JP2005110638A - Microorganism detection method and microorganism detection reagent - Google Patents
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】 高価な機器や顕微鏡を必要とすることなく、かつ、液体試料だけでなく、固体または固体を含む試料にも適用できる迅速かつ安価な微生物の検出方法および微生物検出用試薬を提供すること。
【解決手段】 微生物とテトラゾリウム塩とを接触させる工程を有することを特徴とする微生物の検出方法。微生物と色素原とを接触させる色素原接触工程と、前記色素原接触工程後、酵素的サイクリング反応により前記色素原の発色または蛍光シグナルを増感させる増感工程とを有することを特徴とする微生物の検出方法。脱水素酵素、脱水素酵素の基質、ジアホラーゼおよびテトラゾリウム塩を含むことを特徴とする微生物検出用試薬。
【選択図】 なしPROBLEM TO BE SOLVED: To provide a rapid and inexpensive microorganism detection method and microorganism detection reagent that can be applied not only to a liquid sample but also to a solid or a solid-containing sample without requiring an expensive instrument or a microscope. .
A method for detecting a microorganism comprising the step of bringing a microorganism into contact with a tetrazolium salt. A microorganism comprising: a chromogen contact step for bringing a microorganism into contact with a chromogen; and a sensitization step for sensitizing the coloration or fluorescence signal of the chromogen by an enzymatic cycling reaction after the chromogen contact step. Detection method. A reagent for detecting microorganisms, comprising a dehydrogenase, a substrate for dehydrogenase, diaphorase, and a tetrazolium salt.
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Description
本発明は微生物の検出方法および微生物検出用試薬に関するものであり、さらに詳しくは、例えば食品、化粧品、環境中の微生物汚染を、迅速にかつ安価に検出することのできる微生物の検出方法および微生物検出用試薬に関するものである。 The present invention relates to a microorganism detection method and a microorganism detection reagent, and more specifically, for example, a microorganism detection method and microorganism detection capable of detecting microorganism contamination in foods, cosmetics, and the environment quickly and inexpensively. This relates to a reagent for use.
従来の微生物検査方法について、食品検査における一般生菌数の測定を例として説明する。まず、粉末寒天培地を溶解、滅菌した後、約４５℃程度に保っておく。その寒天培地の一定量を、予め食品の懸濁液などの検査試料一定量を入れた滅菌ペトリ皿などに分注して混釈する。混釈後の寒天を固化し、３５℃で通常２４〜４８時間培養後、生じた微生物のコロニー数を計数する。このように従来の一般生菌検査方法は、前もって培地を調製、滅菌した後、培地が固化しない温度に保っておく必要があるなど、非常に手間と時間がかかる方法である。 The conventional microorganism testing method will be described by taking the measurement of the number of general viable bacteria in food testing as an example. First, a powder agar medium is dissolved and sterilized, and then kept at about 45 ° C. A certain amount of the agar medium is dispensed and mixed in a sterile petri dish or the like in which a predetermined amount of a test sample such as a food suspension is previously placed. The agar after the pour is solidified and cultured at 35 ° C. for usually 24 to 48 hours, and then the number of colonies of the produced microorganisms is counted. As described above, the conventional method for inspecting viable bacteria requires a lot of labor and time. For example, the medium must be prepared and sterilized in advance, and the medium must be kept at a temperature at which the medium does not solidify.
また、培地調製の手間を省いたスタンプタイプ（例えば、特許文献１参照。）、フィルタータイプ、フィルム（シート）タイプ（例えば、特許文献２および３参照。）、試験紙タイプなど、それぞれの目的にあわせ使いやすいように作られた簡易培地が生産されているが、検査時間は上記の寒天培地を用いた場合と変わらず、２４〜４８時間、またはそれ以上を要するものである。 For each purpose such as stamp type (for example, refer to Patent Document 1), filter type, film (sheet) type (for example, refer to Patent Documents 2 and 3), test paper type and the like, which saves the labor of medium preparation. In addition, a simple medium that is easy to use has been produced, but the inspection time is the same as when the above-mentioned agar medium is used, and requires 24 to 48 hours or more.
一方、検査時間を短縮した方法の例として、濾過膜上に捕集した菌を短時間培養した後、界面活性剤や有機溶媒などで菌由来のアデノシン−三リン酸を細胞より抽出し、ルシフェラーゼの存在下にルシフェリンと反応させて発光させ、その発光輝点をイメージアナライザーで検出して生菌数を測定する方法がある（例えば、特許文献４参照。）。また、上記以外にも、捕集した微生物を所定の時間培養した後、発光色素で処理して、これから放射される蛍光を自動検出する方法、微小な光点を検出するために光学スキャナーを使用する方法、捕集した微生物を所定の時間培養するか培養なしに蛍光染色した後落射蛍光顕微鏡を使用して生菌数を測定する方法等が提案されている。しかし、これらの方法は高額な機器を必要とし、通常は固形物を含まない液体試料の検査にしか適用できない。 On the other hand, as an example of a method for shortening the test time, after culturing the bacteria collected on the filtration membrane for a short time, the adenosine triphosphate derived from the bacteria is extracted from the cells with a surfactant or an organic solvent, and luciferase There is a method in which luminescence is caused by reacting with luciferin in the presence of, and the number of viable bacteria is measured by detecting the emission luminescent spot with an image analyzer (see, for example, Patent Document 4). In addition to the above, the collected microorganisms are cultured for a predetermined time and then treated with a luminescent dye to automatically detect the emitted fluorescence, and an optical scanner is used to detect minute light spots. And a method of measuring the number of viable bacteria using an epifluorescence microscope after the collected microorganisms are cultured for a predetermined time or fluorescently stained without culturing. However, these methods require expensive equipment and are usually applicable only to the inspection of liquid samples that do not contain solids.
高額な機器を必要としない方法として、微生物を合成高分子製多孔質濾過膜上に捕集し、寒天培地上で短時間培養して形成された該微生物由来のコロニーに塩基性染料の有機溶媒溶液を添加して染色させた後、該有機溶媒を揮散させて顕微鏡下で染色された微小コロニーの数を計測する方法が記載されている（例えば、特許文献５参照。）。このような方法では、陽荷電を有する塩基性染料の色素部分が、陰荷電を有する微生物を染色することを利用して、微生物の検出を行う。そのため、微生物以外にも陰荷電を有するものが試料中に含まれていると、これに対しても染色するので、微生物が存在しない試料であっても、陽性反応を示すことになる場合がある。また、陰荷電を有する固体物の上に、微生物由来のコロニーが存在している場合には、陽性反応が微生物によるものなのか、それとも固体物によるものなのか判断がつかない場合もある。したがって、このような方法は液体試料には有効な方法であるが、固体試料（特に、陰荷電を有する固体を含む試料）の検査には必ずしも有効な方法ではない。
本発明は、高価な機器や顕微鏡を必要とすることなく、かつ、液体試料だけでなく固体試料にも適用でき、迅速かつ安価な微生物の検出方法および微生物検出用試薬を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a rapid and inexpensive microorganism detection method and microorganism detection reagent that can be applied not only to liquid samples but also to solid samples without the need for expensive equipment and a microscope. To do.
本発明は、以下のとおりである。
（１） 微生物を含む検体を所定時間培養する工程と、前記培養工程後、前記微生物と色素原とを接触させる工程と、前記接触工程後、前記色素原の発色または蛍光シグナルにより微生物の存在を確認する工程とを有し、
前記接触工程において、酵素的サイクリング反応により前記色素原の発色または蛍光シグナルを増感させることを特徴とする微生物の検出方法。
（２） 前記色素原が、還元系発色試薬または還元系蛍光試薬であることを特徴とする前記（１）に記載の微生物の検出方法。
（３） 前記還元系発色試薬または還元系蛍光試薬がテトラゾリウム塩であることを特徴とする前記（２）に記載の微生物の検出方法。
（４） 前記酵素的サイクリング反応による発色または蛍光シグナルの増感が、脱水素酵素、脱水素酵素の基質、およびジアホラーゼを加えることにより行われることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の微生物の検出方法。
（５） 前記接触工程において、微生物の細胞壁を変性させる細胞壁変性剤または微生物の細胞壁を溶解する細胞壁溶解剤を添加することを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物の検出方法。
（６） 前記培養工程において、微生物を含む検体を固体培地で培養することを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれかに記載の微生物の検出方法。
（７） 脱水素酵素、脱水素酵素の基質、ジアホラーゼおよびテトラゾリウム塩を含むことを特徴とする微生物検出用試薬。
（８） 微生物の細胞壁を変性させる細胞壁変性剤または微生物の細胞壁を溶解する細胞壁溶解剤をさらに含むことを特徴とする前記（７）に記載の微生物検出用試薬。
（９） 前記細胞壁変性剤または細胞壁溶解剤が、アルコール、ケトン、キレート剤、抗生物質および界面活性剤から選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする前記（８）に記載の微生物検出用試薬。
（１０） 前記脱水素酵素、脱水素酵素の基質、ジアホラーゼおよびテトラゾリウム塩が、それぞれ溶液または乾燥物の形態で個別に保存されていることを特徴とする前記（７）に記載の微生物検出用試薬。
（１１） 前記脱水素酵素及びジアホラーゼを含有する酵素溶液と、脱水素酵素の基質及びテトラゾリウム塩を含有する基質液とからなり、酵素溶液と基質液とが個別に保存されていることを特徴とする前記（７）に記載の微生物検出用試薬。
The present invention is as follows.
(1) a step of culturing a specimen containing a microorganism for a predetermined time; a step of bringing the microorganism into contact with the chromogen after the culturing step; and And a step of confirming,
In the contacting step, a method for detecting a microorganism, which comprises sensitizing the color development or fluorescence signal of the chromogen by an enzymatic cycling reaction.
(2) The method for detecting a microorganism according to (1), wherein the chromogen is a reducing chromogenic reagent or a reducing fluorescent reagent.
(3) The method for detecting a microorganism according to (2), wherein the reducing color-developing reagent or the reducing fluorescent reagent is a tetrazolium salt.
(4) The chromogenic or fluorescent signal sensitization by the enzymatic cycling reaction is performed by adding a dehydrogenase, a dehydrogenase substrate, and diaphorase, according to the above (1) to (3) The method for detecting a microorganism according to any one of the above.
(5) The microorganism according to any one of (1) to (4), wherein a cell wall denaturing agent that denatures the cell wall of the microorganism or a cell wall solubilizing agent that dissolves the cell wall of the microorganism is added in the contacting step. Detection method.
(6) The microorganism detection method according to any one of (1) to (5), wherein in the culturing step, a specimen containing microorganisms is cultured in a solid medium.
