JP2005500510A - インターフェロンαを選択的に誘導する化合物を同定するための選別法 - Google Patents

Abstract

ＩＦＮ−αの産生を選択的に誘導する化合物の選別方法、およびＩＦＮ−αの産生を選択的に誘導する小分子を使用して患者の病気を回復させる方法が開示されている。

Description

【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫学の分野、特に免疫応答のモジュレーションに関するものである。本発明は、ＩＦＮ−αの選択的誘導用の化合物の選別方法、ＩＦＮ−αの選択的誘導用の化合物、およびＩＦＮ−αに反応する患者の病気を回復させるためのＩＦＮ−αの選択的誘導方法を提供する。
【０００２】
背景
インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）は種々の病気を治療するのに使用できる。たとえば、ＩＦＮ−αは、肝炎、多発性硬化症、Ｃ型肝炎に関連した種々の皮膚疾患、リンパ腫、および黒色腫などの病気を治療するのに使用できる。最近、ウィルス感染に反応する血液中の１次インターフェロン産生細胞は、プラズマ細胞様の樹状細胞（ｐＤＣ）であることが明らかにされた。この細胞は、必要なものであり、イミダゾキノリンと呼ばれる化合物種に反応する、血液中の主要なＩＦＮ−α産生細胞である。このような化合物は、たとえば、米国特許第４，６８９，３３８号、同第５，３８９，６４０号、同第５，２６８，３７６号、同第４，９２９，６２４号、同第５，２６６，５７５号、同第５，３５２，７８４号、同第５，４９４，９１６号、同第５，４８２，９３６号、同第５，３４６，９０５号、同第５，３９５，９３７号、同第５，２３８，９４４号、同第５，５２５，６１２号、同第５，１７５，２９６号、同第５，６９３，８１１号、同第５，７４１，９０８号、同第５，９３９，０９０号、同第６，１１０，９２９号、同第４，９８８，８１５号、同第５，３７６，０７６号、ならびにＰＣＴ公報ＷＯ ９９／２９６９３、ＷＯ ００／７６５０５、ＷＯ ００／７６５１８、およびＷＯ ００／７６５１９に開示されている。これらの出願はすべて、ここでの参照により開示に含まれるものとする。
【０００３】
しかし、ＩＦＮ−α産生などの免疫応答（または免疫応答を誘導する化合物）は、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）やＩＬ−１などの炎症性サイトカインの産生を上方制御することもある。ＴＮＦ−αやＩＬ−１などの炎症性サイトカインの上方制御によって、組織破壊などの有害作用が生じることがよくある。数多くの臨床状況においては、炎症性サイトカインの産生を制限しながら、なおかつＩＦＮ−αの産生を誘導することが望ましい場合がある。したがって、炎症性サイトカインの産生を著しく増大させることなくＩＦＮ−αの産生を誘導するような化合物を作り出すこと、またそれらの化合物を選別する方法を編み出すことが必要である。
【０００４】
発明の概要
本発明は、ＩＦＮ−αの産生を刺激するが、それでも血流中に存在する細胞から著しいレベルの炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−αなど）を付随的に産生させないような化合物を同定するための方法を提供するものである。この方法は、ｐＤＣ２細胞を含んでいる細胞集団に対してそのような潜在能力のある化合物を選別することを伴う。ｐＤＣ２細胞は、細胞集団におけるＩＦＮ−αの産生の大部分を担っているものである。この基準に合った化合物を「選択化合物」と呼ぶことにする。本発明では、本発明の選択化合物を用いて、ＩＦＮ−αの誘導に反応する患者の病気に影響を及ぼすための方法も提供する。
【０００５】
発明の詳細な説明
本発明は、ｐＤＣ２細胞からのＩＦＮ−αの産生を選択的に誘導する化合物の同定方法を提供する。実施態様によっては、本発明は、著しい量の炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＭＣＰ−１など）を産生させることなく、未分離の全血または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などの細胞集団中でＩＦＮ−αを選択的に誘導することが可能である。本発明はまた、ＩＦＮ−αの選択的誘導用の好ましい化合物、ＩＦＮ−αに反応する患者の病気に影響を及ぼす化合物および影響を及ぼす方法も提供する。著しいレベルの炎症性サイトカインを発現させずにＩＦＮ−αの発現を選択的に誘導するような化合物を投与するなら、炎症性サイトカインによる潜在的に望ましくない副作用が生じる可能性を少なくし、所期の治療効果または予防効果を有利にもたらすことができる。
【０００６】
本明細書では、「ｐＤＣ２細胞」は「前駆樹状細胞−２型」を意味する。この細胞は、白血球系譜マーカーがなく、ＣＤ４、ＭＨＣクラスＩＩ分子、およびＣＤ１２３を発現し、またインターロイキン−３（ＣＤ４０リガンドがあってもなくてもよい）で培養した場合に２型樹状細胞に分化する形質細胞様細胞型である。ｐＤＣ２細胞は、表面マーカーであるＣＤ１２３＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ４＋の存在により、また白血球系譜特定マーカーおよびＣＤ１１Ｃ−の非存在により同定できる。「ｐＤＣ２細胞」という用語には、これらの前駆細胞や分化した２型樹状細胞（ＤＣ２）が含まれる。
