JP2005508861A - 閉塞性気管疾患の治療のためのｐｄｅ４阻害剤及び抗コリン性剤の組み合わせ物 - Google Patents

Abstract

本発明は、閉塞性気管又は他の炎症性疾患の治療における吸入経路による同時の、連続した又は別々の投与のための選択的ＰＤＥ４阻害剤及び抗コリン性剤の組み合わせ物に関する。但し、上記抗コリン性剤はチオトロピウム塩ではない。

Description

本発明は選択的ＰＤＥ４阻害剤及び抗コリン性剤の吸入される組み合わせ物に関し、ここで、抗コリン性剤はチオトロピウム塩ではない。本発明は投与のための装置を含む、医薬組成物に、及び上記組み合わせ物の使用にさらに関する。

選択的ＰＤＥ４阻害剤及び抗コリン性剤の組み合わせ物は、閉塞性気管及び他の炎症性疾患、特に閉塞性気管疾患喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）及び高められた気管支の反射作用、炎症、気管支の高反応性及び気管支痙攣により悪化された他の閉塞性気管疾患の治療において有用である。上記組み合わせは特にＣＯＰＤの治療において有用である。

本発明で治療されうる特定の疾患の例は呼吸性疾患喘息、急性呼吸窮迫症候群、慢性肺炎症性疾患、気管支炎、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺（気管）疾患及び珪肺症及びアレルギー性鼻炎及び慢性静脈洞炎の如き免疫系の疾患を含む。

３’，５’−環状ヌクレオチドフォスフォヂエステラーゼ（ＰＤＥｓ）は構造的に、生化学的に及び医薬的に互いに区別される少なくとも１１の異なるファミリーに分けられる酵素の大きなクラスを含む。それぞれのファミリー内の酵素は通常イソ酵素又はアイソザイムといわれる。１５超の遺伝子産物のすべてがこのクラス内に含まれ、そしてさらに多様性が特異なスプラシシング及びそれらの遺伝子産物の翻訳後プロセッシングから生ずる。本発明はＰＤＥｓの４のファミリーの４の遺伝子産物、すなわち、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、及びＰＤＥ４Ｄに主に関連する。これらの酵素は集合的にＰＤＥ４イソ酵素ファミリー（ＰＤＥ４ｓ）のイソ型又はサブタイプであるといわれる。

ＰＤＥ４ｓはセカンドメッセンジャー環状ヌクレオチド、アデノシン３’，５’−環状一リン酸（ｃＡＭＰ）の選択的な、高いアフィニティー加水分解により、及びロリプラムによる阻害への感受性により特徴付けられる。ＰＤＥ４ｓのいくつかの選択的阻害剤は最近発見されており、そしてその阻害から生ずる有益な医薬作用がさまざまな疾患モデルにおいて示されている：例えば、Ｔｏｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ． １０２ Ｓｕｐｐｌ．１０，７９−８４， １９９４； Ｄｕｐｌａｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３９ １２０−１２５， １９９６； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｅｈａｖ． ５０ ２１１−２１７， １９９５； Ｂａｎｎｅｒ ａｎｄ Ｐａｇｅ， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １１４ ９３−９８， １９９５； Ｂａｒｎｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２７３ ６７４−６７９， １９９５；

Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ． “Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｒｏｎｃｈｏｒｅｌａｘａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＣＰ−８０６３３， ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ４ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，” Ｃａｎ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ７５ １００１−１００８， １９９７； Ｍａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ． “Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ ｂｒｏｎｃｈｏｄｉｌａｔｏｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＫＦ１９５１４， ａ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ４ ａｎｄ １ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，” Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３３２ ９７−１０７， １９９７； ａｎｄ Ｕｋｉｔａ ｅｔ ａｌ． “Ｎｏｖｅｌ， ｐｏｔｅｎｔ， ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ−４ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｓ ａｎｔｉａｓｔｈｍａｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ： ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ １−ｐｙｒｉｄｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，” Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４２ １０８８−１０９９， １９９９を参照のこと。

抗コリン性剤は副交感神経をとおる刺激の通過から生ずる効果を妨げる。この活動はそれらの神経伝達物質アセチルコリンの作用をそのムスカリン性コリン性受容体への結合を阻害することにより阻害する能力から生ずる。少なくとも３の型のムスカリン性受容体サブタイプがある。Ｍ₁受容体は主に脳及び中枢神経系の他の組織において見られ、Ｍ₂受容体は心臓及び他の心血管組織において見られ、そしてＭ₃受容体は平滑筋及び腺組織において見られる。上記ムスカリン性受容体は例えば、平滑筋上の神経エフェクター部位に位置し、そして特に、Ｍ₃−ムスカリン性受容体は気管平滑筋に位置する。その結果、抗コリン性剤はムスカリン性受容体アンタゴニストともいわれる。

副交感神経系は気管支運動の弾力性の制御において主要な役割を果たし、そして気管支収縮は主に多様な刺激のセットにより引き起こされる副交感活動における反射作用の増大の結果である。

抗コリン性剤は、ＣＯＰＤ及び喘息の如き部分的に可逆の気管の狭まりを特徴とする慢性気管疾患の治療における使用の長い歴史を有し、そしてエピネフリンの出現前は気管支拡張薬として使用されてきた。それらはその後β−アドレナリン性剤及びメチルキサンチンにより取って代わられた。しかしながら、より最近の臭化イプラトロピウムの導入は肺疾患の治療における抗コリン性治療の使用における再来を導いた。唾液腺及び消化管の如き末梢器官系上にムスカリン性受容体があり、そしてそれゆえ体系的な活性ムスカリン性受容体アンタゴニストの使用は口腔乾燥及び便秘の如き副作用により制限される。したがって、ムスカリン性受容体アンタゴニストの気管支拡張作用及び他の有益な活動は、末梢区画と比較して肺における活性について高い治療指標を有する吸引される剤により理想的に作出される。

抗コリン性剤は、これらの剤により誘発される気管支反射作用における副交感遠心性神経の関与を反映すると考えられる、ヒスタミン、ブラヂキニン又はプロスタグランヂンＦ_2αにより誘導される気管支収縮をも部分的に拮抗する。

今般驚くべきことに、選択的ＰＤＥ４阻害剤及び抗コリン性剤の組み合わせはどちらかの剤単一での治療にまさり、閉塞性気管及び他の炎症性疾患の治療において顕著な有用性を提供することがわかった。上記組み合わせの利点は不適切な炎症の有効な抑制と共に、疾患病態学に最も適切な機構をとおして気管直径の最適な制御、すなわち、ムスカリン性受容体アンタゴニズムを提供することである。吸入される経路を介して抗コリン性剤及び選択的ＰＤＥ４阻害剤の組み合わせを投与することにより、それぞれのクラスの利点は望まれない末梢効果なしに実現される。さらに、上記組み合わせは単一で使用されるいずれかクラスの剤の最大の耐えられる用量よりもより大きな効果を作出して、予想外の相乗作用をもたらす。

本発明はそれゆえ、選択的ＰＤＥ４阻害剤及び抗コリン性剤の吸入される組み合わせ物を提供する。但し、上記抗コリン性剤はチオトロピウム塩ではない。

さらに、本発明は医薬としての使用のための選択的ＰＤＥ４阻害剤及び抗コリン性剤の吸入された組み合わせ物を提供し、ここで、上記抗コリン性剤はチオトロピウム塩ではない。

