JP2005168323A

JP2005168323A - 培養処理装置および自動培養装置

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Publication number: JP2005168323A
Application number: JP2003408952A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Fukuda; 宏福田
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2003-12-08
Filing date: 2003-12-08
Publication date: 2005-06-30

Abstract

【課題】患者から採取された状態の体液を投入するだけで、効率よく培養を行う。
【解決手段】接着性の検体を収容した培養容器の蓋を開けて培養容器内部の検体に対して所定の処理を施す培養処理装置であって、培養容器への投入前に、培養処理装置３０に導入された赤血球を含む体液５０から検体を抽出する検体抽出装置５１と、抽出された検体を培養容器に供給する検体供給装置１０とを備え、前記検体抽出装置５１が、導入された体液５０を貯留する容器５２内に溶血剤５３を注入する溶血剤注入装置５４と、溶血剤５３が注入された体液５０を攪拌する体液攪拌装置１０と、攪拌された体液５０から検体を分離する遠心分離機１１とを備える培養処理装置３０を提供する。
【選択図】図５

Description

この発明は、培養処理装置および自動培養装置に関するものである。

従来の自動培養装置としては、複数の培養容器を収納可能な固定式の収納棚と、水平・昇降・回転移動可能な搬送手段とを備えたものが知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この自動培養装置は、培養室内に配置された収納棚に、鉛直方向に並ぶ複数の小部屋を備え、各小部屋の中に培養容器を１つずつ収容して培養を行い、培養途中あるいは培養終了時に搬送手段を作動させて、小部屋から１つずつ培養容器を取り出し、あるいは、小部屋へ培養容器を収容するよう構成されている。
特開２００２−２６２８５６号公報（図１等）

培養すべき細胞が間葉系幹細胞のような接着性の細胞である場合には、培養容器の底面に付着することにより効率的に成長するため、培養容器の底面への接着性を向上し、あるいは、付着を阻害する要因を除去する方策を施す必要がある。

しかしながら、従来の自動培養装置においては、そのような方策を施したものはなく、培養すべき細胞が既に抽出されているものとして、その培養を如何にして効率よく行うかが課題となっていた。

この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、患者から採取された状態の体液を投入するだけで、効率よく培養を行うことができる培養処理装置および自動培養装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、接着性の検体を収容した培養容器の蓋を開けて培養容器内部の検体に対して所定の処理を施す培養処理装置であって、培養容器への投入前に、培養処理装置に導入された赤血球を含む体液から検体を抽出する検体抽出装置と、抽出された検体を培養容器に供給する検体供給装置とを備え、前記検体抽出装置が、導入された体液を貯留する容器内に溶血剤を注入する溶血剤注入装置と、溶血剤が注入された体液を攪拌する体液攪拌装置と、攪拌された体液から検体を分離する遠心分離機とを備える培養処理装置を提供する。

この発明によれば、患者から採取した状態の赤血球を含む体液を培養処理装置に導入すると、検体抽出装置の作動により体液内から検体が抽出され、検体供給装置の作動により、抽出された検体が培養容器に供給される。具体的には、赤血球を含む体液は溶血剤注入装置の作動により注入された溶血剤と混合され、体液攪拌装置の作動により体液と溶血剤とが攪拌される。この攪拌の間に、溶血剤が体液内の赤血球を溶血処理することにより、赤血球が除去される。次いで、遠心分離器の作動により、所望の検体のみが分離される。

したがって、検体供給装置により培養容器内に供給される検体からは赤血球が除去されており、間葉系幹細胞等の接着性の細胞は赤血球に阻害されることなく培養容器に付着して、効率よく培養される状態とされることになる。すなわち、患者から採取された状態の体液を導入するだけで、検体を効率よく培養させることが可能となる。

上記発明においては、前記体液攪拌装置が、前記容器の蓋を開閉する蓋開閉装置と、蓋が閉じられた状態の容器を揺動させるシェーカとを備えることが好ましい。
この発明によれば、体液が貯留された容器内に溶血剤が注入された状態で、蓋開閉手段が作動させられ、容器が密閉される。この状態でシェーカが作動させられることにより、容器が揺動させられ、容器内の体液と溶血剤とが混合される。これにより、体液に含まれている赤血球が溶血処理されて除去される。

また、上記発明においては、前記液体攪拌装置が、前記容器内の体液を吸引および放出するピペッティング装置からなることとしてもよい。
ピペッティング装置の作動により容器内が吸引、放出されるので、容器内に貯留されている赤血球を含む体液と溶血剤とが吸引、放出の間に混合され、溶血処理が促進される。これにより、赤血球が除去されることになる。

また、上記発明においては、前記検体供給装置が、前記液体攪拌装置と共通のピペッティング装置により構成されていることが好ましい。
この発明によれば、液体攪拌装置を構成するピペッティング装置の作動により、体液と溶血剤とを攪拌して溶血処理を促進した後、遠心分離機の作動により所望の検体のみを分離し、検体供給装置を構成するピペッティング装置の作動により、分離された検体が培養容器に供給される。検体供給装置と液体攪拌装置とを共通化することにより、装置の構成を簡易化することができ、また、設置スペースを節約して装置自体をコンパクト化することができる。