【０００７】
「末梢血単核細胞」（ＰＢＭＣ）という用語は、血液中に通常存在する細胞のことを指し、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、単球（マクロファージなど）、および樹状細胞を包含する。
【０００８】
「炎症性サイトカイン産生細胞」という用語は、ＰＢＭＣ集合内の炎症性サイトカインの大部分を産生する単一細胞型または細胞型の組合わせを包含する。そのような細胞の例としては、単球、マクロファージ、および樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋）が挙げられる。ただし、ＣＤ１１ｃ−である（ＤＣ１）樹状細胞は、ここで用いられている用語としての「炎症性サイトカイン産生細胞」とは見なさない。
【０００９】
「発現」、「発現された」、「発現する」などの用語は、遺伝子から、タンパク質およびタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を産生することを指す。
【００１０】
「炎症性サイトカイン」は、炎症反応を誘導するサイトカインを指す。本発明によれば、炎症性サイトカインの例としては、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＩＬ−１２がある。本明細書における「炎症性サイトカイン」という用語には、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）は含まれない。
【００１１】
「ｐＤＣ２濃縮細胞」という用語は、細胞（たとえば、ＰＢＭＣまたは全血細胞）の標本で、ｐＤＣ２細胞の割合が５％以上、好ましくは２０％以上、さらに好ましくは８０％〜９５％のものを指す。
【００１２】
本明細書における「選択化合物」は、著しいレベルの炎症性サイトカインを付随的に産生させずに、ｐＤＣ２細胞を含んでいるＰＢＭＣなどの造血細胞集団中でＩＦＮ−αの発現を優先的に誘導するような化合物を指す。ここで用いられている「著しいレベル」とは、ある特定の使用での前記化合物の有用性を低減させるほどの炎症性サイトカインによる望ましくない作用を引き起こすような、炎症性サイトカインのレベルを指す。たとえば、産生されたＴＮＦ−αと産生されたＩＦＮ−αの比率が約１：３より大きい場合、これは、炎症性サイトカインの産生が著しいレベルであると見なされる。
【００１３】
選別方法
一実施態様では、本発明はＩＦＮ−αの産生を選択的に誘導する化合物を同定する方法を提供し、この方法は、前記化合物を選別することを含み、前記化合物が、ＴＮＦ−αを含む炎症性サイトカインの産生を著しく誘導することなく細胞集団中でのＩＦＮ−αの産生を誘導するかどうかを判別するものである。本発明による化合物の選別に適した細胞集団は、炎症性サイトカインを産生する細胞およびｐＤＣ２細胞を含む。したがって、好適な細胞集団の例としては、全血細胞、ＰＢＭＣの完全集団または部分集団、ｐＤＣ２細胞分画を多く含んだＰＢＭＣ細胞、あるいはｐＤＣ２またはＤＣ２細胞を含んだ任意の造血集団がある。
【００１４】
典型的な実施態様では、本発明の選択化合物は、主にｐＤＣ２細胞からＩＦＮ−αの発現を誘導する。好ましくは、ＩＦＮ−αの産生を誘導する選択化合物は、細胞集団中のｐＤＣ２細胞または他の細胞から高レベルの炎症性サイトカインを誘導しない。一般に、本発明の選択化合物を、ｐＤＣ２細胞と炎症性サイトカイン産生細胞とを含む細胞集団に与えた場合、ＩＦＮ−αは、ＴＮＦ−αの量より少なくとも３倍の量だけ、典型的には約１００倍、実施態様によっては約１０００倍以上、細胞集団中に存在する。
【００１５】
ｐＤＣ２細胞を含む細胞集団は、任意の適切な方法によって取得または調製できる。たとえば、適切な細胞集団を調製するための血球試料は、たいていの哺乳類から取得できる。細胞試料は、濃縮または精製手順を実施して、細胞集団中における所望の細胞型（ｐＤＣ２細胞など）の割合を増やした細胞集団であってもよい。これらの手順は、ポジティブ選択またはネガティブ選択のいずれかに基づいたものにすることができる。ポジティブ選択の例としては、所望の細胞型をその細胞型の特異抗体で標識し、結合性がその細胞型上の抗体の存在に依存するカラムにその細胞型を結合させてから、細胞集団中の他の細胞から分離するというプロセスがある。ネガティブ選択の例としては、不要な細胞をその細胞に対して作られた抗体で標識し、結合性がその抗体の存在に依存するカラムにその細胞を結合させてから、所望の細胞型から分離するというプロセスがある。そのようなカラムとしては、たとえば、免疫親和性カラムまたはマグネットビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄ）ベースのカラム（Ｄｚｉｏｎｅｋ Ａ、Ｆｕｃｈｓ Ａ、Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｐ、Ｃｒｅｍｅｒ Ｓ、Ｚｙｓｋ Ｍ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｓ、Ｂｕｃｋ ＤＷ、Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｊ：ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、およびＢＤＣＡ−４：ヒト末梢血中の樹状細胞の異なったサブセット用の３種類のマーカー）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（「免疫学ジャーナル」）１６５（１１）：６０３７、２０００）があるが、これらに限定されるわけではない。