さらに、本発明は閉塞性気管又は他の炎症性疾患の治療における同時の、連続した又は別々の投与のための選択的ＰＤＥ４阻害剤及び抗コリン性剤の吸入される組み合わせ物を提供し、ここで、上記抗コリン性剤はチオトロピウム塩ではない。

さらに、本発明は閉塞性気管又は他の炎症性疾患の治療における吸入される経路による投与のための選択的ＰＤＥ４阻害剤、抗コリン性剤及び医薬として許容される賦形剤、希釈剤又は担体を含む医薬組成物を提供し、ここで、上記抗コリン性剤はチオトロピウム塩ではない。

さらに、本発明は閉塞性気管又は他の炎症性疾患の治療における吸入される経路による両方の剤の同時の、連続した又は別々の投与のための医薬の製造における選択的ＰＤＥ４阻害剤又は抗コリン性剤の使用を提供し、ここで、上記抗コリン性剤はチオトロピウム塩ではない。

さらに、本発明は上記治療の必要のある哺乳類に有効な量の選択的ＰＤＥ４阻害剤及び抗コリン性剤を吸入される経路により同時に、連続して又は別々に投与することを含む閉塞性気管又は他の炎症性疾患の治療方法を提供し、ここで、上記抗コリン性剤はチオトロピウム塩ではない。

さらに、本発明は閉塞性気管又は他の炎症性疾患の治療における選択的ＰＤＥ４阻害剤及び抗コリン性剤の同時の、連続した又は別々の投与のための吸入装置を提供し、ここで、上記抗コリン性剤はチオトロピウム塩ではない。

選択的ＰＤＥ４阻害剤はすべての他の知られたＰＤＥイソ酵素よりもＰＤＥ４イソ酵素について大きなアフィニティーを有するものである。好ましくは、本発明にしたがう選択的ＰＤＥ４阻害剤のアフィニティーは他のＰＤＥイソ酵素についてのそのアフィニティーに比較して上記ＰＤＥ４イソ酵素について少なくとも１００倍大きい。

本発明における使用に好適な選択的ＰＤＥ４阻害剤はＷＯ−Ａ−９６／３９４０８において一般的に及び特異的に開示される化合物を含む。

上記好適なＰＤＥ４阻害剤は式（Ｉ）：

｛式中、
Ｒ¹はＨ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₂−Ｃ₄）アルケニル、フェニル、−Ｎ（ＣＨ₃）₂、（Ｃ₃−Ｃ₆）シクロアルキル、（Ｃ₃−Ｃ₆）シクロアルキル（Ｃ₁−Ｃ₃）アルキル又は（Ｃ₁−Ｃ₆）アシルであり、ここで、上記アルキル、フェニル又はアルケニル基は２までの−ＯＨ、（Ｃ₁−Ｃ₃）アルキル又は−ＣＦ₃基又は３までのハロゲンで置換されうる；

Ｒ²及びＲ³はＨ、（Ｃ₁−Ｃ₁₄）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₇）アルコキシ（Ｃ₁−Ｃ₇）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₁₄）アルケニル、（Ｃ₃−Ｃ₇）シクロアルキル、（Ｃ₃−Ｃ₇）シクロアルキル（Ｃ₁−Ｃ₂）アルキル、ヘテロ原子として１又は２の酸素、硫黄、スルフォニル、窒素及びＮＲ⁴から成る基（ここで、Ｒ⁴はＨ又は（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルである）を含み、ｎが０、１又は２である飽和又は不飽和（Ｃ₄−Ｃ₇）ヘテロ環状（ＣＨ₂）_n基；又は以下の式（ＩＩ）の基：

｛式中、ａは１〜５の整数であり；ｂ及びｃは０又は１であり；Ｒ⁵はＨ、−ＯＨ、（Ｃ₁−Ｃ₅）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₅）アルケニル、（Ｃ₁−Ｃ₅）アルコキシ、（Ｃ₃−Ｃ₆）シクロアルコキシ、ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＣＯ₂Ｒ⁶、−ＣＯＮＲ⁶Ｒ⁷、−ＮＲ⁶Ｒ⁷、−ＮＯ₂又は−ＳＯ₂ＮＲ⁶Ｒ⁷であり、ここで、Ｒ⁶及びＲ⁷はそれぞれ独立にＨ又は（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルである；Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ₂−、−ＣＯ−又は−Ｎ（Ｒ⁸）−であり、ここでＲ⁸はＨ又は（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルであり；及びＹは場合により２までの（Ｃ₁−Ｃ₇）アルキル又は（Ｃ₃−Ｃ₇）シクロアルキル基で置換される（Ｃ₁−Ｃ₅）アルキレン又は（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニレンであり；ここで、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アルコキシアルキル又はヘテロ環状基のそれぞれは１〜１４、好ましくは１〜５の（Ｃ₁−Ｃ₂）アルキル、ＣＦ₃又はハロ基で置換されうる｝
から成る群からそれぞれ独立に選ばれ；及びＲ⁹及びＲ¹⁰はそれぞれ独立にＨ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₆−Ｃ₁₀）アリール及び（Ｃ₆−Ｃ₁₀）アリールオキシから成る群からそれぞれ独立に選ばれる｝により表される化合物
又はその医薬として許容される塩又は溶媒和物を含む。

式（Ｉ）の好ましい化合物はＲ¹がメチル、エチル又はイソプロピルであるもの、及びＲ³が（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル、（Ｃ₃−Ｃ₇）シクロアルキル、（Ｃ₃−Ｃ₇）シクロアルキル（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル又は場合によりＨ、−ＯＨ、（Ｃ₁−Ｃ₅）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₅）アルケニル、（Ｃ₁−Ｃ₅）アルコキシ、ハロゲン、トリフルオロメチル、−ＣＯ₂Ｒ⁶、−ＣＯＮＲ⁶Ｒ⁷、−ＮＲ⁶Ｒ⁷、−ＮＯ₂又は−ＳＯ₂ＮＲ⁶Ｒ⁷から成る群の１又は２で置換されるフェニルであるものを含み、ここで、Ｒ⁶及びＲ⁷はそれぞれ独立にＨ又は（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルである。

式（Ｉ）の好ましい個々の化合物は：
９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−フェニル−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン；
９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（フラン−２−イル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン；
９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（２−ピリヂル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン；
９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（４−ピリヂル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン；

９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（３−チエニル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン；
３−ベンジル−９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン；
９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−プロピル−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン；
３，９−ヂシクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン；

９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（１−メチルシクロヘクス−１−イル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン；

３−（第三−ブチル）−９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン；
９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（２−メチルフェニル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン；
９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（２−メトキシフェニル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン；

９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（チエン−２−イル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン；
３−（２−クロロフェニル）−９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン；

９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（２−ヨードフェニル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン；
９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（２−トリフルオロメチルフェニル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン；及び
５，６−ヂヒドロ−７−エチル−９−（４−フルオロフェニル）−３−（１−メチルシクロヘクス−１−イル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン；
並びにそれらの医薬として許容される塩及び溶媒和物を含む。

本発明における使用のための特に好ましい選択的ＰＤＥ４阻害剤は９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（２−チエニル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン及び９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（第三−ブチル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン及びそれらの医薬として許容される塩及び溶媒和物を含む。