また、上記培養処理装置を備える自動培養装置によれば、培養容器内に供給される検体から赤血球が除去されているので、検体は赤血球によって阻害されることなく培養容器の底面に付着することができ、迅速に成長を開始することができる。その結果、検体の培養を効率よく行うことが可能となる。

本発明によれば、患者から採取した状態の体液を導入するだけで、検体を効率よく培養することができるという効果を奏する。したがって、培養処理装置への導入前に前処理を行う必要がなく、医療現場や医療機関における不要な手間を省くことができるという利点がある。

この発明の一実施形態に係る培養処理装置および自動培養装置について、図１〜図１０を参照して説明する。
本実施形態に係る自動培養装置１は、図１に示されるように、外部から観察可能な透明な壁材により密閉され、シャッタ２を介して相互に連絡する第１空間Ｓ１と第２空間Ｓ２とを備えている。

第１空間Ｓ１の両側空間Ｓ１１，Ｓ１３には、培養容器３を収容する培養室４が２個ずつ計４個配置され、中央空間Ｓ１２には、培養容器３を移動するための搬送ロボット（搬送機構）５が備えられている。中央空間Ｓ１２の上部には、中央空間Ｓ１２内の空気を浄化するために清浄な下降空気流を送る空気清浄部６が設けられている。

４個の培養室４は、それぞれ中央空間Ｓ１２に向けて扉４ａを配置することにより、横に並んだ２個ずつが相互に扉４ａを対向させて、間隔をあけて配置されている。
前記各培養室４は、図２および図３に示されるように、一側面に開口部４ｂを有し、該開口部４ｂを開閉可能な扉４ａを備えている。開口部４ｂに向かって左右の側壁には、対応する高さ位置に複数のレール状のトレイ保持部材４ｃが設けられており、左右対となる各トレイ保持部材４ｃに掛け渡すようにして、トレイ７を上下方向に複数段収容できるようになっている。各培養室４内は、所定の培養条件、例えば、温度３７±０．５℃、湿度１００％およびＣＯ₂濃度５％等に維持されている。なお、トレイ保持部材４ｃはレール状に限定されず、トレイ７を出し入れ可能に支持することができれば任意の形態でよい。

各トレイ７には、複数個、例えば、１０個の培養容器３を並べて載置できるようになっている。各培養容器３は、図４に示されるように、容器本体３ａと、該容器本体３ａの上面に設けられた蓋体３ｂとからなり、容器本体３ａの左右の側面には、後述する第２空間内のハンドにより引っかけられる突起３ｃが設けられている。

各培養室４の下方には、図１に示されるように、未使用の培養容器３をトレイ７に搭載した状態で複数収容するストッカ８が配置されている。ストッカ８は、前記培養室４の扉とは反対側の第１空間Ｓ１の外部に向かう側面に開閉可能なドアを有している。該ドアは、ストッカ８の一側面全体を開放する大きさに形成されている。

前記搬送ロボット５は、４個の培養室４の間隔位置のほぼ中央に配置されている。該搬送ロボット５は、水平回転可能な第１アーム５ａと、該第１アーム５ａの先端に鉛直軸回りに回転可能に連結された第２アーム５ｂと、該第２アーム５ｂの先端に鉛直軸回りに回転可能に取り付けられ、それ自身は駆動部、伝導機構などの培養室内の環境を劣化させる機構を持たないハンド５ｃと、これら第１アーム５ａ、第２アーム５ｂおよびハンド５ｃを昇降可能な昇降機構５ｄとを備えている。これにより、搬送ロボット５は、４個の培養室４内の全てのトレイ７にアクセスするとともに、前記シャッタ２を跨いで第１空間Ｓ１と第２空間Ｓ２との間に配置されたコンベア９上にトレイ７を引き渡すことができる水平方向の動作範囲を有している。

前記コンベア９は、搬送ロボット５のハンド５ｃの幅寸法より大きな間隔をあけて左右に配置された２本の無端ベルト９ａを備え、これら無端ベルト９ａに掛け渡してトレイ７を載置できるようになっている。また、搬送ロボット５は、培養室４内の全てのトレイ７にアクセスするとともに、前記ストッカ８内の少なくとも最上段のトレイ７にアクセスできる垂直方向の動作範囲を有している。
なお、ベルト９ａは無端ベルトに限られない。

前記ハンド５ｃは、トレイ７を載置可能に水平方向に延びる平坦な形状に形成されており、培養室４に収容されているトレイ７間の隙間に挿入可能な厚さ寸法に形成されている。そして、ハンド５ｃは、トレイ７間の隙間に挿入された状態から上昇させられることにより、２本の腕によってトレイ７を下方から押し上げてトレイ保持部材４ｃから取り上げるとともに、トレイ７を安定して保持できるようになっている。

前記第２空間Ｓ２には、図１に示されるように、培養処理装置３０が構成されている。この培養処理装置３０は、図５に示されるように、例えば、医療機関等で患者から採取された骨髄液５０を導入され、供給された骨髄液５０から間葉系幹細胞を多く含む細胞を抽出する検体抽出装置５１を備えている。検体抽出装置５１は、導入された骨髄液５０を貯留する容器５２（例えば、そのまま遠心分離できるような遠沈管）内に溶血剤５３を注入する溶血剤注入装置５４と、溶血剤５３が注入された骨髄液５０を攪拌するピペッティング装置１０（体液攪拌装置）と、攪拌された骨髄液５０から間葉系幹細胞を多く含む細胞を分離する遠心分離機１１とを備えている。

