JP2005128030A - Liquid chromatograph - Google Patents
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Abstract
【課題】 ステップグラジエント方式を利用した液体クロマトグラフであって、分離性能を維持したまま測定時間の短縮化、装置の小型化及び低価格化を図り得るものを得る。
【解決手段】 流路２に、送液ポンプ４、インジエクタ５、分離カラム６及び検出器７を順に連結し、上記インジェクタ５として、試料または第２の移動相を吸引するサンプリングノズル８と、六方切り換え弁９と、六方切り換え弁９に接続された液体保持用配管１０とを有し、切り換え弁９の第１の切り換え状態において第１の移動相により目的成分を溶出し、第２の切り換え状態において、液体保持用配管１０に保持されていた第２の移動相を流路に導き非目的成分を溶出・分離する液体クロマトグラフ１。
【選択図】 図２
PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a liquid chromatograph using a step gradient method capable of reducing measurement time, reducing the size and cost of an apparatus while maintaining separation performance.
A liquid feed pump, an injector, a separation column, and a detector are connected to a flow path in order, and a sampling nozzle for sucking a sample or a second mobile phase is used as the injector. A switching valve 9 and a liquid holding pipe 10 connected to the six-way switching valve 9, and in the first switching state of the switching valve 9, the target component is eluted by the first mobile phase, and the second switching state The liquid chromatograph 1 in which the second mobile phase held in the liquid holding pipe 10 is led to the flow path to elute and separate non-target components.
[Selection] Figure 2
Description
本発明は、液体クロマトグラフに関し、特に、複数の移動相をステップ的に切り替えて測定するステップグラジエント方式の測定方法に適した液体クロマトグラフに関する。 The present invention relates to a liquid chromatograph, and more particularly, to a liquid chromatograph suitable for a step gradient method of measuring a plurality of mobile phases by stepwise switching.
従来、液体クロマトグラフィーにおいて、複数の移動相を使用して測定する方法として、ステップグラジエント方式、リニアグラジエント方式等のグラジエント方式が用いられている。グラジエント方式の測定方法の中でも、もっとも簡便な方法は、移動相を所定のタイミングで切り換えるステップグラジエント方式である。上記ステップグラジエント方式で測定するための液体クロマトグラフとしては、低圧グラジエント方式のものを及び高圧グラジエント方式のものが知られている。 Conventionally, in liquid chromatography, a gradient method such as a step gradient method or a linear gradient method is used as a method for measuring using a plurality of mobile phases. Among the gradient method, the simplest method is a step gradient method in which the mobile phase is switched at a predetermined timing. As a liquid chromatograph for measuring by the step gradient method, a low pressure gradient method and a high pressure gradient method are known.
低圧グラジエント方式の液体クロマトグラフ装置では、移動相の流れる方向において、移動相切換え部、送液ポンプ、インジェクタ、分離カラム及び検出器の順に各構成部材が連結されている。低圧グラジエント方式では、移動相の切り換えは、送液ポンプの上流側に設けられた上記移動相切り換え部に使用されている電磁弁の開閉により制御されている。 In the low-pressure gradient liquid chromatograph apparatus, the constituent members are connected in the order of the mobile phase switching unit, the liquid feed pump, the injector, the separation column, and the detector in the direction in which the mobile phase flows. In the low pressure gradient system, switching of the mobile phase is controlled by opening and closing an electromagnetic valve used in the mobile phase switching unit provided on the upstream side of the liquid feed pump.
他方、高圧グラジエント方式の液体クロマトグラフ装置では、移動相の数に応じて複数の送液ポンプを用意し、各送液ポンプの下流側に移動相切り換え部が設けられている。 On the other hand, in a high-pressure gradient type liquid chromatograph, a plurality of liquid feeding pumps are prepared according to the number of mobile phases, and a mobile phase switching unit is provided on the downstream side of each liquid feeding pump.
ところで、上記低圧グラジエント方式の液体クロマトグラフでは、（ａ）移動相切り換え部が送液ポンプよりも上流側に設けられているため、移動相切り換え部において移動相を切り換えてから、実際に分離カラムにおいて移動相が切り換わるまでに時間的な遅れが生じざるを得ないという欠点があった。加えて、前に流れていた移動相と置換される新たな移動相の容量が多いため、移動相同士の拡散が進みやすく、従って移動相がステップ的に切り換わり難いという欠点もあった。 By the way, in the low-pressure gradient type liquid chromatograph, (a) since the mobile phase switching unit is provided on the upstream side of the liquid feeding pump, the mobile phase switching unit switches the mobile phase and then actually separates the separation column. However, there is a drawback in that a time delay must be generated before the mobile phase is switched. In addition, since the capacity of the new mobile phase that is replaced with the mobile phase that has flown before is large, diffusion between the mobile phases easily proceeds, and therefore, there is a drawback that the mobile phase is difficult to switch stepwise.
図１は、高圧グラジエント方式及び低圧グラジエント方式における溶出力の時間的変化を模式的に示すものである。
図１に模式的に示すように、高圧グラジエント法では、移動相Ｉから移動相ＩＩに切り換わる際に、実線で示すように、ステップ的にかつ時間的な遅れがさほど生じずに切り換えが行われるのに対し、低圧グラジエント法では、破線で示す高圧グラジエント法の場合の変化と比べて、移動相ＩＩへの切り換え開始時点Ｐc が遅れ、しかも、ステップ的に切り換わらない。
FIG. 1 schematically shows a temporal change in melt power in the high pressure gradient method and the low pressure gradient method.
