JP2005500340A - Composition for delivery for therapy and method of use thereof - Google Patents

Abstract

The present invention relates to compositions and methods for treating infections and genetic diseases by gene therapy and intracellular delivery of antisense oligonucleotides or other nucleic acid sequences. The present invention relates to the treatment of pathological conditions comprising an administrable mixture of an effective amount of a therapeutic compound capable of modifying the function of a nucleic acid sequence and a block copolymer having the general formula: Wherein the average total molecular weight of the portion of the octablock copolymer represented by polyoxypropylene is between about 5000 and about 7000 Daltons, and a is Such that the portion represented by polyoxyethylene comprises between about 10% and about 40% by weight of the compound, and b is the polyoxypropylene portion of the total molecular weight of the octablock copolymer of the compound Of about 30-60% by weight to about 90% by weight. The present invention also includes compositions and methods that employ biologically active reverse block copolymers.

Description

【００１６】
式中、ａは、（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）で示される疎水性部分が、約７５０から約１５，０００の間、好ましくは約２，２５０から約１５，０００の間、より好ましくは約３，２５０から約１５，０００の間の分子量を持つような整数であり、そしてｂは、（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）で示される親水性部分がこの化合物の約１重量％から約５０重量％、好ましくは約５重量％から約２０重量％を占めるような整数である。
【００１７】
本発明の別の側面は、式のポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンのリバース・トリブロック共重合体をもまた含む、本発明の界面活性を有する非イオン性ブロック共重合体を含有する。
【化２】

【００１８】
式中、“ｂ”は疎水性の（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂの分子量が約２，０００から２０，０００の間となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａのパーセンテージが約２％から３０％の間となるような数を示す。
【００１９】
本発明の界面活性を有する非イオン性ブロック共重合体の別の実施形態は、式のポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンのリバース・トリブロック共重合体を含む。
【化３】

【００２０】
式中、“ｂ”は疎水性の（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂの分子量が約２，５００から８，５００の間となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａのパーセンテージが約７％から２３％の間となるような数を示す。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態は、式のポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンのリバース・トリブロック共重合体を含む。
【化４】

【００２２】
式中、“ｂ”は疎水性の（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂの分子量が約３，０００から７，０００の間となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａのパーセンテージが約８％から２０％の間となるような数を示す。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態は、式のポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンのリバース・トリブロック共重合体を含む。
【化５】

【００２４】
式中、“ｂ”は疎水性の（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂの分子量が約５，０００から６，０００の間となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａのパーセンテージが約１４％から１６％の間となるような数を示す。
【００２５】
一般的に、“ａ”は親水性の（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａのパーセンテージが約５％から３０％の間となるような数を示し、約７％から２３％となる範囲が好ましく、８％から２０％の間となる範囲が最も好ましい。
【００２６】
別の側面において、本発明は、有効量の、核酸配列の機能を改変する能力を有する治療用化合物と、親水性のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）及び疎水性のポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）との共重合体を含有する、有効量の、生物活性を有する共重合体との、投与可能な混合物を含有する、病態を治療するのに有効な、治療のための送達用組成物を含む。ブロック共重合体は、開始剤の四官能性エチレンジアミンを基礎として構築される。生物活性を有する本発明の共重合体の好ましい実施形態において、生物活性を有する本発明の共重合体を含むブロック共重合体は次の一般式を有する。
【化６】

【００２７】
式中：
ポリオキシプロピレン（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（ＰＯＰ）からなる、オクタブロック共重合体の疎水性部分の平均総分子量は、約５，０００から７，０００ダルトンの間であり；
ａは、ポリオキシエチレン（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（ＰＯＥ）で示される親水性部分がこの化合物の総分子量の約１０％から４０％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体のポリオキシプロピレン（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（ＰＯＰ）部分がこの化合物の総分子量の約６０％から９０％の間を占めるような数である。
【００２８】
本発明の別の側面において、生物活性を有する共重合体は、開始剤のエチレンジアミンを基礎として構築される、親水性のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）の重合体を含む。次いで、疎水性のポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）の重合体を親水性のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）のブロックに添加する。この結果、次の一般式を有するオクタブロック共重合体が得られる。
【化７】

【００２９】
式中：
ａは、ポリオキシエチレン（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（ＰＯＥ）で示される親水性部分がこの化合物の総分子量の約１０％から４０％を占めるような数であり；
ポリオキシプロピレン（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（ＰＯＰ）からなるオクタブロック共重合体の疎水性部分の平均総分子量は、約５，０００から７，０００ダルトンの間であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体のポリオキシプロピレン（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（ＰＯＰ）部分がこの化合物の総分子量の約６０％から９０％の間を占めるような数である。
【００３０】
特に有用な組成物は、遺伝子の発現および／またはタンパク質の翻訳を改変する能力を有する化合物、たとえば核酸、ベクター構築物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖ＤＮＡ化合物、リボザイム、またはその他の核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物と、上記のブロック共重合体、上記のオクタブロック共重合体、またはそれらの組み合わせのいずれかとの混合物である。
【００３１】
経皮、経口、経粘膜、皮下注射、静脈注射、腹腔内注射および筋肉注射などの多数の経路によって本発明の組成物を投与することが可能であるが、局所的な経路に限定されるものではない。
【００３２】
したがって、本発明の目的は、治療用薬物送達手段を提供することである。
【００３３】
本発明の別の目的は、治療剤と混合した場合に、一種以上の治療用核酸配列の機能改変薬剤を、食細胞などの細胞の内部に送達することを促進する組成物を提供することである。
【００３４】
本発明の別の目的は、一旦細胞内に送達された薬剤と相乗的に作用する組成物を提供することである。
【００３５】
本発明のさらに別の目的は、核酸配列および核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物が細胞の原形質膜を横切って透過することおよび導入されることを促進する、界面活性を有する非イオン性ブロック共重合体およびオクタブロック共重合体を提供することである。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、核酸配列およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを、非イオン性ブロック共重合体、オクタブロック共重合体、またはそれらの組み合わせと組み合わせて用いることによる、遺伝病および生理的障害を治療するための組成物および方法を提供することである。
【００３７】
本発明の別の目的は、核酸またはベクター構築物を用いて、遺伝子の発現を操作するのに有用な組成物および方法を提供することである。
【００３８】
本発明のさらに別の目的は、ＤＮＡワクチンを提供することである。
【００３９】
本発明の目的の一つは、感染症を患う患者の治療に用いることが可能な組成物を提供することである。
【００４０】
本発明のさらに別の目的は、ヒトまたは動物におけるウイルス感染の治療方法を提供することである。
【００４１】
本発明の別の目的は、動物およびヒトの両方においてウイルスの複製を阻害するのに有効な化合物および方法である。
【００４２】
本発明の別の目的は、ＨＩＶならびにその他のＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスの複製を阻害するのに有効な化合物および方法を提供することである。
【００４３】
本発明のさらに別の目的は、ヒトまたは動物における微生物感染の治療方法を提供することである。
【００４４】
本発明の別の目的は、ヒトまたは動物に注入する前に血液製剤中のウイルスを不活性化することである。
【００４５】
本発明のこれらのおよびその他の目的、特徴ならびに利点は、開示された実施形態についての次の詳細な説明と添付の請求の範囲を検討した後に明らかとなるだろう。
【００４６】
詳細な説明
本発明は、非イオン性ブロック共重合体、オクタブロック共重合体、またはそれらの組み合わせと、核酸配列または核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物との混合物である遺伝子治療用組成物、ならびに遺伝子の発現および／またはタンパク質の翻訳をその細胞内で改変するために必要とする場合に、ヒトまたは動物にこれらの組成物を送達する方法を含む。
【００４７】
ポリオキシエチレンのパーセンテージが小さいポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体、ブロック共重合体、およびそれらの組み合わせが、ＤＮＡおよびその他の化合物の細胞内への輸送を促進し、したがって、それらが、病気を治療するために治療剤をインビボで細胞内に送達するのに有用であることが、思いがけなく見出された。ブロック共重合体およびオクタブロック共重合体の両者は、膜を再閉鎖することに特に有用であると考えられ、したがって、この両者によって、核酸配列またはその他の化合物が細胞内に導入されている細胞の生存率が増加すると考えられる。驚いたことに、本発明の非イオン性ブロック共重合体および／またはオクタブロック共重合体と核酸配列とを含有する組成物は、核酸配列のみの場合よりもＤＮアーゼによる分解作用の影響を受けにくいことも、見出されている。
【００４８】
本発明はさらに、微生物を死滅させるか、または微生物の増殖を阻害する治療用組成物および方法、ならびに、核酸配列の発現または機能を改変する治療用組成物および方法をも含む。本発明が有効な細菌の一例としては、マイコバクテリア種、たとえば、マイコバクテリウム・ツベルクロシス、マイコバクテリウム・アビウム、およびマイコバクテリウム・レプレなどがある。本発明が有効なその他の微生物には、クラミジア・トラコマチス、クラミジア・ニューモニエ、リステリア・モノサイトゲネス、カンジダ・アルビカンス、クリプトコックス・ネオフォルマンス、トキソプラズマ・ゴンディ、ニューモシスティス・カリニ、単純ヘルペスウイルス１型、サイトメガロウイルス、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルス、ならびに呼吸器合胞体ウイルスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
本発明は、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスならびに感染、ならびに、ＨＩＶもしくはヘルペスまたはそれらの抗原的に関連する系統によって引き起こされる感染症を含む、このようなウイルスによってヒトまたは動物において引き起こされる感染症を治療するための治療用組成物ならびに治療方法を含む。抗原的に関連する系統は、ＨＩＶに対して特異的な抗体と交差反応する系統である。当業者であれば、抗−ＨＩＶ抗体と分析対象のウイルス系統とを用いる標準的な免疫測定試験を行い、そして交差反応性が陽性のものを探索することによって、ＨＩＶと抗原的に関連するウイルス系統を容易に割り出すことが可能である。本明細書で開示される、界面活性を有する共重合体および／またはオクタブロック共重合体を含有する治療用組成物は、細胞内のそのようなウイルスの複製の阻害または抑制に効果的である。
【００５０】
本発明は、抗菌剤の送達や病態の治療に有用な治療用組成物を含み、この治療用組成物は、界面活性を有する非イオン性ブロック共重合体もしくはオクタブロック共重合体、またはそれらの組み合わせと核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物との混合物を含有し、そして抗生物質または治療用薬物をさらに含有しうる。核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物の例としては、核酸、発現ベクターまたは機能を有する核酸配列を含むベクターなどのベクター構築物、遺伝子、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖ＤＮＡ化合物、およびリボザイムが挙げられる。
【００５１】
本発明の非イオン性共重合体と一緒に用いることが可能な薬物としては、リファンピン、イソニアジド、エタンブトール、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、ピラジナミド、ストレプトマイシン、クロファジミン、リファブチン、オフロキサシンおよびスパルフロキサシンなどのフルオロキノロン類、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ダプソン、ドキシサイクリン、シプロフロキサシン、アンピシリン、アンホテリシンＢ、フルコナゾール、ケトコナゾール、フルコナゾール、ピリメタミン、スルファジアジン、クリンダマイシン、アジスロマイシン、パロマイシン、ジクラザリル、クラリスロマイシン、アトバコン、ペンタミジン、アシクロビル、トリフルオロウリジン、ＡＺＴ、ＤＤＩ、ＤＤＣ、およびその他の抗ウイルス性ヌクレオシド類似体、ホスカネット、ガンシクロビル、ウイルスプロテアーゼ インヒビター、アンチセンスおよびその他の修飾オリゴヌクレオチド、ならびにリバビリンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
種々の感染性微生物について用いられる好ましい薬物を表１に記載する。
【表１】

【００５３】
随意に、界面活性剤および低分子量のアルコールは、抗菌剤と非イオン性ブロック共重合体、ブロック共重合体、またはそれらの組み合わせとの治療用混合物に添加される。本発明において有用な界面活性剤の例としては、Ｔｗｅｅｎ８０ならびにリン脂質などの脂肪酸、コール酸塩およびアミノ酸を伴うエマルジョンが挙げられる。好ましい界面活性剤はＴｗｅｅｎ８０である。界面活性剤は、約０.１％から約５％ｖ／ｖの範囲の濃度で、混合物に添加される。界面活性剤の好ましい濃度は、約２％である。本明細書において濃度の表示に適用される「約」という用語は、記載された濃度±１０％という意味である。「低分子量のアルコール」という用語は、２から８の炭素を有するアルコールという意味である。本発明において有用である低分子量のアルコールの一例はエタノールであり、エタノールは低分子量のアルコールとして好ましい。低分子量のアルコールは、約０.５％から約５％ｖ／ｖの範囲の濃度で、混合物に添加される。低分子量のアルコールの好ましい濃度は、約１％から約３％ｖ／ｖの間である。
【００５４】
本発明はさらに、動物またはヒトの免疫化、別の表現ではＤＮＡワクチンの接種のための組成物および方法をも含む。免疫化は、発現物中に含まれる免疫化対象の遺伝子産物をコードする遺伝子を含有する組成物を、細胞膜を横切る遺伝物質の取り込みを助長し促進させるブロック共重合体と組み合わせて投与することによって、成し遂げられる。導入される遺伝子が発現すると、抗原性遺伝子産物が産生する。
【００５５】
さらに、非イオン性ブロック共重合体、オクタブロック共重合体、またはそれらの組み合わせと、ガンを死滅させるか、縮小させるかまたはガンの成長を妨げるのに有効な化合物、たとえばリンホカイン類などをコードする遺伝子とを含有する組成物を、ガンの治療のためにヒトまたは動物に投与してもよい。
【００５６】
本発明は、好ましくは次の一般式を有するエチレンオキシド−プロピレンオキシド縮合生成物である、界面活性を有する共重合体を含む。
【化８】

