JP2005505260A

JP2005505260A - タンパク質修飾および維持分子

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Publication number: JP2005505260A
Application number: JP2003507231A
Authority: JP
Inventors: ガンディー、アミーナ・アール; ケーブル、エイミー・イー; スウォーナカール、アニータ; ハファリア、エープリル、ジェイ・エイ; トラン、バオ; ダガン、ブレンダン・エム; ワレン、ブリジット・エイ; アイソン、クレイグ・エイチ; ホンシェル、シンシア・ディー; ニュエン、ダニエル・ビー; リュ、デュング・アイナ・エム; リー、アーンスティーン・エイ; ユエ、ヘンリー; フォーサイス、イアン・ジェイ; バロッソ、イネス; ランクマール、ジャヤラクシミ; グリフィン、ジェニファー・エイ; リー、ジョアナ・エックス; ヤング、ジュンミング; サンガベル、カビサ
Original assignee: インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド
Priority date: 2001-06-22
Filing date: 2002-06-18
Publication date: 2005-02-24
Also published as: WO2003000844A2; WO2003000844A3; AU2002318356A8; US20050069877A1; AU2002318356A1; CA2450921A1

Abstract

本発明の種々の実施態様は、ヒトのタンパク質修飾および維持分子(PMOD)と、PMODを同定およびコードするポリヌクレオチドとを提供する。本発明の幾つかの実施態様はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。他の実施態様は、PMODの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法を提供する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の核酸群、これら核酸がコードするタンパク質修飾および維持分子に関する。また、これらの核酸とタンパク質とを利用した胃腸障害、心血管障害、自己免疫／炎症疾患、細胞増殖異常、発生・発達障害、上皮障害、神経疾患、および生殖障害の診断、治療、及び予防に関する。本発明はまた、該核酸と、タンパク質修飾および維持分子との発現への、外因性化合物の効果のアセスメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質分子の修飾や維持の調節を行う細胞性過程によって、その機能、高次構造、安定化および分解が調整される。これらの各々の過程はキナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、異性化酵素、転移酵素および分子シャペロンなどの主要な酵素またはタンパク質によって媒介される。
【０００３】
キナーゼ
キナーゼは、高エネルギーのリン酸基の、アデノシン三リン酸(ATP)から標的タンパク質のヒドロキシアミノ酸残基であるセリン、トレオニン、またはチロシンへの転移を触媒する。リン酸基が付加されると、受容体分子における局所電荷が変化し、それによって内部構造が変化し、分子間接触に影響し得る。可逆的なタンパク質リン酸化は、真核細胞の細胞内での様々な現象を調節するために広く利用されている。一般的な哺乳動物細胞における活性なタンパク質の10％以上がリン酸化していると推定される。ホルモン、神経伝達物質、成長因子、および分化因子を含む細胞外シグナルはキナーゼを活性化でき、活性化は最終的エフェクタータンパク質のアクティベータとして、または細胞表面受容体として生じるが、シグナル伝達経路に沿っても発生し得る。キナーゼは、解糖などの基本的な代謝プロセスから細胞周期の調節、分化、およびシグナル伝達カスケードによる細胞外環境との情報交換に至る細胞機能の全てに関与する。細胞内におけるタンパク質の不適切なリン酸化は、細胞周期の進行および細胞分化における変化に関連する。細胞周期における変化は、アポトーシスの誘発や癌の誘発に関連付けられている。細胞分化における変化は、生殖系、免疫系、および骨格筋の、疾患や障害に関連付けられている。
【０００４】
プロテインキナーゼには２つのクラスがある。一方のクラスのプロテインチロシンキナーゼ（PTK）はチロシン残基をリン酸化し、他方のクラスであるプロテインセリン／トレオニンキナーゼ（STK）はセリン残基およびトレオニン残基をリン酸化する。数種のPTKおよびSTKは、両方のファミリーの構造的な特徴を有し、チロシン残基およびセリン／トレオニン残基の両方に対して特異性（二重特異性）を有する。ほとんど全てのキナーゼは、キナーゼファミリー特有の特定の残基群および配列モチーフ群を含む保存された250〜300のアミノ酸からなる触媒ドメインを含む (概説はHardie, G. 及びHanks, S. (1995) The Protein Kinase Facts Book, Vol I, 17-20ページ、Academic Press, San Diego CAを参照)。
【０００５】
ホスファターゼ
ホスファターゼ(脱リン酸酵素)は、加水分解によってタンパク質からリン酸基を除く。ホスファターゼは細胞におけるリン酸化の度合いの決定に必須であり、キナーゼと共に代謝酵素活性、細胞増殖、細胞の成長および分化、細胞接着、および細胞周期の進行などの重要な細胞プロセスを調節する。プロテインホスファターゼは、ホスホアミノ酸基質選択性に基づいて、セリン／トレオニン特異性またはチロシン特異性のいずれかによって特徴づけられる。数種のホスファターゼ（DSP：二重特異性ホスファターゼ）は、リン酸化したチロシン、セリン、またはトレオニン残基に作用し得る。プロテインセリン／トレオニンホスファターゼ(PSP)は、細胞内での多くのcAMP仲介性ホルモン応答の重要な制御因子である。プロテインチロシンホスファターゼ(PTP)は、細胞周期および細胞シグナル伝達プロセスにおいて重要な役割を果たす。
【０００６】
プロテアーゼ
プロテアーゼは、タンパク質鎖やペプチド鎖のバックボーンを形成するペプチド結合のところでタンパク質とペプチドを切断する。タンパク質分解は、細胞内外で生じる、最も重要で頻発する酵素反応の1つである。タンパク質分解は、新生ポリペプチドの活性化と成熟、誤ってフォールディングされたタンパク質や損傷したタンパク質の分解、および細胞内のペプチド代謝回転の制御に関する。プロテアーゼは、胚の発達、傷の治癒、および、通常の発育において、消化、内分泌機能、組織再構築に関する。プロテアーゼは、調節タンパク質の半減期に影響することで、調節過程における役割を果たしうる。プロテアーゼは、炎症、血管新生、腫瘍の撒布と転移、循環器疾患、神経系疾患、細菌性感染・寄生性感染・ウイルス性感染などの病態の病因や進行に関わる。
【０００７】
プロテアーゼは基質のどこを切断するかによって分類できる。エキソペプチダーゼにはアミノペプチダーゼ、ジペプジルペプチダーゼ、トリペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ペプチジル−ジペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、およびオメガペプチダーゼが含まれ、基質の末端の残基を切断する。エンドペプチダーゼにはセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼが含まれ、ペプチド内部の残基で切断する。活性部位の構造、作用機序、および全体的三次元構造に基づき、哺乳動物プロテアーゼは四つの主なカテゴリーに分類されている(Beynon, R.J.およびJ.S. Bond (1994) Proteolytic Enzymes: A Practical Approach, Oxford University Press, New York, NY, 1-5ページ参照)。
【０００８】
セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼ（SP）は、サイズが大きく広範なタンパク質分解酵素ファミリーで、消化酵素のトリプシンやキモトリプシン、補体カスケードや血液凝固カスケードの成分、並びに、細胞内部および細胞外基質において高分子の分解や代謝回転を制御する酵素を含む。20以上のサブファミリーのうち、ほとんどは6つの一族に分けることができ、そのそれぞれに共通の祖先をもつ。これら6つの一族は、進化の点で少なくとも4つの異なる祖先の系統を引いていると仮定されている。SPという名前は、ほとんどのファミリーの活性触媒部位に見られるセリン残基の存在に由来する。活性部位は、触媒トライアッド、すなわち、触媒にとって重要な保存アスパラギン、ヒスチジン、セリン残基のセットによって定義される。これらの残基は、基質結合を促進する電荷リレーネットワークを形成する。活性部位外のその他の残基は、触媒中に形成される四面体遷移中間状態（tetrahedral transition intermediate）を安定化するオキシアニオンホール（oxyanion hole）を形成する。SPは広範囲にわたる基質をもち、基質特異性によってサブファミリーへ細分できる。主要なサブファミリーの名前は、それらがどの残基(群)の後で切断するかに由来する。すなわち、トリパーゼはアルギニンまたはリジン、アスパーゼはアスパラギン酸、キマーゼはフェニルアラニンまたはロイシン、メターゼはメチオニン、セラーゼはセリンの後方を切断する（Rawlings, N.D.およびA.J. Barrett (1994) Meth. Enz. 244:19-61)。
【０００９】
哺乳類セリンプロテアーゼのほとんどは、酵素前駆体すなわち、タンパク質分解によって活性化される不活性な前駆体として合成される。例えば、トリプシノーゲンはエンテロペプチダーゼによって、その活性型であるトリプシンに変換される。エンテロペプチダーゼは、トリプシノーゲンからN末端断片を取り除く腸管プロテアーゼである。残った活性断片がトリプシンで、そのトリプシンが他の膵臓酵素の前駆体を活性化する。同様に、トロンビンの前駆体であるプロトロンビンのタンパク質分解は、3つの別々のポリペプチド断片を生成する。N末端断片は放出されるが、活性なトロンビンを構成するほかの2つの断片は、ジスルフィド結合を介して結合したままである。
【００１０】
最大のSPサブファミリーは、キモトリプシン（S1）サブファミリーとサブチリシン（S8）サブファミリーの2つである。キモトリプシンファミリーのメンバーの中には、このファミリーに特有の2つの構造的ドメインを含んでいるものがある。クリングルドメインは、さまざまなコピー数で見られる、3重ループでジスルフィドクロスリンクしたドメインである。クリングルは、膜、他のタンパク質またはリン脂質などのメディエーターの結合、および、タンパク質分解活性の制御の役割を果たしていると考えられている（PROSITE PDOC00020）。アップル（Apple）ドメインは90アミノ酸反復ドメインで、それぞれが6つの保存されたシステインを含んでいる。3つのジスルフィド結合が、第1と第6、第2と第5、第3と第4のシステインを連結する（PROSITE PDOC00376）。アップルドメインは、タンパク質間相互作用に関する。S1ファミリーのメンバーには、トリプシン、キモトリプシン、凝固第IX因子から凝固第XII因子、補体のB因子、C因子、D因子、グランザイム、カリクレイン、組織プラスミノゲンアクチベーター、および、ウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーターが含まれる。サブチリシンファミリーは、真正細菌、古細菌、真核生物、ウイルスに見られるメンバーをもつ。サブチリシンには、プロタンパク質プロセシングエンドペプチダーゼのケキシンとフリン(furin)、および、下垂体プロホルモン変換酵素のPC1、PC2、PC3、PC6とPACE4が含まれる（RawlingsおよびBarrett、前出）。
【００１１】
SPは、正常な多くのプロセスにおける機能をもち、その内のいくつかは疾病の原因あるいは治療に関係していると推定されている。エンテロキナーゼは腸内消化のイニシエーターで腸の刷子縁に見られ、そこでエンテロキナーゼは酸性プロペプチドをトリプシノーゲンから切断して活性トリプシンを産生する（Kitamoto, Y. 他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7588-7592)。アンジオテンシンIIおよびアンジオテンシンIIIや［des-Arg9］ブラジキニンといったペプチドを切断するリソソームセリンペプチダーゼであるプロリルカルボキシペプチダーゼは、セリンカルボキシペプチダーゼファミリーおよびプロリルエンドペプチダーゼファミリーのメンバーと配列相同性を共有している（Tan, F. 他(1993) J. Biol. Chem. 268:16631-16638)。プロテアーゼであるニューロプシンは、神経シグナル伝達に反応して海馬状隆起でのシナプス形成とニューロン結合性に影響する可能性がある（Chen, Z.-L. 他(1995) J Neurosci 15:5088-5097)。組織プラスミノーゲン活性化因子は卒中(Zivin, J.A. (1999)Neurology 53:14-9)や心筋梗塞(Ross, A.M. (1999) Clin Cardiol 22:165-71)の緊急処置に有用である。いくつかの受容体（PAR：プロテイナーゼ活性化受容体）は消化管全体にわたって高度に発現し、タンパク質分解による細胞外ドメイン切断によって活性化される。PARに対する主要なアゴニストであるトロンビン、トリプシンやマスト細胞トリプターゼは、アレルギーや炎症性の状態の際に放出される。プロテアーゼによるPAR活性化の制御は有望な治療標的であると示唆されている(Vergnolle, N. (2000) Aliment. Pharmacol. Ther. 14:257-266; Rice, K.D. 他(1998) Curr. Pharm. Des. 4:381-396)。前立腺特異抗原（PSA）は、前立腺の上皮細胞によってのみ合成され分泌されるカリクレイン様セリンプロテアーゼである。血清PSAは前立腺癌において増加し、癌進行のモニタリングと治療に対する反応との最も敏感な生理学的マーカーである。PSAはまた、前立腺を転移性腫瘍の起源として同定できる(Brawer, M. K. およびLange, P. H. (1989) Urology 33:11-16)。
【００１２】
カリクレインは、セリンプロテアーゼのサブファミリーである。KLK14というカリクレイン遺伝子の位置は、ヒトのカリクレイン遺伝子座である19q13.4内にある。KLK14は約5.4 kbの長さであり、前立腺と骨格筋とにのみ存在する２種の選択的転写物を転写する。前立腺ではKLK14は良性と悪性の双方の腺上皮細胞によって発現されるので、他の２種の前立腺カリクレインであるKLK2とKLK3とに似た発現パターンを示す。KLK2とKLK3は、K2と前立腺特異抗原とを各々コードする(Hooper, J.D. 他(2001) Genomics 73:117-122)。
【００１３】
シグナルペプチダーゼは、数種のタンパク質からシグナルペプチドをプロセシングする役割を果たす、すべての原核細胞および真核細胞のタイプに見られるSPの特殊クラスである。シグナルペプチドは、タンパク質のアミノ末端ドメインであり、リボソーム集合部位から特定の細胞内の位置あるいは細胞外の位置にタンパク質を導く。いったんタンパク質が搬出されると、シグナルペプチダーゼによるシグナル配列の除去および翻訳後プロセシング（例えば、グリコシル化あるいはリン酸化）によってタンパク質が活性化する。シグナルペプチダーゼは、酵母と哺乳類の両方でマルチサブユニット複合体として存在する。イヌのシグナルペプチダーゼ複合体は5つのサブユニットから構成され、そのすべてがミクロソーム膜に結合しており、その膜を1回以上貫通する疎水性領域を含んでいる（Shelness, G.S. および G. Blobel (1990) J. Biol. Chem. 265:9512-9519）。これらのサブユニットの中には、複合体を膜の上の適切な位置に固定するのに役立つものもある一方、実際の触媒活性を含むものもある。
【００１４】
活性部位にセリンをもつプロテアーゼの別のファミリーは、その活性をATP加水分解に依存している。これらのプロテアーゼは、ATP/GTP結合モチーフであるP-loopの存在によって同定されうる調節ATPaseドメインとタンパク質分解コアドメインを含む（PROSITE PDOC00803）。このファミリーのメンバーは、真核ミトコンドリアマトリックスプロテアーゼ、Clpプロテアーゼ、およびプロテアソームを含む。Clpプロテアーゼは元来、植物の葉緑体で発見されたが、原核細胞および真核細胞の両方に広がっていると考えられている。早発性捻転ジストニーの遺伝子は、Clpプロテアーゼに関連する或るタンパク質をコードする（Ozelius, L.J. 他(1998) Adv. Neurol. 78:93-105)。
【００１５】
プロテアソームは幾つかの細菌や全ての真核細胞に見られる細胞内プロテアーゼ複合体で、細胞生理における重要な役割を果たす。プロテアソームはユビキチン抱合システム（UCS）に関連し、このシステムは、転写や細胞周期進行といった細胞プロセスを活性化または抑圧する機能をもつタンパク質など、全タイプの細胞タンパク質の分解の主要経路となる（Ciechanover, A. (1994) Cell 79:13-21）。UCS経路において、分解の標的となるタンパク質は、小さな熱安定タンパク質であるユビキチンに抱合される。そして、ユビキチン化されたタンパク質は、プロテアソームによって認識され分解される。結果として得るユビキチンペプチド複合体は、ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素によって加水分解され、遊離ユビキチンはUCSによる再利用のために放出される。ユビキチンプロテアソームシステムは、有糸分裂周期キナーゼ、腫瘍性タンパク質、腫瘍抑制遺伝子（p53）、シグナル伝達に関連する細胞表面受容体、転写制御因子、および、変異または損傷したタンパク質の分解に関与すると思われている（Ciechanover、前出）。この経路は嚢胞性線維症、Angelman症候群およびリドル症候群を含む多数の疾患に関与している(Schwartz, A.L.およびA. Ciechanover (1999) Ann. Rev. Med. 50:57-74に概説)。マウスの癌原遺伝子であるUnpは或る核ユビキチンプロテアーゼをコードし、その過剰発現はNIH3T3細胞の発癌性形質転換を起こさせる。この遺伝子のヒト相同体は、肺の小細胞腫瘍や肺腺癌において常に増加している（Gray, D.A. (1995) Oncogene 10:2179-2183）。ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素は、リンパ芽球性白血病細胞株が、分裂しない成熟状態に分化することに関与する（Maki, A. 他(1996) Differentiation 60:59-66)。ニューロンでは、ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素（PGP 9.5）発現は、ヒト神経変性疾患に起こる異常な構造において強度である（Lowe, J. 他(1990) J. Pathol. 161:153-160)。プロテアソームは大きい(~2000 kDa)多サブユニット複合体で、中央触媒コアに、活性部位が中央の空洞に向いた4つの七員環状に配列された多様なプロテアーゼを含む。末端のATPアーゼサブユニット群は空洞の外部ポートを覆っており、基質が入るのを調節する（概説はSchmidt, M. 他(1999) Curr. Op. Chem. Biol. 3:584-591参照)。
【００１６】
システインプロテアーゼ
システインプロテアーゼ（CP）は、前駆体タンパク質のプロセシングから細胞内分解にわたる多様な細胞プロセスに関与している。知られているCPの約半数は、ウイルス内にのみ存在する。CPは、触媒がチオエステル中間体を介して進行し近くのヒスチジン残基とアスパラギン残基によって促進される活性部位での主な触媒残基としてシステインをもつ。或るグルタミン残基も重要であるが、それはオキサニオン穴の形成を助けるからである。2つの重要なCPファミリーに、パパイン様酵素（C1）およびカルパイン（C2）がある。パパイン様ファミリーのメンバーは、一般的にリソソーム型あるいは分泌され、したがって、プロペプチドと同様にシグナルペプチドと合成される。ほとんどのメンバーは、構造的重要性をもつ可能性のあるプロペプチドに保存モチーフをもつ（Karrer, K.M. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3063-3067)。パパインファミリーのメンバーの3次元構造は、2つの葉の間に位置する触媒部位をもつ2葉分子を示す。パパインにはカテプシンB、C、H、L、S、数種の植物アレルゲン、並びにジペプチジルペプチダーゼが含まれる(概説はRawlings, N.D.およびA.J. Barrett (1994) Meth. Enz. 244:461-486を参照)。
【００１７】
広範に発現するCPがある一方で、免疫系細胞によってのみ産生されるCPもある。特記すべきは、炎症部位に移動して組織修復に関与する分子を分泌する単球、マクロファージ、および他の細胞によってCPが産生されることである。これら修復分子の過剰は数種の疾患で役割を果たす。慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患において、システインペプチダーゼカテプシンCの分泌は、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、およびその他の骨の細胞外マトリックスに見られる構造タンパク質を分解する。そのような分解によって弱められた骨はまた、腫瘍浸潤と転移を受けやすくなる。カテプシンL発現はまた、リウマチ滑膜の破壊を悪化させる単核細胞の流入に寄与する可能性がある（Keyszer, G.M. (1995) Arthritis Rheum. 38:976-984）。
【００１８】
カルパインは、N末端触媒ドメインとC末端カルシウム結合ドメインの両方を含むカルシウム依存性細胞質エンドペプチダーゼである。カルパインは、それぞれのアイソフォームに特有の触媒サブユニットと異なるアイソフォームに共通の調節サブユニットからなるプロ酵素ヘテロダイマーとして発現される。各サブユニットは、カルシウム結合EFハンドドメインを有する。調節サブユニットはまた、酵素が細胞膜と結合できるようにする疎水性グリシンリッチドメインを含む。カルパインは増加した細胞内カルシウム濃度によって活性化され、高次構造に変化を起こさせ、限られた自己分解を誘導する。結果として生じる活性分子は、その作用に低いカルシウム濃度を必要とする(Chan S.L. および Mattson M.P. (1999) J. Neurosci. Res. 58:167-190)。カルパインの発現は他の組織でも見られるが、主にニューロンに見られる。筋萎縮性側索硬化症（ALS）、パーキンソン病、アルツハイマー病を含むいくつかの慢性神経変性疾患は、増加したカルパイン発現に関連している（Chan および Mattson、前出）。細胞骨格のカルパイン媒介分解が、頭部外傷による脳損傷に寄与しているという示唆がある（McCracken, E. 他(1999) J. Neurotrauma 16:749-61)。カルパイン3は主に骨格筋に発現し、肢帯型筋ジストロフィータイプ2Aの原因である（Minami, N. 他(1999) J. Neurol. Sci. 171:31-37)。
【００１９】
チオールプロテアーゼの別のファミリーのカスパーゼは、アポトーシスの開始段階と実行段階に関与している。プロアポトーシス性シグナルは、タンパク質分解カスパーゼカスケードを引き起こすイニシエーターカスパーゼを活性化でき、標的タンパク質の加水分解と典型的なアポトーシス細胞死に導く。2つの活性部位残基、システインとヒスチジンは、触媒機序に関与すると考えられている。カスパーゼは最も特異的なエンドペプチダーゼの1つで、アスパラギン酸残基の後で切断する。カスパーゼは不活性酵素前駆体として合成され、この前駆体は、小さなスペーサー領域によって分離される1つの大きな（p20）サブユニットと1つの小さな（p10）サブユニット、および、可変N末端プロドメインからなる。このプロドメインは、アポトーシスに正または負に影響しうる補助因子と相互作用する。活性化シグナルが、特異的アスパラギン酸残基（カスパーゼ1の番号付け規則ではD297）の自己タンパク質分解切断およびスペーサーとプロドメインの除去を引き起こし、p10/p20ヘテロダイマーを残す。これらのヘテロダイマーの2つが、その小サブユニットを介して相互作用し、触媒的に活性な四量体を形成する。カスパーゼファミリーのいくつかのメンバーの長いプロドメインが、プロカスパーゼの二量体化と自己プロセシングを促進していることが示されている。幾つかのカスパーゼはそのプロドメインに「デスエフェクタードメイン」を含み、それによって、他のカスパーゼおよび、FADDタンパク質会合細胞死受容体（death receptor）との自己活性化複合体に、あるいはTNF受容体複合体に、カスパーゼが補充されうる。さらに、カスパーゼファミリーの異なるメンバーからの2つの二量体が会合して、結果として得る四量体の基質特異性を変えることができる。内在性カスパーゼ阻害剤（アポトーシスタンパク質阻害剤（IAP））もまた存在する。これら相互作用のすべてはアポトーシスの制御に明らかに作用する(概説はChan及びMattson, 前出; Salveson, G.S. 及び V.M. Dixit (1999) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96:10964-10967)。
【００２０】
カスパーゼは数多くの疾病に結びつけられる。いくつかのカスパーゼを欠いているマウスは、神経上皮のアポトーシス不全により神経系に重度の欠陥をもっており、致死が早くなる。他のカスパーゼを欠くマウスは炎症反応に重度の欠陥を持つが、これはカスパーゼがIL-1bとおそらく他の炎症性サイトカインのプロセシングを担うからである（ChanおよびMattson、前出）。牛痘ウイルスとバキュロウイルスはカスパーゼを標的とし、宿主細胞の死を回避して感染の成功を促進する。更に、不適切アポトーシスの増加がAIDS、神経変性疾患、虚血損傷で報告されている一方、細胞死の減少は癌に関連する（SalvesonおよびDixit、前出; Thompson, C.B. (1995) Science 267:1456-1462）。
【００２１】
アスパルチルプロテアーゼ
アスパルチルプロテアーゼ（AP）は、キモシン、レニン、胃ペプシン、リソソームプロテアーゼのカテプシンDとEを含む。レトロウイルスは、通常、polポリタンパク質の一部として或るAPをコードするものがほとんどである。酸プロテアーゼとも呼ばれるAPは2つのドメインからなる単量体酵素で、各々のドメインは半分の活性部位とそれ自身の触媒アスパラギン酸残基を含む。APはpH2から3の範囲で最も活性が高く、アスパラギン酸残基の1つはイオン化されもう1つは中性になる。APのペプシンファミリーは分泌酵素を多く含み、すべてシグナルペプチドおよびプロペプチドが付いて合成されるようである。ほとんどのファミリーのメンバーは3つのジスルフィドループをもち、最初の約5残基のループが最初のアスパラギン酸に続き、第2の5〜6残基ループが第2アスパラギン酸の前にあり、第3で最大のループはC末端の方にある。一方、レトロペプシンはペプシンの単一ドメインに類似する。またホモ二量体として活性化し、各レトロペプシン単量体は半分の活性部位に寄与する。レトロペプシンはウイルス性ポリタンパク質のプロセシングに必要である。
【００２２】
APは多様な組織における役割をもち、そのいくつかは疾病に関連する。レニンは、電解質バランスと血圧の制御を担っているホルモン、アンジオテンシンのプロセシングにおいて第1段階を媒介している（Crews, D.E. および S.R. Williams (1999) Hum. Biol. 71:475-503の概説を参照）。カテプシンの異常な調整と発現は、多様な炎症性の病状において明らかである。カテプシンDの発現は、慢性関節リウマチおよび骨関節炎の患者から取った滑膜組織において増加している。カテプシンの増加した発現および差次的制御は、さまざまな癌の潜在的な転移性と関係がある（Chambers, A.F. 他(1993) Crit. Rev. Oncol. 4:95-114)。
【００２３】
メタロプロテアーゼ
メタロプロテアーゼは活性のために金属イオンを必要とし、通常はマンガンか亜鉛である。亜鉛依存メタロプロテアーゼのほとんどは、亜鉛結合ドメインにおける共通の配列をもつ。活性部位は、亜鉛リガンドとして作用する2つのヒスチジンと、第1ヒスチジンまでの触媒グルタミン酸C末端とからなる。このシグネチャ配列を含んでいるタンパク質はメトジンシンとして知られており、アミノペプチダーゼN、アンジオテンシン変換酵素、ニューロリシン、マトリックスメタロプロテアーゼ、および、アダマリシン（ADAMS）が含まれる。代替の配列が亜鉛カルボキシペプチダーゼに見られ、3つすべての保存残基（2つのヒスチジンと1つのグルタミン酸）が亜鉛結合に関与している。
【００２４】
アンジオテンシン変換酵素およびアミノペプチダーゼを含む数多くの中性メタロエンドペプチダーゼは、ペプチドホルモンの代謝に関与している。アミノペプチダーゼBの活性亢進は例えば、高血圧ラットの副腎や神経下垂体に見られる(Prieto, I.他(1998) Horm. Metab. Res. 30:246-248)。オリゴペプチダーゼM／ニューロリシンは、ニューロテンシンと同様にブラジキニンを加水分解できる（Serizawa, A. 他(1995) J. Biol. Chem 270:2092-2098)。ニューロテンシンは脳の神経伝達物質として作用しうる血管作動性ペプチドで、脳では食物摂取の制限に関与すると考えられる（Tritos, N.A.他(1999) Neuropeptides 33:339-349)。
【００２５】
マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）は、細胞外マトリックス（ECM）の成分を分解できる少なくとも23の酵素のファミリーである。MMPはN末端触媒ドメインをもつZn⁺²エンドペプチダーゼである。MMPファミリーのほぼ全てのメンバーは、ECM内の基質分子に結合、または組織によって産生される阻害因子（TIMP：メタロプロテアーゼ組織インヒビター; Campbell, I.L. 他 (1999) Trends Neurosci. 22:285）に結合できるC末端ドメインと或るヒンジペプチドとをもつ。フィブロネクチン様リピート、膜貫通ドメイン、またはC末端ヘモペキシナーゼ様ドメインの存在は、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン、および膜タイプMMPサブファミリーにMMPを分類するのに使用できる。不活性型では、活性部位のZn⁺²イオンはプロ配列内システインと相互作用する。活性化因子は、Zn⁺²システイン相互作用すなわち「システインスイッチ」を妨害して、活性部位を露出させる。これは酵素を部分的に活性化し、その酵素はプロペプチドを切断して完全に活性になる。MMPは、セリンプロテアーゼであるプラスミンとフリン(furin)とによってしばしば活性化される。MMPは、しばしば阻害剤との化学量論的で非共有結合の相互作用によって調整されるので、プロテアーゼの、阻害剤に対するバランスが、組織恒常性において非常に重要である（概説はYong, V.W. 他(1998) Trends Neurosci. 21:75)。
【００２６】
MMPは、骨関節炎（Mitchell, P. 他 (1996) J. Clin. Inv. 97:761）、アテローム硬化性プラーク破裂（Sukhova, G.K. 他 (1999) Circulation 99:2503）、大動脈瘤（Schneiderman, J. 他 (1998) Am. J. Path. 152:703）、不治の傷（Saarialho-Kere, U.K. 他 (1994) J. Clin. Inv. 94:79）、骨吸収（Blavier, L. および J.M. Delaisse (1995) J. Cell Sci. 108:3649）、年齢に関連する黄斑変性症（Steen, B. 他 (1998) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39:2194）、肺気腫（Finlay, G.A. 他 (1997) Thorax 52:502）、心筋梗塞（Rohde, L.E. 他 (1999) Circulation 99:3063）、および、拡張型心筋症（Thomas, C.V. 他 (1998) Circulation 97:1708）を含む数多くの疾病に結びつけられる。MMP阻害剤は、ラットにおいて乳癌と実験的腫瘍の転移を阻止し、マウスにおいては、ルイス肺癌、血管腫、およびヒト卵巣癌の異種移植を阻止する（Eccles, S.A. 他 (1996) Cancer Res. 56:2815; Anderson 他 (1996) Cancer Res. 56:715-718; Volpert, O.V. 他 (1996) J. Clin. Invest. 98:671; Taraboletti, G. 他 (1995) JNCI 87:293; Davies, B. 他 (1993) Cancer Res. 53:2087）。MMPはアルツハイマー病において活性である場合がある。数多くのMMPは多発性硬化症に結びつけられ、MMP阻害剤の投与により症状のいくつかを軽減できる（前出のYongの概説を参照）。
【００２７】
メタロプロテアーゼの別のファミリーはADAM（「或るディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼドメイン：A Disintegrin And Metalloprotease Domain」から命名）で、非常に近縁のアダマリシン（ヘビ毒メタロプロテアーゼ（SVMP））とそのドメインを共有している。ADAMは、細胞表面接着分子とプロテアーゼの両方の特徴を組み合せ、プロドメイン、プロテアーゼドメイン、ディスインテグリンドメイン、システインリッチドメイン、上皮成長因子リピート、膜貫通ドメイン、および、細胞質内尾部を含んでいる。上記した最初の3つのドメインはSVMPにも見られる。ADAMは、4つの潜在的機能をもつ。すなわち、タンパク質分解、接着、シグナル伝達、融合である。ADAM類はメトジンシン亜鉛結合配列を共有し、TIMP-1など幾つかのMMPアンタゴニストによって抑制される。
