JP2005508180A - 霊長類の胚性幹細胞から由来した内皮細胞 - Google Patents

Abstract

霊長類の胚性肝細胞を誘起し、相対的に均一な個体群の内皮細胞に分化させる方法が記載されている。このESに由来する内皮細胞は、内皮細胞の一般的、形態学的及び細胞表面標識の特性を有する。このESに由来する内皮細胞は、in vivoにおいて組織に移植されたとき血管形成の誘起及び関与も可能である。

Description

【０００１】
（関連出願の参照）
この出願は2001年11月2日に出願された米国仮特許出願第60/335,332号明細書に基づき優先権を主張する。
（連邦政府の支援研究又は開発に関する陳述）
決定されるべきもの。
（発明の背景）
幹細胞は自己再生と１種以上の分化細胞型への分化との両方の能力を有する細胞であると定義されている。ヒト胚性幹細胞はヒト着床前胚盤胞から作られた幹細胞の部類である。ヒト胚性幹細胞は多能性であってかつ分化全能性であってよく、これはヒト胚性幹細胞が成人の人体に明示される多くの細胞型へと確実に分化できること及び人体に存在するすべての細胞型へと分化する能力を有するかもしれないことを意味している。
胚性幹細胞(ES細胞)はヒト以外の多くの動物からも由来している。例えば、多くの科学的研究がマウスES細胞で行われてきた。特定の種のES細胞培養の開始方法が一旦解明されると、研究中動物の遺伝子について有用な情報を習得するための様々な態様で、ES細胞、及びそれから得た動物を操作することが可能となった。例えば、過去10年にわたって、各マウス幹細胞培養物で一つ又は別の特定の遺伝子がノックアウトされたマウスES細胞の培養物を調製することが可能となっている。マウスES細胞系から実現したいくつかの技術が他の種に移行可能である一方で、多くはそうでなかった。例えば、マウスES細胞培養物を調製するために用いることのできた基礎技術は、多くの他の動物種に上手く移行しなかった。従って、ヒトES細胞の培養及び操作の技術の発展のためには、ヒトとマウス間の系統学的距離のため、マウス細胞は最善のモデルではないかもしれない。しかしながら、ヒトES細胞培養及び技術の科学の発展の過程で、準備作業の多くは、アカゲザルのような非ヒト霊長類において実施された。他の霊長類ES細胞培養物は、ヒト細胞培養物に簡単に移行できる系として相対的に信頼できるモデルであると証明された。例えばマウスES細胞培養物は、未分化細胞成長の維持のため、白血病阻害因子(LIF)又は別のgp130/STAT3シグナル経路の作動薬の適用を必要とするが、ヒト及びアカゲザルES細胞培養物の場合には未分化細胞成長のためのLIFを必要としない。アカゲザルES細胞を用いた造血について従来の研究では、ヒトES細胞培養物へ移行可能な技術の前臨床研究の実施のためのこの系の有用性が確証された。
【０００２】
幹細胞の刺激的な潜在的な用途の一つはヒト組織移植である。幹細胞を特異的な系譜へ分化させ、その系譜を次いで人体へ移行して、人体の組織を置換し又は高め得る技術を発達し得ることが期待されかつ予想されている。これを達成する為には、幹細胞を所望の特異的な細胞系譜に分化することを導く第一の技術が開発されなくてはならない。幹細胞を造血性、神経系、心筋細胞、膵臓の系譜及び他の系譜へ誘導させる技術はすでに提案されている。これらの技術は、新規かつ異なる技術が新たに所望される各系譜に必要とされるという点で互いに全く相違しかつ独立していることが分かっている。
内皮細胞は、人体において相互連絡された細胞のネットワークを構築し、それらの細胞は血管、リンパ管を裏打ちし、及び毛細血管を形成する。内皮細胞は栄養物質の流動を制御し、多様な生物活性分子を作り出しかつ応答する。ヒトES細胞が、内皮細胞を含めて、多くの子孫細胞型に分化することが実証されている一方、内皮系譜に誘導されるヒトES細胞誘導体の別個の培養物を調製することは、これまで可能ではなかった。
（発明の概要）
本発明は、胚性幹細胞の培養物を内皮細胞の培養物へ直接分化させることができる方法に関する。この方法は、内皮細胞を維持することが従来公知であった培地であって、今や、内皮細胞への分化の過程で胚性幹細胞を保持する能力を有することが明らかとなった培地中において胚性幹細胞を培養することを含む。
【０００３】