【００５７】
式中、ａは、（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）で示される疎水性部分が約７５０から約２０，０００の間の分子量を持つような整数であり、そしてｂは、（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）で示される親水性部分がこの化合物の約１重量％から約５０重量％を占めるような整数である。
【００５８】
本発明はさらに、有効量の、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその他の核酸配列と、有効量の、次の一般式を有する非イオン性ブロック共重合体との投与可能な混合物を含有する、遺伝子の発現および／またはタンパク質の翻訳の改変に有用な、治療のための送達用組成物をも含む。
【化９】

【００５９】
式中、ａは、（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）で示される疎水性部分が約７５０から約２０，０００の間、好ましくは約２，２５０から約１５，０００の間、より好ましくは約３，２５０から約１５，０００の間、最も好ましくは約１０，０００から約１５，０００の間の分子量を持つような整数である。そしてｂは、（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）で示される親水性部分がこの化合物の約１重量％から約５０重量％、好ましくは約５％から約２０％を占めるような整数である。本明細書で用いられる混合物という用語は、治療用薬物と非イオン性ブロック共重合体とのあらゆる組み合わせを意味し、共重合体ミセル中の薬物の溶液、懸濁液、またはカプセル封入体も含まれる。有効量とは、活性を改変させるのに十分な量および／またはヒトまたは動物の内部で調節しようとする単数または複数の遺伝子によって産生する遺伝子産物の量である。
【００６０】
本発明はまた、有効量の発現ベクターと、発現ベクター内に含まれる、免疫化対象の遺伝子産物をコードする遺伝子と、有効量の、次の一般式を有する非イオン性ブロック共重合体との投与可能な混合物を含有する、特定の遺伝子産物に対して動物またはヒトを免疫化するのに有用な、治療のための送達用組成物をも含む。
【化１０】

【００６１】
式中、ａは、（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）で示される疎水性部分が約７５０から約２０，０００の間、好ましくは約２，２５０から約１５，０００の間、より好ましくは約３，２５０から約１５，０００の間、そして最も好ましくは約１０，０００から約１５，０００の間の分子量を持つような整数である。そしてｂは、（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）で示される親水性部分がこの化合物の約１重量％から約５０重量％、好ましくは約５％から約２０％を占めるような整数である。有効量とは、ヒトまたは動物に投与される核酸配列の遺伝子産物に対して免疫応答を惹起するのに十分な量である。
【００６２】
本発明の界面活性を有する非イオン性ブロック共重合体は、次の式を有するポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンのリバース・トリブロック共重合体を含む。
【化１１】

【００６３】
式中、“ｂ”は疎水性の（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂの分子量が、約７５０から約２０，０００の間、好ましくは約２，２５０から約１５，０００の間、より好ましくは約３，２５０から約１５，０００の間、好ましくは２，０００および１０，０００、そして好ましくは約１０，０００から約１５，０００の間となるような数を示す。そして“ａ”は親水性の（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａのパーセンテージが約２％から３０％の間となるような数を示す。
【００６４】
本発明の界面活性を有する非イオン性ブロック共重合体の別の実施形態は、次の式を有するポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンのリバース・トリブロック共重合体を含む。
【化１２】

【００６５】
式中、“ｂ”は疎水性の（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂの分子量が約２，５００から８，５００の間となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａのパーセンテージが約７％から２３％の間となるような数を示す。
【００６６】
本発明のさらに別の実施形態は、次の式を有するポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンのリバース・トリブロック共重合体を含む。
【化１３】

【００６７】
式中、“ｂ”は疎水性の（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂの分子量が約３，０００から７，０００の間となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａのパーセンテージが約８％から２０％の間となるような数を示す。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態は、次の式を有するポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンのリバース・トリブロック共重合体を含む。
【化１４】

【００６９】
式中、“ｂ”は疎水性の（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂの分子量が約５，０００から６，０００の間となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａのパーセンテージが約１４％から１６％の間となるような数を示す。
【００７０】
一般的に、“ａ”は親水性の（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａのパーセンテージが約５％から３０％の間となるような数を示し、約７％から２３％となる範囲が好ましく、８％から２０％の間となる範囲が最も好ましい。
【００７１】
ブロック共重合体について記述される分子量の範囲とパーセンテージの範囲は外側の範囲を考慮することになっていること、および記載された範囲内に含まれる分子の任意の集団は本発明の一つの実施形態であるとみなされることを理解すべきである。
【００７２】
ブロック共重合体の分子全体は、水への溶解性が不十分であり、そして実質的に非イオン性である。構成成分の化学的性質よりも、むしろこの分子の立体配置および生理化学的特性の方が、抗感染活性および治療のための送達活性の主な原因であると考えられる。本発明の組成物は水溶液、懸濁液または水中油型エマルジョンなどのエマルジョンを含むが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
重合体のブロックは、高温・高圧、触媒の存在下でエチレンオキシドとプロピレンオキシドとが縮合することによって、形成される。それぞれの共重合体において結合して重合体鎖を形成するモノマー単位の数が統計的に異なるものがいくつか存在する。与えられた分子量は、それぞれの調製品における共重合体分子の平均分子量の概算値であり、そしてこの与えられた分子量は測定の方法論および用いられる目盛標準に左右される。プロピレンオキシドとエチレンオキシドとのブロックは純粋でなくてもよいことを理解すべきである。全体的な物理化学的特性が実質的に変化しない限り、少量の他の材料を混合することも可能である。これらの生成物の調製に関するより詳細な考察は、米国特許第２、６７４、６１９号に見出され、その全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【００７４】
本発明において用いてもよいエチレンオキシド−プロピレンオキシド縮合生成物は、表２に含まれる。これらの化合物は、本発明を実施するために用いることが可能な化合物の単なる代表例に過ぎないこと、そして、本発明を実施するために用いることが可能な、考えられるすべての化合物が含まれているわけではないことを理解すべきである。表２に記載の、ＢＡＳＦ社の商品名が無い高分子量の共重合体は、以前に合成されたことがない新規組成物である。
【表２】

【００７５】
疎水性部分の分子量と親水性部分のパーセントに基づく、本発明が含む共重合体の範囲を図解し、そして選択された非イオン性ブロック共重合体を示すグリッドを、図１として表す。重合体のブロックは、高温・高圧、触媒の存在下でエチレンオキシドとプロピレンオキシドとが縮合することによって、形成される。それぞれの共重合体において結合して重合体鎖を形成するモノマー単位の数が統計的に異なるものがいくつか存在する。与えられた分子量は、それぞれの調製品における共重合体分子の平均サイズの概算値である。これらのブロック共重合体の調製についてのさらなる説明は、米国特許第２、６７４、６１９号に見出される（“Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｌｏｃｋ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ”、Ｓｃｈｍｏｌｋａ Ｉ.Ｒ.、Ｊ.Ａｍ.Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ Ｓｏｃ.、５４:１１０〜１１６（１９７７年）、およびＢｌｏｃｋ ａｎｄ Ｇｒａｆｔ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、第２巻、Ｒ.Ｊ.Ｃｅｒｅｓａ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク、１９７６年、も参照）。
【００７６】
治療のための送達用薬剤として特に効果的な共重合体は図２および図３に示されるものであることが分かった。図２および図３から明らかなように、治療のための送達用薬剤として最も効果的な共重合体は、高分子量かつＰＯＥのパーセンテージが小さいもの、一般的には２０％未満のＰＯＥである。
【００７７】
非イオン性ブロック共重合体は、それらの臨界ミセル濃度より高濃度で上記のミセルを形成する。この非イオン性共重合体は、溶解性の負の温度係数を有する。低温では、水分子の運動エネルギーが減少してＰＯＰブロックの酸素と弱い水素結合を形成する。疎水性物質のこのような水和によって、低温での溶解が促進される。温度を高めて「曇点」に到達すると、増加した水の運動エネルギーによって水素結合が切断されて、重合体が不溶化し、ミセルが形成される。
【００７８】
生物活性を有する本発明のオクタブロック共重合体には、四つの疎水性部分とわずかな割合の親水性部分とを有する、界面活性を有する化合物が含まれる。典型的な例は、八つの部分を有するもの、すなわち、疎水性または親水性のいずれかの中心構造からなるコアと親水性または疎水性の外部構造を備えたオクタブロック構造を有するものである。
【００７９】
分子全体は、水への溶解性が不十分であり、そして非イオン性界面活性剤またはわずかに陽イオン性の界面活性剤のいずれかである。構成成分の化学的性質よりも、むしろこの分子の立体配置および生理化学的特性の方が、共重合体の生物学的効果の原因であると考えられる。
【００８０】
本発明のオクタブロック共重合体は、開始剤のアルキレンジアミンを基礎として構築されるポリオキシプロピレンとポリオキシエチレンとのブロックを含む。ポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）とポリオキシエチレン（ＰＯＥ）とのブロックは、次の構造を有する。
【化１５】

【化１６】

【００８１】
重合体のブロックは、高温・高圧、塩基性触媒の存在下、開始剤の四官能性エチレンジアミンにエチレンオキシドとプロピレンオキシドとが縮合することによって、形成される。それぞれの共重合体において結合して重合体鎖を形成するモノマー単位の数が統計的に異なるものがいくつか存在する。与えられた分子量は、それぞれの調製品における共重合体分子の平均分子量の概算値である。これらのブロック共重合体の調製についてのさらなる説明は、米国特許第２、６７４、６１９号および米国特許第２、９７９、５２８号に見出される（“Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｌｏｃｋ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ”、Ｓｃｈｍｏｌｋａ Ｉ.Ｒ.、Ｊ.Ａｍ.Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ Ｓｏｃ.、５４:１１０〜１１６（１９７７年）、およびＢｌｏｃｋ ａｎｄ Ｇｒａｆｔ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、第２巻、Ｒ.Ｊ.Ｃｅｒｅｓａ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク、１９７６年も参照）。
【００８２】
生物活性を有する本発明のオクタブロック共重合体の一つの側面において、ブロック共重合体には、開始剤のエチレンジアミンを基礎として構築される疎水性のポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）の重合体が含まれる。次いで、親水性のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）の重合体は、疎水性のポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）のブロックを基礎として、構築される。この結果、次の一般式を持つオクタブロック共重合体が得られる。
【化１７】

【００８３】
式中：
ポリオキシプロピレン（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（ＰＯＰ）からなるオクタブロック共重合体の疎水性部分の平均総分子量は、約５，０００から７，０００ダルトンの間であり；
ａは、ポリオキシエチレン（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（ＰＯＥ）で示される親水性部分がこの化合物の総分子量の約１０％から４０％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体のポリオキシプロピレン（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（ＰＯＰ）部分がこの化合物の総分子量の約６０％から９０％の間を占めるような数である。
【００８４】
本発明の別の側面において、オクタブロック共重合体には、開始剤のエチレンジアミンを基礎として構築される、親水性のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）の重合体が含まれる。次いで、疎水性のポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）の重合体は、親水性のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）のブロックを基礎として、構築される。この結果、次の一般式を持つリバース・オクタブロック共重合体が得られる。
【化１８】

【００８５】
式中：
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレン（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（ＰＯＰ）からなる疎水性部分の分子量は約５，０００から７，０００ダルトンの間であり；
ａは、ポリオキシエチレン（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（ＰＯＥ）で示される親水性部分がこの化合物の総分子量の約１０％から４０％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体のポリオキシプロピレン（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（ＰＯＰ）部分がこの化合物の総分子量の約６０％から９０％の間を占めるような数である。
【００８６】
このタイプの重合体は、その構造が、両端をポリオキシエチレン（ＰＯＥ）のブロックで挟まれた、中心部にポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）を有するオクタブロック共重合体と逆になっているので、リバース共重合体と呼ばれている。
【００８７】
共重合体の（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）部分は、最大でオクタブロック共重合体の９５％まで占めることが可能である。共重合体の（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）部分は、オクタブロック共重合体の５％ほどを占めることが可能である。
【００８８】
生物活性を有する本発明の共重合体を含むオクタブロック共重合体には、ＢＡＳＦ社（ＢＡＳＦ社、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）が製造するブロック共重合体のＴｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）およびリバースのＴｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらのものは：
ａは、ポリオキシエチレン（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（ＰＯＥ）で示される親水性部分がこの化合物の総分子量の約５％から２０％を占めるような数であり；
ｂは、オクタブロック共重合体のポリオキシプロピレン（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（ＰＯＰ）部分がこの化合物の約８０％から９５％の間を占めるような数である、共重合体を含む。
【００８９】
生物活性を有する好ましい共重合体は、オクタブロック共重合体Ｔ１１０Ｒ１（ＢＡＳＦ社、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）であり、これは次の式に該当する。
【化１９】

