JP2005160430A - Method for inspection of gene sequence - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、核酸試料中に含まれる特定の塩基配列の検査方法および試薬に関するものであり、とりわけ１塩基置換（ＳＮＰ）及びプロモーター領域に見られる特定塩基の繰り返し配列の検査方法及び検査試薬に関するものである。 The present invention relates to a test method and a reagent for a specific base sequence contained in a nucleic acid sample, and more particularly to a test method and a test reagent for a specific base sequence (SNP) and a repetitive sequence of a specific base found in a promoter region. It is.
遺伝子変異には、数塩基の繰り返し配列の反復数の増減によるマイクロサテライトの変異、数塩基の挿入や欠失による変異、ＳＮＰ等があることはよく知られている。ＳＮＰは遺伝子のうち、特に蛋白質翻訳領域に高頻度に見つかるため疾患との関連など臨床的意義が大きい。未知のＳＮＰを探索するには、直接塩基配列をシーケンスする方法が主に行われている。一方既知のＳＮＰを検査する方法は、種々の方法が提唱されている（例えば、非特許文献1等）。 It is well known that gene mutations include microsatellite mutations due to increase / decrease in the number of repeats of several base repeats, mutations due to insertion or deletion of several bases, SNPs, and the like. Since SNPs are found frequently in genes, particularly in the protein translation region, they have great clinical significance such as association with diseases. In order to search for an unknown SNP, a method of directly sequencing a base sequence is mainly performed. On the other hand, various methods for inspecting known SNPs have been proposed (for example, Non-Patent Document 1).
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法(特許文献1及び２)は遺伝子増幅法を利用した変異の検出方法としてよく知られている。この方法では、プライマーの末端塩基がＳＮＰの塩基になるように設計された正常型プライマーと変異型プライマーを用意し、検体と２つのプライマーをそれぞれ別々にＰＣＲし、どちらが増幅するかにより判定する。しかし、この方法では非特異が多く出現するなどの問題があった。 The polymerase chain reaction (PCR) method (Patent Documents 1 and 2) is well known as a mutation detection method using a gene amplification method. In this method, a normal primer and a mutated primer designed so that the terminal base of the primer becomes a SNP base are prepared, PCR is performed separately on the specimen and the two primers, and the determination is made based on which one is amplified. However, this method has a problem that many non-singularities appear.
ＰＣＲ増幅産物に制限酵素を作用させ、ＳＮＰのタイプにより、増幅産物が切断さ
れるか否かを電気泳動によって確認、判定する方法では、検体の増幅後、増幅反応に
使用したＤＮＡポリメラーゼ(酵素)や未反応のプライマーは制限酵素との正常な反応を妨げる虞があるため、これらを除去する必要があり、さらに制限酵素は、既存の酵素から調べたい遺伝子配列の認識に最適なものを選択するが、現在の技術では全ての遺伝子配列と整合する酵素を設計することは困難で、例えばいずれの制限酵素でも検体が切断されない等の問題がかなりの確率で発生することが知られている。
In a method in which a restriction enzyme is allowed to act on a PCR amplification product and whether or not the amplification product is cleaved according to the type of SNP is confirmed by electrophoresis, the DNA polymerase (enzyme) used for the amplification reaction after amplification of the specimen Because unreacted primers and unreacted primers may interfere with normal reactions with restriction enzymes, these need to be removed. In addition, the restriction enzyme should be selected from the existing enzymes that are optimal for recognizing the gene sequence to be examined. However, it is difficult to design an enzyme that matches all gene sequences with the current technology, and it is known that problems such as a sample not being cleaved by any restriction enzyme occur with a considerable probability.
検体をＰＣＲで増幅しながら、正常型と変異型の２種類のＳＮＰを含むプライマーと別々にプローブ反応させ、どちらのタイプのプローブが反応するかで判定するタックマン法や、ＰＣＲ反応を用いずにＳＮＰを検出する方法で、検体に対しミスマッチ部分(フラップ配列)とＳＮＰ配列を含むシグナルプローブとＳＮＰ部分がオーバーラ
ップするインベーダーオリゴを結合させた後、クリーベイスと呼ばれる特別な酵素を作用させ、シグナルプローブのＳＮＰ塩基が検体配列と同じ時だけ、この酵素でフラップ配列が切断され、切断されたフラップ配列は、シグナルを生成するＦＲＥＴプローブにインベーダーオリゴとなって作用し、発生する蛍光シグナルを検出するインベーダー法等も知られている。
While amplifying the sample by PCR, probe reaction is performed separately with primers containing two types of normal and mutant SNPs, and the Taqman method for determining which type of probe will react, or without using a PCR reaction In the method of detecting SNP, a signal probe containing a mismatched part (flap sequence) and SNP sequence and an invader oligo that overlaps the SNP part are bound to a specimen, and then a special enzyme called cleaves is allowed to act on the signal probe. Only when the SNP base is the same as the sample sequence, the flap sequence is cleaved by this enzyme. The cleaved flap sequence acts as an invader oligo on the FRET probe that generates a signal, and detects the generated fluorescent signal. Laws are also known.
特許文献３には変異部位に相補的な標識連鎖終止ヌクレオチドを取り込ませること
により、その標識連鎖終止ヌクレオチドの有無を検出する技術が開示されている。こ
の方法は、検体をＰＣＲ等で増幅後、検出する塩基の一つ手前の塩基に結合するように設計されたプライマーを用い、ポリメラーゼによる伸長反応により検出部位に標識連鎖終止ヌクレオチドが取り込まれるか否かを検出する方法である。この方法は汎用されている装置で測定できるといった利点はあるが、１塩基のみの変異を識別することから前述のＰＣＲ法と同様に特異性に劣るといった欠点があった。さらに、伸長反応の前処理として、検体のＰＣＲで用いた基質を完全にアルカリホスファターゼ等により除去しなければならないといった問題もあった。
Patent Document 3 discloses a technique for detecting the presence or absence of a labeled chain termination nucleotide by incorporating a complementary labeled chain termination nucleotide into a mutation site. In this method, after a sample is amplified by PCR or the like, a primer designed to bind to the base immediately before the base to be detected is used, and whether or not the labeled chain termination nucleotide is incorporated into the detection site by an extension reaction with a polymerase. This is a method for detecting the above. This method has an advantage that it can be measured by a widely used apparatus, but has a disadvantage that it is inferior in specificity like the PCR method described above because it identifies a mutation of only one base. Furthermore, as a pretreatment for the extension reaction, there has been a problem that the substrate used in the PCR of the specimen must be completely removed by alkaline phosphatase or the like.