【００２８】
ADAMは、精子と卵子の結合と融合、筋芽細胞融合、および、サイトカイン、サイトカイン受容体、接着タンパク質、その他細胞外タンパク質ドメインの、タンパク質-外部ドメインのプロセシングや分断といったプロセスに関与すると考えられる（Schlondorff, J. および C.P. Blobel (1999) J. Cell. Sci. 112:3603-3617）。クズバニアン（Kuzbanian）タンパク質はNOTCH経路の基質（おそらくNOTCH自身）を切断し、ショウジョウバエの神経発達における側抑制のプログラムを活性化する。2つのADAMであるTACE（ADAM 17）とADAM 10は、脳内のアミロイド前駆体タンパク質のプロセシングにおいて類似した役割をもつと提案されている（Schlondorff および Blobel、前出）。TACEはTNF活性化酵素としても同定されている（Black, R.A. 他(1997) Nature 385:729)。TNFは感染あるいは外傷に反応して宿主防御を起動させるのに重要な多面的サイトカインであるが、過剰になると重度の損傷を引き起こすことがあり、しばしば自己免疫疾患において過剰産生される。TACEは、膜結合型プロTNFを切断して可溶型を放出する。他のADAMは、他の膜結合型分子の同様のタイプのプロセシングに関与している可能性がある。
【００２９】
ADAMTSサブファミリーはADAMファミリーのメタロプロテアーゼの全特徴をもち、更なるトロンボスポンジンドメイン（TS）を含む。プロトタイプADAMTSがマウスで同定されており、心臓および腎臓で発現され、炎症誘発性刺激によってアップレギュレートされる（Kuno, K.他(1997) J. Biol. Chem. 272:556)。現在まで、11のメンバーがヒトゲノム解析機構（HUGO; http://www.gene.ucl.ac.uk/users/hester/adamts.html#Approved）によって認識されている。このファミリーのメンバーは、軟骨に圧縮性などの重要な機械的特性をもたらし関節炎の発生時に失われる高分子量プロテオグリカンのアグリカンを分解する。したがって、アグリカンを分解する酵素は、関節軟骨の分解を阻止し遅くする魅力的な標的と考えられている（Tortorella, M.D. (1999) Science 284:1664; Abbaszade, I. (1999) J. Biol. Chem. 274:23443などを参照）。他のメンバーは抗血管新生の可能性(Kuno他、前出)および/またはプロコラーゲンプロセッシング(Colige, A. 他(1997) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 94:2374)を有することが報告されている。
【００３０】
全てのMDCファミリー膜内在タンパク質のメンバーは、1つのメタロプロテイナーゼ様ドメイン、1つのディスインテグリン様ドメイン、1つのシステインリッチドメインを持つ。これらのMDCは広範な哺乳動物組織に見られ、多くは男性生殖路で豊富に発現される。多数のMDCタンパク(fertilin(ファーティリン)α、fertilinβ、tMDC I、tMDC II、tMDC III)は精子形成細胞に局在し、精子が副睾丸を通る際にプロセッシングされ、成熟精子上でディスインテグリンドメインを保持するタンパク質が産生される。fertilinβとtMDC Iは卵の認識に関わると思われる。この認識は、ディスインテグリン-インテグリン相互作用が媒介する(Frayne, J. 他(1998) J. Reprod. Fertil. Suppl. 53:149-155)。
【００３１】
マンガン金属酵素の例としては、アミノペプチダーゼPおよびヒトのプロリンジペプチダーゼ（PEPD）が含まれる。アミノペプチダーゼPは、さまざまな炎症性反応において活性化されるノナペプチドであるブラジキニンを分解できる。アミノペプチダーゼPは、冠状動脈の虚血および再灌流傷害に関係すると考えられている。アミノペプチダーゼP阻害剤の投与は、ラットにおいて心臓を保護する効果をもつことが示されている（Ersahin, C. 他 (1999) J. Cardiovasc. Pharmacol. 34:604-611）。
【００３２】
プロテアーゼインヒビター
プロテアーゼインヒビターおよびその他のプロテアーゼ活性の調節因子は、プロテアーゼの活性および効果を調節する。プロテアーゼインヒビターは、蛋白分解疾患の動物モデルにおける病因を調節すると報告された（Murphy, G. (1991) Agents Actions Suppl. 35:69-76）。HIV患者において、プロテアーゼインヒビターは疾患の進行を防ぎ、死亡率を下げるのに有効であることが示されている(Barry, M. 他(1997) Clin. Pharmacokinet. 32:194-209)。システインプロテアーゼの低分子量インヒビターであるシスタチン濃度の低下は腫瘍の悪性進行と相関する(Calkins, C. 他(1995) Biol. Biochem. Hoppe Seyler 376:71-80)。プロテアーゼインヒビターのシスタチンスーパファミリーは、直線的に配列され、直列にリピートされるジスルフィドループのパターンを特徴とする(Kellermann, J.他(1989) J. Biol. Chem. 264:14121-14128)。シスタチンスーパファミリーの中の新規ファミリーの代表的な構造的プロトタイプの例が、肝臓で合成され、骨の基質、象牙質および他のミネラル化組織に選択的に集中している血漿タンパク質であるヒトα2-HS糖タンパク質(AHSG)であり(Triffitt, J.T. (1976) Calcif. Tissue Res. 22:27-33)、これはまた、fetuin(フェツイン)ファミリーに属するとしても分類されている。fetuinは、2つのN末端に位置するシステイン様リピートと、シスタチンスーパーファミリーの他のタンパク質に存在しない或る独特のC末端ドメインが存在することが特徴である(PROSITE PDOC00966)。AHSGは骨の形成と再吸収、および免疫応答に関与するとの報告がある(Yang, F. 他(1992) 1130:149-156; Lee, C.C. 他(1987) PNAS USA 84:4403-4407; Nakamura, O. 他(1999) Biosci. Biotechnol. Biochem. 63:1383-1391)。さらに、AHSGは子宮内膜症に関連する不妊症(Mathur, S.P. (2000) Am. J. Reprod. Immunol. 44:89-95; Mathur, S.P. 他 (1999) Autoimmunity 29:121-127) および骨形成の抑制に関係している (Binkert, C. 他 (1999) J. Biol Chem. 274:28514-28520)。急性白血病、慢性顆粒球・骨髄性単球白血病、リンパ腫、骨髄線維症、多発性骨髄腫、転移化固形腫瘍、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、急性アルコール性肝炎、脂肪肝、慢性活動性肝炎、肝硬変、急性・慢性膵炎およびクローン病の患者においてAHSGの血清濃度の減少が検出されている(Kalabay, L.他(1992) Orv. Hetil. 133:1553-1554; 1559-1560)。serpin(セルピン)は哺乳動物血漿セリンプロテアーゼのインヒビターである。多くのserpinが、哺乳動物における血液凝固カスケードおよび／または補体カスケードの調節に作用する。SP32は哺乳動物アクロソームプロテアーゼであるアクロシンの正の調節因子である。SP32はプロ酵素であるプロアクロシンと結合し、この酵素をアクロソームマトリックスに詰める助けをする（T. Baba他(1994) J. Biol. Chem. 269:10133-10140)。セリンプロテアーゼインヒビターのKunitzファミリーは１つ以上の「Kunitzドメイン」によって特徴づけられる。Kunitzドメインは一連のシステイン残基を含み、それらは約５０個のアミノ酸残基の間隔で規則的に離れた位置にあり、３つの鎖内ジスルフィド結合を形成する。このファミリーのメンバーには、アプロチニン、組織因子経路インヒビター（TFPI-1およびTFPI-2）、インターαトリプシンインヒビター(ITI)、およびビクニン（bikunin）が含まれる(Marlor, C.W. 他(1997) J. Biol. Chem. 272:12202-12208)。このファミリーのメンバーは、カリクレインおよびプラスミンなどのセリンプロテアーゼに対する強力なインヒビター（ナノモル範囲内）である。臨床有用性として、術中の失血の低減がある。ITIは、ヒトのトリプシン、キモトリプシン、好中球エラスターゼ、カテプシンGを不活性にすることが知られている(Morii, M. 他(1985) Biol. Chem. Hoppe Seyler 366:19-21); また、細胞外基質の生物学および慢性気管支肺疾患または肺癌の進行の病態生理において重要な役割を果たすと推測される(Cuvelier, A.他(2000) Rev. Mal. Respir. 17:437-446)。
【００３３】
eppin(副睾丸プロテアーゼ阻害因子)ファミリーのプロテアーゼ阻害因子は、副睾丸と睾丸とで発現される。2種のeppinのアイソフォームは、KunitzタイプとWAPタイプとの双方の4つのジスルフィドコアプロテアーゼ阻害因子コンセンサス配列群を持つ。Eppin-1は睾丸と副睾丸でのみ発現され、Eppin-2は副睾丸でのみ発現され、Eppin-3は睾丸でのみ発現される(Richardson, R.T. 他(2001) Gene 270:93-102)。
【００３４】
ヒトのシスタチンCは、システインプロテアーゼの強力なインヒビターである。また、アミロイド形成特性を持つ。シスタチンCはリフォールドして非常に密接した2つ折の対称二量体を産生するが、単量体形の二次構造を保持する。この構造が示唆する機序は、アミロイド血管症の高齢者の脳動脈内の凝集メカニズムである。より重度な「立体構造病（conformational disease）」はヒトのシスタチンCのL68Q突然変異体に伴うもので、大量のアミロイドーシス（massive amyloidosis）、脳出血、若年での死亡をもたらす(Janowski, R. 他(2001) Nat. Struct. Biol. 8(4):316-20)。
【００３５】
真核細胞内で合成される全てのタンパク質の主要部は、小胞体(ER)の細胞質ゾル表面上で合成される。これらの未熟タンパク質は、細胞の他の細胞小器官に送られるか、または分泌される前に、翻訳後修飾が行われる小胞体の内部ルーメンに輸送される必要がある。これらの修飾にはタンパク質折り畳みやジスルフィド結合形成およびN結合グリコシル化がある。
【００３６】
タンパク質異性化酵素
ER内でのタンパク質の折り畳みは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)とペプチジル-プロリルイソメラーゼ(PPI)の2種類の主なタンパク質イソメラーゼによって補助される。PDIはシステイン残基における遊離スルフヒドリル基の酸化を触媒してタンパク質内に分子内ジスルフィド結合を形成する。オリゴペプチドおよびタンパク質における幾つかのプロリンイミド結合の異性化を触媒する酵素であるPPIは多くのタンパク質を最終的機能的高次構造に折り畳む際の律速段階の一つを支配するとみなされる。シクロフィリンは、元来、免疫抑制薬シクロスポリンAの主要な受容体として同定された主なクラスのPPIを指す(Handschumacher, R.E. 他(1984) Science 226:544-547)。
【００３７】
タンパク質のグリコシル化
タンパク質における、大部分の可溶性分泌および膜結合タンパク質の、アスパラギン残基結合寡糖類によるグリコシル化もまた、ER(小胞体)において行われる。この反応は、膜結合酵素である寡糖類転移酵素によって触媒される。この「N結合」グリコシル化の正確な目的は知られていないが、寡糖類の存在は糖タンパク質をプロテアーゼ消化に対して耐性にする傾向がある。さらに、セレクチンと呼ばれる細胞表面タンパク質に付着した寡糖類は、細胞間接着過程において作用することがわかっている (Alberts, B. 他(1994) Molecular Biology of the Cell Garland Publishing Co., New York, NY. 608ページ)。タンパク質の「O-結合」グリコシル化もまた、小胞内においてセリンまたはトレオニン残基のヒドロキシル基へのN−アセチルガラクトサミンの付加、次いで、他の糖残基の最初の残基への連続的付加によって生じる。この過程は、各々が特定の供与体糖ヌクレオチドおよび受容体分子に特異的である一連の糖転移酵素によって触媒される(Lodish, H. 他(1995) Molecular Cell Biology, W. H. Freeman and Co., New York, NY 700-708ページ)。多くの場合、NおよびO-結合寡糖類は、タンパク質の分泌、または形質膜糖タンパク質の細胞表面への移動に必要であると思われる。例えばドリコール経路での糖転移酵素の1種であるドリコール燐酸マンノースシンターゼは、タンパクのNグリコシル化、Oマンノシル化、グリコシルホスファチジルイノシトール膜固着に必要である(Tomita, S. 他(1998) J. Biol. Chem. 9249-9254)。このように多くの場合、NおよびO-結合寡糖類は、タンパク質の分泌、または形質膜糖タンパク質の細胞表面への移動に必要であると思われる。
【００３８】
更なるグリコシル化機序はERにおいて特異的にリソソーム酵素を標的としてリソソームへ向かわせ、それらの分泌を妨げる。ER(小胞体)内のリソソーム酵素は形質膜タンパクおよび分泌タンパクのようにN結合性オリゴサッカライドを受け入れるが、更に一つまたは二つのマンノース残基がリン酸化される。マンノース残基のリン酸化は二段階で生じ、最初の段階はN-アセチルグルコサミンリン酸転移酵素によるN-アセチルグルコサミンリン酸残基の付加であり、二番目はホスホジエステラーゼによるN-アセチルグルコサミン基の除去である。リン酸化されたマンノース残基は次に該リソソーム酵素をマンノース6リン酸受容体に向かわせ、該受容体が該酵素をリソソーム小胞に輸送する(前出Lodish 他、708-711ページ)。
【００３９】
シャペロン
分子シャペロンは、未成熟タンパク質の適切な折り畳みや、不適切に折り畳まれたものの畳み直し、タンパク質サブユニット群のアセンブリ、および折り畳まれていないタンパク質の膜貫通輸送を補助するタンパク質である。シャペロンはまた、細胞が短時間高温に晒された後劇的に発現が増加される傾向があるため熱ショックタンパク質(hsp)と呼ばれている。この後者の特性は、おそらく、高温によって変性されたタンパク質は再折り畳みされる必要があるためと思われる。シャペロンはそれらの配置、機能および分子量にしたがって幾つかのクラスに分けることができ、hsp60、TCP1、hsp70、hsp40 (DnaJとも呼ばれる)およびhsp90が含まれる。例えばhsp90はステロイドホルモン受容体に結合し、リガンドの無い場合の転写を阻止し、ホルモンの存在下で受容体のリガンド結合ドメインの折り畳みを正常化する(Burston, S.G.およびA.R. Clarke (1995) Essays Biochem. 29:125-136)。Hsp60とhsp70シャペロンは新しく合成されたタンパク質の輸送と折り畳みを助ける。Hsp70はタンパク質の折り畳みの早期に作用し、新しく合成されたタンパク質がリボソームを離れる前に結合し、ミトコンドリアまたはERにタンパク質を輸送した後、折り畳まれたタンパク質を遊離する。hsp10とともにHsp60は誤って折り畳まれたタンパク質と結合し、タンパク質が正しく折り畳み直される機会を与える。すべてのシャペロンは不完全に折り畳まれたタンパク質上の疎水性パッチへの親和性と、ATPを加水分解する能力を共有する。ATP加水分解のエネルギーが使われ、適切に折り畳まれた状態のhsp結合タンパク質が遊離する(前出Alberts, B.他、214、571-572ページ)。
【００４０】
ジペプチジルペプチダーゼIはリソソームのシステインプロテアーゼであり、タンパク質の細胞内分解に重要である。また、免疫/炎症細胞の多くのセリンプロテイナーゼの活性化の中心的コーディネータであると思われる。その遺伝子は、染色体領域11q14.1-q14.3にマップされている。ジペプチジルペプチダーゼIの高レベル発現は肺、腎臓、胎盤で見られ、また多形核白血球、肺胞マクロファージ、それらの前駆細胞でも見られる(Rao, N.V. 他(1997) J. Biol. Chem.272:10260-10265)。
【００４１】
IAPタンパク質ファミリーはバキュロウイルスIAPリピート(BIR)ドメイン群を持ち、アポトーシスを阻害する。ヒトIAPファミリー遺伝子であるApollonがコードする530 kDaのタンパク質は、1つのBIRドメインと、1つのユビキチン抱合酵素ドメインとを持つ。Apollonは細胞がアポトーシスを受けないように保護することが観察されており、腫瘍形成と薬物耐性とに関わると思われる(Chen, Z. 他(1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 264:847-854）。
【００４２】
RTVL-Hファミリーは、ヒトなど霊長類のゲノム内に見られる内因性レトロウイルス様配列群の中反復(medium repetitive)ファミリーである。RTVL-Hエレメントの数種のサブファミリーが、タイプI、タイプIa、タイプIIと命名されている(Goodchild, N.L. (1993) Virology 196:778-788)。
【００４３】
リジルヒドロキシラーゼ
リジルヒドロキシラーゼ酵素は、コラーゲン生合成に関わる。コラーゲンファミリーの線維構造タンパクは、本質的に全ての組織に見られる。コラーゲンは哺乳類では最も豊富なタンパク質で、皮膚、骨、腱、軟骨、血管、歯など結合組織の形成に必須である。コラーゲンファミリーのメンバーは互いに、コラーゲン線維間の架橋の程度と、コラーゲン線維に付着した糖質ユニット(例えばガラクトースやグルコシルガラクトース)の数で区別できる。ヒドロキシル化したリジン残基(ヒドロキシリジン)が、架橋の安定に、また糖質ユニットの付着点として必須である。
【００４４】
酵素リジルヒドロキシラーゼがリジン残基のヒドロキシル化を触媒し、ヒドロキシリジンが形成される。リジルヒドロキシラーゼは、配列X-lys-gly(lysはリジン、glyはグリシン、Xは何れかのアミノ酸残基)のリジン残基を標的とする。リジルヒドロキシラーゼの3種のアイソフォームが特徴付けられており、命名はLH1(またはPLOD：プロコラーゲンリジン2-オキソグルタル酸5-ジオキシゲナーゼ)、LH2(またはPLOD2)、LH3である。3種の酵素は60％の配列同一性を全体として共有し、更に高い類似性をC末端領域に持つ。また分子の中央部の領域は、80%以上の同一性を持つ(Valtavaara, M. 他(1998) J. Biol. Chem. 273:12881-12886)。
【００４５】
リジルヒドロキシラーゼ活性の減少は、数種の結合組織障害に関わる。特定の突然変異、例えばPLODの遺伝子のコード領域内の切り詰めや重複が、タイプVIエーラース・ダンロス（Ehlers-Danos）症候群患者で記述されている(Hyland, J. 他(1992) Nature Genet.2:228-31; Hautala, T. 他(1993) Genomics 15:399-404)。
【００４６】
ユビキチン結合タンパク質
ユビキチン抱合システム（UCS）は、転写、細胞周期進行、免疫認識といった細胞プロセスを活性化または抑圧する機能をもつタンパク質など、全タイプの細胞タンパク質の分解の主要な経路である（Ciechanover, A. (1994) Cell 79:13-21）。ユビキチン抱合とタンパク質分解のプロセスには、幾つかのステップがある(Jentsch, S. (1992) Annu. Rev. Genet. 26:179-207)。第１番目にATP依存性反応で、小さな耐熱性タンパク質であるユビキチン(Ub)がユビキチン活性化酵素（E1）により活性化する。この反応はUbのC末端をE1内部システイン残基のチオール基に結合する。活性化したUbが次に、Ub抱合酵素（E2）のうちの1つに移る。異なるユビキチン依存性タンパク分解経路は構造的に類似するが異なるユビキチン抱合酵素を利用し、これら酵素は特定の分解シグナルを運ぶタンパク質に酵素を誘導する認識サブユニット群と会合する。E2は次に、C末端グリシンによりユビキチン-タンパク質リガーゼファミリー、E3のメンバーにUb分子を移す。次に、E3はUb分子を標的タンパク質に移す。付加的Ub分子が標的タンパク質に追加され多重Ub鎖構造を形成することがある。ユビキチン結合したタンパク質が次に、プロテアソームによって認識され分解される。プロテアソームは細胞内プロテアーゼ複合体であり、数種の細菌と、全ての真核細胞に見られる。結果として得られるユビキチンペプチド複合体はユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素によって加水分解され、遊離ユビキチンはUCSによる再利用のために放出される。
【００４７】
ユビキチンプロテアソームシステムは、有糸分裂周期キナーゼ、腫瘍性タンパク質、腫瘍抑制遺伝子（p53）、シグナル伝達に関連する細胞表面受容体、転写制御因子、および、変異または損傷したタンパク質の分解に関与すると示唆されている（Ciechanover、前出）。この経路は、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群を含む数多くの疾病に結びつけられている（Schwartz, A.L.およびA. Ciechanover (1999) Annu. Rev. Med. 50:57-74の概説を参照）。マウスの癌原遺伝子であるUnpは或る核ユビキチンプロテアーゼをコードし、その過剰発現はNIH3T3細胞の発癌性形質転換を起こさせる。この遺伝子のヒト相同体は、肺の小細胞腫瘍や肺腺癌において常に増加している（Gray, D.A. (1995) Oncogene 10:2179-2183）。ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素は、リンパ芽球性白血病細胞株が、分裂しない成熟状態に分化することに関与する（Maki, A. 他(1996) Differentiation 60:59-66)。ニューロンでは、ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素（PGP 9.5）発現は、ヒト神経変性疾患に起こる異常な構造において強度である（Lowe, J. 他(1990) J. Pathol. 161:153-160)。
【００４８】
更なるユビキチン様タンパクで、他の細胞タンパクを共有結合的に修飾できる能力をも持つタンパク質が近年、同定されている(概説はYeh, E.T.H. 他(2000) Gene 248:1-14;並びにJentsch, S.およびPyrowolakis, G. (2000) Trends Cell Biol. 10:335-342参照)。これらのユビキチン様タンパク修飾因子としては、セントリン(sentrin：別名SUMOタンパク)、NEDD8、Apg12がある。これらタンパク質の抱合経路は、ユビキチン経路に非常に似ている。例えばセントリンの抱合には、E1ヘテロダイマーであるAOS1/UBA2と、１つのE2酵素UBC9が必要である。最近発見されたタンパク質S3は、セントリンリガーゼとして機能する可能性がある。酵母タンパク質Ulp1は、セントリンヒドロラーゼである。酵母内でのUlp1の失活の結果、重度の細胞周期欠損が起こる。ヒトでは7種のセントリン特異的プロテアーゼ(SENP)が同定されており、サイズは238〜1112アミノ酸残基にわたる(前記Yeh)。全てのヒトSENPは或る保存C末端ドメインを共有する。N末端領域は、細胞配置と基質特異性とを調節している可能性がある。
【００４９】
セントリン結合は、ユビキチンのようにタンパク分解を促進しはしない。幾つかの場合、セントリン結合は、核小体内での標的タンパクの安定した局在に重要なようである。セントリン結合の基質としては、PML(RINGフィンガー蛋白であり腫瘍抑制活性を保有)、HIPK2(ホメオドメイン転写因子のコリプレッサー)、腫瘍抑制因子p53がある。IκBαは炎症関連タンパクの誘導に関わる転写因子NFκBのサイトゾル型インヒビターであり、これもセントリン結合の基質である。セントリン結合したIκBαはユビキチン結合できず、プロテアソーム分解に耐性なので、ユビキチン経路とセントリン経路との連関を示唆する(Jentsch, 前出)。
【００５０】
発現プロファイリング
マイクロアレイは、生物分析に用いる分析ツールである。マイクロアレイには複数の分子をを有し、それらは或る固体支持体の表面で空間的に分布し、その表面と安定して結合している。ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および/または抗体のマイクロアレイが開発され、その種々の用途には例えば遺伝子配列決定、遺伝子発現モニタリング、遺伝子マッピング、細菌同定、創薬、コンビナトリアルケミストリがある。
【００５１】
特にマイクロアレイを用いる領域は遺伝子発現分析である。アレイ技術は、単一の多型遺伝子の発現や、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロファイルを探求する、簡単な方法を提供し得る。単一遺伝子の発現を試験するときは、アレイを用いて或る特定遺伝子又はその変異体の発現を検出する。発現プロファイルを試験するときは、アレイは次のような遺伝子を同定するプラットフォームを提供する。即ちどの遺伝子が組織特異的か、毒性アッセイにおいてテストされる物質に影響されるか、シグナル伝達カスケードの一部であるか、ハウスキーピング機能を実行するか、又は、特定の遺伝的素因や、条件、疾患、又は障害に、特異的に関連する遺伝子であるかの同定である。
【００５２】
タンパク修飾に影響するステロイド
ステロイドは、コレステロール、胆汁酸、ビタミンD、ホルモン等の脂質可溶性分子の１クラスであり、シクロペンタノペルヒドロフェナントレン（cyclopentanoperhydrophenanthrene）に基づく共通な4リング構造を共有し、広範囲な機能を実施する。例えば、コレステロールは膜流動性を制御する細胞膜の1成分である。それは脂質を可溶化して、消化中に小腸で吸収を促進する胆汁酸の前駆体でもある。ビタミンDは小腸におけるカルシウムの吸収を調節し、血漿におけるカルシウムの濃度を制御する。副腎皮質、卵巣、精巣によって生成されるステロイドホルモンには、グルココルチコイド、電解質コルチコイド、アンドロゲン、エストロゲンが含まれる。それらは核内の特定の遺伝子の転写を調節する細胞内受容体に結合することにより、多様な生体プロセスを制御する。例えばグルココルチコイドは、肝臓における糖新生の調節により血糖濃度、脂肪組織のリポリシスの促進により脂肪酸の血中濃度を上昇させ、中枢神経内のカテコールアミンへの感度を調節し、炎症を減少する。主要な電解質コルチコイドであるアルドステロンは副腎皮質により生成され、ナトリウムイオン再吸収を促進するよう腎臓の遠位尿細管の細胞に作用する。精巣内のライディヒの間細胞により生成されるアンドロゲンには、思春期の変化すなわち精子の生成と第二次性徴の維持を誘発する男性ホルモンテストステロン等がある。女性ホルモンであるエストロゲンとプロゲステロンは、卵巣そしてさらに妊娠中に胎盤と胎児の副腎皮質により生成される。エストロゲンは、女性生殖プロセスと第二次性徴を調節する。プロゲステロンは、月経周期と妊娠中の子宮内膜における変化を調節する。
【００５３】
ステロイドホルモンは、避妊法、また怪我や関節炎、喘息、自己免疫障害等の疾患での抗炎症治療において広範囲に利用されている。天然のプロゲスチンであるプロゲステロンは、無月経、異常子宮出血を治療するために、または避妊薬として主に使用される。内因性のプロゲステロンは、エストロゲンに初回刺激された子宮の内膜内の受精卵着床に備えた分泌作用の誘導と妊娠維持を担う。それは黄体形成ホルモン(LH）に応答して黄体から分泌される。外因性のプロゲスチンの主要な避妊効果には、LHのmidcycle surge(月経中期サージ)の抑制が関係する。細胞レベルでプロゲスチンは自由に拡散して標的細胞に入っていき、プロゲステロン受容体に結合する。標的細胞には、女性の生殖管、乳腺、視床下部、下垂体がある。いったん受容体に結合すると、プロゲスチンは視床下部からのゴナドトロピン放出ホルモンの放出の頻度を遅くし、排卵前LHサージを鈍くする。それにより卵胞成熟と排卵を防ぐ。プロゲステロンには、最小限のエストロゲンとアンドロゲンの作用がある。プロゲステロンは、肝臓でプレグナンジオールに代謝され、グルクロン酸と抱合する。
【００５４】
6＿−メチル-17-ヒドロキシプロゲステロンとしても知られるメドロキシプロゲステロン(MAH)は、プロゲステロンよりも約15倍も大きな薬理学的作用を有する合成プロゲスチンである。MAHは腎臓癌と子宮内膜癌、無月経、異常子宮出血および、ホルモン失調と関連する子宮内膜症の治療のために使用される。MAHは呼吸中枢刺激作用を有し、睡眠時無呼吸、慢性閉塞性肺疾患あるいは炭酸過剰症によって引き起こされる、血液の低酸素化の症例に使用されている。
【００５５】
RU-486としても知られるミフェプリストンは、プロゲステロンの受容体を阻害する抗プロゲステロン剤である。それは、妊娠を維持するのに必要であるプロゲステロンの影響を打ち消す。ミフェプリストンは、妊娠初期に投与し、続いてプロスタグランジン系ミソプロストールで処置すると自然流産を誘発する。さらに研究によると、避妊手段を用いない性交の後、5日以内に投与するとミフェプリストンは非常に低量の投与で、性交後の避妊薬として非常に効果的になり得る。従って避妊失敗や性的暴行の場合の女性に「モーニングアフターピル」を提供する。ミフェプリストンにはまた、腫瘍がプロゲステロン依存性である場合の乳癌と卵巣癌の治療において潜在的な使用可能性がある。それは脳髄膜腫のステロイド依存性成長に干渉する。また子宮内膜組織のエストロゲン依存性成長を阻止して子宮内膜症の治療においても有用であろう。子宮類線維腫とクッシング症候群の治療においても有用であろう。ミフェプリストンは糖質コルチコイド受容体に結合し、コルチゾール結合に干渉する。ミフェプリストンは抗糖質コルチコイドとしても作用する可能性があり、AIDS、神経性無食欲症、潰瘍、糖尿病、パーキンソン病、多発性硬化症、アルツハイマー病等、コルチゾールレベルが上昇する症状の治療に効果がありうる。
【００５６】
ダナゾールは、エチニルテストステロン由来の合成ステロイドである。ダナゾールは、卵胞刺激ホルモンとLHの下垂体合成を低下させることによりエストロゲン生成を間接的に減少する。ダナゾールはまた標的組織内で性ホルモン受容体に結合して、同化作用、抗エストロゲン作用、弱いアンドロゲン作用を示す。ダナゾールはいかなるプロゲストゲン作用も有しておらず、コルチコトロピンの正常な下垂体放出あるいは副腎によるコルチゾールの放出を抑制しない。ダナゾールは、子宮内膜症の治療において、痛みを緩和し、子宮内膜細胞成長を阻害するために使用される。また乳腺症疾患と遺伝性血管浮腫の治療にも使用される。
【００５７】
コルチコステロイドは炎症を緩和して、免疫応答を抑制するために使用される。炎症反応を仲介するサイトカインの調節により、好酸球、好塩基球、気道上皮性細胞機能を阻害する。炎症部位で白血球浸潤を阻害し、炎症反応のメディエーターの機能に干渉し、さらに液性免疫応答を抑制する。コルチコステロイドは、アレルギー、喘息、関節炎、皮膚病を治療するために使用される。ベクロメタゾンは、ステロイド依存性喘息を治療、アレルギーまたは非アレルギー（血管運動性）鼻炎に付随する症状を緩和、あるいは外科的切除に続く再発性鼻ポリープを予防するために使用される合成グルココルチコイドである。鼻腔内ベクロメタゾンの抗炎症作用および血管収縮作用は、ヒドロコルチゾンによるものより5000倍強力である。ブデソニドは、アレルギー性鼻炎または喘息に付随する症状を制御するために使用されるコルチコステロイドである。ブデソニドは、全身作用は弱いが強い局所抗炎症作用を有する。デキサメタゾンは、抗炎症組成物または免疫抑制組成物において使用される合成グルココルチコイドである。喘息の症状を予防するため吸入薬においても使用される。中枢神経系に到達する強力な能力のために、デキサメタゾンは脳水腫を制御するために通常選択される治療である。デキサメタゾンは、ヒドロコルチゾンより約20〜30倍、そしてプレドニゾンより5〜7倍強力である。プレドニゾンは肝臓で代謝されて、活性型であるプレドニゾロン（抗炎症特性を有するグルココルチコイド）になる。プレドニゾンはヒドロコルチゾンより約4倍強力であり、そしてプレドニゾンの作用持続時間はヒドロコルチゾンとデキサメタゾンの中間である。プレドニゾンは、同種移植の拒絶反応、喘息、全身性紅斑性狼瘡、関節炎、潰瘍性大腸炎、その他の炎症症状を治療するために使用される。ベタメタゾンは抗炎症作用と免疫抑制作用を有する合成グルココルチコイドであり、乾癬と、水虫や白癬等の真菌感染症を治療するために使用される。
【００５８】
コルチコステロイドの抗炎症作用は、リポコルチンと総称されるホスホリパーゼA₂抑制タンパク質に関係すると考えられる。リポコルチン類はそれぞれ、前駆体分子アラキドン酸の放出を阻害することによりプロスタグランジン、ロイコトリエン等炎症の強力な媒介物の生合成を制御する。提案されている作用の機序には、減少したIgE合成、白血球上で増加したβ-アドレナリン受容体の数、減少したアラキドン酸代謝が含まれる。慢性気管支喘息等の即時アレルギー反応中、アレルゲンは肥満細胞の表面上のIgE抗体を架橋し、これらの細胞の化学走性物質の放出を誘発する。従って肥満細胞の流入と活性化が、喘息患者の口腔粘膜の炎症と過剰刺激感受性を部分的に担う。この炎症は、コルチコステロイドの投与によって遅れ得る。
【００５９】
毒性試験
アレイ技術は、単一の多型遺伝子の発現や、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロファイルを探求する、簡単な方法を提供し得る。単一遺伝子の発現を試験するときは、アレイを用いて或る特定遺伝子又はその変異体の発現を検出する。発現プロファイルを試験するときは、アレイは次のような試験のプラットフォームを提供する。即ちどの遺伝子が組織特異的か、ハウスキーピング機能を行うか、シグナル伝達カスケードの一部であるか、又は、特定の遺伝的素因や、条件、疾患、または障害に、特異的に関連する遺伝子であるかの試験である。