【００９０】
式中、
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレン（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（ＰＯＰ）で示される疎水性部分の平均分子量は約５，２２０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレン（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（ＰＯＥ）で示される親水性部分がこの化合物の約１０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体のポリオキシプロピレン（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（ＰＯＰ）部分がこの化合物の約９０重量％を占めるような数である。
【００９１】
生物活性を有する好ましい共重合体は、オクタブロック共重合体Ｔ１３０Ｒ２（ＢＡＳＦ社、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）であり、これは次の式に該当する。
【化２０】

【００９２】
式中：
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレン（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（ＰＯＰ）で示される疎水性部分の平均分子量は約５，７５０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレン（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（ＰＯＥ）で示される親水性部分がこの化合物の約２０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体のポリオキシプロピレン（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（ＰＯＰ）部分がこの化合物の約８０重量％を占めるような数である。
【００９３】
生物活性を有する本発明の共重合体の別の好ましい実施形態は、Ｔ１５０１（ＢＡＳＦ社、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）で表される化合物であり、これは次の式に該当する。
【化２１】

【００９４】
式中：
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレン（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（ＰＯＰ）で示される疎水性部分の平均分子量は約６，７５０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレン（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（ＰＯＥ）で示される親水性部分がこの化合物の約１０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体のポリオキシプロピレン（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（ＰＯＰ）部分がこの化合物の約９０重量％を占めるような数である。
【００９５】
生物活性を有する本発明の共重合体の最も好ましい実施形態は、オクタブロック共重合体Ｔ１５０Ｒ１（ＢＡＳＦ社、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）であり、これは次の式に該当する。
【化２２】

【００９６】
式中：
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレン（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（ＰＯＰ）で示される疎水性部分の平均分子量は約６，７５０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレン（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（ＰＯＥ）で示される親水性部分がこの化合物の約１０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体のポリオキシプロピレン（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（ＰＯＰ）部分がこの化合物の約９０重量％を占めるような数である。
【００９７】
本発明はまた、有効量の発現ベクターと、発現ベクター内に含まれる、免疫化対象の遺伝子産物をコードする遺伝子と、有効量の本発明のオクタブロック共重合体との投与可能な混合物を含有する、特定の遺伝子産物に対して動物またはヒトを免疫化するのに有用な、治療のための送達用組成物をも含む。
【００９８】
本発明はまた、有効量の発現ベクターと、発現ベクター内に含まれる、免疫化対象の遺伝子産物をコードする遺伝子と、有効量の本発明のオクタブロック共重合体との投与可能な混合物を含有する、特定の遺伝子産物に対して動物またはヒトを免疫化するのに有用な、治療のための送達用組成物をも含む。
【００９９】
本発明のオクタブロック共重合体は、その生物活性を含めて、米国特許第５、４９４、６６０号でさらに考察されており、その全体は引用により本明細書に取り込まれる。
【０１００】
したがって、本発明の非イオン性ブロック共重合体およびオクタブロック共重合体の両者（自身が治療用のものである）を含む共重合体は、追加される別個の治療剤を組み合わせることまたは装填することを可能なものとする、物理的構造を形成することができる。したがって、本発明の非イオン性ブロック共重合体およびオクタブロック共重合体を治療用薬物送達手段として用いることが可能である。治療用薬物と非イオン性ブロック共重合体およびオクタブロック共重合体との混合物は、少なくとも二種の治療剤の相乗的な活性という利点を有する。さらに、特定の治療用薬物と一緒に用いるために、特定の特徴を有する共重合体を選択することも可能である。たとえば、疎水性のＣＲＬ−８１３１は、リファンピンなどの疎水性の抗生物質について優れた担体である。しかしながら、本発明にしたがうことによって、際立って疎水性ではないその他の薬剤を用いることも可能である。
【０１０１】
本発明の界面活性を有する非イオン性ブロック共重合体および／またはオクタブロック共重合体の任意のものを、種々の抗菌剤の任意のものと組み合わせて用いて、治療のための送達手段を調製する。一つの実施形態において、約３％から約５％の濃度のＣＲＬ−８１３１は、治療のための送達手段を構築するために用いられる。ＣＲＬ−８１３１よりも親水性が強い共重合体を用いて作られた、治療のための送達手段は通常、より高濃度（約５％から約１０％）の共重合体を必要とする。
【０１０２】
共重合体に基づいたミセルを治療用薬物送達手段として用いることは、ミセルが、マクロファージ内、ＨＩＶおよびその他のウイルスの感染部位ならびにウイルス療法の主な標的にすぐに集まり、そして長期間そこに存在することから、とりわけ望ましい。このような治療用共重合体に基づく治療用組成物の例としては、２％のＴｗｅｅｎ８０および１％のエタノールと組み合わせたＣＲＬ−８１３１、ならびに１％のＴｗｅｅｎ８０および５％のエタノールと組み合わせたＣＲＬ−８１４２が挙げられる。
【０１０３】
核酸配列またはその他の核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物をヒトまたは動物に投与して、遺伝子発現の改変および／または遺伝子産物の量もしくは活性の変更を行う。たとえば、上記の共重合体のいずれかまたは両方と混合されたアンチセンスオリゴヌクレオチドによって、遺伝子の発現および／またはタンパク質の翻訳を改変するかまたは調節することを目的とする、アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達に有用な組成物が得られる。さらに、不具合のある遺伝子を置換するかまたは増加させて染色体の中に組み込む、遺伝子などの核酸配列を投与することも可能である。あるいは、細胞内に投与される遺伝子が細胞内に留まって、染色体外の構成要素において発現しうる。
【０１０４】
本発明はまた、動物またはヒトを免疫化するための新規な組成物および方法をも提供する。この組成物は、発現ベクターと、発現ベクター内に含まれる、免疫化対象の遺伝子産物をコードする遺伝子と、ブロック共重合体とを含有し、非イオン性ブロック共重合体、オクタブロック共重合体、またはそれらの組み合わせを含むものであり、発現ベクターなどの遺伝物質を細胞膜を横切って移動させるのに効果的である。動物またはヒトを免疫化するための方法には、発現ベクターを含有する共重合体組成物を動物またはヒトに投与することが含まれる。好ましい投与方式は、腹腔内注射によるものである。本発明のこの実施形態によって、インビボまたはエクスビボのいずれかでのヒトまたは動物内へのその後の再導入を伴う、ヒトの細胞または動物細胞内に抗原性遺伝子産物を直接発現させる能力を有する遺伝子配列を送達するための手段が提供される。一旦細胞内に導入されると、抗原性遺伝子産物の産生によって、導入された遺伝子産物に対するヒトまたは動物による免疫応答が惹起され、それが維持される。
【０１０５】
次の特定の実施例によって、本発明の種々の側面、たとえば、遺伝子治療に有用な本発明の組成物および方法、ならびに遺伝子が介在する免疫化に有用な本発明の組成物および方法が説明される。当業者にとってはその他の実施形態および使用は明らかであろうこと、および本発明はこれらの特定の実施例には制限されないことを理解すべきである。
【０１０６】
実施例１
ＣＲＬ−８１３１などの界面活性を有する非イオン性ブロック共重合体のうちの任意のものを、核酸配列の機能を改変する能力を有する種々の化合物のうちの任意のものと組み合わせることによって、治療のための送達手段を調製する。ＣＲＬ−８１３１に関しては、治療用手段を構築するためには、３から５％ｗ／ｖの濃度が望ましい。より親水性が強い共重合体に関しては、５から１０％ｗ／ｖの濃度が望ましい。
【０１０７】
３００ｍｇのＣＲＬ−８１３１を、１０ｍｌの０.９％のＮａＣｌに添加し、そして清澄な溶液となるまで２〜４℃の温度で保管することによって、この混合物を可溶化する。核酸遺伝子の機能を改変する能力を有する化合物の適切な量をこの混合物に添加し、そして、温度を５℃より高い温度に上昇させ、およびミセルの懸濁液を平衡化させることによって、共重合体とこの化合物とが会合してなるミセルが形成される。この平衡化懸濁液は投与に適している。
【０１０８】
たとえば、Ｍａｔｓｕｋａｒａ、Ｍ.ら、Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ８４:７７０６〜７７１０（１９８７年）によって開示されたもの（その全体が引用により本明細書に明白に取り込まれる）のうちの一つなどの、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、共重合体と組み合わされて、ミセル組成物を生ずる。
【０１０９】
概要を述べれば、配列５’−ＴＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＴＣＧ−３’を有するＨＩＶのａｒｔ/ｔｒｓ遺伝子の領域に相補的な配列のホスホロチオエート誘導体またはメチルホスホナート誘導体を、Ｍａｔｓｕｋｕｒａらの方法にしたがって調製する。３００ｍｇのＣＲＬ−８１３１を、１０ｍｌの０.９％のＮａＣｌに添加し、そして清澄な溶液となるまで２〜４℃の温度で保管することによって、この混合物を可溶化する。次いで、所望のアンチセンスオリゴヌクレオチドを共重合体溶液と混合させて、ＨＩＶウイルスに感染した患者に投与した場合にウイルス活性を阻害するのに効果的な濃度のものを提供する。一般的に、アンチセンス化合物の有効量は、血液中の最終濃度が１μＭから１００μＭの範囲となるような量であろう。しかしながら、アンチセンス化合物のこの範囲外の他の有効量が、ある特定のアンチセンス化合物について見出されうる。当業者であれば、Ｍａｔｓｕｋｕｒａらのインビボ試験にしたがって、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドの任意のものについての相対的な有効性を容易に試験することが可能である。
【０１１０】
平均的な人は約６.２５リットルの血液を有する。したがって、１ｍｌの注射にて投与する場合、組成物中に約６ｍＭから６００ｍＭの濃度のオリゴヌクレオチドが必要となる。投与量をさらに多くすることによって、用いるオリゴヌクレオチド組成物の量をより少なくすることが可能である。
【０１１１】
実施例２
実施例１の抗感染性アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物は、ウイルス活性を低減するのに効果的なあらゆる経路によってＨＩＶ患者に投与される。好ましい投与経路は静脈注射によるものである。このアンチセンス組成物を一日に複数回投与してもよく、それによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量が維持されることを確実にする。
【０１１２】
実施例３
不具合のある遺伝子または欠失した遺伝子の影響に苦しむ動物またはヒトを治療するための遺伝子治療用組成物を、ＣＲＬ−８１３１などの共重合体を不具合のある遺伝子の正常なコピーと組み合わせることによって作製する。たとえば、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症に苦しむ患者に関しては、アデノシンデアミナーゼ遺伝子の正常なコピーを含む遺伝子治療用組成物を作製する。上記の実施例１において記載されたようにして調製された共重合体を所望の遺伝子と混合することによって、この遺伝子治療用組成物を作製し、ヒトまたは動物から血液を除去し、ＡＤＡ遺伝子含有組成物を用いて血液細胞に形質導入し、そして形質導入された血液細胞をヒトまたは動物内へ再導入する。導入された遺伝子はインビボで発現し、もとの遺伝子欠損による影響が緩和される。
【０１１３】
実施例４
同様に、実施例３の遺伝子治療用組成物を、単離されたＴリンパ球と組み合わせて、ＡＤＡ遺伝子を含有するＴリンパ球を作製する。次いで、このＡＤＡ遺伝子含有Ｔリンパ球を、たとえば注射によって、アデノシンデアミナーゼ欠損症に苦しむ患者に投与する。投与された細胞はＡＤＡを発現して、アデノシンデアミナーゼを産生し、したがって、患者内でのこの酵素の供給量が増加し、欠乏状態が是正される。
【０１１４】
実施例５
ＤＮＡワクチンの接種は、基本的には実施例３または実施例４において遺伝子治療について記載されたようにして行う。ただし、宿主に導入される遺伝子は、宿主動物によって異物であると認識される抗原性遺伝子産物を発現するものであり、それゆえに免疫応答が惹起される。
【０１１５】
実施例６
形質導入の実験には、共重合体ＣＲＬ−８１３１と単純ヘルペスウイルス１型のｇＤ遺伝子を含む発現ベクターとを含有する組成物が用いられた。通常は、標準的な塩化カルシウム法やＤＥＡＥデキストラン沈殿法を用いて、ＤＮＡ形質導入を実行する。ＤＥＡＥデキストランは細胞膜を粗面にすることに用いられ、そしてカルシウムは細胞表面上にＤＮＡを沈殿させることに用いられ、その結果、細胞内へのＤＮＡの取り込みが促進される。しかしながら、この手法は一般的に細胞にとっては有毒であり、これによってかなりの数の細胞が死に至る。
【０１１６】
塩化カルシウムの代わりに本発明のブロック共重合体を用いるという、新規な形質導入システムを見出した。実際のところ、ＤＥＡＥデキストランが存在しない場合であってさえ、共重合体によって助力される形質導入が起こるということが、驚くべきことに発見された。
【０１１７】
ベロ細胞をＤＥＡＥデキストラン中で３０秒間インキュベートした。ＤＥＡＥデキストランの除去後、直ちに、共重合体と単純ヘルペスウイルス１型の糖タンパク質ｇＤのＤＮＡを含有する発現ベクターとの混合物をベロ細胞に添加した。ｇＤ遺伝子によって、最大で４０％までの細胞が効果的に形質導入を受けたことが分かった。
【０１１８】
驚いたことに、ＤＥＡＥデキストランのインキュベート工程を省略した場合でさえ、四例の実験のうちの二例において、共重合体は、４０％未満の効率でベロ細胞に形質導入することができた。
【０１１９】
実施例７
ブロック共重合体が、インビボにて細胞膜を横切って遺伝物質を移動させることに効果的であるという、その他の研究も実証されてきた。ＤＮＡワクチンによって惹起される免疫化は、共重合体と組み合わされた、単純ヘルペスウイルス１型のｇＤ遺伝子を含有する発現ベクターを、ウサギの腹腔内に二週間ごとに注射した場合、成功した。血清を回収し、そして抗−ｇＤ抗体が存在するかどうかについて試験を行った。このやり方で注射の四週間後に、低濃度の抗−ｇＤ抗体が検出された。これらの結果から、共重合体送達手段と一緒に腹腔内に投与された遺伝物質は、インビボにて細胞に取り込まれ、そしてその遺伝物質が発現して免疫応答を惹起させるのに十分な量の遺伝子産物を生じさせることが、実証される。
【０１２０】
実施例８
ＤＮアーゼに対する防御実験。五種の異なる化合物（ＣＲＬ１１２２、３３６２、３６３２、９３５２、および８１３１）を用いて、防御の程度を試験する実験を行った。４℃にてＤＮＡを化合物と混合し、そして１５分後に３７℃でＤＮアーゼＩ（１０ｍｇ／ｍｌ溶液の１μｌ）を添加した。３７℃でのインキュベーションを３０分間した後、プロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ溶液の３μｌ）で処理することによってＤＮアーゼＩを除去した。コントロールは、ＤＮアーゼＩがあって非イオン性ブロック共重合体がないものと、ＤＮＡのみがあってあらゆるＤＮアーゼＩによる処理を行わないもの、であった。
【０１２１】
非イオン性ブロック共重合体が存在したサンプルのすべてにおいて、ＤＮアーゼＩによる分解からＤＮＡが防御された。ＤＮＡを最も強く防御したのは、ＣＲＬ−３３６２および８１３１を伴うものであった。ＤＮＡ・共重合体組成物は、水平型アガロース電気泳動において移動せず、ウェル内に留まっていた（臭化エチジウムによる染色）。ＤＮアーゼＩの作用に対する効果的な防御は、１体積量のＤＮＡ溶液（１μｇ／ｍｌ）に対して５体積量の非イオン性ブロック共重合体（３０μｇ／ｍｌ）からなる溶液において、達成された。防御の推定値は実験ごとに変化し、総ＤＮＡの１５〜４０％の範囲内であると推定された。
【０１２２】
追加的な実験から、カルシウム法では、ＤＮＡ−共重合体化合物は大腸菌のコンピテント細胞を形質転換できないことが示された。また、フェノールは、ＤＮＡと分離している非イオン性ブロック共重合体を、溶解できなかった。５体積量のイソプロピルアルコールを添加することによって、ＮＢＣに結合したＤＮＡを沈殿させることが可能である。
【０１２３】
実施例９
形質導入実験。ヘルペスウイルスの糖タンパク質遺伝子およびその他の対象の遺伝子を一時的に発現させるための典型的な形質導入実験には、次の手法を必要とした。ＣＯＳ（アフリカザル腎臓細胞；ＣＶ１）などの細胞を６ウェルのプレート上に播種する。細胞が５０〜８０％コンフルエント（まだ対数増殖期の状態）となった時点で、形質導入を実行する。最初に細胞をＰＢＳバッファで洗浄し、これらの細胞を、０.５ｍｌのＤＥＡＥデキストラン溶液（５００ｍｇ／ｍｌ）で１〜２分間インキュベートする。この溶液を吸引し、そしてＤＮＡの沈殿物を細胞に添加する。形質導入するＤＮＡをＣａＣｌ_２と一緒に、ｐＨがコントロールされた条件で室温にて３０分間混合し、純度の高い沈殿物を作製する。この溶液を１ｍｌの増殖培地（ＤＭＥＭ）と混合し、そして細胞上に３７℃で４時間接触させる。この時点で、１５％のグリセロールによって細胞にショックを与え、次いでＰＢＳにて洗浄する。この浸透圧ショックによって、ＣａＣｌ_２−ＤＮＡ沈殿物の細胞内への取り込みが促進される。次いで、細胞をＰＢＳにて再び洗浄し、そして増殖培地と一緒に、３７℃で４８時間インキュベートする。
【０１２４】
遺伝子の発現は、発現タンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体を用いる多くの場合において、間接免疫蛍光法を利用して検出される。この発現タンパク質を放射性トレーサーで標識したり、免疫沈降させたり、またはウエスタンブロット法で検出することも可能である。
【０１２５】
２５μｌのＤＮＡ（７μｇ）および２５μｌの非イオン性ブロック共重合体（３０μｇ／ｍｌ）を用いた。さらに、氷冷して非イオン性ブロック共重合体をＤＮＡと混合し、そして細胞に混合物を添加すると、これらを別個に添加した場合（すなわち、ＤＮＡを最初に添加し、次に非イオン性ブロック共重合体を添加した場合）と同様の結果が生じた。
【０１２６】
共重合体１１８３、１１８７、８１３１、１２３５、８９５０ＡＱおよび１１９０ＡＱ（ここで、ＡＱとは、非イオン性ブロック共重合体が１:１０に希釈され、その２５μｌを用いたことを指す）。代表的な結果は次の通りである。ＤＮＡのみ、デキストランのみ、共重合体のみ、およびＤＮＡ＋デキストランによる形質導入は、０.２％未満という無視できる程度の形質導入であった。対照的に、ＤＮＡ＋デキストラン＋グリセロールというポジティブコントロールでは２％の形質導入であるのに対して、表３に示すように、種々の共重合体＋ＤＮＡでは、このコントロールよりも最大で２.５倍まで高い程度にてＤＮＡを細胞内に形質導入することに成功した。
【表３】