特許文献４には、化学発光によりプライマー伸長反応の有無を検出することによる
遺伝子変異検査の技術が開示されている。この方法は、変異検出用プライマーの３´末端近傍に人工ミスマッチを入れることにより特異性を高めており、しかもホモジニアスな検出方法であるが、検体をＰＣＲにより増幅させると同時にプライマーの伸長反応を化学発光により検出することは、ルシフェラーゼやルシフェリンが熱に不安定であるため困難である。ＰＣＲ増幅後、ポリメラーゼ反応により生成するピロリン酸
を発光により測定するには、ＰＣＲ増幅で生成した内因性のピロリン酸を予めアルカリホスファターゼで分解しておく必要があるなどの前処理や、複数の酵素が必要となる。さらに発光測定の専用装置が必要である。
Patent Document 4 discloses a technique for examining a gene mutation by detecting the presence or absence of a primer extension reaction by chemiluminescence. This method increases the specificity by introducing an artificial mismatch near the 3 'end of the mutation detection primer, and is a homogeneous detection method. However, the sample is amplified by PCR and the primer extension reaction is chemically performed. Detection by luminescence is difficult because luciferase and luciferin are unstable to heat. After PCR amplification, in order to measure pyrophosphate generated by polymerase reaction by luminescence, it is necessary to decompose endogenous pyrophosphate generated by PCR amplification in advance with alkaline phosphatase, etc. Is required. Furthermore, a dedicated device for luminescence measurement is required.
特許文献５によれば、プライマーの３´末端から２番目のヌクレオチドを検査部位
に対応させ、さらにその１塩基上流部位に人エミスマッチを挿入したプライマーを用
いるプライマー伸長法が開示されている。この方法は特別な酵素や機器を必要とせず、
汎用性があり優れた方法であるが、プライマーの３´末端が被検核酸と相補的であるため、検出部位に変異がある場合でも、用いるポリメラーゼの種類によってはプライマー仲長反応が起きる虞があった。さらに、この方法ではゲノム遺伝子のプロモーター領域のＴＡリピートのような特定塩基配列の繰り返し配列における欠失や挿入を検査しようとした場合に、プライマーの３´末端が必ずしも被検核酸の塩基と相補ならない場合が起こり、この発明の本質である３´ヌクレアーゼ活性に対する耐性効果が得られないといった問題があり、この方法はＳＮＰの検査に限られる。
Although it is a versatile and excellent method, since the 3 'end of the primer is complementary to the test nucleic acid, even if there is a mutation in the detection site, there is a possibility that a primer neutralization reaction may occur depending on the type of polymerase used. there were. Furthermore, in this method, when attempting to examine a deletion or insertion in a repetitive sequence of a specific base sequence such as a TA repeat in the promoter region of a genomic gene, the 3 ′ end of the primer does not necessarily complement the base of the nucleic acid to be tested. In some cases, there is a problem that the resistance effect against the 3 ′ nuclease activity which is the essence of the present invention cannot be obtained, and this method is limited to the examination of SNP.
本発明の課題は、塩基配列の検査、とりわけＳＮＰ及びプロモーター領域の特定塩基の繰り返し配列の挿入、欠失の検査を簡便にしかも精度よく、多数検体を効率よく検査できる方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a method that can easily and accurately test a large number of specimens with a simple and accurate inspection of a base sequence, in particular, insertion and deletion of a repetitive sequence of a specific base in a SNP and a promoter region. .
本発明者らは、ＳＮＰの検査を簡便にしかも精度良く、多数検体を効率良く検査できる方法を鋭意研究した。被検核酸試料の検査しようとする特定の塩基に相補的な塩基を３´末端に有し、かつ３´末端から２番目の塩基は被検核酸の塩基に相補的であり、３番目より上流の少なくとも１つの塩基種を被検核酸塩基に相補的である塩基と異なる塩基種に置換したプライマー（以下、本プライマーを検出用プライマーと定義する。）を被検核酸試料にハイブリダイズさせ、基質とポリメラーゼによりプライマー伸長反応を行い、特定の塩基配列に対応してプライマー伸長反応が起こるか否かを検出するに当たり、プライマー伸長反応の生成物を該生成物に特異的に結合しうる結合対と結合させる方法を導入して検出することで簡便にしかも精度良く、多数検体を効率良く検査できる塩基配列又は変異の検査方法を提供することが可能なった。 The present inventors diligently studied a method capable of testing a large number of specimens easily and accurately with a simple SNP test. It has a base complementary to the specific base to be examined in the test nucleic acid sample at the 3 ′ end, and the second base from the 3 ′ end is complementary to the base of the test nucleic acid, and is upstream from the third. A primer obtained by substituting at least one base species of the above with a base species different from a base complementary to the test nucleic acid base (hereinafter, this primer is defined as a detection primer) is hybridized to the test nucleic acid sample, and the substrate When a primer extension reaction is carried out with a polymerase and it is detected whether or not the primer extension reaction occurs corresponding to a specific base sequence, a binding pair capable of specifically binding the product of the primer extension reaction to the product, By introducing and detecting a method of binding, it was possible to provide a method for testing a base sequence or mutation that can easily and accurately test a large number of specimens.