本発明における使用のための好適な抗コリン性剤はイプラトロピウム又はオキシトロピウム塩を含む。

チオトロピウム塩（ＥＰ４１８７１６Ｂ１を参照のこと）は以下の式（１．１）の構造：

｛式中、Ｘ^-は生理学的に許容される陰イオンである｝を有する。

イプラトロピウム塩（ＥＰ３０９４６４Ｂ１を参照のこと）は以下の式（１．２）の構造：

｛式中、Ｘ^-は生理学的に許容される陰イオンである｝を有する。

オキシトロピウム塩（ＥＰ５７９６１５Ｂ１）は以下の式（１．３）の構造：

｛式中、Ｘ^-は生理学的に許容される陰イオンである｝を有する。

イプラトロピウム及びオキシトロピウムの好適な塩形の例はフルオリド、Ｆ^-；クロリド、Ｃｌ^-；ブロミド、Ｂｒ^-；ヨーディド、Ｉ^-；メタンスルフォネート、ＣＨ₃Ｓ（＝Ｏ）₂Ｏ^-；エタンスルフォネート、ＣＨ₃ＣＨ₂Ｓ（＝Ｏ）₂Ｏ^-；メチルサルフェート、ＣＨ₃ＯＳ（＝Ｏ）₂Ｏ−；ベンゼンスルフォネート、Ｃ₆Ｈ₅Ｓ（＝Ｏ）₂Ｏ^-；及びｐ−トルエンスルフォネート、４−ＣＨ₃−Ｃ₆Ｈ₅Ｓ（＝Ｏ）₂Ｏ^-である。上記臭化塩形は好ましい。

本発明における使用のための選択的ＰＤＥ４阻害剤及び抗コリン性剤の特定の好ましい組み合わせは：
９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（２−チエニル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン又はその医薬として許容される塩若しくは溶媒和物及びイプラトロピウム塩又はその溶媒和物；
９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（第三−ブチル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン又はその医薬として許容される塩若しくは溶媒和物及びイプラトロピウム塩又はその溶媒和物；

９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（２−チエニル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン又はその医薬として許容される塩若しくは溶媒和物及びオキシトロピウム塩又はその溶媒和物；及び
９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（第三−ブチル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン又はその医薬として許容される塩若しくは溶媒和物及びオキシトロピウム塩又はその溶媒和物を含む。

本発明にしたがって使用される選択的ＰＤＥ４阻害剤又は抗コリン性化合物は場合により医薬として許容される塩又は溶媒和物の形態で利用されうる。上記塩は酸添加又は塩基性塩でありうる。

好適な酸添加塩は非毒性塩を形成する酸から形成され、そして例は塩酸、臭化水素酸、ヨー化水素酸、硫酸、重硫酸、硝酸、リン酸、リン酸水素酸、酢酸、マレイン酸、フマル酸、乳酸、酒石酸、クエン酸、グルコン酸、琥珀酸、糖酸、ベンゾエート、メタンスルフォン酸、エタンスルフォン酸、ベンゼンスルフォン酸、ｐ−トルエンスルフォン酸及びパモエート塩である。

好適な塩基性塩は非毒性塩を形成する塩基から形成され、そして例はナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛及びヂエタノールアミン塩である。

好適な塩の概要のために、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， ６６，１−１９，１９７７を参照のこと。

本発明にしたがって使用される選択的ＰＤＥ４阻害剤及び抗コリン性化合物又はその塩の医薬として許容される溶媒和物はその水和物を含む。

本発明に係る選択的ＰＤＥ４阻害剤及び抗コリン性化合物は１以上の同質異像形で存在しうる。

本発明に係る選択的ＰＤＥ４阻害剤及び抗コリン性剤（それゆえ、前に「本発明に係る化合物」）は１以上の不斉炭素原子を含むことができ、そしてそれゆえ、２以上の立体異性体形で存在する。上記化合物がアルケニル又はアルケニレン基を含む場合、シス／トランス（又はＺ／Ｅ）異性も起こりうる。本発明は本発明に係る化合物のこれらの個々の立体異性体及び、好適な場合には、それらの混合物と共に、その個々の互変異性体を含む。

ヂアステレオアイソマー又はシス及びトランス異性体の分離は慣用の技術により、例えば、本発明に係る化合物又はその好適な塩若しくは誘導体の分別結晶化、クロマトグラフィー又はＨ．Ｐ．Ｌ．Ｃ．により達成されうる。本発明に係る化合物の個々のエナンチオマーは、好適に、対応する光学的に純粋な中間体から又は好適なキラル支持を用いた対応するラセミ体のＨ．Ｐ．Ｌ．Ｃ．による若しくは対応するラセミ体を好適な光学活性酸又は塩基と反応させることにより形成されるヂアステレオアイソマー塩の分別結晶化によるような分解により調製されうる。

本発明は本発明に係る化合物又はその医薬として許容される塩の全ての好適な同位体変形を含む。本発明に係る化合物又はその医薬として許容される塩の同位体変形は少なくとも１の原子が天然に通常見られるのと同じ原子数を有するが、異なる原子量を有する原子により置換されるものとして定義される。本発明に係る化合物又はその医薬として許容される塩に導入されうる同位体の例は、それぞれ、²Ｈ、³Ｈ、¹³Ｃ、¹⁴Ｃ、¹⁵Ｎ、¹⁷Ｏ、¹⁸Ｏ、³¹Ｐ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、¹⁸Ｆ及び³⁶Ｃｌの如き、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素及び塩素の同位体を含む。本発明に係る化合物及びその医薬として許容される塩のいくつかの同位体変形、例えば、³Ｈ又は¹⁴Ｃの如き放射活性同位体が導入されるものは薬物及び／又は基質組織分布研究において有用である。トリチウム化された、すなわち、³Ｈ及び炭素−１４、すなわち、¹⁴Ｃ同位体はそれらの調製及び検出の容易さのために特に好ましい。さらに、重水素、すなわち、²Ｈの如き同位体での置換は、より大きな代謝安定性、例えば、増大したｉｎ ｖｉｖｏ半減期又は減少した用量必要性から生ずるある治療的利点を与えることができ、それゆえ、ある状況において好まれうる。

本発明に係る組み合わせ物を用いて治療されうる疾患の型は、非限定的に、喘息、慢性又は急性気管支収縮、慢性気管支炎、小気管閉塞、気腫、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、それに関連した慢性気管支炎、肺気腫又は呼吸困難を有するＣＯＰＤ、及び不可逆性の、進行性の気管閉塞により特徴付けられるＣＯＰＤを含む。

喘息
本発明に係る治療用剤の組み合わせ物で治療されうる最も重要な呼吸疾患の１は喘息、慢性の、ますます世界的によくある通常の疾患であり、そして間欠性の可逆の気管閉塞、気管高反応性及び炎症を特徴とする。喘息の原因はまだ決定されていないが、喘息の最も通常の病理学的発現は気管の炎症であり、それは軽い喘息を有する患者の気管においてでさえも顕著でありうる。この炎症は血漿タンパク質の管外遊出をもたらす反射的な気管事件、呼吸困難及び気管支収縮を起こす。気管支生検及び洗浄研究に基づいて、喘息はマスト細胞、好酸球、及びＹ−リンパ球による患者の気管への浸潤を含むことが明らかに示された。アトピー性喘息における気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）はＴ−ヘルパ−２（Ｔｈ−２）様Ｔ−細胞集団の存在を示唆する、インターロイキン（ＩＬ）−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５及び顆粒球／マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の活性化を示す。

