JP2005278414A - Methods for producing 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、グリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子、ミディアムサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子及び／又はプロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子、を含む形質転換体を用いてグリセロールから１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法に関する。 The present invention relates to a gene encoding a large subunit of glycerol dehydratase and / or diol dehydratase, a gene encoding medium subunit and a gene encoding small subunit, glycerol dehydratase reactivation factor and / or diol dehydratase reactivation A gene encoding a large subunit of a factor and a gene encoding a small subunit, a gene encoding an aldehyde dehydrogenase, and a gene encoding 1,3-propanediol oxidoreductase and / or a gene encoding propanediol oxidoreductase, The present invention relates to a method for producing 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid from glycerol using a transformant containing
１，３−プロパンジオールはポリエステル繊維の生産並びにポリウレタン及び環状化合物の製造に使用されるモノマーである。１，３−プロパンジオール合成経路としては、種々ものが知られている。例えば、ホスフィン、水、一酸化炭素、水素及び酸の存在下、触媒上でのエチレンオキサイドの変換により製造する方法；アクロレインの触媒的液相水和、続いての還元により製造する方法；一酸化炭素及び水素存在下、周期律表のＶＩＩＩ族の原子を持っている触媒上で炭化水素（例えば、グリセロール）を反応させることにより製造する方法などが報告されている。しかしながら、伝統的化学合成法は、費用がかかるとともに、環境汚染物質を含んでいる一連の廃棄物を発生するという問題を有していた。 1,3-propanediol is a monomer used in the production of polyester fibers and in the production of polyurethanes and cyclic compounds. Various synthesis routes for 1,3-propanediol are known. For example, a process prepared by conversion of ethylene oxide on a catalyst in the presence of phosphine, water, carbon monoxide, hydrogen and an acid; a process prepared by catalytic liquid phase hydration of acrolein followed by reduction; A method for producing a hydrocarbon (for example, glycerol) by reacting with a catalyst having a group VIII atom in the periodic table in the presence of carbon and hydrogen has been reported. However, traditional chemical synthesis methods are expensive and have the problem of generating a series of wastes containing environmental pollutants.
これに対し、１，３−プロパンジオールを製造するための生物学的方法として、グリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵を触媒する酵素を有する微生物を利用する方法が報告されている（特許文献１〜６参照）。グリセロールから１，３−プロパンジオールを生産できる細菌株が、例えば、Citrobacter属、Clostridium属、Enterobacter属、Salmonella属、Klebsiella属、Lactobacillus属、Caloramator属及びListeria属に属する細菌の群で発見されている。 On the other hand, as a biological method for producing 1,3-propanediol, a method using a microorganism having an enzyme that catalyzes fermentation of glycerol to 1,3-propanediol has been reported (patent) Reference 1-6). Bacterial strains capable of producing 1,3-propanediol from glycerol have been discovered, for example, in a group of bacteria belonging to the genus Citrobacter, Clostridium, Enterobacter, Salmonella, Klebsiella, Lactobacillus, Caloramator and Listeria .
生物学的系において、グリセロールは２段階の酵素触媒反応を経て、１，３−プロパンジオールに変換される。第１段階において、グリセロールデヒドラターゼがグリセロールを３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）及び水へ変換する（グリセロール→３−ＨＰＡ＋Ｈ２Ｏ）。第２段階において、３−ＨＰＡがＮＡＤ＋−結合オキシドレダクターゼにより１，３−プロパンジオールに還元される（３−ＨＰＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋→１，３−プロパンジオール＋ＮＡＤ＋）。１，３−プロパンジオールはそれ以上代謝されず、結果として媒体中に堆積する。 In biological systems, glycerol is converted to 1,3-propanediol via a two-stage enzyme-catalyzed reaction. In the first stage, glycerol dehydratase converts glycerol to 3-hydroxypropionaldehyde (3-HPA) and water (glycerol → 3-HPA + H 2 O). In the second stage, 3-HPA is reduced to 1,3-propanediol by NAD + -linked oxidoreductase (3-HPA + NADH + H + → 1,3-propanediol + NAD + ). 1,3-propanediol is not further metabolized and results in deposition in the medium.
しかし、生物学的系におけるグリセロールからの１，３−プロパンジオールの生産は、一般に嫌気性条件下でグリセロールを単独の炭素源とし、他の外因性還元当量受容物質の不在下で行われるため、最初に、ＮＡＤ＋−（又はＮＡＤＰ＋−）結合グリセロールデヒドロゲナーゼによるグリセロールのジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）への酸化（グリセロール＋ＮＡＤ+→ＤＨＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ）というグリセロールに関する平行経路が働く。そして、ＤＨＡは、ＤＨＡキナーゼによってジヒドロキシアセトンリン酸へリン酸化され、生合成及びＡＴＰ生成のために利用される。 However, since the production of 1,3-propanediol from glycerol in biological systems is generally performed under anaerobic conditions with glycerol as the sole carbon source and in the absence of other exogenous reducing equivalent acceptors, Initially, a parallel pathway for glycerol acts, the oxidation of glycerol to dihydroxyacetone (DHA) by NAD + -(or NADP + -) linked glycerol dehydrogenase (glycerol + NAD + → DHA + NADH + H). DHA is phosphorylated to dihydroxyacetone phosphate by DHA kinase and used for biosynthesis and ATP generation.
従って、従来の微生物を用いた１，３−プロパンジオールの製造方法においては、原料であるグリセロールの半分が上記平行経路において消費され、原料グリセロールに対する生成物の収率が低く、効率性及びコストの点で問題があった。 Therefore, in the conventional method for producing 1,3-propanediol using microorganisms, half of the raw material glycerol is consumed in the parallel path, and the yield of the product relative to the raw material glycerol is low, and the efficiency and cost are low. There was a problem in terms.
一方、３−ヒドロキシプロピオン酸及びそのエステルは、脂肪族ポリエステルの原料として有用な化合物であり、また、これらから合成されるポリエステルは生分解性の環境にやさしいポリエステルとして注目されている。 On the other hand, 3-hydroxypropionic acid and its esters are useful compounds as raw materials for aliphatic polyesters, and polyesters synthesized from these are attracting attention as biodegradable environmentally friendly polyesters.
３−ヒドロキシプロピオン酸は、通常、アクリル酸に対する水の付加により、又はエチレンクロロヒドリンとシアン化ナトリウムとの反応により製造される。アクリル酸を水和する反応は平衡反応であるため、反応率が制限されるという問題があった。エチレンクロロヒドリンの反応の場合は、毒性の強い物質の使用が必要であり、さらに加水分解工程を追加しなくてはならない。この場合、塩化ナトリウム及びアンモニウム塩が大量に生じるという問題がある。 3-Hydroxypropionic acid is usually produced by the addition of water to acrylic acid or by the reaction of ethylene chlorohydrin and sodium cyanide. Since the reaction of hydrating acrylic acid is an equilibrium reaction, there is a problem that the reaction rate is limited. In the case of ethylene chlorohydrin reactions, it is necessary to use highly toxic substances and an additional hydrolysis step must be added. In this case, there is a problem that sodium chloride and ammonium salt are produced in large quantities.
本発明は、グリセロールから１，３−プロパンジオールを製造する際の効率性を改善し、工業上有用なプロセスを提供することを目的とする。 The object of the present invention is to improve the efficiency in producing 1,3-propanediol from glycerol and to provide an industrially useful process.
本発明者らは、上記問題を解決すべく鋭意検討を行った結果、グリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子の各サブユニットをコードする遺伝子、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子及び／又はプロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝、を含む形質転換体を、グリセロールの存在下で培養することにより、２種類の有用な化合物を効率的に製造できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that a gene encoding each subunit of glycerol dehydratase and / or diol dehydratase, a gene encoding each subunit of glycerol dehydratase reactivating factor, By culturing a transformant containing a gene encoding aldehyde dehydrogenase and a gene encoding 1,3-propanediol oxidoreductase and / or a gene encoding propanediol oxidoreductase in the presence of glycerol, 2 It has been found that various kinds of useful compounds can be efficiently produced, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）グリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子、ミディアムサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子及び／又はプロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子、を含む形質転換体。
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) Gene encoding large subunit of glycerol dehydratase and / or diol dehydratase, gene encoding medium subunit and gene encoding small subunit, glycerol dehydratase reactivating factor and / or diol dehydratase reactivating factor A gene encoding a large subunit and a gene encoding a small subunit, a gene encoding an aldehyde dehydrogenase, a gene encoding 1,3-propanediol oxidoreductase and / or a gene encoding propanediol oxidoreductase, A transformant containing.
（２）グリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットをコードする遺伝子がLactobacillus reuteriに由来する、（１）記載の形質転換体。 (2) The transformant according to (1), wherein the gene encoding each subunit of glycerol dehydratase and / or diol dehydratase is derived from Lactobacillus reuteri.
（３）グリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子が以下の(a)又は(b)のタンパク質：
(a)配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニット及びスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子であり、
グリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニットをコードする遺伝子が以下の(c)又は(d)のタンパク質：
(c)配列番号５又は７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(d)配列番号５又は７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニット及びスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子であり、
グリセロールデヒドラターゼのスモールサブユニットをコードする遺伝子が以下の(e)又は(f)のタンパク質：
(e)配列番号９又は１１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(f)配列番号９又は１１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニット及びミディアムサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子である、（２）記載の形質転換体。
(3) The gene encoding the large subunit of glycerol dehydratase is the following protein (a) or (b):
(a) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3
(b) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 contains an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added, and is expressed together with the medium subunit and small subunit of glycerol dehydratase A gene that sometimes encodes a protein having glycerol dehydratase activity,
The gene encoding the medium subunit of glycerol dehydratase is the following protein (c) or (d):
(c) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 7
(d) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 7 contains an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added, and is expressed together with the large subunit and small subunit of glycerol dehydratase A gene that sometimes encodes a protein having glycerol dehydratase activity,
The gene encoding the small subunit of glycerol dehydratase is the following protein (e) or (f):
(e) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 11
(f) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 11 contains an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and is expressed together with a large subunit and a medium subunit of glycerol dehydratase The transformant according to (2), which is a gene that sometimes encodes a protein having glycerol dehydratase activity.