本発明は以下の構成からなる。
１、核酸試料中に含まれる塩基配列又は変異を検査する方法であって、被検核酸試料の検査しようとする特定の塩基に相補的な塩基を３´末端に有し、かつ３´末端から２番目の塩基は被検核酸の塩基に相補的であり、３番目より上流の少なくとも１つの塩基種を被検核酸塩基に相補的である塩基と異なる塩基種に置換したプライマー（以下、本プライマーを検出用プライマーと定義する。）を被検核酸試料にハイブリダイズさせる工程並びに基質とポリメラーゼによりプライマー伸長させる工程、及びプライマー伸長反応の生成物を該生成物に特異的に結合しうる結合対と結合させる工程を導入することにより特定の塩基配列に対応してプライマー伸長反応または増幅反応が起こるか否かを検出する工程を組み合わせることを特徴とする塩基配列又は変異の検査方法。
２、前記１に記載の検査方法において、検出用プライマーが標識されているプライマーを用い、その３´末端側にプライマー伸張した塩基配列に相補的な捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出用プライマー伸長反応物を結合させる工程を導入する検査方法。
３、前記１に記載の検査方法において、検出用プライマーの３´末端側に特定の塩基の５´側に隣接する塩基に相補的な標識連鎖終止ヌクレオチドが取り込まれるか否かを、検出用プライマー伸長反応物と特異的に結合しうる結合対と結合させて検出する検査方法。
４、前記１に記載の検査方法において、２本鎖核酸を試料とし、標識されている検出用プライマーと、この検査しようとする特定の塩基を含む領域とは異なる領域で、しかも前記検出用プライマーがハイブリダイズする核酸の相補鎖にハイブリダイズする前記検出用プライマーとは異なる非標識のプライマーを組み合わせて用い、該検出用プライマーの３´末端側にプライマー伸張した塩基配列に相補的な捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出用プライマー伸長反応物を結合させて検出する検査方法。
５、前記１に記載の検査方法において、２本鎖核酸を試料とし、検出用プライマーと、この検査しようとする特定の塩基を含む領域とは異なる領域で、しかも前記プライマーがハイブリダイズする核酸の相補鎖にハイブリダイズする前記プライマーとは異なる標識したプライマーを組み合わせて用い、該標識プライマーの３´末端側にプライマー伸張した塩基配列に相補的な捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出用プライマー伸長反応物を結合させて検出する検査方法。
６、前記１に記載の検査方法において、プライマーの３´末端側にプライマー伸張した核酸断片とその塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを結合させることにより２本鎖核酸を形成させ、その形成の有無をインターカレーションにより検出する検査方法。
７、前記１〜６に記載の検査方法において、捕獲用オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー伸長反応前のプライマーと特異的に結合しうる結合対のいずれか一方を固定化した多孔性担体及び他の一方を固定化した信号検出しうる物質又は担体を組み合わせて用いることにより、プライマー伸長した核酸断片を多孔性担体及び信号検出しうる物質又は担体に結合させ、多孔性担体上の信号を検出する検査方法。
８、正常型又は変異型をそれぞれ又はそれらを組み合わせて検査する前記１〜７に記載の検査方法。
９、前記７及び８に記載の方法を用いて正常型及び変異型を組み合わせて検査する方法であって、捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを信号検出しうる物質又は担体に固定化し、検出用プライマーを正常型及び変異型で異なる物質で標識した検出用プライマーを用い、該プライマーのそれぞれの標識物質と特異的に結合しうる物質を多孔性担体上に、お互いが平行或いは交差上になるように配置して固定化した装置を用いる検査方法。
１０、複数の遺伝子又は核酸の塩基配列又は変異を検査する前記１〜９に記載の検査方法。
１１、前記１〜１０に記載の検査方法に用いる検査試薬、検査装置、又は検査キット。
The present invention has the following configuration.
1. A method for inspecting a base sequence or mutation contained in a nucleic acid sample, which has a base complementary to a specific base to be examined in a test nucleic acid sample at the 3 ′ end and from the 3 ′ end A primer in which the second base is complementary to the base of the test nucleic acid and at least one base type upstream of the third is replaced with a base type different from the base complementary to the test nucleic acid base (hereinafter this primer) Is defined as a detection primer.) A step of hybridizing to a test nucleic acid sample, a step of primer extension with a substrate and a polymerase, and a binding pair capable of specifically binding the product of the primer extension reaction to the product. A base characterized by combining a step of detecting whether a primer extension reaction or an amplification reaction occurs corresponding to a specific base sequence by introducing a binding step Sequence or mutation test method.
2. In the inspection method according to 1 above, the detection primer is extended using a primer labeled with a detection primer and a capture oligonucleotide probe complementary to the base sequence extended to the 3 ′ end of the primer. An inspection method that introduces a step of combining reactants.
3. In the inspection method according to 1 above, whether or not a labeled chain termination nucleotide complementary to a base adjacent to the 5 ′ side of a specific base is incorporated into the 3 ′ end side of the detection primer is determined as a detection primer A test method for detecting by binding to a binding pair capable of specifically binding to an extension reaction product.
4. In the inspection method according to 1 above, a detection primer labeled with a double-stranded nucleic acid as a sample and a region different from the region containing the specific base to be tested, and the detection primer Capture oligo complementary to the base sequence extended to the 3 'end of the detection primer using a non-labeled primer different from the detection primer hybridizing to the complementary strand of the nucleic acid to which A test method for detecting a primer extension reaction product for detection by using a nucleotide probe.
5. In the test method according to 1 above, the nucleic acid to which the primer hybridizes in a region different from the detection primer and the region containing the specific base to be tested is prepared using a double-stranded nucleic acid as a sample. Primer extension reaction for detection using a combination of a labeled primer different from the primer hybridizing to the complementary strand, and a capture oligonucleotide probe complementary to the base sequence extended to the 3 ′ end of the labeled primer Inspection method to detect by combining objects.
6. In the inspection method according to 1 above, a double-stranded nucleic acid is formed by combining a nucleic acid fragment extended with a primer on the 3 ′ end side of a primer and an oligonucleotide probe complementary to the base sequence. Inspection method that detects the presence or absence by intercalation.
7. In the inspection method according to 1 to 6 above, a porous carrier on which one of a capture oligonucleotide probe or a binding pair capable of specifically binding to a primer before a primer extension reaction is immobilized and the other one A test method for detecting a signal on a porous carrier by combining the immobilized nucleic acid fragment with the signal-detectable substance or carrier by combining the immobilized signal-detectable substance or carrier with the porous carrier and the signal-detectable substance or carrier.
8. Said 1-7 test | inspection method which test | inspects each normal type or a mutant type, or combining them.
9. A method for examining a normal type and a mutant type in combination using the method described in 7 and 8 above, wherein the capture oligonucleotide probe is immobilized on a signal-detectable substance or carrier, and the detection primer is normal Using detection primers labeled with different substances of different types and variants, the substances that can specifically bind to the respective labeled substances of the primers are arranged on the porous carrier so that they are parallel or cross each other. Inspection method using a fixed device.
10. The test method according to 1 to 9, wherein the base sequence or mutation of a plurality of genes or nucleic acids is tested.