【０１２７】
弱い毒性を伴う１１８７以外に、毒性を伴う共重合体は存在しなかった。その他のものは、特にグリセロール処理の後で毒性を示した。
【０１２８】
上記の内容は本発明の好ましい実施形態に関することのみであること、ならびに添付の請求の範囲に記述された本発明の精神および範囲を逸脱することなく、無数の変更および改変がなされ得ることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１は、疎水性部分の分子量と親水性部分％とによってブロック共重合体を説明するグリッドである。
【図２】図２は、疎水性部分の分子量と親水性部分％とによって、好ましい治療のための送達用ブロック共重合体を説明するグリッドである。
【図３】図３は、疎水性部分の分子量と親水性部分％とによって、より好ましい治療のための送達用ブロック共重合体を説明するグリッドである。【Technical field】
[0001]
The present invention relates to compositions and methods for treating infections and genetic diseases by gene therapy and intracellular delivery of nucleic acids.
[Background]
[0002]
A number of new and potentially useful technologies have been developed, and such technologies will form the basis for future medical therapeutics and therapies. Examples of such techniques include gene replacement, antisense gene therapy, triplex gene therapy, and ribozyme based therapies. However, to be successful, these techniques require effective means for delivering therapeutic agents across cell membranes, nuclear membranes and microbial membranes.
[0003]
Recent developments in technology and our ability to understand the structure and function of many genes have made it possible to selectively abolish or modify the activity of a given gene. It is possible to modify the activity of a gene by a number of methods. For example, it has been shown that oligonucleotides complementary to a specific genetic message or viral sequence (known as “antisense” compounds) have an inhibitory effect on the virus. By creating an antisense compound that hybridizes with the targeted RNA message of a cell or virus, it is possible to prevent or prevent translation of that message into a protein. In this way, the activity of the gene can be regulated.
[0004]
The ability to inactivate specific genes provides a great therapeutic benefit. For example, it is theoretically possible to combat viral disease using antisense RNA molecules and antisense DNA molecules that locate and destroy viral gene products. In tissue culture, antisense oligonucleotides inhibit infection by human immunodeficiency virus causing herpes virus, influenza virus and AIDS. It may also be possible to target antisense oligonucleotides against mutated oncogenes. Antisense technology also holds the potential to control growth and proliferation. However, for gene therapy to work, the therapeutic antisense compound must be delivered across the plasma membrane of the cell to the cytosol.
[0005]
Gene activity is also modified using sense DNA in a technique known as gene therapy. By administering a “good” or normal gene that is not the subject of the defect, the defective gene is replaced or supplemented. An administered normal gene that may be inserted into a chromosome or present in extracellular DNA produces normal RNA, which in turn results in normal gene products. In this way, defects and deficiencies in the production of gene products will be corrected. In addition, gene therapy may increase the amount of normal gene replacement in the cell. For example, one method has been proposed to combat HIV by introducing into a T cell of an infected person a gene that confers resistance to HIV infection in the cell. This form of gene therapy is sometimes referred to as “intracellular immunization”. Genetic material such as a polynucleotide may be administered to a mammal to elicit an immune response against the gene product of the administered nucleic acid sequence. Such a genetic vaccine elicits an immune response as follows. First, the nucleic acid sequence is administered to a human or animal. The administered sequence is then expressed to form a gene product within the human or animal. This gene product inside a human or animal is recognized as foreign and the human or animal immune system initiates an immune response against the gene product. However, this approach is not currently feasible because there is no effective gene delivery system that facilitates the delivery of genetic material across both the cell and nuclear membranes.
[0006]
Finally, gene therapy can be used as a method of delivering drugs in vivo. For example, if a gene encoding a therapeutic compound can be delivered to endothelial cells, it will facilitate the gene product to reach the bloodstream. Currently, genes are delivered to cells ex vivo and then reintroduced into animals.
[0007]
Using retroviral vectors, it is possible to deliver the gene to the isolated cells ex vivo, which is then infused back into the patient. However, retroviral vectors have several drawbacks, such as being able to deliver genes only to dividing cells, random integration of delivered genes, the possibility of unnecessary gene modifications, and There is a possibility of returning to the form of a wild-type retrovirus with infectivity. Another drawback of antisense gene therapy is that it has efficacy at the level of messenger RNA, which means that antisense oligonucleotides are administered in an amount that interacts with all or a significant number of mRNAs in the cytosol. This means that it must be introduced and that such treatment is effective only when mRNA is being actively synthesized. Furthermore, in order to be effective for a long time, the oligonucleotide must be maintained at such a high level during mRNA synthesis.
[0008]
The newly developed “triple DNA” technology is an improved example of gene regulation. Triplex DNA technology utilizes oligonucleotides and compounds that specifically bind to specific regions of double-stranded DNA. Thereby, the target gene is inactivated. One advantage of triplex DNA technology is that only one copy of the oligonucleotide or compound is required to alter the expression of the gene. This is because binding occurs at the DNA level, not the mRNA level. However, in triplex DNA technology, oligonucleotides or compounds are incorporated not only into the cell membrane, but also into the microbial membrane when treating microbial infections, or into the function of eukaryotic genes or chromosomal DNA. The modification of exogenous DNA expression has the disadvantage that it must pass through the nuclear membrane.
[0009]
Another new technology relates to the use of ribozymes for therapeutic purposes for the treatment of genetic diseases. A ribozyme is a catalytic RNA molecule composed of a hybridization region and an enzyme region. The ribozyme will be used in the future to specifically bind to the target region of the nucleic acid sequence and to cleave or otherwise modify the sequence to alter its expression or translation into a gene product. May be manipulated automatically.
[0010]
Accordingly, there is an urgent need to improve systems that deliver genetic material that can be used for gene therapy, such as genes, polynucleotides, and antisense oligonucleotides. More specifically, there is a need for non-toxic compositions with surface activity that can facilitate the transport of genetic compounds and other drugs and therapeutic compounds across cell membranes.
[0011]
About effective treatment of acquired immunodeficiency syndrome (disease caused by human retrovirus, human immunodeficiency virus or human T-cell leukemia virus type III (HTLV-III), also called HIV), AIDS There are particularly urgent requests. Like other retroviruses, HIV has ribonucleic acid or RNA as its genetic material. When a virus enters a host cell, a viral enzyme called reverse transcriptase assembles the corresponding DNA molecule using the viral RNA as a template. This DNA moves through the cell nucleus and inserts itself into the host chromosome. It provides the foundation for virus replication.
[0012]
In the case of HIV, host cells are often T4 lymphocytes (white blood cells that have a major and regulatory role in the immune system). Once inside T4 cells, the virus seems to continue to incubate until lymphocytes are immunostimulated by secondary infection. The virus then rapidly replicates itself, killing or rendering the host cell dead. The resulting depletion of T4 cells and loss of activity make patients susceptible to “opportunistic” infections with pathogens that do not normally harm healthy people. The virus can also damage the host through a number of other mechanisms.
[0013]
At present, a number of therapies are being studied to combat AIDS infection. Some of these investigational therapies are based on interfering with the reverse transcriptase when assembling viral DNA that is designed to make the reverse transcriptase a virus. Drugs used for this purpose are chemical analogues of nucleic acids that form subunits of DNA. When this analog is given to infected cells, the analog will be incorporated into the growing DNA strand by reverse transcriptase. However, the chain terminates because the analog lacks the correct point of attachment for the next subunit. Because the truncated DNA cannot integrate itself into the host chromosome, ie, cannot provide a basis for viral replication, the spread of infection stops. One compound that is thought to function by mimicking nucleotides is azidothymidine, or AZT. However, AZT is known to have serious side effects and its efficacy in alleviating AIDS disease is questioned. If improved means and methods are available to deliver therapeutic agents to the site of infection, the efficacy of AZT and other antiviral drugs and antimicrobial agents could be improved.
[0014]
Summary of the Invention
The present invention provides a method of delivering a therapeutic drug to a human or animal to treat a disease state, such as, but not limited to, bacterial infections, infections with HIV and other DNA and RNA viruses Including. In particular, the present invention relates to compositions and methods for treating infections and genetic diseases by gene therapy and intracellular delivery of antisense oligonucleotides or other nucleic acid sequences.
[0015]
The present invention allows administration of an effective amount of a therapeutic compound having the ability to alter the function of a nucleic acid sequence and an effective amount of a nonionic block copolymer having surface activity and having the general formula A therapeutic delivery composition containing the mixture and effective to treat a condition is included.
[Chemical 1]