【００６０】
遺伝子発現プロファイル作成の潜在的応用は特に、疾患の、診断、予後診断、および治療の向上に関わる。例えば、高脂血症患者に由来の組織に発現されるレベルと配列との双方を、正常組織に発現されるレベルおよび配列と比較しうる。
【００６１】
毒性試験は、製薬産業の創薬計画の、必須かつ時間を要する部分である。より迅速なスクリーニングで主要な薬物候補の代謝への効果を判定し毒性を検出することは、遺伝子発現マイクロアレイの利用法と成りうる。例えば様々な種類のマイクロアレイを、完全長遺伝子や遺伝子断片を用いて産生しうる。次にこれらのアレイを用いて、薬物候補で処理した試料を試験し、薬物処理に関する遺伝子発現パターンを解明できる。この遺伝子パターンを、既知の代謝応答および毒性応答を産生する化合物に関する遺伝子発現パターンと比較できる。
【００６２】
ヒトC3A細胞株は、成長での、強力な接触阻害に関して選択されたHepG2/C3（肝臓腫瘍の15才男子から単離した肝臓癌細胞株）のクローン誘導体である。クローン集団の使用は、細胞の再現性を強化する。C3A細胞は、培養中の初代ヒト肝細胞の多くの特徴を有する。ｉ)インシュリン受容体とインシュリン様成長因子II受容体の発現、ｉｉ)αフェトプロテインと比較した血清アルブミンの高率分泌、ｉｉｉ)アンモニアの尿素とグルタミンへの転換、ｉｖ)芳香アミノ酸代謝、ｖ)グルコースの無いまたインシュリンの無い培地での増殖能である。C3A細胞株は、成熟したヒト肝臓のin vitroモデルとして今や十分に確立されている(Mickelson 他(1995) Hepatology 22:866-875; Nagendra 他(1997) Am. J. Physiol. 272:G408-416)。
【００６３】
クロフィブラートという高脂血薬（hypolidemic drug）は、上昇した血清トリグリセリドのレベルを下げる。齧歯類での慢性処理は、肝腫大と、肝臓ペルオキシソームの増加(ペルオキシソーム増殖)とを生じる。ペルオキシソーム増殖剤(PP)クラスの薬物は齧歯類の肝臓でPP活性化受容体を活性化し、酵素誘導、S期の刺激、アポトーシスの抑制を生じる(HasmallおよびRoberts (1999) Pharmacol. Ther. 82:63-70)。PPとしては、フィブラートクラスの高脂血薬、フェノバルビトン、チアゾリジンジオン、数種の非ステロイド性抗炎症剤、天然の脂肪酸由来分子がある(Gelman 他(1999) Cell. Mol. Life Sci. 55:932-943)。クロフィブラートは、チトクロムP450 4Aのレベルを増加することが示されている。またβ酸化遺伝子群の転写や、PP活性化受容体の誘導にも関わる(Kawashima 他(1997) Arch. Biochem. Biophys. 347:148-154)。ペルオキシソーム増殖はクロフィブラートと、化学的関連化合物フェノフィブラート（fenofibrate）との双方で誘導され、ミトコンドリア膜脱分極への共通の阻害効果によって媒介される(ZhouおよびWallace (1999) Toxicol. Sci. 48:82-89)。
【００６４】
デキサメタゾンとその誘導体、デキサメタゾン燐酸ナトリウムおよび酢酸デキサメタゾンは、抗炎症剤または免疫抑制剤として使用される合成グルココルチコイドである。デキサメタゾンは鉱質コルチコイド活性をわずかしか又はまったく持たず、これが通常、脳浮腫の管理のため選択される理由は、中枢神経系に浸透する優れた能力である。グルココルチコイドは天然ホルモンであり、薬理量で投与すると、炎症および免疫応答を防止または抑制する。この応答には、炎症部位の白血球浸潤阻害、炎症応答メディエータ機能妨害、および液性免疫応答抑制を含みうる。コルチコステロイドの抗炎症作用は、リポコルチンと総称されるホスホリパーゼA₂抑制タンパク質に関係すると考えられる。コルチコステロイド使用に関する多数の有害効果は通常、投与量と、治療の持続時間とに依存する。提案されている作用機序には、減少したIgE合成、白血球上で増加したβアドレナリン受容体数、減少したアラキドン酸代謝が含まれる。慢性気管支喘息等の即時アレルギー反応中、アレルゲンは肥満細胞の表面上のIgE抗体を架橋し、これらの細胞の化学走性物質の放出を誘発する。従って肥満細胞の流入と活性化が、喘息患者の口腔粘膜の炎症と過剰刺激感受性を部分的に担う。この炎症は、アドレノコルチコイドの投与によって遅れ得る。他のコルチコステロイドと同じく、肝臓代謝とホルモン除去機序への効果は、薬剤の薬力学を理解するために重要である。
【００６５】
癌
前立腺癌は多段階の進行を通じて発達し、最終的に攻撃的な腫瘍表現型を生じる。腫瘍進行の初めの段階には、正常な内腔および/または基底上皮細胞の過剰増殖が関係する。アンドロゲン応答性細胞は過形成し、初期段階の腫瘍に発展する。初期段階の腫瘍はしばしばアンドロゲンに対して感受性がありアンドロゲン除去療法に反応するが、アンドロゲン非依存性細胞の集団が過形成集団から発展する。これらの細胞は、浸襲性となり、また骨、脳、または肺に転移する可能性がある前立腺腫瘍のより進んだ形態を表す。
【００６６】
乳癌の発達には複数の段階があり、これらの段階の中で前癌乳腺上皮細胞が比較的順序の決まったイベントを経て腫瘍を形成する。早期の腫瘍発達イベントとして導管過形成がある。急速な新生物成長中の細胞は次第に浸潤性の癌に進行し、肺、骨、そして潜在的には他の臓器へ転移するようになる。腫瘍進行と悪性転換との過程に影響しうる変数としては、遺伝因子、環境因子、成長因子、及びホルモンがある。この過程の複雑さに基づいて、悪性転換の過程を受けるヒト乳腺上皮細胞集団を研究し、特定進行段階と、表現型と分子との特徴を関連付けることが重要である。
【００６７】
免疫応答タンパク質
インターロイキン12(IL-12)は多面的サイトカインでありマクロファージとBリンパ球とに産生され、T細胞とナチュラルキラー(NK)細胞とに対する多数の効果を持ちうる。効果としては、休止中および活性化したT細胞とNK細胞とによるIFNγとTNFとの産生の誘導、休止NK細胞およびT細胞の細胞毒性作用の増強、リンホカイン活性化キラー(LAK)細胞の生成中のIL-2の誘導とそれとの相乗作用、休止T細胞の増殖を刺激するcomitogen作用、活性化したT細胞とNK細胞との増殖の誘導がある。現在、IL-12がマクロファージにより感染因子に応じて産生され、TH1細胞の発生、増殖、および活動へのIL-12作用による、細胞に媒介される免疫応答の中心的メディエータであることを示す証拠がある。細胞媒介免疫の発動因子としてIL-12は、微生物病原体、転移癌、AIDSなどウイルス感染への細胞媒介免疫応答を刺激している可能性がある。
【００６８】
当分野には、胃腸障害、心血管疾患、自己免疫／炎症疾患、細胞増殖異常、発生・発達障害、上皮性疾患、神経疾患、および、生殖障害の診断、予防、および治療のための、核酸とタンパク質とを含む新規組成の要望がある。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００６９】
本発明の種々の実施態様は、総称して「PMOD」、個別にはそれぞれ「PMOD-1」、「PMOD-2」、「PMOD-3」、「PMOD-4」、「PMOD-5」、「PMOD-6」、「PMOD-7」、「PMOD-8」、「PMOD-9」、「PMOD-10」、「PMOD-11」、「PMOD-12」、「PMOD-13」、「PMOD-14」、「PMOD-15」、「PMOD-16」、「PMOD-17」、「PMOD-18」、「PMOD-19」、「PMOD-20」、「PMOD-21」、「PMOD-22」、「PMOD-23」、「PMOD-24」、「PMOD-25」、「PMOD-26」、「PMOD-27」、「PMOD-28」と呼ぶ精製されたポリペプチドである、タンパク質修飾および維持分子を提供し、またこれらタンパク質とそれらをコードするポリヌクレオチドとを用いる、疾患と病状との検出、診断、および治療の方法を提供する。幾つかの実施態様はまた、精製したタンパク質修飾および維持分子、並びに/またはそれらをコードするポリヌクレオチドを用いて創薬過程を促進する方法、例えば効力、用量、毒性、および薬理の決定の方法を提供する。関連する幾つかの実施態様は、精製したタンパク質修飾および維持分子、並びに/またはそれらをコードするポリヌクレオチドを用いて疾患と病状との病原を調査する方法を提供する。
【００７０】
或る実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した単離されたポリペプチドを提供する。別の実施態様は、SEQ ID NO:1-28のアミノ酸配列を持つ単離されたポリペプチドを提供する。
【００７１】
また別の実施態様は(ａ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ或る天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または(ｄ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリヌクレオチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:29-56からなる群から選択される。
【００７２】
また別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドを提供する。別の実施態様は、この組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。更に別の実施態様は、この組換えポリヌクレオチドを持つ遺伝形質転換生物を提供する。
【００７３】
別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｂ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％以上の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｃ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片と、(ｄ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、とからなる群から選択したポリペプチドを製造する一方法を提供する。製造方法は、(ａ)或る細胞を該ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、この細胞を組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換する過程と、(ｂ)そのように発現したポリペプチドを回収する過程からなる。この組換えポリヌクレオチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し機能的に連結したプロモーター配列を持つ。
【００７４】
更に別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する、単離された抗体を提供する。
【００７５】
また更に別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)に相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)に相補的なポリヌクレオチド、および(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択した、単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の実施態様で該ポリヌクレオチドは、少なくとも約20、30、40、60、80、または100の連続したヌクレオチド群からなる場合がある。
【００７６】
また別の実施態様は、サンプル中に標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって該標的ポリヌクレオチドが(ａ)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)に相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)に相補的なポリヌクレオチド、および(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択される方法を提供する。検出方法は、(ａ)サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、(ｂ)該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する過程からなる。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。或る関連した実施態様で本法は、該ハイブリダイゼーション複合体の量の検出を含みうる。また別の実施態様で該プローブは、少なくとも約20、30、40、60、80、または100の連続したヌクレオチド群からなる場合がある。
【００７７】
また更に別の実施態様は、サンプル中に標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって該標的ポリヌクレオチドが(ａ)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)に相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)に相補的なポリヌクレオチド、および(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択される方法を提供する。検出方法は、(ａ)ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、(ｂ)該増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出する過程からなる。或る関連した実施態様で本法は、該増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の量の検出を含みうる。
【００７８】
別の実施態様は、或る有効量のポリペプチドと薬物として許容し得る或る賦形剤とからなる、或る組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、(ａ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択される。一実施態様で該組成物は、SEQ ID NO:1-28からなる群から選択された或るアミノ酸配列を持つ場合がある。別の実施態様は、機能的PMODの低下したまたは異常な発現を伴う疾患や症状の治療を要する患者に該組成物を投与する方法を提供する。
【００７９】
また別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、(ｂ)サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程からなる。別の実施態様は、この方法で同定したアゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。また別の実施態様は、機能的PMODの発現の低下を伴う疾患や症状の治療を要する患者への、この組成物の投与方法を提供する。
【００８０】
また更に別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、(ｂ)サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程からなる。別の実施態様は、この方法で同定したアンタゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。また別の実施態様は、機能的PMODの過剰発現を伴う疾患や症状の治療を要する患者への、この組成物の投与方法を提供する。
【００８１】
別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドを少なくとも1つの試験化合物と適切な条件下で混合する過程と、(ｂ)該ポリペプチドと該試験化合物との結合を検出し、該ポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程からなる。
【００８２】
また別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列との少なくとも９０％または少なくとも約９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドの活性をモジュレートする或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドの活性にとり許容し得る条件下で、該ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、(ｂ)該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の存在下で算定する過程と、(ｃ)この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の不存在下での該ポリペプチドの活性と比較する過程からなり、この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性の変化は、該ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を標示する。
【００８３】
また更に別の実施態様は、SEQ ID NO:29-56からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変する効果につき、或る化合物をスクリーニングする一方法を提供する。この方法は、(ａ)この標的ポリヌクレオチドを有するサンプルを或る化合物に曝露する過程と、(ｂ)この標的ポリヌクレオチドの発現の改変を検出する過程と、(ｃ)可変量のこの化合物の存在下でのこの標的ポリヌクレオチドの発現と、この化合物の不在下での発現とを比較する過程とからなる。
【００８４】
別の実施態様は、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。この方法には、以下の過程がある。(ａ)核酸群を有する生体サンプルを試験化合物で処理する過程。(ｂ)処理済み生体サンプルの核酸群をハイブリダイズする過程。この過程には、次のようなプローブを用いる。(i)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ii)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(iii)(i)に相補的な配列を持つポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物、からなる群から選択した或るポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなるプローブである。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生体サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間に特異的ハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で生じる。上記標的ポリヌクレオチドは、(i)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ii)SEQ ID NO:29-56からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％または少なくとも約９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(iii)(i)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物、からなる群から選択する。あるいは標的ポリヌクレオチドは、上記(i)〜(v)からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片を持つ場合がある。毒性の算定方法には更に、以下の過程がある。(ｃ)ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、(ｄ)処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程である。処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量の差異が、試験化合物の毒性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８５】
本発明のタンパク質、核酸、および方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料および方法に本発明の実施態様が限定されるものではなく、修正され得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施態様を説明する目的で用いたものに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００８６】
請求の範囲および明細書中で用いる単数形の「或る」および「その(この)」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もある。したがって、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には1個以上の抗体、および、当業者に公知の抗体の等価物などについても言及している。
【００８７】
本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料および方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明の種々の実施態様に関係して用い得る、細胞、プロトコル、試薬およびベクターについて説明および開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００８８】
(定義)
用語「PMOD」は、天然、合成、半合成或いは組換え体などの、全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたPMODのアミノ酸配列を指す。
【００８９】
用語「アゴニスト」は、PMODの生物学的活性を強化または模倣する分子を指す。アゴニストの例には、PMODと直接に相互作用し、あるいはPMODが関与する生物学的経路の成分に作用してPMODの活性をモジュレートする、タンパク質、核酸、糖質、小分子、または任意の他の化合物や組成物があり得る。
【００９０】
用語「対立遺伝子変異体」は、PMODをコードする別の形の遺伝子を指す。対立遺伝子変異体群は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生じ得る他、変容したmRNA群を生じ得る。また、生じ得るポリペプチドの構造または機能は、変容することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異体を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換による。これら各種の変化は、単独であるいは他の変化と共に、或る配列内で１回以上、生じ得る。
【００９１】
PMODをコードする「変容した／改変された」核酸配列に含む配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換を生じた配列であって、PMODと同一のポリペプチドを、或いは、PMODの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドを生じる配列である。この定義には、PMODをコードするポリヌクレオチドにとり正常な染色体の遺伝子座ではない位置での、対立遺伝子変異配列群への不適当或いは予期しないハイブリダイゼーションを含み、また、PMODをコードするポリヌクレオチドの或る特定オリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多型性を含む。コードされるタンパク質も「変容する／改変される」ことがあり、また、サイレント変化を生じて機能的には等価なPMODと成るような、アミノ酸残基の欠失、挿入、あるいは置換を持ち得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的あるいは免疫学的にPMODの活性が保持される範囲で、残基群の、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性についての、1つ以上の類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンがある。親水性値が近似した非荷電極性側鎖を持つアミノ酸としては、アスパラギンとグルタミン、およびセリンとトレオニンを含みうる。親水性値が近似した非荷電側鎖を持つアミノ酸としては、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、およびフェニルアラニンとチロシンを含みうる。
【００９２】
用語「アミノ酸」および「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、あるいはそれらのいずれかの断片を指し、天然分子または合成分子を指す。「アミノ酸配列」が或る天然タンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」および類似の用語は、記載したそのタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【００９３】
「増幅」は、或る核酸の付加的複製物を作製する行為に関する。増幅には、当業者に公知の、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術または他の核酸増幅技術を用いる。
【００９４】
用語「アンタゴニスト」は、PMODの生物学的活性を阻害あるいは減弱する分子を指す。アンタゴニストとしては、PMODと直接相互作用すること、あるいはPMODが関与する生物学的経路の各成分に作用することによってPMODの活性をモジュレートする、抗体などタンパク質、anticalin、核酸、糖質、小分子、または任意の他の化合物や組成物があり得る。
【００９５】
用語「抗体」は、エピトープの決定基と結合できる、無傷の免疫グロブリン分子やそれらの断片、例えばFab、F(ab')₂ 、およびFv断片を指す。PMODポリペプチド群と結合する抗体類の作製には、免疫抗原として、無傷ポリペプチド群を用いることができ、または、当該の小ペプチド群を有する断片群を用い得る。マウス、ラット、ウサギなどの動物を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドの由来は、RNAの翻訳の場合や、または化学合成があり得る。また、それらは所望により、キャリアタンパク質に抱合し得る。通常用いられるキャリアであってペプチドと化学結合するキャリアの例は、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、および、スカシガイのヘモシアニン(KLH)などがある。結合したこのペプチドは、前記動物を免疫化するために用いる。
【００９６】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する、分子の領域(すなわちエピトープ)を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基(タンパク質の特定の領域または３次元構造)に特異結合する抗体の産生を誘発し得る。或る抗原決定基は、或る抗体への結合について、無傷抗原(すなわち免疫応答を引き出すために用いられる免疫原)と競合し得る。
【００９７】
用語「アプタマー(aptamer)」は、核酸またはオリゴヌクレオチド分子であって、特定の分子ターゲットに結合する分子を指す。アプタマーはin vitroでの進化プロセスに由来する（例えば、SELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmentの略、試験管内選択法）、米国特許第5,270,163号に記述）。これは、大規模な組合せライブラリ群から標的特異的アプタマー配列を選択するプロセスである。アプタマーの構成は二本鎖または一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーの各ヌクレオチド成分は修飾された糖基を持つことがあり(例えば、リボヌクレオチドの2'-OH基は2'-Fまたは2'-NH₂によって置換され得る)、これは、ヌクレアーゼへの抵抗性または血中でのより長い寿命など、所望の特性を向上し得る。アプタマーを他の分子(例えば高分子量のキャリア)と抱合させることにより、循環系からのこのアプタマーのクリアランスを遅らせ得る。アプタマー類は、例えば或る架橋剤の光活性化によって、それらの同種リガンド群と特異的に架橋させ得る(例えば、Brody, E.N.およびL. Gold(2000)J. Biotechnol. 74:5-13を参照)。
【００９８】
用語「イントラマー(intramer)」は、in vivoで発現されるアプタマーを指す。例えば、ワクシニアウイルスに基づく或るRNA発現系を用いて、白血球の細胞質内で特定のRNAアプタマー類が高レベルに発現されている(Blind, M.他(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610)。
【００９９】
用語「スピーゲルマー(spiegelmer)」は、アプタマーの内、L-DNA、L-RNAなどの左旋性ヌクレオチド誘導体または左旋性ヌクレオチド様分子などを指す。左旋性のヌクレオチド群を持つアプタマー類は、右旋性ヌクレオチド群を持つ基質に通常は作用する、天然酵素類による分解に対して耐性がある。
【０１００】
用語「アンチセンス」は、或る特定核酸配列を持つ或るポリヌクレオチドの「センス」(コーディング)鎖との塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物としては、DNAや、RNAや、ペプチド核酸(PNA)や、修飾されたバックボーン連結たとえばホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸などを有するオリゴヌクレオチドや、修飾された糖基たとえば2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖などを有するオリゴヌクレオチドや、あるいは修飾された塩基たとえば5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシンなどを有するオリゴヌクレオチドがあり得る。アンチセンス分子は、化学合成または転写など、任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、細胞に導入されると、細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し、二重鎖を形成して転写または翻訳を妨害する。「負」または「マイナス」という発現は、或る参考DNA分子のアンチセンス鎖を指すことがあり、「正」または「プラス」という発現は或る参考DNA分子のセンス鎖を意味し得る。
【０１０１】
用語「生物学的に活性」は、或る天然分子の構造的、調節的、あるいは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のPMOD、合成PMOD、またはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞内の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【０１０２】
「相補」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の関係を指す。例えば、「5'-AGT-3'」は、その相補配列「3'-TCA-5'」との対を形成する。
【０１０３】
「〜のポリヌクレオチドを含む(持つ)組成物」または「〜のポリペプチドを含む(持つ)組成物」は、指定のポリヌクレオチド若しくはポリペプチドを持つ、任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。PMODをコード、若しくはPMODの断片群をコードするポリヌクレオチド群を有する組成物類は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。これらプローブは、凍結乾燥形態で貯蔵でき、また、糖質などの安定化剤と結合させ得る。ハイブリダイゼーションにおいては、塩(例えばNaCl)、界面活性剤(例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS)および他の成分(例えばデンハート液、粉乳、サケ精子DNAなど)を有する水溶液中に、プローブを分散させ得る。
【０１０４】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を除くためにDNA配列解析を繰り返し行い、XL-PCRキット(Applied Biosystems, Foster City CA)を用いて５'および／または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW フラグメント結合システム(GCG, Madison, WI)またはPhrap(University of Washington, Seattle WA)などのフラグメント結合用コンピュータプログラムを用い1つ以上のオーバーラップするcDNAやESTまたはゲノムDNA断片からアセンブリされた核酸配列を指す。伸長とアセンブリの両方によりコンセンサス配列を産生する配列もある。
【０１０５】
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えないと予測される置換を指す。すなわち、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存され、置換によって大きくは変わらない。下表は、タンパク質内で元のアミノ酸と置換され得るアミノ酸であり、保存的アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示す。