【００１６】
細胞は、フローサイトメーター（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を使用した分別により、ポジティブまたはネガティブ選択で濃縮することもできる。この手順によれば、細胞は、細胞型を区別するフルオロフォア結合抗体で標識し、細胞表面上にフルオロフォア結合抗体が存在するかどうかに基づいて各集団に分別することができる。所望の細胞型の細胞集団を濃縮するその他の技法としては、たとえば、アンモニウム溶解（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｌｙｓｉｓ）、補体細胞溶解（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ）、密度勾配分離、パニング、粘着性減退（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）、およびチャージフロー分離（ｃｈａｒｇｅ−ｆｌｏｗ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）がある。所望の細胞の濃縮または純度を達成するために、これらの技法を単独で、または組み合わせて実施できることは理解されるであろう。
【００１７】
本発明の一実施態様では、ｐＤＣ２を含んでいる細胞集団を、ＩＦＮ−αの発現を選択的に誘導するのに十分な量の選別する化合物と接触させる。細胞集団を化合物と接触させる際の培養条件および培地の組成は、任意の適切な設備を使用して作り出すことができる。発現を誘導するのに使用する化合物の特定量はさまざまであるが、刺激は一般には用量に敏感に応じる。選択化合物の典型的な用量範囲は、約０．００５〜約５μＭである。しかし、サイトカイン発現のもっと強力な刺激物質である化合物は、もっと低い用量範囲でもＩＦＮ−αの産生または炎症性サイトカインの発現を生じさせることがある。化合物は、細胞や培地と生理学的に適合性のある適切な担体中の細胞に加えることができる。
【００１８】
細胞集団は、化合物がＩＦＮ−αの発現を選択的に誘導できるくらい十分な時間、化合物と接触させる。種々のサイトカインの発現の速度論については当技術分野において知られている。ただし、サイトカイン発現の判別方法が、化合物によって細胞集団が刺激される時間に影響を与えることもある。たとえば、産生される細胞内サイトカインｍＲＮＡの量を核酸プローブで評価してサイトカイン発現を判別する場合は、培地に分泌された細胞外サイトカインタンパク質の量でサイトカイン発現を判別する場合と比べて、一般にもっと短い時間内に細胞が刺激されることがある。細胞内ｍＲＮＡまたは細胞内タンパク質の発現は、たいていの場合、細胞集団を化合物と接触させてから約２〜６時間後に判別できる。しかし、ＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−αの細胞内発現は、典型的には刺激してから６〜２４時間後に判別される。細胞外タンパク質の発現は、細胞集団を化合物に接触させてから約６〜４８時間後に、典型的には約１２〜３６時間後に判別できる。
【００１９】
本発明では、ある時間にわたって化合物と接触させた細胞集団から発現するサイトカインの特定量または相対量を測定することもできる。例を挙げれば、サイトカインの測定は、細胞中で産生されるサイトカインの量を、たとえば免疫検出により、多色フローサイトメトリー（ｍｕｌｔｉ−ｃｏｌｏｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を利用して評価することで行うことができる。一実施態様では、ＩＦＮ−αやＴＮＦ−αなどのサイトカインに対する抗体は、細胞内免疫検出に適した公知の技法を用いて調製された細胞集団に侵入するのに使用できる。これらの抗体は、フルオロフォア（たとえば、ＦＩＴＣ、フィコエリトリン、およびＣｙ３）や他の蛍光ラベルなどの化合物と結合させることができ、そうすることで、それらの抗体の蛍光検出が可能となり、細胞中のサイトカインの相対量が分かる。
【００２０】
フローサイトメーターを使用すると、抗ＩＦＮ−αまたは抗ＴＮＦ−αフルオロフォア結合抗体で染色された細胞集団中の蛍光を測定できる。任意選択で、細胞集団は、特定表面タンパク質に対するフルオロフォア結合抗体で染色することもでき、このフルオロフォア結合抗体により細胞集団中の異なる細胞型（たとえばｐＤＣ２細胞）の区別が可能である。所望の細胞型の同定およびその細胞型中で発現するサイトカインの相対量（ｐＤＣ２細胞中で産生されるＩＦＮ−αの量など）の測定は、多色フローサイトメトリーを使用して行うことができる。