As schematically shown in FIG. 1, in the high-pressure gradient method, when switching from the mobile phase I to the mobile phase II, as shown by the solid line, the switching is performed in a stepwise manner without causing much time delay. On the other hand, in the low-pressure gradient method, the switching start point P c to the mobile phase II is delayed as compared with the change in the high-pressure gradient method indicated by the broken line, and the switching is not performed stepwise.
他方、高圧グラジエント方式では、上記のような欠点は生じないが、移動相の種類に応じて送液ポンプを多数用意しなければならないという欠点があった。
また、特開平２−１３０４６６号公報（特許文献１）には、上記高圧グラジエント方式の液体クロマトグラフの簡略化を図るものとして、移動相を送液する送液ポンプと分析用分離カラムとを連結してなる流路に、グラジエント用溶媒を保持する保持配管と、移動相を分離カラムに送給するバイパス配管と並列に設け、さらに上記バイパス配管と保持配管との接続を切り換える切り換え弁を設けた液体クロマトグラフが開示されている。
On the other hand, the high-pressure gradient method does not have the above-described drawbacks, but has a disadvantage that a large number of liquid feed pumps must be prepared according to the type of mobile phase.
Japanese Patent Laid-Open No. 2-130466 (Patent Document 1) connects a liquid feeding pump for feeding a mobile phase and an analytical separation column to simplify the high-pressure gradient liquid chromatograph. In this flow path, a holding pipe for holding the gradient solvent and a bypass pipe for feeding the mobile phase to the separation column are provided in parallel, and a switching valve for switching the connection between the bypass pipe and the holding pipe is provided. A liquid chromatograph is disclosed.
しかしながら、特開平２−１３０４６６号公報に開示されている液体クロマトグラフでは、上記のような保持配管、バイパス配管及び切り換え弁をさらに用意しなければならず、これらを上記のように接続しなければないならない。加えて、実際に上記装置を実現するには、移動相を切り換えるのにのみ必要な専用の切り換え弁、及び該切り換え弁に接続された保持配管に移動相を挿入するためのポンプ等が別途必要となる。 However, in the liquid chromatograph disclosed in JP-A-2-130466, the holding pipe, the bypass pipe and the switching valve as described above must be further prepared, and these must be connected as described above. I don't have to. In addition, in order to actually realize the above device, a dedicated switching valve required only for switching the mobile phase and a pump for inserting the mobile phase into the holding pipe connected to the switching valve are separately required. It becomes.
一般に、液体クロマトグラフィーを利用した測定装置では、測定時間の短縮化、測定装置の小型化及び低価格化が強く求められている。
また、ステップグラジエント方式では、測定時間の短縮を図るために、目的成分までのピークを移動相Ｉによって溶出した後、以後に溶出される幾つかの非目的成分のピークを、移動相ＩＩにより一本のピークとして溶出する方法が多用されている。
Generally, in a measuring apparatus using liquid chromatography, there is a strong demand for shortening the measuring time, miniaturizing the measuring apparatus, and reducing the price.
Further, in the step gradient method, in order to shorten the measurement time, after the peak up to the target component is eluted by the mobile phase I, the peaks of several non-target components that are subsequently eluted are all collected by the mobile phase II. A method of eluting as a peak of a book is frequently used.
この場合、第１の移動相Ｉの溶出力に比べて、第２の移動相ＩＩの溶出力が高くされている。さらに、この方法において、分離カラム及び移動相を変更せずに測定時間を一層短縮するには、（ａ）流速を速くする方法、及び（ｂ）非目的成分を短時間に溶出させる方法が存在する。しかしながら、分離性能を維持したまま測定時間を短縮しようとした場合に、流速を速くする方法では対応が難しくなり、従って結局は、後者の方法（ｂ）を用いなければならない。 In this case, the dissolution power of the second mobile phase II is higher than that of the first mobile phase I. Furthermore, in this method, in order to further shorten the measurement time without changing the separation column and mobile phase, there are (a) a method for increasing the flow rate and (b) a method for eluting non-target components in a short time. To do. However, when it is attempted to shorten the measurement time while maintaining the separation performance, it is difficult to cope with the method in which the flow rate is increased. Therefore, the latter method (b) must be used after all.
他方、（ｂ）非目的成分を短時間に溶出する条件としては、低圧グラジエント方式に比べて高圧グラジエント方式の方が適している。これは、非目的成分を溶出させるための移動相ＩＩにステップ的に切り換わること、並びに第２の移動相ＩＩの第１の移動相Ｉへの拡散が少ないため、非目的成分のピークがシャープに現れることによる。 On the other hand, (b) as a condition for eluting non-target components in a short time, the high pressure gradient method is more suitable than the low pressure gradient method. This is because the peak of the non-target component is sharp because the mobile phase II for eluting the non-target component is switched stepwise and the diffusion of the second mobile phase II to the first mobile phase I is small. By appearing in
より詳しく説明すると、移動相の切り換えがステップ的に行われない場合には、分離カラム中に残存している移動相ＩＩの影響により、次回の測定の目的成分の溶出時間が速くなり過ぎることになる。すなわち、次回の測定が開始されるまでに、分離カラムが移動相Ｉで平衡化されていないければならない。 More specifically, if the mobile phase is not switched stepwise, the elution time of the target component for the next measurement will be too fast due to the influence of the mobile phase II remaining in the separation column. Become. That is, the separation column must be equilibrated with mobile phase I before the next measurement is started.