【０１０６】
保存的なアミノ酸置換では通常、(ａ)置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、(ｂ)置換部位における分子の電荷または疎水性、および／または(ｃ)側鎖の大部分、を保持する。
【０１０７】
「欠失」は、1個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列内の変化または1個以上のヌクレオチドが欠如するヌクレオチド配列内の変化を指す。
【０１０８】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチドの化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、次のようなプロセスによって修飾されたポリペプチドである。すなわち、グリコシル化、ポリエチレングリコール化(pegylation)、あるいは任意の同様なプロセスであって、誘導元のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスである。
【０１０９】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合あるいは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【０１１０】
「差次的発現」は、少なくとも２例のサンプルを比較して判定する、増加(上方調節)、あるいは減少(下方調節)、または欠損した、遺伝子またはタンパク質の発現を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態サンプルと健常サンプルとの間で行われ得る。
【０１１１】
「エキソンシャッフリング」は、異なるコード領域(エキソン)群の組換えを意味する。或るエキソンは、コードするタンパク質の１つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャー群の新たな組合せによって新規のタンパク質群をアセンブリすることが可能であり、新たなタンパク質機能の進化を促進できる。
【０１１２】
用語「断片」は、PMODまたはPMODをコードするポリヌクレオチドの、固有の部分であって、その親配列（parent sequence）と配列は同一でありうるが、親配列より長さが短いものを指す。或る断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、約５〜約１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、あるいはその他の目的のために用いられる或る断片は、少なくとも長さ５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００の、連続したヌクレオチドあるいはアミノ酸残基であり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、或るポリペプチド断片は、定義された或る配列内に見られるような或るポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸(または最初の２５％または５０％)から選択した、或る長さの連続したアミノ酸を持ち得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施態様では、配列表、表および図面を含む本明細書が支持する任意の長さであり得る。
【０１１３】
SEQ ID NO:29-56の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:29-56を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を持ちうる。SEQ ID NO:29-56の或る断片を本発明の方法の1つ以上の実施態様、例えばハイブリダイゼーションおよび増幅技術に、またはSEQ ID NO:29-56を関連ポリヌクレオチドから区別する類似の方法に用い得る。SEQ ID NO:29-56の或る断片の正確な長さは、また、その断片が対応するSEQ ID NO:29-56の領域は、その断片に意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定し得る。
【０１１４】
SEQ ID NO:1-28の或る断片は、SEQ ID NO:29-56の或る断片によってコードされる。SEQ ID NO:1-28の或る断片は、SEQ ID NO:1-28を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を持ち得る。例えばSEQ ID NO:1-28の或る断片を、SEQ ID NO:1-28を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして用い得る。SEQ ID NO:1-28の或る断片の正確な長さは、また、この断片に対応するSEQ ID NO:1-28の領域は、その断片に意図する目的に基づき、本明細書に記載する、または当分野で既知の1つ以上の分析法で判定し得る。
【０１１５】
「完全長」ポリヌクレオチドとは、少なくとも１つの翻訳開始コドン(例えばメチオニン)と、それに続く１オープンリーディングフレームおよび翻訳終止コドンを有する配列である。或る「完全長」ポリヌクレオチド配列は、或る「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１１６】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の、配列類似性、互換性、または配列同一性を意味する。
【０１１７】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」および「〜％同一」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた、２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。標準化アルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するため、標準化された再現性のある方法で比較対象の２配列内にギャップ群を挿入し得るので、２つの配列をより有意に比較できる。
【０１１８】
ポリヌクレオチド配列間の一致率を判定するには、当分野で既知の、または本明細書に記載の、１つ以上のコンピュータアルゴリズムまたはプログラムを用い得る。例えば一致率を判定するには、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムの、デフォルトのパラメータ群を用い得る。このプログラムは、LASERGENE ソフトウェアパッケージ(一組の分子生物学的分析プログラム)(DNASTAR, Madison WI)の一部である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G.およびP.M. Sharp(1989)CABIOS 5:151-153、Higgins, D.G. 他（1992）CABIOS 8:189-191に記載されている。ポリヌクレオチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定される。「weighted」残基重み付け表がデフォルトで選択される。CLUSTAL Vによる一致率の報告は、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「percent similarity(類似性パーセント)」としてなされる。
【０１１９】
あるいは、米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)が、一般的に用いられ、且つ、無料で利用可能な用い得る配列比較アルゴリズム一式を提供している(Altschul, S.F. 他(1990)J. Mol. Biol. 215:403-410)。BLASTアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるNCBIおよびインターネット(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)からも入手可能である。このBLASTソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と、様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いる「blastn」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールも入手可能であり、これは２つのヌクレオチド配列を直接のペアワイズで比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして、対話形式で利用できる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn および blastp(以下に記載)の両方に用い得る。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ(gap)などのパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12(2000年4月21日)を用いてblastnを実行し得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１２０】
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
【０１２１】
一致率は、ある定義された配列の全長(例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列)について測定し得る。あるいは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得た断片(例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または少なくとも２００の連続したヌクレオチドの断片)の長さの一致率も測定し得る。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１２２】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で、類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１２３】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「〜％同一」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷および疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を(したがって機能も)保存する。
【０１２４】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータ群を用いて判定できる(参照先と共に上述)。ポリペプチド配列をCLUSTAL Vを用いてペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定される。PAM250マトリクスがデフォルト残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドのアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の一致率は、CLUSTAL Vによって「percent similarity(類似性パーセント)」として報告される。
【０１２５】
あるいは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用い得る。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12(2000年4月21日)のblastpをデフォルトパラメータに設定して用い得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１２６】
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
【０１２７】
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列の全長(例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列)について測定し得る。あるいは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得た断片(例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０、または少なくとも１５０の連続した残基の断片)の長さの一致率も測定し得る。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１２８】
「ヒト人工染色体(HAC)」は直鎖状の微小染色体であり、約６kb 〜１０MbのサイズのDNA配列を持ち得る。また、染色体の複製、分離および維持に必要な、全てのエレメントを持つ。
【０１２９】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつ、よりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列を改変した抗体分子を指す。
【０１３０】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、或る一本鎖ポリヌクレオチドが或る相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、１回以上の「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合(すなわち完全には一致しない核酸鎖対間の結合)が減少する。核酸配列のアニーリングに関する許容条件は、当業者が慣例的に決定できる。アニール条件はどのハイブリダイゼーション実験でも一定であり得るが、洗浄条件は、所望のストリンジェンシー、したがってハイブリダイゼーション特異性を得るように、実験ごとに変更し得る。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％(w/v)のSDS、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【０１３１】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度およびpHにおける特定配列の融点(Tm)より約５〜２０℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度およびpHの条件下で、完全一致プローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式および核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook, J. 他(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【０１３２】
本発明のポリヌクレオチド間の高ストリンジェンシー条件のハイブリダイゼーションには、約０．２×SSCおよび約０．１％のSDSの存在下、６８℃で１時間の洗浄条件を含む。別法では、約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度で行う。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変更し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約１００〜２００μg/mlの、せん断した変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションでは、有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。進化的類似性は、ヌクレオチド群、およびヌクレオチドがコードするポリペプチド群について、或る同様の役割を強く示唆する。
【０１３３】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合の形成によって形成された、２つの核酸の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る(C₀tまたはR₀t解析など)。あるいは、一方の核酸が溶解状態で存在し、もう一方の核酸が固体支持体(例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、あるいは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板)に固定されているような２つの核酸間に形成され得る。
【０１３４】
用語「挿入」あるいは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基あるいはヌクレオチドがそれぞれ追加される、アミノ酸配列あるいはポリヌクレオチド配列における変化を指す。
【０１３５】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患などに関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞および全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけ得る。
【０１３６】
用語「免疫原性断片」は、生物（例えば哺乳類）に導入すると免疫応答を引き起こし得る、PMODのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用な、PMODの任意のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片をも指す。
【０１３７】
用語「マイクロアレイ」は、或る基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または他の化合物の構成を指す。
【０１３８】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または他の化合物を指す。
【０１３９】
用語「モジュレート」または「活性を調節」は、PMODの活性の変化を指す。例えば、モジュレートによって、PMODのタンパク質活性の増減が、あるいは、結合特性またはその他の、生物学的特性、機能的特性あるいは免疫学的特性の変化が生じ得る。
【０１４０】
「核酸」および「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」および「核酸配列」の語はまた、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるかあるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸(PNA)や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０１４１】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、或るプロモーターが或るコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。機能的に連結したDNA配列群は非常に近接するか連続的に隣接することがあり、また、2つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は同一リーディングフレーム内にあり得る。
【０１４２】
「ペプチド核酸(PNA)」は、末端がリジンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを持つ、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、この組成に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止させる。ポリエチレングリコール化することにより、細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０１４３】
PMODの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、タンパク質分解切断およびその他の当分野で既知の修飾を含み得る。これらのプロセスは、合成により、あるいは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、PMODの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なることとなる。
【０１４４】
「プローブ」とは、同一核酸、対立遺伝子核酸、または関連核酸の検出に用いる、PMODやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸を指す。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に接着した配列である。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬および酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的ポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素により、標的DNA鎖に沿って伸長され得る。
【０１４５】
プライマー対を、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による、核酸の増幅(および同定)に用い得る。
【０１４６】
本発明に用いるプローブおよびプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも１５の連続したヌクレオチド群からなる。特異性を高めるため、長めのプローブおよびプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブおよびプライマーも用い得る。これよりもかなり長いプローブおよびプライマーもある。表、図面および配列リストを含む本明細書が支持する、任意の長さのヌクレオチドを用い得るものと理解されたい。
【０１４７】
プローブおよびプライマーの調製および使用方法については、Sambrook, J. 他(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. 他(1987)Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY、Innis, M. 他(1990)PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego CAなどを参照されたい。PCRプライマー対を既知の配列から得るには例えば、そのためのコンピュータプログラム例えばPrimer(Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA)を用い得る。
【０１４８】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチドおよび、最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得た配列を分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム(テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能)は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、したがってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム(Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research(マサチューセッツ州ケンブリッジ)より入手可能)を用いれば、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ(mispriming library)」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である(後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る)。PrimerGenプログラム(英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能)は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域のいずれかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。したがって、このプログラムは、独自のものであれ保存されたものであれ、オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド断片との同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、あるいは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１４９】
「組換え核酸」は、天然核酸ではなく、配列の、２つ以上の離れたセグメントを人工的に組合せた配列を持つ核酸である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばSambrookの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部と成し得る。
【０１５０】
あるいはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部と成すことができ、ベクターは例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなベクターは哺乳類に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳類内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１５１】
「調節エレメント」は、或る遺伝子の非翻訳領域に通常は由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロンおよび５'および３'の非翻訳領域(UTR)を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を制御する宿主蛋白質またはウイルス蛋白質と相互作用する。
【０１５２】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いる、化学的または生化学的な成分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤(chromogenic agent)、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子およびその他の当分野で既知の成分がある。
【０１５３】
或るDNA分子に対する「RNA等価物」は、基準となるDNA分子と同じ直鎖のヌクレオチド配列からなるが、生じる全ての窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１５４】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。PMOD、PMODをコードする核酸群、またはその断片群を含むと推定されるサンプルとしては、体液と、細胞や細胞から単離した染色体や細胞内小器官（オルガネラ）や膜からの抽出物と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリントなどがあり得る。
【０１５５】
用語「特異結合」および「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドの、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造(例えば抗原決定基すなわちエピトープ)であって結合分子が認識する構造の有無に依存する。例えば、或る抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」と抗体とを含む或る反応の中に、エピトープＡを持つポリペプチドが、あるいは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１５６】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離あるいは分離された核酸配列あるいはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約60％除去されたものであり、好ましくは約75％以上除去、最も好ましくは約90％以上除去されたものを指す。
【０１５７】
「置換」とは、１つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドを、それぞれ別のアミノ酸残基またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１５８】
「基板」は、任意の好適な固体あるいは半固体の支持物を指し、膜およびフィルタ、チップ、スライド、ウェハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、ウェル、溝、ピン、チャネル、孔など、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１５９】
「転写イメージ(transcript image)」または「発現プロファイル」は、所定条件下での所定時間における、或る特定の細胞タイプまたは組織による、遺伝子発現の集合的パターンを指す。
【０１６０】
「形質転換(transformation)」とは、外因性DNAが、或る受容細胞に導入されるプロセスを言う。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する、任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法(エレクトロポレーション)、熱ショック、リポフェクションおよび微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたDNAが、自律的に複製するプラスミドとしてあるいは宿主染色体の一部として複製可能である、安定的に形質転換された細胞が含まれる。更に、限られた期間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【０１６１】
ここで用いる「遺伝形質転換生物(transgenic organism)」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個以上の細胞が、ヒトの介入によって、例えば本技術分野で公知のトランスジェニック技術によって導入された異種核酸を有するものである。細胞への核酸の導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって行う。これは、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によってあるいは組換えウイルスの導入によって行う。別の実施態様で核酸の導入は、組換えウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを感染させて成し得る (Lois, C. 他(2002) Science 295:868-872)。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種あるいはin vitro受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指す。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換生物には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌および動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrook 他(1989)などの参考文献に記載されている。
【０１６２】
特定の核酸配列の「変異体」とは、核酸配列１本の或る長さ全体について、該特定核酸配列に対し少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列として決定された配列である。決定には、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9(1999年5月7日)を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。変異体は、例えば、「対立遺伝子」変異体(上述)または「スプライス」変異体、「種」変異体、「多型」変異体と記述され得る。スプライス変異体は参照分子との顕著な同一性を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって通常、より多数またはより少数のヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメイン群を有するか、あるいは参照分子には存在するドメイン群が欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチドである。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互に有意のアミノ酸同一性を持つ。多型性変異体は、或る種の個体間における、或る特定遺伝子のポリヌクレオチド配列内での変異である。多型変異体には、ポリヌクレオチド配列の1ヌクレオチド塩基が異なる「1塩基多型性」(SNP)も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の集団、病状または病状性向を示し得る。
【０１６３】
特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、ポリペプチド配列１本の或る長さ全体について、該特定ポリペプチド配列に対し少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチド配列として決定された配列である。決定には、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9(1999年5月7日)を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、そのポリペプチドの一方の所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１６４】
(発明)
本発明の種々の実施態様には、新規なヒトのタンパク質修飾および維持分子群（PMOD）および、PMODをコードするポリヌクレオチド群を含む。また、これらの組成物を利用した、胃腸障害、心血管障害、自己免疫／炎症性障害、細胞増殖障害、発生・発達障害、上皮障害、神経疾患、および生殖障害の、診断、治療、および予防を含む。
【０１６５】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド実施態様およびポリペプチド実施態様の命名の概略である。各ポリヌクレオチドおよびその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号(IncyteプロジェクトID)に相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO:）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO:）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。列６は、ポリペプチド実施態様とポリヌクレオチド実施態様とに対応する物理的完全長クローン群のIncyte ID番号を示す。完全長クローンは、列３に示すポリペプチドに対して少なくとも95%の配列同一性を持つポリペプチドをコードする。
【０１６６】
表２は、GenBankタンパク質(genpept)データベースとPROTEOMEデータベースとに対するBLAST分析で同定した、本発明のポリペプチド群に相同な配列群を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列3は、最も近いGenBank相同体のGenBank識別番号(GenBank ID NO:)と、最も近いPROTEOMEデータベース相同体のPROTEOMEデータベース識別番号(PROTEOME ID NO:)とを示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体１つ以上との間の一致に関する確率スコアを示す。列５は、該当箇所には妥当な引用を示すと共にGenBankおよびPROTEOMEデータベース相同体の注釈(annotation)を示し、これら全ては特に引用を以って本明細書の一部とする。
【０１６７】
表３は、本発明のポリペプチドの多様な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム(Genetics Computer Group, Madison WI)によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所には更に、分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１６８】
表２及び表３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それらの特性は、請求の範囲に記載されたポリペプチド群がタンパク質修飾および維持分子であることを確立している。例えばSEQ ID NO:1は、残基K223から残基A774までが、シロイヌナズナのユビキチン蛋白リガーゼ1(GenBank ID g7108521)に対し43％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された(表2参照)。BLAST確率スコアは1.3e-85であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:1はまた、1つのHECT（ユビキチン転移酵素）ドメインを有し、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存タンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して判定された(表3参照)。BLIMPSおよびBLAST解析からのデータは、SEQ ID NO:1がユビキチン蛋白質リガーゼであることを示す更なる確証を提供する。
【０１６９】
別の例でSEQ ID NO:5は、残基E22から残基K368まで、シロイヌナズナのユビキチン特異的プロテアーゼ26(GenBank ID g11993492)に対して38％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された(表2参照)。BLAST確率スコアは1.1e-79であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:5はまた、１つのユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼ1ドメインと１つのユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼ2ドメインを有するが、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された (表3参照)。BLIMPS、MOTIFSおよび追加BLAST解析のデータは、SEQ ID NO:5がユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼである更なる確証を提供する。
【０１７０】
別の例でSEQ ID NO:7は、残基P23から残基S531まで、ヒトのカルボキシペプチダーゼN(GenBank ID g179936)との91％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された(表2参照)。BLAST確率スコアは1.7e-235であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:7はまた、ロイシンリッチリピートドメイン群を有すると、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された (表3参照)。MOTIFS解析よりのデータは、SEQ ID NO:7がカルボキシペプチダーゼである、更なる確証を提供する。
【０１７１】
別の例でSEQ ID NO:10は、残基R8から残基S143まで、マウスのtestatin(システインプロテアーゼ阻害因子であるシスタチンに近縁)(GenBank ID g3928491)との46％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された(表2参照)。BLAST確率スコアは1.4e-27であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:10はまた、１つのシスタチンドメインを有するが、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された (表3参照)。更なるBLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:10がシステインプロテアーゼ阻害因子である、更なる確証を提供する。
【０１７２】
別の例でSEQ ID NO:20は、残基M17から残基K267まで、ヒトのカリクレイン14(GenBank ID g13897995)との99％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された(表2参照)。BLAST確率スコアは2.1e-136であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:20はまた、１つのトリプシンドメインを有するが、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された (表3参照)。BLIMPS、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:20がセリンプロテアーゼである、更なる確証を提供する。
【０１７３】
別の例でSEQ ID NO:27は、残基M1から残基T242まで、ヒトの推定肥満細胞mMCP-7様IIトリプターゼ(GenBank ID g4336577)との96％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された(表2参照)。BLAST確率スコアは1.8e-130であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:27はまた、１つのトリプシンドメインを有するが、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された (表3参照)。BLIMPS、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:27がトリプシン様セリンプロテアーゼである、更なる確証を提供する。
【０１７４】
SEQ ID NO:2-4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8-9、SEQ ID NO:11-19、SEQ ID NO:21-26、SEQ ID NO:28は、同様に分析し、注釈を付けた。SEQ ID NO:1-28の解析用のアルゴリズム及びパラメータを表７に記載した。
【０１７５】
表４に示すように、完全長ポリヌクレオチド実施態様は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード(エキソン)配列を用いて、あるいはこれら２種類の配列を任意に組合せてアセンブリした。列１は、本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号(ポリヌクレオチドSEQ ID NO)、対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号(Incyte ID)、および塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、完全長ポリヌクレオチド実施態様のアセンブリに用いたcDNA配列および／またはゲノム配列の、また、例えばSEQ ID NO:29-56を同定するため、或いはSEQ ID NO:29-56と、関連するポリヌクレオチド群とを区別するためのハイブリダイゼーション技術または増幅技術に有用なポリヌクレオチドの断片の、開始ヌクレオチド（５'）位置および終了ヌクレオチド（３'）位置を示す。
【０１７６】
表４の列２に記載したポリヌクレオチド断片は、特に例えば組織特異的cDNAライブラリ群やプールしたcDNAライブラリ群に由来するIncyte cDNA群を指す場合もある。或いは列２に記載のポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチドのアセンブリに寄与したGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。更に、列２に記載したポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL(The Sanger Centre、英国ケンブリッジ)データベースに由来する配列を同定する場合もある(すなわち「ENST」の命名を含む配列)。あるいは、列２に記載したポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records データベースに由来する場合もあり(すなわち「NM」または「NT」の命名を含む配列)、またNCBI RefSeq Protein Sequence Recordsに由来する場合もある(すなわち「NP」の命名を含む配列)。または列２に記したポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング(exon-stitching)」アルゴリズムにより結び合わせたcDNAおよびGenscan予測エキソン群の両方からなるアセンブリ体を指す場合がある。例えば、ポリヌクレオチド配列の内、FL_XXXXXX_N₁_N₂_YYYYY_N₃_N₄ として同定される配列は「スティッチされた」配列であり、その内、XXXXXXは該アルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号であり、YYYYYは該アルゴリズムが作成する予測の数であり、N_1,2,3...がある場合には、解析中に手動で編集された特定のエキソン群を表す(実施例５参照)。または、列２のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング(exon-stretching)」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンのアセンブリ体を指す場合もある。例えば、ポリヌクレオチド配列の内、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_Nとして同定される配列は「ストレッチ」配列の識別番号である。ここでXXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号、またはNCBI RefSeq識別番号、N は特定のエキソンを指す(実施例５を参照)。或るRefSeq配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、「NM」、「NP」、または「NT」によって表されるRefSeq識別子が、GenBank識別子(すなわち、gBBBBB)の代わりに使用され得る。
【０１７７】
あるいは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムDNA配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法に由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する(実施例４と５を参照)。