（４）グリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子が、以下の(a)又は(b)のＤＮＡ：
(a)配列番号２又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号２又は４で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニット及びスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含み、
グリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニットをコードする遺伝子が、以下の(c)又は(d)のＤＮＡ：
(c)配列番号６又は８で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(d)配列番号６又は８で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニット及びスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含み、
グリセロールデヒドラターゼのスモールサブユニットをコードする遺伝子が、以下の(e)又は(f)のＤＮＡ：
(e)配列番号１０又は１２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(f)配列番号１０又は１２で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニット及びミディアムサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含む、（２）記載の形質転換体。
(4) The gene encoding the large subunit of glycerol dehydratase is the following DNA (a) or (b):
(a) DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4
(b) a medium subunit of glycerol dehydratase that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 And a DNA encoding a protein having glycerol dehydratase activity when expressed together with a small subunit
Including
The gene encoding the medium subunit of glycerol dehydratase is the following DNA (c) or (d):
(c) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 or 8
(d) a large subunit of glycerol dehydratase that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 or 8 And a DNA encoding a protein having glycerol dehydratase activity when expressed together with a small subunit
Including
The gene encoding the small subunit of glycerol dehydratase is the following DNA (e) or (f):
(e) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 or 12
(f) a large subunit of glycerol dehydratase that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to a DNA comprising all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 or 12 And a protein encoding a protein having glycerol dehydratase activity when expressed together with a medium subunit
The transformant according to (2), comprising:
（５）プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を含み、該遺伝子がLactobacillus reuteriに由来する、（１）〜（４）のいずれかに記載の形質転換体。 (5) The transformant according to any one of (1) to (4), comprising a gene encoding propanediol oxidoreductase, wherein the gene is derived from Lactobacillus reuteri.
（６）プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子である（５）記載の形質転換体：
(a)配列番号１３又は１５で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号１３又は１５で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質。
(6) The transformant according to (5), wherein the gene encoding propanediol oxidoreductase is a gene encoding the following protein (a) or (b):
(a) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15
(b) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15, and having propanediol oxidoreductase activity.
（７）プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が、以下の(a)又は(b)のＤＮＡを含む、（５）記載の形質転換体：
(a)配列番号１４又は１６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号１４又は１６で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(7) The transformant according to (5), wherein the gene encoding propanediol oxidoreductase contains the following DNA (a) or (b):
(a) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 or 16
(b) hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 or 16, and exhibits propanediol oxidoreductase activity DNA encoding a protein having the same.
（８）１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を含み、該遺伝子がLactobacillus reuteriに由来する、（１）〜（７）のいずれかに記載の形質転換体。 (8) The transformant according to any one of (1) to (7), comprising a gene encoding 1,3-propanediol oxidoreductase, wherein the gene is derived from Lactobacillus reuteri.
（９）１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子である（８）記載の形質転換体：
(a)配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号１７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質。
(9) The transformant according to (8), wherein the gene encoding 1,3-propanediol oxidoreductase is a gene encoding the following protein (a) or (b):
(a) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17
(b) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, and having 1,3-propanediol oxidoreductase activity.
（１０）１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が、以下の(a)又は(b)のＤＮＡを含む、（８）記載の形質転換体：
(a)配列番号１８で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号１８で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(10) The transformant according to (8), wherein the gene encoding 1,3-propanediol oxidoreductase contains the following DNA (a) or (b):
(a) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 18
(b) hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 18, and 1,3-propanediol oxidoreductase DNA encoding a protein having activity.
（１１）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子の各サブユニットをコードする遺伝子がLactobacillus reuteriに由来する、（１）〜（１０）のいずれかに記載の形質転換体。 (11) The transformant according to any one of (1) to (10), wherein the gene encoding each subunit of the glycerol dehydratase reactivation factor and / or the diol dehydratase reactivation factor is derived from Lactobacillus reuteri.
（１２）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子が以下の(a)又は(b)のタンパク質：
(a)配列番号１９又は２１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号１９又は２１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子であり、
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットをコードする遺伝子が以下の(c)又は(d)のタンパク質：
(c)配列番号２３又は２５で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(d)配列番号２３又は２５で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子である、（１１）記載の形質転換体。
(12) The gene encoding the large subunit of the glycerol dehydratase reactivation factor is the following protein (a) or (b):
(a) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or 21
(b) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or 21 contains an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and is expressed together with a small subunit of a glycerol dehydratase reactivation factor A gene that sometimes encodes a protein having glycerol dehydratase reactivator activity,
The gene encoding the small subunit of the glycerol dehydratase reactivating factor is the following protein (c) or (d):
(c) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 or 25
(d) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 or 25 contains an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and is expressed together with the large subunit of glycerol dehydratase reactivating factor The transformant according to (11), which is a gene encoding a protein sometimes having glycerol dehydratase reactivation factor activity.
（１３）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子が、以下の(a)又は(b)のＤＮＡ：
(a)配列番号２０又は２２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号２０又は２２で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含み、
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットをコードする遺伝子が、以下の(c)又は(d)のＤＮＡ：
(c)配列番号２４又は２６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(d)配列番号２４又は２６で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含む、（１１）記載の形質転換体。
(13) The gene encoding the large subunit of the glycerol dehydratase reactivation factor is the following DNA (a) or (b):
(a) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 or 22
(b) a glycerol dehydratase reactivating factor that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to a DNA comprising all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 or 22 DNA encoding a protein having glycerol dehydratase reactivator activity when expressed together with the small subunit of
Including
The gene encoding the small subunit of the glycerol dehydratase reactivation factor is the following DNA (c) or (d):
(c) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 24 or 26
(d) a glycerol dehydratase reactivation factor that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to a DNA comprising all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 24 or 26 DNA encoding a protein having glycerol dehydratase reactivator activity when expressed with the large subunit of
The transformant according to (11), comprising:
（１４）（１）〜（１３）のいずれかに記載の形質転換体をグリセロールの存在下で培養することにより、１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法。 (14) A method for producing 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid by culturing the transformant according to any one of (1) to (13) in the presence of glycerol.
本発明により、グリセロールから１，３−プロパンジオールを製造する際の原料グリセロールのロスを低減し、かつ１，３−プロパンジオールと合わせて３−ヒドロキシプロピオン酸を製造することができる。 According to the present invention, loss of raw material glycerol when 1,3-propanediol is produced from glycerol can be reduced, and 3-hydroxypropionic acid can be produced together with 1,3-propanediol.
本発明の形質転換体は、グリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子、ミディアムサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子及び／又はプロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を含む。 The transformant of the present invention comprises a gene encoding a large subunit of glycerol dehydratase and / or diol dehydratase, a gene encoding a medium subunit and a gene encoding a small subunit, a glycerol dehydratase reactivating factor and / or a diol A gene encoding a large subunit and a small subunit of a dehydratase reactivation factor, a gene encoding an aldehyde dehydrogenase, and a gene encoding 1,3-propanediol oxidoreductase and / or propanediol oxidoreductase Contains the encoding gene.
本発明の形質転換体は、グリセロールを脱水して、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド及び水へ変換する反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む。そのようなタンパク質としては、グリセロールデヒドラターゼ及びジオールデヒドラターゼが挙げられる。グリセロールデヒドラターゼ及びジオールデヒドラターゼは、ラージサブユニット、ミディアムサブユニット及びスモールサブユニットの３種のサブユニットから構成される。本発明の形質転換体には、グリセロールデヒドラターゼの３種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むもの、ジオールデヒドラターゼの３種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むもの、ならびにグリセロールデヒドラターゼの３種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子とジオールデヒドラターゼの３種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むもののいずれをも包含する。 The transformant of the present invention contains a gene encoding a protein having an enzyme activity that catalyzes a reaction of dehydrating glycerol and converting it to 3-hydroxypropionaldehyde and water. Such proteins include glycerol dehydratase and diol dehydratase. Glycerol dehydratase and diol dehydratase are composed of three subunits, a large subunit, a medium subunit, and a small subunit. The transformant of the present invention includes those containing genes encoding three subunits of glycerol dehydratase, those containing genes encoding three subunits of diol dehydratase, and three types of glycerol dehydratase, respectively. It includes both a gene encoding each subunit and a gene containing each of the three subunits of diol dehydratase.
グリセロールデヒドラターゼ又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットをコードする遺伝子としては、公知のものを使用でき、例えば、Lactobacillus属、Citrobacter属、Clostridium属、Klebsiella属、Enterobacter属、Caloramator属、Salmonella属、及びListeria属等に属する細菌に由来するものを使用することができる。本発明においては、Lactobacillus属細菌に由来するグリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットの遺伝子、特にLactobacillus reuteri由来のグリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットの遺伝子、さらにLactobacillus reuteri JCM1112株及びLactobacillus reuteri ATCC 53608株由来のグリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットの遺伝子が好ましい。 As the gene encoding each subunit of glycerol dehydratase or diol dehydratase, known genes can be used, for example, Lactobacillus genus, Citrobacter genus, Clostridium genus, Klebsiella genus, Enterobacter genus, Caloramator genus, Salmonella genus, Listeria genus, etc. Those derived from bacteria belonging to can be used. In the present invention, the genes for the subunits of glycerol dehydratase and / or diol dehydratase derived from bacteria belonging to the genus Lactobacillus, in particular, the genes for the subunits of glycerol dehydratase and / or diol dehydratase derived from Lactobacillus reuteri, and the Lactobacillus reuteri JCM1112 strain and A gene for each subunit of glycerol dehydratase and / or diol dehydratase derived from Lactobacillus reuteri ATCC 53608 strain is preferred.