【００２１】
免疫検出によるサイトカイン誘導の測定は、細胞外に存在するサイトカインの量、あるいは細胞集団から培地へ分泌されたサイトカインの量を分析することによっても行うことができる。たとえば、分泌されたＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−αの測定は、ＥＬＩＳＡまたは生物検定法などの技法を使用して行うことができる。ある時間にわたって化合物で刺激された後に細胞集団から分泌された、培養上清中に存在するサイトカインは、マイクロタイターのプレート表面などのプラスチック表面に固定化することができる。抗ＩＦＮ−α抗体または抗ＴＮＦ−α抗体などの抗体を使用すると、プラスチック表面に固定化されたそれらのサイトカインの存在を検出できる。それらの抗体は、アルカリ性ホスファターゼまたはペルオキシダーゼ分子などの既知の検出部分と結合させることができる。それらの分子は、検出試薬と一緒に使用して、サイトカインの存在や相対量を示すことができるものである。各サイトカイン標準物質を同時に用いれば、培地中に分泌されたサイトカインの合計量を測定できる。
【００２２】
免疫検出または生物検定法によるサイトカインの測定は、細胞溶解産物中に存在するサイトカインの量を評価することによっても行うことができる。本発明によれば、刺激された細胞は、既知の方法（たとえば、洗浄剤溶解（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ｌｙｓｉｓ））によって溶解または可溶化させることができ、サイトカインを含んでいる溶解産物を担体表面（たとえば、ニトロセルロース膜）に移すことができる。任意選択で、移す前に電気泳動法を実施して、溶解産物の成分を分離することができる。適切な２次および検出試薬を使用して、ウエスタンブロット法またはドットブロット法を実施すれば、細胞溶解産物中のサイトカイン（たとえば、ＩＦＮ−αまたはＴＮＦ−α）の存在や量を判別することができる。細胞溶解産物からタンパク質を検出する技法は、当技術分野では一般に知られており、たとえば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（タンパク質科学の最新プロトコル）」（Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９６、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）に記載されている。
【００２３】
サイトカイン発現の細胞内検出方法としては、特定のサイトカインをコードするｍＲＮＡの量の検出もある。この方法によれば、サイトカインの量は、標的サイトカインｍＲＮＡ（つまり、ｍＲＮＡの一部）の相補的核酸プローブを使用し、上記のフローサイトメトリーおよび免疫検出と組み合わせて測定することができる。核酸プローブは、フルオロフォア（ＦＩＴＣまたはＣｙ３など）と結合させることができる。あるいは、特定の化合物で刺激された細胞を採取および溶解させて、サイトカインｍＲＮＡを含む溶解産物を得ることができる。たとえば、ノーザン分析などの方法を実施できる。一実施態様によれば、ノーザン分析には、電気泳動法によるＲＮＡの分離、ＲＮＡを固体の担体に移すこと（膜分析など）、標的サイトカインｍＲＮＡの相補的核酸による探索、および検出部分への結合が含まれていてよい。好適な検出部分としては、放射能標識、フルオロフォア、発光性化合物、または比色化合物（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）がある。リボヌクレアーゼ保護試験法（ＲＮＡａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）（ＲＰＡ）やＲＴ−ＰＣＲなど他の方法を用いて、細胞試料内のサイトカインｍＲＮＡ（ＩＦＮ−αまたはＴＮＦ−αのｍＲＮＡなど）の存在および量を判別することもできる。そのような試験法は知られており、たとえば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学の最新プロトコル）」（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９０、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に開示されている。この文献は、ここでの参照によりその全体が開示に含まれるものとする。
【００２４】
患者の病気に影響を及ぼす方法
別の実施態様では、本発明は、選択化合物を患者に投与することにより、ＩＦＮ−αに反応する患者の病気に影響を及ぼす方法を提供する。患者はヒトであっても動物であってもよい。選択化合物は、患者のｐＤＣ２細胞からのＩＦＮ−αの発現を増大させることにより、患者のＩＦＮ−αの増大をもたらす。すでに論じたように、選択化合物は、好ましくは、炎症性サイトカインの発現の著しい増大をもたらさない。
【００２５】
