JP2005531608A - ＮＦ−κＢ阻害剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、新規化合物およびＩκＢのＩＫＫ−βリン酸化のアミノチオフェン阻害剤で疾患を治療するためのそれらの使用方法を提供する。その際、これらのアミノチオフェン阻害剤は、ＮＦ−κＢの過剰活性化が関与する疾患における、転写因子ＮＦ−κＢの病理学的活性化を阻害する。

Description

発明の詳細な説明

（発明の分野）
本発明は、一般的に、ベンゾ−ベンゾチオフェン化合物を用いる転写因子ＮＦ−κＢ（核因子−κＢ）の病理学的活性化の阻害方法に関する。かかる方法は、ＮＦ−κＢの活性化が関与する疾患の治療に特に有用である。より詳しくは、これらの方法は、ＮＦ−κＢ二量体の次なる分解および活性化を防止するＩκＢ（阻害性タンパク質κＢ）のＩＫＫ−β（ＩκＢキナーゼ−β、ＩＫＫ−２としても知られている）リン酸化を阻害するために用いることができる。かかる方法は、炎症性および組織修復障害、特に関節リウマチ、炎症性大腸疾患、喘息およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）；変形性関節症、骨粗鬆症および線維化疾患；皮膚病（乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線（ＵＶ）−誘発皮膚損傷を含む）；自己免疫疾患（全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、組織および臓器拒絶反応を含む）、アルツハイマー病、発作、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、ホジキンズ病を含む癌、悪液質、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む、感染症およびある種のウイルス感染症に不随する炎症、成人呼吸窮迫症候群および毛細血管拡張性運動失調症を含む、ＮＦ−κＢ活性化に付随する種々の疾患の治療に有用である。

（発明の背景）
急性および慢性の炎症性疾患および癌に関与するメディエータの科学的理解についての最新の進歩は、有効な療法のサーチにおける新しいストラテジーを導いた。伝統的なアプローチとしては、特異的抗体、受容体アンタゴニストまたは酵素阻害剤の使用のような直接的なターゲットインターベンションが挙げられる。種々のメディエータの転写および翻訳に関与する調節メカニズムの解明についての最近の大きな進歩は、遺伝子転写のレベルに向けられた治療アプローチに対する関心を強めた。

核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）はＲｅｌ／ＮＦ−κＢファミリーのポリペプチドの種々の組み合わせから構成される、密接な関係がある二量体転写因子複合体のファミリーに属する。該ファミリーは哺乳動物における５種類の個々の遺伝子産物であるＲｅｌＡ（ｐ６５）、ＮＦ−κＢ１（ｐ５０／ｐ１０５）、ＮＦ−κＢ２（ｐ４９／ｐ１００）、ｃ−ＲｅｌおよびＲｅｌＢからなり、それらはすべてヘテロダイマーまたはホモダイマーを形成しうる。これらのタンパク質は非常に相同的な３００個のアミノ酸「Ｒｅｌ相同ドメイン」を共有しており、該ドメインはＤＮＡ結合および二量体化ドメインを含んでいる。Ｒｅｌ相同ドメインの先端のＣ−末端は、ＮＦ−κＢを細胞質から核へと輸送するのに重要な核トランスロケーション配列である。さらに、ｐ６５およびｃＲｅｌは、それらのＣ末端に強力なトランス活性化ドメインを有する。

ＮＦ−κＢの活性は、それとタンパク質の阻害剤ＩκＢファミリーのメンバーとの相互作用により調節される。この相互作用はＮＦ−κＢタンパク質上の核局在化配列を効果的にブロックし、かくして、二量体が核へ移動するのを防止する。広範囲に及ぶ様々な刺激が複数のシグナル伝達経路であると思われるものによりＮＦ−κＢを活性化させる。細菌産生物（ＬＰＳ）、いくつかのウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＴＬＶ−１）、炎症サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１）、環境および酸化ストレスならびにＤＮＡ損傷剤が包含される。しかしながら、全ての刺激に明らかに共通することはＩκＢのリン酸化およびその後の分解である。ＩκＢは、最近同定されたＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ−αおよびＩＫＫ−β）により２つのＮ末端セリンにおいてリン酸化される。部位特異的突然変異の研究により、一旦、リン酸化されると該タンパク質はユビキチン−プロテアソーム経路を経る分解用にフラッグを付されるという点で、これらのリン酸化がその後のＮＦ−κＢの活性化に重要であることが示された。ＩκＢがないと、活性なＮＦ−κＢ複合体が核に移動して、そこでそれらは選択的な様式で好ましい遺伝子特異的エンハンサー配列に結合しうる。多くのサイトカインおよびケモカイン、細胞接着分子、急性期タンパク質、免疫調節タンパク質、エイコサノイド代謝酵素ならびに抗アポトーシス遺伝子がＮＦ−κＢにより調節されている遺伝子に含まれる。

ＮＦ−κＢが、ＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８のようなサイトカイン、ＩＣＡＭおよびＶＣＡＭのような細胞接着分子、ならびに誘導性酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）を包含する多数の炎症誘発性メディエータの調節発現において鍵となる役割を果たすことはよく知られている。かかるメディエータは炎症部位における白血球の動員において役割を演じることが知られており、ｉＮＯＳの場合にはいくつかの炎症性疾患および自己免疫疾患において臓器破壊を生じる。

ＮＦ−κＢが活性化されることを示した喘息を包含する気道炎症の研究により、炎症性障害におけるＮＦ−κＢの重要性がさらに高められている。この活性化はこれらの障害に特徴的なサイトカイン産生および白血球浸潤の増加の基礎となっている。さらに、吸入されたステロイドは気道応答性亢進を低下させ、喘息性気道の炎症応答を抑制することが知られている。ＮＦ−κＢのグルココルチコイド阻害に関する最近の知見に鑑みると、これらの効果はＮＦ−κＢの阻害を介して媒介されると考えられる。

炎症性障害におけるＮＦ−κＢの役割に関するさらなる証拠はリウマチ性滑膜の研究から得られる。ＮＦ−κＢは、通常、不活性細胞質複合体として存在するが、最近の免疫組織化学的研究により、ＮＦ−κＢが核に存在し、したがって、リウマチ性滑膜を構成する細胞において活性があることが示されている。さらに、ＮＦ−κＢは、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１βでの刺激に応答してヒト滑膜細胞中で活性化されることが示されている。かかる分布は、この組織に特徴的なサイトカイン産生およびエイコサノイド産生の増加についての基礎をなすメカニズムであり得る。Roshak, A. K.ら、J. Biol. Chem., 271, 31496-31501 (1996)を参照。関節リウマチ患者の滑膜細胞においてＩＫＫ−βの発現が示されており、遺伝子移植の研究により、これらの細胞中での刺激された炎症メディエータ産生におけるＩＫＫ−βの中心的役割が示されている。Auppereleら、J. Immunology 1999, 163:427-433およびAupperleら、J. Immunology 2001; 166:2705-11参照。より最近になって、野生型ＩＫＫ−βアデノウイルス構築物の関節内投与は、ドミナントネガティブＩＫＫ−βにより阻害されたアジュバントにより誘導される関節炎のラットに関節内投与している間に足の腫大を引き起こすことが示された。Takら、Arthritis and Rheumatism 2001; 44:1897-1907を参照。

ＮＦ−κＢ／ＲｅｌおよびＩκＢタンパク質もまた新生物のトランスフォーメーションおよび転移において鍵となる役割を果たす可能性がある。ファミリーのメンバーは、過剰発現、遺伝子増幅、遺伝子のリアレンジまたは移動の結果としてインビトロおよびインビボにおいて細胞のトランスフォーメーションに関連している。さらに、ある種のヒトリンパ腫の２０〜２５％において、これらのタンパク質をコードする遺伝子のリアレンジおよび／または増幅が見られる。さらに、ＮＦ−κＢは、ヒト腫瘍において最も一般的に欠けているものである発癌性ｒａｓにより活性化され、ＮＦ−κＢ活性化の遮断はｒａｓにより媒介される細胞のトランスフォーメーションを抑制する。さらに、アポトーシスの調節におけるＮＦ−κＢの役割が報告されており、腫瘍細胞増殖の調節におけるこの転写因子の役割が強調されている。ＴＮＦ、電離放射線およびＤＮＡ損傷剤はすべてＮＦ−κＢを活性化させ、その結果、数種の抗アポトーシスタンパク質の発現のアップレギュレーションを導くことが示された。逆に、ＮＦ−κＢの阻害は、数種の腫瘍細胞タイプにおいてこれらの作用剤によるアポトーシス性の死滅を増強することが示された。このことが化学療法に対する腫瘍細胞の主な耐性機構を表す可能性があるので、ＮＦ−κＢ活性化の阻害剤は、単一作用剤療法または補助的療法として有用な化学療法剤でありうる。最近の報告は骨格細胞分化の阻害剤およびサイトカインにより誘導される筋肉疲労の調節剤としてのＮＦ−κＢに関連しており（Guttridgeら、Science; 2000; 289: 2363-2365）、さらに新規癌療法としてのＮＦ−κＢ阻害剤の潜在能力を支持するものである。

いくつかのＮＦ−κＢ阻害剤がC. Wahlら、J. Clin. Invest. 101(5), 1163-1174 (1998)、R. W. Sullivanら、J. Med. Chem. 41, 413-419 (1998)、J. W. Pierceら、J. Biol. Chem. 272, 21096-21103 (1997)に記載されている。
海洋天然産物であるヒメニアルジシン（hymenialdisine）はＮＦ−κＢを阻害することが知られている。Roshak, A.ら、JPET, 283, 955-961 (1997)。Breton, J. J and Chabot-Fletcher, M. C., JPET, 282, 459-466 (1997)。