Lactobacillus reuteri由来のグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットのアミノ酸配列を配列番号１及び３に、ミディアムサブユニットのアミノ酸配列を配列番号５及び７に、スモールサブユニットのアミノ酸配列を配列番号９及び１１に例示する。Lactobacillus reuteri由来のグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２及び４に、ミディアムサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号６及び８に、スモールサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１０及び１２に、例示する。 The amino acid sequence of the large subunit of glycerol dehydratase derived from Lactobacillus reuteri is exemplified in SEQ ID NOs: 1 and 3, the amino acid sequence of the medium subunit is exemplified in SEQ ID NOs: 5 and 7, and the amino acid sequence of the small subunit is exemplified in SEQ ID NOs: 9 and 11. . The base sequence of the gene encoding the large subunit of glycerol dehydratase derived from Lactobacillus reuteri is SEQ ID NO: 2 and 4, the base sequence of the gene encoding the medium subunit is SEQ ID NO: 6 and 8, and the gene encoding the small subunit The base sequences are exemplified in SEQ ID NOS: 10 and 12.
各アミノ酸配列を含むタンパク質は、その他２種のサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する限り、各アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。 As long as the protein containing each amino acid sequence has glycerol dehydratase activity when expressed together with the other two subunits, mutations such as deletion, substitution, addition, etc. have occurred in one or several amino acids in each amino acid sequence. May be.
また、各配列番号で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、その他２種のサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を用いる場合も本発明に含まれる。 Further, it hybridizes under stringent conditions with a sequence complementary to DNA consisting of all or part of the DNA consisting of the base sequence represented by each SEQ ID NO. And two other subunits The case where a gene encoding a protein having glycerol dehydratase activity when expressed together is used in the present invention.
各サブユニットをコードする遺伝子は、同一の宿主で発現させる限り、同一のベクターに導入して形質転換を行ってもよいし、別々のベクターに導入して形質転換を行ってもよい。また。３種のサブユニットは、同一の種又は同一の株に由来するものを用いるのが好ましい。 As long as the genes encoding each subunit are expressed in the same host, they may be introduced into the same vector for transformation, or may be introduced into different vectors for transformation. Also. As the three subunits, those derived from the same species or the same strain are preferably used.
本発明の形質転換体は、プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子若しくは１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼコードする遺伝子のいずれか、又はその双方を含む。 The transformant of the present invention contains either a gene encoding propanediol oxidoreductase or a gene encoding 1,3-propanediol oxidoreductase, or both.
本発明において、プロパンジオールオキシドレダクターゼとは、当技術分野において通常用いられる意味を有し、すなわち３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを還元し、プロパンジオールに変換する反応を触媒することができる酵素活性を有するタンパク質を意味する。 In the present invention, propanediol oxidoreductase has a meaning usually used in the art, that is, a protein having an enzyme activity capable of catalyzing a reaction for reducing 3-hydroxypropionaldehyde and converting it to propanediol. Means.
プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子は、公知のものを使用でき、例えば、Lactobacillus属、Citrobacter属、Clostridium属、Klebsiella属、Enterobacter属、Caloramator属、Salmonella属、及びListeria属等に属する細菌に由来するものを使用することができる。本発明においては、Lactobacillus属細菌に由来する１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子、特にLactobacillus reuteri由来の１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子、さらにLactobacillus reuteri JCM1112株及びLactobacillus reuteri ATCC 53608株由来のプロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子が好ましい。 A gene encoding propanediol oxidoreductase can be a known gene, for example, derived from bacteria belonging to the genus Lactobacillus, Citrobacter, Clostridium, Klebsiella, Enterobacter, Caloramator, Salmonella, Listeria, etc. Things can be used. In the present invention, 1,3-propanediol oxidoreductase gene derived from bacteria belonging to the genus Lactobacillus, in particular, 1,3-propanediol oxidoreductase gene derived from Lactobacillus reuteri, propane derived from Lactobacillus reuteri strain JCM1112 and Lactobacillus reuteri ATCC 53608 strain The diol oxidoreductase gene is preferred.
配列番号１３及び１５にLactobacillus reuteri由来のプロパンジオールオキシドレダクターゼのアミノ酸配列を、配列番号１４及び１６にLactobacillus reuteri由来のプロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子の塩基配列を例示する。これらのアミノ酸配列を含むタンパク質がプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有する限り、配列番号１３又は１５で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。 SEQ ID NOs: 13 and 15 exemplify the amino acid sequence of propanediol oxidoreductase derived from Lactobacillus reuteri, and SEQ ID NOs: 14 and 16 exemplify the base sequence of the propanediol oxidoreductase gene derived from Lactobacillus reuteri. As long as the protein containing these amino acid sequences has propanediol oxidoreductase activity, even if the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15 has mutations such as deletion, substitution, addition, etc. in one or several amino acids. Good.
また、配列番号１４又は１６で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を用いる場合も本発明に含まれる。 A propanediol oxidoreductase which hybridizes under stringent conditions with a sequence complementary to a DNA consisting of all or part of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 or 16; The case where a gene encoding a protein having activity is used is also included in the present invention.
本発明において、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼとは、当技術分野において通常用いられる意味を有し、すなわち３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを還元し、１，３−プロパンジオールに変換する反応を触媒することができる酵素活性を有するタンパク質を意味する。 In the present invention, 1,3-propanediol oxidoreductase has a meaning usually used in the art, that is, catalyzes a reaction for reducing 3-hydroxypropionaldehyde and converting it to 1,3-propanediol. It means a protein having an enzymatic activity.
１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子は、公知のものを使用でき、例えば、Lactobacillus属、Citrobacter属、Clostridium属、Klebsiella属、Enterobacter属、Caloramator属、Salmonella属、及びListeria属等に属する細菌に由来するものを使用することができる。本発明においては、Lactobacillus属細菌に由来する１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子、特にLactobacillus reuteri由来の１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子、さらにLactobacillus reuteri JCM1112株及びLactobacillus reuteri ATCC 53608株由来の１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子が好ましい。 As the gene encoding 1,3-propanediol oxidoreductase, a known gene can be used. For example, it belongs to the genus Lactobacillus, Citrobacter, Clostridium, Klebsiella, Enterobacter, Caloramator, Salmonella, Listeria, etc. Those derived from bacteria can be used. In the present invention, 1,3-propanediol oxidoreductase gene derived from bacteria belonging to the genus Lactobacillus, in particular, 1,3-propanediol oxidoreductase gene derived from Lactobacillus reuteri, in addition, Lactobacillus reuteri strain JCM1112 and Lactobacillus reuteri ATCC 53608 strain 1 The 3-propanediol oxidoreductase gene is preferred.
配列番号１７にLactobacillus reuteri由来の１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼのアミノ酸配列を、配列番号１８にLactobacillus reuteri由来の１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子の塩基配列を例示する。これらのアミノ酸配列を含むタンパク質が１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有する限り、配列番号１７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。 SEQ ID NO: 17 exemplifies the amino acid sequence of 1,3-propanediol oxidoreductase derived from Lactobacillus reuteri, and SEQ ID NO: 18 exemplifies the base sequence of the 1,3-propanediol oxidoreductase gene derived from Lactobacillus reuteri. As long as the protein containing these amino acid sequences has 1,3-propanediol oxidoreductase activity, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 has mutations such as deletion, substitution and addition in one or several amino acids. May be.
また、配列番号１８で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を用いる場合も本発明に含まれる。 Further, it hybridizes under stringent conditions with a complementary sequence to DNA consisting of all or part of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 18, and 1,3-propanediol A case where a gene encoding a protein having oxidoreductase activity is used is also included in the present invention.
本発明の形質転換体は、グリセロールの３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド及び水への変換反応を触媒することにより失活したグリセロールデヒドラターゼ又はジオールデヒドラターゼにおける反応中心部分の補酵素Ｂ１２を入れ替えて、再度活性を取り戻させる役割を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む。そのようなタンパク質としては、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及びジオールデヒドラターゼ再活性化因子が挙げられる。グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及びジオールデヒドラターゼ再活性化因子は、ラージサブユニット及びスモールサブユニットの２種のサブユニットから構成される。本発明の形質転換体には、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子の２種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むもの、ジオールデヒドラターゼ再活性化因子の２種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むもの、ならびにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子の２種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子とジオールデヒドラターゼ再活性化因子の２種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むもののいずれをも包含する。 The transformant of the present invention replaces the coenzyme B12 in the reaction center portion of glycerol dehydratase or diol dehydratase, which has been inactivated by catalyzing the conversion reaction of glycerol into 3-hydroxypropionaldehyde and water, and regains activity. A gene encoding a protein having a role of Such proteins include glycerol dehydratase reactivation factor and diol dehydratase reactivation factor. Glycerol dehydratase reactivation factor and diol dehydratase reactivation factor are composed of two subunits, a large subunit and a small subunit. The transformant of the present invention includes a gene encoding two subunits of glycerol dehydratase reactivation factor, and a gene encoding each of two subunits of diol dehydratase reactivation factor And a gene encoding each of the two subunits of the glycerol dehydratase reactivating factor and a gene encoding each of the two subunits of the diol dehydratase reactivating factor.