他方、測定装置の小型化及び低価格化を図るには、高圧グラジエント方式に比べて低圧グラジエント方式の方が適している。当然のことながら、低圧グラジエント方式では送液ポンプを１台用意するだけでよいのに対し、高圧グラジエント方式では移動相の種類に応じて送液ポンプを用意しなければならないからである。 On the other hand, the low-pressure gradient method is more suitable than the high-pressure gradient method in order to reduce the size and cost of the measuring apparatus. Naturally, in the low pressure gradient method, only one liquid feed pump needs to be prepared, whereas in the high pressure gradient method, a liquid feed pump must be prepared according to the type of mobile phase.
上記のように、低圧グラジエント方式及び高圧グラジエント方式の何れの方式においても、測定時間の短縮化並びに測定器の小型化及び低価格化を同時に満たすのは非常に困難である。 As described above, in any of the low-pressure gradient method and the high-pressure gradient method, it is very difficult to satisfy the shortening of the measurement time and the reduction in size and price of the measuring device at the same time.
さらに、上述した特開平２−１３０４６６号公報に開示されている装置では、移動相を切り換えるための切り換え弁、及び切り換え弁に接続された保持配管に移動相を導入するためにポンプ等が別途必要となるため、やはり測定器の十分な小型化及び一層の低価格化を達成し得るものではない。 Furthermore, in the apparatus disclosed in the above-mentioned Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-130466, a switching valve for switching the mobile phase, and a pump or the like are separately required for introducing the mobile phase into the holding pipe connected to the switching valve. Therefore, it is still not possible to achieve a sufficiently small measuring device and further cost reduction.
本発明の目的は、グラジエント方式の液体クロマトグラフであって、測定時間の短縮化並びに測定器の小型化及び低価格化を図り得る新規な液体クロマトグラフを提供することにある。 An object of the present invention is to provide a novel liquid chromatograph that is a gradient-type liquid chromatograph and that can shorten the measurement time and reduce the size and cost of the measuring instrument.
本発明は、第１，第２の移動相を用いる液体クロマトグラフであって、第１の移動相を送液する送液ポンプと分析用の分離カラムとを連結してなる流路において、前記送液ポンプと分離カラムとの間に試料及び第２の移動相を前記流路に導くためのインジェクタを接続してなり、前記インジェクタは、試料または第２の移動相を吸引するサンプリングノズルと、前記サンプリングノズルに連結された切り換え弁と、前記切り換え弁に両端が連結されており、かつ試料または第２の移動相を保持する液体保持流路とを有し、前記切り換え弁は、第１の移動相が前記流路に流され、かつ前記試料または第２の移動相が前記液体保持流路に導かれる第１の切り換え状態と、第１の移動相を前記液体保持流路に導入し、かつ前記試料または第２の移動相を前記液体保持流路から前記流路に導く第２の切り換え状態との間で切り換えられるように構成されていることを特徴とする、液体クロマトグラフである。 The present invention is a liquid chromatograph that uses a first mobile phase and a second mobile phase, wherein the flow channel is formed by connecting a liquid feed pump for feeding the first mobile phase and a separation column for analysis. An injector for guiding the sample and the second mobile phase to the flow path is connected between the liquid feed pump and the separation column, and the injector has a sampling nozzle for sucking the sample or the second mobile phase; A switching valve connected to the sampling nozzle; and a liquid holding channel that is connected to both ends of the switching valve and holds a sample or a second mobile phase; A first switching state in which a mobile phase is caused to flow through the flow path, and the sample or the second mobile phase is guided to the liquid holding flow path; and the first mobile phase is introduced into the liquid holding flow path; And the sample or the second movement Characterized in that it is configured to be switched between a second switching state leading to the flow path from the liquid holding flow path is a liquid chromatograph.
本発明では、上記切り換え弁が第１の状態に切り換えられているときには、第１の移動相が送液ポンプにより上記流路に流され、分離カラムに与えられるとともに、サンプリングノズルからの吸引により上記試料または第２の移動相が液体保持流路に導かれる。他方、第２の切り換え状態では、試料または第２の移動相が液体保持流路から流路に導かれ、分離カラムに与えられる。 In the present invention, when the switching valve is switched to the first state, the first mobile phase is caused to flow through the flow path by the liquid feed pump, is supplied to the separation column, and is suctioned from the sampling nozzle. The sample or the second mobile phase is guided to the liquid holding channel. On the other hand, in the second switching state, the sample or the second mobile phase is guided from the liquid holding channel to the channel and applied to the separation column.