本発明はまた、内皮細胞に特徴的な形態及び細胞表面マーカーを有し、かつin vivoで組織の脈管化を誘導することのできる胚性幹細胞由来の内皮細胞の培養物に関する。
本発明の特徴は、工程が簡素であるため、相対的に効率的にできること、及びその結果、培養物が相対的に均一な内皮細胞集団となると考えられることである。
本発明の他の目的、利点及び特徴は、添付図面と合わせて考慮すると以下の明細書から明らかであろう。
（発明の詳細な説明）
本発明は霊長類の胚性幹細胞を内皮細胞に分化させることを指示する方法と、その方法によって産生された相対的に純粋な内皮細胞の集団との両方を企図する。この方法は、霊長類の胚性幹細胞を、処理された細胞の形態を変化させて内皮細胞となるようにする所定のタンパク成長因子とともに培養することに基づいている。胚性幹細胞から他の系譜の細胞への分化を企図する他の技術とは対照的に、ここで記載されている方法によって得られた胚性幹細胞から由来する内皮細胞の培養物は、相対的に均一であると考えられ、かつ外見より血管形成能力を有する内皮細胞から主に構成されている。
この培養方法は、血管内皮細胞成長因子(VEGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、インスリン様成長因子(IGF-1)、及び上皮成長因子(EGF)を含む培地中で、未分化の霊長類胚性幹(ES)細胞を培養することに基づく。これらの因子はすべて内皮細胞基本培地(EBM-2、クロネティックス/バイオ・ウィッタカー(Clonetics/Bio Whittaker))として公知の、市場において入手可能な培地に見いだされる。この培地は既知であり、培養中、内皮細胞の支持に用いられている。この培地がES細胞から内皮細胞への分化を支援することはこれまで知られていなかった。成長因子のこの組み合わせがES細胞の内皮細胞への分化の支援に十分であることが分かった一方で、培地中で４つのすべての因子を使用する必要はないかもしれず、その因子の一つを省けるか否かは経験的な実験によって、本発明の概念から離れることなく、容易に確認できる。
【０００４】
この方法を、内皮細胞を含む不均一な混合物の従来技術の誘導方法から区別するものは、ES細胞から内皮細胞への細胞培養の変化の相対的な均一性である。この移行を達成するために、他の方法、例えばホルボールエステルの適用、ストローマ細胞及び血清との共同培養及び胚様体からの内皮細胞の単離が試みられ、成功しなかった。これらの努力のどれも、主に内皮細胞からする培養物を再測性よく生成しなかった。対照的に、ここで記載されている方法は、簡易かつ効率的であり、かつ内皮細胞の特徴を有する形態学的に類似の細胞の細胞培養物を生じる。
本発明によって調製される内皮細胞の培養物は一定の性質を有する。この細胞は伸びた又は放射状の内皮細胞に類似した特徴的な形態を有する。対照的に、他の培地で成長させたES細胞は、特徴的な内皮外観の細胞を有しない不均一の集団へと分化する。内皮細胞は、マトリゲル(Matrigel)(登録商標)培地に置かれると、迅速に管状構造を形成する。内皮細胞はフォン・ウィルブラント因子(vWF)の存在に対して陽性であり、インテグリンavb3及び表面抗原CD146の発現と同様に高レベルのレックス・ユーロピーアスアグルチニン(UEA-1)結合力を有する。内皮細胞の別の形質特性であるが、内皮細胞はアセチル化LDLを取り込む。これらの細胞は内皮細胞の表面に一般に、しかしいつもではないが存在する二つの抗原、CD31及びVE-カドヘリンの発現を欠いている。これらの内皮細胞は、SCID（重症複合型免疫不全）マウスに腫瘍細胞とともに移植されたとき、その腫瘍の脈管化をもたらし、そのため、in vivoにおいて脈管化を増大しかつそれに関与する内皮細胞の能力を実証する能力を有する。これらの細胞の脈管化に関与する能力は特に顕著であり、なぜなら、この性状により遺伝学的に変化させた内皮細胞を、脈管化を必要とする組織に移植することが可能となり、変化した細胞が、どんな遺伝子が細胞に挿入されても、発現するように形成された脈管マトリックスでin vivo生存する。
【０００５】