溶血剤注入装置５４は、溶血剤５３、例えば、０．１７モル濃度の塩化アンモニウム溶液を貯留する溶血剤タンク５５と、該溶血剤タンク５５から必要量の溶血剤５３を放出させるバルブ５６とを備えている。前記ピペッティング装置１０は後述する給排ロボット１０によって構成されている。また、遠心分離機１１は、後述するように培地から細胞を分離するための遠心分離機１１と共通である。バルブ５６はポンプに置き換えてもよい。

培養処理装置３０は、図１に示されるように、シャッタ２が開かれた状態で第１空間Ｓ１からコンベア９によって搬送されてきたトレイ７上の培養容器３に対し、上記検体抽出装置５１において抽出された細胞を供給し、あるいは、培地を供給、回収する給排ロボット（体液攪拌装置、検体供給装置、ピペッティング装置）１０と、培養容器３内の培地から細胞を分離する遠心分離機１１と、血清や試薬等の種々の液体を分注するための電動ピペット１２を備えた水平回転および昇降移動可能な４台の分注ロボット１３と、これら給排ロボット１０および分注ロボット１３の電動ピペット１２先端に取り付ける使い捨て可能なチップ１４を複数収容していて給排ロボット１０および分注ロボット１３の動作範囲内に提供可能な３台のチップ供給装置１５と、使用済みのチップ１４を廃棄回収するチップ回収部３１と、血清や試薬等の種々の液体を複数の容器に貯留する試薬等供給装置１６と、培養容器３内における細胞の様子を観察可能な顕微鏡１７と、各試薬および培地交換等により廃棄される廃液をそれぞれ貯留する複数の貯留タンク１８と、前記コンベア９と各ロボット１０，１３との間で培養容器３を受け渡し可能とするように培養容器３を移動させる水平移動機構１９と、該水平移動機構１９のスライダ２０に取り付けられ、受け取った培養容器３を載置する載置台２１とを備えている。
なお、第２空間Ｓ２にも、該第２空間Ｓ２内の空気を浄化するために清浄な下降気流を形成する空気清浄機３２が設けられている。

前記第２空間Ｓ２に構成された培養処理装置３０は、その高さ方向の中間位置に配され第２空間Ｓ２内を上部空間Ｓ２１と下部空間Ｓ２２とに上下に区画する第１の区画壁３３と、該第１の区画壁３３により形成された下部空間Ｓ２２内をさらに上下に区画する第２の区隔壁３４とにより、上下方向に並ぶ３つの空間Ｓ２１，Ｓ２２１，Ｓ２２２に区画されている。第１の区画壁３３は、前記コンベア９の高さに配置され、その上方の上部空間Ｓ２１内に、載置台２１、給排ロボット１０、分注ロボット１３のアーム１３ａ、顕微鏡１７のＸＹテーブル１７ａ以上の機構部等を配置している。これらの装置は、培養容器３の移動に必要な装置、および培養容器３の上部開口からアクセスすることが必要な装置だからである。なお、試薬等供給装置１６の上面も第１の区画壁３３の上面に露出しているが、これはチップ１４の挿入口１６ｃを上部空間Ｓ２１に開口させるためである。

また、第１の区画壁３３には、載置台２１を上部空間Ｓ２１において移動させるために、載置台２１を下部空間Ｓ２１内の水平移動機構１９に連結するための長孔３５、第１の区画壁３３の下方の空間Ｓ２２１に配置されたチップ供給装置１５からチップ１４を取り出すための貫通孔３６、使用済みのチップ１４を廃棄するための廃棄口３７が貫通形成されている。さらに、第１の区画壁３３には、その側壁３０ａ，３０ｂに沿って、上下に貫通する通気口３８が設けられている（斜線部）。

第１の区画壁３３と第２の区画壁３４との間の空間Ｓ２２１には、図６に示されるように、分注ロボット１３の本体部分、チップ供給装置１５、試薬等供給装置１６、顕微鏡１７のＸＹテーブル１７ａ以下の部分、水平移動機構１９および、チップ回収部３１の廃棄口３７と廃棄容器３９とを接続するダクト４０が備えられている。前記ダクト４０は、図７に示されるように、例えば、その上端にフランジ部４０ａを備える構造とされ、第１の区画壁３３の下部に設けたフック４４に引っかけることで、第１の区画壁３３と第２の区画壁３４との間に着脱可能に設ければよい。第２の区画壁３４の側壁３０ａ，３０ｂ近傍には、該側壁３０ａ，３０ｂに沿って、上下に貫通する通気口４３が設けられている（斜線部）。

さらに、第２の区画壁３４の下方の空間Ｓ２２２には、図８に示されるように、遠心分離機１１、貯留タンク１８、廃棄容器３９、および排気ファン４１が配置されている。排気ファン４１の出口にはＨＥＰＡフィルタのようなフィルタ４２が設けられ、排気される空気を清浄にするようになっている。