さらに、ＩＫＫ−２のアミノチオフェン阻害剤に関する特許出願（Callahanら、ＷＯ２００２０３０３５３、Baxterら、ＷＯ２００１０５８８９０、Faullら、ＷＯ２００３０１０１５８、Griffithsら、ＷＯ２００３０１０１６３、Fancelliら、ＷＯ２００１９８２９０を参照）；ＩＫＫ−２のイミダゾール阻害剤に関する特許出願（Callahanら、ＷＯ２００２３０４２３を参照）；ＩＫＫ−２のアニリノフェニルピリミジン阻害剤に関する特許出願（Koisら、ＷＯ２００２０４６１７１を参照）；ＩＫＫ−２のβ−カルボリン阻害剤に関する特許出願（Ritzelerら、ＷＯ２００１０６８６４８、Ritzelerら、ＥＰ１１３４２２１、Nielschら、ＤＥ１９８０７９９３、Ritzelerら、ＥＰ１２０９１５８を参照）；ＩＫＫ−２のインドール阻害剤に関する特許出願（Ritzelerら、ＷＯ２００１０３０７７４を参照）；ＩＫＫ−２のベンゾイミダゾール阻害剤に関する特許出願（Ritzelerら、ＤＥ１９９２８４２４、Ritzeler ら、ＷＯ２００１０００６１０を参照）；ＩＫＫ−２のアミノピリジン阻害剤に関する特許出願（Lowingerら、ＷＯ２００２０２４６７９、Murataら、ＷＯ２００２０２４６９３、Murataら、ＷＯ２００２０４４１５３を参照）；ＩＫＫ−２のピラゾラキナゾリン阻害剤に関する特許出願（Beaulieuら、ＷＯ２００２０２８８６０、Burke ら、ＷＯ２００２０６０３８６、Burkeら、米国特許出願公開２００３００２２８９８を参照）；ＩＫＫ−２のキノリン阻害剤に関する特許出願（Brownerら、ＷＯ２００２０４１８４３、Brownerら、米国特許出願公開２００２０１６１００４を参照）およびＩＫＫ−２のピリジルシアノグアニジン阻害剤に関する特許出願（Bjorklingら、ＷＯ２００２０９４８１３、Binderup ら、ＷＯ２００２０９４３２２、およびMadsenら、ＷＯ２００２９４２６５を参照）が出願されている。天然産物であるスタウロスポリン、ケルセチン、Ｋ２５２ａおよびＫ２５２ｂはＩＫＫ−２阻害剤であることが示されている。Peet, G. W. and Li, J. J. Biol. Chem., 274, 32655-32661 (1999) および Wisniewski, D.ら、Analytical Biochem. 274, 220-228 (1999)を参照。ＩＫＫ−２の合成阻害剤もまた開示されており（Burkeら、J. Biol. Chem., 278, 1450-1456 (2003)を参照）、Murataら、Bioorg. Med. Chem. Lett., 13, 913-198 (2003)にはＩＫＫ−２阻害剤が開示されている。
米国特許第３，９６３，７５０号には、ある種のアミノチオフェンの製造が開示されている。

（発明の概要）
本発明は、新規化合物および該化合物を用いる転写因子ＮＦ−κＢの活性化を阻害する新規方法に関する。
本発明の目的は、転写因子ＮＦ−κＢの活性を変化させることにより治療的に改変され得る疾患の治療方法を提供することである。

したがって、第１の態様において、本発明は、式Ｉで示される化合物を含む医薬組成物を提供する。

別の態様において、本発明は、ＩＫＫ−βによるＩκＢのリン酸化およびその後の分解を阻害することにより疾患の病態を治療的に改変することができる、疾患の治療方法を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、ＮＦ−κＢの病理学的活性化を阻害することにより疾患の病態を治療的に改変することができる、疾患の治療方法を提供する。

特別な態様において、本発明は、炎症性および組織修復障害、特に、関節リウマチ、炎症性大腸疾患、喘息およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）変形性関節症、骨粗鬆症および線維化疾患、皮膚病（乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線（ＵＶ）−誘発皮膚損傷を含む）；自己免疫疾患（全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、組織および臓器拒絶反応を含む）、アルツハイマー病、発作、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、ホジキンズ病を含む癌、悪液質、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む、感染症およびある種のウイルス感染症に不随する炎症、成人呼吸窮迫症候群および毛細血管拡張性運動失調症を含む、ＮＦ−κＢ活性化に不随する種々の疾患の治療方法を提供する。

（発明の詳細な記載）
本発明の化合物は、下記する式（Ｉ）：

［式中：
Ｒ_１はＮＲ_４Ｒ_５であり；
Ｒ_２は、ＣＯＮＨ_２またはＳＯ_２ＮＨ_２であり；
Ｒ_３は、ハロゲン、Ｃ_１−４アルキル、ＮＨ_２、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＣＮ、ＣＨＯ、ＳＯ_２−アルキルおよびＮＯ_２からなる群から選択される３個までの置換基であり；
Ｒ_４は、Ｈ、Ｃ_１−２アルキルであり；
Ｒ_５は、Ｃ（＝Ａ）ＮＨＲ_６、ＣＯＲ_７またはＲ_６であり；
Ａは、Ｏ、ＳまたはＮであり；
Ｒ_６は、ＨまたはＣ_１−２アルキルであり；
Ｒ_７は、Ｃ_１−２アルキルであり；
Ｌは、リンカーＤ−Ｅ−Ｄであり、
Ｄは、結合またはＣ_１−４アルキルであり；
Ｅは、

ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＣＯＯ、Ｎ、Ｏ、Ｓまたは≡であり；
ＧおよびＩは、独立して、Ｈ、Ｃ_１−２アルキルである］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩から選択される：だだし、式（Ｉ）で示される化合物は、２−［（アミノカルボニル）アミノ］−５−｛［（４−クロロフェニル）メチル］オキシル−３−チオフェンカルボキサミド以外である。

好ましくは、Ｒ_２はＣＯＮＨ_２である。
好ましくは、Ｒ_５はＣ（＝Ａ）ＮＨＲ_６である。
好ましくは、Ｒ_６はＨである。
好ましくは、ＡはＯである。
好ましくは、Ｅは、

ＣＯＮＨ、または≡であり
より好ましくは、Ｅは、

または≡である。

本発明において有用な好ましい化合物は：
５−［（Ｅ）−フェニル）−エテニル］−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
５−［（Ｅ）−２−（４−フルオロ−フェニル）−エテニル］−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
５−［（Ｅ）−２−（４−クロロ−フェニル）−エテニル］−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
５−フェネチル−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
５−ベンジル−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
５−（１−フェニル−エチル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
５−フェニルエチニル−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
５−（４−フルオロフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
５−（４−エチルフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
５−（４−メトキシフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
５−（４−クロロフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
５−（４−トリフルオロメチルフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
５−（３−トリフルオロメチルフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；および
５−アセチルアミノ−チオフェン−２，４−ジカルボン酸４−アミド２−［（３−クロロ−フェニル）−アミド］
またはその医薬上許容される塩を含む。

本発明は、炎症性および組織修復障害；特に関節リウマチ、炎症性大腸疾患、喘息およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）変形性関節症、骨粗鬆症および線維化疾患；皮膚病（乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線（ＵＶ）−誘発皮膚損傷を含む）；自己免疫疾患（全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、組織および臓器拒絶反応を含む）、アルツハイマー病、発作、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、ホジキンズ病を含む癌、悪液質、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む、感染症およびある種のウイルス感染症に不随する炎症、成人呼吸窮迫症候群および毛細血管拡張性運動失調症を含む、ＮＦ−κＢ活性化が不随する種々の疾患の治療方法を提供する。

定義
本発明は、本発明の化合物の、すべての水和物、溶媒和物、複合体およびプロドラッグを含む。プロドラッグは共有結合した化合物であり、インビボにおいて式Ｉで示される活性親薬剤を放出するものである。キラル中心または別形態の異性中心が本発明の化合物中に存在する場合、エナンチオマーおよびジアステレオマーを含む全ての形態のかかる異性体（複数でも可）は、本発明の範囲内に含まれる。キラル中心を含む本発明の化合物は、ラセミ混合物、エナンチオマー的に富んだ混合物として用いてもよく、あるいは、よく知られた方法を用いてラセミ混合物を分離し、個々のエナンチオマーを単独で用いてもよい。化合物が不飽和炭素−炭素二重結合を有する場合、シス（Ｚ）異性体およびトランス（Ｅ）異性体は、共に本発明の範囲内に含まれる。化合物がケト−エノール互変異性体のような互変異性体として存在する場合、各々の互変異性体は、平衡状態で存在しても一の形態が優勢に存在しても本発明の範囲内に含まれる。

式Ｉまたはそのいずれもの下位式においていずれか１つの場合におけるいずれもの置換基の意味は、特記しない限り、他のいずれの場合におけるその意味または他のいずれの置換基の意味からも独立している。

本明細書で用いられる場合、「アルキル」は、炭素−炭素単結合により結合され、１〜６個の共に結合した炭素原子を有する、置換されていてもよい炭化水素基を意味する。アルキル炭化水素基は、直鎖、分枝鎖または環状、飽和または不飽和であってもよい。置換されていてもよいアルキルにおける置換基は、アリール、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＯ、ハロゲン、ＣＦ_３およびＯＣＦ_３からなる群から選択される。