同様の作用を有するものであれば、特に制限なく使用できる。グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子としては、ＷＯ９８／２１３４１；Daniel et al., J. Bacteriol., 177, 2151(1995);Toraya and Mori, J. Biol. Chem., 274, 3372(1999);及びTobimatsu et al., J. Bacteriol. 181, 4110(1999)に記載のものなどが挙げられる。 As long as it has the same action, it can be used without particular limitation. Glycerol dehydratase reactivation factors include WO 98/21341; Daniel et al., J. Bacteriol., 177, 2151 (1995); Toraya and Mori, J. Biol. Chem., 274, 3372 (1999); and Tobimatsu et al., J. Bacteriol. 181, 4110 (1999).
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子の各サブユニットをコードする遺伝子としては、一般に嫌気条件下でグリセロールを資化することのできる細菌群が有するｇｄｈレギュロン、ｐｄｕオペロンと呼ばれる遺伝子郡内に存在するものが含まれ、例えば、ｇｄｒＡ、ｇｄｒＢ、ｐｄｕＧ、ｐｄｕＨ、ｄｄｒＡ、ｄｄｒＢ、ｄｈａＦ、ｄｈａＧ、ｏｒｆＺ、及びｏｒｆＹなどが挙げられる。 As a gene encoding each subunit of a glycerol dehydratase reactivation factor or a diol dehydratase reactivation factor, gene groups called gdh regulon and pdu operon possessed by a group of bacteria generally capable of assimilating glycerol under anaerobic conditions Are included, for example, gdrA, gdrB, pduG, pduH, ddrA, ddrB, dhaF, dhaG, orfZ, and orfY.
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子の各サブユニットをコードする遺伝子としては、公知のものを使用でき、例えば、Lactobacillus属、Citrobacter属、Clostridium属、Klebsiella属、Enterobacter属、Caloramator属、Salmonella属、及びListeria属等に属する細菌に由来するものを使用することができる。本発明においては、Lactobacillus属細菌に由来するグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子の各サブユニットの遺伝子、特にLactobacillus reuteri由来のグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子の各サブユニットの遺伝子、さらにLactobacillus reuteri JCM1112株及びLactobacillus reuteri ATCC 53608株由来のグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子の各サブユニットの遺伝子が好ましい。 As a gene encoding each subunit of glycerol dehydratase reactivation factor or diol dehydratase reactivation factor, known genes can be used, for example, Lactobacillus genus, Citrobacter genus, Clostridium genus, Klebsiella genus, Enterobacter genus, Caloramator genus , Derived from bacteria belonging to the genus Salmonella, Listeria, and the like. In the present invention, glycerol dehydratase reactivation factor and / or diol dehydratase reactivation factor genes derived from bacteria belonging to the genus Lactobacillus, particularly glycerol dehydratase reactivation factor and / or diol dehydratase reactivation factor derived from Lactobacillus reuteri. The gene of each subunit of the activator, and the gene of each subunit of the glycerol dehydratase reactivating factor and / or the diol dehydratase reactivating factor derived from the Lactobacillus reuteri JCM1112 strain and the Lactobacillus reuteri ATCC 53608 strain are preferable.
好ましくは、グリセロールデヒドラターゼの３種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含む形質転換体は、少なくともグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子の２種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含み、ジオールデヒドラターゼの３種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含む形質転換体は、少なくともジオールデヒドラターゼ再活性化因子の２種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含む。 Preferably, the transformant containing genes encoding the three subunits of glycerol dehydratase each include a gene encoding at least two subunits of the glycerol dehydratase reactivating factor, and the three types of diol dehydratase. A transformant containing a gene that encodes each subunit contains at least two genes that respectively encode two subunits of a diol dehydratase reactivation factor.
Lactobacillus reuteri由来のグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットのアミノ酸配列を配列番号１９及び２１に、スモールサブユニットのアミノ酸配列を配列番号２３及び２５に例示する。Lactobacillus reuteri由来のグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２０及び２２に、スモールサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２４及び２６に、例示する。 The amino acid sequence of the large subunit of the glycerol dehydratase reactivation factor derived from Lactobacillus reuteri is exemplified in SEQ ID NOs: 19 and 21, and the amino acid sequence of the small subunit is exemplified in SEQ ID NOs: 23 and 25. The base sequence of the gene encoding the large subunit of glycerol dehydratase derived from Lactobacillus reuteri is exemplified in SEQ ID NOs: 20 and 22, and the base sequence of the gene encoding the small subunit is exemplified in SEQ ID NOs: 24 and 26.
各アミノ酸配列を含むタンパク質は、もう一方のサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有する限り、各アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。 As long as the protein containing each amino acid sequence has glycerol dehydratase reactivating factor activity when expressed together with the other subunit, mutations such as deletion, substitution, addition, etc. in one or several amino acids in each amino acid sequence May have occurred.
また、各配列番号で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、もう一方のサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を用いる場合も本発明に含まれる。 Further, it hybridizes under stringent conditions with a complementary sequence to DNA consisting of all or part of the DNA consisting of the base sequence represented by each SEQ ID NO. And with the other subunit The case where a gene encoding a protein having glycerol dehydratase reactivating factor activity when expressed is also included in the present invention.
各サブユニットをコードする遺伝子は、同一の宿主で発現させる限り、同一のベクターに導入して形質転換を行ってもよいし、別々のベクターに導入して形質転換を行ってもよい。また。３種のサブユニットは、同一の種又は同一の株に由来するものを用いるのが好ましい。 As long as the genes encoding each subunit are expressed in the same host, they may be introduced into the same vector for transformation, or may be introduced into different vectors for transformation. Also. As the three subunits, those derived from the same species or the same strain are preferably used.
本明細書において、各配列番号で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じたアミノ酸配列とは、各配列番号で表されるアミノ酸配列の１個、又は好ましくは１０〜２０個、より好ましくは５〜１０個、さらに好ましくは２〜３個のアミノ酸が欠失してもよく、又は各配列番号で表されるアミノ酸配列に１個、又は好ましくは、１０〜２０個、より好ましくは５〜１０個、さらに好ましくは２〜３個のアミノ酸が付加してもよく、又は、各配列番号で表されるアミノ酸配列の１個、又は好ましくは、１０〜２０個、より好ましくは５〜１０個、さらに好ましくは２〜３個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよいことを意味する。 In the present specification, in the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO., An amino acid sequence in which mutation such as deletion, substitution, addition or the like has occurred in one or several amino acids refers to the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO. 1, or preferably 10 to 20, more preferably 5 to 10, more preferably 2 to 3 amino acids may be deleted, or one amino acid sequence represented by each SEQ ID NO. Or, preferably, 10 to 20, more preferably 5 to 10, more preferably 2 to 3 amino acids may be added, or one of the amino acid sequences represented by each SEQ ID NO, or preferably Means that 10 to 20, more preferably 5 to 10, more preferably 2 to 3 amino acids may be substituted with other amino acids.
本明細書において、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、各遺伝子に対し高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、０．５〜１ＭのＮａＣｌ存在下４２〜６８℃で、又は５０％ホルムアミド存在下４２℃で、又は水溶液中６５〜６８℃で、ハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（saline sodium citrate）溶液を用いて室温〜６８℃でフィルターを洗浄することにより達成できる。 In the present specification, stringent conditions refer to conditions in which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed, that is, high homology to each gene (homology is 90% or more, preferably Is 95% or more). More specifically, such conditions include hybridization at 42-68 ° C. in the presence of 0.5-1 M NaCl, 42 ° C. in the presence of 50% formamide, or 65-68 ° C. in an aqueous solution. After that, the filter can be washed at room temperature to 68 ° C. using a SSC (saline sodium citrate) solution having a concentration of 0.1 to 2 times.
ここで、「一部の配列」とは、各遺伝子の塩基配列の一部分を含むＤＮＡの塩基配列であって、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるのに十分な塩基配列の長さを有するもの、例えば、少なくとも５０塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。 Here, the “partial sequence” is a DNA base sequence that includes a part of the base sequence of each gene, and has a sufficient base sequence length for hybridization under stringent conditions. For example, a sequence of at least 50 bases, preferably at least 100 bases, more preferably at least 200 bases.
なお、遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutan-K（TAKARA社製）、Mutan-G（TAKARA社製））などを用いて、又は、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキットを用いて行うことができる。なお、上記手法により塩基配列が決定された後は、化学合成によって、又は染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって、又は該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。 To introduce a mutation into a gene, a mutation introduction kit (for example, Mutan-K (for example, Mutant-K) using a site-directed mutagenesis method, for example, by a known method such as the Kunkel method, the Gapped duplex method, or a similar method. TAKARA), Mutan-G (TAKARA)) or the like, or TAKARA LA PCR in vitro Mutagenesis series kit. After the nucleotide sequence is determined by the above method, the gene of the present invention is obtained by chemical synthesis, by PCR using chromosomal DNA as a template, or by hybridizing with a DNA fragment having the nucleotide sequence as a probe. Can be obtained.
本発明においてアルデヒドデヒドロゲナーゼとは、当技術分野において通常用いられる意味を有し、すなわちアルデヒドを酸化してカルボン酸又はアシル基を生成する酵素活性を有するタンパク質を意味する。 In the present invention, the aldehyde dehydrogenase has a meaning usually used in the art, that is, a protein having an enzyme activity that oxidizes an aldehyde to generate a carboxylic acid or an acyl group.
アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子としては、公知のものを使用でき、例えば、Alcaligenes属、Aspergillus属、Bacillus属、Candida属、Chromobacterium属、Clostridium属、Corynebacterium属、Escherichia属、Lactobacillus属、Lactococcus属、Oceanobacillus属、Pichia属、Pseudomonas属、Rhizobium属、Rhodobacter属、Rhodococcus属、Saccharomyces属、Salmonella属、Sulfolobus属、Thermotoga属等に属する細菌に由来するものを使用することができる。 As a gene encoding aldehyde dehydrogenase, a known gene can be used, for example, Alcaligenes genus, Aspergillus genus, Bacillus genus, Candida genus, Chromobacterium genus, Clostridium genus, Corynebacterium genus, Escherichia genus, Lactobacillus genus, Lactococcus genus, Oceanobacillus genus , Pichia genus, Pseudomonas genus, Rhizobium genus, Rhodobacter genus, Rhodococcus genus, Saccharomyces genus, Salmonella genus, Sulfolobus genus, Thermotoga genus and the like can be used.
形質転換体の作成
本発明の形質転換体は、上記４種の遺伝子又はその一部を適当なベクターに連結し、得られた組換えベクターを本発明の遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。「一部」とは、宿主中に導入された場合に各遺伝子がコードするタンパク質を発現することができる各遺伝子の一部分を指す。
Preparation of transformant The transformant of the present invention comprises the above four genes or a part thereof linked to an appropriate vector, and the resulting recombinant vector is introduced into a host so that the gene of the present invention can be expressed. It can be obtained by introduction. “Part” refers to a part of each gene capable of expressing the protein encoded by each gene when introduced into a host.
バクテリアゲノムから所望の遺伝子を得る方法は、分子生物学の分野において周知である。例えば遺伝子の配列が既知の場合、制限エンドヌクレアーゼ消化により適したゲノムライブラリを作り、所望の遺伝子配列に相補的なプローブを用いてスクリーニングすることができる。配列が単離されたら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，２０２号）のような標準的増幅法を用いてＤＮＡを増幅し、形質転換に適した量のＤＮＡを得ることができる。 Methods for obtaining a desired gene from a bacterial genome are well known in the field of molecular biology. For example, when the gene sequence is known, a suitable genomic library can be prepared by restriction endonuclease digestion and screened using a probe complementary to the desired gene sequence. Once the sequence has been isolated, the DNA is amplified using standard amplification methods such as the polymerase chain reaction (PCR) (US Pat. No. 4,683,202) to obtain a quantity suitable for transformation. Can do.
本発明においては、グリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットをコードする遺伝子、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子、プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子の各サブユニットをコードする遺伝子及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、別々にベクターに導入して複数のベクターで形質転換を実施してもよいし、複数種の遺伝子を１つのベクターに導入して形質転換を行ってもよい。 In the present invention, a gene encoding each subunit of glycerol dehydratase and / or diol dehydratase, 1,3-propanediol oxidoreductase gene, propanediol oxidoreductase gene, glycerol dehydratase reactivation factor and / or diol dehydratase reactivation The gene encoding each subunit of the oxidative factor and the aldehyde dehydrogenase gene may be separately introduced into a vector and transformed with a plurality of vectors, or a plurality of genes may be introduced into a single vector and transformed. Conversion may be performed.
本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、コスミドＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＳＣ１０１、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＡＣＹＣ１１７、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＥＴＤｕｅｔ−１、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１等が挙げられ、ファージＤＮＡとしては、例えばλｇｔ１０、Ｃｈａｒｏｎ ４Ａ、ＥＭＢＬ−、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９等が挙げられる。 The vector for inserting the gene of the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated in a host cell, and examples thereof include plasmid DNA, phage DNA, and cosmid DNA. Examples of plasmid DNA include pBR322, pSC101, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pACYC117, pBluescript II SK (+), pETDuet-1, pACYCDuet-1, and the like. Examples of phage DNA include λgt10, Char, EMBL-, M13mp18, M13mp19 and the like.
宿主としては、目的とする遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、Ralstonia eutrophaなどのRalstonia属に属する細菌、Pseudomonas putidaなどのPseudomonas属に属する細菌、Bacillus subtilisなどのBacillus属に属する細菌、大腸菌などのEscherichia属に属する細菌、Saccharomyces cerevisiaeなどのSaccharomyces属に属する酵母、Candida maltosaなどのCandida属に属する酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などの動物細胞、ＳＦ９細胞などの昆虫細胞などが挙げられる。 The host is not particularly limited as long as it can express the target gene. For example, bacteria belonging to the genus Ralstonia such as Ralstonia eutropha, bacteria belonging to the genus Pseudomonas such as Pseudomonas putida, and belonging to the genus Bacillus such as Bacillus subtilis Bacteria, bacteria belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli, yeasts belonging to the genus Saccharomyces such as Saccharomyces cerevisiae, yeasts belonging to the genus Candida such as Candida maltosa, animals such as COS cells, CHO cells, mouse L cells, rat GH3, human FL cells Insect cells such as cells and SF9 cells.
宿主細胞においては、グリセロールデヒドロゲナーゼを発現しない宿主細胞、すなわちグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有しない細胞及びグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子をノックアウトした細胞を使用するのが好ましい。これらを用いることにより、グリセロールが酸化されてジヒドロキシアセトンに変換される経路を遮断することができ、より高い収率で１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸を製造することができる。 As host cells, it is preferable to use host cells that do not express glycerol dehydrogenase, that is, cells that do not have a glycerol dehydrogenase gene and cells in which a glycerol dehydrogenase gene has been knocked out. By using these, the pathway in which glycerol is oxidized and converted into dihydroxyacetone can be blocked, and 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid can be produced with higher yield.
グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子をノックアウトした細胞とは、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されて発現できないような状況にある細胞を意味する。具体的には、該細胞は、細胞中のグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子を標的遺伝子として、標的遺伝子の任意の位置で相同組換えを起こすベクター（ターゲティングベクター）を用いて当該遺伝子を破壊する方法（ジーンターゲティング法）や、標的遺伝子の任意の位置にトラップベクター（プロモーターを持たないレポーター遺伝子）を挿入して当該遺伝子を破壊しその機能を失わせる方法（遺伝子トラップ法）、それらを組み合わせた方法等の通常当技術分野でノックアウト細胞、トランスジェニック動物（ノックアウト動物含む）等を作製する際に用いられる方法を用いて該細胞中のグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊することによって作製される。相同置換を起こす位置又はトラップベクターを挿入する位置は、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現の消失をもたらす変異を生じる位置であれば特に限定されないが、好ましくは転写調節領域、より好ましくは第２エクソンを置換する。またグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子をノックアウトする他の方法としては、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子のアンチセンスｃＤＮＡを発現するベクターを導入する方法や、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子の２重鎖ＲＮＡを発現するベクターを細胞に導入する方法が挙げられる。当該ベクターとしては、ウイルスベクターやプラスミドベクター等が包含され、通常の遺伝子工学的手法に基づき、例えばMolecular cloning 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い作製することができる。又、市販されているベクターを任意の制限酵素で切断し所望の遺伝子等を組み込んで半合成することもできる。 The cell in which the glycerol dehydrogenase gene is knocked out means a cell in a situation where the glycerol dehydrogenase gene is destroyed and cannot be expressed. Specifically, the cell uses a glycerol dehydrogenase gene in the cell as a target gene and destroys the gene using a vector (targeting vector) that causes homologous recombination at any position of the target gene (gene targeting method) ), A method of inserting a trap vector (reporter gene without a promoter) at an arbitrary position of the target gene to destroy the gene and losing its function (gene trap method), a method combining them, etc. It is produced by disrupting the glycerol dehydrogenase gene in the cells using a method used for producing knockout cells, transgenic animals (including knockout animals) and the like in the technical field. The position at which homologous substitution occurs or the position at which the trap vector is inserted is not particularly limited as long as it causes a mutation that results in loss of expression of the glycerol dehydrogenase gene, but it preferably replaces the transcriptional regulatory region, more preferably the second exon. . Other methods for knocking out the glycerol dehydrogenase gene include a method of introducing a vector expressing an antisense cDNA of the glycerol dehydrogenase gene and a method of introducing a vector expressing a double-stranded RNA of the glycerol dehydrogenase gene into a cell. It is done. Such vectors include viral vectors, plasmid vectors, and the like, and can be prepared according to basic books such as Molecular cloning 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), etc., based on ordinary genetic engineering techniques. Alternatively, a commercially available vector can be cleaved with an arbitrary restriction enzyme, and a desired gene or the like can be incorporated and semi-synthesized.
グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子がノックアウトされているか否かは、該ベクターが導入された細胞についてサザンブロットを行い正しく相同組換えが起こっていることを確認することによって、ターゲティングベクターに宿主細胞が有しない薬剤耐性遺伝子を入れておき薬剤耐性の形質が組み込まれたものを選抜することによって、破壊導入後、選抜した株のゲノム、菌体、菌体培養液等をテンプレートにして、破壊するグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子のＦ側とＲ側のプライマーを用いてＰＣＲをかけ、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子と破壊導入部位の配列を合わせた大きさのＤＮＡ断片の増幅を確認することによって、もしくはそれをクローニングして配列解析することによって、又はジヒドロキシアセトンが生成しないことを確認することによっても知ることができる。 Whether or not the glycerol dehydrogenase gene is knocked out is determined by performing a Southern blot on cells into which the vector has been introduced and confirming that homologous recombination has occurred correctly. And select the one with the drug-resistant trait incorporated, and use the F, the glycerol dehydrogenase gene to be destroyed after the introduction of the disruption, using the selected strain's genome, bacterial body, bacterial culture, etc. as a template. And PCR using the R-side primers and confirming amplification of a DNA fragment of a size that combines the sequence of the glycerol dehydrogenase gene and the disruption introduction site, or by cloning and sequencing it, or Dihydroxyacetone does not form It can be known also by checking the.