前記給排ロボット１０は、水平多関節型ロボットであって、例えば、図１に示す例では、２種類の電動ピペット１０ａ，１０ｂを備えるヘッド１０ｃと、水平旋回可能な２つのアーム１０ｄ，１０ｅと、アーム１０ｅの先端に設けられヘッド１０ｃを昇降させる昇降機構１０ｆとを備えている。電動ピペット１０ａは、貯留タンク１８からダクト１０ｇを介して導かれた培地を供給し、あるいはピペッティング動作を行うようになっている。電動ピペット１０ｂは、培養容器３内あるいは遠心容器内の不要な培地を吸引し、ダクト１０ｇを介して他の貯留タンク１８へ廃液として排出するようになっている。

電動ピペット１０ａによるピペッティング動作は、前記溶血剤注入装置５４により溶血剤５３を注入された骨髄液５０に対して行われるとともに、遠心分離機１１により分離された細胞に対しても行われるようになっている。ピペッティング動作は、電動ピペット１０ａの先端にチップ供給装置１５から供給されたチップ１４を装着して、容器５２内に挿入され、容器５２内に貯留されている骨髄液５０と溶血剤５３との混合液、あるいは細胞と培地との混合液に対し、吸引および放出を１０回〜２０回繰り返す。これにより、混合液を均一に攪拌するようになっている。

また、給排ロボット１０は、ピペッティング動作の後に、電動ピペット１０ａによって、遠心分離機１１により分離された細胞と培地との混合液を吸引し、載置台２１上に搭載された培養容器３内に上部開口から供給するようになっている。

一旦使用された使用済みのチップ１４は、チップ回収部３１において取り外され回収されるようになっている。したがって、給排ロボット１０は、溶血剤注入装置５４、載置台２１、チップ供給装置１５、チップ回収部３１および遠心分離機１１からの細胞供給装置（図示略）等の種々の装置をその動作範囲内に配置している。

前記遠心分離機１１は、ピペッティングにより混合された骨髄液５０と溶血剤５３との混合液を貯留した容器５２を受け取って低速回転させることにより、骨髄液５０内に含有されている間葉系幹細胞等の白血球をその他の体液から分離して沈下させるようになっている。また、遠心分離機１１は、給排ロボット１０から供給された細胞入り培地を低速回転させることにより培地内に浮遊していた比重の重い細胞を培地から分離して沈下させるようになっている。

前記分注ロボット１３は、それぞれ、先端にチップ１４を着脱可能に取り付ける電動ピペット１２を備えた水平回転可能なアーム１３ａと、該アーム１３ａを昇降させる昇降機構１３ｂとを備えている。分注ロボット１３は、水平移動機構１９によって搬送されて来た培養容器３内へ、培地や種々の試薬を供給するようになっている。したがって、分注ロボット１３は、水平移動機構１９上の載置台２１、チップ供給装置１５、チップ回収部３１および試薬等供給装置１６等の種々の装置をその動作範囲内に配置している。

前記チップ供給装置１５は、上方に開口した容器１５ａ内に、電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２への取付口を上向きにして複数のチップ１４を配列状態に収容しており、給排ロボット１０や分注ロボット１３が、新たなチップ１４を必要とするときに、電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２を上方から挿入するだけで、電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２の先端にチップ１４を取り付けるように構成されている。容器１５ａは、給排ロボット１０や分注ロボット１３による電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２の移動方向に対して交差する方向に往復移動させられるように移動機構１５ｂに取り付けられている。また、分注ロボット１３にチップ１４を供給するチップ供給装置１５には、移動機構１５ｂによる移動方向とは直交する方向に容器１５ａを移動させる他の移動機構１５ｃが備えられている。これにより、容器１５ａ内の全てのチップ１４に対して電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２がアクセスすることができるようになっている。

前記チップ回収部３１は、廃棄容器３９の入口に、チップ１４を把持する把持装置（図示略）を備えていて、給排ロボット１０や分注ロボット１３において使用されたチップ１４が把持装置に挿入されると、これを把持するようになっている。そして、この状態で給排ロボット１０や分注ロボット１３が電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２を移動させることにより、電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２先端から使用済みチップ１４が取り外され、廃棄容器３９内にダクト４０を介して回収されるようになっている。廃棄容器３９は、空間Ｓ２２２内に着脱可能に配置されており、必要に応じて交換可能となっている。

前記ダクト４０および廃棄容器３９の交換時には、培養処理装置３０の側壁３０ａ，３０ｂに設けられた図示しないドアを開くことにより、培養処理装置３０の外部からアクセスすることとすればよい。

前記試薬等供給装置１６は、例えば、図６に示されるように、円筒状のケーシング内部に、水平回転可能なテーブル１６ａを収容し、該テーブル１６ａ上に、扇型の底面形状を有する筒状の試薬等容器１６ｂを周方向に複数配列して搭載している。ケーシング内部は一定の温度に保冷されている。各試薬等容器１６ｂには、種々の試薬等が貯留されている。例えば、細胞を培養するために必要な培地を構成するＭＥＭ(Minimal Essential Medium：最小必須培地)、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）やヒト血清のような血清、培養容器３内の細胞を剥離させるトリプシンのような蛋白質分解酵素や、培養に際して細胞を成長させるサイトカインのような成長因子、細胞を分化させるデキサメタゾンのような分化誘導因子、ペニシリン系抗生物質のような抗生剤、エストロゲン等のホルモン剤や、ビタミン等の栄養剤が貯留されている。