従って、上記切り換え弁を第１の状態と第２の状態とで切り換えることにより、第１の移動相から第２の移動相に、ステップ的に移動相を切り換えることができる。すなわち、第２の移動相が速やかに分離カラムに到達し得るため、従来の高圧グラジエント方式の場合と同様に、移動相の切り換えに際しての時間的な遅れがほとんどなく、移動相をステップ的に確実に切り換えることができる。 Therefore, by switching the switching valve between the first state and the second state, the mobile phase can be switched stepwise from the first mobile phase to the second mobile phase. That is, since the second mobile phase can quickly reach the separation column, there is almost no time delay when switching the mobile phase, as in the case of the conventional high-pressure gradient method, and the mobile phase is surely stepwise. Can be switched to.
また、上記インジェクタを利用してステップグラジエントを行うものであるため、第２の移動相を流路に導くための構成として、別途送液ポンプを必要とせず、さらに追加的な配管としても、切り換え弁に接続される上記液体保持流路を構成するための配管を用意するだけでよい。 In addition, since the step gradient is performed by using the injector, the configuration for guiding the second mobile phase to the flow path does not require a separate liquid feed pump and can be switched as an additional pipe. It is only necessary to prepare a pipe for configuring the liquid holding channel connected to the valve.
本発明によれば、インジェクタ内に設けられた上記切り換え弁を第１の切り換え状態から第２の切り換え状態に切り換えることにより液体保持流路に蓄えられていた第２の移動相を分離カラムに与えるものであるため、従来の高圧グラジエント方式の場合と同様に移動相をステップ的に切り換えることができる。従って、複数の移動相を用いたグラジエント方式の液体クロマトグラフにおいて、測定性能を低下させることなく測定時間を短縮することができる。 According to the present invention, the second mobile phase stored in the liquid holding channel is given to the separation column by switching the switching valve provided in the injector from the first switching state to the second switching state. Therefore, the mobile phase can be switched stepwise as in the case of the conventional high-pressure gradient method. Therefore, in a gradient type liquid chromatograph using a plurality of mobile phases, measurement time can be shortened without degrading measurement performance.
しかも、従来の高圧グラジエント方式では移動相の種類に応じて多数の送液ポンプを用意しなければならず、また特開平２−１３０４６６号公報に記載の装置では、流路内に保持配管及びバイパス配管を並列に接続しなければならず、かつ第２の移動相を注入するために送液ポンプを必要とする。これに対して、本発明の液体クロマトグラフでは、上記のような多数の部品を必要としないため、液体クロマトグラフの小型化及び低価格化も図り得る。 In addition, in the conventional high-pressure gradient method, a large number of liquid feeding pumps must be prepared according to the type of mobile phase, and in the apparatus described in JP-A-2-130466, a holding pipe and a bypass are provided in the flow path. Pipes must be connected in parallel and a liquid feed pump is required to inject the second mobile phase. On the other hand, the liquid chromatograph of the present invention does not require many parts as described above, so that the liquid chromatograph can be reduced in size and price.
以下、図面を参照しつつ本発明の一実施例にかかる液体クロマトグラフを説明することにより、本発明を明らかにする。 Hereinafter, the present invention will be clarified by describing a liquid chromatograph according to an embodiment of the present invention with reference to the drawings.
図１は、本発明の一実施例にかかる液体クロマトグラフの構成を示す概略ブロック図である。
本実施例の液体クロマトグラフ１は、流路２に沿って設けられている。流路２の最も上流には、第１の移動相Ｉが収納された容器３が配置されている。容器３の下流には、送液ポンプ４が配置されている。送液ポンプ４は、第１の移動相Ｉを送液するために設けられており、この目的に応じた種々の形式のポンプ例えば、ローラーポンプ等のポンプにより構成することができる。送液ポンプとして用い得るポンプの具体的な例としては、島津製作所製、商品名ＬＣ−９Ａ等が挙げられる。ポンプ４の下流には、インジェクタ５、分離カラム６及び検出器７がこの順序で流路２に沿って連結されている。
FIG. 1 is a schematic block diagram showing the configuration of a liquid chromatograph according to one embodiment of the present invention.
The liquid chromatograph 1 according to the present embodiment is provided along the flow path 2. A container 3 in which the first mobile phase I is stored is disposed at the most upstream side of the flow path 2. A liquid feed pump 4 is disposed downstream of the container 3. The liquid feeding pump 4 is provided for feeding the first mobile phase I, and can be constituted by various types of pumps according to this purpose, for example, pumps such as roller pumps. Specific examples of pumps that can be used as the liquid feed pump include Shimadzu Corporation trade name LC-9A. An injector 5, a separation column 6, and a detector 7 are connected along the flow path 2 in this order downstream of the pump 4.
インジェクタ５は、試料または第２の移動相を吸引するサンプリングノズル８と、切り換え弁９と、液体保持流路を構成するための液体保持配管１０とを有する。 The injector 5 includes a sampling nozzle 8 that sucks the sample or the second mobile phase, a switching valve 9, and a liquid holding pipe 10 for forming a liquid holding channel.
サンプリングノズル８は、第２の移動相や試料を吸引し得る適宜のサンプリングノズルを用いて構成することができ、該サンプリングノズル８が用いられているため、本実施例の液体クロマトグラフ１では、第２の移動相を導入するのに大掛かりな送液ポンプ等の装置を必要としない。 The sampling nozzle 8 can be configured using an appropriate sampling nozzle capable of sucking the second mobile phase or sample, and since the sampling nozzle 8 is used, in the liquid chromatograph 1 of the present embodiment, Introducing the second mobile phase does not require a large apparatus such as a liquid feed pump.