[0016]
Where a is (C₃H₆The hydrophobic moiety represented by O) has a molecular weight between about 750 and about 15,000, preferably between about 2,250 and about 15,000, more preferably between about 3,250 and about 15,000. And an integer such that b is (C₂H₄An integer such that the hydrophilic moiety represented by O) comprises from about 1% to about 50%, preferably from about 5% to about 20% by weight of the compound.
[0017]
Another aspect of the present invention comprises the nonionic block copolymer having surface activity of the present invention, which also comprises a polyoxypropylene / polyoxyethylene reverse triblock copolymer of the formula.
[Chemical 2]

[0018]
In the formula, “b” is hydrophobic (C₃H₆O)_bThe molecular weight of which is between about 2,000 and 20,000, and “a” is hydrophilic (C₂H₄O)_aIs a number that is between about 2% and 30%.
[0019]
Another embodiment of the surfactant nonionic block copolymer of the present invention comprises a polyoxypropylene / polyoxyethylene reverse triblock copolymer of the formula.
[Chemical 3]

[0020]
In the formula, “b” is hydrophobic (C₃H₆O)_bIs a number such that the molecular weight is between about 2,500 and 8,500, and “a” is hydrophilic (C₂H₄O)_aIs a number that is between about 7% and 23%.
[0021]
Yet another embodiment of the present invention comprises a polyoxypropylene / polyoxyethylene reverse triblock copolymer of the formula.
[Formula 4]

[0022]
In the formula, “b” is hydrophobic (C₃H₆O)_bIs a number such that the molecular weight is between about 3,000 and 7,000, and "a" is hydrophilic (C₂H₄O)_aIs a number that is between about 8% and 20%.
[0023]
A preferred embodiment of the present invention comprises a polyoxypropylene / polyoxyethylene reverse triblock copolymer of the formula.
[Chemical formula 5]

[0024]
In the formula, “b” is hydrophobic (C₃H₆O)_bIs a number such that the molecular weight is between about 5,000 and 6,000, and “a” is hydrophilic (C₂H₄O)_aIs a number that is between about 14% and 16%.
[0025]
In general, “a” is hydrophilic (C₂H₄O)_aIs a number such that the percentage is between about 5% and 30%, with a range between about 7% and 23% being preferred, and a range between 8% and 20% being most preferred.
[0026]
In another aspect, the present invention provides a co-treatment of an effective amount of a therapeutic compound capable of altering the function of a nucleic acid sequence with hydrophilic polyoxyethylene (POE) and hydrophobic polyoxypropylene (POP). A therapeutic delivery composition effective for treating a disease condition comprising an administrable mixture of an effective amount of a bioactive copolymer containing a polymer. Block copolymers are built on the basis of the initiator tetrafunctional ethylenediamine. In a preferred embodiment of the copolymer of the invention having biological activity, the block copolymer comprising the copolymer of the invention having biological activity has the following general formula:
[Chemical 6]

[0027]
In the formula:
Polyoxypropylene (C₃H₆O)_bThe average total molecular weight of the hydrophobic portion of the octablock copolymer consisting of (POP) is between about 5,000 and 7,000 daltons;
a is polyoxyethylene (C₂H₄O)_aA number such that the hydrophilic moiety denoted (POE) accounts for about 10% to 40% of the total molecular weight of the compound; and
b is an octablock copolymer polyoxypropylene (C₃H₆O)_bNumbers such that the (POP) moiety occupies between about 60% and 90% of the total molecular weight of the compound.
[0028]
In another aspect of the invention, the biologically active copolymer comprises a polymer of hydrophilic polyoxyethylene (POE) constructed on the basis of the initiator ethylenediamine. A polymer of hydrophobic polyoxypropylene (POP) is then added to the block of hydrophilic polyoxyethylene (POE). As a result, an octablock copolymer having the following general formula is obtained.
[Chemical 7]

[0029]
In the formula:
a is polyoxyethylene (C₂H₄O)_aSuch that the hydrophilic moiety represented by (POE) accounts for about 10% to 40% of the total molecular weight of the compound;
Polyoxypropylene (C₃H₆O)_bThe average total molecular weight of the hydrophobic portion of the octablock copolymer consisting of (POP) is between about 5,000 and 7,000 daltons; and
b is an octablock copolymer polyoxypropylene (C₃H₆O)_bNumbers such that the (POP) moiety occupies between about 60% and 90% of the total molecular weight of the compound.
[0030]
Particularly useful compositions are those that have the ability to alter gene expression and / or protein translation, such as nucleic acids, vector constructs, antisense oligonucleotides, triplex DNA compounds, ribozymes, or other nucleic acid sequence functions. It is a mixture of a compound having the ability to modify and any one of the above block copolymer, the above octa block copolymer, or a combination thereof.
[0031]
The composition of the present invention can be administered by a number of routes such as transdermal, oral, transmucosal, subcutaneous injection, intravenous injection, intraperitoneal injection and intramuscular injection, but is limited to the local route is not.
[0032]
Accordingly, it is an object of the present invention to provide a therapeutic drug delivery means.
[0033]
Another object of the present invention is to provide a composition that, when mixed with a therapeutic agent, facilitates delivery of one or more therapeutic nucleic acid sequence function-modifying agents into the interior of a cell, such as a phagocytic cell. is there.
[0034]
Another object of the present invention is to provide compositions that act synergistically with drugs once delivered intracellularly.
[0035]
Yet another object of the present invention is to provide non-ionic surfactants that promote nucleic acid sequences and compounds that have the ability to alter the function of nucleic acid sequences to permeate and be introduced across the plasma membrane of cells. It is to provide a functional block copolymer and an octablock copolymer.
[0036]
A further object of the present invention is to treat genetic diseases and physiological disorders by using nucleic acid sequences and antisense oligonucleotides in combination with nonionic block copolymers, octablock copolymers, or combinations thereof. It is to provide a composition and method for the above.
[0037]
Another object of the present invention is to provide compositions and methods useful for manipulating gene expression using nucleic acid or vector constructs.
[0038]
Yet another object of the present invention is to provide a DNA vaccine.
[0039]
One of the objects of the present invention is to provide a composition that can be used to treat a patient suffering from an infection.
[0040]
Yet another object of the present invention is to provide a method for the treatment of viral infections in humans or animals.
[0041]
Another object of the invention is compounds and methods effective to inhibit viral replication in both animals and humans.
[0042]
Another object of the present invention is to provide compounds and methods that are effective in inhibiting the replication of HIV and other RNA and DNA viruses.
[0043]
Yet another object of the present invention is to provide a method for the treatment of microbial infections in humans or animals.
[0044]
Another object of the present invention is to inactivate viruses in blood products prior to injection into humans or animals.
[0045]
These and other objects, features and advantages of the present invention will become apparent after reviewing the following detailed description of the disclosed embodiments and the appended claims.
[0046]
Detailed description
The present invention relates to a composition for gene therapy which is a mixture of a nonionic block copolymer, an octablock copolymer, or a combination thereof and a compound having the ability to modify the function of a nucleic acid sequence or nucleic acid sequence, and It includes methods of delivering these compositions to humans or animals where gene expression and / or protein translation is required to modify within the cell.
[0047]
Polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymers, block copolymers, and combinations thereof with a low percentage of polyoxyethylene facilitate the transport of DNA and other compounds into the cells, so that they It has been unexpectedly found to be useful for delivering therapeutic agents into cells in vivo to treat disease. Both block copolymers and octablock copolymers are believed to be particularly useful for reclosing membranes, and therefore both allow cells into which nucleic acid sequences or other compounds have been introduced into the cell. It is thought that the survival rate increases. Surprisingly, a composition containing the nonionic block copolymer and / or octablock copolymer of the present invention and a nucleic acid sequence is more susceptible to degradation by DNase than the nucleic acid sequence alone. Difficult things have also been found.
[0048]
The invention further includes therapeutic compositions and methods for killing or inhibiting the growth of microorganisms, and therapeutic compositions and methods for altering the expression or function of nucleic acid sequences. Examples of bacteria for which the present invention is effective include mycobacterial species, such as Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium abium, and Mycobacterium repres. Other microorganisms in which the present invention is effective include Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Listeria monocytogenes, Candida albicans, Cryptocox neoformans, Toxoplasma gondii, Pneumocystis carini, Herpes simplex virus 1 Type, cytomegalovirus, type A and type B influenza virus, and respiratory syncytial virus, but are not limited to these.
[0049]
The present invention treats infections caused in humans or animals by such viruses, including DNA and RNA viruses and infections, and infections caused by HIV or herpes or their antigenically related strains Therapeutic compositions for the treatment as well as methods of treatment. Antigenically related strains are those that cross-react with antibodies specific for HIV. A person skilled in the art will carry out a standard immunoassay test using anti-HIV antibodies and the virus strain to be analyzed, and search for those that are positive for cross-reactivity, thereby antigenically related to HIV. The system can be easily determined. Therapeutic compositions containing surfactant and / or octablock copolymers disclosed herein are effective in inhibiting or suppressing the replication of such viruses in cells .
[0050]
The present invention includes therapeutic compositions useful for the delivery of antibacterial agents and the treatment of pathological conditions, the therapeutic compositions comprising nonionic block copolymers or octablock copolymers having surface activity, or their Contains a mixture of the combination and a compound having the ability to alter the function of the nucleic acid sequence, and may further contain antibiotics or therapeutic drugs. Examples of compounds having the ability to modify the function of nucleic acid sequences include nucleic acid, expression vectors or vector constructs such as vectors containing functional nucleic acid sequences, genes, oligonucleotides, antisense oligonucleotides, triplex DNA compounds, and Ribozymes can be mentioned.
[0051]
Drugs that can be used with the nonionic copolymers of the present invention include rifampin, isoniazid, ethambutol, gentamicin, tetracycline, erythromycin, pyrazinamide, streptomycin, clofazimine, rifabutin, ofloxacin, and sparfloxacin. Quinolones, azithromycin, clarithromycin, dapsone, doxycycline, ciprofloxacin, ampicillin, amphotericin B, fluconazole, ketoconazole, fluconazole, pyrimethamine, sulfadiazine, clindamycin, azithromycin, paromycin, diclazaryl, clarithromycin, atovacon, pentamidin , Acyclovir, trifluorouridine, AZT, DDI, DDC, and Other antiviral nucleoside analogs, foscarnet, ganciclovir, viral protease inhibitors, antisense and other modified oligonucleotides, as well as include ribavirin, but is not limited thereto.
[0052]
Preferred drugs used for various infectious microorganisms are listed in Table 1.
[Table 1]

[0053]
Optionally, a surfactant and a low molecular weight alcohol are added to the therapeutic mixture of the antimicrobial agent and the nonionic block copolymer, block copolymer, or combinations thereof. Examples of surfactants useful in the present invention include Tween 80 and emulsions with fatty acids such as phospholipids, cholate and amino acids. A preferred surfactant is Tween 80. Surfactant is added to the mixture at a concentration in the range of about 0.1% to about 5% v / v. A preferred concentration of surfactant is about 2%. As used herein, the term “about” as applied to concentration indications means the stated concentration ± 10%. The term “low molecular weight alcohol” means an alcohol having 2 to 8 carbons. An example of a low molecular weight alcohol useful in the present invention is ethanol, with ethanol being preferred as the low molecular weight alcohol. Low molecular weight alcohol is added to the mixture at a concentration ranging from about 0.5% to about 5% v / v. A preferred concentration of low molecular weight alcohol is between about 1% and about 3% v / v.
[0054]
The present invention further includes compositions and methods for immunization of animals or humans, in other words DNA vaccination. Immunization involves administering a composition containing a gene encoding a gene product to be immunized contained in an expression product in combination with a block copolymer that facilitates and facilitates the uptake of genetic material across the cell membrane. , Accomplished. When the introduced gene is expressed, an antigenic gene product is produced.
[0055]
In addition, it encodes non-ionic block copolymers, octablock copolymers, or combinations thereof and compounds that are effective in killing, shrinking or preventing cancer growth, such as lymphokines, etc. A composition containing the gene may be administered to a human or animal for the treatment of cancer.
[0056]
The present invention includes a copolymer having surface activity, preferably an ethylene oxide-propylene oxide condensation product having the general formula:
[Chemical 8]