【０１７８】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために、表４に示すような配列カバレッジと重複するIncyte cDNAカバレッジが得られたが、該当するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０１７９】
表５は、Incyte cDNA配列を用いてアセンブリされた完全長ポリヌクレオチドのための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリとはIncyte cDNAライブラリであり、これは、最も頻繁にはIncyte cDNA配列群によって代表されるが、これらは、上記ポリヌクレオチド群をアセンブリおよび確認するために用いられた。cDNAライブラリを作製するために用いた組織およびベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１８０】
表８は、ポリヌクレオチド実施態様に見られる一塩基多型(SNP)を、種々のヒト集団での対立遺伝子(アレル)頻度と共に示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteプロジェクト識別番号（PID）を示す。列3はSNPが検出されたESTのIncyte識別番号(EST ID)を示し、列4はSNPの識別番号(SNP ID)を示す。列5はEST配列内のSNP位置(EST SNP)を示し、列6は完全長ポリヌクレオチド配列内のSNPの位置(CB1 SNP)を示す。列7は、EST配列内で見られたアレルを示す。列8と列9は、SNP部位で見られた2種のアレルを示す。列10はSNP部位を含むコドンがコードするアミノ酸をEST内で見られたアレルに基づき示す。列11-14は4群のヒト集団でのアレル1頻度を示す。エントリがn/d(非検出)であれば該集団でのアレル1頻度が検出できないほど低すぎたことを示し、n/a(利用不可)は該集団のアレル頻度判定が無かったことを示す。
【０１８１】
本発明はまた、PMODの変異配列（変異体）をも含む。好適なPMODの変異体は、PMODアミノ酸配列に対して、少なくとも約80％、あるいは少なくとも約90％、さらには少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有し、PMODの機能的または構造的特徴を少なくとも1つ含む変異体である。
【０１８２】
種々の実施態様はまた、PMODをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施態様において、本発明は、PMODをコードする、SEQ ID NO:29-56からなる一群から選択された１配列を持つポリヌクレオチド配列を提供する。SEQ ID NO:29-56のポリヌクレオチド配列は、配列表に示されているように等価RNA配列をも含むが、そこでは窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくてリボースから構成されている。
【０１８３】
本発明はまた、PMODをコードするポリヌクレオチドの変異体群を含む。詳細には、このような変異体ポリヌクレオチドは、PMODをコードするポリヌクレオチドとの、少なくとも約70％のポリヌクレオチド配列同一性、あるいは少なくとも約85％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約95％ものポリヌクレオチド配列同一性を持つこととなる。本発明の或る態様では、SEQ ID NO:29-56からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約７０％、或いは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％もの一致率を有するようなSEQ ID NO:29-56からなる群から選択された配列を有するポリヌクレオチドの変異体を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、PMODの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するポリペプチドをコードし得る。
【０１８４】
更に或いは別法では、本発明の或るポリヌクレオチド変異体は、PMODをコードするポリヌクレオチドのスプライス変異体である。或るスプライス変異体はPMODをコードするポリヌクレオチドとの顕著な配列同一性を持つ部分複数を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって生ずる、配列の数ブロックの付加または欠失により、通常、より多数またはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。或るスプライス変異体には、約70％未満、または約60％未満、あるいは約50％未満のポリヌクレオチド配列同一性が、PMODをコードするポリヌクレオチドとの間で全長に渡って見られるが、このスプライス変異体の幾つかの部分には、PMODをコードするポリヌクレオチドの各部との、少なくとも約70％、あるいは少なくとも約85％、または少なくとも約95％、なおまたは100％の、ポリヌクレオチド配列同一性を有することとなる。例えばSEQ ID NO:31の配列からなるポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:34の配列からなるポリヌクレオチドのスプライス変異体である。別の例でSEQ ID NO:44の配列からなるポリヌクレオチドはSEQ ID NO:56の配列からなるポリヌクレオチドのスプライス変異体である。上記したスプライス変異配列は何れも、PMODの機能的或いは構造的特徴の少なくとも1つを有する或るポリペプチドをコードし得る。
【０１８５】
遺伝暗号の縮重により、PMODをコードする種々のポリヌクレオチド配列が作り出され、中には、既知のいかなる天然遺伝子のポリヌクレオチド配列群とも最小の類似性しか有しない配列もあることは、当業者には理解されよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るあらゆる可能なポリヌクレオチド配列のバリエーションを網羅し得る。これらの組み合わせは、天然PMODのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に成される。このような全ての変異は明確に開示されていると考慮されたい。
【０１８６】
PMODとその変異体とをコードするポリヌクレオチドは一般に、好適に選択されたストリンジェンシー条件下で天然PMODのポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能であるが、非天然コドン群を含めるなどの実質的に異なるコドン使用を有するPMOD或いはその誘導体をコードするポリヌクレオチドを作り出すことは、有益であり得る。宿主が特定コドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主または原核宿主に生じるペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択し得る。コードされるアミノ酸配列を改変せずに、PMODおよびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に改変する別の理由には、天然配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることもある。
【０１８７】
本発明にはまた、PMODとその誘導体とをコードする、ポリヌクレオチド群またはそれらの断片の、完全に合成化学による作製も含む。作製後、当分野で周知の試薬を用いて、この合成ポリヌクレオチドを任意の様々な入手可能な発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。更に、合成化学を用いてPMODまたはその任意の断片をコードする或るポリヌクレオチドに突然変異を誘導し得る。
【０１８８】
本発明の実施態様には、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載のポリヌクレオチド、特に、SEQ ID NO:29-56に示す配列を持つポリヌクレオチド、及びそれらの断片群にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド群が含まれる(例えば、Wahl, G.M.およびS.L. Berger(1987)Methods Enzymol.152:399-407、Kimmel, A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507-511.) アニーリングおよび洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載した。
【０１８９】
DNAシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例も、DNAシークエンシング方法を用い得る。DNAシークエンシング方法には酵素を用い得る。例えばDNAポリメラーゼ１のクレノウ断片、SEQUENASE(US Biochemical, Cleveland OH)、Taqポリメラーゼ(Applied Biosystems)、熱安定性T7ポリメラーゼ(Amersham Biosciences, Piscataway NJ)を用い得る。あるいは、例えばELONGASE増幅システム(Invitrogen, Carlsbad CA)において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼとを併用し得る。好適には、MICROLAB2200液体転移システム(Hamilton, Reno, NV)、PTC200サーマルサイクラー(MJ Research, Watertown MA)およびABI CATALYST 800サーマルサイクラー(Applied Biosystems)などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373或いは377 DNAシークエンシングシステム(Applied Biosystems)、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Amersham Biosciences)または当分野で既知の他のシステムを用いてシークエンシングを行う。結果として得た配列を、当分野で周知の種々のアルゴリズムを用いて分析する(例えば、Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, 7.7ユニット、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページを参照)。
【０１９０】
当分野で周知の、PCR法をベースにした種々の方法と、部分的ヌクレオチド配列とを利用して、PMODをコードする核酸を伸長し、プロモーターや調節エレメントなど、上流にある配列を検出し得る。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマーおよびネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAからの未知の配列を増幅する方法である(例えばSarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322を参照)。別の方法にインバースPCR法があり、これは多岐の方向に伸長するプライマー群を用いて、環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座およびその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る(例えばTriglia, T. 他(1988) Nucleic Acids Res. 16:8186を参照)。第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これにはヒトおよび酵母人工染色体DNAの既知の配列群に隣接するDNA断片群をPCR増幅する方法を含む(例えばLagerstrom, M. 他(1991) PCR Methods Applic 1:111-119を参照)。この方法では、PCRを行う前に、複数の制限酵素の消化とライゲーション反応とを用い、未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入し得る。未知の配列群を検索するために用い得る、他の複数の方法も当分野で既知である(例えばParker, J.D.他(1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060を参照)。更に、PCR、ネステッドプライマー類、およびPROMOTERFINDERライブラリ類(Clontech, Palo Alto CA)を用いて、ゲノムDNAをウォーキングし得る。この手順は、ライブラリ類をスクリーニングする必要がなく、イントロン/エキソン接合部の発見に有用である。全てのPCRベースの方法では、市販ソフトウェア例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア(National Biosciences, Plymouth MN)或いは別の好適なプログラムを用い、長さ約22〜30ヌクレオチド、GC含有率が約50％以上、温度約68℃〜72℃で鋳型に対してアニーリングするよう、プライマー群を設計し得る。
【０１９１】
完全長cDNA群をスクリーニングする際は、より大きなcDNA群を含むようにサイズ選択されたライブラリ群を用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリ群は、しばしば遺伝子群の５'領域を有する配列を含み、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリ群は、５'非転写調節領域への、配列の伸長に有用であろう。
【０１９２】
市販のキャピラリー電気泳動システム群を用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認し得る。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザーで活性化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア(Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATORなど)を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析および電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１９３】
本発明の別の実施態様では、PMODをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を、PMOD、その断片または機能的等価物を適切な宿主細胞内に発現させる組換えDNA分子にクローニングし得る。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドを産生し、これらの配列をPMODの発現に利用し得る。
【０１９４】
種々の目的で、PMODをコードする配列群を改変するために、当分野で一般的に既知の複数の方法を用いて、本発明のポリヌクレオチド群を組換えることができる。この組換えの多様な目的には、遺伝子産物のクローン化の、あるいはプロセッシングおよび／または発現のモディフィケーションが含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドとの、ランダムなフラグメンテーションおよびPCR再アセンブリによるDNAシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組換え得る。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの改変、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成などを起こす突然変異を導入し得る。
【０１９５】
本発明のヌクレオチドは、MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA; 米国特許第5,837,458号; Chang, C.-C. 他(1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797; Christians, F.C. 他(1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A. 他(1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャッフリング技術の対象となり得る。これにより、生物活性または酵素活性、あるいは他の分子や化合物と結合する能力など、PMODの生物学的特性を改変あるいは改良し得る。DNAシャッフリングは、PCRを介する遺伝子断片組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異体群を同定する、選択またはスクリーニングの手順を経る。続いて、これら好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリングおよび選択／スクリーニングを行い得る。かくして、「人工的な」育種および急速な分子の進化によって、多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を持つ単一の遺伝子の断片を組換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングし得る。あるいは、所定の遺伝子の断片群を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子の断片と組換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、定方向の、制御可能な方法で最大化させることができる。
【０１９６】
別の実施態様では、PMODをコードするポリヌクレオチドは、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部を合成可能である(例えば、Caruthers. M.H.他(1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:215-223; および Horn, T.他(1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:225-232を参照)。或いはPMOD自体またはその断片の合成に、当分野で既知の化学的方法を用い得る。例えば種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行い得る(例えばCreighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, 55-60ページ; および Roberge, J.Y.他(1995) Science 269:202-204を参照)。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ(Applied Biosystems)を用いて達成し得る。更にPMODのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の改変、および／または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列群との組み合わせにより、天然ポリペプチドの配列を有するポリペプチド、または変異体ポリペプチドを作製できる。
【０１９７】
このペプチドは、分取用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質的に精製し得る(例えばChiez, R.M.およびF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421を参照)。この合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認できる(例えば前出のCreighton, 28-53ページを参照)。
【０１９８】
生物学的に活性なPMODを発現させるために、PMODをコードするポリヌクレオチドまたはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入し得る。好適な発現ベクターとは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写および翻訳の制御に必要なエレメント群を持つベクターである。必要なエレメントとしては、ベクター内およびPMODをコードするポリヌクレオチドにおける調節配列（例えばエンハンサー、構成型および発現誘導型のプロモーター、５'および３'の非翻訳領域など）が含まれる。必要なエレメント群は、強度および特異性が様々である。特異的な開始シグナル類を用いて、PMODをコードするポリヌクレオチド群の、より効率的な翻訳を達成することもできる。開始シグナルの例には、ATG開始コドンと、コザック配列など近傍の配列とが含まれる。PMODをコードするポリヌクレオチド配列、およびその開始コドンや、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写制御シグナルや翻訳制御シグナルは必要ないこともある。しかしながら、コード配列あるいはその断片のみが挿入された場合は、インフレームATG開始コドンなど外来性の翻訳制御シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外因性の翻訳エレメント群および開始コドン群は、様々な天然物および合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である(例えばScharf, D. 他(1994) Results Probl.Cell Differ. 20:125-162を参照)。
【０１９９】
当業者に周知の方法を用いて、PMODをコードするポリヌクレオチドと、好適な転写および翻訳制御エレメントとを持つ発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法としては、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組換え技術がある(例えばSambrook, J.他(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4, 8, および 16-17章; Ausubel, F.M.他(1995)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, 9, 13, および 16章を参照)。
【０２００】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、PMODをコードするポリヌクレオチドの保持および発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌など微生物や、ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルス、CaMVまたはタバコモザイクウイルス、TMV)または細菌発現ベクター(例えばTiプラスミドまたはpBR322プラスミド)で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある(例えば前出Sambrook; 前出Ausubel; Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509; Engelhard, E.K. 他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; Sandig, V.他(1996) Hum.Gene Ther. 7:1937-1945; Takamatsu, N.(1987) EMBO J. 6:307-311;『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill, New York NY, 191-196ページ; Logan, J. および T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659; および Harrington, J.J. 他(1997) Nat. Genet. 15:345-355を参照)。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ポリヌクレオチドを標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる(例えばDi Nicola, M.他(1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350-356; Yu, M.他 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344; Buller, R.M.他(1985) Nature 317(6040):813-815; McGregor, D.P.他(1994) Mol. Immunol. 31(3):219-226;並びにVerma, I.M.およびN. Somia (1997) Nature 389:239-242を参照)。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０２０１】
細菌系では、PMODをコードするポリヌクレオチドの使用目的に応じて多数のクローニングベクターおよび発現ベクターを選択し得る。例えばPMODをコードするポリヌクレオチドの慣例的なクローニング、サブクローニング、増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはPSPORT１プラスミド(Invitrogen)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。PMODをコードするポリヌクレオチドをベクターのマルチクローニング部位にライゲーションするとlacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子欠失の生成にも有用であろう(例えば、Van Heeke, G.およびS.M. Schuster(1989)J. Biol. Chem. 264:5503-5509を参照)。例えば抗体の産生のためなどに多量のPMODが必要な場合は、PMODの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導SP6バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを持つベクターが使用できる。
【０２０２】
PMODの産生には、酵母発現系を用い得る。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーターなど、構成型あるいは誘導型のプロモーターを持つ多数のベクターが、出芽酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)またはピキア酵母(Pichia pastoris)内で使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の、分泌か細胞内での保持かのどちらかを指示するものであり、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来ポリヌクレオチド配列群を組み込むことを可能にする(例えば前出のAusubel, 1995; Bitter, G.A. 他(1987) Methods Enzymol.153:516-544; および Scorer, C.A.他(1994) Bio/Technology 12:181-184を参照)。
【０２０３】
PMODの発現には植物系も使用可能である。PMODをコードするポリヌクレオチドの転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独であるいはTMV由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなCaMV由来の35Sおよび19Sプロモーターによって促進し得る（Takamatsu, N.（1987）EMBO J 6:307-311）。あるいは、RuBisCOの小サブユニットなどの植物プロモーター、または熱ショックプロモーターを用い得る(例えばCoruzzi, G.他(1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R.他(1984) Science 224:838-843; および Winter, J.他(1991) Results Probl.Cell Differ. 17:85-105を参照)。これらの作製物は、直接DNA形質転換により、または病原体を媒介とする形質移入により、植物細胞内に導入し得る(例えば『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY,191-196ページを参照)。
【０２０４】
哺乳類細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後期プロモーターと３連リーダー配列とからなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に、PMODをコードするポリヌクレオチド群をライゲーションし得る。アデノウイルスゲノムの可欠E1またはE3領域への挿入を用いれば、宿主細胞内でPMODを発現する感染ウイルスを得ることができる(例えばLogan, J.およびT. Shenk(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659を参照)。更に、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳類宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０２０５】
また、ヒト人工染色体(HAC)類を用いて、或るプラスミドに含まれ得る断片やプラスミドから発現し得る断片より大きなDNAの断片群を送達し得る。治療のために約６kb〜１０MbのHACsが作製され、従来の送達方法(リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル)で送達されている(例えばHarrington, J.J.他(1997) Nat. Genet. 15:345-355を参照)。
【０２０６】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、細胞株におけるPMODの安定した発現が望ましい。例えば、PMODをコードするポリヌクレオチドを細胞株に形質転換するために、発現ベクター類と、同じベクター上の或いは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用い得る。用いる発現ベクターは、ウイルス起源の複製要素、および／または内因性の発現要素を持ち得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間、細胞を増殖させ得る。選択可能マーカーの目的は選択剤への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーの存在により、導入した配列をうまく発現するような細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０２０７】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk⁻細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、apr⁻細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある(例えばWigler, M.他(1977) Cell 11:223-232; Lowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質あるいは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシドであるネオマイシンおよびG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える(例えばWigler, M.他(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570; Colbere-Garapin, F.他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14を参照)。この他の選択可能な遺伝子(例えばtrpBおよびhisD、これらは代謝物のための、細胞の必要条件を改変)も、文献に記載がある(例えばHartman, S.C.およびR.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047-8051を参照)。可視マーカー類、例えばアントシアニンや、緑色蛍光タンパク質(GFP；Clontech)、βグルクロニダーゼおよびその基質であるβグルクロニド、またはルシフェラーゼおよびその基質であるルシフェリンを用い得る。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを同定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性あるいは安定したタンパク質発現を定量し得る(例えばRhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131を参照)。
【０２０８】
マーカー遺伝子発現の有無によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在および発現の確認が必要な場合もある。例えば、PMODをコードする配列が或るマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、PMODをコードするポリヌクレオチド群を有する形質転換された細胞群は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定できる。または、或るマーカー遺伝子を、PMODをコードする配列とタンデムに、１つのプロモーターの制御下に配置し得る。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０２０９】
一般に、PMODをコードするポリヌクレオチドを持ち、PMODを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定できる。これらの方法には、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２１０】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いる、PMODの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。このような技法には、酵素に結合したイムノソルベントのアッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光活性化細胞選別（FACS）などがある。PMOD上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合結合試験を用いることもできる。これらのアッセイおよび他のアッセイは、当分野で周知である(例えばHampton, R.他(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN, Sect.IV; Coligan, J.E.他(1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience, New York NY; および Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJを参照)。
【０２１１】
多岐にわたる標識方法および抱合方法が当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。PMODをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、エンドラベリング（末端標識化)、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。或いはPMODをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片を、mRNAプローブを生成するためのベクターにクローニングしうる。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6などの好適なRNAポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えばAmersham Biosciences、Promega(Madison WI)、U.S. Biochemicalなどの種々の市販キットを用いて実行できる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子あるいは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤などがある。
【０２１２】
PMODをコードするポリヌクレオチドで形質転換した宿主細胞を、細胞培地での該タンパク質の発現と回収とに好適な条件下で培養しうる。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、又はその両者に依存する。PMODをコードするポリヌクレオチドを持つ発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を透過するPMODの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０２１３】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入したポリヌクレオチドの発現をモジュレートする能力、または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ、および／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための、特定の細胞装置および特徴的な機序を持つ、種々の宿主細胞(例えばCHO、HeLa、MDCK、HEK293、WI38など)は、American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするように選択し得る。
【０２１４】
本発明の別の実施態様では、PMODをコードする、天然ポリヌクレオチド、修飾ポリヌクレオチド、または組換えポリヌクレオチドを或る異種配列に結合させることにより、上記した任意の宿主系内で、１融合タンパク質の翻訳を生じ得る。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラPMODタンパク質は、PMODの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分および異種ペプチド部分も、市販されている親和性マトリックスを用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、チオレドキシン(Trx)、カルモジュリン結合ペプチド(CBP)、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素(HA)がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-mycおよび赤血球凝集素(HA)は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いた、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、PMODをコードする配列と異種タンパク質配列との間に、タンパク質分解切断部位を融合タンパク質が持つように遺伝子操作すると、PMODが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現および精製方法は、前出のAusubel（1995）10章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現および精製を促進することもできる。
【０２１５】
別の実施態様では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで、放射標識PMODを合成しうる。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターに機能的に連結したタンパク質コード配列群の、転写と翻訳とを共役させる。翻訳は、例えば³⁵Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０２１６】
PMOD或いはその断片または変異体を用いて、PMODに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。１つ以上の試験化合物を用いて、PMODへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。種々の実施態様で、1、2、3、4、5、10、20、50、100、または200個の試験化合物をPMODへの特異結合につきスクリーニングできる。試験化合物の例として、抗体、anticalin、オリゴヌクレオチド、タンパク質(例えばリガンドや受容体)、または小分子が挙げられる。
関連の実施態様で、PMOD変異体を用いて試験化合物たとえば抗体の、PMODへの結合や、PMOD変異体へ、または組み合わせたPMODおよび/または1つ以上のPMOD変異体への結合をスクリーニングできる。或る実施態様で或るPMOD変異体を用いて、PMOD変異体に結合するがSEQ ID NO:1-28の正確な配列を持つPMODには結合しない化合物をスクリーニングできる。こうしたスクリーニングの実施に用いるPMOD変異体は、約50％〜約99％のPMODへの配列同一性の範囲を持つ場合があり、種々の実施態様は60％、70％、75％、80％、85％、90％、および95％の配列同一性を持ち得る。
【０２１７】
或る実施態様でPMODへの特異結合スクリーニングで同定された化合物は、PMODの天然リガンドに密接に関連する場合があり、例えばリガンドやその断片であり、または天然基質や、構造的または機能的な擬態物質（mimetic）、あるいは自然結合パートナーである(例えばColigan, J.E.他(1991) Current Protocols in Immunology 1(2):5章を参照)。別の実施態様では、こうして同定した化合物は、受容体PMODの天然リガンドでありうる(例えばHoward, A.D.他(2001) Trends Pharmacol.Sci.22:132-140; Wise, A. 他(2002) Drug Discovery Today 7:235-246を参照)。
【０２１８】
別の実施態様でPMODへの特異結合スクリーニングで同定した化合物は、PMODが結合する天然受容体に、或いは少なくとも該受容体の或る断片に、または例えばリガンド結合部位や結合ポケットの全体または一部を含む該受容体の或る断片に、密接に関連し得る。例えば該化合物は、シグナルを伝播可能なPMOD受容体の場合や、シグナルを伝播できないPMODおとり受容体の場合がある(Ashkenazi, A. およびV.M. Divit (1999) Curr. Opin. Cell Biol.11:255-260; Mantovani, A. 他(2001) Trends Immunol. 22:328-336)。該化合物は既知の技術を用いて合理的に設計できる。こうした技術の例としては、化合物エタネルセプト(etanercept)(ENBREL; Immunex Corp., Seattle WA)作製に用いた技術を含む。エタネルセプトは、ヒトのリウマチ様関節炎の治療に有効である。エタネルセプトは遺伝子操作されたp75腫瘍壊死因子(TNF)受容体ダイマーであり、ヒトIgG₁ のFc部分に連結されている(Taylor, P.C. 他(2001) Curr. Opin. Immunol. 13:611-616)。
【０２１９】
１つの実施態様で、2種以上の、同様のまたは或いは異なる特異性を持つ抗体を、PMODまたはその断片あるいは変異体への特異結合に関してスクリーニングできる。こうしてスクリーニングした抗体の結合特異性を選択し、PMODの特定の断片または変異体を同定できる。１つの実施態様で、PMODの特定の断片または変異体を優先的に同定できる結合特異性を持つ抗体を選択できる。別の実施態様で、PMOD産生の増加、低下、或いは異常を有する特定の疾患または病状を優先的に診断できる結合特異性を持つ抗体を選択できる。
【０２２０】
１つの実施態様で、anticalinを、PMODまたはその断片あるいは変異体への特異結合につきスクリーニングできる。anticalinはリガンド結合タンパクであり、リポカリンの足場を元に構築されている(Weiss, G.A.およびH.B. Lowman (2000) Chem. Biol. 7:R177-R184; Skerra, A. (2001) J. Biotechnol. 74:257-275)。リポカリン類のタンパク構造には８本鎖逆平行βストランドを持つ或るβバレルを含むことがあり、このバレルはその開放端で4つのループを支持する。これらのループはリポカリンの天然リガンド結合部位を形成する。この部位をin vitroアミノ酸置換で再操作し、新規な結合特異性を与えうる。アミノ酸置換には当分野で既知の方法または本明細書に記載の方法を利用でき、保存的置換(例えば結合特異性を変えない置換)または、結合特異性を軽度、中等度、または大きく変える置換を含みうる。
【０２２１】
一実施態様では、PMODに特異的に結合、もしくは刺激または阻害する化合物のスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてPMODを発現する適切な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳類、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。PMODを発現する細胞、またはPMODを含有する細胞膜分画を試験化合物と接触させて、結合や、PMODまたは該化合物のどちらかの、刺激または活性の阻害を分析する。
【０２２２】
或るアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、フルオロフォア、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の、あるいは固体支持物に固定されたPMODと混合するステップと、PMODとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出および測定を行いうる。更にこのアッセイは、無細胞再構成標本、化学ライブラリ、または、天然産物の混合物を用いて実施でき、試験化合物(群)は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定する。
【０２２３】
アッセイを用いて、或る化合物が、その天然リガンドに結合する能力、および/または、その天然リガンドの、その天然受容体への結合を阻害する能力を評価しうる。こうしたアッセイの例としては、米国特許第5,914,236号および第6,372,724号に記載されたような放射ラベルアッセイを含む。関連した実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(受容体など)に導入され、その天然リガンドに結合する能力を向上または改変しうる(例えばMatthews, D.J. および J.A. Wells. (1994) Chem. Biol. 1:25-30を参照)。別の関連した実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(リガンドなど)に導入され、その天然受容体に結合する能力を向上または改変しうる(例えばCunningham, B.C. および J.A. Wells (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3407-3411; Lowman, H.B. 他(1991) J. Biol. Chem. 266:10982-10988を参照)。
【０２２４】
PMOD或いはその断片または変異体を用いて、PMODの活性をモジュレートする化合物をスクリーニングしうる。このような化合物としては、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニストまたは逆アゴニストなどが含まれ得る。或る実施例では、PMODが少なくとも１つの試験化合物と結合する、PMODの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのPMODの活性と、試験化合物不在下でのPMODの活性とを比較する。試験化合物の存在下でのPMODの活性の変化は、PMODの活性をモジュレートする化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物を、PMODの活性に適した条件下で、PMODを含むin vitro系すなわち無細胞系と混合してアッセイを実施する。これらアッセイの何れにおいても、PMODの活性をモジュレートする試験化合物は間接的にモジュレートする場合があり、その際は試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０２２５】
別の実施例では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、PMODまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である(米国特許第5,175,383号および第5,767,337号などを参照)。例えば129/SvJ細胞系などのマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo: Capecchi, M.R.(1989)Science 244:1288-1292)などのマーカー遺伝子で破壊した、目的の遺伝子を持つベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより、宿主ゲノムの対応する領域に組込まれる。或いは、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする(Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002; Wagner, K.U.他(1997) Nucleic Acids Res. 25:4323-4330)。形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス株などから採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。これらの胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を特定し、これらを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物を、潜在的な治療薬や毒性薬物で試験しうる。
【０２２６】
PMODをコードするポリヌクレオチドを、in vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することも可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞タイプを含む、少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統および心筋細胞に分化する(Thomson, J.A.他(1998) Science 282:1145-1147)。
【０２２７】
PMODをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することも可能である。ノックイン技術を用いて、PMODをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について試験し、潜在的医薬品で処理し、ヒト疾患の治療に関する情報を得る。或いは例えばPMODを乳汁内に分泌するなどPMODを過剰発現する哺乳類近交系は、このタンパク質の便利な源泉ともなり得る(Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74)。
【０２２８】
(治療)
PMODの領域群とタンパク質修飾および維持分子との間には、例えば配列及びモチーフに関する、化学的および構造的類似性が存在する。更にPMODの発現は、上皮、脳、脳腫瘍、回腸、リンパ節、肝臓、卵巣、胎盤、前立腺、小脳、下垂体、小腸、睾丸の各組織および前単球細胞に密接に関連している。PMODを発現する組織の更なる数例は、表６と実施例１１とを見られたい。このようにPMODは、胃腸障害、心血管障害、自己免疫／炎症性疾患、細胞増殖障害、発生・発達障害、上皮障害、神経疾患、および生殖障害において役割を果たすと考えられる。PMODの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、PMODの発現または活性を低下させることが望ましい。また、PMODの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、PMODの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０２２９】
従って、一実施態様において、PMODの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にPMODまたはその断片や誘導体を投与し得る。限定するものではないが、このような疾患には胃腸障害、心血管障害、自己免疫／炎症疾患、上皮性疾患、細胞増殖異常、発生・発達障害、神経疾患、生殖障害が含まれ、胃腸障害には、嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動的うっ血、ヘパトーム、感染性結腸炎、潰瘍性結腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホウィップル病、マロリー‐ワイス症候群、大腸癌、大腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（AIDS）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、脂肪肝、血色素症、ウィルソン病、α₁アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞および血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性脂肪肝、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性過形成および腺腫、癌腫など肝癌を含む。心血管障害には、動静脈瘻、アテローム硬化、高血圧、脈管炎、レイノー病、動脈瘤、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎および静脈血栓、血管系腫瘍、血栓溶解の合併症、バルーン血管形成術、血管置換術（vascular replacement）、冠動脈バイパス移植術、鬱血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪部石灰化（mitral annular calcification）、僧帽弁逸脱、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心移植の合併症を含む。自己免疫／炎症疾患には、後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジソン病（慢性原発性副腎機能不全）、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、アテローム性粥腫崩壊、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、関節軟骨変性、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症(systemic sclerosis)、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷を含む。上皮性疾患には、発汗異常性湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、毛孔性角化症、肝斑、白斑、光線性角化症、基底細胞癌、扁平細胞癌、脂漏性角化症、毛嚢炎、単純疱疹、帯状疱疹、水痘、カンジダ症、皮膚糸状菌症、疥癬、虫刺され、サクランボ色血管腫、ケロイド、皮膚線維腫、先端線維性軟疣、蕁麻疹、一過性棘融解性皮膚症、乾燥症、湿疹、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、手湿疹、貨幣状湿疹、慢性単純性苔癬、皮脂減少性湿疹、鬱血性皮膚炎および鬱血性潰瘍化、脂漏性皮膚炎、乾癬、扁平苔癬、薔薇色粃糠疹、膿痂疹、膿瘡、皮膚糸状菌症、癜風、疣、尋常性座瘡、赤鼻、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、腫瘍随伴性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、妊娠性疱疹、疱疹状皮膚炎、線状IgA病、後天性表皮水疱症、皮膚筋炎、紅斑性狼瘡、強皮症、限局性強皮症、紅皮症、脱毛症、修飾皮膚病変(figurate skin lesion)、毛細血管拡張、色素脱失、色素沈着過剰、小疱疹／水疱、発疹、皮膚薬物反応、丘疹結節皮膚損傷、慢性不治傷、光過敏症、単純型表皮水疱症、表皮剥離性角質増殖症、表皮溶解性掌蹠角皮症および非表皮溶解性掌蹠角皮症、ジーメンス水疱型魚鱗癬、剥脱性魚鱗癬、手掌角化症および足底角化症、掌蹠角化症、掌蹠角皮症、点状角化症、メースマン角膜ジストロフィ、先天性爪肥厚、白色海綿状母斑、多発性皮脂嚢腫症、上皮性母斑／表皮剥離性角質増殖症、連珠毛、裂毛症、慢性肝炎／特発性肝硬変、および、結腸直腸過形成を含む。細胞増殖異常には日光角化症、動脈硬化、アテローム硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌を含む。発生・発達障害には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、骨吸収、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス‐マジェニス症候群（Smith- Magenis syndrome）、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症や、シャルコーマリーツース病および神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症や、Syndenham舞踏病（Syndenham's chorea）および脳性小児麻痺などの発作障害、二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、加齢黄斑変性、感音難聴を含む。神経疾患には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病およびその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化および他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症および他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、およびGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病および代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳三叉神経血管症候群(encephalotrigeminal syndrome)、精神遅滞および他の中枢神経系発達障害(ダウン症を含む)、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経疾患、脊髄疾患、筋ジストロフィー他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神障害（気分性、不安性の障害、統合失調症／分裂病）、季節性感情障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性（corticobasal degeneration）、および家族性前頭側頭型痴呆を含む。生殖障害には不妊（例えば卵管疾患、排卵不良、子宮内膜症、プロラクチン産生障害、性周期途絶、月経周期途絶、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜腫瘍や卵巣腫瘍、子宮筋腫、自己免疫疾患、異所性妊娠、奇形発生、乳癌、乳腺症疾患、乳漏症、精子形成の途絶、異常精子生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、ペーロニー病、インポテンス、男性乳癌、女性化乳房を含む。
【０２３０】
別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、PMODの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、PMODまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを被験者に投与し得る。
【０２３１】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、PMODの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたPMODを有する組成物を、好適な医薬用キャリアと共に被験者に投与し得る。
【０２３２】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、PMODの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、PMODの活性を調節するアゴニストを被験者に投与し得る。
【０２３３】
更なる実施例では、PMODの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にPMODのアンタゴニストを投与し得る。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した胃腸障害、心血管障害、自己免疫／炎症疾患、細胞増殖障害、発生・発達障害、上皮障害、神経疾患、および生殖障害が含まれる。一実施態様では、PMODと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはPMODを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング機構或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０２３４】
別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、PMODの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、PMODをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを被験者に投与し得る。
【０２３５】
別の実施態様では、任意のタンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、相補配列、またはベクター実施態様を、別の適切な治療薬と組合せて投与できる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組合せることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法により、少量の各薬物で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２３６】
PMODのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造し得る。詳しくは、精製されたPMODを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてPMODと特異的に結合する薬の同定が可能である。PMODへの抗体も、本技術分野で公知の方法を用いて産生され得る。限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、およびFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体(すなわち二量体の形成を阻害する抗体)は通常、治療用に好適である。一本鎖抗体(例えば由来はラクダまたはラマ)は強力な酵素阻害剤である可能性があり、ペプチド擬態物質の設計において利点を持つようであり、免疫吸着剤とバイオセンサーとの開発においても利点を持つようである(Muyldermans, S. (2001) J. Biotechnol. 74:277-302)。
【０２３７】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒトなどを含む種々の宿主が、PMOD、若しくは免疫原性の特性を備えるその任意の断片またはオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン(KLH)、ジニトロフェノールなどの界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG(カルメット‐ゲラン杆菌)およびコリネバクテリウム‐パルバム(Corynebacterium parvum)が特に好ましい。
【０２３８】
PMODに対する抗体を誘導するために用いるオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を持つものが好ましく、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものとなる。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。PMODアミノ酸の短いストレッチは、KLHなど別のタンパク質の配列と融合し得、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０２３９】
PMODに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって抗体分子を産生する、任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびEBV-ハイブリドーマ技術がある(例えばKohler, G.他(1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D.他(1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, R.J.他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; および Cole, S.P.他(1984) Mol.Cell Biol. 62:109-120を参照)。
【０２４０】
更に、「キメラ抗体」作製のために発達した、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性および生物学的活性を備える分子を得るために用いられる(例えばMorrison, S.L.他(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger, M.S. 他(1984) Nature 312:604-608; および Takeda, S.他(1985) Nature 314:452-454を参照)。別法では、当分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のために記載された技術を適用して、PMOD特異的一本鎖抗体を生成し得る。関連した特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリ類からチェーンシャッフリングによって産生することもできる(例えばBurton D.R.(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137を参照)。
【０２４１】
抗体類の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは文献に開示されているように非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリ類またはパネル類のスクリーニングによっても行い得る(例えばOrlandi, R.他(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837; Winter, G.他(1991) Nature 349:293-299を参照)。
【０２４２】
PMODに対する特異結合部位を持つ抗体断片をも産生し得る。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF(ab')₂ 断片と、F(ab')₂ 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。あるいは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる(例えばHuse, W.D.他(1989) Science 246:1275-1281を参照)。
【０２４３】
種々の免疫学的検定(イムノアッセイ)を用いてスクリーニングすることにより、所望の特異性を有する抗体を同定し得る。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを用いる競合的な結合、または免疫放射線アッセイのための数々のプロトコルが、当分野では周知である。通常このような免疫学的検定には、PMODとその特異性抗体との間の複合体形成の測定が含まれる。２つの非干渉性PMODエピトープに対して反応性を持つモノクローナル抗体群を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合結合試験も利用できる(Pound、前出)。
【０２４４】
ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、PMODに対する抗体の親和性を算定する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態の下でPMOD抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。PMODエピトープ多数に対してポリクローナル抗体類は親和性が不均一であり、或るポリクローナル抗体製剤に関して判定したKaは、PMODに対する抗体群の平均の親和性または結合活性を表す。特定PMODエピトープに対してモノクローナル抗体は単一特異的であり、モノクローナル抗体の或る製剤について判定したKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が１０^９〜１０^１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体製剤は、PMOD-抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が１０^６〜１０^７liter／ｍｏｌの低親和性抗体製剤は、PMODが抗体から最終的に（好ましくは活性化状態で）解離する必要がある免疫精製（immunopurification）および類似の処理に用いるのが好ましい（Catty, D.（1988）Antibodies, Volume I: A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. および Cryer, A.（1991）A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY）。
【０２４５】
ポリクローナル抗体製剤の抗体価および結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような製剤の品質および適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体製剤は一般に、PMOD抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である（例えば前出のCatty、同Coligan 他を参照）。
【０２４６】
本発明の別の実施例では、PMODをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列を、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、PMODをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（DNA、RNA、PNA、または修飾したオリゴヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはより大きな断片が、PMODをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である(例えばAgrawal, S.,編集(1996)Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJを参照)。
【０２４７】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を適切な標的細胞に導入するのに好適な、任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で、細胞内に送達し得る(例えばSlater, J.E. 他(1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475;およびScanlon, K.J.他(1995) 9(13):1288-1296を参照)。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（例えばMiller, A.D.（1990）Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W.およびW. Walther（1994）Pharmacol. Ther. 63（3）:323-347を参照）。その他の遺伝子送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープおよび当分野で公知のその他のシステムが含まれる(例えばRossi, J.J.(1995)Br. Med. Bull. 51(1):217-225; Boado、R.J.他(1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C.他(1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736を参照)。
【０２４８】
本発明の別の実施態様では、PMODをコードするポリヌクレオチドを体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用い得る。遺伝子治療により、(i)遺伝子欠損症を治療し(例えばＸ染色体連鎖遺伝(Cavazzana-Calvo, M.他(2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重症複合型免疫不全(SCID)-X1病の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重症複合型免疫不全症候群（Blaese, R.M. 他(1995) Science 270:475-480; Bordignon, C.他(1995) Science 270:470-475)、嚢胞性繊維症(Zabner, J.他(1993) Cell 75:207-216; Crystal, R.G.他(1995) Hum.Gene Therapy 6:643-666; Crystal, R.G.他(1995) Hum.Gene Therapy 6:667-703)、サラセミア(thalassamia)、家族性高コレステロール血症や、第８因子若しくは第９因子欠損に起因する血友病(Crystal, R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 389:239-242)、(ii)条件的致死性遺伝子産物を発現させ(例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合)、(iii)細胞内の寄生生物、例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)(Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poeschla, E.他(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）などヒトレトロウイルス、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicansおよびParacoccidioides brasiliensis等の寄生真菌、並びに熱帯熱マラリア原虫およびクルーズトリパノソーマ等の寄生原虫に対する防御機能を有するタンパク質を発現できる。PMODの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からPMODを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２４９】
本発明の更なる実施例では、PMODの欠損による疾患や異常症を、PMODをコードする哺乳類発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってPMOD欠損細胞に導入することによって治療する。in vivoあるいはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、(i)個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、(ii)遺伝子銃、(iii)リポソームを介した形質移入、(iv)受容体を介した遺伝子導入、および(v)DNAトランスポゾンの使用がある(Morgan, R.A. および W.F. Anderson(1993)Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z.(1997)Cell 91:501-510; Boulay, J-L. およびH. Recipon(1998)Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450)。
【０２５０】
PMODの発現に有効であり得る発現ベクターの例として、限定するものではないがpcDNA 3.1、EpiTag、pRcCMV2、pREP、pVAX、pCRII-TOPOTAベクター（Invitrogen, Carlsbad CA）、pCMV-Script、pCMV-Tag、PEGSH/PERV（Stratagene, La Jolla CA）およびPTET-OFF、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG（Clontech, Palo Alto CA）が挙げられる。PMODを発現させるために、（i）構成的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチンの遺伝子など）、(ii)誘導性プロモーター（例えば、市販されているT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. および H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他(1995) Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V. および H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456))、エクジソン誘導性プロモーター(市販されているプラスミドPVGRXRおよびPINDに含まれている：Invitrogen)、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター(Rossi, F.M.V. および H.M. Blau, 前出)、または(iii)正常な個体に由来する、PMODをコードする内因性遺伝子の天然プロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用い得る。
【０２５１】
市販のリポソーム形質転換キット(例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Transfection Kit)を用いれば、当業者は実験の各パラメータを最適化する努力をさほど要さず、ポリヌクレオチド群を、培養中の標的細胞群に送達し得る。別法では、リン酸カルシウム法(Graham. F.L. および A.J. Eb(1973)Virology 52:456-467)若しくは電気穿孔法(Neumann, E. 他(1982) EMBO J. 1:841-845)によって、形質転換が実施される。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳類の形質移入プロトコルの修正が必要である。
【０２５２】