(7) A reagent for detecting a microorganism comprising dehydrogenase, a substrate for dehydrogenase, diaphorase, and a tetrazolium salt.
(8) The reagent for detecting a microorganism according to (7) above, further comprising a cell wall denaturing agent that denatures the cell wall of the microorganism or a cell wall solubilizing agent that dissolves the cell wall of the microorganism.
(9) The reagent for detecting a microorganism according to (8), wherein the cell wall denaturing agent or cell wall solubilizing agent is at least one selected from alcohols, ketones, chelating agents, antibiotics and surfactants. .
(10) The reagent for detecting a microorganism according to (7), wherein the dehydrogenase, the substrate for dehydrogenase, diaphorase, and a tetrazolium salt are individually stored in the form of a solution or a dried product, respectively. .
(11) It comprises an enzyme solution containing the dehydrogenase and diaphorase, and a substrate solution containing a dehydrogenase substrate and a tetrazolium salt, wherein the enzyme solution and the substrate solution are stored separately. The reagent for detecting a microorganism according to (7) above.
本発明によれば、高価な機器や顕微鏡を必要とすることなく、かつ、液体試料だけでなく、固体試料または固体を含む試料にも適用できる迅速かつ安価な微生物の検出方法および微生物検出用試薬が提供される。本発明では、例えば食品、化粧品、環境中の微生物汚染を迅速かつ安価に検出することができる。 According to the present invention, a rapid and inexpensive microorganism detection method and microorganism detection reagent that can be applied not only to a liquid sample but also to a solid sample or a sample containing a solid, without requiring an expensive instrument or a microscope. Is provided. In the present invention, for example, microbial contamination in food, cosmetics, and the environment can be detected quickly and inexpensively.
本発明は、微生物を含む検体を所定時間培養する工程と、前記培養工程後、前記微生物と色素原とを接触させる工程と、前記接触工程後、前記色素原の発色または蛍光シグナルにより微生物の存在を確認する工程とを有し、前記接触工程において、酵素的サイクリング反応により前記色素原の発色または蛍光シグナルを増感させる微生物の検出方法を提供するものである。以下、本発明に係る微生物の検出方法の実施形態について説明する。 The present invention includes a step of culturing a specimen containing a microorganism for a predetermined time, a step of bringing the microorganism into contact with the chromogen after the culturing step, and the presence of the microorganism by color development or fluorescence signal of the chromogen after the contact step. And a method for detecting a microorganism that sensitizes the color development or fluorescence signal of the chromogen by an enzymatic cycling reaction in the contacting step. Hereinafter, embodiments of the microorganism detection method according to the present invention will be described.
前記培養工程において、所定時間とは、培養により生じる微生物のコロニー等が、肉眼で観察できない位の小さいものにしかならないけれども、これにテトラゾリウム塩を加えることでコロニー等を色素産生させることで肉眼でも観察できるようになる程度の短い時間である。なお、この場合の「肉眼での観察」にはルーペを用いての観察も含まれる。前記所定時間としては、好ましくは２時間から１０時間の範囲、より好ましくは３時間から９時間の範囲、更に好ましくは４時間から８時間の範囲である。なお培養温度は、検出対象となる微生物に応じて適宜決定できる。 In the culturing step, the predetermined period of time means that the colonies of microorganisms generated by culturing are so small that they cannot be observed with the naked eye. The time is short enough to allow observation. In this case, “observation with the naked eye” includes observation with a loupe. The predetermined time is preferably in the range of 2 hours to 10 hours, more preferably in the range of 3 hours to 9 hours, and still more preferably in the range of 4 hours to 8 hours. The culture temperature can be appropriately determined according to the microorganism to be detected.
本発明の微生物の検査方法に適用できる検体としては、特に限定されず、食品、化粧品、実験用器具等が挙げられる。また、検出可能な微生物も特に限定されない。
培地は、液状培地でも固体培地でもよく、固体培地がより好ましい。固体培地としては、例えば、シート状（フィルム状）培地、シャーレ状乾式培地、寒天培地、試験紙等を挙げることができる。中でも、培養液や試薬が全体に迅速に浸透して検出時間をより短縮できることから、シート状（フィルム状）培地が好ましい。
The sample that can be applied to the microorganism testing method of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include foods, cosmetics, and laboratory instruments. Further, the detectable microorganism is not particularly limited.
The medium may be a liquid medium or a solid medium, and a solid medium is more preferable. Examples of the solid medium include a sheet-shaped (film-shaped) medium, a petri dish-shaped dry medium, an agar medium, a test paper, and the like. Among them, a sheet-like (film-like) medium is preferable because the culture solution and the reagent can rapidly permeate the whole and the detection time can be further shortened.
また、シート状（フィルム状）培地としては、特開２００１−２４５６９３号公報に記載の一般生菌検出用シート状培地が好ましい。この一般生菌検出用シート状培地は、多孔質マトリックス層と２または３層の水溶性高分子化合物層とを含み、多孔質マトリックス層から最も離れた側の水溶性高分子化合物層に接して台紙を含んでもよい積層物が、その積層物より大きな粘着シートの中心部に多孔質マトリックス層が上になるように接着されている。その上に前記積層物より大きな透明フィルムが多孔質マトリックス層に接しかつ前記積層物と中心部を合わせるように被せられ、この透明フィルムの前記積層物からはみ出している部分が粘着シートの前記積層物が接着されていない部分と接着されている。
多孔質マトリックス層に接する水溶性高分子化合物層は、ペプトン、肉エキスおよび任意成分としての酵母エキスからなる栄養成分、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムおよび炭酸カルシウムからなる群から選ばれる１種以上の塩、および発色剤を含む水溶性高分子化合物層であることが好ましい。また、多孔質マトリックス層に接する層の次の水溶性高分子化合物層がペプトン、肉エキス、グルコースおよび任意成分としての酵母エキスからなる栄養成分、およびリン酸カリウム、リン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムおよび炭酸カルシウムからなる群から選ばれる１種以上の塩を含むことが好ましい。
このようなシート状培地としては、市販品が知られており、具体的には「サニ太くん」（チッソ（株）社製）が知られている。
Moreover, as a sheet-like (film-like) culture medium, the sheet-like culture medium for general viable bacteria detection described in JP-A-2001-245893 is preferable. This sheet medium for detecting viable bacteria includes a porous matrix layer and two or three water-soluble polymer compound layers, and is in contact with the water-soluble polymer compound layer farthest from the porous matrix layer. A laminate that may include a mount is bonded to the center of the adhesive sheet that is larger than the laminate so that the porous matrix layer is on top. A transparent film larger than the laminate is placed thereon so as to be in contact with the porous matrix layer and align with the laminate, and the portion of the transparent film protruding from the laminate is the laminate of the pressure-sensitive adhesive sheet. Is bonded to the unbonded part.
The water-soluble polymer compound layer in contact with the porous matrix layer is composed of a nutrient component consisting of peptone, meat extract and yeast extract as an optional component, and a group consisting of potassium phosphate, sodium phosphate, sodium carbonate, potassium carbonate and calcium carbonate. It is preferably a water-soluble polymer compound layer containing at least one selected salt and a color former. In addition, the water-soluble polymer compound layer next to the porous matrix layer is composed of peptone, meat extract, glucose and optional yeast extract, and potassium phosphate, sodium phosphate, sodium carbonate, carbonate It is preferable to include at least one salt selected from the group consisting of potassium and calcium carbonate.
As such a sheet-shaped medium, a commercially available product is known, and specifically “Sani Tai-kun” (manufactured by Chisso Corporation) is known.
前記接触工程において、前記色素原は還元系発色試薬または還元系蛍光試薬であることが好ましく、さらに還元系発色試薬または還元系蛍光試薬はテトラゾリウム塩であることが好ましい。
テトラゾリウム系色素であるテトラゾリウム塩は、培養された微生物の細胞内代謝系反応により還元されて、ホルマザンを生じ発色または蛍光色素産生する。これにより、微生物を検出することが可能となるが、この色素産生は細胞内代謝系反応によるため、通常、発色または蛍光箇所は細胞の集落以上の大きさにはならない。しかし、本発明では、色素原との接触工程において酵素的サイクリング反応を行うことにより、微生物の細胞に存在する色素の量を増量することができ、細胞の集落自体を増量させなくても肉眼で十分検出できるようになる。したがって、前記培養工程における培養時間を短縮でき、しかも肉眼で微生物の存在を確認することができる。
また、テトラゾリウム塩を用いた場合、前記特許文献５等に記載の塩基性染料を用いる方法とは異なり、微生物の細胞内代謝系反応を利用しているため、固体試料または固体を含有する液体試料であっても微生物の検出を行うことが可能である。
In the contacting step, the chromogen is preferably a reducing chromogenic reagent or a reducing fluorescent reagent, and the reducing chromogenic reagent or reducing fluorescent reagent is preferably a tetrazolium salt.
Tetrazolium salts, which are tetrazolium dyes, are reduced by the intracellular metabolic reaction of the cultured microorganisms to produce formazan and produce color or fluorescent dyes. This makes it possible to detect microorganisms. However, since this pigment production is caused by intracellular metabolic reactions, the color development or fluorescence sites are usually not larger than the size of the cell colonies. However, in the present invention, the amount of dye present in the cells of the microorganism can be increased by performing an enzymatic cycling reaction in the contact step with the chromogen, and the naked eye can be used without increasing the number of cell colonies. It will be able to detect enough. Therefore, the culture time in the culture process can be shortened, and the presence of microorganisms can be confirmed with the naked eye.
In addition, when a tetrazolium salt is used, unlike a method using a basic dye described in Patent Document 5 or the like, a solid sample or a liquid sample containing a solid is used because an intracellular metabolic system reaction of a microorganism is used. Even so, it is possible to detect microorganisms.