試薬等供給装置１６のケーシングの上面には、分注ロボット１３が電動ピペット１２先端のチップ１４を挿入する挿入口１６ｃが設けられている。この挿入口１６ｃは、前記分注ロボット１３の動作範囲内に配置されている。また、各試薬等容器１６ｂは、その上面に、前記挿入口１６ｃに一致する位置に配置される開口部（図示略）を備えている。これにより、テーブル１６ａを回転させて試薬等容器１６ｂの開口部をケーシングの挿入口１６ｃの鉛直下方に配置することで、分注ロボット１３が、電動ピペット１２先端のチップ１４を上方から試薬等容器１６ｂ内へ挿入して、内部に貯留されている試薬等を吸引することができるようになっている。試薬等供給装置１６を２台設けているのは、検体に共通のトリプシンのような薬液と、検体に固有の血清のような液体とを分離して取り扱うようにしているためである。

前記顕微鏡１７は、培養工程の途中、あるいは、培地交換の際に、培養容器３内の細胞の様子や増殖の程度を観察したり、細胞数を計数したりする場合等に使用されるようになっている。顕微鏡１７のＸＹステージ１７ａや作動距離調整、倍率の変更等は全て遠隔操作により行うことができるように構成されている。第２空間Ｓ２の外方に向けて接眼レンズを配置しておくことにより、自動培養装置１の外部から培養容器３内の細胞の状態を観察できるようにしてもよい。

前記貯留タンク１８は、例えば、全ての検体に共通して使用できるＭＥＭやＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）等を貯留しておき、必要に応じて試薬等供給装置１６内の試薬等容器１６ｂ内に供給するようになっている。また、貯留タンク１８には、廃液タンクとして、培地交換の際に排出される廃培地等を貯留するものもある。

前記水平移動機構１９は、直線移動機構により水平方向に移動可能なスライダ２０を備えている。スライダ２０上には前記載置台２１が搭載されており、載置台２１に搭載された培養容器３を、コンベア９から分注ロボット１３の動作範囲まで移動させることができるようになっている。

前記載置台２１は、コンベア９上のトレイ７内から移載された培養容器３を搭載して保持する保持機構（図示略）を備えている。また、該培養容器３に振動を付与する加振装置（図示略）を備えていてもよい。加振装置は、例えば、培養容器３を所定の角度範囲で往復揺動させる装置の他、超音波振動を加える装置や、水平方向の振動を加える装置を採用してもよい。

本実施形態に係る自動培養装置１の各種装置には、図示しない制御装置が接続されている。制御装置は、各工程の順序や動作タイミング等を制御するとともに、動作履歴等を記録保存するようになっている。

このように構成された本実施形態に係る培養処理装置３０および自動培養装置１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る自動培養装置１を用いて、間葉系幹細胞を培養するには、まず、患者から採取された骨髄液５０を容器５２に入れた状態で培養処理装置３０内に導入し、検体抽出装置５１に供給する。この工程は作業者が行ってもよく、図５に示されるハンドリングロボット５７により行ってもよい。

検体抽出装置５１においては、図９に示される検体抽出工程が行われる。すなわち、図９（ａ）のように検体抽出装置５１に導入された骨髄液５０に対して、図９（ｂ）に示されるように、溶血剤注入装置５４の作動により、骨髄液５０が貯留されている容器５２内に溶血剤５３が注入される。溶血剤５３の注入量は、例えば、骨髄液５０を１ｍｌに対して１２ｍｌ程度でよい。次いで、図９（ｃ）に示されるように、給排ロボット１０の電動ピペット１０ｂに取り付けたチップ１４の先端が、骨髄液５０と溶血剤５３とが混合された容器５２内に挿入され、電動ピペット１０ｂの作動により、容器５２内の混合液が繰り返し吸引、放出される。これにより、骨髄液５０と溶血剤５３とが均一に混合されるので、この状態で、図９（ｄ）に示されるように、例えば、３〜７ｍｉｎ程度放置することにより溶血処理を行う。
溶血処理により、比重の大きな赤血球の細胞膜が破壊され、容器５２内の赤血球が除去されることになる。

その後、ハンドリングロボット５７の作動により、容器５２が遠心分離機１１に投入される。そして、遠心分離機１１が、例えば、８００〜１３００Ｇで３〜５ｍｉｎ間作動させられることにより、図１０（ａ）に示されるように、骨髄液５０内の比重の重い間葉系幹細胞を含む細胞５８が沈降した状態に集められる。

この状態で、再度ハンドリングロボット５７の作動により、容器５２が遠心分離機１１外に取り出される。そして、給排ロボット１０およびチップ供給装置１５の作動により、電動ピペット１０ｂ先端に未使用のチップ１４が取り付けられる。

すなわち、チップ供給装置１５は移動機構１５ｂを作動させることにより、未使用のチップ１４を給排ロボット１０の動作範囲内に配する。すると、給排ロボット１０は、昇降機構１０ｆを作動させることにより、ヘッド１０ｃを下降させて、第１の区画壁３３下方のチップ供給装置１５から未使用のチップ１４を受け取り、電動ピペット１０ｂの先端に取り付ける。

この状態で、図１０（ｂ）に示されるように、給排ロボット１０を作動させて電動ピペット１０ｂのチップ１４の先端を容器５２内に挿入して吸引する。これにより、図１０（ｃ）に示されるように、容器５２内の上澄み液５９が除去され、赤血球を含まない間葉系幹細胞を多く含む細胞５８が容器５２内に残される。