本発明の別の実施態様では、PMODの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や障害は、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは独立したプロモーターの調節の下でPMODをコードするポリヌクレオチドと、（ii）好適なRNAパッケージングシグナルと、（iii）追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコード配列を伴うRev応答性エレメント（RRE）と、からなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター(例えばPFBおよびPFBNEO)はStratagene社から市販されており、刊行データ(Riviere, I. 他(1995)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6733-6737)に基づく。上記データを引用することを以て本明細書の一部とする。このベクターは、好適なベクター産生細胞株(VPCL)において増殖される。VPCLは、各標的細胞上の受容体への親和性を持つエンベロープ遺伝子を、またはVSVgなど汎親和性エンベロープタンパク質を発現する(Armentano, D. 他(1987) J. Virol. 61:1647-1650; Bender, M.A.他 (1987) J. Virol. 61:1639-1646; Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806; Dull, T.他 (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zufferey, R.他 (1998) J. Virol. 72:9873-9880)。Riggに付与された米国特許第5,910,434号(「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」)において、レトロウイルスパッケージング細胞株群を得る方法が開示されており、引用を以て本明細書の一部とする。レトロウイルスベクター類の繁殖や、細胞集団(例えばCD4⁺Ｔ細胞群)の形質導入、および形質導入した細胞群の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に周知の手法であり、多数の文献に記載がある(Ranga, U.他(1997) J. Virol. 71:7020-7029; Bauer, G.他 (1997) Blood 89:2259-2267; Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716; Ranga, U.他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1201-1206; Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290)。
【０２５３】
或る実施態様では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、PMODの発現に関連する１或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にPMODをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクター類の作製およびパッケージングについては、当業者に周知である。複製欠損型アデノウイルスベクター類は、種々の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子群を、無損傷の膵島内に導入する目的で多様に利用し得ることが証明された(Csete, M.E.他(1995) Transplantation 27:263-268)。潜在的に有用なアデノウイルスベクター類はArmentanoに付与された米国特許第5,707,618号(「Adenovirus vectors for gene therapy」)に記載されており、引用することを以て本明細書の一部とする。アデノウイルスベクター類については、Antinozzi, P.A. 他(1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544 並びに、Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 18:389:239-242も参照されたい。両文献は、引用を以て本明細書の一部とする。
【０２５４】
別の実施態様では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、PMODの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する標的細胞に、PMODをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純ヘルペスウイルス（HSV）系ベクター類は、HSVが親和性を持つ中枢神経細胞にPMODを導入する際に、特に有益に思える。ヘルペス系ベクター類の作製およびパッケージングは、当業者に公知である。或る複製適格性単純ヘルペスウイルス(HSV)１型系のベクターが、或るレポーター遺伝子の、霊長類の眼への送達に用いられている(Liu, X. 他(1999) Exp.Eye Res. 169:385-395)。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号(「Herpes simplex virus strains for gene transfer」)に詳細に開示されており、該特許の引用を以て本明細書の一部とする。米国特許第5,804,413号は、ヒト遺伝子治療などの目的で、好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外来遺伝子を有するゲノムを持つ、組換えHSV d92の利用について記載する。上記特許はまた、ICP4、ICP27、およびICP22を欠失した組換えHSV系統の、作製および使用について開示している。HSVベクター類については、Goins, W.F. 他(1999) J. Virol. 73:519-532 および Xu, H.他 (1994) Dev. Biol. 163:152-161も参照されたい。両文献は、引用を以て本明細書の一部とする。クローン化したヘルペスウイルス配列群の操作、大ヘルペスウイルスゲノム(large herpesvirus genomes)の様々なセグメントを持つ複数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長および増殖、並びに細胞群へのヘルペスウイルスの感染は、当業者に公知の技術である。
【０２５５】
別の実施態様では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてPMODをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス(SFV)の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクター類は、SFVゲノムに基づく(Garoff, H. および K.-J. Li (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:464-469)。αウイルスRNAの複製中に、ウイルスのカプシドタンパク質群を通常はコードする、サブゲノムRNAが産生される。このサブゲノムRNAは、完全長ゲノムRNAよりも高レベルに複製するので、酵素活性(例えばプロテアーゼおよびポリメラーゼ)を持つウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質群が過剰産生される。同様に、PMODをコードする配列をαウイルスゲノムの、キャプシッドをコードする領域に挿入することにより、ベクター導入細胞において、PMODをコードするRNAが多数、産生され、高レベルにPMODが合成される。通常、αウイルスの感染は、数日以内の細胞溶解を伴う。一方、シンドビスウイルス(SIN)の或る変異体を有するハムスター正常腎臓細胞(BHK-21)群が持続的な感染を確立する能力は、αウイルス類の溶解複製を、遺伝子治療に応用し得るように好適に改変可能であることを示唆する(Dryga, S.A.他(1997) Virology 228:74-83)。広い宿主域を持つαウイルスにより、様々なタイプの細胞にPMODを導入できる。或る集団における或るサブセットの細胞群の特異的形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNAおよびRNAの形質移入方法およびαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２５６】
転写開始部位(transcription initiation site)由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。この位置は、例えばスタート部位(start site)から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開く、二重らせんの能力を阻害するので有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある(例えばGee, J.E.他(1994) in Huber, B.E. および B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing, Mt. Kisco NY, 163-177ページを参照)。また、相補配列またはアンチセンス分子を設計し、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳をブロックし得る。
【０２５７】
リボザイム類は、酵素的RNA分子である。RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用い得る。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、人為操作されたハンマーヘッド型リボザイム分子は、PMODをコードするRNA分子のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触媒する可能性がある。
【０２５８】
任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位を先ず同定するため、GUA、GUU、GUC配列などリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンする。一度同定されると、切断部位を持つ標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いRNA配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチド群とのハイブリダイゼーションへのアクセス可能性をテストすることによって行い得る。
【０２５９】
相補リボ核酸分子およびリボザイムは、核酸分子合成のための当分野で既知の任意の方法を用いて作製し得る。作製方法には、固相ホスホラミダイト化学合成など、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、PMODをコードするDNA分子のin vitroおよびin vivo転写によってRNA分子を作成し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6などの好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取込むことが可能である。あるいは、相補的RNAを構成的あるいは誘導的に合成するこれらのcDNA構成物を、細胞株、細胞または組織内に導入することができる。
【０２６０】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするために、RNA分子を修飾し得る。限定するものではないが可能な修飾としては、分子の５'末端、３'末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加することや、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2' O-メチルを使用することが含まれる。この概念は、本来はPNA群の産出におけるものであるが、これら全ての分子に拡大することができる。そのためには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−および同様の修飾をしたものや、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン(queosine)、ワイブトシン(wybutosine)を加える。
【０２６１】
本発明の更なる実施例は、PMODをコードするポリヌクレオチドの発現の改変に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現改変を起こすのに有効であり得る化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチドや、転写因子などのポリペプチド転写制御因子、および、特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を改変し得る。従って、PMODの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、PMODをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、PMODの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、PMODをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２６２】
或る特定ポリヌクレオチドの発現を改変する際の有効性について、少なくとも１個、または複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物を得るには、当分野で公知の任意の方法を用い得る。取得方法としては、以下の場合に有効な既知化合物の化学修飾がある。ポリヌクレオチドの発現を改変する場合と、既存の、市販のまたは私的な、天然または非天然の化合物のライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的および／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合とである。PMODをコードするポリヌクレオチドを持つサンプルを、このようにして得た試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルは例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、in vitro無細胞系すなわち再構成生化学系があり得る。PMODをコードするポリヌクレオチドの発現の改変は、当分野で公知の任意の方法でアッセイする。通常、或る特定ヌクレオチドの発現を検出するには、PMODをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を持つプローブとのハイブリダイゼーションを用いる。ハイブリダイゼーション量を定量することにより、１つ以上の試験化合物に曝露される、または曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較のための基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示す。或る特定ポリヌクレオチドの改変発現に有効な化合物のためのスクリーニングを実行でき、例えば分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)遺伝子発現系(Atkins, D. 他(1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他(2000) Nucleic Acids Res. 28:E15)、またはヒト細胞株たとえばHeLa細胞(Clarke, M.L.他(2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13)を用い得る。本発明の或る特定の実施態様は、或る特定ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性について、オリゴヌクレオチド(デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾したオリゴヌクレオチド)の組合せライブラリをスクリーニングする過程に関する(Bruice, T.W. 他(1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W.他(2000) 米国特許第6,022,691号}。
【０２６３】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitroおよびex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを、患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクションによる、またはリボソーム注入やポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる(例えばGoldman, C.K.他(1997) Nat. Biotechnol. 15:462-466を参照)。
【０２６４】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルなどの哺乳類を含めて治療が必要な全ての被験体に適用できる。
【０２６５】
本発明の或る更なる実施態様は、薬物として許容できる或る賦形剤と共に製剤される或る活性成分を一般に有する、或る組成物の投与に関する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴムおよびタンパク質がある。様々な剤型が広く知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing, Easton PA)の最新版に記載されている。このような組成物は、PMOD、PMODに対する抗体、PMODの擬態物質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターから構成し得る。
【０２６６】
本発明に用いる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２６７】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子(例えば伝統的な低分子量有機薬)の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子(例えばより大きなペプチドおよびタンパク質)の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリンなどの薬物を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした(Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号などを参照)。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２６８】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２６９】
PMODを有する、またはその断片群を有する高分子群を直接、細胞内に送達すべく、特殊な種々の形状の組成物群が調製され得る。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、その高分子の細胞融合と細胞内送達とを促進し得る。別法では、PMODまたはその断片を、HIV Tat-1タンパク質の陽イオンN末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質類は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞群に形質導入することがわかっている(Schwarze, S.R. 他(1999) Science 285:1569-1572)。
【０２７０】
任意の化合物に対して、先ず細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、あるいは、動物モデル、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルまたはブタなどにおいて、治療有効量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。
【０２７１】
治療有効量とは、症状や容態を回復させる、例えばPMODまたはその断片、PMODの抗体、アゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど、活性処方成分の量を指す。治療有効性および毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬学手法によって、例えばED₅₀(集団の５０％の治療有効量)またはLD₅₀(集団の５０％の致死量)統計を計算するなどして判定できる。毒性効果の、治療効果に対する用量比が治療指数であり、LD₅₀/ED₅₀比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイと動物実験とから得られたデータは、ヒトに用いる投与量の範囲の策定に用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆どあるいは全く持たず、ED₅₀を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性および投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２７２】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、あるいは所望の効果を維持すべく、用法および用量を調整する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、患者の年齢、体重および性別(ジェンダー)、投与の時間および頻度、薬物の配合、反応感受性および治療に対する応答などを考慮し得る。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、あるいは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２７３】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０.１〜１００,０００μgであり、合計で約１gまでとする。特定の投与量および送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、ヌクレオチドの処方では、タンパク質またはそれらのインヒビター類とは異なる処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、部位などに特異的なものとなる。
【０２７４】
(診断)
別の実施態様では、PMODに特異的に結合する抗体が、PMODの発現によって特徴付けられる障害の診断に、またはPMODやそのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療中の患者をモニターするためのアッセイに用いられ得る。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。PMODの診断アッセイには、ヒトの体液から、あるいは細胞や組織の抽出物から、抗体および標識を用いてPMODを検出する方法が含まれる。この抗体は、修飾して、または修飾せずに使用される。また、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２７５】
PMODを測定するための種々のプロトコル、例えばELISA，RIA，およびFACSなどが当分野では周知であり、変化した、あるいは異常なレベルのPMODの発現を診断するための基盤を提供する。正常或いは標準的なPMODの発現の値は、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とPMODに対する抗体とを複合体の形成に適した条件の下で結合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験体、対照および、生検組織からの疾患サンプルで発現するPMODの量を、標準値と比較する。標準値と被験体との偏差が、疾患を診断するパラメータを確定する。
【０２７６】
本発明の別の実施態様によれば、PMODをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用い得るポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド、相補的RNAおよびDNA分子、そしてPNAが含まれる。これらのポリヌクレオチドを用いて、PMODの発現が疾患と相関し得る生検組織での遺伝子発現を、検出し定量し得る。この診断アッセイを用いて、PMODの存在の有無、更には過剰な発現を判定し、治療時のPMODレベルの調節を監視する。
【０２７７】
或る態様では、PMODまたは近縁の分子をコードする、ゲノム配列などポリヌクレオチドを検出可能なPCRプローブ類とのハイブリダイゼーションを、PMODをコードする核酸配列を同定するために用いることができる。プローブが高度に特異的な領域（例えば５'調節領域）から作られている、或いはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているという、プローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェンシーとによって、そのプローブがPMODをコードする天然配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子変異体や関連配列を同定するかどうかが決まることとなる。
【０２７８】
プローブ類はまた、関連配列の検出に利用され得る。また、PMODをコードする任意の配列との少なくとも５０％の配列同一性を持ち得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:29-56の配列、あるいはPMOD遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２７９】
PMODをコードするポリヌクレオチド群に対して特異的なハイブリダイゼーションプローブ群の作製手段としては、PMODまたはPMOD誘導体群をコードするポリヌクレオチド群を、mRNAプローブ群の作製のためのベクター類にクローニングする方法を含む。mRNAプローブ作製用ベクター類は、当業者に知られまた市販されており、好適なRNAポリメラーゼと好適な標識されたヌクレオチドとを加えることによって、in vitroでRNAプローブを合成するために用い得る。ハイブリダイゼーションプローブ類は、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、³²Pまたは³⁵Sなどの放射性核種が、あるいはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼなど酵素標識が挙げられる。
【０２８０】
PMODをコードするポリヌクレオチドを用いて、PMODの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には胃腸障害、心血管障害、自己免疫／炎症疾患、上皮性疾患、細胞増殖異常、発生・発達障害、神経疾患、生殖障害が含まれ、胃腸障害には、嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動的うっ血、ヘパトーム、感染性結腸炎、潰瘍性結腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホウィップル病、マロリー‐ワイス症候群、大腸癌、大腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（AIDS）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、脂肪肝、血色素症、ウィルソン病、α₁アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞および血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性脂肪肝、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性過形成および腺腫、癌腫など肝癌を含む。心血管障害には、動静脈瘻、アテローム硬化、高血圧、脈管炎、レイノー病、動脈瘤、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎および静脈血栓、血管系腫瘍、血栓溶解の合併症、バルーン血管形成術、血管置換術（vascular replacement）、冠動脈バイパス移植術、鬱血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪部石灰化（mitral annular calcification）、僧帽弁逸脱、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心移植の合併症を含む。自己免疫／炎症疾患には、後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジソン病（慢性原発性副腎機能不全）、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、アテローム性粥腫崩壊、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、関節軟骨劣化、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症(systemic sclerosis)、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷を含む。上皮性疾患には、発汗異常性湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、毛孔性角化症、肝斑、白斑、光線性角化症、基底細胞癌、扁平細胞癌、脂漏性角化症、毛嚢炎、単純疱疹、帯状疱疹、水痘、カンジダ症、皮膚糸状菌症、疥癬、虫刺され、サクランボ色血管腫、ケロイド、皮膚線維腫、先端線維性軟疣、蕁麻疹、一過性棘融解性皮膚症、乾燥症、湿疹、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、手湿疹、貨幣状湿疹、慢性単純性苔癬、皮脂減少性湿疹、鬱血性皮膚炎および鬱血性潰瘍化、脂漏性皮膚炎、乾癬、扁平苔癬、薔薇色粃糠疹、膿痂疹、膿瘡、皮膚糸状菌症、癜風、疣、尋常性座瘡、赤鼻、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、腫瘍随伴性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、妊娠性疱疹、疱疹状皮膚炎、線状IgA病、後天性表皮水疱症、皮膚筋炎、紅斑性狼瘡、強皮症、限局性強皮症、紅皮症、脱毛症、修飾皮膚病変(figurate skin lesion)、毛細血管拡張、色素脱失、色素沈着過剰、小疱疹／水疱、発疹、皮膚薬物反応、丘疹結節皮膚損傷、慢性不治傷、光過敏症、単純型表皮水疱症、表皮剥離性角質増殖症、表皮溶解性掌蹠角皮症および非表皮溶解性掌蹠角皮症、ジーメンス水疱型魚鱗癬、剥脱性魚鱗癬、手掌角化症および足底角化症、掌蹠角化症、掌蹠角皮症、点状角化症、メースマン角膜ジストロフィ、先天性爪肥厚、白色海綿状母斑、多発性皮脂嚢腫症、上皮性母斑／表皮剥離性角質増殖症、連珠毛、裂毛症、慢性肝炎／特発性肝硬変、および、結腸直腸過形成を含む。細胞増殖異常には日光角化症、動脈硬化、アテローム硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌を含む。発生・発達障害には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、骨吸収、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス‐マジェニス症候群（Smith- Magenis syndrome）、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症や、シャルコーマリーツース病および神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症や、Syndenham舞踏病（Syndenham's chorea）および脳性小児麻痺などの発作障害、二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、加齢黄斑変性、感音難聴を含む。神経疾患には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病およびその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化および他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症および他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、およびGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病および代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳三叉神経血管症候群(encephalotrigeminal syndrome)、精神遅滞および他の中枢神経系発達障害(ダウン症を含む)、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経疾患、脊髄疾患、筋ジストロフィー他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神障害（気分性、不安性の障害、統合失調症／分裂病）、季節性感情障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性（corticobasal degeneration）、および家族性前頭側頭型痴呆を含む。生殖障害には不妊（例えば卵管疾患、排卵不良、子宮内膜症、プロラクチン産生障害、性周期途絶、月経周期途絶、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜腫瘍や卵巣腫瘍、子宮筋腫、自己免疫疾患、異所性妊娠、奇形発生、乳癌、乳房線維嚢胞病、乳漏症、精子形成の途絶、異常精子生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、ペーロニー病、インポテンス、男性乳癌、女性化乳房を含む。PMODをコードするポリヌクレオチドは、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、およびマルチフォーマットのELISA式アッセイ、および、変容したPMOD発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２８１】
或る特定の態様では、PMODをコードするヌクレオチド群を、関連する障害、特に上記した障害を検出するアッセイ類に用い得る。PMODをコードする配列に相補的なポリヌクレオチドを、標準的な方法で標識化し、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が対照サンプルに比較して著しく変化している場合は、そのサンプル内のPMODをコードするポリヌクレオチド群のレベル変化の存在により、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を評価するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２８２】
PMODの発現に関連する疾患の診断の基盤を提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーションあるいは増幅に好適な条件の下、動物あるいはヒトのいずれかの正常な被験者から抽出された体液あるいは細胞と、PMODをコードする配列あるいはその断片とを混合することにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量で用いて行った実験から得た値を正常な被験者から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２８３】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２８４】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物(過少発現または過剰発現)の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２８５】
PMODをコードする配列群から設計されたオリゴヌクレオチド群の、更なる診断への利用には、PCRの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、あるいはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはPMODをコードするポリヌクレオチドの断片、あるいはPMODをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェンシー条件下で、近縁のDNAあるいはRNA配列の検出、定量、あるいはその両方のため用いることが可能である。
【０２８６】
或る特定態様で、PMODをコードするポリヌクレオチド群に由来のオリゴヌクレオチドプライマー類を用い一塩基多型(SNP)を検出し得る。SNPは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入および欠失である。限定するものではないがSNPの検出方法には、SSCP(single-stranded conformation polymorphism)および蛍光SSCP(fSSCP)がある。SSCPでは、PMODをコードするポリヌクレオチド群に由来のオリゴヌクレオチドプライマー類とポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）を用いDNAを増幅する。このDNAは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液などに由来し得る。DNA内のSNPは、一本鎖形のPCR生成物の２次および３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。fSSCPでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってDNAシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー(amplimer)の検出が可能になる。更に、インシリコSNP(in silico SNP, isSNP)と呼ばれる配列データベース分析法は、共通のコンセンサス配列へアセンブリされるような個々のオーバーラップするDNA断片群の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、DNAの実験室での調製に、または統計モデルとDNA配列クロマトグラムの自動分析とを用いたシークエンシングのエラーに起因する配列変異を、フィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム(Sequenom, Inc., San Diego CA)を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０２８７】
SNPを利用して、ヒト疾患の遺伝的基礎を研究しうる。例えば少なくとも16種の一般的SNPが、インスリン非依存型糖尿病と関連している。SNPはまた、単一遺伝子病における疾病転帰における相違を試験するにも有用である。単一遺伝子病としては、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、または慢性肉芽腫症がある。例えばマンノース結合レクチンであるMBL2における変異体群は、嚢胞性線維症における有害な肺の転帰との相関が示されている。SNPはまた、薬理ゲノム学においても有用性を持つ。薬理ゲノム学は、患者の薬物への応答(例えば命を脅かす毒性)に影響する遺伝的変異体の同定を行う。例えばNアセチル転移酵素における或る変異は、抗結核薬であるイソニアジドに応答しての末梢ニューロパシーの高い発症率と関連する。一方、ALOX5遺伝子のコアプロモータにおける或る変異の結果、5-リポキシゲナーゼ経路を標的とする或る抗喘息薬での治療に対する臨床応答が低下する。異なる集団群におけるSNPの分布の分析は、遺伝的浮動、突然変異、遺伝子組換え、遺伝子選択の調査に有用であり、集団の起源とその移動との追跡にも有用である(Taylor, J.G. 他(2001) Trends Mol. Med. 7:507-512; Kwok, P.-Y. および Z. Gu (1999) Mol. Med. Today 5:538-543; Nowotny, P. 他(2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11:637-641)。
【０２８８】
PMODの発現を定量するために用い得る別の方法の例としては、ヌクレオチド群の放射標識またはビオチン標識、対照核酸の共増幅（coamplification）、および、標準曲線から得た結果の補間もある(例えばMelby, P.C.他(1993) J. Immunol. Methods 159:235-244; Duplaa, C.他 (1993) Anal. Biochem. 212:229-236を参照)。複数サンプルの定量速度を加速するには、目的のオリゴマーまたはポリヌクレオチドを種々の希釈液中に置き、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットでのアッセイを行い得る。
【０２８９】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチドに由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、或るマイクロアレイにおけるエレメント群として用いることができる。多数の遺伝子の相対発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異および多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬物の活性を開発およびモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロファイルを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロファイルに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２９０】
PMODやその断片群、PMODに特異的な抗体類を、別の実施態様では、或るマイクロアレイ上のエレメント群として用い得る。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬物−標的相互作用および遺伝子発現プロファイルをモニターまたは測定することが可能である。
【０２９１】
或る実施態様は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを作製する、本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプによる、遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数および相対存在量を定量することにより分析し得る(Seilhamer 他の米国特許第5,840,484号「Comparative Gene Transcript Analysis」を参照。該特許は特に引用することを以って本明細書の一部となす)。したがって、特定の組織または細胞タイプの転写物または逆転写物全体に、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを作製し得る。或る実施態様では、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体が１マイクロアレイ上に複数エレメントの１サブセットを持つような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロファイルを提供し得る。
【０２９２】
転写イメージは、組織、細胞株、生検またはその生体サンプルから単離した転写物を用いて作製し得る。転写イメージはしたがって、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、細胞株の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０２９３】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロファイルを作製する転写イメージはまた、in vitroモデル系および薬物の前臨床評価に、あるいは工業的または天然の環境化合物の毒性試験に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用および毒性のメカニズムを標示し、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャ(toxicant signatures)と称される、特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する(Nuwaysir, E.F. 他(1999) Mol. Carcinog. 24:153-159; Steiner, S.およびN.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113:467-471)。試験化合物が、既知毒性を有する化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子および遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合に、最も有用且つ正確である。理想的には、ゲノム全域にわたる発現の測定が、最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変容しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データをノーマライズすることに使用できるため、それらの遺伝子は重要である。ノーマライズ手順は、種々の化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。或る毒性シグネチャのエレメント群に遺伝子機能を割り当てることは毒性機序の解釈に役立つが、毒性の予測につながる、シグネチャ群の統計的マッチングには、遺伝子機能の知識は必要でない(例えば２０００年２月２９日に米国国立環境健康科学研究所(National Institute of Environmental Health Sciences)より発行されたPress Release 00-02を参照されたい。これについてはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である)。したがって、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは、重要且つ望ましい。
【０２９４】
或る実施態様では、核酸を有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより、この試験化合物の毒性を算定しうる。処理した生体サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ以上のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生体サンプル中の転写レベルを、未処理生体サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理済サンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を標示する。
【０２９５】
別の実施態様は、本発明で開示するポリペプチド群を用いた、或る組織または細胞タイプのプロテオームの分析に関する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更なる分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターンすなわちプロファイルは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数および相対存在量を定量することにより分析し得る。したがって、或る細胞のプロテオームのプロファイルは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離および分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により、分離が達成される(前出のSteiner および Anderson)。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生体サンプルからの、同等に位置したタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。或るスポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、目的のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０２９６】
プロテオームのプロファイルは、PMODに特異的な抗体類を用いてPMOD発現レベルを定量することによっても作成できる。或る実施態様では、マイクロアレイ上のエレメントとしてこれら抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することにより、タンパク質発現レベルを定量する(Lueking, A. 他(1999) Anal. Biochem. 270:103-111; Mendoze, L.G.他(1999) Biotechniques 27:778-788)。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物とサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２９７】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写物レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。いくつかの組織のいくつかのタンパク質については、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関が乏しいので(Anderson, N.L. および J. Seilhamer(1997)Electrophoresis 18:533-537)、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロファイルを改変するような化合物の分析において、プロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はmRNAの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロファイル作成はこのような場合により信頼し得、情報価値があり得る。
【０２９８】
別の実施例では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生体サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生体サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０２９９】
別の実施例では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生体サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生体サンプル中のタンパク質の量を、未処理生体サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。
【０３００】
マイクロアレイは、本技術分野で既知の方法で調製し、使用し、分析する(例えばBrennan, T.M. 他(1995)米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他(1995)PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他(1995)PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155、Heller, M.J. 他(1997)米国特許第5,605,662号を参照)。様々なタイプのマイクロアレイが周知であり、詳細は、DNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, 編集 (1999) Oxford University Press, Londonに記載がある。
【０３０１】
本発明の別の実施態様で、PMODをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製しうる。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、いくつかの例では、コード配列より非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子族のメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。配列は、或る特定の染色体に、または或る染色体の或る特定領域に、または人為形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、細菌P1産物、あるいは単一染色体cDNAライブラリ群に対してマッピングされる(例えばHarrington, J.J.他(1997)Nat. Genet. 15:345-355; Price, C.M.(1993)Blood Rev. 7:127-134; Trask, B.J.(1991)Trends Genet. 7:149-154を参照)。一度マッピングすると、核酸配列群を用いて、例えば或る病状の遺伝を特定染色体領域の遺伝とまたは制限酵素断片長多型(RFLP)と相関させるような遺伝子連鎖地図を開発し得る(例えば、Lander, E.S.およびD. Botstein(1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357を参照)。
【０３０２】
蛍光原位置ハイブリッド形成法(FISH)は、他の物理的および遺伝的地図データと相関し得る(例えばHeinz-Ulrich,他(1995) in Meyers, 前出、965-968ページを参照)。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man(OMIM)のウェブサイトに見られる。物理的染色体地図上の、PMODをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するDNAの領域の決定に役立ち得るため、ポジショナルクローニングの作業を促進し得る。
【０３０３】
確定した染色体マーカー類を用いた連鎖分析などの物理的マッピング技術、および染色体標本の原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳類の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、ポジショナルクローニングなどの遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探る研究者にとって価値がある。いったん疾患または症候群に関与する遺伝子(群)が、血管拡張性失調症の11q22-23領域など、特定のゲノム領域への遺伝的連鎖によって、大まかに位置決めがなされると、該領域にマップされる任意の配列は、更なる調査のための関連遺伝子あるいは調節遺伝子を提示している可能性がある(例えばGatti, R.A. 他(1988) Nature 336:577-580を参照)。転座、反転などに起因する、健常者、保有者、罹病者の三者間における染色体位置の相違を検出する場合にも、本発明のヌクレオチド配列を用い得る。
【０３０４】
本発明の別の実施態様では、PMOD、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬物スクリーニング技術における、化合物のライブラリのスクリーニングに用い得る。薬物スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することができる。PMODと、試験する薬物との結合による複合体の形成を測定し得る。
【０３０５】
別の薬物スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(例えばGeysen, 他(1984)PCT出願第WO84/03564号を参照)。この方法においては、多数の様々な低分子の試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、PMOD、或いはその断片と反応してから洗浄される。次に、結合したPMODを本技術分野で周知の方法で検出する。精製したPMODはまた、上記した薬剤スクリーニング技術に用いるプレート上に直接コーティングできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０３０６】
別の実施態様で、PMODと特異結合可能な中和抗体がPMODとの結合について試験化合物と競合する、競合的薬物スクリーニングアッセイを用いうる。この方法では、抗体を用いて、１つ以上の抗原決定基をPMODと共有するどのペプチドの存在をも検出できる。
【０３０７】
別の実施例では、PMODをコードするヌクレオチド配列を、将来に開発される分子生物学技術であり、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存する新技術に用い得る。
【０３０８】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。したがって、これ以下に記載する好適な特定実施態様は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０３０９】
上述および後述の全ての特許、特許出願および刊行物の開示は、米国特許出願第60/300,508号、第60/303,445号、第60/305,405号、第60/311,442号、第60/314,821号、第60/315,992号、および第60/378/205号を含め、言及することを以て特に本明細書の一部となす。
【実施例】
【０３１０】
１ cDNA ライブラリの作製
Incyte cDNA群の由来は、LIFESEQ GOLDデータベース (Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリ群である。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解し、他の組織はホモジナイズしてフェノールにまたは変性剤群の好適な混合液に溶解した。混合液の１例であるTRIZOL（Invitrogen）は、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの単相溶液である。結果として得た溶解物は、塩化セシウムのクッション液の上に重層して遠心分離するか、クロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、あるいは別の慣例的方法で、溶解物からRNAを沈殿させた。
【０３１１】
RNAの純度を高めるため、フェノールによるRNAの抽出および沈殿を、必要な回数繰り返した。場合によっては、DNアーゼでRNAを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd(T)連結常磁性粒子(Promega)、OLIGOTEXラテックス粒子(QIAGEN, Chatsworth CA)またはOLIGOTEX mRNA精製キット(QIAGEN)を用いて、ポリ(A)+RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キット(Ambion, Austin TX)を用いて、組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０３１２】
場合によってはStratagene社にRNAを提供し、同社が、対応するcDNAライブラリ群を作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム(Stratagene)またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム(Invitrogen)を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した(前出のAusubel, 1997, 5.1-6.6ユニットなどを参照)。逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素群でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ選択(300〜1000bp)は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィ(Amersham Biosciences)、あるいは分取用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。cDNAは好適なプラスミドのポリリンカーの、適合する制限酵素部位にライゲーションされた。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド(Stratagene)、PSPORT1プラスミド(Invitrogen)PCDNA2.1プラスミド(Invitrogen, Carlsbad CA)、PBK-CMVプラスミド(Stratagene)、PCR2−TOPOTAプラスミド(Invitrogen)、PCMV-ICISプラスミド(Stratagene)、pIGEN(Incyte Genomics, Palo Alto CA)、pRARE (Incyte Genomics)、またはplNCY(Incyte Genomics)、またはこれらの誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、あるいはInvitrogen社のDH5α、DH10BまたはElectroMAX DH10Bなど適格な大腸菌細胞に形質転換した。
【０３１３】
２ cDNA クローンの単離
実施例１のようにして得たプラスミドの、宿主細胞からの回収は、UNIZAPベクターシステム(Stratagene)を用いたin vivo切除によって、あるいは細胞溶解によって行った。プラスミドを精製する方法は、MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム(Promega)、AGTC Miniprep精製キット(Edge Biosystems, Gaithersburg MD)、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus PlasmidおよびQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットの中から少なくとも１つを用いた。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０３１４】
別法では、高処理フォーマットで直接結合PCR法を用い、宿主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した(Rao, V.B.(1994)Anal. Biochem. 216:1-14)。宿主細胞の溶解および熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを加工し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度をPICOGREEN色素(Molecular Probes, Eugene OR)およびFLUOROSKAN II蛍光スキャナ(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を用いて蛍光分析的に定量した。
【０３１５】
３シークエンシングおよび分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したIncyte cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法あるいは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー(Applied Biosystems)またはPTC-200 サーマルサイクラー(MJ Research)を、HYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific)またはMICROLAB 2200(Hamilton)液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Biosciences社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit(Applied Biosystems)の試薬を用いて準備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離と、標識したポリヌクレオチドの検出とには、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Amersham Biosciences)か、標準ABIプロトコルと塩基呼び出しソフトウェアとを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム(Applied Biosystems)か、あるいはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。cDNA配列内のリーディングフレームは、標準的方法(前出のAusubel, 1997, 7.7ユニットに概説)を用いて同定した。いくつかのcDNA配列を選択し、実施例８に開示する技術で配列を伸長させた。
【０３１６】
Incyte cDNAに由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカーおよびポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基をマスクすることによって有効性を確認した。その際、BLASTと、動的プログラミングと、隣接ジヌクレオチド頻度分析とに基づく、アルゴリズムとプログラムとを用いた。次に、Incyte cDNA配列またはそれらの翻訳の問い合わせを、以下のデータベース群に対して行った。すなわち、選抜した公共のデータベース群(例えばGenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM)と、ヒト、ラット、マウス、線虫(Caenorhabditis elegans)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)およびCandida albicansからの配列群を持つPROTEOMEデータベース群(Incyte Genomics, Palo Alto CA)、および、隠れマルコフモデル(HMM)ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、例えばPFAM、INCY、およびTIGRFAM (Haft, D.H. 他(2001) Nucleic Acids Res. 29:41-43); 並びにHMMベースのタンパク質ドメインデータベース例えばSMART (Schultz他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857-5864; Letunic, I. 他(2002) Nucleic Acids Res. 30:242-244)。（HMMは、遺伝子ファミリのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えばEddy, S.R. (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6:361-365等を参照）。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS、およびHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列をアセンブリし、完全長のポリヌクレオチド配列を産出した。あるいは、GenBank cDNA群、GenBank EST群、スティッチされた配列群、ストレッチされた配列群、またはGenscan予測コード配列群(実施例４および５を参照)を用い、Incyte cDNAのアセンブリ体を完全長まで伸長させた。PhredとPhrapとConsedとに基づくプログラムを用いてアセンブリし、GenMarkとBLASTとFASTAとに基づくプログラムを用いて、cDNAの構築物を、オープンリーディングフレームについてスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を引き出した。或いはポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、GenBankタンパク質データベース群(genpept)、SwissProt、PROTEOMEデータベース群、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOMおよびProsite等のデータベースや、PFAM、INCY、およびTIGRFAM等の隠れマルコフモデル(HMM)ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、並びにSMART等のHMMベースのタンパク質ドメインデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア(日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA)およびLASERGENEソフトウェア(DNASTAR)を用いて分析する。ポリヌクレオチドとポリペプチドとの配列アラインメントは、MEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム(DNASTAR)に組込まれたCLUSTALアルゴリズムが指定する、デフォルトパラメータを用いて作製する。これは、アラインメントした配列間の一致率も計算する。
【０３１７】
表７は、Incyte cDNAと完全長配列との分析とアセンブリとに利用したツールとプログラムとアルゴリズムとの概略と、適用可能な説明、参照文献、閾値パラメータを示す。用いたツール、プログラムおよびアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献は引用を以って全文を本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は、２つの配列が一致する強さを評価するために用いた、スコア、確率値などのパラメータを示す(スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の同一性が高い)。
【０３１８】
完全長ポリヌクレオチド配列群とポリペプチド配列群とのアセンブリと分析とに用いた上記プログラム群は、SEQ ID NO:29-56のポリヌクレオチド配列断片群の同定にも利用した。ハイブリダイゼーション技術と増幅技術とに有用な約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片群を、表４の列2に示した。
【０３１９】
４ゲノム DNA からのコード配列の同定および編集
推定上のタンパク質修飾および維持分子類の同定には、先ずGenscan遺伝子同定プログラムを、公共のゲノム配列データベース(例えば、gbpriやgbhtg)に対して実行した。Genscanは汎用遺伝子同定プログラムであり、様々な生物からのゲノムDNA配列を分析する(Burge, C. および S. Karlin(1997)J. Mol. Biol. 268:78-94、Burge, C. および S. Karlin(1998)Curr. Opin. Struct. Biol. 8:346-354参照)。このプログラムは予測されたエキソン群を連結し、メチオニンから終止コドンに及ぶ、アセンブリされたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、３０kbに設定した。これらのGenscan予測cDNA配列の内、どの配列がタンパク質修飾および維持分子をコードするかを判定するために、コードされるポリペプチドを、PFAMモデル群に対し、タンパク質修飾および維持分子について問合せて分析した。潜在的なタンパク質修飾および維持分子はまた、既にタンパク質修飾および維持分子としてアノテーションが付けられたIncyte cDNA配列に対する相同性を基に同定された。これら選択したGenscan予測配列を、次にBLAST分析により、公共データベースgenpeptおよびgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは省略されたエキソンなど、Genscanが予測した配列におけるエラーを補正した。BLAST分析はまた、Genscan予測配列の、いかなるIncyte cDNAまたは公共cDNAカバレッジ(coverage)の発見にも用いられ、したがって転写の証拠を提供した。Incyte cDNAカバレッジが利用できた場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を補正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載したアセンブリプロセスを用いて、Incyte cDNA配列および／または公共cDNA配列でGenscan予測コード配列をアセンブリして得た。あるいは、完全長ポリヌクレオチド配列は、編集後または非編集のGenscan予測コード配列に、完全に由来する。
【０３２０】
５ゲノム配列データの cDNA 配列データとのアセンブリ
スティッチ配列 (Stitched Sequence)
部分cDNA配列群を伸長させるため、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムが予測したエキソン群を用いた。実施例３に記載したようにアセンブリした部分cDNA群を、ゲノムDNAにマッピングし、また、関連するcDNA群と、１つ以上のゲノム配列からGenscan予測されたエキソン群とを有するクラスター群に分解した。cDNAとゲノムとの情報を統合すべく、グラフ理論および動的プログラミングに基づく或るアルゴリズムを用いて各クラスターを分析し、潜在的スプライス変異体群を生成した。配列群を続いて確認、編集または伸長し、完全長配列を創出した。区間の全長が、２つ以上の配列に在るような配列区間群をクラスター内で同定し、そのように同定された区間群は、推移性により、等しいと考えた。例えば、或る区間が、１つのcDNAと２つのゲノム配列とに在る場合、３つの区間は全て等しいと考えた。このプロセスにより、無関係だが連続したゲノム配列群を、cDNA配列で結び合わせて架橋し得る。このようにして同定した区間を、それらの親配列(parent sequences)に沿って現われる順にスティッチアルゴリズムで「縫い合わせ」、可能な限り最長の配列と配列変異体群とを生成した。１種類の親配列に沿って続く区間間の連鎖(cDNA−cDNAまたはゲノム配列−ゲノム配列)は、親の種類を変える連鎖(cDNA−ゲノム配列)より優先した。結果として得たスティッチ配列群を翻訳し、BLAST分析で公共データベースgenpeptおよびgbpriと比較した。Genscanが予測した不正確なエキソン群は、genpeptからのトップBLASTヒットとの比較により補正した。必要な場合、追加cDNA配列群を用いるかゲノムDNAの検査により、配列群を更に伸長させた。
【０３２１】
ストレッチ配列 (Stretched Sequence)
部分DNA配列群を、BLAST分析に基づく１アルゴリズムにより完全長まで伸長した。先ず、BLASTプログラムを用いて、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物および真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたようにアセンブリされた部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体を、BLAST分析により、Incyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対(HSP)を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGenBankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に対し、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を、相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを判定した。
【０３２２】
６ PMOD をコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:29-56をアセンブリするために用いた配列群を、BLAST他のSmith-Watermanアルゴリズムの実装群を用いて、Incyte LIFESEQデータベースおよび公共ドメインデータベース群の配列と比較した。SEQ ID NO:29-56と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどのアセンブリアルゴリズム(表７)を使用して、連続しオーバーラップする配列のクラスター群にアセンブリした。スタンフォード・ヒトゲノムセンター(SHGC)、ホワイトヘッド・ゲノム研究所(WIGR)、Genethonなどの公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッドおよび遺伝地図データを用いて、いずれかのクラスター化された配列が既にマッピングされているかを判定した。マッピングされた配列が或るクラスターに含まれている場合、そのクラスターの全配列が、個々の配列番号と共に、地図上の位置に割り当てられた。
【０３２３】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または区間として表される。或る区間の地図上の位置(センチモルガン単位)は、染色体の短腕（p-arm）の末端に対して測定する(センチモルガン(cM)は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒトDNAの１メガベース(Mb)にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポットおよびコールドスポットに起因して広範囲に変化する)。cM距離は、各クラスタ内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するGenethonによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。NCBI「GeneMap'99」(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/)など一般個人が入手可能なヒトゲノム地図などの資源を用いて、既に同定された疾患遺伝子類が、上記の区間内若しくは近傍にマップされているかを判定できる。
【０３２４】
７ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在の検出に用いる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合している膜への、標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与する(例えば前出のSambrook, 7章、同Ausubel (1995) 4章および16章を参照)。
【０３２５】
類似の、BLASTを応用したコンピュータ技術を用いて、GenBankやLIFESEQ(Incyte Genomics)などのcDNAデータベースにおいて、同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、いくつかの膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、任意の特定の一致を厳密なあるいは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を修正することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０３２６】
【数１】