テトラゾリウム塩としては、前述のように、微生物の細胞内代謝系反応により還元されて、ホルマザンを生じ発色または蛍光色素産生するものであればとくに制限されないが、還元反応により目視可能な色調で発色シグナルを生じる（つまり、３００ｎｍから８００ｎｍの範囲の波長領域で、その一部または全部で光吸収を有するは）ものであるか、または目視可能な蛍光を呈するものであるのがよい。
例えば、ｐ−ヨードニトロテトラゾリウム・バイオレット［ケミカルアブストラクト登録番号１４６−６８−９］、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ テトラゾリウムブロミド（以下「ＭＴＴ」と略す。）［ケミカルアブストラクト登録番号２９８−９３−１］、ネオテトラゾリウム［ケミカルアブストラクト登録番号２９８−９５−３］、ニトロ・ブルー・テトラゾリウム［ケミカルアブストラクト登録番号２９８−８３−９］、テトラニトロ・ブルー・テトラゾリウム［ケミカルアブストラクト登録番号４２７９８−９８−１］、テトラゾリウム・ブルー［ケミカルアブストラクト登録番号１８７１−２２−３］、テトラゾリウム・レッド（トリフェニル・テトラゾリウム）［ケミカルアブストラクト登録番号２９８−９６−４］、テトラゾリウム・バイオレット［ケミカルアブストラクト登録番号１７１９−７１−７］、チオカルバミル・ニトロ・ブルー・テトラゾリウム［ケミカルアブストラクト登録番号３６８８９−４３−７］、２，３−ビス[２−メソキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリド（以下「ＸＴＴ」と略す。）［ケミカルアブストラクト登録番号１１１０７２−３１−２］、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノソディウム塩（2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt）（以下「ＷＳＴ−１」と略す）［ケミカルアブストラクト登録番号１５０８４９−５２−８］、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノソディウム塩（2-(4-Iodophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium ,monosodium salt）（以下「ＷＳＴ−３」と略す。）［ケミカルアブストラクト未登録］、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド（以下、「ＩＮＴ」と略す。）またはこれらの塩が挙げられる。これらの中でも、特に好ましくはｐ−ヨードニトロテトラゾリウム・バイオレット、ＭＴＴ、ニトロ・ブルー・テトラゾリウム、テトラゾリウム・レッドである。
As described above, the tetrazolium salt is not particularly limited as long as it is reduced by the intracellular metabolic reaction of the microorganism to produce formazan and develops a color or a fluorescent dye. (That is, light absorption is partly or wholly in the wavelength region in the range of 300 nm to 800 nm), or exhibits visible fluorescence.
For example, p-iodonitrotetrazolium violet [chemical abstract registration number 146-68-9], 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide (hereinafter referred to as “MTT”) Abbreviated.) [Chemical Abstract Registration Number 298-93-1], Neotetrazolium [Chemical Abstract Registration Number 298-95-3], Nitro Blue Tetrazolium [Chemical Abstract Registration Number 298-83-9], Tetranitro Blue Tetrazolium [Chemical Abstract Registration Number 42798-98-1], Tetrazolium Blue [Chemical Abstract Registration Number 1871-22-3], Tetrazolium Red (Triphenyl Tetrazolium) [Chemical Abstract Registration number 298-96-4], tetrazolium violet [chemical abstract registration number 1719-71-7], thiocarbamyl nitro blue tetrazolium [chemical abstract registration number 36889-43-7], 2,3-bis [ 2-mesoxy-4-nitro-5-sulfophenyl] -2H-tetrazolium-5-carboxanilide (hereinafter abbreviated as “XTT”) [Chemical Abstract Registration No. 111072-31-2], 2- (4-iodophenyl) -3- (4-Nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium monosodium salt (2- (4-Iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2, 4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium, monosodium salt) (hereinafter abbreviated as “WST-1”) [Chemical Abstract Registration Number 150849- 2-8], 2- (4-Iodophenyl) -3- (2,4-dinitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium monosodium salt (2- (4-Iodophenyl) ) -3- (2,4-dinitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium, monosodium salt) (hereinafter abbreviated as “WST-3”) [chemical abstract not registered], 2- ( 4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5-phenyl-2H-tetrazolium chloride (hereinafter abbreviated as “INT”) or a salt thereof. Among these, p-iodonitrotetrazolium violet, MTT, nitro blue tetrazolium, and tetrazolium red are particularly preferable.
なお、ＭＴＴ、ＸＴＴ、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３、およびＩＮＴの化学構造式を以下に示す。
テトラゾリウム塩以外の色素原としては、例えば２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（以下、「ＤＣＰＩＰ」と略す。）［ケミカルアブストラクト登録番号６２０−４５−１］、メチレン・ブルー［ケミカルアブストラクト登録番号６１−７３−４］、レザズリン［ケミカルアブストラクト登録番号６２７５８−１３−８］等が挙げられる。 Examples of chromogens other than tetrazolium salts include 2,6-dichlorophenolindophenol (hereinafter abbreviated as “DCPIP”) [Chemical Abstract Registration Number 620-45-1], Methylene Blue [Chemical Abstract Registration Number 61- 73-4], resazurin [chemical abstract registration number 62758-13-8] and the like.
前記接触工程において用いられる色素原の使用量は、微生物の検出反応を充分に実施できる量であれば特に限定されるものではない。例えば、寒天培地、シート培地その他の固形培地では培地１ｍｌ中、１μｇ以上が、液体培地では培地１ｍｌ中、０．１μｇ以上が好ましい。この数値以上の濃度であれば、微生物の存在をより確認しやすくなる。 The amount of chromogen used in the contacting step is not particularly limited as long as it is an amount that can sufficiently carry out the detection reaction of microorganisms. For example, 1 μg or more in 1 ml of medium is preferable for an agar medium, sheet medium or other solid medium, and 0.1 μg or more in 1 ml of medium is preferable for liquid medium. If the concentration is higher than this value, the presence of microorganisms can be more easily confirmed.
微生物には、微生物に由来する遺伝子、たんぱく質、脂肪酸、酵素、ＡＴＰあるいはＮＡＤ等の補酵素、微生物の代謝により増加する酸素、二酸化炭素、過酸化水素等の成分が含まれている。
本発明では、これらの成分から選ばれる少なくとも一つを、酵素的サイクリング反応を構成する要素の一部として利用し、色素原を目視可能な色素または蛍光色素へと導くことにより、微生物を検出することができる。
なお、酵素的サイクリング反応においては、微生物内に比較的多く存在する成分を利用するのが好ましい。例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの酸化型（以下「ＮＡＤ」と略す。）およびその還元型（以下「ＮＡＤＨ」と略す。）並びにニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の酸化型（以下「ＮＡＤＰ」と略す。）およびその還元型（以下「ＮＡＤＰＨ」と略す。）は生体含量の最も多い補酵素であり、水素原子の授受を介して可逆的に変化することによって多くの脱水素酵素の酸化還元反応に関与している。したがって、ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰまたはＮＡＤＰＨの酸化反応または還元反応に伴って生じる色素原の発色または蛍光シグナルを、酵素的サイクリング反応によって増感させ、ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰまたはＮＡＤＰＨの存在を高感度に検出するのが好ましい。この観点から、色素原は、還元系発色試薬または還元系蛍光試薬、とくにテトラゾリウム塩であるのが好ましい。この場合、酵素的サイクリング反応による増感は、脱水素酵素、脱水素酵素の基質、およびジアホラーゼを加えることにより行われることが好ましい。
ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰまたはＮＡＤＰＨを利用し、かつ色素原としてテトラゾリウム塩を用いた場合の酵素的サイクリング反応を、下記スキームにより具体的に説明する。
Microorganisms contain components derived from microorganisms, such as genes, proteins, fatty acids, enzymes, coenzymes such as ATP or NAD, oxygen, carbon dioxide, hydrogen peroxide and the like that increase due to the metabolism of microorganisms.
In the present invention, microorganisms are detected by utilizing at least one selected from these components as a part of the elements constituting the enzymatic cycling reaction and leading the chromogen to a visible or fluorescent dye. be able to.
In the enzymatic cycling reaction, it is preferable to use components that are present in a relatively large amount in the microorganism. For example, an oxidized form of nicotinamide adenine dinucleotide (hereinafter abbreviated as “NAD”) and a reduced form thereof (hereinafter abbreviated as “NADH”) and an oxidized form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (hereinafter abbreviated as “NADP”). ) And its reduced form (hereinafter abbreviated as “NADPH”) is the coenzyme with the highest biological content, and it can reversibly change through the exchange of hydrogen atoms, thereby causing the redox reaction of many dehydrogenases. Is involved. Therefore, the chromogenic color or fluorescence signal generated by the oxidation or reduction reaction of NAD, NADH, NADP or NADPH is sensitized by enzymatic cycling reaction, and the presence of NAD, NADH, NADP or NADPH is made highly sensitive. It is preferable to detect. From this viewpoint, the chromogen is preferably a reducing coloring reagent or a reducing fluorescent reagent, particularly a tetrazolium salt. In this case, sensitization by enzymatic cycling reaction is preferably performed by adding dehydrogenase, a substrate for dehydrogenase, and diaphorase.
The enzymatic cycling reaction when NAD, NADH, NADP or NADPH is used and a tetrazolium salt is used as a chromogen will be specifically described by the following scheme.
ＮＡＤまたはＮＡＤＰは、脱水素酵素とその基質（還元型）の存在下で、脱水素酵素による基質（還元型）の酸化反応に補酵素として作用し、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへと還元される。さらにこのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは、色素原、例えばテトラゾリウム系色素とその還元酵素であるジアホラーゼ存在下で再びＮＡＤまたはＮＡＤＰへと酸化される。このとき、同時にテトラゾリウム系色素が還元されてホルマザンとなり、発色または蛍光シグナルが得られる。ＮＡＤまたはＮＡＤＰは、このような条件下で酸化還元を繰り返すため、シグナル強度は徐々に大きくなる。すなわち、酵素的サイクリング反応によってシグナル強度は徐々に大きくなる。 NAD or NADP acts as a coenzyme in the oxidation reaction of the substrate (reduced form) by the dehydrogenase in the presence of dehydrogenase and its substrate (reduced form), and is reduced to NADH or NADPH. Further, this NADH or NADPH is oxidized again to NAD or NADP in the presence of a chromogen, for example, a tetrazolium dye and its reductase diaphorase. At this time, the tetrazolium dye is simultaneously reduced to formazan, and a color or fluorescent signal is obtained. Since NAD or NADP repeats redox under such conditions, the signal intensity gradually increases. That is, the signal intensity gradually increases due to the enzymatic cycling reaction.
本発明においては、培養後の微生物に含まれる比較的多く存在する成分、例えばＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰまたはＮＡＤＰＨを酵素的サイクリング反応させることにより、色素原に由来する発色または蛍光シグナルを増感させるものであるから、酵素的サイクリング反応を維持させている限り、発色または蛍光シグナルは増感し続ける。したがって、発色または蛍光シグナルが目視可能なまでに増感するまで酵素的サイクリング反応を維持するのに必要量の基質および色素原を添加すれば、短時間の微生物培養でも確実に目視で微生物の検出が可能となる。 In the present invention, a relatively large amount of components contained in microorganisms after culturing, for example, NAD, NADH, NADP or NADPH is subjected to an enzymatic cycling reaction to enhance chromogenic or fluorescent signals derived from chromogen. Thus, as long as the enzymatic cycling reaction is maintained, the chromogenic or fluorescent signal continues to sensitize. Therefore, the addition of the necessary amount of substrate and chromogen to maintain the enzymatic cycling reaction until the chromogenic or fluorescent signal is sensitized enough to be visible ensures that microorganisms can be detected visually even in short microbial cultures. Is possible.