切り換え弁９は、本実施例では、略図的に示されている六方切り換え弁により構成されている。この切り換え弁９は、６個のポート９ａ〜９ｆを有し、各ポート間は、図示の実線で示す第１の切り換え状態と、図示の破線で示す第２の切り換え状態との間で切り換えられるように構成されている。すなわち、第１の切り換え状態では、ポート９ａ−ポート９ｂ間、ポート９ｃ−ポート９ｄ間及びポート９ｅ−ポート９ｆ間が連結されている。他方、第２の切り換え状態では、ポート９ｂ−ポート９ｃ間、ポート９ｄ−ポート９ｅ間及びポート９ｆ−ポート９ａ間が接続される。 In this embodiment, the switching valve 9 is constituted by a six-way switching valve schematically shown. The switching valve 9 has six ports 9a to 9f, and each port is switched between a first switching state indicated by a solid line in the drawing and a second switching state indicated by a broken line in the drawing. It is configured as follows. That is, in the first switching state, the ports 9a and 9b, the ports 9c and 9d, and the ports 9e and 9f are connected. On the other hand, in the second switching state, the ports 9b and 9c, the ports 9d and 9e, and the ports 9f and 9a are connected.
上記サンプリングノズル８は、ポート９ａに接続されている。また、ポート９ｂとポート９ｅとの間に上記液体保持用配管１０が接続されている。さらに、ポート９ｃ，ポート９ｄが、上記流路２に接続されている。また、ポート９ｆには、廃液部１１が接続されている。廃液部１１は、試料または第２の移動相を貯溜し得る適宜の容器で構成してもよいが、特にこのような容器からなる廃液部１１を設けずともよい。すなわち、ポート９ｆに、単に廃液管を接続した構成であってもよい。 The sampling nozzle 8 is connected to the port 9a. The liquid holding pipe 10 is connected between the port 9b and the port 9e. Further, the port 9c and the port 9d are connected to the flow path 2. Further, the waste liquid part 11 is connected to the port 9f. The waste liquid part 11 may be constituted by an appropriate container capable of storing the sample or the second mobile phase, but the waste liquid part 11 composed of such a container may not be provided. That is, a configuration in which a waste liquid pipe is simply connected to the port 9f may be used.
液体保持用配管１０は、本発明における液体保持流路を構成するために設けられているが、本実施例では図示のようなループ配管で構成されている。もっとも、上述のように第２の移動相や試料を保持し得る限り、ループ配管に限らず、第２の移動相や試料５を目的の量だけ保持させ得る適宜の形状の配管を用いることができる。 The liquid holding pipe 10 is provided in order to constitute the liquid holding flow path in the present invention, but in the present embodiment, it is constituted by a loop pipe as shown in the figure. However, as long as the second mobile phase and the sample can be held as described above, not only the loop pipe but also a pipe having an appropriate shape that can hold the second mobile phase and the sample 5 by a desired amount is used. it can.
なお、上記液体保持用配管１０の容量としては、注入する試料や第２の移動相ＩＩのうち、注入量の最も多いものよりも、大きくする必要がある。
また、本実施例では、切り換え弁として、六方切り換え弁９を用いているが、上記第１の切り換え状態と第２の切り換え状態とを実現し得る限り、六方切り換え弁９以外の他の構造の切り換え弁により、本発明の切り換え弁を構成してもよい。
The capacity of the liquid holding pipe 10 needs to be larger than that of the sample to be injected and the second mobile phase II having the largest injection amount.
In the present embodiment, the six-way switching valve 9 is used as the switching valve. However, as long as the first switching state and the second switching state can be realized, the structure other than the six-way switching valve 9 is used. The switching valve of the present invention may be constituted by the switching valve.
上記のように、本実施例の液体クロマトグラフ１では、インジェタク５は、サンプリングノズル８、切り換え弁９及び液体保持用配管１０のみを備えておればよく、第２の移動相を導くために、送液ポンプ等の大掛かりな装置を必要としない。 As described above, in the liquid chromatograph 1 of the present embodiment, the injector 5 only needs to include the sampling nozzle 8, the switching valve 9, and the liquid holding pipe 10. In order to introduce the second mobile phase, A large-scale device such as a liquid pump is not required.
インジェクタ５の下流に接続されている分離カラム６は、試料を分離するための従来より液体クロマトグラフに用いられている適宜のカラムにより構成することができる。 The separation column 6 connected downstream of the injector 5 can be constituted by an appropriate column conventionally used in a liquid chromatograph for separating a sample.
また、分離カラム６の下流に接続されている検出器７は、分離カラム６から溶出された成分を検出するための適宜の検出器により構成される。
次に、上記実施例の液体クロマトグラフを用いた測定方法につき説明する。
Further, the detector 7 connected downstream of the separation column 6 is constituted by an appropriate detector for detecting the components eluted from the separation column 6.
Next, a measurement method using the liquid chromatograph of the above embodiment will be described.
まず、切り換え弁９を第１の切り換え状態にしておく。この状態で、ポンプ４により、第１の移動相Ｉが容器３から流路２に送液される。この送液ポンプ４による移動相Ｉの送液は、測定工程の全段階にわたり常時行われている。 First, the switching valve 9 is set to the first switching state. In this state, the pump 4 sends the first mobile phase I from the container 3 to the flow path 2. Liquid feeding of the mobile phase I by the liquid feeding pump 4 is always performed throughout all stages of the measurement process.