[0057]
Where a is (C₃H₆O) is an integer such that the hydrophobic moiety represented by O) has a molecular weight between about 750 and about 20,000, and b is (C₂H₄An integer such that the hydrophilic moiety represented by O) comprises from about 1% to about 50% by weight of the compound.
[0058]
The invention further includes expression of a gene comprising an administrable mixture of an effective amount of an antisense oligonucleotide or other nucleic acid sequence and an effective amount of a nonionic block copolymer having the general formula: And / or therapeutic delivery compositions useful for altering protein translation.
[Chemical 9]

[0059]
Where a is (C₃H₆O) is preferably between about 750 and about 20,000, preferably between about 2,250 and about 15,000, more preferably between about 3,250 and about 15,000, most preferably Is an integer having a molecular weight between about 10,000 and about 15,000. And b is (C₂H₄An integer such that the hydrophilic moiety represented by O) comprises from about 1% to about 50% by weight of the compound, preferably from about 5% to about 20%. As used herein, the term mixture means any combination of therapeutic drug and nonionic block copolymer, including solutions, suspensions, or encapsulations of the drug in copolymer micelles. It is. An effective amount is an amount sufficient to alter activity and / or the amount of gene product produced by the gene or genes that are to be regulated within the human or animal.
[0060]
The present invention also includes an effective amount of an expression vector, a gene encoding a gene product to be immunized, contained in the expression vector, and an effective amount of a nonionic block copolymer having the following general formula: Also included are therapeutic delivery compositions useful for immunizing an animal or human against a particular gene product containing an administrable mixture.
Embedded image

[0061]
Where a is (C₃H₆The hydrophobic moiety represented by O) is between about 750 and about 20,000, preferably between about 2,250 and about 15,000, more preferably between about 3,250 and about 15,000, and most Preferably it is an integer having a molecular weight between about 10,000 and about 15,000. And b is (C₂H₄An integer such that the hydrophilic moiety represented by O) comprises from about 1% to about 50% by weight of the compound, preferably from about 5% to about 20%. An effective amount is an amount sufficient to elicit an immune response against the gene product of the nucleic acid sequence administered to a human or animal.
[0062]
The nonionic block copolymer having surface activity of the present invention includes a polyoxypropylene / polyoxyethylene reverse triblock copolymer having the following formula:
Embedded image

[0063]
In the formula, “b” is hydrophobic (C₃H₆O)_bHas a molecular weight of between about 750 and about 20,000, preferably between about 2,250 and about 15,000, more preferably between about 3,250 and about 15,000, preferably 2,000 and 10 , And preferably a number such that it is between about 10,000 and about 15,000. “A” is hydrophilic (C₂H₄O)_aIs a number such that the percentage is between about 2% and 30%.
[0064]
Another embodiment of the surfactant nonionic block copolymer of the present invention comprises a polyoxypropylene / polyoxyethylene reverse triblock copolymer having the formula:
Embedded image

[0065]
In the formula, “b” is hydrophobic (C₃H₆O)_bIs a number such that the molecular weight is between about 2,500 and 8,500, and “a” is hydrophilic (C₂H₄O)_aIs a number that is between about 7% and 23%.
[0066]
Yet another embodiment of the present invention comprises a polyoxypropylene / polyoxyethylene reverse triblock copolymer having the formula:
Embedded image

[0067]
In the formula, “b” is hydrophobic (C₃H₆O)_bIs a number such that the molecular weight is between about 3,000 and 7,000, and "a" is hydrophilic (C₂H₄O)_aIs a number that is between about 8% and 20%.
[0068]
A preferred embodiment of the present invention comprises a polyoxypropylene / polyoxyethylene reverse triblock copolymer having the formula:
Embedded image

[0069]
In the formula, “b” is hydrophobic (C₃H₆O)_bIs a number such that the molecular weight is between about 5,000 and 6,000, and “a” is hydrophilic (C₂H₄O)_aIs a number that is between about 14% and 16%.
[0070]
In general, “a” is hydrophilic (C₂H₄O)_aIs a number such that the percentage is between about 5% and 30%, with a range between about 7% and 23% being preferred, and a range between 8% and 20% being most preferred.
[0071]
The molecular weight ranges and percentage ranges described for block copolymers are intended to take into account the outer ranges, and any population of molecules contained within the stated ranges is one implementation of the present invention. It should be understood that it is considered a form.
[0072]
The entire molecule of the block copolymer is poorly soluble in water and is substantially nonionic. It is believed that the configuration and physiochemical properties of this molecule, rather than the chemical nature of the components, are the main cause of anti-infective activity and therapeutic delivery activity. The compositions of the present invention include, but are not limited to, aqueous solutions, suspensions or emulsions such as oil-in-water emulsions.
[0073]
The polymer block is formed by condensation of ethylene oxide and propylene oxide in the presence of a catalyst at high temperature and high pressure. There are several statistically different numbers of monomer units that combine to form polymer chains in each copolymer. The given molecular weight is an approximation of the average molecular weight of the copolymer molecules in each preparation, and this given molecular weight depends on the measurement methodology and the scale standard used. It should be understood that the block of propylene oxide and ethylene oxide need not be pure. It is possible to mix small amounts of other materials as long as the overall physicochemical properties do not change substantially. A more detailed discussion regarding the preparation of these products is found in US Pat. No. 2,674,619, which is incorporated herein by reference in its entirety.
[0074]
The ethylene oxide-propylene oxide condensation products that may be used in the present invention are included in Table 2. These compounds are merely representative of compounds that can be used to practice the invention, and include all possible compounds that can be used to practice the invention. It should be understood that it is not. The high molecular weight copolymers without the BASF brand name listed in Table 2 are novel compositions that have never been synthesized before.
[Table 2]

[0075]
A grid illustrating the range of copolymers encompassed by the present invention based on the molecular weight of the hydrophobic portion and the percent of the hydrophilic portion, and showing the selected nonionic block copolymer, is represented as FIG. The polymer block is formed by condensation of ethylene oxide and propylene oxide in the presence of a catalyst at high temperature and high pressure. There are several statistically different numbers of monomer units that combine to form polymer chains in each copolymer. The given molecular weight is an approximation of the average size of the copolymer molecules in each preparation. Further description of the preparation of these block copolymers can be found in US Pat. No. 2,674,619 (“A Review of Block Polymer Surfactants”, Schmolka IR, J. Am. Oil Chemist Soc. 54: 110-116 (1977), and Block and Graft Copolymerization, Volume 2, edited by R.J. Ceresa, John Wiley and Sons, New York, 1976).
[0076]
Copolymers that are particularly effective as therapeutic delivery agents have been found to be those shown in FIGS. As is apparent from FIGS. 2 and 3, the most effective copolymers as therapeutic delivery agents are those with a high molecular weight and a small percentage of POE, typically less than 20%.
[0077]
Nonionic block copolymers form the above micelles at concentrations higher than their critical micelle concentration. This nonionic copolymer has a soluble negative temperature coefficient. At low temperatures, the kinetic energy of water molecules decreases and forms weak hydrogen bonds with oxygen in the POP block. Such hydration of the hydrophobic material facilitates dissolution at low temperatures. When the temperature reaches the “cloud point” by increasing the temperature, hydrogen bonds are broken by the increased kinetic energy of water, the polymer is insolubilized, and micelles are formed.
[0078]
The octablock copolymer of the present invention having biological activity includes a compound having surface activity having four hydrophobic moieties and a small proportion of hydrophilic moieties. A typical example is one having eight parts, that is, having an octablock structure with a core consisting of either a hydrophobic or hydrophilic central structure and a hydrophilic or hydrophobic outer structure.
[0079]
The entire molecule is poorly soluble in water and is either a nonionic surfactant or a slightly cationic surfactant. It is believed that the configuration and physiochemical properties of this molecule, rather than the chemical nature of the constituents, are responsible for the biological effects of the copolymer.
[0080]
The octablock copolymer of the present invention comprises a block of polyoxypropylene and polyoxyethylene constructed on the basis of the initiator alkylene diamine. The block of polyoxypropylene (POP) and polyoxyethylene (POE) has the following structure.
Embedded image

Embedded image

[0081]
The polymer block is formed by the condensation of ethylene oxide and propylene oxide with the tetrafunctional ethylenediamine as an initiator in the presence of a basic catalyst at high temperature and high pressure. There are several statistically different numbers of monomer units that combine to form polymer chains in each copolymer. The given molecular weight is an approximation of the average molecular weight of the copolymer molecules in each preparation. Further description of the preparation of these block copolymers is found in US Pat. No. 2,674,619 and US Pat. No. 2,979,528 (“A Review of Block Polymer Surfactants”, Schmolka I.R. , J. Am. Oil Chemist Soc., 54: 110-116 (1977), and Block and Craft Copolymerization, Volume 2, edited by R. J. Ceresa, John Wiley and Sons, New York, 1976. ).
[0082]
In one aspect of the inventive octablock copolymer having biological activity, the block copolymer includes a polymer of hydrophobic polyoxypropylene (POP) constructed on the basis of the initiator ethylenediamine. . A polymer of hydrophilic polyoxyethylene (POE) is then built on the basis of a block of hydrophobic polyoxypropylene (POP). As a result, an octablock copolymer having the following general formula is obtained.
Embedded image

[0083]
In the formula:
Polyoxypropylene (C₃H₆O)_bThe average total molecular weight of the hydrophobic portion of the octablock copolymer consisting of (POP) is between about 5,000 and 7,000 daltons;
a is polyoxyethylene (C₂H₄O)_aA number such that the hydrophilic moiety denoted (POE) accounts for about 10% to 40% of the total molecular weight of the compound; and
b is an octablock copolymer polyoxypropylene (C₃H₆O)_bNumbers such that the (POP) moiety occupies between about 60% and 90% of the total molecular weight of the compound.
[0084]
In another aspect of the invention, the octablock copolymer includes a polymer of hydrophilic polyoxyethylene (POE) constructed on the basis of the initiator ethylenediamine. A polymer of hydrophobic polyoxypropylene (POP) is then built on the basis of blocks of hydrophilic polyoxyethylene (POE). As a result, a reverse octablock copolymer having the following general formula is obtained.
Embedded image

[0085]
In the formula:
Polyoxypropylene (C₃H₆O)_bThe molecular weight of the hydrophobic moiety consisting of (POP) is between about 5,000 and 7,000 daltons;
a is polyoxyethylene (C₂H₄O)_aA number such that the hydrophilic moiety denoted (POE) accounts for about 10% to 40% of the total molecular weight of the compound; and
b is an octablock copolymer polyoxypropylene (C₃H₆O)_bNumbers such that the (POP) moiety occupies between about 60% and 90% of the total molecular weight of the compound.
[0086]
This type of polymer has a structure opposite to that of an octablock copolymer having polyoxypropylene (POP) in the center, with both ends sandwiched between polyoxyethylene (POE) blocks. It is called a reverse copolymer.
[0087]
Copolymer (C₃H₆The O) portion can occupy up to 95% of the octablock copolymer. Copolymer (C₂H₄The O) portion can occupy as much as 5% of the octablock copolymer.
[0088]
Octablock copolymers, including the bioactive copolymers of the present invention, include block copolymers Tetronic (registered trademark) and reverse Tetronic (registered trademark) manufactured by BASF (BASF, Parsippany, NJ). However, it is not limited to these. These are:
a is polyoxyethylene (C₂H₄O)_aSuch that the hydrophilic moiety represented by (POE) accounts for about 5% to 20% of the total molecular weight of the compound;
b is an octablock copolymer polyoxypropylene (C₃H₆O)_bIncluding copolymers where the (POP) moiety is such that it accounts for between about 80% and 95% of the compound.
[0089]
A preferred copolymer having biological activity is the octablock copolymer T110R1 (BASF, Parsippany, NJ), which corresponds to the following formula:
Embedded image

[0090]
Where
Polyoxypropylene (C₃H₆O)_bThe average molecular weight of the hydrophobic moiety denoted (POP) is about 5,220 Daltons;
a is polyoxyethylene (C₂H₄O)_aSuch that the hydrophilic moiety represented by (POE) comprises about 10% by weight of the compound; and
b is an octablock copolymer polyoxypropylene (C₃H₆O)_bNumbers such that the (POP) moiety accounts for about 90% by weight of the compound.
[0091]
A preferred copolymer having biological activity is the octablock copolymer T130R2 (BASF, Parsippany, NJ), which corresponds to the following formula:
Embedded image

[0092]
In the formula:
Polyoxypropylene (C₃H₆O)_bThe average molecular weight of the hydrophobic moiety represented by (POP) is about 5,750 daltons;
a is polyoxyethylene (C₂H₄O)_aA number such that the hydrophilic moiety represented by (POE) comprises about 20% by weight of the compound; and
b is an octablock copolymer polyoxypropylene (C₃H₆O)_bNumbers such that the (POP) moiety accounts for about 80% by weight of the compound.
[0093]
Another preferred embodiment of the copolymer of the present invention having biological activity is a compound represented by T1501 (BASF, Parsippany, NJ), which corresponds to the following formula:
Embedded image