本発明に係る治療用剤の組み合わせ物はアトピー性及び非アトピー性喘息の治療において有用である。上記用語「アトピー」は通常の環境抗原に対するＩ型（中間）高感受性反応の発展に対する遺伝的素因をいう。上記最も通常の臨床的現れはアレルギー性鼻炎であり、一方で気管支喘息、アトピー性皮膚炎、及び食物アレルギーはより少ない頻度で起こる。したがって、上記表現「アトピー性喘息」は、本明細書中で使用されるとき、敏感にされた人におけるアレルギーの現れである、「アレルギー性喘息」、すなわち、気管支喘息と同義語であると意図される。上記用語「非アトピー性喘息」は、本明細書中で使用されるとき、激しい運動、刺激性の粒子、心理学的ストレス等を含むさまざまな因子により引き起こされる、全ての他の喘息、特に、重要な又は「真性」喘息をいうと意図される。

慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）
本発明に係る治療用剤の組み合わせ物は慢性気管支炎、肺性気腫又はそれに関連する呼吸困難を含むＣＯＰＤ又はＣＯＡＤの治療においてさらに有用である。ＣＯＰＤは不十分に可逆な、進行性の気管閉塞により特徴付けられる。慢性気管支炎は大きな軟骨性の気管における粘膜下組織の粘液分泌腺の過形成及び肥大に関連する。杯状細胞の過形成、粘膜及び粘膜下組織の炎症性細胞の浸潤、浮腫、線維症、粘液栓及び増大した平滑筋は終末及び呼吸細気管支においてすべて見られる。上記小気管は気管閉塞の主な部位であることが知られている。気腫は肺胞壁の破壊及び肺の弾性の損失により特徴付けられる。いくつかの危険因子はＣＯＰＤの発病に関連していることが同定されている。タバコ喫煙及びＣＯＰＤの間の関係はよく確立されている。他の危険因子は炭塵への暴露及びさまざまな遺伝的因子を含む。Ｓａｎｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ，” Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ． １０ １３８０−１３９１， １９９７を参照のこと。ＣＯＰＤの発病率は増大しており、そしてそれは産業化された国民集団への顕著な経済的負担を示す。

ＣＯＰＤはまた不能を伴わない単純な慢性気管支炎から慢性呼吸不全を伴う重篤な不能状態における患者までの広い範囲の変形をそれ自体臨床的に示す。

ＣＯＰＤは喘息の場合には、気管の炎症を特徴とするが、患者の気管支肺胞の洗浄液及び痰において見られていた炎症性細胞は好酸球よりもむしろ好中球及びマクロファージである。ＩＬ−８、ＬＴＢ₄、及びＴＮＦ−αを含む、炎症性仲介物質の高い値はまたＣＯＰＤ患者においても見られ、そして上記患者の気管支の表面上皮及び上皮下組織はＴ−リンパ球及びマクロファージにより浸潤されていることがわかった。ＣＯＰＤ患者のための症状の軽減はβアゴニスト及び抗コリン性気管支拡張剤の使用により提供されうるが、疾患の進行は変更されないままである。ＣＯＰＤはテオフィリンを用いて治療されてきたが、部分的にはその望まれない効果を産出する傾向のために大きな成功はなかった。ステロイドはまた、それらが抗炎症性剤として比較的効果がないのでＣＯＰＤにおける満足のいく治療剤としての大きな期待を保ち得なかった。

したがって、ＣＯＰＤ及びその関連する及び含まれる閉塞性気管疾患を治療するための本発明に係る治療用剤の組み合わせの使用は本分野において顕著な前進を示す。本発明は上記所望の治療目的が本発明に係る治療用剤の組み合わせ物を利用することにより得られている方法について特定の作用モード又は仮説に限定されない。

気管支炎及び気管支拡張
本発明に係る治療用剤の組み合わせ物の所有する上記に示した特定の及びさまざまな阻害活性にしたがって、それらは、例えば、短いが重篤な過程を有し、冷所への暴露、刺激性物質の吸い込み又は急性感染により引き起こされる急性気管支炎；多量の粘膜膿性排出物を伴う急性気管支炎の形であるカタル性気管支炎；急性気管支炎又は咳き込みの発作により、少量の又は多量の痰を吐くことにより、及び肺組織の二次的な変化により特徴付けられる慢性の一般的な疾患の繰り返しの発作のために休止の段階後に再発する顕著な傾向がいくらかある長く続く気管支炎の形である慢性気管支炎；粘着性の痰の少量の分泌により特徴付けられる乾燥気管支炎；喘息を有する者における呼吸管感染に伴う気管支痙攣の症状の発展により特徴付けられる症候群である感染性喘息気管支炎；増殖的な咳に関連した気管支炎である増殖的気管支炎を含む、どんな型、病因又は病原の気管支炎の治療においても有用である。

アトピー性喘息又は非アトピー性喘息、ＣＯＰＤ又は他の慢性炎症性気管疾患を治療するための本発明に係る治療用剤の組み合わせの使用は確立され、以下に示される血漿管外遊出及び気管支拡張モデルを含む気管における反射性事件の阻害の分野において知られるいくつかの異なるモデルの使用により示されうる。

気管支拡張薬活性−ｃＡＭＰは平滑筋弛緩に関連するのみでなく、気管平滑筋増殖に対する全体的な阻害効果を発揮し、その両方は本発明に係るＰＤＥ４成分によるｃＡＭＰの高めから生じうる。気管平滑筋肥大及び過形成はｃＡＭＰにより調節されることができ、そしてこれらの状態は慢性喘息の通常の形態学的特徴である。

Ｉｎ Ｖｉｔｒｏにおける気管拡張性活性−モルモット気管平滑筋の弛緩を引き起こす本発明に係る治療用剤の組み合わせの能力は以下の試験手順において示される。モルモット（３５０−５００ｇ）をペントタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）で殺す。上記気管を切り出し、そして２〜３ｃｍの長さの区画を摘出する。上記気管を３〜５ｃｍの深さの組織の輪を与えるよう代替の軟骨プレートで横の面で切開する。中央部及び末端の輪は捨てる。個々の輪はステンレススチール支持上に垂直にのせ、その１を器官浴の基礎で固定し、その一方で他方は等体積の変換機に結合する。上記輪をＫｒｅｂｓ溶液（組成 μＭ：ＮａＨＣＯ₃ ２５；ＮａＣｌ １１３；ＫＣｌ ４．７；ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １．２；ＫＨ₂ＰＯ₄ １．２；ＣａＣｌ₂ ２．５；グルコース １１．７）中に３７℃で浸け、Ｏ₂／ＣＯ₂（９５：５， ｖ／ｖ）で気体化する。この様式において調製される輪は電場刺激により収縮される。鎮痙活性を確かめるために、本発明に係る治療用剤の試験の組み合わせ物を生理学的食塩水中に溶解し、そして累積濃度−効果曲線を提供するために５ｍ間隔で器官浴に増大する量で添加する。