次に、インジェクタ５のサンプリングノズル８から、試料部１２の試料１３を吸引し、ポート９ａ−９ｂを経て液体保持用配管１０に導く。しかる後、切り換え弁９を第２の切り換え状態に切り換える。第２の切り換え状態に切り換えられると、ポート９ｃ−ポート９ｂ間が連結されるため、第１の移動相Ｉが液体保持用配管１０に導かれ、それによって試料が液体保持用配管１０からポート９ｅ及びポート９ｄを介して流路２に排出され、分離カラム６に導かれる。 Next, the sample 13 of the sample part 12 is sucked from the sampling nozzle 8 of the injector 5 and guided to the liquid holding pipe 10 through the ports 9a-9b. Thereafter, the switching valve 9 is switched to the second switching state. When switched to the second switching state, since the port 9c and the port 9b are connected, the first mobile phase I is guided to the liquid holding pipe 10, whereby the sample is transferred from the liquid holding pipe 10 to the port 9e. And it is discharged to the flow path 2 through the port 9d and guided to the separation column 6.
従って、試料が分離カラム６に与えられ、第１の移動相Ｉにより各目的成分が分離・溶出される。
液体保持用配管１０から試料が全て押し出された後に、切り換え弁９を第１の切り換え状態に切り換える。次に、図示しない洗浄機構により、サンプリングノズル８及び液体保持用配管１０を洗浄する。この洗浄機構としては、従来よりサンプリングノズルの洗浄に慣用されている適宜のものを用いることができる。
Therefore, a sample is given to the separation column 6 and each target component is separated and eluted by the first mobile phase I.
After all the sample is pushed out from the liquid holding pipe 10, the switching valve 9 is switched to the first switching state. Next, the sampling nozzle 8 and the liquid holding pipe 10 are cleaned by a cleaning mechanism (not shown). As this cleaning mechanism, an appropriate one conventionally used for cleaning the sampling nozzle can be used.
次に、インジェクタ５において、サンプリングノズル８により、第２の移動相ＩＩを、容器１４から吸引し、第２の移動相ＩＩをポート９ａ及びポート９ｂを介して液体保持用配管１０に導く。さらに、液体保持用配管１０内に第２の移動相ＩＩが閉鎖された段階以降に、切り換え弁９を第２の切り換え状態に切り換える。なお、この切り換え弁９が切り換えられるまでの間は、送液ポンプ４により第１の移動相１が流路２に送液されている。 Next, in the injector 5, the second mobile phase II is sucked from the container 14 by the sampling nozzle 8, and the second mobile phase II is guided to the liquid holding pipe 10 through the port 9 a and the port 9 b. Further, after the second mobile phase II is closed in the liquid holding pipe 10, the switching valve 9 is switched to the second switching state. In addition, until the switching valve 9 is switched, the first mobile phase 1 is fed to the flow path 2 by the liquid feed pump 4.
上記第２の切り換え状態に切り換え弁９を切り換え、第１の移動相Ｉをポート９ｃ及びポート９ｂを介して液体保持用配管１０側に送液することにより、液体保持用配管１０に保持されていた第２の移動相ＩＩがポート９ｅ及びポート９ｄを介して流路２に流され、分離カラム６に送られる。従って、分離カラム６において、第２の移動相ＩＩにより非目的成分が溶出される。溶出された非目的成分は、検出器７において検出される。 The switching valve 9 is switched to the second switching state, and the first mobile phase I is supplied to the liquid holding pipe 10 via the port 9c and the port 9b, so that the liquid holding pipe 10 holds the first mobile phase I. The second mobile phase II flows through the flow path 2 through the port 9e and the port 9d and is sent to the separation column 6. Therefore, in the separation column 6, the non-target component is eluted by the second mobile phase II. The eluted non-target component is detected by the detector 7.
所定量の第２の移動相ＩＩが液体保持用配管１０から押し出された後に、六方切り換え弁９を第１の状態に切り換え、再度ポート９ｃ−ポート９ｄ間を連結することにより、流路２に第１の移動相Ｉが流される。また、図示しない洗浄機構により、上記サンプリングノズル８及び液体保持用配管１０を洗浄する。 After a predetermined amount of the second mobile phase II is pushed out from the liquid holding pipe 10, the six-way switching valve 9 is switched to the first state, and the port 9c and the port 9d are connected again to the flow path 2. A first mobile phase I is flowed. Further, the sampling nozzle 8 and the liquid holding pipe 10 are cleaned by a cleaning mechanism (not shown).
上記工程を繰り返すことにより、第１の移動相Ｉを送液し、途中で切り換え弁９の切り換え及びサンプリングノズル８からの移動相ＩＩの注入により、第２の移動相ＩＩを流路２に流すことができ、しかも上記説明から明らかなように、第１の移動相Ｉから第２の移動相ＩＩへの切り換えはステップ的に行われる。 By repeating the above steps, the first mobile phase I is fed, and the second mobile phase II is caused to flow through the flow path 2 by switching the switching valve 9 and injecting the mobile phase II from the sampling nozzle 8 on the way. Moreover, as is clear from the above description, the switching from the first mobile phase I to the second mobile phase II is performed in a stepwise manner.