本明細書で用いられる場合、「アリール」は、共役パイ電子系を有する少なくとも１個の環を有し、２個までの共役または縮合環系を含有する、置換されていてもよい芳香族基を意味する。アリールは、カルボサイクリックアリールおよびビアリール基を含み、これらはすべて置換されていてもよい。置換基は、ハロゲン、Ｃ_１−４アルキル、ＮＨ_２、ＯＣＦ_３、ＣＦ_３、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＣＮ、ＣＨＯ、ＳＯ_２−アルキルおよびＮＯ_２からなる群から選択される。

本明細書で用いられる場合、「ヘテロアリール」は、共役パイ電子系を有する少なくとも１つの環を有し、２個までの共役または縮合環系およびＯ、ＳおよびＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含有する、置換されていてもよい芳香族基を意味する。ヘテロアリールは、カルボサイクリックヘテロアリールアリール、アリール−ヘテロアリールおよびビヘテロアリールアリール基を含み、これらはすべて置換されていてもよい。好ましいアリールは、フェニルおよびナフチルを含む。より好ましいアリールはフェニルを含む。好ましい置換基は、ハロゲン、Ｃ_１−４アルキル、ＮＨ_２、ＯＣＦ_３、ＣＦ_３、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＣＮ、ＣＨＯ、ＳＯ_２−アルキルおよびＮＯ_２からなる群から選択される。ヘテロアリール環の例としては、ピロール、フラン、チオフェン、インドール、イソインドール、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ピリジン、キノリン、イソキノリン、キノリジン、ピラゾール、イミダゾール、イソオキサゾール、オキサゾール、イソチアゾール、チアゾール、ピリダジン、ピリミジンおよびピラジンが挙げられる。
本明細書で用いられる場合、「ハロゲン」は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩを意味する。

調製方法
以下の方法および実施例は、本発明を説明するものであって、何ら限定するものではない。
式Ｉで示される化合物の一般的な調製方法を、スキーム１、２、３および４に示した。重要な５−ブロモ−または５−ヨウド−２−アミノチオフェン中間体は、対応する保護２−アミノチオフェンから、それぞれ、Ｎ−ブロモスクシニミド（ＮＢＳ）またはヨウドクロライド（ＩＣｌ）で処理することにより調製した（スキーム１）。５−ブロモ−または５−ヨウド−２−アミノチオフェンを利用して、オレフィンリンカーを有するアナログは、スズキカップリングにより調製し；アセチレンリンカーを５−位に有するアナログは、ソノガシラカップリングにより調製し；アミド、エステル、チオエステルリンカーを５−位に有するアナログは、パラジウム触媒カルボニル化により調製することができる（スキーム２）。別法として、２−アミノチオフェン３−カルボン酸アミドは、２−シアノアセトアミドを、［１，４］−ジチアン−２，５−ジオールと反応させ、ついで、トリクロロアセチルイソシアネートで保護して調製することができる。ついで、保護チオフェンを、Ｎ−ブロモスクシニミドまたはヨウドクロライドによりハロゲン化した。炭酸ナトリウム水溶液中で脱保護して、５−ブロモまたは５−ヨウド−２−ウレイドチオフェン−３−カルボン酸アミドを得た（スキーム３）。５位にアルキルリンカーを有するアミノチオフェンは、必要なアルデヒドを２−シアノアセトアミドで処理することにより調製することができ、ついで、クロロスルホニルイソシアネートと反応させて、５位にアルキルリンカーを有する２−ウレイド−３−アミドチオフェンを得た（スキーム４）。

一般方法
核磁気共鳴スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＣ ４００分光計を用いて、４００ＭＨｚで記録した。ＣＤＣｌ_３は重クロロホルムであり、ＤＭＳＯ−ｄ_６はヘキサジュウテリオジメチルスルホキシドであり、ＣＤ_３ＯＤは、テトラジュウテリオメタノールである。化学シフトは、内部標準であるテトラメチルシランからの低磁場への１００万あたりの部（ｄ）で記録した。ＮＭＲデータの略号は、下記の通りである：ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｍ＝マルチプレット、ｄｄ＝ダブレットダブレット、ｄｔ＝ダブレットトリプレット、ａｐｐ＝見かけ、ｂｒ＝ブロード。Ｊは、ヘルツで測定したＮＭＲカップリング定数を示す。質量スペクトルを、蒸発光散乱により、２１４ｎｍのＵＶにより検出して、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ １５０ＥＸ装置［１×４０ｍｍのＡｑｕａｓｉｌ（Ｃ１８）カラム、勾配４．５％〜９０％のアセトニトリル−水（０．０２％のＴＦＡ）を用いる、ＬＣＭＳシステムで３．２分間にわたって回収した。質量を、エレクトロスプレーイオン化法を用いて測定した。すべての温度は摂氏で記録する。ＡｎａｌｔｅｃｈシリカゲルＧＦおよびＥ．Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０ Ｆ−２５４薄層プレートを、薄層クロマトグラフィーに用いた。フラッシュおよび重力クロマトグラフィーは、両方とも、Ｅ．Ｍｅｒｃｋキーゼルゲル（Kieselgel）６０（２３０−４００メッシュ）シリカゲルで行った。分取ＨＰＬＣを、１０〜８０の勾配（アセトニトリル中の０．１％のＴＦＡ／０．１％のＴＦＡ水溶液）で溶出する、５０×２０ｍｍｌのＳ−５μＬ Ｃ１８逆相カラムを用いる、Gilson Preparativeシステムを用いて行った。

以下の実施例は、本発明の説明するものであって、何ら限定するものではない。

実施例１
５−ブロモ−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドの調製
ａ）２−アミノ−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド
トリエチルアミン（３６ｍＬ、２５６ｍｍｏｌ）を、エタノール（４００ｍＬ）中の２−シアノアセトアミド（１０．８ｇ、１２８ｍｍｏｌ）および［１，４］−ジチアン−２，５−ジオール（１９．５ｇ、１２８ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。得られた反応混合物を、室温で５分間、ついで、還流温度で２時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却した後、これを濾過し、減圧下で濃縮した。ついで、残渣を、酢酸エチル（４００ｍＬ）中に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液（１Ｍ、１×２００ｍＬ）、水（２×２００ｍＬ）およびブライン（１×２００ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮して、上記標題化合物を、淡黄色固体（１６ｇ、１１３ｍｍｏｌ、８８％の収率）として得た。ＬＣ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ１４３。

ｂ）２−［３−（２，２，２−トリクロロ−エタノイル）−ウレイド］−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド
トリクロロアセチルイソシアネート（１０ｇ、５３ｍｍｏｌ）を、ピリジン（１１０ｍＬ）中の２−アミノ−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド（３．８ｇ、２６．５ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃で滴下した。得られた反応混合物を０℃で撹拌した。反応混合物の温度を、ＬＣ−ＭＳにより出発物質が残っていないことが示されるまで３時間にわたって室温に上昇させた。ジエチルエーテル（１００ｍＬ）を反応混合物に加え、得られた沈殿物を濾過し、減圧下で乾燥させて、淡灰色固体として標題化合物（８．７ｇ、２６．３ｍｍｏｌ、９９％の収率）を得た。

ｃ）５−ブロモ−２−［３−（２，２，２−トリクロロ−エタノイル）−ウレイド］−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド
Ｎ−ブロモスクシニミド（１．５６ｇ、８．８ｍｍｏｌ）を、酢酸（３０ｍＬ）およびクロロホルム（１０ｍＬ）中の２−［３−（２，２，２−トリクロロ−エタノイル）−ウレイド］−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド（２．９ｇ、８．８ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で加えた。得られた溶液を、アリコートを１０分毎にＬＣ−ＭＳ用に採取しながら、窒素雰囲気下で撹拌した。３０分後、ＬＣ−ＭＳにより、残存する出発物質は示されなかった。ジエチルエーテル（８０ｍＬ）を溶液に加え、得られた沈殿物を濾過し、減圧下で乾燥して、標題化合物を淡褐色固体（３．５ｇ、８．５５ｍｍｏｌ、９７％の収率）として得た。

ｄ）５−ブロモ−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド
炭酸ナトリウム溶液（１０％の溶液、３０ｍＬ）を、ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の５−ブロモ−２−［３−（２，２，２−トリクロロ−エタノイル）−ウレイド］−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド（１．０ｇ、２．４４ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。得られた反応混合物を、窒素雰囲気下で一晩撹拌した。溶媒の３分の１を減圧下で除去した後、反応混合物を濾過した。沈殿物を水（３×５０ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥して、標題化合物を淡褐色固体（５１０ｍｇ、２．１６ｍｍｏｌ、８９％収率）として得た。

実施例２
５−［（Ｅ）−フェニル）−エテニル］−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド５の調製
５ｍＬの反応バイアル中の無水エタノール（２ｍＬ）およびトルエン（２ｍＬ）中の５−ブロモ−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド（０．０６６ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の溶液を、酢酸カリウム（０．０５ｇ、０．５ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．０１５ｇ、５ｍｏｌ％）およびｔｒａｎｓ−２−フェニルエテニルボロン酸（０．０４１ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）で処理した。ついで、反応バイアルをシールして、９０〜９５℃に１２時間加熱した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＤＭＳＯ（５ｍＬ）中に溶解し、濾過し、Ｇｉｌｓｏｎ分取ＨＰＬＣシステムを用いて精製して、標題化合物を淡褐色固体（２９ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、４０％の収率）として得た。ＬＣ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ２８８。