また、前記接触工程において、微生物の細胞壁を変性させる細胞壁変性剤または微生物の細胞壁を溶解する細胞壁溶解剤を添加することが好ましい。
微生物の細胞壁を変性または溶解させて、微生物の成分を漏出させ、漏出した成分を酵素的サイクリング反応させることにより、着色箇所をより見やすくすることができる。微生物の細胞壁を変性または溶解させる際には、微生物の全体またはすべての微生物を変性または溶菌させてもよいし、微生物の一部または培地もしくは集落表層部分に存在する微生物のみを変性または溶菌させてもよい。
In the contacting step, it is preferable to add a cell wall denaturing agent that denatures the cell wall of the microorganism or a cell wall solubilizing agent that dissolves the cell wall of the microorganism.
By denatured or lysed cell walls of microorganisms, components of microorganisms are leaked, and the leaked components are subjected to an enzymatic cycling reaction, thereby making it easier to see the colored portions. When the cell wall of a microorganism is denatured or lysed, all or all of the microorganisms may be denatured or lysed, or only a part of the microorganisms or only the microorganisms present in the culture medium or settlement surface layer may be denatured or lysed. Also good.
微生物の細胞壁を変性または溶解させるには、後述の細胞壁変性剤または細胞壁溶解剤を使用することができる。また、脱水素酵素、脱水素酵素の基質、ジアホラーゼについても、後述のものを使用することができる。また、本発明の検出方法に係る酵素的サイクリング反応における各成分の使用量についても後述の使用量を適用することができる。 In order to denature or lyse the cell wall of the microorganism, the cell wall denaturing agent or cell wall lysing agent described later can be used. In addition, dehydrogenase, dehydrogenase substrate, and diaphorase can be used as described below. Moreover, the usage-amount mentioned later is applicable also about the usage-amount of each component in the enzymatic cycling reaction which concerns on the detection method of this invention.
また、本発明に係る微生物検出用試薬は、脱水素酵素、脱水素酵素の基質、ジアホラーゼおよびテトラゾリウム塩を含むことを特徴とする。本発明の微生物検出用試薬は、前記スキームに基づく酵素的サイクリング反応に適用され、微生物の検出に適用されるのが好ましい。以下、本発明に係る微生物検出用試薬に含まれる各成分について説明する。 The microorganism detection reagent according to the present invention includes a dehydrogenase, a substrate for dehydrogenase, diaphorase, and a tetrazolium salt. The reagent for detecting a microorganism of the present invention is applied to an enzymatic cycling reaction based on the above scheme, and is preferably applied to detection of a microorganism. Hereinafter, each component contained in the reagent for detecting microorganisms according to the present invention will be described.
〔脱水素酵素および脱水素酵素の基質〕
本発明の試薬に用いられる脱水素酵素は、ＮＡＤまたはＮＡＤＰの共存下でその基質の酸化反応を触媒するものであれば特に限定されるものではない。具体的には、一般的に酵素番号が［ＥＣ１．Ｘ．１．Ｙ］で表される、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ共存下でその基質の酸化反応を触媒する酵素が挙げられる。例えば、［ＥＣ１．１．１．Ｙ］、［ＥＣ１．２．１．Ｙ］、［ＥＣ１．３．１．Ｙ］および［ＥＣ１．１．４．Ｙ］が挙げられる。また、このような脱水素酵素は、供給源となる生物種等によって特に限定されるものではない。
[Dehydrogenase and its substrate]
The dehydrogenase used in the reagent of the present invention is not particularly limited as long as it catalyzes the oxidation reaction of the substrate in the presence of NAD or NADP. Specifically, the enzyme number is generally [EC1. X. 1. Y], an enzyme that catalyzes the oxidation reaction of the substrate in the presence of NAD or NADP. For example, [EC 1.1.1. Y], [EC 1.2.1. Y], [EC 1.3.1. Y] and [EC 1.1.4. Y]. Moreover, such a dehydrogenase is not specifically limited by the biological species etc. used as a supply source.
代表的な脱水素酵素およびその基質の組み合わせとしては、アルコール脱水素酵素［ＥＣ１．１．１．１］とメタノール、エタノールまたはプロパノール、グリセロール脱水素酵素［ＥＣ１．１．１．６］とグリセリン、グリセロール３−リン酸脱水素酵素［ＥＣ１．１．１．８］とグリセロール３−リン酸、アルデヒド脱水素酵素［ＥＣ１．１．１．２１］とアセトアルデヒド、乳酸脱水素酵素［ＥＣ１．１．１．２７］と乳酸、リンゴ酸脱水素酵素［ＥＣ１．１．１．３７］とリンゴ酸、グルコース脱水素酵素［ＥＣ１．１．１．４７］とグルコース、グルコース６−リン酸脱水素酵素［ＥＣ１．１．１．４９］とグルコース６−リン酸、（ホルマリンを加えると微生物に影響が大きいと思われるので削除します）、蟻酸脱水素酵素［ＥＣ１．２．１．２］と蟻酸、アルデヒド脱水素酵素［ＥＣ１．２．１．３］とアセトアルデヒド、コレステロール脱水素酵素［ＥＣ１．３．１．２２］とコレステロール、酵素番号が［ＥＣ１．４．１．１から２０］で表される各種アミノ酸脱水素酵素と各種アミノ酸が挙げられる。 Representative dehydrogenases and their substrate combinations include alcohol dehydrogenase [EC 1.1.1.1] and methanol, ethanol or propanol, glycerol dehydrogenase [EC 1.1.1.6] and glycerin, Glycerol 3-phosphate dehydrogenase [EC 1.1.1.18] and glycerol 3-phosphate, aldehyde dehydrogenase [EC 1.1.1.21] and acetaldehyde, lactate dehydrogenase [EC 1.1.1 .27] and lactate, malate dehydrogenase [EC1.1.1.17] and malate, glucose dehydrogenase [EC1.1.1.17] and glucose, glucose 6-phosphate dehydrogenase [EC1 1.1.49] and glucose 6-phosphate (removed because formalin is considered to have a large effect on microorganisms), formate dehydrogenase [E 1.2.1.2] and formic acid, aldehyde dehydrogenase [EC 1.2.1.3] and acetaldehyde, cholesterol dehydrogenase [EC 1.3.1.22] and cholesterol, enzyme number [EC1.4 1.1 to 20] and various amino acid dehydrogenases and various amino acids.
これらの脱水素酵素と基質の組み合わせの中でも、アルコール脱水素酵素とエタノール、グリセロール脱水素酵素とグリセリン、乳酸脱水素酵素と乳酸、リンゴ酸脱水素酵素とリンゴ酸、グルコース脱水素酵素とグルコース、グルコース６−リン酸脱水素酵素とグルコース６−リン酸、アラニン脱水素酵素とアラニン、グルタミン酸脱水素酵素とグルタミン酸、フェニルアラニン脱水素酵素とフェニルアラニンの組み合わせが好ましい。特に好ましくは、アルコール脱水素酵素とエタノール、グルコース脱水素酵素とグルコース、グルコース６−リン酸脱水素酵素とグルコース６−リン酸、アラニン脱水素酵素とアラニンである。 Among these dehydrogenase and substrate combinations, alcohol dehydrogenase and ethanol, glycerol dehydrogenase and glycerin, lactate dehydrogenase and lactic acid, malate dehydrogenase and malate, glucose dehydrogenase and glucose, glucose A combination of 6-phosphate dehydrogenase and glucose 6-phosphate, alanine dehydrogenase and alanine, glutamate dehydrogenase and glutamate, phenylalanine dehydrogenase and phenylalanine is preferred. Particularly preferred are alcohol dehydrogenase and ethanol, glucose dehydrogenase and glucose, glucose 6-phosphate dehydrogenase and glucose 6-phosphate, alanine dehydrogenase and alanine.
本発明の試薬に用いられる脱水素酵素およびその基質の使用量は、微生物の検出反応を充分に実施できる量であれば特に限定されるものではない。脱水素酵素の使用量は、微生物の検出判定を実施する際に、微生物に由来するＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰおよびＮＡＤＰＨから選ばれる少なくとも一つ、基質（還元型）、脱水素酵素、ジアホラーゼ並びにテトラゾリウム塩が同時に存在する状態で、０．０１ｕ／ｍＬから１０００ｕ／ｍＬの範囲内であることが好ましい。より好ましくは０．１／ｍＬから２００ｕ／ｍＬの範囲内である。一方、脱水素酵素の基質の使用量は、該状態で１μｇ／ｍＬ以上であることが好ましい。
ここで、上記単位ｕ（ユニット）とは、脱水素酵素については、３０℃で１μＭのＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成する量を示す。
The amount of the dehydrogenase and its substrate used in the reagent of the present invention is not particularly limited as long as it can sufficiently carry out a microorganism detection reaction. The amount of dehydrogenase used is at least one selected from NAD, NADH, NADP and NADPH derived from microorganisms, substrate (reduced form), dehydrogenase, diaphorase and tetrazolium salt when carrying out detection detection of microorganisms Are preferably in the range of 0.01 u / mL to 1000 u / mL. More preferably, it is in the range of 0.1 / mL to 200 u / mL. On the other hand, the amount of the dehydrogenase substrate used is preferably 1 μg / mL or more in this state.
Here, the unit u (unit) indicates an amount of 1 μM NADH or NADPH generated at 30 ° C. for the dehydrogenase.
〔ジアホラーゼ〕
本発明の試薬に用いられるジアホラーゼは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの共存下でテトラゾリウム塩の還元反応を触媒するものであれば特に限定されるものではない。また、その供給源となる生物種等によって特に限定されるものではない。例えば、バチルス・ステアロサーモフィルス、クロストリジウム・クルイベリその他の微生物由来のものや、ブタ心臓由来のものが挙げられる。中でも、微生物由来の酵素は生産性が良く入手も容易であることから好ましい。さらに、保存安定性に優れていることから、バチルス・ステアロサーモフィルス由来のジアホラーゼＩ［ＥＣ１．６．４．３］およびジアホラーゼII［ＥＣ１．６．９９．−］が特に好ましい。
また、ジアホラーゼの代わりにフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）やメルドラーブルーなどの電子伝達物質を用いても、本発明の効果を奏する。
[Diaphorase]
The diaphorase used in the reagent of the present invention is not particularly limited as long as it catalyzes the reduction reaction of tetrazolium salt in the presence of NADH or NADPH. Moreover, it is not specifically limited by the biological species etc. which become the supply source. Examples include those derived from Bacillus stearothermophilus, Clostridium kluyveri and other microorganisms, and those derived from porcine heart. Among these, microorganism-derived enzymes are preferable because of their high productivity and easy availability. Furthermore, since it is excellent in storage stability, diaphorase I [EC1.6.4.3] and diaphorase II [EC1.6.99.] Derived from Bacillus stearothermophilus. -] Is particularly preferable.