11. A test reagent, a test apparatus, or a test kit used in the test method according to 1 to 10 above.
本発明は、塩基配列の検査、とりわけＳＮＰ及びプロモーター領域の特定塩基の繰り返し配列の挿入、欠失の検査をできる方法を提供し、測定に際して特殊な機器、設備を必要とせずに安価で簡便に、しかも精度よく多数検体を効率よく検査できるといった、格段の効果を有する検査方法、検査試薬及びキットを提供することを可能にした。 The present invention provides a method capable of examining base sequences, in particular, inserting and deleting repeat sequences of specific bases of SNPs and promoter regions, and is inexpensive and simple without requiring special equipment or facilities for measurement. In addition, it is possible to provide a test method, a test reagent, and a kit that have a remarkable effect that a large number of samples can be efficiently tested with high accuracy.
本発明において用いられている用語の定義は以下のとおりである。
１、核酸とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）の両方又はどちらか一方を表し、ＤＮＡにおいては特に限定しない限り、１本鎖又は２本鎖のいずれも含まれる。また、ある特定の領域の全長を核酸とし、その一部を核酸断片という。
２、オリゴヌクレオチドとはとりわけ、数塩基〜数十塩基からなる核酸断片をいう。
３、プライマーとは１本鎖の核酸又は核酸断片とハイブリダイズし、ポリメラーゼによる塩基伸長反応を誘導し得るオリゴヌクレオチドである。
４、プローブとは１本鎖の核酸又は核酸断片とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである。
Definitions of terms used in the present invention are as follows.
1. Nucleic acid represents deoxyribonucleic acid (DNA) and / or ribonucleic acid (RNA), and DNA includes both single-stranded and double-stranded unless specifically limited. Moreover, the full length of a specific area | region is made into a nucleic acid, and the part is called a nucleic acid fragment.
2. Oligonucleotide refers to a nucleic acid fragment consisting of several bases to several tens of bases.
3. A primer is an oligonucleotide that can hybridize with a single-stranded nucleic acid or nucleic acid fragment and induce a base extension reaction by a polymerase.
4. A probe is an oligonucleotide that can hybridize with a single-stranded nucleic acid or nucleic acid fragment.
本発明の特徴は、被検核酸試料の検査しようとする特定の塩基に相補的な塩基を３´末端に有し、かつ３´末端から２番目の塩基は被検核酸の塩基に相補的であり、３番目より上流の少なくとも１つの塩基種を被検核酸塩基に相補的である塩基と異なる塩基種に置換したプライマー（検出用プライマー）を用いること及び、該検出用プライマーの３´末端が被検核酸の特定の塩基配列に相補的であるか否かによって、プライマー伸長反応やポリメラーゼ連鎖反応等の増幅反応が起こるか否かを検出する工程において、プライマー伸長反応の生成物を該生成物に特異的に結合しうる結合対と結合させる工程を導入して検出することを組み合わせたことである。 The feature of the present invention is that a 3 ′ end has a base complementary to a specific base to be examined of a test nucleic acid sample, and the second base from the 3 ′ end is complementary to the base of the test nucleic acid. Yes, using a primer (detection primer) in which at least one base species upstream from the third is replaced with a base species different from the base complementary to the test nucleic acid base, and the 3 ′ end of the detection primer is In the step of detecting whether or not an amplification reaction such as a primer extension reaction or a polymerase chain reaction occurs depending on whether or not it is complementary to a specific base sequence of a test nucleic acid, the product of the primer extension reaction is the product This is a combination of detection by introducing a step of binding to a binding pair that can specifically bind to.
本発明を実施するために設計される、被検核酸試料の検査しようとする特定の塩基に相補的な塩基を３´末端に有し、かつ３´末端から２番目の塩基は被検核酸の塩基に相補的であり、３番目より上流の少なくとも１つの塩基種を被検核酸塩基に相補的である塩基と異なる塩基種に置換した検出用プライマーの設計は図１に示したごとくである。例えば、検査しようとする核酸の塩基配列が正常型で「５´・・・ＴＡＣ―――３´」であり、変異型で「５´・・・ＧＡＣ―――３´」であれば、正常型用プライマーは「５´―――Ｃ*ＴＡ３´」とし、変異型用プライマーは「５´Ｃ*ＴＣ３´」となるように設計する。すなわち検査しようとする配列中の下線部分（−）が正常型でＴ、変異型でＧとなっているのであるから、検出用プライマーはその部位で、それぞれ相補になるＡとＣが３´末端に来るようにする。そしてその１塩基上流は相補塩基であるＴとし、下線（ *）で表した２塩基上流部は被検核酸の塩基はＣであるので、本来はその相補塩基Ｇのところを、人工ミスマッチとなるようにＣを入れる。その後の上流部分は相補配列を用いる。この人工ミスマッチ導入の塩基種の選択は一例であり、相補でない組み合わせであれば特に限定されるものではない。 A base designed for practicing the present invention, which has a base complementary to a specific base to be examined in a test nucleic acid sample at the 3 ′ end, and the second base from the 3 ′ end is the nucleic acid of the test nucleic acid The design of a detection primer that is complementary to a base and in which at least one base species upstream of the third is substituted with a base species different from a base that is complementary to a test nucleic acid base is as shown in FIG. For example, a "5'··· T AC --- 3'" in the nucleotide sequence is normal type of nucleic acid to be examined, there in the "5'··· G AC --- 3'" in the mutant For example, the normal primer is designed to be “5 ′ -C * T A 3 ′”, and the mutant primer is designed to be “5 ′ C * T C 3 ′”. That is, the underlined part (-) in the sequence to be examined is T for the normal type and G for the mutant type, so that the detection primer is at that site, and A and C complementary to each other are at the 3 'end. To come to. The base upstream of the base is T, which is a complementary base, and the base of the test nucleic acid is C at the base of the two bases represented by the underline ( * ). Therefore, the complementary base G is originally an artificial mismatch. Put C as follows. Subsequent upstream portions use complementary sequences. The selection of the base species for introducing the artificial mismatch is an example, and is not particularly limited as long as it is a combination that is not complementary.
本発明を実施するために設計される、上記検出用プライマーの３´末端が被検核酸の特定の塩基配列に相補的であるか否かによって、プライマー伸長反応やＰＣＲ等の増幅反応が起こるか否かを検出する工程において、プライマー伸長反応により生じた部位に特異的に結合しうる結合対について、それぞれの実施形態に応じて説明する。 Whether the primer extension reaction or amplification reaction such as PCR occurs depending on whether or not the 3 ′ end of the detection primer designed to carry out the present invention is complementary to a specific base sequence of the test nucleic acid In the step of detecting whether or not, a binding pair that can specifically bind to a site generated by the primer extension reaction will be described according to each embodiment.