上記試験モデルにおいては、本発明に係る治療用剤の組み合わせ物は０．００１〜１．０μＭの範囲の濃度でモルモット気管輪調製物の電場刺激された収縮を阻害する。

オゾン誘導気管高反応性モデル−本発明に係る治療用剤の組み合わせ物の、気管支高活性としても知られる、有害な刺激への気管の増大する反応性を妨げる能力はモルモットにおける肺の反応性の活性に対するこれらの剤の効果の決定において示される。成体モルモット（３００〜６００ｇ）をＹｅａｄｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９２， Ｐｕｌｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ５， １０１−１１２にしたがって前処理し、調製する。さまざまな刺激への気管の反応性は基礎の状態で及び肺の機構における変化をもたらすさまざまな介入の後モニターされる。試験物質はチャレンジの前にさまざまな時間に、ｉ．ｔ．又はエーロゾルにより投与された。コントロール動物におけるオゾン前処理は肺反応性における３〜１００×増大をもたらし、それは本発明に係る治療用剤の組み合わせ物により用量依存的に妨げられた。

上記試験モデルにおいて、本発明に係る治療用剤の組み合わせ物は０．００１〜０．３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｔ．の範囲の投与で抗炎症性活性を示す。

ヒト気管支の弛緩−癌の手術の間に切除されたヒト肺のサンプルを除去から３日後以内に得る。小気管支（内径〜２〜５ｍｍ）を摘出し、切片に切り分け、そして１．８Ｍヂメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）及び０．１Ｍスクロースを凍結保護剤として含むウシ胎児血清（ＦＣＳ）で満たした２ｍｌの液体窒素貯蔵アンプル中に置く。上記アンプルをポリスチロール箱（１１×１１×２２ｃｍ）中に置き、そして−７０℃で維持されたフリーザー中で約０．６℃／分の平均冷却速度でゆっくり凍結する。３〜１５時間後、上記アンプルを液体窒素（−１９６℃）中に移し、そこで、それらは使用されるまで貯蔵される。使用前に、上記組織を３０〜６０分間−７０℃に暴露し、その後３７℃の水浴中に上記アンプルを置くことにより２．５分以内に溶かす。その後、上記気管支切片を３７℃でＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液（μＭ：ＮａＣｌ １１８， ＫＣｌ ４．７， ＭｇＳＯ₄ １．２， ＣａＣｌ₂ １．２， ＫＨ₂ＰＯ₄ １．２， ＮａＨＣＯ₃ ２５， ｇｌｕｃｏｓｅ １１， ＥＤＴＡ ０．０３）を含むディッシュ中にそれらを置くことによりすすぎ、輪に切り分け、そして約１ｇの前ロードの下で記録しながら等体積緊張のためにの１０ｍｌの器官浴中に懸濁する。緊張におけるさらなる増大は、気管サンプルにおける神経の活性化を誘導し、そしてアセチルコリン及び他の神経由来の仲介物質の放出を介して緊張を産出すると知られる、電場刺激の使用を介して誘導される。濃度応答曲線は累積添加により産出され、上記最大の効果が前の濃度により産出されたときそれぞれの濃度が添加される。パパベリン（３００μＭ）を気管支輪の完全な弛緩を誘導するために濃度応答曲線の終末で添加する。この効果は１００％弛緩としてとられる。

上記試験モデルにおいて、本発明に係る治療用剤の組み合わせは５．０ｎＭ〜５００ｎＭの範囲内での濃度で活性である好ましい態様で、０．００１〜１．０μＭの範囲の濃度でのヒト気管支輪調製物の濃度関連弛緩を産出する。

カプサイシン誘導気管支収縮の抑制−実験前に食餌及び水を自由に摂取できる雄Ｄｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（４００〜８００ｇ）をフェノバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ． ［腹腔内］）で麻酔する。動物を、直腸サーモメーターにより制御される暖めたパッドで３７℃で保ち、空気及び酸素（４５：５５ ｖ／ｖ）の混合物で管カニューレ（約８ｍｌ／ｋｇ、１Ｈｚ）を介して人工呼吸をする。人工呼吸を呼吸ポンプとつながった差圧変換機に接続された呼吸タコグラフにより器官でモニターする。胸腔内の圧変化を、差圧変換機を用いて、胸部内カニューレを介して直接モニターするので、気管及び胸部の間の圧の差が計測され示されうる。空気流及び肺を介する圧のこれらの計測から、空気抵抗（Ｒ₁ ｃｍＨ₂０／Ｉ／ｓ）及びコンプライアンス（Ｃｄ_dyn）をそれぞれの呼吸周期についてデジタル電気呼吸分析器で計算する。血圧及び心拍を圧変換機を用いて頸動脈から記録する。

基礎抵抗及びコンプライアンスについての値が安定であるとき、気管支収縮の急性発現がカプサイシンの静脈内ボーラスにより誘導される。カプサイシンは１００％エタノール中に溶解され、そしてリン酸緩衝塩水で希釈される。本発明に係る治療用剤の試験の組み合わせは、１０分間の間隔で２〜３の上記投与の後であると計算される、カプサイシンへの応答が安定であるとき投与される。気管支収縮の反転は管内又は十二指腸内点滴注入又は静脈内ボーラス注入に続いて１〜８時間にわたり評価される。気管支拡張性活性はカプサイシンの融合に続いてはじめの、最大の抵抗（Ｒ_D）のａ％阻害として表現される。ＥＤ₅₀値はカプサイシンにより誘導される抵抗における増大の５０％減少を引き起こす用量を示す。活性の長さは気管支収縮が５０％以上減少される時間として分で定義される。血圧（ＢＰ）及び心拍（ＨＲ）への影響はＥＤ₂₀値；すなわち、投与５分後に計測されるＢＰ又はＨＲを２０％減少させる用量により特徴付けられる。

上記試験モデルにおいて、本発明に係る治療用剤の組み合わせは０．００１〜０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｔ．［管内］の範囲の投与値で気管支拡張活性を示す。さらに、ｉ．ｔ．でデリバリーされる組み合わせは気管支痙攣に対して少なくとも追加の阻害効果を示し、それぞれの成分単一は観察されたコントロール応答の５０％超阻害することができる。

ＬＰＳ誘導肺好中球増加症−肺内の好中球の補充及び活性化はＣＯＰＤにおいて及び重篤な喘息において重要な病理学的特徴と考えられている。その結果、動物におけるこれらの終点のどちらか又は両方の阻害は本発明の利用性の支持的な証拠を提供する。

雄Ｗｉｓｔａｒ−Ａｌｂｉｎｏラット（１５０〜２５０ｇ）又は雄Ｄｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（４００〜６００ｇ）を短い一般的な麻酔の下で吸入又は管内（ｉ．ｔ．）点滴注入により試験物質単一で又は組み合わせで前処理する。化合物投与後１〜２４時間後、動物を著しい肺好中球増加症を続く１〜２４時間にわたり誘導するのに十分な菌リオポリサッカライド（ＬＰＳ）の吸入エーロゾルでチャレンジする。上記好中球は気管支洗浄における細胞計測により又は肺洗浄又は組織における好中球産物の決定により評価される。この試験系において、本発明に係る治療用剤は０．０００１〜０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｔ．の範囲の用量で抗炎症活性を示す。予想外に、ｉ．ｔ．でデリバリーされた組み合わせは、上記成分の１はそれ自体顕著な抗炎症作用を発揮しないという事実にもかかわらず、少なくとも炎症に対する追加の効果を発揮する。さらに、高用量の１の成分の当量の抗炎症作用は本発明において組み合わせで使用されるとき低容量で観察されることができ、したがって、体系的な所望されない効果を最小限にする。