次に、容器５２内に残った検体は、給排ロボット１０により、培養容器３に投入される。投入に先立って、コンベア９の作動により、トレイ７に載せた１０個の空の培養容器３が、第１空間Ｓ１から第２空間Ｓ２に差し出されている。トレイ７上の培養容器３の内の２個の培養容器３が、図示しない移載装置の作動により、載置台２１上に載置される。そして、図示しない蓋体開閉装置の作動により、載置台２１上の培養容器３の蓋体３ｂが開けられる。

この状態で、給排ロボット１０を作動させて、図１０（ｄ）に示されるように、電動ピペット１０ａから容器５２内に、貯留タンク１８に貯留されているＤＭＥＭやＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）等の培地構成液６０を、所定量供給する。電動ピペット１０ａ先端のチップ１４を容器５２内に挿入した状態に保持したまま、電動ピペット１０ａを作動させることにより、ピペッティングを行う。これにより、赤血球を含まず、間葉系幹細胞を多く含む細胞５８と培地構成液６０とが均一に混合された細胞懸濁液６１が構成されることになる。

このようにして製造された細胞懸濁液６１は、電動ピペット１０ａを作動させることにより、チップ１４内に吸引される。吸引された細胞懸濁液６１は、チップ１４内に保持された状態で、給排ロボット１０を作動させることにより、載置台２１上の培養容器３内に上部開口から投入される。

この場合において、本実施形態に係る培養処理装置３０および自動培養装置１によれば、検体抽出装置５１によって骨髄液５０内から赤血球が除去された状態の検体が抽出される。したがって、細胞懸濁液６１内に浮遊している間葉系幹細胞は、静置されて沈降させられる際に、その沈降を赤血球に阻害されることがなく、培養容器３の底面に容易に付着して成長を開始することになる。すなわち、迅速かつ効率的に増殖させられるので、早期に必要な細胞数に達することができる。

本実施形態においては、骨髄液の入った容器に溶血剤を加えることとしたが、投入した骨髄液を予め溶血剤入りの容器に分注し、その後ピペッティングにより両液を混合する処理を行ってもよいことは言うまでもない。

細胞懸濁液６１を培養容器３内に投入し終わると、給排ロボット１０は、第１の区画壁３３に形成された廃棄口３７にチップ１４を挿入して取り外し、チップ回収部３１に回収させる。廃棄口３７において取り外されたチップ１４は、ダクト４０を介して、最下位の空間Ｓ２２２に配置されている廃棄容器内に投入される。

次に、細胞懸濁液６１が投入された培養容器３は、水平移動機構１９を作動させることにより、載置台２１ごと水平移動させられ、各分注ロボット１３の動作範囲内に配置される。分注ロボット１３は、チップ供給装置１５から受け取った未使用のチップ１４を先端に取り付けた電動ピペット１２を作動させることにより、試薬等供給装置１６の試薬等容器１６ｂ内からＤＭＥＭや血清、あるいは各種試薬を適量吸引した後に、培養容器３の上方まで搬送して培養容器３内に注入する。血清や各試薬の吸引は、各試薬等の吸引ごとにチップ供給装置１５から未使用のチップ１４に交換して行われる。これにより、培養容器３内においては、適正な培地内に間葉系幹細胞が混合された状態で存在することになる。なお、培地内において間葉系幹細胞を均一に分布させるために、載置台２１を作動させて、培養容器３ごと加振することにしてもよい。

そして、全ての処理を終えた培養容器３は水平移動機構１９の作動により、コンベア９の近傍まで移動させられ、そこで、再度、蓋体開閉装置および移載装置の作動により、蓋体３ｂにより上部開口を閉じられた状態で、トレイ７に戻される。

トレイ７上の全ての培養容器３に対して所定の処理が行われた後に、コンベア９を作動させることにより、トレイ７に載せられた培養容器３が第２空間Ｓ２から第１空間Ｓ１の中央空間Ｓ１２内に挿入される。

この状態で、搬送ロボット５を作動させることにより、ハンド５ｃによってトレイ７を持ち上げる。そして、トレイ７を収容する培養室４の前まで搬送したところで、当該培養室４の扉４ａを開き、搬送ロボット５によって、空いているトレイ保持部材４ｃ上にトレイ７を挿入する。そして、再度、扉４ａを閉じることにより、培養室４内の培養条件を一定に保持して細胞の培養が行われることになる。なお、細胞懸濁液６１の投入や、ＤＭＥＭ、血清、各種試薬の投入や吸引の順序は適宜変更してもよいのは言うまでもない。

また、培地交換や容器交換の際にも、上記と同様にして、培養室４外に配置されている搬送ロボット５の作動により、培養室４内の培養容器３がトレイ７ごと取り出され、第１空間Ｓ１から第２空間Ｓ２へ受け渡される。第２空間Ｓ２では、培養容器３内にトリプシンが注入されて、培養容器３内の細胞が剥離させられた状態で、給排ロボット１０の作動によって遠心分離機１１内に投入され、間葉系幹細胞等の必要なもののみが集められる。その他の処理工程は上記と同様である。