本発明の第１の実施の形態は、予め増幅された被検核酸に前記検出用プライマーをハイブリダイズさせ、基質とポリメラーゼによりプライマー伸長反応を起こさせる。ここで用いる検出用プライマーは、その５´末端をビオチン、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ジゴキシゲニン等の公知の標識物質で標識しておく。プライマー伸長反応により生成した部位を特異的に結合しうる結合対は、プライマー伸長反応により生成した塩基配列に相補的な配列を有する捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを用いて結合させる。すなわちプライマー伸長反応が起これば標識検出用プライマーを含む核酸断片が捕獲用オリゴヌクレオチドプローブと結合する。一方変異のためにプライマー伸長反応が起こらなければ、標識検出用プライマーを含む核酸断片が捕獲用オリゴヌクレオチドプローブと結合しないので、標識物質が捕獲用オリゴヌクレオチドプローブに結合しない。捕獲用オリゴヌクレオチドプローブ上に結合した標識物質を検出することにより、プライマー伸長の有無が検出でき、ひいては遺伝子の配列、変異が検査できる（図２）。ここで用いる捕獲用オリゴヌクレオチドプローブは適当な固相担体に結合させて用いることが好適である。固相担体への結合はアミノ化オリゴヌクレオチドを、サクシニイミド基を介して結合させるなどの公知の方法が適用される。固相担体は、磁性粒子、マイクロタイタープレートウエル、チューブ、ガラスビーズ、プラスチックビーズ等が用いられる。 In the first embodiment of the present invention, the detection primer is hybridized to a test nucleic acid amplified in advance, and a primer extension reaction is caused by a substrate and a polymerase. The 5 ′ end of the detection primer used here is labeled with a known labeling substance such as biotin, fluorescein, Cy3, Cy5, or digoxigenin. A binding pair capable of specifically binding a site generated by the primer extension reaction is bound using a capture oligonucleotide probe having a sequence complementary to the base sequence generated by the primer extension reaction. That is, when the primer extension reaction occurs, the nucleic acid fragment containing the label detection primer is bound to the capture oligonucleotide probe. On the other hand, if the primer extension reaction does not occur due to mutation, the nucleic acid fragment containing the label detection primer does not bind to the capture oligonucleotide probe, so the labeling substance does not bind to the capture oligonucleotide probe. By detecting the labeling substance bound on the oligonucleotide probe for capture, the presence or absence of primer extension can be detected, and the gene sequence and mutation can be examined (FIG. 2). The capture oligonucleotide probe used here is preferably bound to an appropriate solid phase carrier. For binding to the solid phase carrier, a known method such as binding an aminated oligonucleotide via a succinimide group is applied. As the solid phase carrier, magnetic particles, microtiter plate wells, tubes, glass beads, plastic beads and the like are used.
本発明の第２の実施の形態は、予め増幅された被検核酸に前記検出用プライマーをハイブリダイズさせ、連鎖終止基質とポリメラーゼによりプライマー伸長反応を起こさせ、１塩基伸長させる。ここで用いる連鎖終止基質のダイデオキシヌクレオチドは、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、Ｃｙ３、Ｃｙ５等の公知の標識物質で標識しておく。プライマー伸長反応が起これば、これらの標識ダイデオキシヌクレオチドがプライマーに取り込まれることになる。この場合の、一つの実施の形態として、これらの標識物質に特異的に結合しうる結合対を結合させることにより信号の検出工程へ導くことが可能になる（図３）。プライマーの５´末端を連鎖終止基質とは異なる標識物質で標識しておき、固相上に結合させた特異的結合対と伸長反応物を反応させることにより、固相上にプライマー伸長反応物を捕獲した後、プライマーの５´末端の標識物質を検出することで本発明を実施できる。もう一方の実施の形態としては、逆にプライマーの５´末端の標識物質、あるいはプライマーの塩基配列と相補は配列を持つオリゴヌクレオチドを介して、固相上にプライマー伸長反応物を捕獲して、伸長反応により結合した標識物質をその結合対を用いて検出する方法も本発明に含まれる。さらにこのばあいには、標識連鎖終止ヌクレオチドの標識物質が蛍光物質のごとく、それ自体で検出可能なものであれば、固相上に捕獲したプライマー伸長反応物を直接検出することも可能である。 In the second embodiment of the present invention, the detection primer is hybridized to a pre-amplified nucleic acid, a primer extension reaction is caused by a chain termination substrate and a polymerase, and one base is extended. The chain termination substrate dideoxynucleotide used here is labeled with a known labeling substance such as biotin, fluorescein, digoxigenin, Cy3 or Cy5. When the primer extension reaction occurs, these labeled dideoxynucleotides are incorporated into the primer. In this case, as one embodiment, it is possible to lead to a signal detection step by binding a binding pair that can specifically bind to these labeling substances (FIG. 3). The primer extension reaction product is labeled on the solid phase by labeling the 5 'end of the primer with a labeling substance different from the chain termination substrate and reacting the specific binding pair bound to the solid phase with the extension reaction product. After capturing, the present invention can be carried out by detecting the labeling substance at the 5 ′ end of the primer. In another embodiment, conversely, a primer extension reaction product is captured on a solid phase via a labeling substance at the 5 ′ end of the primer, or an oligonucleotide having a sequence complementary to the base sequence of the primer, A method for detecting a labeling substance bound by an extension reaction using the binding pair is also included in the present invention. Furthermore, in this case, it is also possible to directly detect the primer extension reaction product captured on the solid phase if the labeling substance of the labeled chain terminating nucleotide is a fluorescent substance that can be detected by itself. .