ＩＦＮ−αのレベルを増大させることにより影響を及ぼすことのできる病気の例としては、黒色腫、骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、腎細胞癌、カポジ肉腫、多発性硬化症、好酸球増加症候群、アデノウイルス、ライノウイルス、痘瘡（特に、大痘瘡）、インフルエンザ、コロナウイルス、ＨＩＶ、パラインフルエンザ、筋増殖性（ｍｙｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）疾患（真性多血症や特発性骨髄線維症など）、Ｂ型肝炎、慢性Ｃ型肝炎、ならびに、皮膚壊死性脈管炎（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｎｅｃｒｏｔｉｓｉｎｇ ｖａｓｉｃｕｌｉｔｉｓ）などの皮膚性疾患、混合性クリオグロブリン血症、晩発性皮膚ポルフィリン症、扁平苔癬、アダマンティアディス−ベーチェット症候群（Ａｄａｍａｎｔｉａｄｉｓ−Ｂｅｈｃｅｔ ｓｙｎｄｒｏｍ）、多形性紅斑、結節性紅斑、マラコプラキア、じんま疹そう痒症、基底細胞癌、性器いぼ、光線性角化症、およびその他の種類のヒト乳頭腫ウイルス感染（表皮異形成ベルシフォルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｌａｓｉａ ｖｅｒｕｃｃｉｆｏｒｍｉｓ）、尋常性ゆうぜい、足底いぼ、および子宮頚部異形成を含む）があるが、これらに限定されるわけではない。
【００２６】
選択化合物
選択化合物としては、炎症性サイトカインを著しく発現させることなく主にｐＤＣ２細胞からのＩＦＮ−αの発現を増大させる、ある特定のイミダゾキノリンアミン、イミダゾキノリンスルホンアミド、およびイミダゾキノリン尿素が挙げられる。
【００２７】
本発明の方法を使用して選択性があるとして選別された化合物の例としては、次のものがある。
【化１】

【化２】

【化３】

【化４】

【化５】

【化６】

【００２８】
上記の化合物およびその調製方法は、ＷＯ ００７６５０５、ＷＯ ００７６５１８、およびＷＯ ００７６５１９に詳しく記載されており、その内容を参照により本明細書に引用したものとする。
【００２９】
これらの化合物は、標的部分へ化合物が結合する対象となる細胞型へ特別に送達されるようにすることもできる。イミダゾキノリンをベースにした化合物などの化合物と結合させるのに役立つ標的部分としては、影響を受ける細胞（特にｐＤＣ２細胞）に特異的である抗体、サイトカイン、およびレセプターリガンドがある。ｐＤＣ２細胞の標的部分としては、たとえば、抗ＢＤＣＡ−２、抗ＢＤＣＡ−４、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ１２３抗体、または抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を挙げることができる。
【００３０】
本発明の選択化合物が、安定した無毒性の酸性塩または塩基性塩を形成できるほど十分に塩基性または酸性である場合には、化合物を塩として投与するのが適切であろう。薬学的に許容される塩の例としては、生理学的に許容される陰イオンを生じる酸によって形成される有機酸付加塩、たとえば、トシラート、メタンスルホン酸塩、アセテート、シトレート、マロネート、酒石酸塩、スクシネート、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩、およびα−グリセロ燐酸塩がある。塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、および炭酸塩を含め、好適な無機酸塩を形成してもよい。薬学的に許容される塩は、当技術分野で知られている標準的な手順、たとえば、十分に塩基性である化合物（アミンなど）と生理学的に許容される陰イオンを生じる好適な酸とを反応させることにより得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属（たとえば、ナトリウム、カリウム、またはリチウム）塩またはアルカリ土類金属（たとえば、カルシウム）塩も作ることができる。
【００３１】
本発明のいくつかの実施態様の具体的な説明によって本発明をさらに説明するために、以下に実施例を示す。ただし、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３２】
実施例
以下の実施例では、ｐＤＣ２細胞からのサイトカイン産生を選択的に誘導するＩＲＭ化合物の選別方法について記載する。
【００３３】
培地
検討したこれらの実施例では、完全ＲＰＭＩ（ｃＲＰＭＩ）培地を使用した。１０％熱失活（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび５０μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ，ＭＤ）を補充した２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とＲＰＭＩ１６４０とを混合して、ｃＲＰＭＩを調製した。
【００３４】
種々の細胞型の産生、精製、または濃縮