[0094]
In the formula:
Polyoxypropylene (C₃H₆O)_bThe average molecular weight of the hydrophobic moiety denoted (POP) is about 6,750 daltons;
a is polyoxyethylene (C₂H₄O)_aSuch that the hydrophilic moiety represented by (POE) comprises about 10% by weight of the compound; and
b is an octablock copolymer polyoxypropylene (C₃H₆O)_bNumbers such that the (POP) moiety accounts for about 90% by weight of the compound.
[0095]
The most preferred embodiment of the copolymer of the present invention having biological activity is the octablock copolymer T150R1 (BASF, Parsippany, NJ), which corresponds to the following formula:
Embedded image

[0096]
In the formula:
Polyoxypropylene (C₃H₆O)_bThe average molecular weight of the hydrophobic moiety denoted (POP) is about 6,750 daltons;
a is polyoxyethylene (C₂H₄O)_aSuch that the hydrophilic moiety represented by (POE) comprises about 10% by weight of the compound; and
b is an octablock copolymer polyoxypropylene (C₃H₆O)_bNumbers such that the (POP) moiety accounts for about 90% by weight of the compound.
[0097]
The present invention also includes an effective amount of an expression vector, an administrable mixture of the gene encoding the gene product to be immunized contained in the expression vector, and an effective amount of the octablock copolymer of the present invention. Also included are therapeutic delivery compositions useful for immunizing animals or humans against specific gene products.
[0098]
The present invention also includes an effective amount of an expression vector, an administrable mixture of the gene encoding the gene product to be immunized contained in the expression vector, and an effective amount of the octablock copolymer of the present invention. Also included are therapeutic delivery compositions useful for immunizing animals or humans against specific gene products.
[0099]
The octablock copolymers of the present invention, including their biological activity, are further discussed in US Pat. No. 5,494,660, which is hereby incorporated by reference in its entirety.
[0100]
Thus, a copolymer comprising both the non-ionic block copolymer and the octablock copolymer of the present invention (which is itself therapeutic) combines or loads an additional separate therapeutic agent. A physical structure can be formed that makes it possible. Therefore, the nonionic block copolymer and octablock copolymer of the present invention can be used as a therapeutic drug delivery means. Mixtures of therapeutic drugs with nonionic block copolymers and octablock copolymers have the advantage of synergistic activity of at least two therapeutic agents. In addition, it is possible to select copolymers having specific characteristics for use with specific therapeutic drugs. For example, hydrophobic CRL-8131 is an excellent carrier for hydrophobic antibiotics such as rifampin. However, in accordance with the present invention, it is possible to use other drugs that are not significantly hydrophobic.
[0101]
Use any of the surface-active nonionic block copolymers and / or octablock copolymers of the present invention in combination with any of a variety of antibacterial agents to prepare therapeutic delivery means To do. In one embodiment, a concentration of about 3% to about 5% of CRL-8131 is used to construct a delivery means for treatment. The therapeutic delivery means made with copolymers that are more hydrophilic than CRL-8131 usually require higher concentrations (from about 5% to about 10%) of the copolymer.
[0102]
The use of copolymer-based micelles as a therapeutic drug delivery means that micelles quickly gather and remain in macrophages, HIV and other viral infection sites and the main targets of viral therapy This is especially desirable. Examples of therapeutic compositions based on such therapeutic copolymers include CRL-8131 in combination with 2% Tween 80 and 1% ethanol, and CRL- in combination with 1% Tween 80 and 5% ethanol. 8142.
[0103]
A compound having the ability to alter the function of a nucleic acid sequence or other nucleic acid sequence is administered to a human or animal to alter gene expression and / or alter the amount or activity of a gene product. Delivery of antisense oligonucleotides intended to alter or regulate gene expression and / or protein translation by, for example, antisense oligonucleotides mixed with either or both of the above copolymers A useful composition is obtained. It is also possible to administer a nucleic acid sequence such as a gene that replaces or increases the defective gene and incorporates it into the chromosome. Alternatively, genes administered into cells can remain in the cell and be expressed in extrachromosomal components.
[0104]
The present invention also provides novel compositions and methods for immunizing animals or humans. This composition contains an expression vector, a gene encoding a gene product to be immunized, contained in the expression vector, and a block copolymer, a nonionic block copolymer, an octablock copolymer , Or combinations thereof, and is effective in moving genetic material such as expression vectors across the cell membrane. A method for immunizing an animal or human includes administering a copolymer composition containing the expression vector to the animal or human. A preferred mode of administration is by intraperitoneal injection. According to this embodiment of the invention, a gene sequence having the ability to directly express an antigenic gene product in a human or animal cell, with subsequent reintroduction into the human or animal either in vivo or ex vivo A means for delivering is provided. Once introduced into the cell, production of the antigenic gene product elicits and maintains an immune response by the human or animal against the introduced gene product.
[0105]
The following specific examples illustrate various aspects of the present invention, for example, the compositions and methods of the invention useful for gene therapy, and the compositions and methods of the invention useful for gene-mediated immunization. The It should be understood that other embodiments and uses will be apparent to those skilled in the art and that the present invention is not limited to these specific examples.
[0106]
Example 1
By combining any of the nonionic block copolymers having surface activity such as CRL-8131 with any of a variety of compounds having the ability to alter the function of the nucleic acid sequence, A delivery means for is prepared. For CRL-8131, a concentration of 3 to 5% w / v is desirable to establish therapeutic means. For more hydrophilic copolymers, a concentration of 5 to 10% w / v is desirable.
[0107]
The mixture is solubilized by adding 300 mg of CRL-8131 to 10 ml of 0.9% NaCl and storing at a temperature of 2-4 ° C. until a clear solution. By adding an appropriate amount of a compound having the ability to alter the function of the nucleic acid gene to this mixture and raising the temperature to above 5 ° C. and equilibrating the suspension of micelles, A micelle formed by association of the union with this compound is formed. This equilibrated suspension is suitable for administration.
[0108]
For example, one of those disclosed by Matsukara, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7706-7710 (1987), which is expressly incorporated herein by reference in its entirety. Antisense oligonucleotide sequences, such as one, are combined with the copolymer to produce a micelle composition.
[0109]
Briefly, a phosphorothioate derivative or methylphosphonate derivative of a sequence complementary to the region of the HIV art / trs gene having the sequence 5'-TCGTCGCTGTCTCG-3 'is prepared according to the method of Matsukura et al. The mixture is solubilized by adding 300 mg of CRL-8131 to 10 ml of 0.9% NaCl and storing at a temperature of 2-4 ° C. until a clear solution. The desired antisense oligonucleotide is then mixed with the copolymer solution to provide a concentration effective to inhibit viral activity when administered to a patient infected with HIV virus. In general, an effective amount of an antisense compound will be such that the final concentration in the blood will range from 1 μM to 100 μM. However, other effective amounts of antisense compounds outside this range can be found for a particular antisense compound. One skilled in the art can readily test the relative effectiveness of any of the specific antisense oligonucleotides according to the in vivo test of Matsukura et al.
[0110]
The average person has about 6.25 liters of blood. Therefore, when administered by injection of 1 ml, an oligonucleotide with a concentration of about 6 mM to 600 mM is required in the composition. By further increasing the dose, it is possible to reduce the amount of oligonucleotide composition used.
[0111]
Example 2
The anti-infective antisense oligonucleotide composition of Example 1 is administered to HIV patients by any route effective to reduce viral activity. The preferred route of administration is by intravenous injection. The antisense composition may be administered multiple times per day, thereby ensuring that an effective amount of antisense oligonucleotide is maintained.
[0112]
Example 3
Gene therapy composition for treating animals or humans suffering from the effects of defective or deleted genes by combining a copolymer such as CRL-8131 with a normal copy of the defective gene To do. For example, for patients suffering from adenosine deaminase (ADA) deficiency, a gene therapy composition comprising a normal copy of the adenosine deaminase gene is made. This gene therapy composition is made by mixing the copolymer prepared as described in Example 1 above with the desired gene, removing blood from humans or animals, and containing the ADA gene The composition is used to transduce blood cells, and the transduced blood cells are reintroduced into a human or animal. The introduced gene is expressed in vivo, mitigating the effects of the original gene defect.
[0113]
Example 4
Similarly, the gene therapy composition of Example 3 is combined with the isolated T lymphocytes to produce T lymphocytes containing the ADA gene. The ADA gene-containing T lymphocytes are then administered to patients suffering from adenosine deaminase deficiency, for example by injection. The administered cells express ADA and produce adenosine deaminase, thus increasing the supply of this enzyme within the patient and correcting the deficiency.
[0114]
Example 5
DNA vaccination is basically performed as described for gene therapy in Example 3 or Example 4. However, the gene introduced into the host expresses an antigenic gene product that is recognized as a foreign substance by the host animal, and therefore an immune response is elicited.
[0115]
Example 6
In the transduction experiment, a composition containing a copolymer CRL-8131 and an expression vector containing the herpes simplex virus type 1 gD gene was used. Usually, DNA transduction is performed using standard calcium chloride methods or DEAE dextran precipitation methods. DEAE dextran is used to roughen the cell membrane, and calcium is used to precipitate DNA on the cell surface, which promotes DNA uptake into the cell. However, this approach is generally toxic to cells, which causes a significant number of cells to die.
[0116]
We have discovered a novel transduction system that uses the block copolymer of the present invention in place of calcium chloride. In fact, it has been surprisingly discovered that transduction assisted by the copolymer occurs even in the absence of DEAE dextran.
[0117]
Vero cells were incubated in DEAE dextran for 30 seconds. Immediately after the removal of DEAE dextran, a mixture of the copolymer and an expression vector containing the herpes simplex virus type 1 glycoprotein gD DNA was added to Vero cells. It was found that up to 40% of cells were effectively transduced by the gD gene.
[0118]
Surprisingly, even when the DEAE dextran incubation step was omitted, in two of the four experiments, the copolymer was able to transduce Vero cells with an efficiency of less than 40%.
[0119]
Example 7
Other studies have also demonstrated that block copolymers are effective in moving genetic material across cell membranes in vivo. Immunization elicited by the DNA vaccine was successful when an expression vector containing the herpes simplex virus type 1 gD gene combined with a copolymer was injected into the peritoneal cavity of a rabbit every two weeks. Serum was collected and tested for the presence of anti-gD antibodies. In this manner, low concentrations of anti-gD antibody were detected 4 weeks after injection. From these results, the genetic material administered intraperitoneally with the copolymer delivery means is taken up by cells in vivo and is in an amount sufficient to express the genetic material and elicit an immune response. Producing gene products is demonstrated.
[0120]
Example 8
Protection experiment against DNase. Experiments were conducted to test the degree of protection using five different compounds (CRL 1122, 3362, 3632, 9352, and 8131). DNA was mixed with the compound at 4 ° C. and after 15 minutes DNase I (1 μl of a 10 mg / ml solution) was added at 37 ° C. After incubation at 37 ° C. for 30 minutes, DNase I was removed by treatment with proteinase K (3 μl of a 10 mg / ml solution). Controls were those with DNase I and no nonionic block copolymer, and those with only DNA and no treatment with any DNase I.
[0121]
In all samples where nonionic block copolymer was present, DNA was protected from degradation by DNase I. The strongest protection for DNA was with CRL-3362 and 8131. The DNA / copolymer composition did not move in horizontal agarose electrophoresis, but remained in the well (staining with ethidium bromide). Effective protection against the action of DNase I was achieved in a solution consisting of 5 volumes of nonionic block copolymer (30 μg / ml) per 1 volume of DNA solution (1 μg / ml). . Protection estimates varied from experiment to experiment and were estimated to be in the range of 15-40% of total DNA.
[0122]
Additional experiments showed that with the calcium method, DNA-copolymer compounds are unable to transform E. coli competent cells. Moreover, phenol could not dissolve the nonionic block copolymer separated from DNA. By adding 5 volumes of isopropyl alcohol, it is possible to precipitate the DNA bound to NBC.
[0123]
Example 9
Transduction experiment. A typical transduction experiment to transiently express the herpesvirus glycoprotein gene and other genes of interest required the following procedure. Cells such as COS (African monkey kidney cells; CV1) are seeded on 6-well plates. Transduction is performed when the cells are 50-80% confluent (still in logarithmic growth phase). The cells are first washed with PBS buffer and the cells are incubated with 0.5 ml DEAE dextran solution (500 mg / ml) for 1-2 minutes. The solution is aspirated and a DNA precipitate is added to the cells. The transducing DNA is CaCl₂And 30 minutes at room temperature under controlled pH conditions to produce a highly pure precipitate. This solution is mixed with 1 ml growth medium (DMEM) and contacted on the cells at 37 ° C. for 4 hours. At this point, the cells are shocked with 15% glycerol and then washed with PBS. This osmotic shock causes CaCl₂-The uptake of DNA precipitate into the cell is promoted. The cells are then washed again with PBS and incubated with growth medium for 48 hours at 37 ° C.
[0124]
Gene expression is detected using indirect immunofluorescence in many cases using monoclonal antibodies specific for the expressed protein. The expressed protein can be labeled with a radioactive tracer, immunoprecipitated, or detected by Western blotting.
[0125]
25 μl of DNA (7 μg) and 25 μl of nonionic block copolymer (30 μg / ml) were used. In addition, when ice-cooled to mix the nonionic block copolymer with the DNA and add the mixture to the cells, they are added separately (ie, the DNA is added first and then the nonionic block. The same results as in the case of adding a copolymer) were obtained.
[0126]
Copolymers 1183, 1187, 8131, 1235, 8950AQ and 1190AQ (where AQ refers to a non-ionic block copolymer diluted 1:10 and 25 μl was used). Typical results are as follows. Transduction with DNA only, dextran only, copolymer only, and DNA + dextran was negligible, less than 0.2%. In contrast, the positive control DNA + Dextran + Glycerol was 2% transduction, as shown in Table 3, with various copolymers + DNA up to 2.5 times this control. We have successfully transduced DNA into cells to a high degree.
[Table 3]

[0127]
There was no toxic copolymer other than 1187 with weak toxicity. Others showed toxicity, especially after glycerol treatment.
[0128]
It is understood that the foregoing is only relevant to the preferred embodiment of the present invention and that numerous changes and modifications can be made without departing from the spirit and scope of the invention as set forth in the appended claims. Should.
[Brief description of the drawings]
[0129]
FIG. 1 is a grid illustrating a block copolymer by the molecular weight of the hydrophobic portion and the hydrophilic portion%.
FIG. 2 is a grid illustrating a preferred therapeutic block copolymer for delivery by molecular weight of the hydrophobic portion and% hydrophilic portion.
FIG. 3 is a grid illustrating a block copolymer for delivery for a more preferred treatment by molecular weight of the hydrophobic portion and% hydrophilic portion.