そして、複数回の培地交換や容器交換を介した所定期間にわたる培養工程を行うことにより、間葉系幹細胞が十分な細胞数まで増殖させられることになる。十分な細胞数に達したか否かは、給排ロボット１０の作動により、間葉系幹細胞が底面に付着した培養容器３を顕微鏡１７まで搬送することにより、観察あるいは測定され、細胞の増殖の程度が判断される。なお、トレイ７上には、同一検体の培養容器３が載置されていてもよいし、異なる検体の培養容器３が混在していてもよい。また、載置台２１上には同一検体の培養容器３が載置されてもよいし、異なる検体の培養容器３が混在していてもよい。

このようにして、本実施形態に係る自動培養装置１により、患者から採取した骨髄液５０から十分な細胞数の間葉系幹細胞を自動的に培養することが可能となる。なお、十分な間葉系幹細胞が得られた後には、培養容器３内にリン酸カルシウムのような生体組織補填材およびデキサメタゾンのような分化誘導因子を投入して、再度培養工程を継続することにより、生体の欠損部に補填可能な、生体組織補填体を製造することにしてもよい。

この場合において、本実施形態に係る自動培養装置１によれば、培養室４内に、培養容器３を取り出すための機構部が存在しない。すなわち、培養室４内には、トレイ７を載置した状態に支持するトレイ保持部材４ｃが設けられているのみであり、培養容器３を取り出すための機構部は全て培養室４外に配置された搬送ロボット５に集約されている。そして、搬送ロボット５は、トレイ７の出し入れ作業が行われた後には、培養室４の扉４ａの外側に完全に退避することができるようになっている。

したがって、扉４ａが閉じられた状態では、培養室４内に機構部が存在せず、機構部の作動によって発生するような塵埃の発生は全く存在しない。また、培養室４内は、温度３７±０．５℃、湿度１００％およびＣＯ₂濃度５％等に維持されるが、機構部が存在しないために、このような環境下においても、腐食等の問題が生ずることがない。また、扉４ａが開かれた状態においても、培養室４内に挿入されるのは搬送ロボット５のハンド５ｃ先端のみであり、実質的に回転機構や摺動機構が培養室４内に入ることはない。その結果、培養室４内への塵埃の侵入が抑制され、培養室４内部の清浄度を高めることができる。

なお、培養室４は、ＣＯ₂インキュベータ、マルチガスインキュベータ、インキュベータ、または保冷庫等のように、培養に利用されるものあるいはその組合せで構成されていてもよい。

また、本実施形態に係る培養処理装置３０および自動培養装置１によれば、医療機関等において患者から採取された状態の骨髄液５０に何ら前処理を施すことなく培養処理装置３０に導入するだけで、早期に間葉系幹細胞を必要細胞数まで増殖させることができる。したがって、医療機関や作業者に特別な設備や作業を発生させることがないという利点がある。

特に、細胞懸濁液６１を製造するためのピペッティング作業と、溶血処理を行うためのピペッティング作業とを同一の給排ロボット１０に行わせることができるので、設置スペースを増大させることなくコンパクトに構成することができる。

さらに、本実施形態に係る培養処理装置３０および自動培養装置１によれば、培養処理装置３０の第２空間Ｓ２内が、第１の区画壁３３により上部空間Ｓ２１と下部空間Ｓ２２とに区画されている。さらに、上部空間Ｓ２１には清浄な下降気流を発生させる空気清浄機３２が設けられている。そして、第１の区画壁３３には、その側壁３０ａ，３０ｂ近傍に通気口３８が設けられている。第１の区画壁３３には、通気口３８の他に種々の装置を貫通させるための貫通孔３６，３７等が形成されているが、通気口３８の流通断面積を他の貫通孔３６，３７等の流通断面積より十分に大きく確保しておくことにより、気流を通気口３８に通過させることが可能となる。

したがって、上部空間Ｓ２１内を下降してきた清浄な気流は、第１の区画壁３３の近くで側壁３０ａ，３０ｂの方向に向かい、通気口３８を介して下部空間Ｓ２２へと流通させられる。その結果、上部空間Ｓ２１内に浮遊していた塵埃を下方に向かって押し流してきた気流が、上部空間Ｓ２１の側壁３０ａ，３０ｂ近傍の角部に滞留することがなく、スムーズに下部空間Ｓ２２へ流通させられることになる。

さらに、本実施形態に係る培養処理装置３０および自動培養装置１によれば、蓋体３ｂを開かれた状態の培養容器３が移動させられる上部空間Ｓ２１には、培養容器３の移動に必要な載置台２１、顕微鏡１７のＸＹテーブル１７ａ、培養容器３の上部開口からアクセスすることが必要な給排ロボット１０、分注ロボット１３の電動ピペット１２、顕微鏡１７の光源部分等のみが配置され、その他の機構部は下部空間Ｓ２２に配置されている。したがって、上部空間Ｓ２１における塵埃の発生が最小限に抑えられ、培養容器３内への塵埃の混入の可能性が低減されることになる。

また、特に、塵埃を発生する可能性の高い装置、例えば、遠心分離機１１、廃棄容器３９、排気ファン４１等は、下部空間Ｓ２２の内、さらに第２の区画壁３４によって区画された最下位の空間Ｓ２２２内に配置されているので、そこで発生した塵埃が上部空間Ｓ２１に流入することはない。さらに、空間Ｓ２２２内の空気は排気ファン４１によって吸引され、ＨＥＰＡフィルタ４２によって塵埃を除去された後に培養処理装置３０の外部に放出される。したがって、上部空間Ｓ２１の清浄度は、極めて高い清浄度に維持されることになる。