胚性幹細胞から形成するように誘起された他の細胞型とは対照的に、ここで記載され及び特徴付けられた内皮細胞培養物は、誘導された系譜、すなわち内皮細胞となるべきことに関連付けられる細胞において相対的に均一である。ES由来の内皮細胞培養は、単一形態を有しかつ内皮細胞の特性を示す細胞から形成される。しかし、現在の細胞培養技術の限界のため、ES由来内皮細胞培養物は、他の細胞型をまったく含んでないと確信をもって言えない。言えることは、ES由来内皮細胞培養物は主に内皮細胞から構成され、内皮細胞として作用しin vivoで宿主に移植されたとき組織の脈管化を促進かつ関与する細胞の実際的な源、であることである。内皮特性である、レックス・ユーロピーアスアグルチニン(UEA-1)レクチンに結合する能力を一般的な試験を用いたところ、誘導された培地中の再生可能な90%を超える細胞がUEA-1レクチンに結合することが分かった。いくつかの変更態様の方法において、UEA-1に結合する細胞の割合は変動するかもしれず、ここで記載の方法によって作られた内皮細胞の培養物において、少なくとも75%、及びさらに好ましくは90%以上の培養中の細胞はUEA-1レクチンに結合する能力の検査で陽性となる。
【０００６】
以下の実施例はアカゲザルES細胞によって実施されたものであるが、ヒトES細胞に対しても同一の方法及び結果が得られる。ES細胞由来のヒト内皮細胞は、ヒト患者に移植できる組織に成長する見込みを提示した。内皮細胞の移植は、虚血性組織の脈管化が求められている用途に望ましい。加えて、内皮細胞の採用は、改良された脈管化が必要とされる体のどんな部位においても有用かもしれない。プレカーサーES細胞はどんな数でも成長するので、医療の実験又は治療用に大量の数の内皮細胞の産生が可能である。
【実施例１】
【０００７】
＜方法＞
（細胞培養）
未分化なアカゲザルES細胞（R366.4細胞株）を以前に記載されているように培養した(Thomson et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844-7848(1996)を参照されたい。)。要するに、DMEM、20%FBS（ユタ州オグデンに所在のハイクローン社製）、2mM L-グルタミン（ミズーリ州セントルイスに所在のシグマ社製）、0.1mM 2-メルカプトエタノール（シグマ社）、及び1%MEM非必須アミノ酸（インビトロゲン社）を含有する培地で、R366.4細胞を照射されたマウスの胚性線維芽 (MEF) 細胞とともに共同培養した。未分化細胞に日々新しい培地を与え、約5-7日毎に新しいMEFに継代した。内皮細胞の分化を促進するために、培地を、植付け後(plating)24時間後ES細胞から除去し、EGM2、5%FBS、VEGF、bFGF、IGF-1、EGF、及びアスコルビン酸(EGM2)(EGM2-MVブリットキット、クロネティックス/バイオ・ウィッタカー、ウォーカーズビル、メリーランド州)からなる培地と置換した。ES細胞を、EGM2培地中29日間分化させ、培地は3〜5日毎に取り替えた。分化したアカゲザルES細胞を0.05%トリプシン/0.53mM EDTA(GIBCO/BRL)で5分間解離し、遠心分離にかけ、そして照射されたMEF細胞なしで10cm組織培養皿上のEGM2に再度プレートした。24時間後、非粘着性細胞を除去し及び粘着性細胞を新しい培地で培養した。アカゲザルES細胞由来の内皮細胞(RESDEC)を集密となるまで成長させ、連続継代し、そしてEBM2培地中で増大させた。
【０００８】
ヒト臍帯静脈細胞(HUVEC)(クロネティックス/バイオ・ウィッタカー)も既知の方法によりEGM2中で成長させ、継代した。
（マトリゲル中の管形成）
0.2mlのマトリゲル（Becton Dickinson社）を24穴組織培養皿の各ウェルに添加し、37℃で少なくとも30分間放置し凝固させた。ゲル化の後、5x10⁴〜1x10⁵個のRESDECを含む0.2mlの細胞懸濁液をマトリゲルの上に敷いた。この培養物を37℃/5%CO₂下でインキュベートし、24、48、及び72時間後における細胞の筒状構造への再構成を観察した。個々の実験を３回行い、代表的なウェルを写真で記録した。
（VEGF及びbFGF ELISA）
RESDECを、VEGF又はbFGFの不存在下のEGM2中、FBSの代わりに10%ノックアウト血清リプレーサー(replacer)(GIBCO)を補充したEGM2中、又は10%FBSを補充したDMEM中、3日間培養した。72時間後、条件培地(CM)を収集し及び遠心分離をして死細胞を除去した。EGM2培地単独を陰性コントロールとした。CM中のVEGF又はbFGFの量を、比色定量ELISAアッセイ(ミネソタ州ミネアポリス所在のR&Dシステムズ社)によって分析した。