Claims (35)

Octablock copolymer having the formula:

Where
The average total molecular weight of the portion of the octablock copolymer, designated polyoxypropylene (POP), is between about 5,000 and about 7,000 daltons;
a is a number such that the portion represented by polyoxyethylene (POE) comprises from about 10% to about 40% by weight of the compound; and b is the polyoxypropylene of the total molecular weight of the octablock copolymer A number such that the portion comprises between about 60% and about 90% by weight of the compound,
A therapeutic composition for treating a human or animal comprising a compound having the ability to alter the function of a nucleic acid, mixed with the composition. The average total molecular weight of the portion of the octablock copolymer indicated by polyoxypropylene is about 6,750 daltons;
a is a number such that the portion represented by polyoxyethylene comprises about 10% by weight of the compound; and b is about 90% by weight of the polyoxypropylene portion of the total molecular weight of the octablock copolymer of the compound. The composition according to claim 1, wherein the number is such that it comprises%. The average total molecular weight of the portion of the octablock copolymer indicated by polyoxypropylene is about 5,750 daltons;
a is a number such that the portion represented by polyoxyethylene comprises about 10% by weight of the compound; and b is about 90% by weight of the polyoxypropylene portion of the total molecular weight of the octablock copolymer of the compound. The composition according to claim 1, wherein the number is such that it comprises%. The average total molecular weight of the portion of the octablock copolymer indicated by polyoxypropylene is about 5,220 Daltons;
a is a number such that the portion represented by polyoxyethylene comprises about 10% by weight of the compound; and b is about 90% by weight of the polyoxypropylene portion of the total molecular weight of the octablock copolymer of the compound. The composition according to claim 1, wherein the number is such that it comprises%. The average total molecular weight of the portion of the octablock copolymer represented by polyoxypropylene is between about 5,000 and about 7,000 daltons;
a is a number such that the moiety represented by polyoxyethylene comprises from about 5% to about 20% by weight of the compound; and b is the total molecular weight polyoxypropylene part of the octablock copolymer 2. The composition of claim 1, wherein the number is between about 80% and about 95% by weight of the compound. The composition of claim 1, wherein the compound having the ability to alter the function of the nucleic acid sequence is selected from a nucleic acid, a vector construct, a gene, an oligonucleotide, an antisense oligonucleotide, a triplex DNA compound, or a ribozyme. Octablock copolymer having the formula:

Where
The average total molecular weight of the portion of the octablock copolymer represented by polyoxypropylene is between about 5,000 and about 7,000 daltons;
a is a number such that the moiety represented by polyoxyethylene comprises from about 10% to about 40% by weight of the compound; and b is the total molecular weight polyoxypropylene part of the octablock copolymer A number that occupies between about 60% to about 90% by weight of the compound,
A therapeutic composition for treating a human or animal comprising a compound having the ability to alter the function of a nucleic acid, mixed with the composition. The average total molecular weight of the portion of the octablock copolymer indicated by polyoxypropylene is about 6,750 daltons;
a is a number such that the portion represented by polyoxyethylene comprises about 10% by weight of the compound; and b is about 90% by weight of the polyoxypropylene portion of the total molecular weight of the octablock copolymer of the compound. The composition according to claim 7, wherein the number is such that it comprises%. The average total molecular weight of the portion of the octablock copolymer indicated by polyoxypropylene is about 5,750 daltons;
a is a number such that the portion represented by polyoxyethylene comprises about 10% by weight of the compound; and b is about 90% by weight of the polyoxypropylene portion of the total molecular weight of the octablock copolymer of the compound. The composition according to claim 7, wherein the number is such that it comprises%. The average total molecular weight of the portion of the octablock copolymer indicated by polyoxypropylene is about 5,220 Daltons;
a is a number such that the portion represented by polyoxyethylene comprises about 10% by weight of the compound; and b is about 90% by weight of the polyoxypropylene portion of the total molecular weight of the octablock copolymer of the compound. The composition according to claim 7, wherein the number is such that it comprises%. 8. The composition of claim 7, wherein the compound having the ability to alter the function of the nucleic acid sequence is selected from a nucleic acid, a vector construct, a gene, an oligonucleotide, an antisense oligonucleotide, a triplex DNA compound, or a ribozyme. Octablock copolymer having the formula:

Where
The average total molecular weight of the portion of the octablock copolymer represented by polyoxypropylene is between about 5,000 and about 7,000 daltons;
a is a number such that the moiety represented by polyoxyethylene comprises from about 10% to about 40% by weight of the compound; and b is the total molecular weight polyoxypropylene part of the octablock copolymer A number that occupies between about 60% to about 90% by weight of the compound,
A method of delivering to a human or animal a compound having the ability to alter the function of a nucleic acid sequence, comprising administering to the human or animal a composition containing the compound having the ability to alter the function of the nucleic acid sequence mixed with . The average total molecular weight of the portion of the octablock copolymer indicated by polyoxypropylene is about 6,750 daltons;
a is a number such that the portion represented by polyoxyethylene comprises about 10% by weight of the compound; and b is about 90% by weight of the polyoxypropylene portion of the total molecular weight of the octablock copolymer of the compound. The method of claim 12, wherein the number is such that it comprises%. The average total molecular weight of the portion of the octablock copolymer indicated by polyoxypropylene is about 5,750 daltons;
a is a number such that the portion represented by polyoxyethylene comprises about 10% by weight of the compound; and b is about 90% by weight of the polyoxypropylene portion of the total molecular weight of the octablock copolymer of the compound. The method of claim 12, wherein the number is such that it comprises%. The average total molecular weight of the portion of the octablock copolymer indicated by polyoxypropylene is about 5,220 Daltons;
a is a number such that the portion represented by polyoxyethylene comprises about 10% by weight of the compound; and b is about 90% by weight of the polyoxypropylene portion of the total molecular weight of the octablock copolymer of the compound. The method of claim 12, wherein the number is such that it comprises%. 13. The method of claim 12, wherein the compound having the ability to alter the function of the nucleic acid sequence is selected from a nucleic acid, a vector construct, a gene, an oligonucleotide, an antisense oligonucleotide, a triplex DNA compound, or a ribozyme. Octablock copolymer having the formula:

Where
The average total molecular weight of the portion of the octablock copolymer represented by polyoxypropylene is between about 5,000 and about 7,000 daltons;
a is a number such that the moiety represented by polyoxyethylene comprises from about 10% to about 40% by weight of the compound; and b is the total molecular weight polyoxypropylene part of the octablock copolymer A number that occupies between about 60% to about 90% by weight of the compound,
A method of delivering to a human or animal a compound having the ability to alter the function of a nucleic acid sequence, comprising administering to the human or animal a composition containing the compound having the ability to alter the function of the nucleic acid sequence mixed with . The average total molecular weight of the portion of the octablock copolymer indicated by polyoxypropylene is about 6,750 daltons;
a is a number such that the portion represented by polyoxyethylene comprises about 10% by weight of the compound; and b is about 90% by weight of the polyoxypropylene portion of the total molecular weight of the octablock copolymer of the compound. The method of claim 17, wherein the number is such that it comprises%. The average total molecular weight of the portion of the octablock copolymer indicated by polyoxypropylene is about 5,750 daltons;
a is a number such that the portion represented by polyoxyethylene comprises about 10% by weight of the compound; and b is about 90% by weight of the polyoxypropylene portion of the total molecular weight of the octablock copolymer of the compound. The method of claim 17, wherein the number is such that it comprises%. The average total molecular weight of the portion of the octablock copolymer indicated by polyoxypropylene is about 5,220 Daltons;
a is a number such that the portion represented by polyoxyethylene comprises about 10% by weight of the compound; and b is about 90% by weight of the polyoxypropylene portion of the total molecular weight of the octablock copolymer of the compound. The method of claim 17, wherein the number is such that it comprises%. 18. A method according to claim 17, wherein the compound having the ability to alter the function of the nucleic acid sequence is selected from nucleic acids, vector constructs, genes, oligonucleotides, antisense oligonucleotides, triplex DNA compounds, or ribozymes. The average total molecular weight of the portion of the octablock copolymer represented by polyoxypropylene is between about 5,000 and about 7,000 daltons;
a is a number such that the moiety represented by polyoxyethylene comprises from about 5% to about 20% by weight of the compound; and b is the total molecular weight polyoxypropylene part of the octablock copolymer 18. The method of claim 17, wherein the number is between about 80% and about 95% by weight of the compound. Block copolymer having the following formula:

Where “b” indicates a number such that the molecular weight of hydrophobic (C ₃ H ₆ O) _b is between about 2,000 and about 20,000, and “a” is hydrophilic (C ₂ H ₄ O) _a indicates a number such that the percentage is between about 1% and 90%.
A therapeutic composition for treating a human or animal comprising a compound having the ability to alter the function of a nucleic acid, mixed with the composition. “B” indicates a number such that the molecular weight of hydrophobic (C ₃ H ₆ O) _b is about 5,000, and “a” indicates the percentage of hydrophilic (C ₂ H ₄ O) _a is about 24. The composition of claim 23, wherein the composition exhibits a number such that it is 90%. “B” indicates a number such that the molecular weight of hydrophobic (C ₃ H ₆ O) _b is about 5,750, and “a” is the percentage of hydrophilic (C ₂ H ₄ O) _a is about 24. The composition of claim 23, wherein the composition exhibits a number such that it is 10%. “B” indicates a number such that the molecular weight of hydrophobic (C ₃ H ₆ O) _b is about 5,220, and “a” is the percentage of hydrophilic (C ₂ H ₄ O) _a is about 24. The composition of claim 23, wherein the composition exhibits a number such that it is 10%. 24. The composition of claim 23, wherein the compound having the ability to alter the function of the nucleic acid sequence is selected from nucleic acids, vector constructs, genes, oligonucleotides, antisense oligonucleotides, triplex DNA compounds, or ribozymes. “B” indicates a number such that the molecular weight of hydrophobic (C ₃ H ₆ O) _b is between about 2,000 and 10,000, and “a” indicates hydrophilic (C ₂ H ₄ O ) the percentage of _a indicates the number such that between about 5% and 30%, the composition of claim 23. “B” indicates a number such that the molecular weight of hydrophobic (C ₃ H ₆ O) _b is about 6,750 daltons, and “a” is the percentage of hydrophilic (C ₂ H ₄ O) _a 24. The composition of claim 23, wherein the composition exhibits a number such that it is about 10%. A block copolymer having the formula:

Where “b” indicates a number such that the molecular weight of hydrophobic (C ₃ H ₆ O) _b is between about 2,000 and 20,000, and “a” is hydrophilic (C ₂ A number such that the percentage of H ₄ O) _a is between about 1% and 90%,
A method of delivering to a human or animal a compound having the ability to alter the function of a nucleic acid sequence, comprising administering to the human or animal a composition containing the compound having the ability to alter the function of the nucleic acid sequence mixed with . “B” indicates a number such that the molecular weight of hydrophobic (C ₃ H ₆ O) _b is about 6,750, and “a” is the percentage of hydrophilic (C ₂ H ₄ O) _a is about 32. The method of claim 30, wherein the number is such that it is 10%. “B” indicates a number such that the molecular weight of hydrophobic (C ₃ H ₆ O) _b is about 5,750, and “a” is the percentage of hydrophilic (C ₂ H ₄ O) _a is about 32. The method of claim 30, wherein the number is such that it is 10%. “B” indicates a number such that the molecular weight of hydrophobic (C ₃ H ₆ O) _b is about 5,220, and “a” is the percentage of hydrophilic (C ₂ H ₄ O) _a is about 32. The method of claim 30, wherein the number is such that it is 10%. 31. The method of claim 30, wherein the compound having the ability to alter the function of the nucleic acid sequence is selected from a nucleic acid, a vector construct, a gene, an oligonucleotide, an antisense oligonucleotide, a triplex DNA compound, or a ribozyme. “B” indicates a number such that the molecular weight of hydrophobic (C ₃ H ₆ O) _b is between about 2,000 and 10,000, and “a” indicates hydrophilic (C ₂ H ₄ O ) shows a number such that the percentage of _a is between about 5% and 30%, the method of claim 30.

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