ＰＢＭＣは、インフォームド・コンセントを得た後に健康な志願者から、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ ＨｙｂｒｉＭａｘ−１０７７密度勾配（Ｓｉｇｍａ）を使用して分離した。ＣＤ１４＋細胞は、製造業者の指示に従い、ＭｉｎｉＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｏｒｎ，ＣＡ）に関連してＣＤ１４＋マイクロビーズを用いて、ポジティブ選択で精製した。フローサイトメトリーで評価した純度は９０％を超えていた。
【００３５】
ｐＤＣ２細胞は、製造業者の指示に従い、ＭｉｎｉＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｏｒｎ，ＣＡ）に関連してＣＤ３−、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ１４−、およびＣＤ５６−マイクロビーズを用いて、ネガティブ選択で濃縮した。その後、ネガティブ選択で濃縮したｐＤＣ２細胞は、抗ＣＤ１２３、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ４抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、固体数が５％以上（フローサイトメトリーで判定）になるまで濃縮した。
【００３６】
ＩＲＭ化合物による細胞刺激
ＰＢＭＣ、単球（ＣＤ１４＋）、ｐＤＣ２濃縮、またはＤＣ１（ＣＤ１１ｃ＋血中ＤＣ）細胞を、１０６細胞／μｌの濃度で補足ＲＰＭＩ中に再懸濁した。その後、１００μｌの細胞（１０^５個の細胞）を、９６ウェルＶ型プレート（Ｖ−ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅ）（ヌンク）の個々のウェルに加えた。選択化合物または非選択化合物の濃度を変化させた補足ＲＰＭＩを含んだ溶液を調製した。具体的には、以下に示す非選択化合物レシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）および選択化合物Ｉ〜ＶＩを補足ＲＰＭＩで２．２、０．６６、０．２２、０．０６６、および０．０２２μＭに希釈した。１００μｌの化合物希釈溶液を細胞に加えて、化合物の最終濃度をそれぞれ１．１、０．３３、０．１１、０．０３３、および０．０１１μＭとした。ＤＣ１細胞の刺激については、非選択化合物のレシキモドを希釈して６４、３２、１６、８、４、および２μＭにした。１００μｌの化合物希釈溶液を細胞に加えて、最終濃度を３２、１６、８、４、２、および１μＭとした。細胞は、５％ＣＯ_２／９５％空気の雰囲気下において３７℃で培養した。
【化７】

【００３７】
細胞表面および細胞内フローサイトメトリー
細胞表面マーカー発現の評価は、次のモノクローナル抗体を使用してフローサイトメトリー分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）で行った：ＰＥ結合ＣＤ１４、クローンＭφＰ９、ＰＥ結合およびＦＩＴＣ結合ＨＬＡ−ＤＲ、クローンＬ２４３、ＰＥ結合およびＦＩＴＣ結合γ１／γ２ａアイソタイプコントロール、クローンＸ４０およびＸ３９（すべてベクトンディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）（カリフォルニア州、マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ））からのもの）。細胞（５×１０^５）を、４℃で１５分間、精製ＩｇＤ（ベクトンディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を使用して培養して非特定結合をブロックし、その後、１０％ＦＣＳおよび０．１％アジ化ナトリウムを含んだＰＢＳ中で、４℃で３０分間、細胞を抗体で染色した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターおよびＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ベクトンディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））で分析した。
【００３８】
サイトカインの分析
サイトカインのレベルはＥＬＩＳＡで測定した。ヒトのＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２（ｐ４０／ｐ７０）キットは、ジェンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）（マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ））から購入した。ヒトＩＬ−６キットは、バイオソースインターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（カリフォルニア州、カマリロ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ））から入手した。ＥＬＩＳＡはすべて製造業者の付属書に従って行った。ＩＦＮのレベルは生物検定法（４０）で測定した。ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの特異抗体を使用して、タイプＩのどのＩＦＮが細胞上清中に存在するかを判別した。ＥＬＩＳＡの結果はすべてｐｇ／ｍｌで示し、ＩＦＮの結果はＵ／ｍｌで示してある。