In addition, the effect of the present invention can be obtained by using an electron transfer material such as phenazine methosulfate (PMS) or Meldler Blue instead of diaphorase.
本発明の試薬に用いられるジアホラーゼの使用量は、微生物の検出反応を充分に実施できる量であれば特に限定されるものではない。ジアホラーゼの使用量は、微生物の検出判定を実施する際に、微生物に由来するＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰおよびＮＡＤＰＨから選ばれる少なくとも一つ、基質（還元型）、脱水素酵素、ジアホラーゼ並びにテトラゾリウム塩が同時に存在する状態で、０．０１ｕ／ｍＬから１０００ｕ／ｍＬの範囲内であることが好ましい。より好ましくは０．１ｕ／ｍＬから２００ｕ／ｍＬの範囲内である。
ここで、上記単位ｕ（ユニット）とは、ジアホラーゼについては、３０℃で１μＭのＤＣＩＰ（Dichlorophenolindophenol）を１分間に還元する量を示す。
The amount of diaphorase used in the reagent of the present invention is not particularly limited as long as it is an amount that can sufficiently carry out a microorganism detection reaction. The amount of diaphorase used is that at least one of NAD, NADH, NADP and NADPH derived from the microorganism, substrate (reduced form), dehydrogenase, diaphorase and tetrazolium salt are simultaneously used when performing detection detection of the microorganism. When present, it is preferably in the range of 0.01 u / mL to 1000 u / mL. More preferably, it is in the range of 0.1 u / mL to 200 u / mL.
Here, the unit u (unit) indicates the amount of diaphorase that reduces 1 μM DCIP (Dichlorophenolindophenol) per minute at 30 ° C.
本発明の試薬におけるテトラゾリウム塩の使用量は、微生物の検出反応を充分に実施できる量であれば特に限定されるものではない。テトラゾリウム塩の使用量は、微生物の検出判定を実施する際に、微生物に由来するＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰおよびＮＡＤＰＨから選ばれる少なくとも一つ、基質（還元型）、脱水素酵素、ジアホラーゼ並びにテトラゾリウム塩が同時に存在する状態で、寒天培地、シート培地その他の固形培地では５０μｇ／ｍＬ以上、液体培地では５μｇ／ｍＬ以上が好ましい。この数値以上の濃度であれば、確認しやすい程度にまで発色するからである。 The amount of tetrazolium salt used in the reagent of the present invention is not particularly limited as long as it is an amount that can sufficiently carry out a microorganism detection reaction. The amount of tetrazolium salt used is such that at least one selected from NAD, NADH, NADP and NADPH derived from microorganisms, substrate (reduced form), dehydrogenase, diaphorase and tetrazolium salt are used when carrying out detection detection of microorganisms. In the state of being present at the same time, it is preferably 50 μg / mL or more for an agar medium, sheet medium or other solid medium, and 5 μg / mL or more for a liquid medium. This is because the color is developed to such a level that it is easy to confirm if the concentration is above this value.
本発明の試薬は、細胞壁変性剤および細胞壁溶解剤から選ばれる少なくとも一つを含有するのが好ましい。細胞壁変性剤および細胞壁溶解剤から選ばれる少なくとも一つを含むことで、微生物に由来するＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰおよびＮＡＤＰＨから選ばれる少なくとも一つを、より効率的に酵素的サイクリング反応に供することができる。
前記細胞壁変性剤および細胞壁溶解剤としては、アルコール、ケトン、キレート剤、抗生物質、界面活性剤を挙げることができる。
微生物を培養した微生物試料、培地または試験紙に、予め細胞壁変性剤または細胞壁溶解剤を作用させて微生物の細胞壁を変性させまたは細胞を破壊させておく方法や、微生物検出用試薬に細胞壁変性剤または細胞壁溶解剤を共存させておく方法を用いることで、微生物に由来するＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰおよびＮＡＤＰＨから選ばれる少なくとも一つを、より効率的に酵素的サイクリング反応に供することができる。細胞壁変性剤または細胞壁溶解剤の種類および使用量は、微生物検出反応を阻害しないものおよび量であれば特に限定されるものではない。
The reagent of the present invention preferably contains at least one selected from a cell wall denaturing agent and a cell wall lysing agent. By including at least one selected from a cell wall denaturing agent and a cell wall lysing agent, at least one selected from NAD, NADH, NADP and NADPH derived from a microorganism can be more efficiently subjected to an enzymatic cycling reaction. .
Examples of the cell wall denaturing agent and cell wall solubilizer include alcohols, ketones, chelating agents, antibiotics, and surfactants.
A method in which a cell wall denaturing agent or cell wall lysing agent is previously acted on a microorganism sample, medium or test paper in which microorganisms are cultured to denature or destroy the cell wall of the microorganism, or a cell wall denaturing agent or By using a method in which a cell wall lysing agent is allowed to coexist, at least one selected from NAD, NADH, NADP and NADPH derived from microorganisms can be more efficiently subjected to an enzymatic cycling reaction. The type and amount of the cell wall denaturing agent or cell wall solubilizing agent are not particularly limited as long as they do not inhibit the microorganism detection reaction and are in amounts.
また、本発明の試薬に粘性を持たせるために、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールやポリビニリドンなどの水溶性高分子を試薬中に予め添加しておいてもよい。本発明の試薬に粘性を持たせることで、試薬と微生物試料との接触が容易になる。その結果、より確実に微生物の検出判定をすることができるようになる。 In order to give the reagent of the present invention viscosity, a water-soluble polymer such as polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, or polyvinylidone may be added in advance to the reagent. By making the reagent of the present invention viscous, contact between the reagent and the microorganism sample is facilitated. As a result, it becomes possible to more reliably detect and determine microorganisms.
本発明の試薬の使用する時には、生理食塩水などに、基質（還元型）、脱水素酵素、ジアホラーゼおよびテトラゾリウム塩が同時に含まれている緩衝液の形態とすることができる。この緩衝液に試料を混合し、呈色するか否かを観察することで試料中の微生物を検出判定することができる。緩衝液の種類や濃度に関しては反応を阻害しない限り特に限定はない。 When the reagent of the present invention is used, it can be in the form of a buffer solution in which a physiological saline or the like simultaneously contains a substrate (reduced form), a dehydrogenase, a diaphorase, and a tetrazolium salt. The microorganism in the sample can be detected and determined by mixing the sample with this buffer solution and observing whether or not the sample is colored. The type and concentration of the buffer solution are not particularly limited as long as the reaction is not inhibited.
また、検出判定を実施するまでは、本発明における試薬の形態は特に限定されることはない。すなわち、基質（還元型）、脱水素酵素、ジアホラーゼおよびテトラゾリウム系色素がそれぞれ個別の状態、またはこれらを幾つかに組合せた状態若しくはこれらのすべてを一緒にした状態で保存しておいてもよい。但し、使用（すなわち検出判定を実施）する際には、これらが同時に存在している状態であることが必要である。
また、これらの状態は、溶液状態、粉末状態、試験紙若しくは不織布に含浸された状態、または試験紙若しくは不織布上で乾燥された状態であってもよい。
In addition, the form of the reagent in the present invention is not particularly limited until detection determination is performed. That is, the substrate (reduced form), dehydrogenase, diaphorase, and tetrazolium dye may be stored individually, in a combination of these, or in a combination of all of these. However, when using (that is, carrying out detection determination), it is necessary that these exist simultaneously.
Moreover, these states may be a solution state, a powder state, a state impregnated with a test paper or a nonwoven fabric, or a state dried on the test paper or the nonwoven fabric.
本発明の試薬を用いて微生物を検出するには、より具体的には以下のように行うのが好ましい。まず、微生物を肉眼では観察できない程度の時間、より具体的には２時間から１０時間、液状培地、シート状培地、フィルム状培地、シャーレ状乾式培地、寒天培地または試験紙上で培養する。この培養後の微生物試料、培地または試験紙に、微生物検出用試薬を滴下、混合または表面を覆い被せる。その際、微生物の脱水素反応と共役してテトラゾリウム塩を発色若しくは発光させるか、微生物に由来するＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰおよびＮＡＤＰＨから選ばれる少なくとも一つを起点として酵素的サイクリング反応を継続せしめ発色若しくは発光させるか、またはこの両者の反応による発色若しくは蛍光シグナルを目視により確認することで、微生物を検出することができる。 More specifically, the detection of microorganisms using the reagent of the present invention is preferably carried out as follows. First, the microorganism is cultured on a liquid medium, a sheet-shaped medium, a film-shaped medium, a petri dish-shaped dry medium, an agar medium, or a test paper for a time that cannot be observed with the naked eye, more specifically, for 2 to 10 hours. The microorganism detection reagent is dropped, mixed or covered on the cultured microorganism sample, medium or test paper. At that time, the tetrazolium salt is colored or luminescent in combination with the dehydrogenation reaction of the microorganism, or the enzymatic cycling reaction is continued from at least one selected from NAD, NADH, NADP and NADPH derived from the microorganism to develop or Microorganisms can be detected by emitting light or visually confirming the color development or fluorescence signal resulting from the reaction of both.
以下、本発明の微生物の検出方法及び本発明の微生物検出用試薬のより具体的な実施形態について説明する。
（１）液状培地を用いる場合
試料に滅菌生理食塩水などを加えて、ストマッカーなどの懸濁装置により懸濁する。この懸濁液若しくはこれを適宜希釈した希釈懸濁液または試料そのものを、予め作製しておいた液体培地に加えて、５〜１０時間培養する。
次に、下記１又は２の微生物検出用試薬に液体培地の一部を加える。
１．脱水素酵素、脱水素酵素の基質、ジアホラーゼ並びにテトラゾリウム塩を含む微生物検出用試薬。
２．細胞壁変性剤および細胞壁溶解剤から選ばれる少なくとも一つ、脱水素酵素、脱水素酵素の基質、ジアホラーゼ並びにテトラゾリウム塩を含む微生物検出用試薬。
その後、一定時間放置して、目視で発色または蛍光を確認して微生物の有無を判断する。
Hereinafter, more specific embodiments of the microorganism detection method of the present invention and the microorganism detection reagent of the present invention will be described.