アレルギー性モルモット分析−呼吸困難および気管支痙攣の症状、すなわち、困難な又は苦しい呼吸及び増大した肺の抵抗に対する、及び炎症の症状、すなわち、肺好中球増加症及び好酸球増加症に対する本発明に係る治療用剤の組み合わせの治療の影響を評価するための試験はＤｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（４００〜６００ｇ体重）を利用する。

本試験において使用される卵アルブミン（ＥＡ）、グレードＶ、結晶化され凍結乾燥された、水酸化アルミニウム及びマレイン酸メピラミンは商業的に入手可能である。上記チャレンジ及び続く呼吸記録は１０×６×４インチの内径を有する透明プラスティック箱内で行われる。上記箱の頭部及び体部区画は分離可能である。使用において上記２は留め金でしっかりと一緒にとめられ、そしてチャンバー間の気密密閉は柔らかいゴムのガスケットにより維持される。上記チャンバーの頭部の端の中心をとおして噴霧器が気密密閉を介して挿入され、そして上記箱のそれぞれの端ははけ口を有する。呼吸タゴグラフは上記箱の１の端に挿入され、そして適切な連結器をとおしてダイノグラフに連結される体積測定圧変換機に連結される。上記抗原をエーロゾルする間、上記はけ口は開いており、そして呼吸タコグラフはチャンバーから離される。上記はけ口をその後閉め、そして上記呼吸タコグラフ及び上記チャンバーを呼吸パターンの記録の間つなげる。チャレンジについて、塩水中２ｍｌの３％抗原溶液をそれぞれの噴霧器中に置き、そして上記エーロゾルを１０ｐｓｉ及び８ｌ／分の流速で操作する小膜ポンプからの空気で作出する。

モルモットを塩水中に１ｍｇのＥＡ及び２００ｍｇの水酸化アルミニウムを含む１ｍｌの懸濁物を皮下に及びｉ．ｐ．で注入することにより感作する。それらを感作後１２〜２４日の間使用する。上記応答のヒスタミン成分を減少させるために、モルモットをエーロゾルチャレンジの３０分前に２ｍｇ／ｋｇのメピアルミンでｉ．ｐ．で前処理する。モルモットをその後正確に１分間塩水中３％ＥＡのエーロゾルに暴露し、その後呼吸特性をさらなる３０分間記録する。続いて、肺炎症を１〜４８時間にわたり死後決定する。連続する呼吸困難の長さを呼吸記録から計測する。

本発明に係る治療用剤のテストの組み合わせ物は一般的にｉ．ｔ．又はエーロゾルによりチャレンジの０．５〜４時間前に投与される。化合物の組み合わせは塩水又は生物和合性溶媒中に溶解される。上記化合物の活性は媒体処理コントロールの群に比較して、それらの呼吸困難及び気管支痙攣の症状の強さ及び長さ及び／又は肺炎症の強さを減少させる能力に基づいて決定される。本発明に係る治療用剤の組み合わせの試験は一連の用量にわたり評価され、そして症状の長さを５０％阻害するであろう用量（ｍｇ／ｋｇ）として定義されるＥＤ₅₀が得られる。

抗炎症活性−本発明に係る治療用剤の組み合わせの抗炎症活性は好酸球又は好中球活性の阻害により示される。本分析において、血液サンプル（５０ｍｌ）を０．０６〜０．４７×１０⁹Ｌ^-1の範囲の好酸球数の非アトピー性ヴォランティアから回収する。静脈血を５ｍｌのクエン酸三ナトリウム（３．８％，ｐＨ７．４）を含む遠心管に回収する。

抗凝集血をリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ、カルシウム及びマグネシウムのどちらも含まない）で希釈し（１：１、ｖ：ｖ）、そして、５０ｍｌの遠心管中で１５ｍｌの等張Ｐｅｒｃｏｌｌ（密度 １．０８２−１．０８５ｇ／ｍｌ，ｐＨ７．４）上に層にする。遠心分離（３０分間、１０００×ｇ、２０℃）に続いて、血漿／Ｐｅｒｃｏｌｌ界面の単核細胞を慎重に吸引し、捨てる。

上記好中球／好酸球／赤血球ペレット（容積でｃａ．５ｍｌ）を３５ｍｌの等張塩化アンモニウム溶液（ＮＨ₄Ｃｌ、１５５ｍＭ；ＫＨＣＯ₃，１０ｍＭ；ＥＤＴＡ．０．１ｍＭ；０〜４℃）中におだやかに再懸濁する。１５分後、細胞をウシ胎児血清（２％ ＦＣＳ）を含むＰＢＳ中で２回（１０分間、４００×ｇ、４℃）洗浄する。

磁気細胞分離系を好酸球及び好中球を分離するのに使用する。この系は界面マーカーにしたがって懸濁物中で細胞を分離することができ、そして磁化可能スチールマトリックスを含むカラムがその中に置かれる永久磁石を含む。使用前に、上記カラムをＰＢＳ／ＦＣＳで１時間平衡化し、そしてその後２０ｍｌのシリンジを介して逆行基礎上で氷冷ＰＢＳ／ＦＣＳでフラッシュする。２１Ｇの皮下針を上記カラムの基礎に結合し、そして１〜２ｍｌの氷冷緩衝液を上記針をとおして流出させる。

顆粒球の遠心分離に続いて、血清を吸引し、そして細胞を１００μｌ磁気粒子（スーパーパラマグネティック粒子に結合された抗ＣＤ１６モノクローナル抗体）でおだやかに再懸濁する。上記好酸球／好中球／抗ＣＤ１６磁気粒子混合物を氷上で４０分間インキュベートし、そしてその後氷冷ＰＢＳ／ＦＣＳで５ｍｌまで希釈する。上記細胞懸濁物を上記カラムの上部にゆっくり導入し、そしてタップを開けて細胞を上記スチールマトリックス内へゆっくり移動させる。上記カラムをその後ＰＢＳ／ＦＣＳ（３５ｍｌ）で洗浄し、それを上記スチールマトリックス中に既にトラップされた磁気的に標識された好中球を乱さないように、上記カラムの上部に慎重に添加する。非標識化好酸球を５０ｍｌ遠心管中に回収し、そして洗浄する（１０分間、４００×ｇ、４℃）。細胞数及び純度を使用前に評価できるように、生ずるペレットを５ｍｌＨａｎｋ’ｓ緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）中に再懸濁する。上記分離カラムを上記磁石から離し、そして上記好中球画分を溶離する。上記カラムをその後ＰＢＳ（５０ｍｌ）及びエタノール（無水）で洗浄し、そして４℃で貯蔵する。

細胞全体をマイクロセルカウンターで計測する。１滴の溶原溶液を上記サンプルに添加し、それを３０分後に赤血球での汚染を評価するために再計測する。サイトスピンうわぐすりをＳｈａｎｄｏｎ Ｃｙｔｏｓｐｉｎ ２サイトスピナー上に調製する（１００μｌサンプル、３分間、５００ｒｐｍ）。これらの調製物を染色し、そして差異細胞計測を少なくとも５００細胞を調べて、光学顕微鏡により決定する。細胞生存率はトリパンブルーの除外により評価する。