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、組換えベクターが該宿主中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、目的とするＤＮＡ、転写終結配列を含む構成であることが好ましい。発現ベクターとしては、広範囲の宿主において複製・保持されるＲＫ２複製起点を有するｐＬＡ２９１７（ATCC 37355）やＲＳＦ１０１０複製起点を有するｐＪＲＤ２１５（ATCC 37533）等が挙げられる。 When a bacterium such as Escherichia coli is used as a host, it is preferable that the recombinant vector is capable of autonomous replication in the host and at the same time includes a promoter, the target DNA, and a transcription termination sequence. Examples of expression vectors include pLA2917 (ATCC 37355) having an RK2 replication origin that is replicated and maintained in a wide range of hosts, pJRD215 (ATCC 37533) having an RSF1010 replication origin, and the like.
プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組換えベクターの導入方法としては、特に限定されないが、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Current Protocols in Molecular Biology, 1, 181（1994））やエレクトロポレーション法等が挙げられる。 Any promoter that can be expressed in the host may be used. For example, promoters derived from Escherichia coli or phages such as trp promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, T7 promoter, etc. are used. The method for introducing a recombinant vector into bacteria is not particularly limited, and examples thereof include a method using calcium ions (Current Protocols in Molecular Biology, 1, 181 (1994)) and an electroporation method.
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えばＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等が挙げられる。プロモーターとしては、例えばｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＧＡＰプロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、特に限定されないが、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 192, 9-1933（1978））、酢酸リチウム法（J. Bacteriol., 153, 163-168（1983））等が挙げられる。 When yeast is used as a host, examples of expression vectors include YEp13 and YCp50. Examples of the promoter include gal 1 promoter, gal 10 promoter, heat shock protein promoter, GAP promoter and the like. The method for introducing a recombinant vector into yeast is not particularly limited. For example, electroporation method, spheroplast method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 192, 9-1933 (1978)), Examples include the lithium acetate method (J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)).
動物細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社）等が用いられる。プロモーターとしては、例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等が挙げられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、特に限定されないが、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。 When animal cells are used as hosts, for example, pcDNAI, pcDNAI / Amp (Invitrogen) and the like are used as expression vectors. Examples of the promoter include SRα promoter, SV40 promoter, CMV promoter and the like. The method for introducing a recombinant vector into animal cells is not particularly limited, and examples thereof include an electroporation method, a calcium phosphate method, and a lipofection method.
遺伝子の単離及び形質転換体の作成については、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。 The isolation of genes and the preparation of transformants are described in Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press.
１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸の製造
本発明において、１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸の製造は、グリセロールの存在下、本発明の形質転換体を培養し、培養物（培養菌体又は培養上清）中に１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸を生成蓄積させ、該培養物から１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸を採取することにより実施できる。
Production of 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid In the present invention, 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid are produced by culturing the transformant of the present invention in the presence of glycerol. By producing and accumulating 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid in a product (cultured cells or culture supernatant), and collecting 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid from the culture Can be implemented.
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って、炭素源としてグリセロールを用いることにより行われる。例えば、比較的リッチな培地、例えば２培地等を用いて好気培養し、菌体量を増やしてから嫌気条件にし、グリセロールを与えて発酵を行う。ｐＨは、宿主の生育を妨害せず、かつ発酵液から酸を分離するときの障害とならない試薬を用いて調整する。炭酸ナトリウム、アンモニア、ナトリウムイオン供給源、例えば塩化ナトリウムを添加してもよい。また、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化アンモニウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液等の一般的なアルカリ試薬を用いてもよい。培養期間中ｐＨは、５．０〜８．０、好ましくは５．５〜７．５に保持する。 The method of culturing the transformant of the present invention is performed by using glycerol as a carbon source according to a usual method used for culturing a host. For example, an aerobic culture is performed using a relatively rich medium, for example, two mediums, and the amount of bacterial cells is increased, followed by anaerobic conditions, and fermentation is performed with glycerol. The pH is adjusted using a reagent that does not interfere with the growth of the host and does not interfere with the separation of the acid from the fermentation broth. Sodium carbonate, ammonia, a sodium ion source such as sodium chloride may be added. In addition, a common alkaline reagent such as an aqueous sodium hydroxide solution, an aqueous potassium hydroxide solution, an aqueous sodium hydroxide solution, an aqueous ammonium hydroxide solution, an aqueous calcium hydroxide solution, an aqueous potassium carbonate solution, an aqueous sodium carbonate solution, or an aqueous potassium acetate solution may be used. . The pH is maintained at 5.0 to 8.0, preferably 5.5 to 7.5 during the culture period.
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。また、無機物としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。 Examples of the nitrogen source include ammonium salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate, as well as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, and the like. Examples of inorganic substances include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, and sodium chloride.
培養中は、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、インデューサーを培地に添加することもできる。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加することができる。 During the culture, antibiotics such as kanamycin, ampicillin, and tetracycline may be added to the medium. When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter, an inducer can be added to the medium. For example, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), indoleacrylic acid (IAA), or the like can be added to the medium.
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えばＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地にウシ胎児血清を添加した培地が用いられる。培養は、通常５％ＣＯ２存在下、３０〜４０℃で１〜３０日間行う。培養中はカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。 As a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host, for example, RPMI-1640, DMEM medium, or a medium obtained by adding fetal bovine serum to these mediums is used. The culture is usually performed at 30 to 40 ° C. for 1 to 30 days in the presence of 5% CO 2 . During culture, antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium.
あるいは、上記において得られた形質転換体の培養物から遠心分離などによって集菌を行い、適当な緩衝液に懸濁する。この菌体懸濁液をグリセロールを含む緩衝液に懸濁し、反応を行うことによって、１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸を製造することができる。反応の条件は、例えば、反応温度は１０〜８０℃、好ましくは１５〜５０℃、反応時間は５分〜９６時間、好ましくは１０分〜７２時間、ｐＨは５．０〜８．０、好ましくは５．５〜７．５である。 Alternatively, the cells are collected from the transformant culture obtained above by centrifugation or the like and suspended in an appropriate buffer. 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid can be produced by suspending this cell suspension in a buffer containing glycerol and carrying out the reaction. The reaction conditions are, for example, a reaction temperature of 10 to 80 ° C., preferably 15 to 50 ° C., a reaction time of 5 minutes to 96 hours, preferably 10 minutes to 72 hours, and a pH of 5.0 to 8.0, preferably Is 5.5 to 7.5.
また、該培養物の処理物を用いて反応を行うこともできる。該処理物としては、菌体破砕物、菌体破砕物又は培養上清から調製した粗酵素、精製酵素等が挙げられる。また、常法により担体に固定化した菌体、該処理物、酵素等を用いることができる。 The reaction can also be performed using a processed product of the culture. Examples of the treated product include crushed cells, crushed cells, or crude enzymes and purified enzymes prepared from culture supernatants. Moreover, the microbial cell fixed to the support | carrier by the conventional method, this processed material, an enzyme, etc. can be used.
培養培地からの１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸の精製法は当該技術分野において周知である。例えば、有機溶媒を用いる抽出、蒸留及びカラムクロマトグラフィーに反応混合物を供することにより、培地から１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸を得ることができる（米国特許第５，３５６，８１２号）。また、限外濾過膜や水などの低分子のみが透過できるゼオライト分離膜などで発酵液の濃縮を行うのが好ましい。濃縮を行うことにより、水を蒸発させるためのエネルギーを低減することができる。 Methods for purifying 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid from culture media are well known in the art. For example, 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid can be obtained from the culture medium by subjecting the reaction mixture to extraction with organic solvent, distillation and column chromatography (US Pat. No. 5,356,812). ). Further, it is preferable to concentrate the fermentation broth with an ultrafiltration membrane or a zeolite separation membrane that allows only low molecules such as water to pass through. By concentrating, the energy for evaporating water can be reduced.
培地を高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析にかけることにより、１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸を直接同定することもできる。 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid can also be identified directly by subjecting the medium to high pressure liquid chromatography (HPLC) analysis.
（実施例１）グリセロールデヒドラターゼ遺伝子の取得
合成オリゴヌクレオチドプライマー（フォワードプライマー：5'-ATGAAACGTCAAAAACGATTTGAAGAACTAGAAAAAC-3'（配列番号２７）、リバースプライマー：5'-TTAGTTATCGCCCTTTAGCTTCTTACGACTTT-3'（配列番号２８）を作成し、Lactobacillus reuteri JCM1112株のゲノムを鋳型にして、以下の条件でＰＣＲ反応を実施した。
(Example 1) Acquisition of glycerol dehydratase gene A synthetic oligonucleotide primer (forward primer: 5'-ATGAAACGTCAAAAACGATTTGAAGAACTAGAAAAAC-3 '(SEQ ID NO: 27), reverse primer: 5'-TTAGTTATCGCCCTTTAGCTTCTTACGACTTT-3' (SEQ ID NO: 28) was prepared. A PCR reaction was performed under the following conditions using the genome of Lactobacillus reuteri JCM1112 strain as a template.