(1) When using a liquid medium Add sterile physiological saline to the sample and suspend it using a suspension device such as a stomacher. This suspension or a diluted suspension obtained by appropriately diluting this suspension or the sample itself is added to a liquid medium prepared in advance and cultured for 5 to 10 hours.
Next, a part of the liquid medium is added to the following microorganism detection reagent 1 or 2.
1. A microorganism detection reagent comprising dehydrogenase, a substrate for dehydrogenase, diaphorase, and a tetrazolium salt.
2. A reagent for detecting a microorganism comprising at least one selected from a cell wall denaturant and a cell wall lysing agent, a dehydrogenase, a substrate for dehydrogenase, diaphorase, and a tetrazolium salt.
Then, it is left for a certain period of time, and the presence or absence of microorganisms is judged by visually confirming color development or fluorescence.
（２）シート状（フィルム状）培地を用いる場合
試料に滅菌生理食塩水などを加えて、ストマッカーなどの懸濁装置により懸濁する。この懸濁液若しくはこれを適宜希釈した希釈懸濁液または試料そのものを透明カバー付シート状（フィルム状）培地に加えて、５〜１０時間培養する。次に、下記１〜４のいずれかの微生物検出用試薬を、カバーを開いたシート状（フィルム状）培地に滴下し、カバーを閉じながら溶液を培地上に拡げて、一定時間放置する。放置後に現れた発色または発光スポットを数える。
１．脱水素酵素、脱水素酵素の基質、ジアホラーゼ並びにテトラゾリウム塩を含む微生物検出用試薬。
２．脱水素酵素及びジアホラーゼを含有する酵素溶液と、脱水素酵素の基質及びテトラゾリウム塩を含有する基質液と、からなる微生物検出用試薬。
３．細胞壁変性剤および細胞壁溶解剤から選ばれる少なくとも一つ、脱水素酵素、脱水素酵素の基質、ジアホラーゼ並びにテトラゾリウム塩を含む微生物検出用試薬。
４．脱水素酵素及びジアホラーゼを含有する酵素溶液と、細胞壁変性剤および細胞壁溶解剤から選ばれる少なくとも一つ、脱水素酵素の基質、及びテトラゾリウム塩を含有する基質液と、からなる微生物検出用試薬。
(2) When using a sheet-like (film-like) medium Add sterile physiological saline to the sample and suspend it with a suspension device such as a stomacher. This suspension or a diluted suspension obtained by appropriately diluting this suspension or the sample itself is added to a sheet-like (film-like) medium with a transparent cover and cultured for 5 to 10 hours. Next, any one of the following microorganism detection reagents 1 to 4 is dropped onto a sheet (film) medium with the cover opened, the solution is spread on the medium while the cover is closed, and left for a certain period of time. Count the colored or luminous spots that appear after standing.
1. A microorganism detection reagent comprising dehydrogenase, a substrate for dehydrogenase, diaphorase, and a tetrazolium salt.
2. A reagent for detecting microorganisms, comprising an enzyme solution containing dehydrogenase and diaphorase, and a substrate solution containing a substrate of dehydrogenase and a tetrazolium salt.
3. A reagent for detecting a microorganism, comprising at least one selected from a cell wall denaturant and a cell wall lysing agent, dehydrogenase, a substrate for dehydrogenase, diaphorase, and a tetrazolium salt.
4). A reagent for detecting a microorganism comprising an enzyme solution containing a dehydrogenase and a diaphorase, and a substrate solution containing at least one selected from a cell wall denaturant and a cell wall lysing agent, a substrate for a dehydrogenase, and a tetrazolium salt.
（３）寒天培地を用いる場合
試料に滅菌生理食塩水などを加えて、ストマッカーなどの懸濁装置により懸濁する。この懸濁液若しくはこれを適宜希釈した希釈懸濁液または試料そのものの一定量を滅菌ペトリ皿に入れ、そこに予め溶解滅菌し、４５℃に保っておいた培地を分注し、撹拌する。これを固化させるか、予め作製しておいた寒天培地にその一定量を塗布させた後、５〜１０時間培養する。次に、前記１〜４のいずれかの微生物検出用試薬を寒天培地に加える。この加えた溶液を寒天培地上に拡げて、一定時間放置する。放置後に現れた発色または発光スポットを数える。
(3) When using an agar medium Add sterile physiological saline to the sample and suspend it using a suspension device such as a stomacher. A certain amount of this suspension or a diluted suspension obtained by appropriately diluting this suspension or the sample itself is placed in a sterilized Petri dish, and the medium previously dissolved and sterilized therein is dispensed and stirred. After solidifying this or applying a certain amount to a previously prepared agar medium, it is cultured for 5 to 10 hours. Next, the microorganism detection reagent of any one of 1 to 4 is added to the agar medium. The added solution is spread on an agar medium and left for a certain period of time. Count the colored or luminous spots that appear after standing.
（４）試験紙を培地として用いる場合
試料に滅菌生理食塩水などを加えて、ストマッカーなどの懸濁装置により懸濁する。この懸濁液またはこれを適宜希釈した希釈懸濁液に試験紙を浸した後、試験紙を袋に入れて、５〜１０時間培養する。次に、前記１〜４のいずれかの微生物検出用試薬を試験紙の入った袋に加え、一定時間放置する。放置後に現れた発色または発光スポットを数える。
(4) When using test paper as a medium Add sterile physiological saline to the sample and suspend it with a suspension device such as a stomacher. After immersing the test paper in this suspension or a diluted suspension obtained by appropriately diluting this, the test paper is put in a bag and incubated for 5 to 10 hours. Next, any one of the microorganism detecting reagents 1 to 4 is added to the bag containing the test paper and left for a certain period of time. Count the colored or luminous spots that appear after standing.
次に実施例および比較例をあげて本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。各例に用いた酵素のユニットは入手した酵素の仕様書または容器に記載のユニット数をそのまま用いた。 EXAMPLES Next, although an Example and a comparative example are given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to the following examples. As the unit of the enzyme used in each example, the number of units described in the specification sheet or the container of the obtained enzyme was used as it was.
実施例１
溶解後の濃度が、ジアホラーゼＩ（ユニチカ(株)製）は３０ユニット／ｍＬ、グルコー
ス６リン酸デヒドロゲナーゼ（ユニチカ(株)製）は３０ユニット／ｍＬ、完全鹸化重合度５００のポリビニルアルコールは５％（ｗ／ｗ）、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルは２％（ｗ／ｖ）となるように０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解させて、酵素溶液を調製した。
溶解後の濃度が、グルコース６リン酸２ナトリウム塩は５ｍＭ、ＭＴＴは０．０５ｍｇ／ｍＬ、ドデシル硫酸ナトリウムは１％（ｗ／ｖ）、ＥＤＴＡは１００ｍＭ、ポリミキシンＢは１００μｇ／ｍＬ、完全鹸化重合度５００のポリビニルアルコールは５％（ｗ／ｗ）となるように０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解させて、基質液を調製した。このようにして、酵素溶液および基質液が分離している態様の微生物検出用試薬を調製した。
Example 1
The concentration after dissolution is 30 units / mL for diaphorase I (manufactured by Unitika), 30 units / mL for glucose 6-phosphate dehydrogenase (manufactured by Unitika), and 5% for polyvinyl alcohol having a complete saponification polymerization degree of 500. (W / w), polyoxyethylene (10) octylphenyl ether was dissolved in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8) so as to be 2% (w / v) to prepare an enzyme solution.
Concentration after dissolution is 5 mM for glucose 6-phosphate disodium salt, 0.05 mg / mL for MTT, 1% (w / v) for sodium dodecyl sulfate, 100 mM for EDTA, 100 μg / mL for polymyxin B, complete saponification polymerization A polyvinyl alcohol having a degree of 500 was dissolved in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8) so as to be 5% (w / w) to prepare a substrate solution. In this way, a reagent for detecting microorganisms in which the enzyme solution and the substrate solution were separated was prepared.
滅菌生理食塩水で１０〜１０００ｃｆｕ／ｍＬとなるように希釈した枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ３１３４）、エンテロバクターエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ ＩＦＯ１２５３４）、クレブシエラニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＪＣＭ１６６２）、シトロバクターフレンディー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＩＦＯ１２６８１）および食品分離株の懸濁液１ｍＬずつを別々のフィルム状培地（サニ太くん一般生菌用、チッソ（株）製）に加えてカバーを被せ、３５℃で６時間培養した。
フィルム状培地のカバーを開き、上記で調製した基質液２滴、続いて酵素溶液２滴を滴下した。二液を混合させ、フィルム状培地の不織布上に拡がるようにして、カバーを被せた。３５℃に保温すると５分経過時点から、ＭＴＴによる青から青紫色の斑点が肉眼で確認できた。
Bacillus subtilis IFO3134, Enterobacter aerogenes IFO12534, Klebsiella pneumoniae C16, and Klebsiella pneumoniae C IFO12681) and 1 mL each of the food isolate suspension were added to separate film-like media (for Sani-taikun general live bacteria, manufactured by Chisso Corporation), covered, and cultured at 35 ° C. for 6 hours.
The cover of the film medium was opened, and 2 drops of the substrate solution prepared above was added dropwise, followed by 2 drops of the enzyme solution. The two liquids were mixed and covered with a cover so as to spread on the nonwoven fabric of the film-like medium. When the temperature was kept at 35 ° C., blue to blue-purple spots due to MTT were confirmed with the naked eye after 5 minutes.
実施例２
溶解後の濃度が、ジアホラーゼＩ（ユニチカ(株)製）は３０ユニット／ｍＬ、グルコー
ス６リン酸デヒドロゲナーゼ（ユニチカ(株)製）は３０ユニット／ｍＬ、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートは２％（ｗ／ｗ）となるように０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解させて、酵素溶液を調製した。
溶解後の濃度が、グルコース６リン酸グルコース６リン酸２ナトリウム塩は５ｍＭ、ＭＴＴは０．０５ｍｇ／ｍＬ、塩化ベンザルコニウムは０．５％（ｗ／ｗ）、ＥＤＴＡは１００ｍＭ、アセトンは１０％（ｗ／ｗ）となるように０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解させて、基質液を調製した。このようにして、酵素溶液および基質液が分離している態様の微生物検出用試薬を調製した。
Example 2
Concentration after dissolution is 30 units / mL for diaphorase I (manufactured by Unitika), 30 units / mL for glucose 6-phosphate dehydrogenase (manufactured by Unitika), and polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate is An enzyme solution was prepared by dissolving in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8) to 2% (w / w).