好酸球又は好中球をＨＢＳＳ中に希釈し、そして９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）中に１〜１０×１０³細胞／ウェルでピペッティングする。それぞれのウェルは１００μｌ細胞懸濁物；５０μｌＨＢＳＳ；１０μｌルシゲニン；２０μｌ活性化刺激；及び２０μｌ試験化合物を含む２００μｌサンプルを含む。

上記サンプルをヂメチルスルフォキシド中に溶解した活性化刺激ｆＭＬＰ（１〜１０μＭ）又はＣ５ａ（１〜１００ｎＭ）の添加前に１０分間試験化合物又は媒体でインキュベートし、そしてその後、使用される最も高い溶媒濃度が１％（１００μＭ試験化合物で）であるように、緩衝液中に希釈する。ＭＴＰｓを細胞及び媒体の混合を促進するために攪拌し、そして上記ＭＴＰはルミノメーター中に置かれる。総化学発光及び上記それぞれのウェルの一時的な特性は２０分にわたり同時に計測され、そして上記結果は任意の単位又は試験化合物の非存在下におけるｆＭＬＰ誘導化学発光のパーセントとして表現される。結果はＨｉｌｌの式に適合され、そしてＩＣ₅₀値は自動的に計算される。

本発明に係る治療用剤の組み合わせ物は、０．１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲内の濃度で活性である好ましい態様で、０．０００１μＭ〜０．５μＭの範囲内の濃度で上記試験方法において活性である。

本発明に係る治療用剤の組み合わせ物の抗炎症活性はラット気管への血漿浸潤の阻害により追加的に示される。この分析において、管組織をとり、そして血漿の漏れの程度が決定される。この分析は、非限定的に、ＣＯＰＤを含む、気管の他の慢性炎症性疾患に同様に関連し、そしてしたがって、その区画中に要約されない。

Ｗｉｓｔａｒアルビノラット（１５０〜２００ｇ）又はＤｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（４５０〜６００ｇ）をペントバルビトンナトリウムで麻酔し、そして静脈及び動脈カニューレを導入する。血漿タンパク質に結合するＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅ色素をｉ．ｖ．（３０ｍｇ／ｋｇ）で投与する。１０分後、上記試験剤をｉ．ｔ．で投与し、そして１０分後にカプサイシンをｉ．ｖ．（３μｇ／ｋｇ）で投与する。３０分後、気管組織を除去し、フォルムアミド中に一晩抽出し、吸収を６２０ｎｍで読む。いくつかの実験において、投与の順は上記化合物がＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅ及び炎症性刺激の前に投与されるように逆にした。

上記試験モデルにおいて、本発明に係る治療用剤の組み合わせ物は０．００１〜０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｔ．の範囲の用量で抗炎症活性を示す。

上記から、本発明に係る治療用剤の組み合わせ物は炎症性又は閉塞性気管疾患又は気管閉塞を含む他の状態の治療に有用である。特に、それらは気管支喘息の治療に有用である。

それらの抗炎症活性及びそれらの気管高反応性への影響の観点において、本発明に係る治療用剤の組み合わせ物は治療、特に閉塞性又は炎症性気管疾患の予防的処置に有用である。したがって、延長された期間にわたる連続した及び規則的な投与により、本発明に係る化合物の組み合わせ物は気管支収縮又は閉塞性又は炎症性気管疾患の結果として起こる他の徴候的な攻撃の再発に対する前もっての保護を提供することにおいて有用である。本発明に係る化合物の組み合わせ物は上記疾患の基礎の事態の制御、改善又は回復に有用である。

それらの気管支拡張活性に関して、本発明に係る治療用剤の組み合わせ物は気管支拡張薬として、例えば、慢性又は急性気管支収縮の治療において、及び閉塞性又は炎症性気管疾患の徴候の治療に有用である。

本発明が適用される閉塞性又は炎症性気管疾患は、他の薬物治療、例えば、アスピリン又はβ−アゴニスト治療の結果の気管高反応性の悪化に加えて、喘息；塵肺症；慢性好酸球性肺炎；慢性閉塞性気管又は肺性疾患（ＣＯＡＤ又はＣＯＰＤ）；及び成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）を含む。

本発明に係る選択的ＰＤＥ４阻害剤及び抗コリン性剤は単一で又は組み合わせで投与されうるが、一般的に好適な医薬賦形剤、希釈剤又は担体との混合物で投与されるであろう。

本発明に係る選択的ＰＤＥ４阻害剤及び抗コリン性剤は吸入により好ましく投与され、そして好適な駆出剤、例えば、ヂクロロヂフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ヂクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ １３４Ａ（商標））又は１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ ２２７ＥＡ（商標））の如きヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素、Ｐｅｒｆｌｕｂｒｏｎ（商標）の如きさらなる過フッ素化炭化水素又は他の好適な気体の使用と共に又はなしに、加圧容器、ポンプ、スプレイ、霧吹き（好ましくは細かい霧を作出するための電気水力を用いる霧吹き）又は噴霧器からの乾燥粉末吸入剤又はエーロゾルスプレイ提示の形態で便利にデリバリーされる。加圧エーロゾルの場合には、上記投与単位は計測される量デリバリーする弁を提供することにより決定されうる。

上記加圧容器、ポンプ、スプレイ、霧吹き又は噴霧器は分散の、溶解の又は延長する放出のために、例えば、エタノール（場合により、水性エタノール）又は好適な剤及び潤滑剤、例えば、トリオール酸ソルビタンを追加的に含みうる溶媒としての駆出剤の混合物を用いて、上記活性化合物の溶液又は懸濁物を含みうる。吸入剤又は粉吹き器における使用のために（例えば、ゼラチン又はＨＰＭＣから作られた）カプセル、ブリスターズ及びカートリッジは本発明に係る化合物、ラクトース又はデンプンの如き好適な粉末基礎及びＩ−ロイシン、マンニトール又はステアリン酸マグネシウムの如きパフォーマンス調節剤の粉末混合物を含むよう調合されうる。

吸入のための乾燥粉末調剤又は懸濁調剤における使用の前に、本発明に係る化合物は吸入によるデリバリーのために好適な大きさに微小化されるであろう（典型的に５ミクロン未満と考えられる）。微小化は方法、例えば、スパイラルジェットミル、液体ベッドジェットミル又は超臨界液体結晶化の使用の範囲により達成されうる。

細かい霧を作出するための電気水力学を用いる霧吹き器における使用のために好適な溶液調剤は１μｇ〜１０ｍｇの本発明に係る化合物を含むことができ、そして作動体積は１〜１００μｌで変動しうる。典型的な調剤は活性化合物、プロピレングリコール、滅菌水、エタノール及び塩化ナトリウムを含みうる。
エーロゾル又は乾燥粉末調剤はそれぞれの計測された用量又は「パフ」が患者へのデリバリーのために１〜４０００μｇの本発明に係る化合物を含むよう好ましく調節される。エーロゾルでの全体の日の用量は単一の用量又はより通常には、日をとおして別々の用量で投与されうる１μｇ〜２０ｍｇの範囲内であろう。