本発明の第３の実施の形態は、被検核酸試料の検査しようとする特定の塩基に相補的な塩基を３´末端に有し、かつ３´末端から２番目の塩基は被検核酸の塩基に相補的であり、３番目より上流の少なくとも１つの塩基種を被検核酸塩基に相補的である塩基と異なる塩基種に置換したプライマーでしかもその５´末端を標識したプライマーと、この検査しようとする特定の塩基を含む領域とは異なる領域で、しかも前記プライマーがハイブリダイズする核酸の相補鎖にハイブリダイズする非標識のプライマー、所謂リバースプライマーとを組み合わせて、ゲノム核酸或いは予め増幅された被検核酸にプライマー対をハイブリダイズさせ、基質とポリメラーゼによりプライマー伸長反応および増幅反応を起こさせる（図４）。後の操作は段落番号００１６で述べた本発明の第１の実施の形態と同様に行い、プライマー伸長反応により伸長した部分を特異的に固相に捕獲することにより実施することが可能である。ここで用いる捕獲用のオリゴヌクレオチドは、標識プライマーが新たに伸長する部分の相補配列を有するものであればよいが、リバースプライマーの配列を含まないことが好適である。この実施の形態では、予め増幅させた核酸試料に限定されることなく、直接ゲノム核酸を増幅しながら変異も検出できる。 The third embodiment of the present invention has a base complementary to a specific base to be examined in the test nucleic acid sample at the 3 ′ end, and the second base from the 3 ′ end is the nucleic acid of the test nucleic acid. A primer that is complementary to the base and has at least one base species upstream of the third substituted with a base species different from the base that is complementary to the test nucleobase, and labeled at the 5 ′ end thereof, and this test Genomic nucleic acid or preamplified in combination with an unlabeled primer that hybridizes to the complementary strand of the nucleic acid to which the primer hybridizes, so-called reverse primer, in a region different from the region containing the specific base to be synthesized A primer pair is hybridized to a test nucleic acid, and a primer extension reaction and an amplification reaction are caused by a substrate and a polymerase (FIG. 4). The subsequent operation can be performed in the same manner as in the first embodiment of the present invention described in Paragraph 0016, and the portion extended by the primer extension reaction can be specifically captured on the solid phase. The capture oligonucleotide used here may be any that has a complementary sequence of the newly extending portion of the labeled primer, but preferably does not include the reverse primer sequence. In this embodiment, the present invention is not limited to a nucleic acid sample amplified in advance, and mutation can be detected while directly amplifying genomic nucleic acid.
本発明の第４の実施の形態は、被検核酸試料の検査しようとする特定の塩基に相補的な塩基を３´末端に有し、かつ３´末端から２番目の塩基は被検核酸の塩基に相補的であり、３番目より上流の少なくとも１つの塩基種を被検核酸塩基に相補的である塩基と異なる塩基種に置換した非標識プライマーと、この検査しようとする特定の塩基を含む領域とは異なる領域で、しかも前記プライマーがハイブリダイズする核酸の相補鎖にハイブリダイズするプライマーの５´末端を標識した、所謂標識リバースプライマーとを組み合わせて、ゲノム核酸或いは予め増幅された被検核酸にプライマー対をハイブリダイズさせ、基質とポリメラーゼによりプライマー伸長反応および増幅反応を起こさせる（図５）。後の操作は、標識リバースプライマーの３´側に伸張した塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて特異的に伸長反応物を捕獲することにより、段落番号００１６で述べた本発明の第１の実施の形態と同様に実施することが可能である。ここで用いる捕獲用のオリゴヌクレオチドは、標識リバースプライマーが新たに伸長する部分の相補配列を有するものであればよいが、非標識の検出用プライマーの配列を含まないことが好適である。すなわち、検査しようとする特定の塩基よりも３´側下流部分で、標識リバースプライマーの３´末端がハイブリダイズする部位までの間の配列から選択することが好ましい。この実施の形態においても、予め増幅させた核酸試料に限定されることなく、直接ゲノム核酸を増幅しながら変異も検出できる。 The fourth embodiment of the present invention has a base complementary to a specific base to be tested at the 3 ′ end and the second base from the 3 ′ end of the test nucleic acid sample. It includes a non-labeled primer that is complementary to the base and has at least one base species upstream of the third substituted with a base species different from the base that is complementary to the test nucleobase, and the specific base to be tested A genomic nucleic acid or a pre-amplified test nucleic acid in combination with a so-called labeled reverse primer, which is a region different from the region and is labeled with the 5 ′ end of the primer hybridizing to the complementary strand of the nucleic acid to which the primer hybridizes The primer pair is hybridized with the substrate, and a primer extension reaction and an amplification reaction are caused by the substrate and the polymerase (FIG. 5). The subsequent operation is to capture the extension reaction product specifically using an oligonucleotide complementary to the base sequence extended to the 3 ′ side of the labeled reverse primer, whereby the first of the present invention described in paragraph No. 0016 is used. It can be carried out in the same manner as in the embodiment. The capture oligonucleotide used here may be any that has a complementary sequence of the newly extended portion of the labeled reverse primer, but preferably does not include the sequence of the unlabeled detection primer. That is, it is preferable to select from the sequence between the 3 ′ end downstream of the specific base to be examined and the site where the 3 ′ end of the labeled reverse primer hybridizes. Also in this embodiment, the mutation can be detected while directly amplifying the genomic nucleic acid without being limited to the nucleic acid sample amplified in advance.
本発明の第５の実施の形態は、被検核酸試料の検査しようとする特定の塩基に相補的な塩基を３´末端に有し、かつ３´末端から２番目の塩基は被検核酸の塩基に相補的であり、３番目より上流の少なくとも１つの塩基種を被検核酸塩基に相補的である塩基と異なる塩基種に置換した非標識プライマーを用い、プライマー伸長反応させる。リバースプライマーを用いて、増幅と同時にすることも可能である。次いでプライマー伸長した部位に特異的に結合する捕獲用オリゴヌクレオチドを用いて２本鎖を形成させる。このときアクリジニウムエステルやエチジウムブロミドのように２本鎖構造と１本鎖構造で安定性や信号強度の変化が起こる物質を作用させる、所謂インターカレーション効果を利用することにより、プライマー伸長が起きたか否かを検出することにより本発明を実施することが可能である（図６）。
本実施の形態では、必ずしも捕獲用オリゴヌクレオチドプローブは固相化する必要はなく、所謂ホモジニアスな系で検査が可能である。
The fifth embodiment of the present invention has a base complementary to a specific base to be tested at the 3 ′ end, and the second base from the 3 ′ end is the nucleic acid of the test nucleic acid. A primer extension reaction is carried out using an unlabeled primer that is complementary to the base and in which at least one base species upstream of the third is substituted with a base species different from the base that is complementary to the test nucleic acid base. It is also possible to use the reverse primer and simultaneously perform amplification. Next, a double strand is formed using a capture oligonucleotide that specifically binds to the primer-extended site. At this time, primer extension can be achieved by utilizing a so-called intercalation effect that acts on a substance that changes in stability and signal intensity in a double-stranded structure and a single-stranded structure such as acridinium ester and ethidium bromide. It is possible to implement the present invention by detecting whether it has happened (FIG. 6).