【００３９】
細胞内フローサイトメトリーによるサイトカインのプロファイルの特徴付け
ｐＤＣ２含有細胞集団を０．００５〜５μＭの濃度範囲の種々の選択化合物および非選択化合物で１２時間にわたって刺激した。またこれは、タンパク質の分泌を防ぐためにＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の存在下で行った。ｐＤＣ２含有細胞集団をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（Ｍｅｒｃｋ）で固定してから、０．１％サポニン／ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）で透過化処理を施した。ｍＡｂｓ ＨＬＡ−ＤＲ＋−ＰｅｒＣＰとＣＤ１２３−ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用し、さらにＴＮＦ−ＦＩＴＣ、ＩＬ−１２−ＦＩＴＣおよびＩＦＮ−α−ＦＩＴＣ（Ｃｈｒｏｍａｐｒｏｂｅ）のうちのいずれかを使用して、細胞を染色した。ＰＢＳで洗浄した後、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターおよびＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、三色フローサイトメトリー（ｔｈｒｅｅ ｃｏｌｏｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で細胞を分析した。
【００４０】
表１のデータは、非選択化合物であるレシキモドで刺激した種々の細胞集団の細胞培養上清から測定した、サイトカインＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−αの発現についての生物検定法およびＥＬＩＳＡの結果を示している。
【００４１】
表２のデータは、選択化合物ＩＩで刺激した種々の細胞集団の細胞培養上清から測定した、サイトカインＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−αの発現についての生物検定法およびＥＬＩＳＡの結果を示している。他の選択化合物ＩおよびＩＩＩ〜ＶＩの刺激で産生されたサイトカイン発現レベルも同様であった。
【００４２】
【表１】

【００４３】
【表２】

Claims (40)

1. ｐＤＣ２細胞からのＩＦＮ−αの産生を選択的に誘導する化合物の同定方法であって、
   − 炎症性サイトカイン産生細胞とｐＤＣ２細胞の両方を含む細胞集団を取得することと、
   − 前記細胞集団を試験化合物に接触させることと、
   − 前記試験化合物に接触させた前記細胞集団中に存在するＩＦＮ−αの量を測定することと、
   − 前記試験化合物に接触させた前記細胞集団中に存在する炎症性サイトカインの量を測定することと、
   − 前記試験化合物との接触後にＩＦＮ−αが、前記細胞集団中に存在する炎症性サイトカインの量よりも少なくとも３倍の量だけ前記細胞集団中に存在する場合に、前記試験化合物をＩＦＮ−αの選択誘導物質として同定することとを含む、化合物の同定方法。
2. ＩＦＮ−αの量と炎症性サイトカインの量を、ＥＬＩＳＡまたは生物検定法を用いて培養上清から測定する、請求項１に記載の方法。
3. ＩＦＮ−αの量と炎症性サイトカインの量を、ドットブロット法、ウエスタンブロット法、ノーザンブロット法、ＲＰＡ、およびＲＴ−ＰＣＲからなる群より選ばれた方法を用いて、前記集団中の細胞から測定する、請求項１に記載の方法。
4. 前記炎症性サイトカインがＴＮＦ−αまたはＩＬ−１２である請求項１に記載の方法。
5. 前記細胞集団が全血中のものである請求項１に記載の方法。
6. 前記細胞集団が末梢血単核細胞を含んでいる請求項１に記載の方法。
7. 前記細胞集団が、少なくとも５％のｐＤＣ細胞を含有している末梢血単核細胞の分画を含んでいる、請求項１に記載の方法。
8. 前記細胞集団を、約０．００５〜５μＭの範囲の濃度の前記試験化合物に接触させる、請求項１に記載の方法。
9. 前記細胞集団を、約１２〜３６時間の間、前記試験化合物を加えて培養する、請求項１に記載の方法。
10. 前記細胞集団がＣＤ１４＋細胞型を含んでいる請求項１に記載の方法。
11. 前記炎症性サイトカインがＴＮＦ−αであり、前記ＣＤ１４＋細胞によって産生されるＴＮＦ−αの量は、前記試験化合物が１μＭの濃度で前記細胞集団と接触したときには検出不可能である、請求項１０に記載の方法。
12. ｐＤＣ２細胞からのＩＦＮ−αの産生を選択的に誘導する化合物の同定方法であって、
    − 炎症性サイトカイン産生細胞とｐＤＣ２細胞の両方を含む細胞集団を取得することと、
    − 前記細胞集団を試験化合物に接触させることと、
    − 前記集団中に存在するｐＤＣ２細胞を同定し、ＩＦＮ−αがｐＤＣ２細胞によって産生されることをフローサイトメトリーで判別することと、