実施例３
５−［（Ｅ）−２−（４−フルオロ−フェニル）−エテニル］−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドの調製
５−［（Ｅ）−２−（４−フルオロ−フェニル）−エテニル］−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドを、ｔｒａｎｓ−２−フェニルエテニルボロン酸の代わりにｔｒａｎｓ−２−（４−フルオロフェニル）ビニルボロン酸を用いて、実施例２に記載のものと類似の方法により調製した。標題化合物を、淡褐色固体（３１ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、４０％の収率）として単離した。ＥＳＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ３０６。

実施例４
５−［（Ｅ）−２−（４−クロロ−フェニル）−エテニル］−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドの調製
５−［（Ｅ）−２−（４−クロロ−フェニル）−エテニル］−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドを、ｔｒａｎｓ−２−フェニルエテニルボロン酸の代わりに、ｔｒａｎｓ−２−（４−クロロフェニル）エテニルボロン酸を用いること以外、実施例２に記載の方法を用いて調製した。標題化合物を、淡褐色固体（２８ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ、３５％の収率）として単離した。ＥＳＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ３２２。

実施例５
５−フェネチル−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドの調製
炭素担持パラジウム（１０％、０．０１ｇ）を、酢酸（１ｍＬ）およびエタノール（１ｍＬ）中の５−［（Ｅ）−スチリル）−ビニル］−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド（０．０２ｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の溶液に加え、得られた反応混合物をＰａｒｒ反応器中に置き、２０ｐｓｉのＨ_２で７２時間処理した。ついで、反応混合物を、セライトで濾過し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１００％の酢酸エチル）により精製して、標題化合物を白色固体（５ｍｇ、２５％の収率）として得た。ＥＳＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ２９０。

実施例６
５−ベンジル−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドの調製
ａ）２−アミノ−５−ベンジル−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドトリフルオロ酢酸
トリエチルアミン（０．２８ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（８ｍＬ）中の２−シアノ−アセトアミド（０．１６８ｇ、２．０ｍｍｏｌ）、硫黄（０．０６４ｇ、２．０ｍｍｏｌ）および３−フェニルプロピオンアルデヒド（０．２９ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の混合物に滴下し、得られた反応混合物を、室温に一晩撹拌した。ついで、反応混合物を濾過し、Ｇｉｌｓｏｎ分取ＨＰＬＣを用いて精製して、標題化合物を淡黄色固体（０．２５ｇ、１．０６ｍｍｏｌ、５３％の収率）として得た。ＬＣ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ２３３。

ｂ）５−ベンジル−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド
クロロスルホニルイソシアネート（０．０９ｍＬ、１．０３ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（９ｍＬ）中の２−アミノ−５−ベンジル−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド（０．２ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下０℃で滴下した。得られた撹拌反応混合物の温度を、０℃から室温に１時間にわたってゆっくりと上昇させた。ＬＣ−ＭＳにより出発物質が残っていないことが示されてから、反応を水（１ｍＬ）でクエンチし、さらに１０分間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をＤＭＳＯ（２ｍＬ）中に注ぎ、Ｇｉｌｓｏｎ分取ＨＰＬＣを用いて精製して、標題化合物を淡褐色固体（０．１６ｇ、６７％）として得た。ＬＣ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ２７６。

実施例７
５−（１−フェニル−エチル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドの調製
ａ）２−アミノ−５−（１−フェニル−エチル）−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドトリフルオロ酢酸
２−アミノ−５−（１−フェニル−エチル）−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドトリフルオロ酢酸を、３−フェニルプロピオンアルデヒドの代わりに３−フェニルブチルアルデヒドを用いて、実施例６ａに記載のものと類似の方法により調製して、標題化合物を淡褐色固体（１７％の収率）として得た。ＬＣ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ２４７。

ｂ）５−（１−フェニル−エチル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド
５−（１−フェニル−エチル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドを、２−アミノ−５−ベンジル−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドの代わりに２−アミノ−５−（１−フェニル−エチル）−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドを用いて、実施例６ｂの方法を類似の方法により調製して、標題化合物を淡褐色固体（８７％の収率）として得た。ＬＣ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ２９０。

実施例８
５−フェニルエチニル−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドの調製
ＤＭＦ（４ｍＬ）中の５−ブロモ−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド（０．２６４ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（０．００５ｇ）、トリフェニルホスフィン（０．０３０ｇ、１５ｍｏｌ％）、酢酸パラジウム（０．０１０ｇ、５％ｍｏｌ％）、トリエチルアミン（１ｍＬ）およびフェニルアセチレン（０．１ｇ、１．１ｍｍｏｌ）を、９ｍＬの反応バイアル中に加えた。反応バイアルをシールし、Ｓｍｉｔｈマイクロ波シンセサイザ中で２０分間１００℃に加熱した。水（５ｍＬ）および酢酸エチル（２０ｍＬ）を反応混合物に加え、ついで、有機相を分離し、ブライン（２×１０ｍＬ）および水（１×１０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過した後、溶媒を減圧下で除去し、粗残渣をＤＭＳＯ（５ｍＬ）中に溶解し、Ｇｉｌｓｏｎ分取ＨＰＬＣを用いて精製した。

実施例９
５−（４−フルオロフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドの調製
５−（４−フルオロフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドを、フェニルアセチレンの代わりに４−フルオロフェニルアセチレンを用いて、実施例８と同様の方法により調製して、標題化合物を淡褐色固体としてを得た。ＬＣ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ３０４。

実施例１０
５−（４−エチルフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドの調製
５−（４−エチルフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドを、フェニルアセチレンの代わりに４−エチルフェニルアセチレンを用いて、実施例８と同様の方法により調製して、標題化合物を淡褐色固体として得た。ＬＣ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ３１４。

実施例１１
５−（４−メトキシフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドの調製
５−（４−メトキシフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドを、フェニルアセチレンの代わりに４−メトキシフェニルアセチレンを用いて、実施例８と同様の方法により調製して、標題化合物を淡褐色固体として得た。ＬＣ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ３１６。

実施例１２
５−（４−クロロフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドの調製
５−（４−クロロフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドを、フェニルアセチレンの代わりに４−クロロフェニルアセチレンと用いて、実施例８と同様の方法により調製して、標題化合物を淡褐色固体として得た。ＬＣ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ３２０。

実施例１３
５−（４−トリフルオロメチルフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドの調製
５−（４−トリフルオロメチルフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸を、フェニルアセチレンの代わりに４−トリフルオロメチルフェニルアセチレンを用いて、実施例８と同様の方法により調製して、標題化合物を淡褐色固体として得た。ＬＣ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ３５４。

実施例１４
５−（３−トリフルオロメチルフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドの調製
５−（３−トリフルオロメチルフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドを、フェニルアセチレンの代わりに３−トリフルオロメチルフェニルアセチレンを用いて、実施例８と同様の方法により調製して、標題化合物を淡褐色固体として得た。［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ３５４。

実施例１５
２−アセチルアミノ−５−ブロモ−チオフェン−３−ジカルボン酸アミドの調製
ａ）２−アセチルアミノ−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド
塩化アセチル（４．２ｍＬ、５９ｍｍｏｌ）を、ピリジン（１００ｍＬ）中の２−アミノ−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド（７．７ｇ、５４．２ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で滴下した。反応混合物の温度を、出発物質がＬＣ−ＭＳに基づいて存在しなくなるまで、３時間にわたって室温に上昇させた。ついで、溶媒を減圧下で除去して、標題化合物を淡褐色固体（９．７ｇ、５２．７ｍｍｏｌ、９７．２％の収率）として得た。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］］^＋ｍ／ｚ１８５。

ｂ）２−アセチルアミノ−５−ブロモ−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド
２−アセチルアミノ−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド（３．８９ｇ、２７．４ｍｍｏｌ）を、酢酸ナトリウム（２．４７ｇ、３０．１ｍｍｏｌ）（１３６ｍＬ）の水溶液中に懸濁させた。臭素（１．４ｍＬ、２７．４ｍｍｏｌ）を溶液に滴下した。得られた溶液を窒素雰囲気下で一晩撹拌した。ＬＣ−ＭＳが出発物質が残存しないことを示してから、反応混合物を濾過し、水（５０ｍＬ）で洗浄した。ついで、濾液をＧｉｌｓｏｎ分取ＨＰＬＣにより精製して、標題化合物を淡褐色固体（１ｇ、１３．８％）として得た。ＬＣ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ２６３。

実施例１６
５−アセチルアミノ−チオフェン−２，４−ジカルボン酸４−アミド−２−［（３−クロロ−フェニル）−アミド］の調製
ＮＭＰ（４ｍＬ）中の２−アセチルアミノ−５−ブロモ−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド（０．１ｇ、０．３８ｍｍｏｌ）、ｂｉｓ−トリフェニルホスフィン塩化パラジウム（ＩＩ）（０．０１３ｇ、５ｍｏｌ％）、ジイソプロピルエチルアミン（０．１６ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、水（０．０１５ｍＬ、０．８７ｍｍｏｌ）、３−クロロアニリン（０．１２ｇ、０．７８ｍｍｏｌ）を、９ｍＬの反応バイアルに加えた。一酸化炭素を、反応混合物に一酸化炭素で満たしたプラスチック付箋により通気した。反応バイアルをシールし、９０℃で１２時間撹拌した。水（５ｍＬ）および酢酸エチル（２０ｍＬ）を反応混合物に加えて、有機相を分離し、ついで、ブライン（２×１０ｍＬ）および水（１×１０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過した後、溶媒を減圧下で除去し、粗残渣をＤＭＳＯ（５ｍＬ）中に溶解させて、Ｇｉｌｓｏｎ分取ＨＰＬＣを用いて精製して、標題化合物を淡褐色固体（０．０２０ｇ、０．１７ｍｍｏｌ、１６％の収率）として得た。ＬＣ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ３３８。