ＰＣＲ反応組成（μl）
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ＫＯＤｐｌｕｓ ５
２ｍＭ ｄＮＴＰｓ ５
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２
ゲノム １１１ｎｇ／μｌ １
ＫＯＤｐｌｕｓ １
水 ３４
フォワードプライマー ２０ｐＭ １
リバースプライマー ２０ｐＭ １
反応系体積 計 ５０
反応サイクル：９４℃ ２分×１、９４℃ １５秒、４５〜６５℃ ３０秒、６８℃ ５分×３０回、４℃ ∞。
PCR reaction composition (μl)
10 x Buffer KODplus 5
2 mM dNTPs 5
25 mM MgSO 4 2
Genome 111 ng / μl 1
KODplus 1
Water 34
Forward primer 20pM 1
Reverse primer 20pM 1
Reaction system volume meter 50
Reaction cycle: 94 ° C. 2 minutes × 1, 94 ° C. 15 seconds, 45 to 65 ° C. 30 seconds, 68 ° C. 5 minutes × 30 times, 4 ° C.∞.
断片溶液にＴａｑプレミックスを等量加えて、７２℃で１０分、３’Ａ−オーバーハング処理し、精製したサンプルをｐＣＲ４−ＴＯＰＯにＴＡクローニングした。シーケンサーはＡＢＩのＰＥＩＳＭ３１０、３１００を使用した。その結果、配列番号２で示されるグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列、配列番号６で示されるグリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列、並びに配列番号１０で示されるグリセロールデヒドラターゼのスモールサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を決定した。 An equal amount of Taq premix was added to the fragment solution, treated with 3'A-overhang at 72 ° C for 10 minutes, and the purified sample was TA cloned into pCR4-TOPO. The sequencer used was ABI's PEISM 310,3100. As a result, the base sequence of the gene encoding the large subunit of glycerol dehydratase represented by SEQ ID NO: 2, the base sequence of the gene encoding the medium subunit of glycerol dehydratase represented by SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 10 The nucleotide sequence of the gene encoding the small subunit of glycerol dehydratase was determined.
また、フォワードプライマー：5'-ATGAAACGTCAAAAACGTTTTGAAGAACTA-3'（配列番号２９）、リバースプライマー：5'-CTAGTTATCACCCTTGAGCTTCTTT-3'（配列番号３０）を作成し、Lactobacillus reuteri ATCC 53608株のゲノムを鋳型にして、上記と同様にＰＣＲ反応及びＤＮＡシークエンスを実施した。その結果、配列番号４で示されるグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列、配列番号８で示されるグリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列、並びに配列番号１２で示されるグリセロールデヒドラターゼのスモールサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を決定した。 Further, a forward primer: 5′-ATGAAACGTCAAAAACGTTTTGAAGAACTA-3 ′ (SEQ ID NO: 29) and a reverse primer: 5′-CTAGTTATCACCCTTGAGCTTCTTT-3 ′ (SEQ ID NO: 30) were prepared, and the above-mentioned genome of Lactobacillus reuteri ATCC 53608 strain was used as a template. PCR reaction and DNA sequencing were performed as described above. As a result, the base sequence of the gene encoding the large subunit of glycerol dehydratase shown in SEQ ID NO: 4, the base sequence of the gene encoding the medium subunit of glycerol dehydratase shown in SEQ ID NO: 8, and the sequence shown in SEQ ID NO: 12 The nucleotide sequence of the gene encoding the small subunit of glycerol dehydratase was determined.
（実施例２）プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子の取得
フォワードプライマー：5'-ATGGGAGGCATAATTCCAATGGAAAAATA-3'（配列番号３１）、リバースプライマー：5'-TTAACGAATTATTGCTTCGTAAACCATCTTC-3'（配列番号３２）を作成し、Lactobacillus reuteri JCM1112株のゲノムを鋳型にして、実施例１と同様にＰＣＲ反応及びＤＮＡシークエンスを実施した。その結果、配列番号１４で示されるプロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子の塩基配列を決定した。
(Example 2) Acquisition of propanediol oxidoreductase gene Forward primer: 5'-ATGGGAGGCATAATTCCAATGGAAAAATA-3 '(SEQ ID NO: 31), reverse primer: 5'-TTAACGAATTATTGCTTCGTAAACCATCTTC-3' (SEQ ID NO: 32) was prepared, and Lactobacillus reuteri JCM1112 PCR reaction and DNA sequencing were performed in the same manner as in Example 1 using the strain genome as a template. As a result, the base sequence of the propanediol oxidoreductase gene represented by SEQ ID NO: 14 was determined.
また、フォワードプライマー：5'-ATGGGAGGCATAATGCCGATG-3'（配列番号３３）、リバースプライマー：5'-TTAACGAATTATTGCTTCGTAAATCATCTTC-3'（配列番号３４）を作成し、Lactobacillus reuteri ATCC 53608株のゲノムを鋳型にして、実施例１と同様にＰＣＲ反応及びＤＮＡシークエンスを実施した。その結果、配列番号１６で示されるプロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子の塩基配列を決定した。 In addition, a forward primer: 5′-ATGGGAGGCATAATGCCGATG-3 ′ (SEQ ID NO: 33) and a reverse primer: 5′-TTAACGAATTATTGCTTCGTAAATCATCTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 34) were prepared and performed using the genome of Lactobacillus reuteri ATCC 53608 strain as a template. PCR reaction and DNA sequencing were performed as in Example 1. As a result, the base sequence of the propanediol oxidoreductase gene represented by SEQ ID NO: 16 was determined.
（実施例３）１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子の取得
フォワードプライマー：5'-ATGAATAGACAATTTGATTTCTTAATGCCAAG-3'（配列番号３５）、リバースプライマー：5'-TTAGTAGATGCCATCGTAAGCCTTTT-3'（配列番号３６）を作成し、Lactobacillus reuteri JCM1112株のゲノムを鋳型にして、実施例１と同様にＰＣＲ反応及びＤＮＡシークエンスを実施した。その結果、配列番号１８で示される１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子の塩基配列を決定した。
(Example 3) Obtaining 1,3-propanediol oxidoreductase gene Forward primer: 5'-ATGAATAGACAATTTGATTTCTTAATGCCAAG-3 '(SEQ ID NO: 35), reverse primer: 5'-TTAGTAGATGCCATCGTAAGCCTTTT-3' (SEQ ID NO: 36) Using the genome of Lactobacillus reuteri JCM1112 as a template, PCR reaction and DNA sequencing were carried out in the same manner as in Example 1. As a result, the base sequence of the 1,3-propanediol oxidoreductase gene represented by SEQ ID NO: 18 was determined.
（実施例４）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子の取得
フォワードプライマー：5'-ATGGCAACTGAAAAAGTAATTGGTGTTGATATT-3'（配列番号３７）、リバースプライマー：5'-TCACCTGTTTGCCATTTCCTTAAAAGGGATT-3'（配列番号３８）を作成し、Lactobacillus reuteri JCM1112株のゲノムを鋳型にして、実施例１と同様にＰＣＲ反応及びＤＮＡシークエンスを実施した。配列番号２０で示されるグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子、並びに配列番号２４で示されるグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を決定した。
(Example 4) Acquisition of glycerol dehydratase reactivation factor gene Forward primer: 5'-ATGGCAACTGAAAAAGTAATTGGTGTTGATATT-3 '(SEQ ID NO: 37), reverse primer: 5'-TCACCTGTTTGCCATTTCCTTAAAAGGGATT-3' (SEQ ID NO: 38) was prepared, and Lactobacillus PCR reaction and DNA sequencing were performed in the same manner as in Example 1 using the genome of reuteri JCM1112 strain as a template. The base sequence of the gene encoding the large subunit of the glycerol dehydratase reactivation factor represented by SEQ ID NO: 20 and the gene encoding the small subunit of the glycerol dehydratase reactivation factor represented by SEQ ID NO: 24 were determined.
また、フォワードプライマー：5'-ATGGCAACTGAAAAAGTAATTGGTGTTG-3'（配列番号３９）、リバースプライマー：5'-TCACCTGTTTACCATTTCCTTAAAGG-3'（配列番号４０）を作成し、Lactobacillus reuteri ATCC 53608株のゲノムを鋳型にして、実施例１と同様にＰＣＲ反応及びＤＮＡシークエンスを実施した。その結果、配列番号２２で示されるグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子、並びに配列番号２６で示されるグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を決定した。 In addition, a forward primer: 5′-ATGGCAACTGAAAAAGTAATTGGTGTTG-3 ′ (SEQ ID NO: 39) and a reverse primer: 5′-TCACCTGTTTACCATTTCCTTAAAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 40) were prepared and performed using the genome of Lactobacillus reuteri ATCC 53608 strain as a template. PCR reaction and DNA sequencing were performed as in Example 1. As a result, the base sequence of the gene encoding the large subunit of the glycerol dehydratase reactivation factor represented by SEQ ID NO: 22 and the gene encoding the small subunit of the glycerol dehydratase reactivation factor represented by SEQ ID NO: 26 were determined. did.
（実施例５）１，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸の製造
(1)組み換え微生物の作成
Novagen社のｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターのマルチクローニングサイト１に乳酸菌のグリセロールデヒドラターゼ遺伝子、マルチクローニングサイト２に１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子を導入したプラスミド１と、Novagen社のｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクターのマルチクローニングサイト１にグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子、マルチクローニングサイト２にアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（大腸菌のａｌｄＢ アクセッションナンバー L40742）を導入したプラスミド２をそれぞれ作成し、これをＢＬ２１（ＤＥ３）−ＲＩＬに、Bio-RadのGENE PULSER IIエレクトロポレーションで導入した。
Example 5 Production of 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid
(1) Creation of recombinant microorganisms
Multicloning of Novagen pETDuet-1 vector multicloning site 1 with lactic acid glycerol dehydratase gene and multicloning site 2 introduced 1,3-propanediol oxidoreductase gene with Novagen pACYCDuet-1 vector A plasmid 2 in which a glycerol dehydratase reactivator gene was introduced into site 1 and an aldehyde dehydrogenase gene (aldB accession number L40742 of Escherichia coli) was introduced into multicloning site 2 was prepared, and this was added to BL21 (DE3) -RIL and Bio- Introduced by Rad's GENE PULSER II electroporation.