In the present embodiment, the capture oligonucleotide probe does not necessarily need to be solid-phased, and can be examined in a so-called homogeneous system.
本発明を実施するに当たり、信号の検出方法は、前述のごとく、固相に捕獲された標識物質を検出する方法が好適に用いられる。さらにインターカレーション効果を利用することにより、ホモジニアス系でも検出が可能であることは既に述べた。前述のこれらの方法に加えて、免疫測定法で用いられている、ラテラルフロー型やフロースルー型の分析方法も本発明に適用される。金属コロイド粒子、着色ラテックス或いは蛍光ラテックス等の信号を与えることが可能な粒子に捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを固定化しておき、プライマー伸長反応物を結合させる。プライマーの伸長部分とは異なる部位と特異的に結合しうるもうひとつの結合物質を予めろ紙、メンブラン等の多孔性担体に固定化しておき、そこに粒子−プライマー伸長物複合体を導き反応させる。プライマー伸長が起きていれば粒子は多孔性担体に捕獲されることになる（図７）。プライマーの伸長部分とは異なる部位と特異的に結合しうる結合対の組み合わせの例として、５´末端をビオチン標識したプライマーであれば、アビジン又はストレプトアビジンを固相化しておくことができる。フルオレセインやジゴキシゲニン標識であればそれぞれに対する抗体を固相化しておく。非標識プライマーであればプライマーの塩基配列と相補的配列をもつオリゴヌクレオチドプローブを固相化しておくことが可能である。本実施の形態では金属コロイド粒子、着色ラテックス或いは蛍光ラテックス等の信号を与えることが可能な粒子に結合させる捕獲用オリゴヌクレオチドと、多孔性担体に固定化する結合対を逆にすることも可能である。 In practicing the present invention, as described above, a method for detecting a labeling substance captured on a solid phase is suitably used as a signal detection method. Furthermore, it has already been described that detection is possible even in a homogeneous system by utilizing the intercalation effect. In addition to these methods described above, lateral flow type and flow through type analysis methods used in immunoassays are also applied to the present invention. A capture oligonucleotide probe is immobilized on particles capable of giving a signal such as metal colloid particles, colored latex or fluorescent latex, and a primer extension reaction product is bound thereto. Another binding substance that can specifically bind to a site different from the extension part of the primer is immobilized in advance on a porous carrier such as filter paper or membrane, and a particle-primer extension complex is introduced and reacted therewith. If primer extension occurs, the particles will be trapped on the porous support (FIG. 7). As an example of a combination of a binding pair that can specifically bind to a site different from the extended portion of the primer, avidin or streptavidin can be immobilized on a solid phase as long as the primer has a biotin-labeled 5 ′ end. If it is labeled with fluorescein or digoxigenin, the antibody against each is immobilized. In the case of an unlabeled primer, it is possible to immobilize an oligonucleotide probe having a sequence complementary to the base sequence of the primer. In this embodiment, it is also possible to reverse the capture oligonucleotide to be bound to a particle capable of giving a signal such as metal colloid particles, colored latex or fluorescent latex and the binding pair to be immobilized on the porous carrier. is there.
上記のラテラルフロー型やフロースルー型の分析方法においては、試験の実施が適切に行われたか否かを判定するコントロールが必要となる場合がある。本発明の実施に際しても、コントロールを入れることができる。例えば、オリゴデオキシチミジン（ＯｄＴ）を着色粒子等に固定化したものを検査用の着色粒子等と混ぜておき、一方多孔性担体のコントロール検出部位にオリゴデオキシアデニン（ＯｄＡ）を固定化しておくことにより、試験が正常に実施されたか否かを検証するためのコントロール機能を付加できる。 In the above-described lateral flow type and flow through type analysis methods, it may be necessary to control whether or not the test has been properly performed. Controls can also be included in the practice of the invention. For example, oligodeoxythymidine (OdT) immobilized on colored particles or the like is mixed with colored particles for inspection or the like, while oligodeoxyadenine (OdA) is immobilized on the control detection site of the porous carrier. Therefore, it is possible to add a control function for verifying whether or not the test has been carried out normally.
本発明は、単一の遺伝子の検査のみならず、複数の遺伝子の検査を同時に行うことも可能である。一つの酵素等をコードする遺伝子の複数の箇所の変異を同時に検査することも、また、異なる複数の酵素等をコードする遺伝子を同時に検査することも可能である。具体的には、検出用プライマーとリバースプライマーの組み合わせ及び捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを検査しようとする特定の塩基に対応して設計し、同時に被検核酸試料にプライマー対をハイブリダイズ後、プライマー伸長させて、伸長部位を特異的に捕獲することにより実施できる。それぞれの捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを、例えばマイクロタイタープレートの特定のウエルに配置して固定化しておけば、一つの装置で同時に複数の変異検査を実施することも可能である。またフロースルー型の分析装置を使えば、複数の捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを多孔性担体上に固定化しておくことにより、一つの装置で同時に複数の変異検査を実施することも可能である（図８）。これと同様の方法で、核酸チップ（核酸アレイ）上に複数の捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを固定化しておくことにより、一つの装置で同時に複数の変異検査を実施することも可能である。 In the present invention, not only a single gene test but also a plurality of gene tests can be performed simultaneously. It is possible to simultaneously examine mutations at a plurality of positions of a gene encoding one enzyme or the like, or to simultaneously test genes encoding a plurality of different enzymes or the like. Specifically, the detection primer and reverse primer combination and the capture oligonucleotide probe are designed for the specific base to be tested, and at the same time, the primer pair is hybridized to the test nucleic acid sample, and then the primer is extended. Thus, it can be carried out by specifically capturing the extension site. If each capture oligonucleotide probe is placed in a specific well of a microtiter plate and immobilized, for example, a plurality of mutation tests can be carried out simultaneously with one apparatus. In addition, if a flow-through type analyzer is used, a plurality of mutation probes can be simultaneously tested with a single device by immobilizing a plurality of capture oligonucleotide probes on a porous carrier (Fig. 8). By immobilizing a plurality of capture oligonucleotide probes on a nucleic acid chip (nucleic acid array) in the same manner as described above, it is possible to carry out a plurality of mutation tests simultaneously with one apparatus.