【０００９】
（フロー・サイトメトリー）
RESDECを、Ca²⁺及びMg²⁺のないPBSで洗浄し、5分間0.05%トリプシン/0.53mM EDTAで単層から剥離させた。解離された細胞を遠心分離し、2%FBS及び0.1%アジ化ナトリウムを追加したPBSからなるFACS培養液で洗浄した。80mm（ミクロン）ニテックス(nitex)を通して濾過した後、単細胞の懸濁液をアリコートで測定し、FAC培養液中好適な濃度に希釈されたアイソトープコントロール又は抗原特異的抗体で染色した。細胞表面抗原発現を、抗原特異的一次抗体を使用し、次いで、アイソトープコントロール及び蛍光標識された二次抗体（間接染色）又は蛍光性複合抗原特異的抗体（直接染色）を使用して分析した。適切な非複合化マウス及びヤギIgG（共にシグマ社）及び、FITC-複合マウスIgG（カリフォルニア州サンディエゴ所在のファーミンゲン社）をアイソトープコントロールとして使用した。flk-1(リサーチ・ダイアグノスチックス社(Research Diagnostics)製)に対する非複合化抗原特異的抗体を、FITC標識された抗-ヤギIgG抗体（シグマ社）で検出した。VEGF受容体1に対する非複合化抗体(Flt-1)と、VEGF受容体2(flk-1)（共にシグマ社）とをFITC標識されたヤギ抗-マウスIgG(カルタッグ社(Caltag))で検出した。非複合化P1H12抗体（マウスIgG1、ミネソタ大学Robert Hebbel博士により提供された。）をラット抗-マウスIgG-FITC複合化２次抗体（カルタッグ社）により検出した。細胞は、また、ビオチン化VEGFキット(R&D システムズ社)を用いてVEGF受容体の発現について及びウレックス・ユーロピーアスアグルチニン1(UEA-1)(Vector labs社)との結合能について試験した。使用した直接複合化抗体はHLA-A、B、C-FITC(Pharmingen社)及びaVb3/clLM609-FITC(Chemicon社)であった。ヒト臍帯静脈細胞(HUVEC)(クロネティックス社)は陽性コントロールとして使用した。FACスキャン(FACScan)又はFACカリブール(FACs Calibur)(Becton Dickinson社)において固着しないで、かつ死んだ細胞を除くためにプロピジウム(propidium)ヨージドを使用して、細胞を分析した。CellQuest ソフトウェア(Becton Dickinson社)を使用してデータ解析を行った。
【００１０】
（免疫染色）
アセチル化LDL受容体の解析は、血清のないEGM中のdiIAcLDL(Molecular Probes社)を希釈することにより実施した。細胞を二回洗浄し、diIAcLDLを含有するEGM2培地中、終夜インキュベートした。洗浄後、細胞を蛍光顕微鏡(UV、ローダミンフィルター)で観察した。HUVECを陽性コントロールとして使用した。
フォン・ウィルブランド因子タンパク(vWF)(DAKO社)の発現をヤギ抗-ウサギIgG-FITC二次抗体（シグマ社）によって検出した。細胞を固定し、室温で１時間vWFとともにインキュベートし、洗浄し、二次抗体中で30分間インキュベートした。最後の洗浄後、細胞を蛍光顕微鏡(UV、FITCフィルター)で観察した。HUVECSを再び陽性コントロールとした。
（マトリゲルプラグ）
1回目の実験において、SCIDマウス(Balb/Scid、Harlan Sprague Dawley社)に、5x10⁵〜1x10⁶RESDECを含有するマトリゲル(Becton Dickinson社)0.5mlを皮下注射した。二回目の実験を行い、凝固したマトリゲルにRESDECを含有するスポンジを移植した。14、21、35、及び42日間後マトリゲルプラグを除去した。このプラグを除去し及び固定する数分前に、高分子量のFITCデキストラン（シグマ社）を静脈注射することにより、血管を観察した。標準H/Eスライドも調製した。
【００１１】
（In Vivo研究）