また、本実施例の液体クロマトグラフにおける時間的な条件としては、試料の流路への注入から第２の移動相ＩＩの液体保持用配管１０への吸引までの操作は、測定開始（試料注入と同時）から第２の移動相ＩＩへの切り換えまでの時間よりも短く行わねばならない。 In addition, as a time condition in the liquid chromatograph of the present embodiment, the operation from the injection of the sample into the flow path to the suction of the second mobile phase II into the liquid holding pipe 10 is the start of measurement (sample injection At the same time) to the second mobile phase II.
また、連続測定に際しては、サンプルリングノズル８、液体保持用配管１０の洗浄から次回の測定における試料の液体保持用配管１０までの吸引までの操作が、第２の移動相ＩＩから第１の移動相Ｉへの切り換えから次回の測定開始時点までの時間よりも短いことが必要である。 In the continuous measurement, the operations from the cleaning of the sample ring nozzle 8 and the liquid holding pipe 10 to the suction of the sample to the liquid holding pipe 10 in the next measurement are performed from the second mobile phase II to the first movement. It is necessary to be shorter than the time from switching to phase I until the next measurement start time.
次に、具体的な実験例につき説明する。
糖尿病の臨床検査項目であるグリコヘモグロビンの分析を、上記実施例の液体クロマトグラフ及び図３及び図４に示す比較例の液体クロマトグラフを用いて行った。実施例及び比較例の装置では、送液ポンプとして、島津製作所製、商品名：ＬＣ−９Ａ、カラム恒温槽として、積水化学工業社製、商品名：ＣＯＵ−８２０、低圧グラジエンターとてし、積水化学工業社製、商品名：ＳＣＲ−７２０、分離カラムとして、積水化学工業社製、商品名：ＭＩＣＲＯＮＥＸ−Ａ１ｃを用いた。
Next, specific experimental examples will be described.
Analysis of glycohemoglobin, which is a clinical laboratory test item for diabetes, was performed using the liquid chromatograph of the above example and the liquid chromatograph of the comparative example shown in FIGS. In the apparatus of Examples and Comparative Examples, as a liquid feed pump, manufactured by Shimadzu Corporation, trade name: LC-9A, as a column thermostatic bath, manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd., trade name: COU-820, low pressure gradient enter, Sekisui Chemical Co., Ltd., trade name: SCR-720, and Sekisui Chemical Co., Ltd., trade name: MICRONEX-A1c was used as the separation column.
また、移動相としては、第１の移動相Ｉ（りん酸緩衝液ｐＨ＝６．０、塩濃度＝１４０ｍＭ）と、第２の移動相ＩＩ（りん酸緩衝液ｐＨ＝７．２、塩濃度＝３２０ｍＭ）を用いた。なお、グリコヘモグロビンに対する溶出能は、第２の移動相の方が第１の移動相に比べて大きくされている。 As the mobile phase, the first mobile phase I (phosphate buffer solution pH = 6.0, salt concentration = 140 mM) and the second mobile phase II (phosphate buffer solution pH = 7.2, salt concentration). = 320 mM). In addition, the elution capability with respect to glycohemoglobin is made larger in the second mobile phase than in the first mobile phase.
さらに、試料として、国際試薬社製コントロール血液を２００倍に希釈したものを用いた。
図１に示した実施例の装置において、下記の条件にて測定を行った。得られたクロマトグラフを図５に示す。
Furthermore, a sample obtained by diluting control blood manufactured by Kokusai Reagent Co., Ltd. 200 times was used.
In the apparatus of the example shown in FIG. 1, the measurement was performed under the following conditions. The obtained chromatograph is shown in FIG.
流速：１．５ｍｆ／分
カラム温度：４０℃
試料注入量：１０μｌ
第２の移動相注入量：１５０μｌ
また、比較例１として、図３に示した測定系を構成し、実施例の装置を用いた測定方法と測定条件を同様とし、グリコヘモグロビンの測定を行った。
Flow rate: 1.5 mf / min Column temperature: 40 ° C
Sample injection volume: 10 μl
Second mobile phase injection volume: 150 μl
Further, as Comparative Example 1, the measurement system shown in FIG. 3 was configured, and the measurement method and measurement conditions using the apparatus of the example were the same, and glycohemoglobin was measured.
図３における装置は、第１の移動相Ｉが収納された容器２１と、第２の移動相ＩＩが収納された容器２２の下流に低圧グラジエンター２３、送液ポンプ２４、試料注入用インジェクタ２５、分離カラム２６及び検出器２７を順に接続した構造を有する。すなわち、従来の低圧グラジエント方式の測定系に当たるものである。なお、第２の移動相ＩＩは、実施例の場合と同容量となるように、低圧グラジエンターにおける第２の移動相の通液時間を０．１分とし、第２の移動相の注入量を１５０μｌとした。得られたクロマトグラフを図６に示す。 The apparatus in FIG. 3 includes a low pressure gradient 23, a liquid feed pump 24, and a sample injection injector 25 downstream of a container 21 in which a first mobile phase I is stored and a container 22 in which a second mobile phase II is stored. The separation column 26 and the detector 27 are connected in order. That is, it corresponds to a conventional low-pressure gradient measurement system. The second mobile phase II has the same capacity as in the example, and the liquid passage time of the second mobile phase in the low pressure gradient is 0.1 minute, and the injection amount of the second mobile phase is Was 150 μl. The obtained chromatograph is shown in FIG.