    − 前記細胞集団中での炎症性サイトカインの産生をフローサイトメトリーで判別することと、
    − ｐＤＣ２細胞以外の前記集団中に存在するすべての細胞で産生される炎症性サイトカインがわずかなレベルである場合に、前記試験化合物をＩＦＮ−αの選択誘導物質として同定することとを含む、化合物の同定方法。
13. ｐＤＣ２細胞の同定が、ｐＤＣ２細胞の表面上にＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ１２３細胞表面マーカーが存在するかどうかで行われる、請求項１２に記載の方法。
14. 前記炎症性サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、および／またはＩＬ−１である、請求項１２に記載の方法。
15. 前記細胞集団が全血中のものである請求項１２に記載の方法。
16. 前記細胞集団が末梢血単核細胞を含んでいる請求項１２に記載の方法。
17. 前記細胞集団が末梢血単核細胞の分画を含んでいる請求項１２に記載の方法。
18. 前記細胞集団を、約０．００５〜５μＭの範囲の濃度の前記試験化合物に接触させる、請求項１２に記載の方法。
19. 前記細胞集団を、約２〜２４時間の間、前記化合物で培養する、請求項１２に記載の方法。
20. ＩＦＮ−αに反応する患者の病気に影響を及ぼす方法であって、
    − 炎症性サイトカイン産生細胞とｐＤＣ２細胞の両方を含む細胞集団を取得することと、
    − 前記細胞集団を試験化合物に接触させることと、
    − 前記試験化合物に接触させた前記細胞集団中に存在するＩＦＮ−αの量を測定することと、
    − 前記試験化合物に接触させた前記細胞集団中に存在する炎症性サイトカインの量を測定することと、
    − 前記試験化合物との接触後にＩＦＮ−αが、前記細胞集団中に存在する炎症性サイトカインの量よりも少なくとも３倍の量だけ前記細胞集団中に存在する場合に、前記試験化合物をＩＦＮ−αの選択誘導物質として同定することと、
    − 前記同定済み選択化合物を患者に投与して患者の病気に影響を及ぼすことからなるステップを含む、病気に影響を及ぼす方法。
21. ＩＦＮ−αの量と炎症性サイトカインの量を、ＥＬＩＳＡまたは生物検定法を用いて培養上清から測定する、請求項２０に記載の方法。
22. ＩＦＮ−αの量と炎症性サイトカインの量を、ドットブロット法、ウエスタンブロット法、ノーザンブロット法、ＲＰＡ、およびＲＴ−ＰＣＲからなる群より選ばれた方法を用いて、前記集団中の細胞から測定する、請求項２０に記載の方法。
23. 前記炎症性サイトカインがＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１を含んでいる、請求項２０に記載の方法。
24. 前記細胞集団が全血中のものである請求項２０に記載の方法。
25. 前記細胞集団が末梢血単核細胞を含んでいる請求項２０に記載の方法。
26. 前記細胞集団が末梢血単核細胞の分画を含んでいる請求項２０に記載の方法。
27. 前記細胞集団を、約０．００５〜５μＭの範囲の濃度の前記試験化合物と接触させる、請求項２０に記載の方法。
28. 前記細胞集団を、約１２〜３６時間の間、前記試験化合物を加えて培養する、請求項２０に記載の方法。
29. 前記細胞集団がＣＤ１４＋細胞型またはＤＣ１細胞型を含んでいる請求項２０に記載の方法。
30. 前記炎症性サイトカインがＴＮＦ−αであり、前記ＣＤ１４＋またはＤＣ１細胞によって産生されるＴＮＦ−αの量は、前記試験化合物が約１μＭの濃度で前記細胞と接触しているときには検出不可能である、請求項２９に記載の方法。
31. 前記病気が、黒色腫、骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、腎細胞癌、カポジ肉腫、多発性硬化症、好酸球増加症候群、筋増殖性疾患、特発性骨髄線維症、Ｂ型肝炎と慢性Ｃ型肝炎、天然痘、インフルエンザ、パラインフルエンザ、アデノウイルス、コロナウイルス、およびライノウイルスからなる群より選ばれる、請求項２０に記載の方法。
32. 前記病気が、皮膚壊死性脈管炎、混合性クリオグロブリン血症、晩発性皮膚ポルフィリン症、扁平苔癬、アダマンティアディス−ベーチェット症候群、多形性紅斑、結節性紅斑、マラコプラキア、じんま疹、およびそう痒症からなる群より選ばれる、請求項３１に記載の方法。
33. 前記選択化合物が、標的部分によって所望の細胞型へ届けられる、請求項２０に記載の方法。
34. ｐＤＣ２細胞を含んでいる細胞集団からＩＦＮ−αの産生を選択的に誘導する方法であって、前記細胞集団を、ｐＤＣ２細胞によるＩＦＮ−αの産生を選択的に誘導する免疫応答変更因子化合物と接触させることを含む、選択的に誘導する方法。
35. 前記化合物が化合物Ｉである請求項３４に記載の方法。
36. 前記化合物が化合物ＩＩである請求項３４に記載の方法。
37. 前記化合物が化合物ＩＩＩである請求項３４に記載の方法。
38. 前記化合物が化合物ＩＶである請求項３４に記載の方法。
39. 前記化合物が化合物Ｖである請求項３４に記載の方法。
40. 前記化合物が化合物ＶＩである請求項３４に記載の方法。