粘着性RESDECをトリプシン処理して収集し、次いでマウス乳癌C755細胞株と混合した。二つの別々の実験において、Balb/c-SCIDマウスに、1x10⁶C755腫瘍細胞又は1x10⁶RESDECを、又は1x10⁶腫瘍細胞及び1x10⁶RESDEC混合物を皮下注射した。初期成長の後、腫瘍を3〜5日毎にキャリパーで測定した。移植後約３週間後にすべてのマウスは、成長腫瘍の組織化学的分析のために犠牲にした。RESDECのみ注射されたマウスは腫瘍が成長しなった。
（腫瘍の免疫組織化学的染色）
第一の実験において腫瘍を単離し、またパラフィン切片を調製するために10%ホルマリンに固定した。冷凍された切片を調製するために腫瘍を2%パラホルムアルデヒドに固定した。すべての切片をFisher Superfrostスライド上に固定した。標準ABC技術(VectaStain Elite ABCキット、Vector lab社)を使用して、切片をHLA-classI A、B、C(W6/32抗体、IgG_2a)及びCD31(IgG₁)(Novacastra、ベクター)の発現について処理した。マウスのIgG₁（シグマ社）及びIgG_2a(Southern Biotechnology社)をアイソトープコントロールとして使用した。ペルオキシダーゼ活性をDAB基質（ベクター）で視覚化し、また切片をヘマトキシリンで対比染色した。
【００１２】
＜結果＞
（アカゲザルES細胞から内皮細胞への誘導）
アカゲザルES細胞を、材料及び方法について記載されているようにVEGF、bFGF、EGF、及びIGFを含有するEGM2培地において成長させた。約5〜10日後、これらのES細胞は伸びた又は星状形態の内皮細胞に類似した均一形態をとっていた。対照的に、FBSを単独で追加した培地で成長したES細胞は、明瞭な内皮-外観細胞を有さない不均一な細胞群に分化した。EGM2中成長させると、潜在的内皮細胞を連続継代し、約20集目の倍加へと拡張し均一外観を維持した。内皮細胞特性の最初の試験として、これらの細胞をマトリゲルベースの培地に蒔き、そこではマトリゲルベース培地に置かれたときにHUVEC又は他の内皮細胞によって形成されたものと類似するチューブ様キャピラリー構造を迅速に形成した。細胞遺伝学研究により、すべての細胞が正常アカゲザル40XY核型を有することが分かった。これらの細胞遺伝学的結果は重要であり、これらの細胞が長期培養の後は形質転換せず、未分化のES細胞の成長に使用された潜在的に混入しているマウス胚性線維素芽細胞に由来しないことを実証した。
アカゲザルES細胞由来の細胞の電子顕微鏡写真は典型的な内皮細胞の特徴を示した。これらは多重高密度円形又は棒状のウェイベル-パレード体、細胞間の固い接合、及びエンドサイトーシス/エクソサイティックのベシクルを含む。
【００１３】
（免疫表現型）
次に、これらのアカゲザル由来の内皮-様細胞を免疫組織化学的に染色すると、フォン・ウィルブランド因子(vWF)の存在、これらの細胞かつアセチル化LDLを迅速に取り込む能力、及びUEA-1レクチンに結合する能力の存在が実証された。フロー・サイトメトリー研究によって、インテグリンavb3及びP1H12抗体によって認識される表面抗原CD146の発現と同様に、高レベルなUEA-1結合性が確認された。これらのタンパク質は内皮細胞同士の相互作用にとって重要であることが分かった。これらの結果に基づき、これらをアカゲザル胚性幹細胞由来の内皮細胞(RESDEC)と命名した。驚くべきことに、HUVEC細胞との結合も弱いが、VEGF受容体flk-1及びflt-1に対する抗体はRESDECと結合しなかった。しかしビオチン化したVEGF及び２次ストレプトアビジン-FITCを使用したアッセイはRESDEC(及びHUVEC)細胞への結合を示した。この結合の特定性はアンチ-VEGF抗体でブロックすることによって実証した。この結果は、抗ヒトflk-1及びflt-1抗体がアカゲザル由来細胞と交差反応しない、又はこれらの細胞は異なるVEGF受容体を発現することを示唆する。RT-PCR研究はRESDEC中flk-1 mRNAの発現を示し、抗体が交差反応できないかもしれないことを示唆する。もちろん、このmRNAに由来するタンパク質は細胞表面上で適切に発現しない可能性がある。