使用される選択的ＰＤＥ４阻害剤：抗コリン性剤の、重量での（ｗ／ｗ）、好ましい割合は調べられる特定の組み合わせに因るであろう。これは個々の化合物の潜在性における差のためである。主治医はどんな事件においても個々の患者に最も好適であろうそれぞれの化合物の実際の用量を決定するであろう、そしてそれは特定の患者の年齢、体重及び応答と共に変化するであろう。

治療に関する全ての本明細書中の引用文献は治療の、緩和の及び予防の処置を含むことが理解されるべきである。

Claims (15)

1. 選択的ＰＤＥ４阻害剤及び抗コリン性剤の吸入される組み合わせ物。但し、上記抗コリン性剤はチオトロピウム塩でない。
2. 前記選択的ＰＤＥ４阻害剤は、式（Ｉ）：
   

   

   ｛式中：
   Ｒ¹は、Ｈ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₂−Ｃ₄）アルケニル、フェニル、−Ｎ（ＣＨ₃）₂、（Ｃ₃−Ｃ₆）シクロアルキル、（Ｃ₃−Ｃ₆）シクロアルキル（Ｃ₁−Ｃ₃）アルキル又は（Ｃ₁−Ｃ₆）アシルであり、ここで、上記アルキル、フェニル又はアルケニル基は、２までの−ＯＨ、（Ｃ₁−Ｃ₃）アルキル又は−ＣＦ₃基又は３までのハロゲンで置換されうる；
   Ｒ²及びＲ³は、Ｈ、（Ｃ₁−Ｃ₁₄）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₇）アルコキシ（Ｃ₁−Ｃ₇）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₁₄）アルケニル、（Ｃ₃−Ｃ₇）シクロアルキル、（Ｃ₃−Ｃ₇）シクロアルキル（Ｃ₁−Ｃ₂）アルキル、ヘテロ原子として１又は２の酸素、硫黄、スルフォニル、窒素及びＮＲ⁴（ここでＲ⁴はＨ又は（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルである）を含み、ｎが０、１又は２である飽和又は不飽和（Ｃ₄−Ｃ₇）ヘテロ環状（ＣＨ₂）_n基；又は以下の式（ＩＩ）の基：
   

   

   ｛式中、ａは１〜５の整数であり；ｂ及びｃは０又は１であり；Ｒ⁵はＨ、−ＯＨ、（Ｃ₁−Ｃ₅）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₅）アルケニル、（Ｃ₁−Ｃ₅）アルコキシ、（Ｃ₃−Ｃ₆）シクロアルコキシ、ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＣＯ₂Ｒ⁶、−ＣＯＮＲ⁶Ｒ⁷、−ＮＲ⁶Ｒ⁷、−ＮＯ₂又は−ＳＯ₂ＮＲ⁶Ｒ⁷であり、ここで、Ｒ⁶及びＲ⁷はそれぞれ独立にＨ又は（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルである；Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ₂−、−ＣＯ−又は−Ｎ（Ｒ⁸）−であり、ここで、Ｒ⁸はＨ又は（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルであり；及びＹは場合により２までの（Ｃ₁−Ｃ₇）アルキル又は（Ｃ₃−Ｃ₇）シクロアルキル基で置換される（Ｃ₁−Ｃ₅）アルキレン又は（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニレンであり；ここで、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アルコキシアルキル又はヘテロ環状基のそれぞれは１〜１４、好ましくは１〜５の、（Ｃ₁−Ｃ₂）アルキル、ＣＦ₃又はハロ基で置換されうる｝から成る群からそれぞれ独立に選ばれ；及びＲ⁹及びＲ¹⁰はＨ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₆−Ｃ₁₀）アリール及び（Ｃ₆−Ｃ₁₀）アリールオキシから成る群からそれぞれ独立に選ばれる｝により表される化合物又はその医薬として許容される塩又は溶媒和物である、請求項１に記載の組み合わせ物。
3. 前記選択的ＰＤＥ４阻害剤は９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（２−チエニル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン又は９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（第三−ブチル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン又はその医薬として許容される塩又は溶媒和物である、請求項２に記載の組み合わせ物。
4. 前記抗コリン性剤はイプラトロピウム又はオキシトロピウム塩である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組み合わせ物。
5. 前記選択的ＰＤＥ４阻害剤は９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（２−チエニル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン又はその医薬として許容される塩又は溶媒和物であり、そして前記抗コリン性剤はイプラトロピウム塩又はその溶媒和物であり；又は
   前記選択的ＰＤＥ４阻害剤は９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（第三−ブチル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン又はその医薬として許容される塩又は溶媒和物であり、そして前記抗コリン性剤はイプラトロピウム塩又はその溶媒和物であり；又は
   前記選択的ＰＤＥ４阻害剤は９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（２−チエニル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン又はその医薬として許容される塩又は溶媒和物であり、そして前記抗コリン性剤はオキシトロピウム塩又はその溶媒和物であり；又は
   前記選択的ＰＤＥ４阻害剤は９−シクロペンチル−５，６−ヂヒドロ−７−エチル−３−（第三−ブチル）−９Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピリヂン又はその医薬として許容される塩又は溶媒和物であり、そして前記抗コリン性剤はオキシトロピウム塩又はその溶媒和物である、請求項１に記載の組み合わせ物。
6. 医薬としての使用のための請求項１〜５のいずれか１項に記載の組み合わせ物。
7. 閉塞性気管又は他の炎症性疾患の治療における吸入経路による同時の、連続した又は別々の投与ための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組み合わせ物。
8. 閉塞性気管又は他の炎症性疾患の治療における吸入経路による投与のための、選択的ＰＤＥ４阻害剤、抗コリン性剤及び医薬として許容される賦形剤、希釈剤又は担体を含む医薬組成物。但し、上記抗コリン性剤はチオトロピウム塩ではない。
9. 上記選択的ＰＤＥ４阻害剤及び抗コリン性剤は請求項２〜５のいずれか１項に記載されるものである、請求項８に記載の医薬組成物。
10. 上記抗コリン性剤はチオトロピウム塩ではない、閉塞性気管又は他の炎症性疾患の治療における吸入経路による選択的ＰＤＥ４阻害剤と抗コリン性剤の同時の、連続した又は別々の投与のための医薬の製造における上記選択的ＰＤＥ４阻害剤又は抗コリン性剤の使用。
11. 前記選択的ＰＤＥ４阻害剤及び上記抗コリン性剤は、請求項２〜５のいずれか１項に記載されるものである、請求項１０に記載の使用。
12. 治療の必要な哺乳類に有効な量の選択的ＰＤＥ４阻害剤及び抗コリン性剤を吸入経路により同時に、連続して又は別々に投与することを含む閉塞性気管又は他の炎症性疾患の治療方法。但し、上記抗コリン性剤はチオトロピウム塩ではない。
13. 上記選択的ＰＤＥ４阻害剤及び上記抗コリン性剤は請求項２〜５のいずれか１項に記載されるものである、請求項１２に記載の方法。
14. 閉塞性気管又は他の炎症性疾患の治療における選択的ＰＤＥ４阻害剤及び抗コリン性剤の同時の、連続した又は別々の投与のための吸入装置。但し、上記抗コリン性剤はチオトロピウム塩ではない。
15. 上記選択的ＰＤＥ４阻害剤及び上記抗コリン性剤は請求項２〜５のいずれか１項に記載されるものである、請求項１４に記載の装置。