本発明は、式Ｉで示される化合物および医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。したがって、式Ｉで示される化合物は、薬物の製造において用いることができる。上記のように製造した式Ｉで示される化合物の医薬組成物は、非経口投与用溶液または凍結乾燥粉末として処方され得る。粉末は、使用前に適当な希釈剤または他の医薬上許容される担体を添加することにより復元され得る。液体製剤は、緩衝等張性水溶液であり得る。適当な希釈剤の例は、通常等張生理食塩水、標準水中５％デキストロース、または緩衝酢酸ナトリウム溶液もしくは緩衝酢酸アンモニウム溶液である。かかる製剤は、特に非経口投与に適しているが、経口投与のために使用しても、吹送法のために定量型吸入器またはネブライザーに入れてもよい。ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシア、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムのような賦形剤を添加するのが望ましい。

別法として、これらの化合物は、経口投与用に、カプセル化されても、錠剤化されても、エマルジョンまたはシロップに調製されてもよい。医薬上許容される固体または液体担体を加えて、組成物を増強または安定化させてもよく、あるいは、組成物の調製を促進することができる。固体担体としては、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム・二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天またはゼラチンが挙げられる。液体担体としては、シロップ、落花生油、オリーブ油、セイラインおよび水が挙げられる。該担体としては、また、単独またはワックスと混合したモノステアリン酸グリセリンもしくはジステアリン酸グリセリンのような徐放性物質が挙げられる。固体担体の量は様々であるが、好ましくは、１回投与あたり約２０ｍｇ〜約１ｇである。医薬製剤は、粉砕、混合、顆粒化、および、錠剤形態のために必要であれば圧縮、または、ハードゼラチンカプセル剤形態のためには粉砕、混合および充填を含む慣用の製薬技法に従って調製される。液体担体を使用する場合、該製剤は、シロップ、エリキシル、エマルジョンまたは水性もしくは非水性懸濁液の剤形である。かかる液体製剤は、直接経口投与しても、ソフトゼラチンカプセル中に充填してもよい。

典型的な吸入用組成物は、乾燥粉末、溶液、懸濁液またはエマルジョンの剤形である。投与は、例えば、乾燥粉末吸入器（例えば、米国特許第５５９０６４５号に記載されているような１回投与用または複数回投与用吸入器）により、または噴霧により、または加圧式エアロゾルの剤形であり得る。乾燥粉末組成物は、典型的には、ラクトース、トレハロースまたはデンプンのような担体を用いる。噴霧用組成物は、典型的には、ビヒクルとして水を用いる。加圧式エアロゾルは、典型的には、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、または、より好ましくは、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，１，２，３，３，３−ヘフタフルオロ−ｎ−プロパンまたはその混合物のような噴射剤を使用する。加圧式エアロゾル製剤は、溶液の剤形（おそらくエタノールのような可溶化剤を用いる）であっても、賦形剤を含まなくてもよいか、または界面活性剤および／または補助溶媒（例えば、エタノール）を含む賦形剤を用いてもよい懸濁液の剤形であってもよい。乾燥粉末組成物および懸濁液エアロゾル組成物においては、活性成分は、好ましくは、吸入に適した大きさのものである（典型的には、２０ミクロン未満、例えば、１〜１０ミクロン、特に、１〜５ミクロンのマスメジアン径（mass median diameter；ＭＭＤ）を有する）。微粒子化などによって活性成分の大きさを減少させることは必要である。

加圧式エアロゾル組成物は、一般に、バルブ、特に、計量用バルブを装着したキャニスターに装填される。キャニスターは、所望により、プラスチック材料、例えば、ＷＯ９６／３２１５０に記載されているフルオロカーボンポリマーで被覆されていてもよい。キャニスターは、バッカルデリバリーに適したアクチュエーター中に装着される。

典型的な経鼻デリバリー用組成物としては、吸入について上記したものが挙げられ、さらに、鼻用ポンプによって投与され得る、緩衝液、抗菌剤、緊張度調整剤および粘度調整剤のような慣用の賦形剤と組み合わせてもよい水のような不活性ビヒクル中の溶液または懸濁液の形態の非加圧式組成物が含まれる。

経直腸投与については、本発明の化合物をカカオ脂、グリセリン、ゼラチンまたはポリエチレングリコールのような賦形剤と配合してもよく、坐剤に成形することができる。

本発明の方法としては、式Ｉで示される化合物の局所投与、吸入投与および結腸内投与が挙げられる。局所投与とは非全身投与を意味し、本発明の化合物の表皮への外用、頬側口腔への外用、およびかかる化合物の耳、目および鼻への滴下注入が挙げられる。この場合、化合物は血流に有意には侵入しない。全身投与とは経口投与、静脈内投与、腹腔内投与および筋肉内投与を意味する。局所投与による治療的または予防的効果に必要とされる本発明の化合物（以下、活性成分と記す）の量はもちろん、選択される化合物、処置される症状の性質および重篤度、ならびに処置を受ける動物によって様々であり、最終的には医師の裁量による。

活性成分を未加工の化合物として単独で投与することも可能であるが、それを医薬製剤として提供することが好ましい。活性成分は、局所投与については、製剤の０．０１〜５．０ｗｔ％を構成する。

獣医用ならびにヒトの医療用の本発明の局所処方は、１種またはそれ以上の許容される担体および任意の他の治療成分と一緒に活性成分を含む。担体は、処方の他の成分と適合するものであり、その受容者に有害でないという意味で「許容される」ものでなくてはならない。

局所投与に適した処方としては、皮膚を通して治療が必要な部位へ浸透するのに適した液体または半液体製剤が挙げられ、例えば、リニメント、ローション、クリーム、軟膏剤またはパスタ剤、ならびに目、耳または鼻への投与に適した滴剤である。

本発明の滴剤は滅菌水性または油性溶液または懸濁液を含んでいてもよく、殺菌剤および／または殺真菌剤および／または他の適当な保存剤の適当な水溶液、好ましくは界面活性剤を含む該水溶液中に活性成分を溶解することにより調製してもよい。ついで、得られた溶液を濾過により清澄化し、適当な容器に移し、ついで、密封し、オートクレーブ処理することまたは９０〜１００℃に半時間維持することにより滅菌することができる。別法として、溶液を濾過滅菌し、無菌的方法により容器に移してもよい。滴剤に含有させるのに適した殺菌剤および殺真菌剤の例は、硝酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）および酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）である。油性溶液の調製に適した溶媒としてはグリセロール、希アルコールおよびプロピレングリコールが挙げられる。

本発明のローションは、皮膚または目への適用に適したものを包含する。眼ローションは殺菌剤を含んでいてもよい滅菌水溶液を含むことができ、滴剤の調製と同様の方法により調製してもよい。皮膚に適用するローションまたはリニメントは、アルコールまたはアセトンのような乾燥を促進し皮膚を冷却する薬剤、および／またはグリセリンのような保湿剤またはヒマシ油もしくは落花生油のような油脂を含んでいてもよい。

本発明のクリーム、軟膏剤またはパスタ剤は外用される活性成分の半固体製剤である。それらは、微粉砕形態または細粉形態の活性成分を単独で、または水性もしくは非水性流体中の溶液もしくは懸濁液として、適当な機器の助けを借りてグリース状または非グリース状基剤と混合することにより調製されうる。基剤は硬、軟もしくは流動パラフィンのような炭化水素、グリセロール、蜜ロウ、金属セッケン、粘滑剤、扁桃油、コーン油、落花生油、ヒマシ油もしくはオリーブ油のような天然起源の油脂、羊毛脂またはその誘導体、プロピレングリコールまたはマクロゴールのごときアルコールと一緒になったステアリン酸またはオレイン酸のような脂肪酸を含んでいてもよい。該製剤はソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体のような陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤または非イオン界面活性剤のような適当な界面活性剤を含んでいてもよい。天然ガム類、セルロース誘導体、またはケイ酸塩含有シリカのような有機材料のような懸濁化剤、ならびにラノリンのような他の成分が含まれていてもよい。

本発明の有用性
式Ｉで示される化合物はＩκＢのＩＫＫ−ベータキナーゼリン酸化の阻害剤として有用であり、例えば、ＮＦ−κＢ活性化の阻害剤である。本発明の方法は、該化合物の医薬組成物および医薬処方を含む該化合物の組成物および処方を利用する。

特に、本発明は、不適当なＮＦ−κＢ活性化に付随する疾患の治療方法であって、該治療を必要とする動物、特に哺乳類、最も特別にはヒトに１またはそれ以上の式Ｉで示される化合物を投与することを含む方法を提供する。本発明は、炎症性および組織修復障害、特に、関節リウマチ、炎症性大腸疾患、喘息およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）変形性関節症、骨粗鬆症および線維化疾患；皮膚病（乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線（ＵＶ）−誘発皮膚損傷を含む）、自己免疫疾患（全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、組織および臓器拒絶反応を含む）、アルツハイマー病、発作、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、ホジキンズ病を含む癌、悪液質、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む、感染症およびある種のウイルス感染症に不随する炎症、成人呼吸窮迫症候群および毛細血管拡張性運動失調症の治療方法を提供する。