(2)組み換え微生物の培養
この菌株１μｌループ１掻き分を、クロラムフェニコール１００μｇ／ｍｌ、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む２培地５ｍｌ（グリセロール４０ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム １０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４６ｇ／ｌ、酵母エキス４０ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム七水和物１ｇ／ｌ、消泡剤アデカノール２０滴／ｌ）で、３７℃にて振とうしながら好気条件で、対数増殖後期（ＯＤ６６０＝５０）まで培養した。この培養液１ｍｌをとり、再度５００ｍｌ坂口フラスコに入れたクロラムフェニコール１００μｇ／ｍｌ、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む２培地１００ｍｌに植え継ぎ、３７℃にて振とうしながら好気条件で、対数増殖後期（ＯＤ６６０＝５０）まで培養した。
(2) Culture of recombinant microorganism 1 scrap of 1 μl loop of this strain was added to 5 ml of 2 medium containing chloramphenicol 100 μg / ml and ampicillin 50 μg / ml (glycerol 40 g / l, ammonium sulfate 10 g / l, KH 2 PO 4 2 g / l, K 2 HPO 4 6 g / l, yeast extract 40 g / l, magnesium sulfate heptahydrate 1 g / l, defoamer adecanol 20 drops / l) under aerobic conditions while shaking at 37 ° C. And cultured until late logarithmic growth (OD 660 = 50). Take 1 ml of this culture and transfer to 100 ml of 2 medium containing 100 μg / ml chloramphenicol and 50 μg / ml ampicillin again in a 500 ml Sakaguchi flask. Logarithmic growth under aerobic conditions with shaking at 37 ° C. The cells were cultured until late (OD 660 = 50).
ここでＩＰＴＧを１ｍＭとなるように投入し、２時間おいた。菌体を遠心分離で回収し、１Ｍのグリセロール１００ｍｌに加え、気相部を窒素に置換した１００ｍｌボトルをボトルローラー上に３７℃で５時間おき、その後、液を分析した。その結果、液中には１，３−プロパンジオールが０．４Ｍ、３−ヒドロキシプロピオン酸が０．４Ｍ含まれていた。 Here, IPTG was added to 1 mM and allowed to stand for 2 hours. The cells were collected by centrifugation, added to 100 ml of 1M glycerol, and a 100 ml bottle in which the gas phase was replaced with nitrogen was placed on a bottle roller at 37 ° C. for 5 hours, and then the liquid was analyzed. As a result, the liquid contained 0.4M 1,3-propanediol and 0.4M 3-hydroxypropionic acid.
配列番号２７〜４０：合成オリゴヌクレオチド SEQ ID NOs: 27-40: synthetic oligonucleotides
Claims (14)
(a)配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニット及びスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子であり、
グリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニットをコードする遺伝子が以下の(c)又は(d)のタンパク質：
(c)配列番号５又は７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(d)配列番号５又は７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニット及びスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子であり、
グリセロールデヒドラターゼのスモールサブユニットをコードする遺伝子が以下の(e)又は(f)のタンパク質：
(e)配列番号９又は１１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(f)配列番号９又は１１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニット及びミディアムサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子である、請求項２記載の形質転換体。 The gene encoding the large subunit of glycerol dehydratase is the following protein (a) or (b):
(a) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3
(b) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 contains an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added, and is expressed together with the medium subunit and small subunit of glycerol dehydratase A gene that sometimes encodes a protein having glycerol dehydratase activity,
The gene encoding the medium subunit of glycerol dehydratase is the following protein (c) or (d):
(c) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 7
(d) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 7 contains an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and is expressed together with the large subunit and small subunit of glycerol dehydratase A gene that sometimes encodes a protein having glycerol dehydratase activity,
The gene encoding the small subunit of glycerol dehydratase is the following protein (e) or (f):
(e) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 11
(f) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 11 contains an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added, and is expressed together with the large subunit and medium subunit of glycerol dehydratase The transformant according to claim 2, which is a gene encoding a protein sometimes having glycerol dehydratase activity.
(a)配列番号２又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号２又は４で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニット及びスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含み、
グリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニットをコードする遺伝子が、以下の(c)又は(d)のＤＮＡ：
(c)配列番号６又は８で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(d)配列番号６又は８で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニット及びスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含み、
グリセロールデヒドラターゼのスモールサブユニットをコードする遺伝子が、以下の(e)又は(f)のＤＮＡ：
(e)配列番号１０又は１２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(f)配列番号１０又は１２で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニット及びミディアムサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含む、請求項２記載の形質転換体。 The gene encoding the large subunit of glycerol dehydratase is the following DNA (a) or (b):
(a) DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4
(b) a medium subunit of glycerol dehydratase that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 And a DNA encoding a protein having glycerol dehydratase activity when expressed together with a small subunit
Including
The gene encoding the medium subunit of glycerol dehydratase is the following DNA (c) or (d):
(c) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 or 8
(d) a large subunit of glycerol dehydratase that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 or 8 And a DNA encoding a protein having glycerol dehydratase activity when expressed together with a small subunit
Including
The gene encoding the small subunit of glycerol dehydratase is the following DNA (e) or (f):
(e) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 or 12
(f) a large subunit of glycerol dehydratase that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to a DNA comprising all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 or 12 And a protein encoding a protein having glycerol dehydratase activity when expressed together with a medium subunit
The transformant of Claim 2 containing this.
(a)配列番号１３又は１５で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号１３又は１５で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質。 The transformant according to claim 5, wherein the gene encoding propanediol oxidoreductase is a gene encoding the following protein (a) or (b):
(a) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15
(b) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15, and having propanediol oxidoreductase activity.
(a)配列番号１４又は１６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号１４又は１６で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 The transformant according to claim 5, wherein the gene encoding propanediol oxidoreductase comprises the following DNA (a) or (b):
(a) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 or 16
(b) hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 or 16, and exhibits propanediol oxidoreductase activity DNA encoding a protein having the same.
(a)配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号１７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質。 The transformant according to claim 8, wherein the gene encoding 1,3-propanediol oxidoreductase is a gene encoding the following protein (a) or (b):
(a) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17
(b) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, and having 1,3-propanediol oxidoreductase activity.
(a)配列番号１８で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号１８で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 The transformant according to claim 8, wherein the gene encoding 1,3-propanediol oxidoreductase comprises the following DNA (a) or (b):
(a) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 18
(b) hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 18, and 1,3-propanediol oxidoreductase DNA encoding a protein having activity.
(a)配列番号１９又は２１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号１９又は２１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子であり、
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットをコードする遺伝子が以下の(c)又は(d)のタンパク質：
(c)配列番号２３又は２５で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(d)配列番号２３又は２５で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子である、請求項１１記載の形質転換体。 The gene encoding the large subunit of glycerol dehydratase reactivating factor is the following protein (a) or (b):
(a) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or 21
(b) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or 21 contains an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and is expressed together with a small subunit of a glycerol dehydratase reactivation factor A gene that sometimes encodes a protein having glycerol dehydratase reactivator activity,
The gene encoding the small subunit of the glycerol dehydratase reactivating factor is the following protein (c) or (d):
(c) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 or 25
(d) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 or 25 contains an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and is expressed together with the large subunit of glycerol dehydratase reactivating factor 12. The transformant according to claim 11, which is a gene encoding a protein sometimes having glycerol dehydratase reactivating factor activity.
(a)配列番号２０又は２２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号２０又は２２で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含み、
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットをコードする遺伝子が、以下の(c)又は(d)のＤＮＡ：
(c)配列番号２４又は２６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(d)配列番号２４又は２６で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含む、請求項１１記載の形質転換体。 The gene encoding the large subunit of glycerol dehydratase reactivating factor is the following DNA (a) or (b):
(a) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 or 22
(b) a glycerol dehydratase reactivating factor that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to a DNA comprising all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 or 22 DNA encoding a protein having glycerol dehydratase reactivator activity when expressed together with the small subunit of
Including
The gene encoding the small subunit of the glycerol dehydratase reactivation factor is the following DNA (c) or (d):
(c) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 24 or 26
(d) a glycerol dehydratase reactivation factor that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to a DNA comprising all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 24 or 26 DNA encoding a protein having glycerol dehydratase reactivator activity when expressed with the large subunit of
The transformant of Claim 11 containing this.
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|---|---|---|---|
| JP2004093417A JP2005278414A (en) | 2004-03-26 | 2004-03-26 | Methods for producing 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid |
| US10/594,417 US20070148749A1 (en) | 2004-03-26 | 2005-03-25 | Process for producting 1,3-propanediol and or/3-hydroxypropionic acid |
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| JP2007159500A (en) * | 2005-12-15 | 2007-06-28 | Sumitomo Chemical Co Ltd | Production method of carboxylic acid |
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| JP2013070675A (en) * | 2011-09-28 | 2013-04-22 | Daicel Corp | Method for culturing recombinant bacterium producing alkyl diol |
| JP2015500016A (en) * | 2011-11-30 | 2015-01-05 | コンパニ・ジェルベ・ダノン | Reuterin-producing Lactobacillus brevis |
-
2004
- 2004-03-26 JP JP2004093417A patent/JP2005278414A/en active Pending
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