【０３２７】
積スコアは、２つの配列間の類似度と、配列が一致する長さとの両方を考慮している。積スコアは0〜100のノーマライズされた値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。BLASTスコアを計算するには、或る高スコアリングセグメント対(HSP)内の一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基に−４を割り当てる。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得る(ギャップにより隔離される)。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０３２８】
或いは、PMODをコードするポリヌクレオチドを、由来する組織源について分析する。例えば幾つかの完全長配列は、少なくとも一部は、オーバーラップするIncyte cDNA配列群を用いてアセンブリされる(実施例３を参照)。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリの１つへ分類される。すなわち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路である。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／条件カテゴリー、すなわち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、PMODをコードするcDNAの疾患特異的な発現を反映する。cDNA配列群およびcDNAライブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLDデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）から得ることができる。
【０３２９】
８ PMOD をコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長ポリヌクレオチドを、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマー群を用いて該断片を伸長させ産生する。或るプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、別のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマー群の設計にはOLIGO 4.06ソフトウェア(National Biosciences)或いは別の適切なプログラムを用い、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上となり、約６８〜約７２℃の温度で標的配列にアニーリングするようにした。ヘアピン構造およびプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチド群の伸長は、全て回避した。
【０３３０】
選択したヒトcDNAライブラリ群を用い、配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０３３１】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したPCR法によって得られた。PCRは、PTC-200 サーマルサイクラー(MJ Research, Inc.)を用いて９６穴プレート内で行った。反応混液は、鋳型DNAを有し、また、200 nmolの各プライマーを有する。また、Mg^２ ⁺と(NH₄)₂SO₄と２−メルカプトエタノールとを含有する反応バッファーと、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Biosciences)と、ELONGASE酵素(Invitrogen)と、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)とを含有する。プライマー対であるPCI AとPCI Bとに対し、以下のパラメータで増幅した。ステップ1：94℃で3分間。ステップ2：94℃で15秒間。ステップ3：57℃で1分間。ステップ4：68℃で2分間。ステップ5：ステップ2、3および4を20回繰り返す。ステップ6：68℃で5分間。ステップ7：4℃で保存。
【０３３２】
各ウェルのDNA濃度は、１×TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Corning Costar, Acton MA)の各ウェルに分配してDNAが試薬と結合できるようにして測定した。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量すべく、プレートをFluoroskan II(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)でスキャンした。反応混合物のアリコット５〜１０μlを１％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
【０３３３】
伸長したヌクレオチドは、脱塩および濃縮して３８４穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madison WI)を用いて消化し、音波処理またはせん断し、pUC 18ベクター(Amersham Biosciences)への再連結を行った。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度(０.６〜０.８％)のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE(Promega)で消化した。伸長させたクローンをＴ４リガーゼ(New England Biolabs, Beverly MA)を用いてpUC 18ベクター(Amersham Biosciences)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で処理して制限部位のオーバーハングを満たし、適格な大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞群の選択を、抗生物質を含む培地で行い、それぞれのコロニーを採取し、LB/2Xカルベニシリン培養液中の384ウェルプレート群に３７℃で一晩培養した。
【０３３４】
細胞を溶解し、Taq DNAポリメラーゼ（Amersham Biosciences）およびPfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）を用いて以下のパラメータでDNAをPCR増幅した。ステップ1：94℃で3分間。ステップ2：94℃で15秒間。ステップ3：60℃で1分間。ステップ4：72℃で2分間。ステップ5：ステップ2、3および4を29回繰り返す。ステップ6：72℃で5分間。ステップ7：4℃で保存。DNAの定量化には、上記したようにPICOGREEN試薬（Molecular Probes）を用いた。DNAの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド(１：２,v/v)で希釈し、DYENAMICエネルギー移動シークエンシングプライマー、およびDYENAMIC DIRECT kit(Amersham Biosciences)またはABI PRISM BIGDYEターミネーターサイクルシークエンシングレディ反応キット(Terminator cycle sequencing ready reaction kit)(Applied Biosystems)を用いてシークエンシングした。
【０３３５】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチドを検証した。あるいは、完全長ポリヌクレオチドを用い、上記手順で、そのような伸長のために設計したオリゴヌクレオチド類と、或る適切なゲノムライブラリとを用いて５'調節配列を得た。
【０３３６】
９ PMOD をコードするポリヌクレオチドにおける１塩基多型の同定
１塩基多型(SNP)として知られる一般的なDNA配列変異体が、SEQ ID NO:29-56において、LIFESEQデータベース(Incyte Genomics)を用いて同定された。同じ遺伝子からの配列群は共にクラスター化され、実施例３に述べたようにアセンブリされて、その遺伝子における全ての配列変異体の同定を可能にした。一連のフィルタ群を有する或るアルゴリズムを用いて、SNPを他の配列変異体から区別した。前段フィルタ群(preliminary filters)が過半の塩基呼び出し(basecall)エラーの除去を、最少Phred質スコア15を要求することによって行い、また、配列アラインメントエラーと、ベクター配列、キメラ、およびスプライス変異体の不適切なトリミングの結果であるエラーとをも除去した。先進の染色体分析の自動化された手順によって、推定上のSNPの近傍にある、オリジナルのクロマトグラムファイル群を分析した。クローンエラーフィルタ群は、統計的に発生させたアルゴリズムを用いて、実験室でのプロセス中に生じたエラーを同定した。エラーとしては、逆転写酵素、ポリメラーゼ、または常染色体突然変異によって起きたエラーがある。クラスター化エラーフィルタ群は、統計的に発生させたアルゴリズムを用いて、近縁の相同体群または偽遺伝子群のクラスター化の結果であるエラーや、非ヒト配列による汚染が原因のエラーを同定した。最終セットのフィルタ群は、免疫グロブリンまたはT細胞受容体において見られる重複(duplicates)とSNPとを除去した。
【０３３７】
幾つかのSNPは、更なる特徴付けの為に選択された。選択は高処理MASSARRAYシステム(Sequenom, Inc.)を用いた質量分析によって行い、４群の異なるヒト集団におけるSNP部位での対立遺伝子頻度を分析した。白人集団は92個体(46名の男子、46名の女子)からなり、83名はユタ出身、4名はフランス人、3名はベネズエラ人、2名はアーミッシュの人々である。アフリカ集団は194個体(97名の男子、97名の女子)からなり、全員がアフリカ系アメリカ人である。ヒスパニック集団は324個体(162名の男子、162名の女子)からなり、全員がメキシコのヒスパニックである。アジア集団は126個体(64名の男子、62名の女子)からなり、報告された親の内訳は43％が中国人、31％が日本人、13％がコリアン、5％がベトナム人、8％が他のアジア人である。対立遺伝子頻度の分析は先ず白人集団においてなされ、幾つかの場合、SNPの内、対立遺伝子変異をこの集団において示さなかったSNPは、更に他の３集団においてテストされることは無かった。
【０３３８】
１０個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化および使用
SEQ ID NO:29-56由来のハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェア(National Biosciences)等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０pmolと、[γ-³²P]アデノシン３リン酸(Amersham Biosciences)２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN, Boston MA)とを化合させることにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストランビーズカラム(Amersham Biosciences)を用いて実質的に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba IまたはPvu II(DuPont NEN)のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの、典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０⁷カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０３３９】
各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜(Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH)に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。非特異的シグナル群を除去するため、最大で例えば０.１×クエン酸ナトリウム食塩水および０.５％ドデシル硫酸ナトリウムの条件下で、ブロット群を室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３４０】
１１マイクロアレイ
或るマイクロアレイ上でのアレイエレメント群の連接または合成は、フォトリソグラフィ、ピエゾ式印刷(インクジェット印刷、前出のBaldeschweilerなどを参照)、機械的マイクロスポッティング技術およびこれらから派生した技術を用いて達成し得る。上記各技術において基板は、均一な、無孔の表面を持つ固体とすべきである(Schena(1999)前出)。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップおよびシリコンウェハがある。あるいは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似した手順を利用し、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置および結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る(例えばSchena, M. 他(1995) Science 270:467-470; Shalon, D.他(1996) Genome Res.6:639-645; Marshall, A. および J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31を参照)。
【０３４１】
完全長cDNA、発現配列タグ(EST)、またはそれらの断片またはオリゴマーが、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア(DNASTAR)など本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメント群を、生体サンプル中のポリヌクレオチド群とハイブリダイズする。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識などの分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、生体サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザー脱離および質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。一実施態様におけるマイクロアレイの調製および使用について、以下に詳述する。
【０３４２】
組織または細胞サンプルの調製
全RNAを組織サンプル群から単離するためグアニジニウムチオシアネート法を用い、ポリ(A)⁺RNAを精製するためオリゴ(dT)セルロース法を用いる。各ポリ(A)⁺RNAサンプルを逆転写するため、MMLV逆転写酵素を用い、また、0.05pg/μlのオリゴ(dT)プライマー(21mer)、１×第一鎖バッファー、0.03unit/μlのRNアーゼ阻害因子、500μMのdATP、500μMのdGTP、500μMのdTTP、40μMのdCTP、40μMのdCTP-Cy3(BDS)またはdCTP-Cy5(Amersham Biosciences)を用いる。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット(Incyte)を用い、２００ｎｇのポリ(A)⁺RNAを含有する体積２５ｍｌで行う。特異的対照ポリ(A)⁺RNA群は、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。３７℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル(１つはＣｙ3、もう１つはＣｙ5標識)は、２.５mlの０.５M水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプル群の精製には、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いる。混合後、２つの反応サンプルのエタノール沈殿を、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、６０mlの酢酸ナトリウム、および３００mlの１００％エタノールで行う。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて完全に乾燥させ、１４μlの５×SSC／０.２％SDS中で再懸濁する。
【０３４３】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化したcDNAインサート群と、ベクター群とを含有する細菌細胞群から増幅する。PCR増幅は、cDNAインサートに隣接するベクター配列群に相補的なプライマー類を用いる。３０サイクルのPCRによって、１〜２ngの初期量から５μgを超える最終量まで、アレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、SEPHACRYL-400(Amersham Biosciences)を用いて精製する。
【０３４４】
精製済アレイエレメントは、ポリマー被覆スライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス(Corning)は、0.1％のSDSおよびアセトン中で超音波洗浄し、処理の間および処理後に充分に蒸留水で洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸(VWR Scientific Products Corporation(VWR), West Chester PA)中でエッチングし、充分に蒸留水中で洗浄し、95％エタノール中で0.05％アミノプロピルシラン(Sigma)を用いてコーティングする。コーティングしたスライドは、110℃のオーブンで硬化させる。
【０３４５】
米国特許第5,807,522号に記載されている手順を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメント群を付加する。この特許は、引用を以って本明細書の一部とする。平均濃度１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを、高速ロボット装置（robotic apparatus）により、開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルを置く。
【０３４６】
マイクロアレイをUV架橋するため、STRATALINKER UV架橋剤(Stratagene)を用いる。マイクロアレイの洗浄を、室温において、０.２％ＳＤＳで１回、蒸留水で３回行う。非特異結合部位をブロックするため、マイクロアレイのインキュベートをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Tropix, Inc., Bedford MA)中の０.２％カゼイン中において６０℃で３０分間行った後、前に行ったように０.２％SDSおよび蒸留水で洗浄する。
【０３４７】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応に用いる９μlのサンプル混合体には、Cy3またはCy5で標識したcDNA合成産物群の各０.２μgを、５×SSC,０.２％SDSハイブリダイゼーション緩衝液中に含む。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上へ等分して１.８cm²のカバーガラスで覆う。アレイを、顕微鏡用スライドよりわずかに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバー内を湿度100％に保つため、１４０μlの５×SSCをチェンバーの１コーナーに加える。アレイを入れたチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中(１×SSC,０.１％SDS)において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中(０.１×SSC)において４５℃で１０分間ずつ３回洗浄し、乾燥させる。
【０３４８】
検出
レポーター標識したハイブリダイゼーション複合体を検出するには、Ｃｙ3の励起のために４８８nm、Ｃｙ5の励起のために６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova70混合ガス10Ｗレーザー(Coherent, Inc., Santa Clara CA)を備えた顕微鏡を用いる。励起レーザー光の焦点をアレイ上に置くため、２０×顕微鏡対物レンズ(Nikon, Inc., Melville NY)を用いる。アレイを含むスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる１.８cm×１.８cmのアレイは、解像度２０μmでスキャンする。
【０３４９】
異なる２回のスキャンで、混合ガスマルチラインレーザーは2つのフルオロフォアを連続的に励起する。発光は、波長に基づき分離され、2つのフルオロフォアに対応する２つの光電子増倍管検出器(PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ)に送られる。好適なフィルタ群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルタする。用いるフルオロフォアの最大発光の波長は、Cy3では５６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方のフルオロフォアからのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザー源において好適なフィルタを用いて、フルオロフォア１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３５０】
通常、各スキャンの感度を較正するため、cDNA対照種を或る既知濃度でサンプル混合体に添加し、対照種が生じるシグナル強度を用いる。アレイ上の或る特定の位置には或る相補的DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイゼーション種の重量比1：100,000で相関させる。異なる源泉(例えば代表的な試験細胞および対照細胞など)からの２つのサンプルを、各々異なるフルオロフォアで標識し、異なる発現をする遺伝子群を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、較正するcDNAのサンプルを２種のフルオロフォアで標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０３５１】
光電子増倍管の出力をディジタル化するため、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールした12ビットRTI-835Hアナログディジタル(A/D)変換ボード(Analog Devices, Inc., Norwood MA)を用いる。ディジタル化したデータは、青色(低シグナル)から赤色(高シグナル)までの擬似カラースケールへのリニア20色変換を用いて、シグナル強度がマッピングされたイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なるフルオロフォアを同時に励起および測定する場合には、各フルオロフォアの発光スペクトルを用いて、データは先ずフルオロフォア間の光学的クロストーク(発光スペクトルの重なりに起因する)を補正される。
【０３５２】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム(Incyte)である。少なくとも約２倍の発現変化、2.5以上のSB比、および少なくとも40％のエレメントスポットサイズを示したアレイエレメントが、差次的発現を示したとしてGEMTOOLSプログラム(Incyte Genomics)で同定された。
【０３５３】
発現
ヒトC3A細胞株は、成長での、強力な接触阻害に関して選択されたHepG2/C3（肝臓腫瘍の15才男子から単離した肝臓癌細胞株）のクローン誘導体である。クローン集団の使用は、細胞の再現性を強化する。C3A細胞は、培養中の主要なヒト肝細胞の多くの特徴を有する。I)インシュリン受容体とインシュリン様成長因子II受容体の発現、ii)αフェトプロテインと比較した血清アルブミンの高率分泌、iii)アンモニアの尿素とグルタミンへの転換、iv)芳香アミノ酸代謝、v)グルコースの無いまたインシュリンの無い培地での増殖、である。C3A細胞株は、成熟したヒト肝臓のin vitroモデルとして今や十分に確立されている(Mickelson 他(1995) Hepatology 22:866-875; Nagendra 他(1997) Am. J. Physiol. 272:G408-G416)。SEQ ID NO:29の発現は、種々のステロイド例えばプレドニゾン、デキサメタゾン、メドロキシプロゲステロン、ブデソニド、およびベクロメタゾンで処理した細胞で2倍以上、変容した。またSEQ ID NO:29の発現は、C3A細胞内で2倍以上、変容した。したがってSEQ ID NO:29を、細胞増殖障害の治療に関するアッセイに用い得る。
【０３５４】
例えばSEQ ID NO:31とSEQ ID NO:34はマイクロアレイ分析の判定で、正常乳房上皮細胞に対し乳房腫瘍細胞株内で差次的発現を示した。SEQ ID NO:31とSEQ ID NO:34の発現は、腫瘍進行と悪性転換の早期と後期の両方で提供者から採取した乳房腫瘍細胞株で少なくとも2倍減少した。よって、SEQ ID NO:31とSEQ ID NO:34は、乳癌の診断アッセイに用い得る。
【０３５５】
別の例でSEQ ID NO:33の差次的発現は、既知の代謝応答と毒性応答とを生じる数種の化合物に応答して示された。ヒトC3A肝臓細胞株のインキュベートを種々の時間長で、化合物たとえばfenofibrate、クロフィブラート、デキサメタゾン、ベクロメタゾン、メドロキシプロゲステロン、ブデソニド、およびベタメタゾンと共に行い、SEQ ID NO:33の発現が少なくとも2倍減少した。したがってSEQ ID NO:33は、毒性試験に用い得る。
【０３５６】
SEQ ID NO:35の差次的発現は、ヒトの末梢血単核細胞(PBMC)を5および25μMプレドニゾンに24時間、曝露して示された。プレドニゾンはコルチコステロイドであり、肝臓で代謝されて活性型であるプレドニゾロンになる。プレドニゾンはグルココルチコイドとしてヒドロコルチゾンの約4倍、強力である。グルココルチコイドは天然ホルモンであり、薬理量で投与すると、炎症および免疫応答を防止または抑制する。分子レベルでは、非結合グルココルチコイドは容易に細胞膜を越え、特異的細胞質レセプターに高親和性の結合をする。結合後、転写に影響し、最終的に、タンパク合成に影響する。この結果には、炎症部位の白血球浸潤阻害、炎症応答メディエータ機能妨害、および液性免疫応答抑制を含みうる。PBMCは、免疫系の主要な細胞成分を代表する分散した細胞集団に分類できる。PBMCは約５２％のリンパ球（１２％がBリンパ球、４０％がTリンパ球｛２５％がCD4+で１５％がCD8+｝）、２０％のNK細胞、２５％の単球および３％の様々な細胞(樹状細胞および前駆細胞など)からなる。これらの細胞は、6名の健康な志願ドナーの血中からプールした。SEQ ID NO:35の発現は、無処理対照に比べてプレドニゾン処理(5および25μM)細胞で少なくとも２倍減少していた。
【０３５７】
SEQ ID NO:44の差次的発現は正常な組織と前立腺癌に冒された組織とのマイクロアレイ分析で示された。SEQ ID NO:44の、健常ドナーから単離した初代前立腺上皮細胞株(PrEC)内での発現を、SEQ ID NO:44のLNCaP内での発現と比較した。LNCaPは転移性前立腺癌の50才男性のリンパ節生検から単離した前立腺癌細胞株である。SEQ ID NO:44の発現は、前立腺癌に冒された細胞株内で少なくとも2倍減少した。またSEQ ID NO:44の発現は、健康なドナー群のプールから単離した末梢血単核細胞内では1 ng/mlのIL12で24時間処理すると少なくとも2倍低下した。SEQ ID NO:44の発現はまた、乳房細胞と比較して差次的発現であることがマイクロアレイ分析で示された。7中4の試験した乳癌細胞株でSEQ ID NO:44の少なくとも2倍の発現低下が正常な乳腺上皮細胞(HMEC)と比較して見られ、SEQ ID NO:44の、プロテアーゼ関連疾患たとえば前立腺癌および乳癌の病期分類用診断マーカーとして、また治療標的としての利用を示唆する。
【０３５８】
例えばSEQ ID NO:51はマイクロアレイ分析による判定で、毒性研究において差次的発現を示した。SEQ ID NO:51の発現は、未処理のC3A 細胞に対して、様々な薬剤（ステロイド、ステロイドホルモン等）で処理したヒトC3A肝臓細胞株で少なくとも2倍減少した。ヒトC3A細胞株は、成長での、強力な接触阻害に関して選択されたHepG2/C3（肝臓腫瘍の15才男子から単離した肝臓癌細胞株）のクローン誘導体である。C3A細胞株は、成熟したヒト肝臓のin vitroモデルとして十分に確立される(Mickelson 他 (1995) Hepatology 22:866-875、Nagendra 他 (1997) Am J Physiol 272:G408-G416)。(1995) Hepatology 22:866-875; Nagendra 他(1997) Am J Physiol 272:G408-G416)。肝臓代謝への影響は、薬剤の薬力学を理解するために重要である。よって、SEQ ID NO:51は、薬剤の薬力学を理解するために用い得る。
【０３５９】
別の例でSEQ ID NO:55は差次的発現を肺腺癌と正常な肺組織とで示し、これはマイクロアレイ分析で判定した。SEQ ID NO:55の発現は、肺腺癌において、同じドナーの肉眼的に無併発の正常肺組織と比べて少なくとも2分の1に減少した。したがってSEQ ID NO:55を、肺癌の病期分類用診断マーカーとして、または潜在的治療標的として用い得る。
【０３６０】
別の例でSEQ ID NO:56は非悪性乳腺上皮細胞に比較して乳癌細胞株において下方制御され、これはマイクロアレイ分析で判定した。1つの実験で、非悪性乳腺上皮細胞の遺伝子発現プロファイルが、腫瘍進行の様々な段階の乳癌株群の遺伝子発現プロファイルと比較された。細胞はRNA収集前に無血清H14限定培地で70%-80%のコンフルエンスにまで増殖した。比較した細胞株は次のとおりである。a) HMEC、初代乳房上皮細胞株で正常なドナーから単離。b)MCF-10A、乳腺細胞株で36才の乳腺症疾患の女性から単離。c)MCF7、非悪性乳腺癌細胞株で69才女性の胸水から単離。d)T-47D、乳癌細胞株で54才の浸潤性乳管癌の女性から得た胸水から単離。e)Sk-BR-3、乳腺癌細胞株で43才の女性の悪性胸水から単離。f)BT-20、乳癌細胞株で74才の女性から単離した腫瘍塊の薄切片からin vitroで遊出した細胞に由来。g)MDA-mb-231、乳房腫瘍細胞株で51才の女性の胸水から単離。h)MDA-mb-435S、紡錘状の細胞株で、それが導かれた元の親株(435)はR. Cailleauが31才の転移性乳管腺癌の女性の胸水から単離、以上の株である。したがってSEQ ID NO:56を、乳癌の治療モニタリングと診断アッセイとに用い得る。
【０３６１】
別の例でSEQ ID NO:56は初代前立腺上皮細胞に比較して前立腺癌において下方制御され、これはマイクロアレイ分析で判定した。初代前立腺上皮細胞を、腫瘍進行の様々な段階を示す前立腺癌と比較した。比較した細胞株は次のとおりである。a) PrEC、正常なドナーから単離した初代前立腺上皮細胞株。b) DU-145、広範囲な転移性前立腺癌の69才男性の脳内転移部位から単離した前立腺癌細胞株。c) LNCaP、50才の転移性前立腺癌の男性のリンパ節生検から単離した前立腺癌細胞株。d)PC-3、骨に転移したグレード4の前立腺癌を患う62才男性の骨内転移部位から単離した前立腺癌細胞株である。1つの実験で、細胞は基礎培地中、成長因子とホルモンとの不在下で成長させた。第2の実験で、細胞を、最適な成長条件下、成長因子と栄養素との存在下で成長させた。拘束性条件下で成長した細胞を、拘束性条件下で成長した正常なPrECと比較した。このようにSEQ ID NO:56を、前立腺癌の治療モニタリングと診断アッセイとに用い得る。
【０３６２】
１２相補的ポリヌクレオチド
PMODをコードする配列あるいはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然PMODの発現を検出、低減または阻害するために用いられる。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或いは大きな配列断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。適切なオリゴヌクレオチド群を設計するため、Oligo 4.06ソフトウェア(National Biosciences)および、PMODのコーディング配列を用いる。転写を阻害するには、最も独特な５'配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いて、プロモーターがコーディング配列に結合するのを防ぐ。翻訳を阻害するには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがPMODをコードする転写物に結合するのを防ぐ。
【０３６３】
１３ PMOD の発現
PMODの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて成される。細菌内でPMODを発現させるには、抗生物質耐性遺伝子と、cDNA転写レベルを高める誘導性プロモーターとを有する適切なベクターにcDNAをサブクローニングする。こうしたプロモーターとしては、lacオペレーター調節エレメントと併用するT5またはT7バクテリオファージプロモーター、およびtrp-lac（tac）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21(DE3)などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性細菌は、イソプロピルβ-Dチオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導されるとPMODを発現する。真核細胞でのPMODの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株をバキュロウイルスとして一般に知られているAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の組換え型に感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換え、或いはトランスファープラスミドの媒介を伴う細菌媒介遺伝子転移のどちらかによって、PMODをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモーターによって高レベルのcDNA転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合は夜蛾の１種Spodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞への感染に用いるが、ヒト肝細胞への感染に用いることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスへの更なる遺伝子修飾が必要になる(Engelhard, E.K.他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; Sandig, V.他(1996) Hum.Gene Ther. 7:1937-1945を参照)。
殆どの発現系では、PMODが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)と、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識と合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製を迅速に１回で行うことができる。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性および抗原性を維持する条件下で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする(Amersham Biosciences)。精製後、GST部分を、特異的に操作した部位においてPMODからタンパク分解的に切断できる。FLAGは8アミノ酸のペプチドであり、市販のモノクローナルおよびポリクローナル抗FLAG抗体（Eastman Kodak）を用いた免疫親和性精製を可能にする。連続した6ヒスチジン残基のストレッチである6-Hisは、金属キレート樹脂上での精製を可能にする（QIAGEN）。タンパク質の発現および精製の方法は、前出Ausubel(1995)10章、16章に記載されている。これらの方法で精製したPMODを直接用いて実施例 17 、 18 および 19の、適用可能なアッセイを行える。
【０３６４】
１４機能的アッセイ
PMOD機能は、哺乳動物細胞培養系において生理的に高められたレベルでの、PMODをコードする配列を発現させて評価する。cDNAを、cDNAを高レベル発現する強いプロモーターを持つ哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。選択されるベクターとしては、PCMV SPORTプラスミド(Invitrogen, Carlsbad CA)およびPCR 3.1プラスミド(Invitrogen)があり、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを持つ。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮細胞株または造血細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を持つ1〜2μgのプラスミドを同時形質移入する。標識タンパク質の発現は、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段を提供する。また標識タンパク質の発現によって、組換えベクターからのcDNA発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP;Clontech)、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入細胞を同定し、それら細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するかあるいは同時に生じる現象を診断する蛍光分子の取込を検出して数量化する。このような現象として挙げられるのは、ヨウ化プロピジウムによるDNA染色によって計測される核DNA含量の変化、前方散乱光と90°側方散乱光によって計測される細胞サイズと顆粒性の変化、ブロモデオキシウリジン取込の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面および細胞内タンパク質の発現の変容、および、フルオレセイン抱合したアネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変容がある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M.G. (1994) Flow Cytometry, Oxford, New York NYに記述がある。
【０３６５】
遺伝子発現におけるPMODの影響は、PMODをコードする配列と、CD64またはCD64-GFPのどちらかとが形質移入された、高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64-GFPは、形質移入された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存された複数の領域に結合する。形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビーズを用いて効率的に分離できる(DYNAL. Lake Success. NY)。mRNAは、当業者に周知の方法で細胞から精製できる。PMOD及び目的の他の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析できる。
【０３６６】
１５ PMOD 特異抗体の産生
実質的に精製されたPMODをポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE；例えばHarrington, M.G. (1990) Methods Enzymol.182:488-495を参照)または他の精製技術で行い、これを用いて標準的なプロトコルで動物(例えばウサギ、マウスなど)を免疫化して抗体を作り出す。
【０３６７】
別法では、PMODアミノ酸配列をLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて当業者に既知の方法で抗体を産生する。Ｃ末端付近の或いは親水性領域内のエピトープなど適切なエピトープの選択法は、当分野に記載が多い(例えば前出Ausubel, 1995,11章を参照)。
【０３６８】
通常は、長さ約15残基のオリゴペプチドを、FMOCケミストリを用いるABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応でKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（例えば前出Ausubel, 1995を参照）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性および抗PMOD活性を検査するため、例えばペプチドまたはPMODを或る基板に結合し、1％BSAでブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、更に、放射性ヨウ素標識したヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０３６９】
１６特異抗体を用いる天然 PMOD の精製
天然または組換えのPMODを、PMOD特異抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーで実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化したSEPHAROSE(Amersham Biosciences)など活性化クロマトグラフィー用レジンと抗PMOD抗体とを共有結合させて構成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０３７０】
PMODを有する培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、PMODを優先的に吸着できる条件で(例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで)そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とPMODとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸イオンのようなカオトロープで）溶出させ、PMODを収集する。
【０３７１】
１７ PMOD と相互作用する分子の同定
PMODまたはその生物活性断片を、¹²⁵Iボルトンハンター試薬で標識する（例えば Bolton, A.E.およびW.M. Hunter（1973）Biochem. J. 133:529-539を参照）。マルチウェルプレートの各ウェルに予め配列しておいた候補の分子群を、標識したPMODと共にインキュベートし、洗浄して、標識されたPMOD複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なPMOD濃度で得たデータを用いて、候補分子と結合したPMODの数および親和性、会合についての値を計算する。
【０３７２】
別法では、PMODと相互作用する分子を、Fields, S.および O. Song(1989, Nature 340:245-246)に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（yeast two-hybrid system）を、または、MATCHMAKERシステム(Clontech)など２−ハイブリッドシステムに基づく市販キットを用いて分析する。
【０３７３】
PMODはまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２大ライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定し得る（Nandabalan, K. 他(2000) 米国特許第6,057,101号}。
【０３７４】
１７ PMOD 活性の実証
PMOD活性は一般的免疫ブロット法を用いて、または種々の特異的活性アッセイを通じて実証でき、それらのいくつかを以下に概説する。一般的アプローチとして、PMODコード配列を持つベクターで形質転換した細胞株または組織は、免疫ブロットでPMOD活性をアッセイできる。形質転換された細胞はβ-メルカプトエタノールの存在下、SDS中で変性され、核酸はエタノール沈澱によって除去され、タンパク質はアセトン沈澱によって精製される。ペレットはpH 7.5の20mMトリス緩衝液で再懸濁し、PMODに特異的な抗体でプレコーティングしたProtein G-Sepharoseとインキュベートする。洗浄後、Sepharoseビーズを電気泳動サンプル緩衝液中で煮沸し、溶出したタンパク質をSDS-PAGEにかける。SDS-PAGEを免疫ブロットの膜に移し、一次抗体としてPMODに特異的な抗体を用い、二次抗体として一次抗体に特異的な¹²⁵I標識したIgGを用いてブロット上のバンドを視覚化し定量することによって、PMOD活性を算定する。
【０３７５】
PMODキナーゼ活性は、γ標識³²P-ATPの存在下で、PMODによるタンパク質基質のリン酸エステル化を定量して測定される。PMODを、タンパク質基質、³²P-ATP、および或る適切なキナーゼバッファと共にインキュベートする。基質に組み込まれた³²Pは、電気泳動法で遊離³²P-ATPより分離され、組み込まれた³²Pをラジオアイソトープカウンターでカウントする。組み込まれた³²Pの量が、PMODの活性に比例する。リン酸化した特異的アミノ酸残基の判定を、加水分解したタンパク質のホスホアミノ酸解析で行う。
【０３７６】
PMODホスファターゼ活性を、P-ニトロフェニルリン酸(PNPP)の加水分解によって測定する。PMODを0.1%のβメルカプトエタノールの存在下、37℃のHEPESバッファ（pH 7.5）中でPNPPと共に60分間インキュベートする。この反応は10Nの水酸化ナトリウムを6 ml加えて停止し、PNPP加水分解の結果の、410nmでの吸光度の増加を分光光度計で測定する。このアッセイでは、光吸収の増加がPMODの活性に比例する(Diamond, R.H. 他(1994) Mol. Cell. Biol. 14:3752-62)。
【０３７７】
SEQ ID NO:10のアッセイを、PMODについて上記したように行い、これにはシステインプロテアーゼ例えばパパインを用い、SEQ ID NO:10の不存在下と種々の濃度のSEQ ID NO:10の存在下でアッセイする。パパインのプロテアーゼ活性の阻害が、本アッセイのSEQ ID NO:10活性に比例する。
【０３７８】
SEQ ID NO:11のアッセイを、PMODについて上記したように行い、これにはマトリックスメタロプロテイナーゼを用い、SEQ ID NO:11の不存在下と種々の濃度のSEQ ID NO:11の存在下でアッセイする。マトリックスメタロプロテイナーゼ活性の阻害が、本アッセイのSEQ ID NO:11 活性に比例する。
【０３７９】
別法で、PMODのホスファターゼ活性を、リン酸化したタンパク質基質から除去されたリン酸の量を測定して決定する。反応は、60mM Tris（pH7.6）、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％2-メルカプトエタノールおよび10μM基質、³²P標識した適切なセリン／トレオニンまたはチロシンを含む最終量30μl中、2nM或いは4nMの酵素で行なう。反応を基質で開始し、30℃で10〜15分間インキュベートする。反応は0.6 M HC1、90mM Na₄P₂O₇、および2mM NaH₂PO₄中の4％(w/v)活性炭450μlでクエンチし、次に12,000×gで5分間遠心分離する。酸可溶性³²Piを液体シンチレーションカウンターで定量する（Sinclair, C. 他(1999) J. Biol. Chem. 274:23666-23672)。
【０３８０】
PMODプロテアーゼ活性は、種々の色素原分子で抱合した適切な合成ペプチド基質の加水分解によって測定される。この加水分解の程度は遊離された発色団の分光光度的(または蛍光定量的)吸光度によって定量される(Beynon, R.J. および J.S. Bond (1994) Proteolytic Enzymes:A Practical Approach, Oxford University Press, New York, NY, 25-55ページ)。ペプチドの基質はプロテアーゼ活性のカテゴリにしたがって設計される。このカテゴリーには、エンドペプチダーゼ(セリン、システイン、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ)、アミノペプチダーゼ(ロイシンアミノペプチダーゼ)、カルボキシペプチダーゼ(カルボキシペプチダーゼAおよびB、プロコラーゲンC-プロテイナーゼ)が含まれる。一般に使われる色素原は、2-ナフチルアミン、4-ニトロアニリンおよびフリルアクリル酸である。アッセイは室温で行い、適切なバッファに一定量の酵素および適切な基質を入れる。反応は光学的キュベットで行い、ペプチド基質の加水分解時に遊離される色素原の吸光度の増加または減少を測定する。このアッセイでは、吸光度の変化は酵素活性に比例する。
【０３８１】
或いはPMODプロテアーゼ活性のアッセイは、蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)を利用しており、このエネルギー伝達は適切なスペクトルの重複を持つ一つの供与体と一つの受容体のフルオロフォアが極めて近くにある場合に生じる。PMODに特異的な切断部位を含む可動性ペプチドリンカーを、グリーン蛍光タンパク質の赤にシフトした変異体(RSGFP4)と青い変異体(BFP5)の間に融合する。この融合タンパク質は、エネルギー移動がBFP5からRSGFP4へと起こっていることを示唆するスペクトル特性を有する。該融合タンパク質をPMODと共にインキュベートすると、基質が切断され二つの蛍光タンパク質が分離される。これは著しいエネルギー伝達の減少を伴い、この減少がPMODを加える前後の発光スペクトルを比較することによって定量される(Mitra, R.D. 他 (1996) Gene 173:13-17)。このアッセイは生細胞内でも行われ得る。この場合、蛍光基質タンパク質は細胞内で構成的に発現され、PMODは誘導ベクター上に導入され、したがって、PMODの存在および非存在におけるFRETをモニターできる(Sagot, I. 他(1999) FEBS Letters 447:53-57)。
【０３８２】
ユビキチン加水分解酵素活性の或るアッセイは、ユビキチン前駆体の加水分解を測定する。アッセイは室温で行い、適切なバッファに一定量のPMODと適切な基質を入れる。化学的に合成されたヒトユビキチン−バリンは基質として用いられ得る。基質からのC末端バリン残基の切断が、毛細管電気泳動でモニターされる（Franklin, K.他(1997) Anal. Biochem. 247:305-309)。
【０３８３】
アルファ2-HS糖タンパク質(AHSG)についてのPMODプロテアーゼ阻害活性は、デキサメサゾンで処理したラット骨髄細胞培養物(dex-RBMC)における骨形成活性の減少として測定しうる。アッセイは15%のウシ胎児血清、アスコルビン酸(50 mg/ml)、抗生物質(ペニシリンGを100 mg/ml、ゲンタマイシン50 mg/ml、ファンギゾン0.3 mg/ml)、10 mMのBグリセロリン酸、デキサメタゾン(10^-8 M)を補給した最小必須培地と種々の濃度のPMODを含む96穴の培養プレートで12〜14日間行う。培地内のミネラル化した組織形成を96穴プレートリーダーを用いて525 nmで吸光度を測定して定量する(Binkert, C. 他、前出)。
【０３８４】
インターαトリプシンインヒビター(ITI)に対するPMODプロテアーゼ阻害活性は、トリプシン活性の分光光度率の連続判定で測定し得る。本アッセイは、63 mMのリン酸ナトリウム、0.23 mMのNαベンゾイル-L-アルギニンエチルエステル、0.06 mMの塩酸、100単位のトリプシンおよび種々の濃度のPMODを含むpH 7.6のアッセイバッファ中、室温の石英キュベットで行う。倒置によって混合した直後に、A₂₅₃ _nm の増加を約5分間記録し、酵素活性を算出する（Bergmeyer, H.U. 他(1974) Meth. Enzym. Anal. 1:515-516)。
【０３８５】
ペプチジルプロリルシス/トランスイソメラーゼ活性などPMODイソメラーゼ活性は、Rahfeld, J.U.他(1994) (FEBS Lett. 352: 180-184)が述べた酵素アッセイで検定できる。このアッセイはキモトリプシン(0.5 mg/ml)と種々の濃度のPMODを含む35 mMのHEPESバッファ（pH 7.8)で10℃にて行う。これらのアッセイ条件下で、基質であるSuc-Ala-Xaa-Pro-Phe-4-NAはプロリル結合に関して平衡になり、トランス構造が80〜95%であり、シス構造が5〜20%である。ジメチルスルホキシド（10 mg/ml）中に溶解したアリコット（2μl）の基質を上記の反応混液に加える。シス異性体の基質のみがキモトリプシンによって切断される基質である。したがって、基質がPMODによって異性化されると、生成物はキモトリプシンによって切断されて4-ニトロアニリドが生成され、これは390 nmでのその吸光度によって検出される。4-ニトロアニリドの出現は時間依存性であり、またPMOD濃度依存的である。
【０３８６】
PMODのガラクトシル基転移酵素活性は、UDP-ガラクトースからGlcNAc末端オリゴ糖鎖への放射標識したガラクトースの転移を測定して判定できる(Kolbinger, F.他(1998) J. Biol. Chem. 273:58-65)。サンプルは、14 μlのアッセイ用ストック溶液(180 mMのカコジル酸ナトリウム、pH 6.5、1 mg/mlのウシ血清アルブミン、0.26 mMのUDP-ガラクトース、2 μlのUDP-[³H]ガラクトース)、1 μlのMnCl₂ (500 mM)および2.5 μlのGlcNAcβO-(CH₂)₈-CO₂Me (ジメチルスルホキシド中に37 mg/ml)で37℃にて60分間インキュベートする。この反応は1mlの水を加えてクエンチし、C18 Sep-Pakカートリッジ(Waters)に搭載し、カラムを2回5mlの水で洗浄して未反応のUDP-[³H]ガラクトースを除去する。[³H]ガラクトシル化GlcNAcβO-(CH₂)₈-CO₂Meは水で洗浄する間はカラムに結合されたままであり、5mlのメタノールで溶出する。溶出された物質の放射活性は液体シンチレーション計数で測定され、これは開始サンプルのガラクトシル基転移酵素活性に比例する。
【０３８７】
熱または毒素によるPMOD誘導はヒト線維芽細胞の初代培養あるいはCCL-13、HEK293またはHEP G2 (ATCC)などヒト細胞株で実証しうる。PMODの発現を加熱誘導するには、アリコートの細胞を42℃で15、30または60分間インキュベートする。対照アリコートを37℃で同じ時間長、インキュベートする。PMOD発現を毒素で誘導するには、アリコートの細胞を100 μMの亜砒酸または20mMのアゼチジン-2-カルボン酸で0、3、6または12時間処理する。熱、亜砒酸またはアミノ酸類似体に晒した後、処理した細胞のサンプルを収集し、細胞溶解物を調製しウエスタンブロットで分析する。細胞は1% Nonidet P-40、0.15 M NaCl、50 mMのTris-HCl、5 mMのEDTA、2 mMのN-エチルマレイミド、2 mMのフッ化フェニルメチルスルホニル、1 mg/mlのロイペプチンおよび1 mg/mlのペプスタチンを含む溶解バッファ内で溶解する。20マイクログラムの細胞溶解液を8% SDS-PAGEゲル上で分離し、膜に移す。5%の脱脂粉乳/リン酸緩衝食塩水で1時間ブロックした後、膜を4℃で一晩インキュベートするか、または2%の脱脂粉乳/リン酸緩衝食塩水中、適切な希釈度の抗PMOD血清で室温にて2〜4時間インキュベートする。次にこの膜を洗浄し、2％粉乳/リン酸緩衝食塩水で1:1000希釈の西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgGを用いてインキュベートする。リン酸緩衝食塩水に溶かした0.1%Tween 20で洗浄後、化学発光を用いてPMODタンパク質を検出し、対照と比較する。
【０３８８】
PMODのリジルヒドロキシラーゼ活性を判定するため、ヒドロキシ[¹⁴C]リジンの、[¹⁴C]リジンからの産生を測定する。放射標識プロトコラーゲンのインキュベートをPMODと共に行い、その緩衝液にはアスコルビン酸、硫酸鉄、ジチオスレイトール、ウシ血清アルブミン、およびカタラーゼを含む。30分間のインキュベート後、反応を、アセトンを加えて停止させ、遠心する。沈降した物質を乾燥し、ヒドロキシ[¹⁴C]リジンを[¹⁴C]ホルムアルデヒドへ転換するため過ヨウ素酸で酸化し、次にトルエン中へ抽出する。トルエン中へ抽出した¹⁴Cの量はシンチレーション計数で定量され、これがサンプル中のPMOD活性に比例する(Kivirikko, K.,およびMyllyla, R. (1982) Methods Enzymol. 82:245-304)。
【０３８９】
１８ PMOD 基質の同定
ファージ表示ライブラリを用いてPMODに対する最適な基質配列を同定できる。後にリンカーと既知の抗体エピトープが付いたランダム六量体を、繊維状ファージライブラリ内の遺伝子IIIのN末端伸長としてクローンする。遺伝子IIIはコートタンパク質をコードし、エピトープは各々のファージ粒子の表面に表示されることとなる。六量体がPMOD切断部位をコードするとエピトープが除去されるタンパク分解条件下で、ライブラリをPMODと共にインキュベートする。エピトープを認識する抗体を、固定化したタンパク質Aとともに加える。なおもエピトープを持つ未切断ファージは遠心分離で除去する。次に、上澄み中のファージを増幅し、更に数回スクリーニングする。その後、個々のファージクローンを単離し、配列決定する。これらペプチド基質の反応速度論は実施例１７のアッセイを用いて試験でき、最適な切断配列が得られる(Ke, S.H. 他(1997) J. Biol. Chem. 272:16603-16609)。
【０３９０】
in vivoのPMOD基質をスクリーニングするため、この方法を拡大し、ファージ粒子(T7SELECT?10-3ファージディスプレイベクター、Novagen, Madison, WI)または酵母細胞(pYD1酵母ディスプレイベクターキット、Invitrogen, Carlsbad, CA)の表面に表示されたcDNA発現ライブラリをスクリーニングできる。この場合、全体のcDNAが、遺伝子IIIと適切なエピトープの間に融合される。
【０３９１】
１９ PMOD インヒビターの同定
実施例１７のアッセイで説明したように、試験する化合物を、好適なバッファーおよび基質と共に、様々な濃度でマルチウェルプレートのウェルに分注する。PMOD活性を各ウェルにつき測定し、各々の化合物がPMOD活性を阻害する能力、および用量反応キネティックスを決定できる。PMOD活性を増強する分子の同定にも、このアッセイを利用できる。
【０３９２】
或いは、ファージ表示ライブラリを用いてペプチドPMODインヒビターをスクリーニングできる。インヒビターの候補はプロテアーゼに強く結合しているペプチドの内に見つけられる。この場合、マルチウェルプレートのウェルをPMODで被覆し、ランダムペプチドファージディスプレーライブラリ、またはサイクリックペプチドライブラリでインキュベートする(Koivunen, E. 他(1999) Nature Biotech 17:768-774)。非結合ファージを洗い流し、選択したファージを増幅し、更に数回再スクリーニングする。候補は実施例１７に記載のアッセイを用いてPMOD阻害活性をテストする。
【０３９３】
当業者には、本発明の範囲および精神から逸脱しない限りの、記載した本発明の組成物、方法およびシステムの、種々の修正および変更については自明であろう。本発明が、新規かつ有用なタンパク質群およびそれらをコードするポリヌクレオチド群を提供し、これらを創薬過程に利用しうること、また本発明が、これらの組成を用いた、疾患と病態との検出、診断、および治療の方法を提供することは理解されよう。本発明について説明するにあたり幾つかの実施態様に関連して説明を行ったが、本発明の請求の範囲が、そのような特定の実施態様に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。このような実施態様の記載は完全であると考慮されるべきでなく、また本発明を開示したとおりの形態に限定するものでもない。更に、1つの実施態様の要素は、他の1つ以上の実施態様の要素と容易に組み換え得る。このような組み合わせにより、本発明の範囲にある多数の実施態様を形成し得る。本発明の範囲は、添付した請求の範囲およびそれらの等価物によって規定されるよう意図される。
【０３９４】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド実施態様およびポリペプチド実施態様の命名の概略である。
【０３９５】
表２は、本発明のポリペプチド実施態様のGenBank識別番号と、最も近いGenBank相同体の注釈(annotation)と、PROTEOMEデータベース識別番号と、PROTEOMEデータベース相同体群の注釈とを示す。また、各ポリペプチドとその相同体（１つ以上）が一致する確率スコアも併せて示す。
【０３９６】
表３は、予測されるモチーフおよびドメインなど、ポリペプチド実施態様の構造的特徴を、該ポリペプチドの分析に用いる方法、アルゴリズムおよび検索可能なデータベースと共に示す。
【０３９７】
表４は、ポリヌクレオチド実施態様をアセンブリするために用いたcDNA断片および/またはゲノムDNA断片を、該ポリヌクレオチドの選択した断片と共に示す。
表５は、ポリヌクレオチド実施態様の代表的cDNAライブラリを示す。
【０３９８】
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織およびベクターを説明する付表である。
【０３９９】
表７は、ポリヌクレオチドとポリペプチドとの分析に用いたツール、プログラム、およびアルゴリズムを、適用可能な説明、参照文献および閾値パラメータと共に示す。
【０４００】
表８は、ポリヌクレオチド実施態様に見られる一塩基多型を、種々のヒト集団での対立遺伝子(アレル)頻度と共に示す。
【０４０１】
【表１】