急性療法に関しては、１種またはそれ以上の式Ｉで示される化合物の非経口投与が有用である。水中５％デキストロースまたは通常生理食塩水中の化合物の静脈輸液、または適当な賦形剤を伴う類似の処方が最も有効であるが、筋肉内ボーラス注射も有用である。典型的には、非経口用量は、薬物の血漿中濃度を、ＩＫＫ−ベータを阻害してＮＦ−κＢの活性化を阻害するに有効な濃度に維持するように、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ；好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｋｇであるだろう。１日の合計投与量が約０．４〜約８０ｍｇ／ｋｇ／日となるようなレベルで１日に１〜４回、当該化合物を投与する。本発明の方法に用いられる化合物の正確な治療上有効な量、およびかかる化合物が最もうまく投与される経路は、治療効果を及ぼすのに必要な濃度と薬剤の血中レベルを比較することにより当業者により容易に決定される。

薬物濃度がＩＫＫ−ベータを阻害してＮＦ−κＢの活性化を阻害するのに十分であるように、あるいは本明細書に開示した他の治療的効能を得るに十分であるように、式Ｉで示される化合物を患者に経口投与してもよい。典型的には、化合物を含有する医薬組成物を、患者の症状に合わせて、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇの経口用量で投与する。好ましくは、経口用量は約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇであろう。

薬物濃度がＩＫＫ−ベータを阻害してＮＦ−κＢの活性化を阻害するように、あるいは本明細書に開示した他の治療的効能が得られるように、式Ｉの化合物を患者に局所投与してもよい。典型的には、化合物を含有する医薬組成物を約０．０１％ｗ／ｗ〜約５％ｗ／ｗの局所処方にて投与する。

本発明の化合物を本発明に従って投与する場合には、許容されない毒物学的効果は考えられない。

本明細書に記載の化合物の、ＮＦ−κＢの活性化を阻害する能力は、それらの、ＩＫＫ−βによるＩκＢ−αのＮ−末端フラグメントのリン酸化を阻害する能力において明確に証明される。また、これらの化合物は、炎症誘発性刺激（例えば、ＴＮＦ−α、ＬＰＳ等）で細胞が活性化された場合にヒト単球および他の哺乳動物細胞におけるＩκＢ−αの分解およびＮＦ−κＢの核トランスロケーションをブロックする。さらに、これらの化合物は、ＬＰＳにより刺激されたヒト単球および刺激されたヒト一次滑膜線維芽細胞からの炎症誘発性メディエータ産生を阻害する。疾患の治療における本発明のＮＦ−κＢ阻害剤の有用性は、種々の疾患におけるＮＦ−κＢ活性化の重要性を前提としている。

ＮＦ−κＢは、ＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８のようなサイトカイン（Mukaida et al., 1990；Liberman and Baltimore, 1990；Matsusaka et al., 1993）、ＩＣＡＭおよびＶＣＡＭのような接着分子（Marui et al., 1993；Kawai et al., 1995；Ledebur and Parks, 1995）ならびに誘導性酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）（Xie et al., 1994；Adcock et al., 1994）を包含する多数の炎症誘発性メディエータの調節された発現において重要な役割を果たしている。かかるメディエータは炎症部位における白血球の動員において役割を果たすことが知られており、ｉＮＯＳの場合には、いくつかの炎症疾患および自己免疫疾患において臓器破壊を導きうる（McCartney-Francis et al., 1993；Kleemann et al., 1993）。

炎症性障害におけるＮＦ−κＢの重要な役割に関する証拠が喘息患者の研究において得られている。軽いアトピー性喘息患者から採取した気管支生検は、正常な非アトピー性対照からの生検と比較すると、粘膜下染色において、活性化されたＮＦ−κＢ、全ＮＦ−κＢ、ならびにＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαのようなＮＦ−κＢにより調節されるサイトカインに関する多くの細胞の有意な増加を示す（Wilson et al., 1998）。さらにそのうえ、ＮＦ−κＢ免疫反応性を示す血管のパーセンテージは、生検標本の上皮におけるＩＬ−８免疫反応性と同様に増加する（Wilson et al., 1998）。そのようなものとして、これらの化合物により示されたＮＦ−κＢの阻害によるＩＬ−８産生の阻害は気道炎症において有益であると予測されるであろう。

最近の研究は、ＮＦ−κＢが炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の発生においても重要な役割を果たす可能性を示唆している。活性化されたＮＦ−κＢは、クローン病患者および潰瘍性大腸炎患者からの大腸生検標本において見られる（Ardite et al., 1998；Rogler et al., 1998；Schreiber et al., 1998）。活性化は、炎症性粘膜において明らかであるが、非炎症性粘膜においては明らかでなく（Ardite et al., 1998；Rogler et al., 1998）、同じ部位におけるＩＬ−８ ｍＲＮＡ発現の増加に関連している（Ardite et al., 1998）。さらに、コルチコステロイド処理は、腸のＮＦ−κＢ活性化を強く阻害し、大腸の炎症を軽減させる（Ardite et al., 1998；Schreiber et al., 1998）。さらに、これらの化合物により示されるようなＮＦ−κＢの阻害によるＩＬ−８産生の阻害は、炎症性腸疾患において有益であると予測されるであろう。

胃腸炎症の動物モデルは、大腸炎の重要な調節因子としてのＮＦ−κＢに関するさらなる支持を提供する。活性化複合体の主要成分であるｐ６５を有するマウスの２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）誘発性大腸炎のマクロファージ固有層においてＮＦ−κＢ活性の増加が観察されている（Neurath et al., 1996；Neurath and Pettersson, 1997）。ｐ６５アンチセンスの局所投与は、処置動物において確立された大腸炎の徴候を抑止し、毒性の兆候も見られない（Neurath et al., 1996；Neurath and Pettersson, 1997）。そのようなものとして、ＮＦ−κＢの小分子阻害剤はＩＢＤの治療に有用であろう。

炎症性障害におけるＮＦ−κＢの役割に関するさらなる証拠はリウマチ様滑膜の研究から得られる。ＮＦ−κＢは、通常、不活性細胞質複合体として存在するが、最近の免疫組織学的研究により、ＮＦ−κＢは、核に存在し、それゆえヒトリウマチ様滑膜を含む細胞（Handel et al., 1995；Marok et al., 1996；Sioud et al., 1998）および該疾患の動物モデル（Tsao et al., 1997）において活性を有することが示されている。染色はＡ型滑膜細胞および血管内皮に関連したものである（Marok et al., 1996）。さらに、培養された滑膜細胞（Roshak et al., 1996；Miyazawa et al., 1998）およびＩＬ−１βまたはＴＮＦαで刺激された滑膜細胞培養物（Roshak et al., 1996；Fujisawa et al., 1996；Roshak et al., 1997）においてＮＦ−κＢの恒常的活性化が見られる。よって、ＮＦ−κＢの活性化は、炎症性滑膜に特徴的なサイトカイン産生および白血球浸潤の増加を引き起こし得る。これらの化合物の、ＮＦ−κＢを阻害してこれらの細胞による炎症誘発性メディエータ（例えば、サイトカインおよびプロスタノイド）の産生を阻害する能力は、関節リウマチにおいて利益をもたらすと予測されよう。

生物学的アッセイ：
所定の薬理学的効果を生じさせるに必要な化合物の濃度を決定するためのいくつかの生物学的アッセイの１つにおいて本発明の化合物を試験することができる。

核中のＮＦ−κＢタンパク質の存在を評価するための電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）においてＮＦ−κＢ活性を測定することもできる。目的細胞を培養して１×１０^６個／ｍＬの密度とする。遠心分離により細胞を集め、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋を含有しないＰＢＳで洗浄し、ついで、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋を含有するＰＢＳに再懸濁して１×１０^７個／ｍＬとする。化合物のＮＦ−κＢの活性化に対する影響を調べるために、細胞懸濁液を種々の濃度の薬物またはビヒクル（ＤＭＳＯ、０．１％）で３７℃において３０分処理してから、ＴＮＦ−α（５．０ｎｇ／ｍＬ）でさらに１５分処理する。細胞および核抽出物を以下のようにして調製する。簡単に説明すると、インキュベーション期間の終わりに細胞（１×１０^７個）を、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋を含有しないＰＢＳで２回洗浄する。得られた細胞ペレットをバッファーＡ（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）および０．１％のＮＰ−４０）２０μＬに再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートする。４℃にて３５００ｒｐｍで１０分間微量遠心分離することにより核をペレット化する。生じた上清を細胞抽出物として集め、核ペレットをバッファーＣ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、０．４２ＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、２５％のグリセロール、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＤＴＴおよび０．５ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ））１５μＬに再懸濁する。懸濁物を４℃で２０分間おだやかに混合し、ついで、４℃にて１４，０００ｒｐｍで１０分間微量遠心分離する。上清を集め、バッファーＤ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、５０ｍＭのＫＣｌ、２０％グリセロール、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＤＴＴおよび０．５ｍＭのＰＭＳＦ）で６０μＬに希釈する。すべての試料を分析まで−８０℃で保存する。ＢｉｏＲａｄ試薬を用いてBradfordの方法（Bradford, 1976）に従って抽出物のタンパク質濃度を決定する。