Concentration after dissolution was 5 mM for glucose 6-phosphate glucose 6-phosphate disodium salt, 0.05 mg / mL for MTT, 0.5% (w / w) for benzalkonium chloride, 100 mM for EDTA, 10 for acetone % (W / w) was dissolved in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8) to prepare a substrate solution. In this way, a reagent for detecting microorganisms in which the enzyme solution and the substrate solution were separated was prepared.
滅菌生理食塩水で１０〜１０００ｃｆｕ／ｍＬとなるように希釈した枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ３１３４）、エンテロバクターエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ ＩＦＯ１２５３４）、クレブシエラニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＪＣＭ１６６２）、シトロバクターフレンディー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＩＦＯ１２６８１）および食品分離株の懸濁液1ｍＬずつを径９０ｍｍのプラスチックシャーレに分注した。ここに、予めオートクレーブ滅菌し、４５℃に保っておいた普通寒天培地１０ｍＬを加え混釈した。寒天が固化後、３５℃で６時間培養した。
上記で調製した基質液５滴、続いて酵素溶液５滴を滴下し、コーンラージ棒で二液を混合し寒天培地上に拡げた。３５℃に保温すると１０分経過した時点から、寒天培地上に青から青紫色の斑点が確認できた。
Bacillus subtilis IFO3134, Enterobacter aerogenes IFO12534, Klebsiella pneumoniae C16, and Klebsiella pneumoniae C IFO12681) and 1 mL of the food isolate suspension were dispensed into a plastic petri dish with a diameter of 90 mm. To this, 10 mL of a normal agar medium that had been sterilized by autoclaving and kept at 45 ° C. was added and mixed. After the agar solidified, it was cultured at 35 ° C. for 6 hours.
Five drops of the substrate solution prepared above and then five drops of the enzyme solution were dropped, and the two solutions were mixed with a corn large rod and spread on an agar medium. When the temperature was kept at 35 ° C., blue to blue-violet spots were confirmed on the agar medium after 10 minutes had passed.
実施例３
溶解後の濃度が、ジアホラーゼＩ（ユニチカ(株)製）は３０ユニット／ｍＬ、グルコー
ス６リン酸デヒドロゲナーゼ（ユニチカ(株)製）は３０ユニット／ｍＬ、グリセリンは０．２Ｍとなるように０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解させて、酵素溶液を調製した。
溶解後の濃度が、グルコース６リン酸２ナトリウム塩は５ｍＭ、ＭＴＴは０．０５ｍｇ／ｍＬ、ポリミキシンＢは２０μｇ／ｍＬ、エタノールは２０％となるように０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解させて、基質液を調製した。このようにして、酵素溶液および基質液が分離している態様の微生物検出用試薬を調製した。
Example 3
The concentration after dissolution was 30 units / mL for diaphorase I (manufactured by Unitika Ltd.), 30 units / mL for glucose 6-phosphate dehydrogenase (manufactured by Unitika Ltd.) and 0.2 M so that glycerol was 0.2 M. An enzyme solution was prepared by dissolving in 1M Tris-HCl buffer (pH 8).
The concentration after dissolution was 5 mM for glucose 6-phosphate disodium salt, 0.05 mg / mL for MTT, 20 μg / mL for polymyxin B, and 20% ethanol for 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8). The substrate solution was prepared by dissolution. In this way, a reagent for detecting microorganisms in which the enzyme solution and the substrate solution were separated was prepared.
滅菌生理食塩水で１０〜１００ｃｆｕ／ｍＬとなるように希釈した枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ３１３４）、エンテロバクターエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ ＩＦＯ１２５３４）、クレブシエラニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＪＣＭ１６６２）、シトロバクターフレンディー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＩＦＯ１２６８１）および食品分離株の懸濁液1ｍＬずつを、４枚のフィルム状培地（サニ太くん一般生菌用、チッソ（株）製）にそれぞれ加えた。そのうち２枚を３５℃で６時間３０分培養した後、フィルム状培地のカバーを開き、上記で調製した基質液２滴、続いて酵素溶液２滴を滴下して、二液を混合させフィルム状培地の不織布上に拡がるように、カバーを被せた。３５℃に１時間保温し、ルーペ下で観察される青から青紫色のスポットを数え平均した。
一方、比較として、残りの２枚には微生物検出用試薬を添加せず、３５℃で２４時間保温したところ、菌の生育による赤色のスポットが観察された。この赤色のスポットを数え平均した。
この結果を下記表１に示す。
Bacillus subtilis IFO3134, Enterobacter aerogenes IFO12534, Klebsiella pneumoniae C16, and Klebsiella pneumoniae C IFO12681) and 1 mL each of the food isolate suspension were added to each of four film-like media (for Sani-taikun general live bacteria, manufactured by Chisso Corporation). Two of them were cultured at 35 ° C for 6 hours and 30 minutes, then the cover of the film medium was opened, and 2 drops of the substrate solution prepared above and then 2 drops of the enzyme solution were added dropwise to mix the two solutions to form a film. A cover was placed so as to spread on the nonwoven fabric of the medium. The temperature was kept at 35 ° C. for 1 hour, and the blue to blue-violet spots observed under a loupe were counted and averaged.
On the other hand, as a comparison, when the reagent for microorganism detection was not added to the remaining two sheets and incubated at 35 ° C. for 24 hours, red spots due to the growth of the bacteria were observed. The red spots were counted and averaged.
The results are shown in Table 1 below.
実施例４
溶解後の濃度が、ジアホラーゼＩ（ユニチカ(株)製）は６０ユニット／ｍＬ、グリセロ
リン酸デヒドロゲナーゼは６０ユニット／ｍＬとなるように０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解させて、酵素溶液を調製した。
溶解後の濃度が、グリセロリン酸２ナトリウム塩は０．１Ｍ、ＭＴＴは１ｍｇ／ｍＬ、コリスチンは２０μｇ／ｍＬとなるように０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解させて、基質液を調製した。このようにして、酵素溶液および基質液が分離している態様の微生物検出用試薬を調製した。
Example 4
The enzyme solution is dissolved in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8) so that the concentration after dissolution is 60 units / mL for diaphorase I (manufactured by Unitika Ltd.) and 60 units / mL for glycerophosphate dehydrogenase. Was prepared.
Prepare a substrate solution by dissolving in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8) so that the concentration after dissolution is 0.1 M for glycerophosphate disodium salt, 1 mg / mL for MTT, and 20 μg / mL for colistin. did. In this way, a reagent for detecting microorganisms in which the enzyme solution and the substrate solution were separated was prepared.
滅菌生理食塩水で１００〜１０００ｃｆｕ／ｍＬとなるように希釈した枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ３１３４）、エンテロバクターエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ ＩＦＯ１２５３４）、クレブシエラニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＪＣＭ１６６２）、シトロバクターフレンディー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＩＦＯ１２６８１）および食品分離株の懸濁液０．1ｍＬずつを、予め調製した別々の標準寒天培地に塗布し、３５℃で６時間培養した。上記で調製した基質液および酵素液を等量混合し、その１ｍＬをそれぞれの標準寒天培地に滴下し、培地上に拡げた。３５℃で１時間保温し、ルーペ下で観察すると、すべての標準寒天培地において青から青紫色のスポットが認められた。 Bacillus subtilis IFO 3134, Enterobacter aerogenes IFO 12534, Klebsiella pneumonia C IFO12681) and 0.1 mL each of the food isolate suspension were applied to separate standard agar media prepared in advance and cultured at 35 ° C. for 6 hours. Equal amounts of the substrate solution and enzyme solution prepared above were mixed, and 1 mL thereof was dropped onto each standard agar medium and spread on the medium. When incubated at 35 ° C. for 1 hour and observed under a loupe, blue to blue-violet spots were observed in all standard agar media.
実施例５
実施例３のグルコース６−リン酸脱水素酵素およびグルコース６−リン酸を、アルコール脱水素酵素（ユニチカ製）およびエタノール、グリセロール脱水素酵素（東洋紡製）およびグリセリン、乳酸脱水素酵素（ロッシュ製）および乳酸、リンゴ酸脱水素酵素（ロッシュ製）およびリンゴ酸、グルコース脱水素酵素（ユニチカ製）およびブドウ糖、ホルムアルデヒド脱水素酵素（シグマ製）およびホルマリン、アラニン脱水素酵素（ユニチカ製）およびアラニン、グルタミン酸脱水素酵素（東洋紡製）およびグルタミン酸、フェニルアラニン脱水素酵素（ユニチカ製）およびフェニルアラニンの組み合わせに代えて、基質液および酵素溶液を調製したこと以外は、実施例３と同様の操作を行った。すべての組み合わせにおいて実施例３と同様の結果が得られた。
Example 5
Glucose 6-phosphate dehydrogenase and glucose 6-phosphate of Example 3 were converted into alcohol dehydrogenase (Unitika) and ethanol, glycerol dehydrogenase (Toyobo) and glycerin, lactate dehydrogenase (Roche). And lactate, malate dehydrogenase (Roche) and malate, glucose dehydrogenase (Unitika) and glucose, formaldehyde dehydrogenase (Sigma) and formalin, alanine dehydrogenase (Unitika) and alanine, glutamate The same operation as in Example 3 was performed except that a substrate solution and an enzyme solution were prepared in place of a combination of dehydrogenase (Toyobo), glutamic acid, phenylalanine dehydrogenase (Unitika) and phenylalanine. The same results as in Example 3 were obtained in all combinations.
実施例６
実施例４におけるＭＴＴの代わりに、ＩＮＴ、ＤＣＰＩＰ、ｐ−ヨードニトロテトラゾリウム・バイオレット、ネオテトラゾリウム、ニトロ・ブルー・テトラゾリウム、テトラニトロ・ブルー・テトラゾリウム、テトラゾリウム・ブルー、テトラゾリウム・バイオレット、チオカルバミル・ニトロ・ブルー・テトラゾリウム、ＸＴＴ、ＷＳＴ−１またはＷＳＴ−３を用いて、基質液を調製したこと以外は、実施例４と同様の操作を行った。化合物の種類により目視で確認できるまでの時間に違いはあったものの、すべての標準寒天培地において実施例４と同様の結果が得られた。
Example 6
Instead of MTT in Example 4, INT, DCPIP, p-iodonitrotetrazolium violet, neotetrazolium, nitro blue tetrazolium, tetranitro blue tetrazolium, tetrazolium blue, tetrazolium violet, thiocarbamyl nitro blue The same operation as in Example 4 was performed except that the substrate solution was prepared using tetrazolium, XTT, WST-1 or WST-3. Although there was a difference in the time until visual confirmation was possible depending on the type of compound, the same results as in Example 4 were obtained in all standard agar media.