RESDEC細胞は、内皮細胞の表面共通に、しかし均一にではなく見出される二つの表面抗原CD31、及びVE-カドヘリンの発現を欠くことによりHUVEC細胞と異なる。RT-PCR研究によってこれらの遺伝子のmRNA発現の不存在が確認された。しかし、マウスES細胞由来内皮細胞のいくつかの研究は、一定の内皮細胞集団におけるCD31及びVE-カドヘリンの欠如も示した。CD31及びVE-カドヘリンは内皮細胞の陽性コントロールとして機能するが、発現の欠如によってこれらが内皮細胞であることを排除するものではない。
【００１４】
（RESDEC細胞からの脈管形成）
RESDECのin vivo機能は、最初、マトリゲルプラグ分析により評価された。ここで、RESDECは、スポンジ中に包埋し、該スポンジは凝固したマトリゲルの中に懸濁されている。次いで、このマトリゲルプラグを重症複合型免疫不全(SCID)マウスの皮下に移植した。約28日後、マウスにFITC-デキストラン溶液を静脈注射し、引続きプラグの除去及び画像診断を行った。これによって、RESDEC含有スポンジに向かう強度の血管局在化、即ち内皮細胞特有の化学走性-様事象が実証された。この血管新生の外見から、この血管新生がRESDEC由来因子に応答するネズミ血管脈管形成の領域を表しているようである。実際に、ELISAによるRESDEC上清の解析によって、これらの細胞によって産生された有意なレベルの血管内皮成長因子(VEGF)が実証された。しかし、内皮細胞によって頻繁に産生される別の血管由来タンパクである、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)はRESDEC培養物上清において評価されなかった。
RESDECによって産生された新血管を実証する為に、0.5〜1.0x10⁶細胞を、SCIDマウス中に皮下移植されたマトリゲルプラグに均一に懸濁した。再度、動物にFITC-デキストランを注射し、引き続きプラグの除去及び画像診断を行った。ここで、大きい血管構造が見られ、また後のプラグの組織学的試験によってRESDECによった血管形成が示された。
次に、in vivoにおいて腫瘍内での活性脈管形成に寄与するRESDEC細胞の能力を実証するために、別のSCIDマウスモデルを使用した。ここで、マウス乳癌株C755の細胞に、単独で又は等数のRESDECとともに共注射で、皮下注射した。腫瘍成長を規則正しい間隔で測定し、また腫瘍はRESDECと共注射したとき顕著により早く成長した。重要なことには、10⁶RESDEC単独で注射すると、測定可能な腫瘍成長ももたらさず、このことは、これらの細胞は直接には腫瘍原性のものでないことを実証した。これらの腫瘍は、抗-ヒト特異的抗体（アカゲザル細胞と交差反応するが、マウス細胞とは交差反応しない。）により腫瘍の血管及び免疫組織化学染色性が高く、このことはRESDEC細胞から内皮への寄与を明らかに実証した。実質的な数の内皮細胞の染色は、抗-MHCクラス1又はRESDEC細胞と共に共投与した腫瘍中の抗-VWF抗体を使用して陽性であったが、C755単独由来の腫瘍中の内皮細胞はこれらの抗原に対し陰性であった。

Claims (6)

1. 霊長類の胚性幹細胞を内皮細胞に分化させる方法であって、以下の工程、
   (a)血管内皮細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子及び上皮細胞成長因子を含む培地において、胚性幹細胞の培養物を培養する工程；及び
   (b)内皮細胞の形態を有する細胞を継代培養する工程、
   を含むことを特徴とする方法。
2. 前記霊長類細胞が、アカゲザル細胞である請求項１に記載の方法。
3. 前記霊長類細胞が、ヒト細胞である請求項１に記載の方法。
4. 胚性幹細胞から内皮細胞への培養のための前記培地が、哺乳類血清も含む請求項１に記載の方法。
5. 霊長類の胚性幹細胞から由来する細胞培養物であって、前記培養物が以下の特性、
   (a)放射状形に引き伸ばされた均一な形態、
   (b)フォン・ウィルブランド因子の存在に対し陽性、
   (c)アセチル化LDLを取り込む能力に対し陽性、及び
   (d)哺乳動物にin vivoで移植したときに血管形成を奨励し及び関与する能力、
   を有する内皮細胞を主に含むことを特徴とする細胞培養物。
6. 霊長類の胚性幹細胞から由来する内皮細胞の細胞培養物であって、構成する細胞の90%以上がレックス・ユーロピーアスアグルチニン(UEA-1)レクチンに結合する能力に対する検査で陽性であることを特徴とする細胞培養物。