化合物の転写因子活性化に対する影響を、上記のごとく処理した細胞からの核抽出物を用いる電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）において評価する。２本鎖ＮＦ−κＢコンセンサスオリゴヌクレオチド（５’−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ−３’）をＴ_４ポリヌクレオチドキナ−ゼおよび［ｇ−^３２Ｐ］ＡＴＰで標識する。結合混合物（２５μＬ）は１０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）、４ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのジチオスレイトール、１０％グリセロール、０．３ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンおよびポリ（ｄＩ−ｄＣ）・ポリ（ｄＩ−ｄＣ）１μｇを含有する。未標識競争物質の存在下または不在下で、結合混合物（核抽出タンパク質１０μｇ）を^３２Ｐ−標識オリゴヌクレオチド０．５ｎｇとともに室温で２０分インキュベートし（５０，０００〜１００，０００ｃｐｍ）、その後、１Ｘ Ｔｒｉｓボラート／ＥＤＴＡ中で調製した４％ポリアクリルアミドゲルに混合物を添加し、２００Ｖで２時間電気泳動させる。電気泳動後、ゲルを乾燥させ、結合反応検出用フィルムに曝露する。

化合物の、ＩκＢのリン酸化に対する影響を、ウェスタンブロットにおいてモニターしてもよい。細胞抽出物を１０％ゲルによるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（BioRad, Hercules, CA）にかけ、ついで、タンパク質をニトロセルロースシート（Ｈｙｂｏｎｄ（登録商標）−ＥＣＬ；Amersham Corp., Arlington Heights,IL）に移行させる。ＩκＢαまたはＩκＢβに対して作られたポリクローナルウサギ抗体、ついで、ペルオキシダーゼを抱合しているロバ抗ウサギ二次抗体（Amersham Corp., Arlington Heights, IL）を用いてイムノブロットアッセイを行なう。エンハンストケミルミネッセンス（ＥＣＬ）アッセイ系（Amersham Corp., Arlington Heights, IL）を用いて免疫反応性バンドを検出する。

ＩκＢキナーゼに関するアッセイを以下のとおり行なった：ＩＫＫ−αをヘキサ−ヒスチジン標識タンパク質としてバキュロウイルス感染昆虫細胞中で発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティーカラムで精製した。種々の濃度の化合物またはＤＭＳＯビヒクルおよび示されたＡＴＰ（Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ）を含有するアッセイバッファー（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．７）、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＭｎＣｌ_２、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸、１０ｍＭのＮａＦ、１０ｍＭのＰＮＰＰ、０.３ｍＭのＮａ₃ＶＯ₄、１ｍＭのベンズアミジン、２μＭのＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍＬのロイペプチン、１μｇ／ｍＬのペプスタチン、１ｍＭ ＤＴＴ）中で、５０ｎｇの精製タンパク質を用いてキナーゼ活性をアッセイした。ＩκＢ−ＧＳＴ（Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA）２００ｎｇを添加して全体積を５０μＬとすることにより反応を開始させた。３０℃で１時間反応を進行させ、その後、ＥＤＴＡを添加して２０ｍＭの最終濃度とすることにより反応を終結させた。ホスホ−ＩκＢ−α（Ｓｅｒ３２）抗体（New England Biolabs, Inc., Beverly, MA）およびＥｕ^３＋標識抗ウサギＩｇＧ（Wallac Oy, Turku, Finland）を用い、解離により増強されるランタニド蛍光イムノアッセイ（Wallac Oy, Turku, Finland）によりキナーゼ活性を決定した。標準的なユーロピウムプロトコル（励起３４０ｎｍ、発光６１５ｎｍ；４００ｕｓｅｃ遅延後４００μｓ間測定した蛍光）を用い、ＶＩＣＴＯＲ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ （Wallac）にてプレートを読んだ。データを蛍光（ｃｐｓ）単位として表す。

ＩＫＫ−βをＧＳＴ標識タンパク質として発現させ、その活性を９６ウェルシンチレーション・プロキシミティー・アッセイ（ＳＰＡ）にてアッセイした。簡単に説明すると、種々の濃度の化合物またはＤＭＳＯビヒクル、２４０ｎＭのＡＴＰおよび２００ｎＣｉ[γ−³³Ｐ]−ＡＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍＬ、２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；NEN Life Science Products, Boston, MA）を含有する上記アッセイバッファーでＩＫＫ−βを希釈した（最終２０ｎＭ）。ＩκＢ−αのアミノ酸１５〜４６を含むビオチン標識ペプチド（American Peptide）を添加して最終体積５０μＬ中最終濃度２.４μＭとすることにより反応を開始させた。試料を３０℃で１時間インキュベートし、ついで、ストレプトアビジン被覆ＳＰＡ ＰＶＴビーズ（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）０.２ｍｇを含む停止バッファー（ＰＢＳ ｗ／ｏ Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｖ／ｖ）、１０ｍＭのＥＤＴＡ）１５０μＬを添加した。試料を混合し、室温で１０分間インキュベートし、遠心分離（１０００×ｇ、２分間）し、ついで、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔで測定した。

加えて、３８４−ウェルマイクロタイタープレート中にて、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を使用して組換えＧＳＴ−ＩκＢαのリン酸化によりＩＫＫ−βまたはＩＫＫ−α活性を測定する。簡単に説明すると、アッセイバッファー（１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭのＣＨＡＰＳ、１ｍＭのＤＴＴおよび０．０１％のｗ／ｖ ＢＳＡを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４）でＩＫＫ−βまたはＩＫＫ−αを最終濃度５ｎＭに希釈する。これを種々の濃度の化合物またはＤＭＳＯビヒクルに添加し、アッセイバッファー中にて２５ｎＭのＧＳＴ−ＩκＢαおよび１μＭのＡＴＰを添加して体積３０μＬとすることにより反応を開始させる。周囲温度で３０分間インキュベートした後、５０ｍＭのｐＨ７．４のＥＤＴＡ（１５μＬ）を添加することにより該反応を停止させた。最終濃度０．５ｎＭのＬＡＮＣＥユーロピウムキレート標識特異的抗ホスホセリンモノクローナル抗体（Cell signalling Technology via Perkin Elmer）および最終濃度１０ｎＭのアロフィコシアニン標識抗ＧＳＴ抗体を（Ｐｒｏｚｙｍｅ）を添加して最終体積６０μｌとすることによりリン酸化生成物の検出を行った。周囲温度で少なくとも３０分間さらにインキョベートした後、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ蛍光光度計にて信号を読み取った。

ＩＫＫ−β阻害剤の一次滑膜線維芽細胞メディエータ産生に対する効果を以下のとおり評価した：以前に開示されたようにして（Roshak et al., 1996b）、成人の関節リウマチ患者から得た滑膜を酵素消化することによりヒトＲＳＦの一次培養物を得た。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（GIBCO, Grand Island, NY）を含むEarlの最少必須培地（ＥＭＥＭ）中にて３７℃および５％のＣＯ₂で細胞を培養した。より均一なＢ型線維芽細胞集団を得るために４〜９継代の培養物を用いた。いくつかの研究には、線維芽細胞を１６ｍｍ（直径）の２４ウェルプレート（Costar, Cambridge, MA）に５×１０⁴個／ｍＬの密度で撒いた。細胞（７０〜８０％集密）を特定時間ＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍＬ）（Genzyme, Cambridge, MA）に曝露した。ＩＬ−１の添加の１５分前にＤＭＳＯビヒクル中の薬物（１％）を細胞培養物に添加した。異なるドナーからの滑膜細胞を用いて実験を３〜４回行った。上記のごとく処理した細胞からＲＳＦ細胞抽出物を得た。簡単に説明すると、ヒトＲＳＦをトリプシン／ＥＤＴＡにより取り出し、洗浄し、ついで、遠心分離により集めた。以前に開示されたようにして（Dignamet al., 1983；Osborn, et al., 1989）、細胞抽出物を調製した。簡単に説明すると、インキュベーション期間の終わりに細胞（１×１０^７個）をＣａ^２＋およびＭｇ^２＋を含まないＰＢＳ中で２回洗浄した。得られた細胞ペレットをバッファーＡ（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ）２０μＬに再懸濁した。

ＩＫＫ−β阻害の、ヒト単球により刺激されたエイコサノイドおよびサイトカイン産生に対する効果を以下のとおり評価した：以前に開示されたようにして二重勾配遠心分離によりヘパリン処理全血から単球を単離した。ついで、単離された単球が豊富なＰＢＭＣｓをＲＰＭＩ １６４０ １０％ＦＢＳ（Hyclone, Logan, Utah）中２×１０^６細胞／ｍＬとして２４ウェル培養プレートに２時間付着させてさらに単球集団を豊富化させた。ついで、培地を除去し、細胞をＲＰＭＩ １６４０で１回洗浄し、該ウェルにＲＰＭＩ １６４０ １０％ＦＢＳを添加した。該ウェルに試験化合物を最終ビヒクル濃度０．０５％のＤＭＳＯと一緒に添加した。２００ｎｇ／ｍＬのエンドトキシン（ＬＰＳ；E. coli 血清型０２６：Ｂ６）（Sigma, St. Louis, MO.）を添加することにより単球を活性化させ、２４時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡによりＴＮＦ−α（SBで開発されたＥＩＡ）、ＰＧＥ_２（Cayman Chemical, Ann Arbor, MI）ならびにＩＬ−８およびＩＬ−６（Biosource International, Camarillo, CA）について無細胞上清を分析した。トリパンブルー排除法により細胞の生存率を決定した。