さらに、比較例２として、図４に示した測定系を構成し、同様にグリコヘモグロビンの測定を行った。
図４に示す装置では、上流に第１の移動相Ｉ及び第２の移動相ＩＩをそれぞれ収納してなる容器２１，２２が配置されており、その下流に送液ポンプ２４，２４がそれぞれ接続されている。送液ポンプ２４，２４の下流において、流路が結合されており、さらにその下流に試料注入用インジェクタ２５、分離カラム２６及び検出器２７がその順序で接続されている。すなわち、図４に示した測定系は、従来の高圧グラジエント方式の装置に当たる。図４に示した装置を用いた測定に際しても第２の移動相ＩＩの注入量が実施例の場合と同容量となるように、第２の移動相ＩＩの送液のためのポンプの作動時間を０．１分とした。得られたクロマトグラフを図７に示す。
Furthermore, as Comparative Example 2, the measurement system shown in FIG. 4 was configured, and glycohemoglobin was similarly measured.
In the apparatus shown in FIG. 4, containers 21 and 22 each containing a first mobile phase I and a second mobile phase II are arranged upstream, and liquid feed pumps 24 and 24 are connected downstream thereof. Has been. A flow path is coupled downstream of the liquid feed pumps 24, 24, and further, a sample injection injector 25, a separation column 26, and a detector 27 are connected downstream thereof. That is, the measurement system shown in FIG. 4 corresponds to a conventional high-pressure gradient apparatus. In the measurement using the apparatus shown in FIG. 4, the operation time of the pump for feeding the second mobile phase II so that the injection amount of the second mobile phase II has the same capacity as in the embodiment. Was 0.1 minutes. The obtained chromatograph is shown in FIG.
図５〜図７から明らかなように、低圧グラジエント方式に比べて、実施例の液体クロマトグラフを用いた場合には、ＨｂＡ０を溶出するための第２の移動相ＩＩの拡散が少なくなる。従って、ＨｂＡ０のピークがシャープになることがわかる。よって、測定時間の短縮を図り得ることがわかる。 As is apparent from FIGS. 5 to 7, when the liquid chromatograph of the example is used, the diffusion of the second mobile phase II for eluting HbA0 is reduced as compared with the low pressure gradient method. Therefore, it can be seen that the peak of HbA0 becomes sharp. Therefore, it can be seen that the measurement time can be shortened.
なお、上記実施例では、第１，第２の２種類の移動相を用いた場合の液体クロマトグラフ及び測定方法につき説明したが、さらに多くの種類の移動相を用いた場合でも、同様に移動相の切り換えをステップ的に行うことができる。 In the above embodiment, the liquid chromatograph and the measurement method using the first and second types of mobile phases have been described. However, even when more types of mobile phases are used, the mobile phase is similarly moved. The phase can be switched stepwise.
１ 液体クロマトグラフ
２ 流路
４ 送液ポンプ
５ インジェクタ
６ 分離カラム
７ 検出器
８ サンプリングノズル
９ 切り換え弁
１０ 液体保持流路を構成する液体保持用配管
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Liquid chromatograph 2 Flow path 4 Liquid feed pump 5 Injector 6 Separation column 7 Detector 8 Sampling nozzle 9 Switching valve 10 Liquid holding piping which comprises a liquid holding flow path
Claims (1)
第１の移動相を送液する送液ポンプと分析用の分離カラムとを連結してなる流路において、
前記送液ポンプと分離カラムとの間に試料及び第２の移動相を前記流路に導くためのインジェクタを接続してなり、
前記インジェクタは、試料または第２の移動相を吸引するサンプリングノズルと、前記サンプリングノズルに連結された切り換え弁と、前記切り換え弁に両端が連結されており、かつ試料または第２の移動相を保持する液体保持流路とを有し、
前記切り換え弁は、第１の移動相が前記流路に流され、かつ前記試料または第２の移動相が前記液体保持流路に導かれる第１の切り換え状態と、第１の移動相を前記液体保持流路に導入し、かつ前記試料または第２の移動相を前記液体保持流路から前記流路に導く第２の切り換え状態との間で切り換えられるように構成されていることを特徴とする、液体クロマトグラフ。 A liquid chromatograph using first and second mobile phases,
In a flow path formed by connecting a liquid feeding pump for feeding the first mobile phase and a separation column for analysis,
An injector for guiding the sample and the second mobile phase to the flow path is connected between the liquid feed pump and the separation column,
The injector has a sampling nozzle for sucking the sample or the second mobile phase, a switching valve connected to the sampling nozzle, and both ends connected to the switching valve, and holds the sample or the second mobile phase. And a liquid holding channel that
The switching valve includes a first switching state in which a first mobile phase is caused to flow through the flow path, and the sample or the second mobile phase is guided to the liquid holding flow path, and the first mobile phase is set to the first mobile phase. It is configured to be switched between a second switching state for introducing the sample or the second mobile phase from the liquid holding channel to the channel and introducing the sample or the second mobile phase into the liquid holding channel. A liquid chromatograph.
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