実施例７
溶解後の濃度が、ジアホラーゼＩ（ユニチカ(株)製）は６０ユニット／ｍＬ、グルコー
ス６リン酸デヒドロゲナーゼ（ユニチカ(株)製）は６０ユニット／ｍＬ、グリセリンは０．１％（ｗ／ｗ）となるように０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解させて、酵素溶液を調製した。
溶解後の濃度が、グルコース６リン酸２ナトリウム塩は１０ｍＭ、ＭＴＴは１ｍｇ／ｍＬ、ポリミキシンＢは２０μｇ／ｍＬ、エタノールは２０％となるように０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解させて、基質液を調製した。このようにして、酵素溶液および基質液が分離している態様の微生物検出用試薬を調製した。
Example 7
The concentration after dissolution was 60 units / mL for diaphorase I (manufactured by Unitika), 60 units / mL for glucose 6-phosphate dehydrogenase (manufactured by Unitika), and 0.1% (w / w) for glycerin. An enzyme solution was prepared by dissolving in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8).
Dissolve in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8) so that the concentration after dissolution is 10 mM for glucose 6-phosphate disodium salt, 1 mg / mL for MTT, 20 μg / mL for polymyxin B, and 20% for ethanol. A substrate solution was prepared. In this way, a reagent for detecting microorganisms in which the enzyme solution and the substrate solution were separated was prepared.
食品１０ｇに滅菌生理食塩水９０ｍＬを加え、３０秒間ストマッカー処理した。懸濁液１ｍＬを９ｍＬの滅菌生理食塩水で希釈して、１０倍段階希釈液を調製した。懸濁液または１０倍段階希釈液１ｍＬを、フィルム状培地（サニ太くん一般生菌用、チッソ（株）製）に加え、３５℃で培養した。６．５時間後、上記で作製した基質液２滴続いて酵素溶液２滴を滴下して、二液を混合させ、フィルム状培地の不織布上に拡がるように、カバーを被せた。３５℃に１時間保温し、ルーペ下で観察される青から青紫色のスポットを数え平均し、３５℃で２４時間培養後の赤色スポット数と比較した。６．５時間培養して観察されたスポット数は２４時間培養して観察されたスポット数に対して平均約６０％であった。 90 g of sterilized physiological saline was added to 10 g of food, followed by a stomacher treatment for 30 seconds. 1 mL of the suspension was diluted with 9 mL of sterilized physiological saline to prepare a 10-fold serial dilution. 1 mL of the suspension or 10-fold serially diluted solution was added to a film-like medium (for Sani-taikun live bacteria, manufactured by Chisso Corp.) and cultured at 35 ° C. After 6.5 hours, 2 drops of the substrate solution prepared above and then 2 drops of the enzyme solution were added dropwise to mix the two solutions, and the cover was placed so as to spread on the nonwoven fabric of the film medium. The temperature was kept at 35 ° C. for 1 hour, the blue to blue-violet spots observed under a loupe were counted and averaged, and compared with the number of red spots after culturing at 35 ° C. for 24 hours. The number of spots observed after culturing for 6.5 hours was about 60% on average with respect to the number of spots observed after culturing for 24 hours.
実施例８
ＳＣＤ濃縮液体培地「ダイゴ」（日本製薬製）一缶を精製水で５００Ｌに希釈したもの９ｍＬに、滅菌生理食塩水で１０〜１００ｃｆｕ／ｍＬの範囲に入るように希釈した枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ３１３４）の懸濁液1ｍＬを加え、３５℃で６時間培養して、微生物を含む試料を調製した。
溶解後の濃度が、アルコール脱水素酵素（ユニチカ製）は２０ユニット／ｍＬ、エタノール（脱水素酵素用基質）は５ｍＭ、ジアホラーゼＩ（ユニチカ(株)製）は１０ユニット／
ｍＬ、ＩＮＴ（テトラゾリウム塩）は０．０２ｍｇ／ｍＬ、ラウリル硫酸ナトリウムは１％（ｗ／ｖ）となるように０．１Ｍトリエチルアミン緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させて、微生物検出用試薬を調製した。
微生物を含む試料０．５ｍＬと、微生物検出用試薬２．５ｍＬとを混合し、室温で３０分間放置した。液全体にＩＮＴが反応することによる薄い赤色の着色を確認した。
Example 8
Bacillus subtilis IFO3134 diluted to 9 mL of a can of SCD concentrated liquid medium “Daigo” (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) diluted to 500 L with purified water so as to fall within the range of 10-100 cfu / mL with sterile physiological saline. 1 mL of the suspension was added and cultured at 35 ° C. for 6 hours to prepare a sample containing microorganisms.
The concentration after dissolution is 20 units / mL for alcohol dehydrogenase (manufactured by Unitika), 5 mM for ethanol (substrate for dehydrogenase), and 10 units / unit for diaphorase I (manufactured by Unitika Ltd.).
mL, INT (tetrazolium salt) 0.02 mg / mL, sodium lauryl sulfate 1% (w / v) dissolved in 0.1 M triethylamine buffer (pH 7.5) Prepared.
A sample containing microorganisms (0.5 mL) and a microorganism detection reagent (2.5 mL) were mixed and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. A pale red coloration due to the reaction of INT with the whole liquid was confirmed.
実施例９
実施例８におけるアルコール脱水素酵素（ユニチカ製）およびエタノール（脱水素酵素用基質）の代わりに、グリセロール脱水素酵素（東洋紡製）およびグリセリン（脱水素酵素用基質）、乳酸脱水素酵素（ロッシュ製）および乳酸（脱水素酵素用基質）、リンゴ酸脱水素酵素（ロッシュ製）およびリンゴ酸（脱水素酵素用基質）、グルコース脱水素酵素（ユニチカ製）およびグルコース（脱水素酵素用基質）、グルコース６−リン酸脱水素酵素（ユニチカ製）およびグルコース６−リン酸（脱水素酵素用基質）、ホルムアルデヒド脱水素酵素（シグマ製）およびホルマリン（脱水素酵素用基質）、アラニン脱水素酵素（ユニチカ製）およびアラニン（脱水素酵素用基質）、グルタミン酸脱水素酵素（東洋紡製）およびグルタミン酸（脱水素酵素用基質）並びにフェニルアラニン脱水素酵素（ユニチカ製）およびフェニルアラニン（脱水素酵素用基質）を用いても、すべての組合せにおいて同様に赤色の着色が起こることを確認した。
Example 9
In place of alcohol dehydrogenase (Unitika) and ethanol (substrate for dehydrogenase) in Example 8, glycerol dehydrogenase (produced by Toyobo), glycerin (substrate for dehydrogenase), lactate dehydrogenase (produced by Roche) ) And lactic acid (dehydrogenase substrate), malate dehydrogenase (Roche) and malate (dehydrogenase substrate), glucose dehydrogenase (Unitika) and glucose (dehydrogenase substrate), glucose 6-phosphate dehydrogenase (manufactured by Unitika) and glucose 6-phosphate (substrate for dehydrogenase), formaldehyde dehydrogenase (manufactured by Sigma) and formalin (substrate for dehydrogenase), alanine dehydrogenase (manufactured by Unitika) ) And alanine (substrate for dehydrogenase), glutamate dehydrogenase (Toyobo) and glutamate (dehydrogenation) Motoyo substrate) as well as with phenylalanine dehydrogenase (manufactured by Unitika) and phenylalanine (dehydrogenase for substrate), it was confirmed similarly to red coloration occurs in all combinations.
比較例１
実施例８において、エタノール（脱水素酵素用基質）のみ取り除いたブランク試薬を調製した。
実施例８で調製した微生物を含む試料０．５ｍＬと、このブランク試薬２．５ｍＬとを混合し、室温で３０分間放置してＩＮＴが反応することによる赤色の着色が起こらないことを確認した。
Comparative Example 1
In Example 8, a blank reagent was prepared by removing only ethanol (dehydrogenase substrate).
0.5 mL of the sample containing the microorganism prepared in Example 8 and 2.5 mL of this blank reagent were mixed and left at room temperature for 30 minutes to confirm that red coloring due to the reaction of INT did not occur.
比較例２
実施例８において、アルコール脱水素酵素（ユニチカ製）をグリセロール脱水素酵素（東洋紡製）、乳酸脱水素酵素（ロッシュ製）、リンゴ酸脱水素酵素（ロッシュ製）、グルコース脱水素酵素（ユニチカ製）、グルコース６−リン酸脱水素酵素（ユニチカ製）、ホルムアルデヒド脱水素酵素（シグマ製）、アラニン脱水素酵素（ユニチカ製）、グルタミン酸脱水素酵素（東洋紡製）またはフェニルアラニン脱水素酵素（ユニチカ製）に変更したこと以外は、実施例８を繰り返した。すべての組合せにおいて同様に赤色の着色が起こらないことを確認した。
Comparative Example 2
In Example 8, alcohol dehydrogenase (manufactured by Unitika) was changed to glycerol dehydrogenase (Toyobo), lactate dehydrogenase (Roche), malate dehydrogenase (Roche), glucose dehydrogenase (Unitika) Glucose 6-phosphate dehydrogenase (manufactured by Unitika), formaldehyde dehydrogenase (manufactured by Sigma), alanine dehydrogenase (manufactured by Unitika), glutamate dehydrogenase (manufactured by Toyobo) or phenylalanine dehydrogenase (manufactured by Unitika) Example 8 was repeated except that the changes were made. It was confirmed that red coloring did not occur in all combinations in the same manner.
本発明によれば、高価な機器や顕微鏡を必要とすることなく、かつ、液体試料だけでなく、固体または固体を含む試料にも適用できる迅速かつ安価な微生物の検出方法および微生物検出用試薬が提供される。本発明では、例えば食品、化粧品、環境中の微生物汚染を迅速かつ安価に検出することができる。 According to the present invention, a rapid and inexpensive microorganism detection method and microorganism detection reagent that can be applied not only to a liquid sample but also to a solid or a solid-containing sample without the need for expensive equipment and a microscope. Provided. In the present invention, for example, microbial contamination in food, cosmetics, and the environment can be detected quickly and inexpensively.
Claims (11)
前記接触工程において、酵素的サイクリング反応により前記色素原の発色または蛍光シグナルを増感させることを特徴とする微生物の検出方法。 A step of culturing a specimen containing microorganisms for a predetermined time, a step of bringing the microorganism into contact with the chromogen after the culturing step, and a step of confirming the presence of the microorganism by the color development or fluorescence signal of the chromogen after the contacting step And
In the contacting step, a method for detecting a microorganism, which comprises sensitizing the color development or fluorescence signal of the chromogen by an enzymatic cycling reaction.
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