【０４０２】
【表２】

【０４０３】
【表３】

【０４０４】
【表４】

【０４０５】
【表５】

【０４０６】
【表６】

【０４０７】
【表７】

【０４０８】
【表８】

【０４０９】
【表９】

【０４１０】
【表１０】

【０４１１】
【表１１】

【０４１２】
【表１２】

【０４１３】
【表１３】

【０４１４】
【表１４】

【０４１５】
【表１５】

【０４１６】
【表１６】

【０４１７】
【表１７】

【０４１８】
【表１８】

【０４１９】
【表１９】

【０４２０】
【表２０】

【０４２１】
【表２１】

【０４２２】
【表２２】

【０４２３】
【表２３】

【０４２４】
【表２４】

【０４２５】
【表２５】

【０４２６】
【表２６】

【０４２７】
【表２７】

【０４２８】
【表２８】

【０４２９】
【表２９】

【０４３０】
【表３０】

【０４３１】
【表３１】

【０４３２】
【表３２】

【０４３３】
【表３３】

【０４３４】
【表３４】

【０４３５】
【表３５】

【０４３６】
【表３６】

【０４３７】
【表３７】

【０４３８】
【表３８】

【０４３９】
【表３９】

【０４４０】
【表４０】

【０４４１】
【表４１】

【０４４２】
【表４２】

【０４４３】
【表４３】

【０４４４】
【表４４】

【０４４５】
【表４５】

【０４４６】
【表４６】

【０４４７】
【表４７】

【０４４８】
【表４８】

【０４４９】
【表４９】

【０４５０】
【表５０】

【０４５１】
【表５１】

【０４５２】
【表５２】

【０４５３】
【表５３】

【０４５４】
【表５４】

【０４５５】
【表５５】

【０４５６】
【表５６】

Claims

以下の（ａ）乃至（ｇ）からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
（ａ）SEQ ID NO:1-28（配列番号１乃至28）からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド
（ｂ）SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-7、SEQ ID NO:9-19、SEQ ID NO:21-26、SEQ ID NO:28からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも９０％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:20からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも９４％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｄ）SEQ ID NO:8のアミノ酸配列に対して少なくとも96％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｅ）SEQ ID NO:27のアミノ酸配列に対して少なくとも97％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｆ）SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
（ｇ）SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
請求項1のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
請求項2のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:29-56からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
請求項３に記載のポリヌクレオチドへ機能的に連結したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチド。
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを有する遺伝形質転換生物。
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項1のポリペプチドをコードする或るポリヌクレオチドへ機能的に連結されたプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
（ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程、とからなることを特徴とする方法。
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
請求項１に記載のポリペプチドと特異結合するような単離された抗体。
以下の（ａ）乃至（ｇ）からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）SEQ ID NO:29-56からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）SEQ ID NO:29-53、SEQ ID NO:55-56からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｃ）SEQ ID NO:54のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９１％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｅ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｆ）（ｃ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のRNA等価物
請求項12に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを持つ、単離されたポリヌクレオチド。
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列を有する少なくとも２０の連続したヌクレオチド群を持つ或るプローブと前記サンプルとをハイブリダイズし、該プローブが、或るハイブリダイゼーション複合体が前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片群との間に形成される条件下で、前記標的ポリヌクレオチドへ特異的にハイブリダイズする過程と、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含む方法。
前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ）前記増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含むことを特徴とする方法。
請求項１のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項17の組成物。
機能的PMODの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項17の組成物の投与を含む治療方法。
請求項１のポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出する過程、とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
請求項20に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
機能的PMODの発現低下に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項21に記載の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
請求項１のポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出する過程、とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
請求項23の方法で同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを有する組成物。
機能的PMODの過剰発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項24の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする治療方法。
請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを適切な諸条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程、とを含むことを特徴とする方法。
請求項１のポリペプチドの活性をモジュレート（調節）する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドの活性が許容された諸条件下で、請求項1に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項1に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ）試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。
請求項５の配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変するのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な諸条件下で、前記標的ポリヌクレオチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝露する過程と、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの、改変された発現を検出する過程と、
（ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程、とを含むことを特徴とする方法。
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ）核酸群を有する或る生体サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ）処理した前記生体サンプルの核酸群と、請求項12のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチド群を有する或るプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションが、前記プローブと前記生体サンプルの或る標的ポリヌクレオチドとの間で或る特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される諸条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項12のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を有するポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ）前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量を、或る処理されていない生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示することを特徴とする方法。
生体サンプル中のPMODの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ）請求項11に記載の抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体が形成されるのに適した諸条件下で、前記生体サンプルを該抗体と混合する過程と、
（ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生体サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
請求項11の抗体であって、
（ａ）キメラ抗体
（ｂ）一本鎖抗体
（ｃ）Fab断片
（ｄ）F(ab')₂断片
（ｅ）ヒト化抗体、のいずれかであることを特徴とする抗体。
請求項11に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを有する組成物。
被検者のPMODの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項32に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
前記抗体が標識されることを特徴とする、請求項32に記載の組成物。
被検者のPMODの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項34に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
請求項11の抗体の特異性を持つポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有する或るポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ）前記単離された抗体を該ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する或るポリペプチドに特異結合するようなポリクローナル抗体を同定する過程、とを含むことを特徴とする方法。
請求項36の方法で産生したポリクローナル抗体。
請求項37のポリクローナル抗体と好適なキャリアとを有する組成物。
請求項11に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有する或るポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から、抗体を産出する細胞を単離する過程と、
（ｃ）不死化した細胞と前記抗体産出細胞とを融合し、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ）SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程、とを含むことを特徴とする方法。
請求項39に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
請求項40に記載のモノクローナル抗体と適切なキャリアとを有する組成物。
Fab発現ライブラリのスクリーニングによって前記抗体を産出することを特徴とする、請求項11に記載の抗体。
組換え免疫グロブリンライブラリをスクリーニングすることにより産出されることを特徴とする、請求項11に記載の抗体。
SEQ ID NO:1-28からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドをサンプル中に検出する方法であって、
（ａ）前記抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、或るサンプルと共に請求項11に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する或るポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
SEQ ID NO:1-28 からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）前記抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、或るサンプルと共に請求項11に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-28からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程、とを含むことを特徴とする方法。
マイクロアレイの少なくとも１つのエレメントが請求項13に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするマイクロアレイ。
ポリヌクレオチド群を有する或るサンプルの発現プロファイルを作製する方法であって、
（ａ）該サンプルの該ポリヌクレオチド群を標識する過程と、
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した諸条件下で請求項46のマイクロアレイのエレメント群をサンプルの標識されたポリヌクレオチド群と接触させる過程と、
（ｃ）該サンプル中の該ポリヌクレオチド群の発現を定量化する過程、とを含むことを特徴とする方法。
或る固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を有するアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、或る標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチド群と特異的にハイブリダイズ可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項12に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
請求項48に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
請求項48に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも60の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
請求項48に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
請求項48に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
請求項48に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を有するヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを有することを特徴とするアレイ。
請求項48に記載のアレイで、或るリンカーが少なくとも１つの前記のヌクレオチド分子と前記の固体基板とを連結していることを特徴とするアレイ。
請求項48に記載のアレイで、該基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、該基板上の固有の物理的位置の各々は、該基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子群の配列とは異なる或る配列を有するヌクレオチド分子群を含むことを特徴とするアレイ。
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:24のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:25のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:27のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:28のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
SEQ ID NO:29のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:30のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:31のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:32のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:33のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:34のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:35のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:36のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:37のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:38のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:39のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:40のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:41のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:42のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:43のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:44のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:45のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:46のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:47のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:48のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:49のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:50のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:51のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:52のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:53のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:54のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:55のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
SEQ ID NO:56のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。