明に比べれば測定可能範囲が狭いために希釈を要するサンプルが発生する可能性が有る。従来抗体に対して非常に測定範囲が広い本発明の抗体によれば、測定範囲を越えるために希釈再測定しなければならないサンプルに遭遇する機会を大きく減らすことが可能である。

本発明によれば、免疫学的粒子凝集反応におけるプロゾーン現象を抑制し、ダイナミックレンジの広い抗原性成分でも、広い濃度範囲にわたって正しい測定値を得ることができる。

プラスミン処理したモノクローナル抗体を利用した本発明の試薬によるＳＡＡの測定結果。図中、縦軸は吸光度の差（ΔＯＤ）を、横軸は試料のＳＡＡ濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。

酸処理したモノクローナル抗体を利用した本発明の試薬によるＳＡＡの測定結果。図中、縦軸は吸光度の差（ΔＯＤ）を、横軸は試料のＳＡＡ濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。

Claims (8)

1. ラテックス粒子に固定した抗体を抗原と反応させ、抗原抗体反応によって生じるラテックス粒子の凝集を観察することによって抗原を検出、または測定する方法であって、抗体として分析対象抗原に対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を用いる免疫学的ラテックス凝集反応方法
2. ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体が別のラテックス粒子上に固定されている請求項１の免疫学的ラテックス凝集反応方法
3. モノクローナル抗体が、パパイン、ペプシン、プラスミン、及びトリプシンで構成される群から選択されたプロテアーゼで変性処理を施したものである請求項１の免疫学的ラテックス凝集反応方法
4. 抗原が血清アミロイドＡである請求項１の免疫学的ラテックス凝集反応方法
5. 抗原を含む試料を予め希釈すること無く抗体と接触させる請求項１の免疫学的ラテックス凝集反応方法
6. ラテックス粒子の凝集を光学的に測定する請求項１の免疫学的ラテックス凝集反応方法
7. ラテックス粒子に固定した抗体を抗原と反応させ、抗原−抗体によって生じるラテックス粒子の凝集を光学的に測定することによって抗原を検出、または測定する方法に用いる試薬であって、抗体として分析対象抗原に対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を用いる免疫学的ラテックス凝集反応方法のための試薬
8. ラテックス粒子に固定した抗体を抗原と反応させ、抗原抗体反応によって生じるラテックス粒子の凝集を光学的に測定するすることによって抗原を検出、または測定する方法において、抗体として分析対象抗原に対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を用いるプロゾーン現象の抑制方法
   

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