また、第２の区画壁３４にも、側壁３０ａ，３０ｂに沿って通気口４３が設けられているので、上部空間Ｓ２１から流入した塵埃を含む気流が、空間Ｓ２２１内に広がることなく、スムーズに空間Ｓ２２２に向けて流通させられることになる。

さらに、培地や細胞が付着した使用済みのチップ１４を収容した廃棄容器３９は、着脱可能であり、必要によりまたは定期的に交換することで、下部空間Ｓ２２の清浄度をも高い状態に回復することができる。さらに、廃棄容器３９への廃棄の際に使用済みのチップ１４を通過させるダクト４０も、必要によりまたは定期的に取り外して、交換あるいは清掃することで、清浄度の向上に寄与することができる。

さらに、本実施形態に係る自動培養装置１は、搬送ロボット５の設置されている中央空間Ｓ１２の上部に、空気清浄部６を備えているので、搬送ロボット５の存在する中央空間Ｓ１２内も常に清浄度が維持されている。したがって、培養室４の扉４ａが開かれたときにも、培養室４内に塵埃が流入することを最小限に抑えることが可能となる。

したがって、本実施形態に係る自動培養装置１によれば、培養中の細胞が塵埃等によって汚染される可能性を低減し、健全な細胞を培養することができるという効果がある。

なお、この発明は、上記実施形態に示した構成に限定されるものではない。すなわち、培養室４の形状や数、搬送ロボット５、給排ロボット１０および分注ロボット１３の形態や数、各種装置の形態や数等は、何ら限定されることなく、適用条件に合わせて任意に設定することができる。

また、細胞懸濁液６１製造のためのピペッティングと、溶血処理のためのピペッティングとを共通の給排ロボット１０によって行うこととしたが、別個のロボットによって行うことにしてもよい。また、溶血処理のための骨髄液５０と溶血剤５３との混合をピペッティングにより行うこととしたが、これに代えて、図１１に示されるように、シェーカ６２により行うこととしてもよい。この場合、容器５２の蓋６３を開閉する蓋開閉装置（図示略）を設けることが必要である。

また、成長因子としては、サイトカインの他に、例えば、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を採用することにしてもよい。また、抗生剤としては、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。

また、本発明に係る自動培養装置は、骨髄の間葉系幹細胞の培養に限定されるものではない。生体の種々の組織から採取された細胞や、樹立された細胞ラインを培養してもよい。
また、生体組織補填材としては、リン酸カルシウムに代えて、生体組織に親和性のある材料であれば任意のものでよく、生体吸収性の材料であればさらに好ましい。特に、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組合せを用いてもよい。また、チタンの様な金属であってもよい。また、生体組織補填材は、顆粒状でもブロック状でもよい。

この発明の一実施形態に係る自動培養装置を示す斜視図である。図１の自動培養装置の第１空間を概略的に示す縦断面図である。図１の自動培養装置の第１空間を概略的に示す平面図である。図１の自動培養装置において用いられる培養容器の一例を示す斜視図である。図１の自動培養装置の検体抽出装置を模式的に説明する正面図である。図１の自動培養装置の培養処理装置の第１の区画壁を除去して第２の区画壁上の装置を示す斜視図である。図１の自動培養装置の培養処理装置の第１および第２の区画壁を除去して最下位の空間内に設置された装置を示す斜視図である。図１の自動培養装置の培養処理装置の廃棄容器に接続するダクトの取付構造例を示す縦断面図である。図５の検体抽出装置による検体抽出工程の一部（前半）を説明する図である。図９の検体抽出工程の一部（後半）を説明する図である。図５の検体抽出装置を構成する体液攪拌装置の変形例を示す図である。

符号の説明

１自動培養装置
３培養容器
３ｂ蓋体（蓋）
１０給排ロボット（検体供給装置、体液攪拌装置、ピペッティング装置）
１１遠心分離機
３０培養処理装置
５０骨髄液（体液）
５１検体抽出装置
５２容器
５３溶血剤
５４溶血剤注入装置

Claims

接着性の検体を収容した培養容器の蓋を開けて培養容器内部の検体に対して所定の処理を施す培養処理装置であって、
培養容器への投入前に、培養処理装置に導入された赤血球を含む体液から検体を抽出する検体抽出装置と、抽出された検体を培養容器に供給する検体供給装置とを備え、
前記検体抽出装置が、導入された体液を貯留する容器内に溶血剤を注入する溶血剤注入装置と、溶血剤が注入された体液を攪拌する体液攪拌装置と、攪拌された体液から検体を分離する遠心分離機とを備える培養処理装置。
前記体液攪拌装置が、前記容器の蓋を開閉する蓋開閉装置と、蓋が閉じられた状態の容器を揺動させるシェーカとを備える請求項１に記載の培養処理装置。
前記液体攪拌装置が、前記容器内を吸引および放出するピペッティング装置からなる請求項１に記載の培養処理装置。
前記検体供給装置が、前記液体攪拌装置と共通のピペッティング装置により構成されている請求項３に記載の培養処理装置。
請求項１から請求項４に記載の培養処理装置を備える自動培養装置。