ＩＫＫ−β阻害剤のホルボールエステル誘発性炎症に対する影響を以下のとおり評価した：ホルボールエステル（ＰＭＡ）をＢａｌｂ／ｃマウスの耳介外側の皮膚に適用することにより誘発された炎症応答は、多因子性炎症細胞浸潤および皮膚の炎症性変化を試験するための有用なモデルであることが証明されている。強い炎症性病変は好中球浸潤が支配的であり、それは、好中球に存在するアズール親和性顆粒酵素であるミエロペルオキシダーゼの組織濃度を測定することにより容易に定量化することができる。さらに、耳の厚みを測定することにより炎症応答の全体的な強度を測定することができる。Ｂａｌｂ／ｃマウス（１群につきｎ＝６）に薬物処置またはビヒクルを投与し、ついで、ＰＭＡ（１ツの耳につき４μｇ）を投与した。４時間後にマウスを屠殺し、耳の厚みを決定し、ＩκＢαウェスタンまたはＥＭＳＡ分析によりＮＦ−κＢ活性化をモニターした。

ＩＫＫ−β阻害剤の、ラットのカラギーナン誘発性足浮腫に対する影響を以下のとおり評価した：雄性Ｌｅｗｉｓラット（Charles River-Raleigh, NC）を飼育し、食餌と水を自由に摂取させ、各実験用に体重２００〜２７５ｇとした。カラギーナン注射の３０分〜１時間前に化合物またはビヒクル（０．５％トラガカント（経口）または１０％ＤＭＳＯ、５％ＤＭＡ、３０％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（腹腔内））を投与した。滅菌ｄＨ２Ｏ中１％カラギーナン（０.０５ｍｌ／足）を右後足の足底表面に注射することにより浮腫を誘発した。化合物またはビヒクルの投与前、および３時間後に足の厚みを測定して足の体積の変化を決定した。ＣＯ₂吸入によりラットを安楽死させ、右後足を取り外し、すぐに液体窒素中にて凍結させ、分析まで−８０℃で保存した。

マウスのコラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいてＩＫＫ−２阻害剤の効果を決定する。０日目に、処置群１つにつき１２匹の雄性ＤＢＡ／１マウス（２０〜２２グラム）を、ウシII型コラーゲン２００μｇを含有するフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）の合計１００μＬで免疫化した。２１日目に、ウシII型コラーゲン２００μｇを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００μＬをマウスにブーストした（コラーゲン／ＣＦＡまたはコラーゲン／ＰＢＳ １００μＬを尾に静脈注射した）。１日目から４０日目まで１日２回ビヒクル中のＩＫＫ−２阻害剤またはビヒクル単独を腹腔内投与した（疾患症状は２５〜２８日目に明らかに始まる）。２つのさらなる処置群は、正の対照であるエタネルセプト（Enbrel）（４ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、１日おき）とエタネルセプト・ビヒクル（ＰＢＳ）である。５０日間を通して毎日臨床症状についてマウスをスコア付けし（下記参照）、足の厚みを測定した。実験の全体にわたってスコア付けをした処置群１つにつき１２匹のマウスに加えて、疾患の経過の間のいくつかの時点で、上記のように処置したサテライトマウス（処置群１つにつき３〜５匹）を使用して足のサイトカイン／ケモカインレベルおよびｐ６５レベル、リンパ節によるリンパ節抗原召還応答による流入領域エキソビボ抗原召還応答を測定した。

関節炎の誘発：６〜８週齢の雄性Ｌｅｗｉｓラット（１６０〜１８０ｇ）の尾の基底部にパラフィン油に懸濁させたマイコバクテリウム・ブチリカム（Mycobacterium butyricum）（Difco, Detroit, MＩ）７５ｍｇを１回注射することによりＡＩＡを誘発させる。１６日目および／または２０日目に水置換法により後足の体積を測定する。試験化合物を適当なビヒクルにホモジナイズし、適当な経路により投与した。対照動物にはビヒクルだけを投与する。一般的に２つの投与プロトコルを使用する：アジュバント注射の当日に開始する予防的投与、およびいったん炎症が確立されてから１０日目に開始する治療的投与。

臨床的スコア付け
以下の規準に基づいて、足ごとに０〜４の範囲のスコアを付けた：
０＝炎症がない
１＝１本の指の腫大
２＝数本の指の腫大、足の軽い腫大
３＝数本の指の腫大、足の中程度の腫大
４＝全ての指の腫大、足の重度の腫大

限定するものではないが、本明細書に引用された特許および特許出願を含むすべての刊行物は、出典明示により本明細書に組み入れる。

上記記載は、その好ましい具体例を含む本発明を完全に開示する。本明細書に特記される具体例の修飾および改善は、特許請求の範囲内に含まれる。当業者は、さらに検討することなく、上記記載を用いて、本発明をそのすべての範囲に利用することができる。したがって、本明細書の実施例は、単なる説明として解釈されるべきであり、いかなる点においても本発明の範囲を限定するものではない。排他的所有権または特権を特許請求する本発明の具体例は、特許請求の範囲に記載する。

Claims (22)

1. 下記する式（Ｉ）：
   

   

   ［式中：
   Ｒ_１はＮＲ_４Ｒ_５であり；
   Ｒ_２は、ＣＯＮＨ_２またはＳＯ_２ＮＨ_２であり；
   Ｒ_３は、ハロゲン、Ｃ_１−４アルキル、ＮＨ_２、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＣＮ、ＣＨＯ、ＳＯ_２−アルキルおよびＮＯ_２からなる群から選択される３個までの置換基であり；
   Ｒ_４は、Ｈ、Ｃ_１−２アルキルであり；
   Ｒ_５は、Ｃ（＝Ａ）ＮＨＲ_６、ＣＯＲ_７またはＲ_６であり；
   Ａは、Ｏ、ＳまたはＮであり；
   Ｒ_６は、ＨまたはＣ_１−２アルキルであり；
   Ｒ_７はＣ_１−２アルキルであり；
   Ｌは、リンカーＤ−Ｅ−Ｄであり；
   Ｄは、結合またはＣ_１−４アルキルであり；
   Ｅは、
   

   

   ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＣＯＯ、Ｎ、Ｏ、Ｓまたは≡であり；
   ＧおよびＩは、独立して、Ｈ、Ｃ_１−２アルキルである］
   で示される化合物：ただし、２−［（アミノカルボニル）アミノ］−５−｛［（４−クロロフェニル）メチル］オキシル−３−チオフェンカルボキサミド以外である化合物またはその医薬上許容される塩。
2. Ｒ_２がＣＯＮＨ_２である、請求項１記載の化合物。
3. Ｒ_５がＣ（＝Ａ）ＮＨＲ_６である、請求項１記載の化合物。
4. ＡがＯである、請求項１記載の化合物。
5. Ｅが、
   

   

   ＣＯＮＨまたは≡である、請求項１記載の化合物。
6. 化合物が、５−［（Ｅ）−フェニル）−エテニル］−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
   ５−［（Ｅ）−２−（４−フルオロ−フェニル）−エテニル］−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
   ５−［（Ｅ）−２−（４−クロロ−フェニル）−エテニル］−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
   ５−フェネチル−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
   ５−ベンジル−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
   ５−（１−フェニル−エチル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
   ５−フェニルエチニル−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
   ５−（４−フルオロフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
   ５−（４−エチルフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
   ５−（４−メトキシフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
   ５−（４−クロロフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
   ５−（４−トリフルオロメチルフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；
   ５−（３−トリフルオロメチルフェニルエチニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−ジカルボン酸アミド；および
   ５−アセチルアミノ−チオフェン−２，４−ジカルボン酸４−アミド２−［（３−クロロ−フェニル）−アミド］
   からなる群から選択される、請求項１記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
7. 病理学的ＮＦ−κＢ活性化により特徴付けられる疾患の治療方法であって、該治療を必要とする患者に、有効量の請求項１記載の化合物を投与することにより、病理学的活性化を阻害することを含む方法。
8. 疾患が炎症性または組織修復障害である、請求項７記載の方法。
9. 疾患が、炎症性および組織修復障害、特に、関節リウマチ、炎症性大腸疾患、喘息およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）変形性関節症、骨粗鬆症および線維化疾患、皮膚病（乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線（ＵＶ）−誘発皮膚損傷を含む）、自己免疫疾患（全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、組織および臓器拒絶反応を含む）、アルツハイマー病、発作、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、ホジキンズ病を含む癌、悪液質、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む、感染症およびある種のウイルス感染症に不随する炎症、成人呼吸窮迫症候群および毛細血管拡張性運動失調症からなる群から選択される、請求項８記載の方法。
10. 疾患がＣＯＰＤである、請求項７記載の方法。
11. 疾患が喘息である、請求項７記載の方法。
12. 疾患が関節リウマチである、請求項７記載の方法。
13. 疾患が皮膚病である、請求項７記載の方法。
14. 疾患が、乾癬、アトピー性皮膚炎およびＵＶ−誘発皮膚損傷からなる群から選択される、請求項７記載の方法。
15. 疾患が、自己免疫疾患；組織および臓器拒絶反応、アルツハイマー病、発作、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、変形性関節症、骨粗鬆症および毛細血管拡張性運動失調症からなる群から選択される、請求項７記載の方法。
16. 疾患が自己免疫疾患である、請求項７記載の方法。
17. 自己免疫疾患が、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、乾癬性関節炎または強直性脊椎炎、糖尿病である、請求項９記載の方法。
18. 疾患が、癌およびまたは悪液質である、請求項７記載の方法。
19. 癌がホジキンズ病である、請求項７記載の方法。
20. 疾患が、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む、感染症およびある種のウイルス感染症に不随する炎症である、請求項７記載の方法。
21. 疾患がＡＩＤＳである、請求項７記載の方法。
22. 疾患が成人呼吸窮迫症候群である、請求項７記載の方法。