多孔性担体を用いた分析法の本発明の応用例として、図９に示したように、一つの変異について、正常型と変異型をそれぞれ異なる標識物質で標識した標識検査用プライマーを設計し、一つの着色粒子等に固定化した共通の捕獲用オリゴヌクレオチドプローブでプライマー伸長物を捕獲する。そして多孔性担体上に標識物質に対する特異的結合対を十字型に固定化した装置を構築し、そこに着色粒子−プライマー伸長物複合体を反応させることにより、一つの装置で同時に複数の変異検査を実施することも可能である。 As an application example of the present invention of an analysis method using a porous carrier, as shown in FIG. 9, for one mutation, a normal inspection and a mutation type are each labeled with a different labeling substance, and a label inspection primer is designed. Primer extension is captured with a common capture oligonucleotide probe immobilized on one colored particle or the like. Then, a device in which a specific binding pair for a labeling substance is immobilized in a cross shape on a porous carrier and a colored particle-primer extension complex is reacted therewith, so that multiple mutation tests can be performed simultaneously on one device. It is also possible to implement.
本発明の方法を実施するための検査試薬及びキットも本発明に含まれる。正常型検出用プライマー、変異検出用プライマー、ポリメラーゼ、基質、及び捕獲用オリゴヌクレオチドプローブが必須の構成試薬となる。増幅工程を組み込む場合にはリバースプライマーを、捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを固相化する場合には、マイクロタイタープレート或いは磁性粒子等の適当な固相にプローブを固定化した固相を、
標識物質がビオチンであれば、それを検出するための酵素標識アビジン或いは酵素標識ストレプトアビジンと酵素活性測定のための基質類を構成試薬にする。さらに、検体からの核酸抽出用試薬、核酸処理用のアルカリ液等の処理液類、緩衝液類及び洗浄液等も組み込むことができる。
Test reagents and kits for carrying out the method of the present invention are also included in the present invention. A normal detection primer, a mutation detection primer, a polymerase, a substrate, and a capture oligonucleotide probe are essential constituent reagents. When incorporating an amplification step, a reverse primer is used, and when a capture oligonucleotide probe is immobilized, a solid phase in which the probe is immobilized on a suitable solid phase such as a microtiter plate or magnetic particles,
If the labeling substance is biotin, enzyme-labeled avidin or enzyme-labeled streptavidin for detecting it and substrates for enzyme activity measurement are used as constituent reagents. Furthermore, a reagent for nucleic acid extraction from a specimen, a processing solution such as an alkaline solution for nucleic acid processing, a buffer solution, a washing solution, and the like can be incorporated.
グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ）のアミノ酸配列４８６番目のチロシンのアスパラギン酸への変異（Ｙ４８６Ｄ）が知られている。このアミノ酸をコードする遺伝子の変異を本発明の方法により調べた。まず本酵素をコードする遺伝子のエキソン５領域の変異部分を含む領域を配列番号１に示したフォワードプライマーと配列番号２に示したリバースプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅した。ＵＧＴ遺伝子のエキソン５領域のＹ４８６Ｄの変異を検出するために、得られたＰＣＲ産物に配列番号３及び４に示した変異部位の２塩基上流部位に人工的にミスマッチをいれ５'末端をビオチンで標識した検出用プライマーと通常の基質（４種類のデオキシヌクレオシド３リン酸）を加えてプライマー伸長反応を行った。反応終了後、反応液に２ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ、１０μＬを加え、２本鎖核酸を1本鎖にし、それを配列番号５で示した捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを固定化したマイクロタイタープレートのウエルに移し、ｐＨを約７．５に調製して室温で３０分間ハイブリダイズ反応させた。ハイブリダイズ反応後、反応液を除去しリン酸緩衝液でウエルを洗浄した。そのウエルに西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジン溶液１００μLを加え室温２０分間反応させ、未反応の標識アビジンを除去、洗浄した。ペルオキシダーゼの基質である過酸化水素を含むオルトフェニレンジアミン溶液を加えて発色反応を行った。３７℃で１０分問反応させた後、１ｍｏｌ／Ｌの硫酸を１００μＬ加えて反応を停止させ、波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を表1に示した。変異型では正常型に比べて明らかに低い吸光度となり本発明の方法により簡便に変異が検出できることがわかった。 A mutation (Y486D) of tyrosine at the 486th amino acid sequence of glucuronyltransferase (UGT) to aspartic acid is known. The mutation of the gene encoding this amino acid was examined by the method of the present invention. First, a region containing the mutated portion of exon 5 region of the gene encoding this enzyme was amplified by PCR using the forward primer shown in SEQ ID NO: 1 and the reverse primer shown in SEQ ID NO: 2. In order to detect the Y486D mutation in the exon 5 region of the UGT gene, the resulting PCR product was artificially mismatched at the 2 base upstream site of the mutation site shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, and the 5 'end was biotinized. A primer extension reaction was performed by adding a labeled detection primer and a normal substrate (four kinds of deoxynucleoside triphosphates). After completion of the reaction, 10 μL of 2 mol / L NaOH is added to the reaction solution to convert the double-stranded nucleic acid into a single strand, which is then added to the well of the microtiter plate on which the capture oligonucleotide probe shown in SEQ ID NO: 5 is immobilized. The pH was adjusted to about 7.5 and a hybridization reaction was performed at room temperature for 30 minutes. After the hybridization reaction, the reaction solution was removed and the wells were washed with a phosphate buffer. 100 μL of a horseradish peroxidase-labeled streptavidin solution was added to the well and reacted at room temperature for 20 minutes to remove and wash the unreacted labeled avidin. A color reaction was carried out by adding an orthophenylenediamine solution containing hydrogen peroxide as a substrate for peroxidase. After 10 minutes of reaction at 37 ° C., 100 μL of 1 mol / L sulfuric acid was added to stop the reaction, and the absorbance at a wavelength of 492 nm was measured. The results are shown in Table 1. In the mutant type, the absorbance was clearly lower than that in the normal type, and it was found that the mutation could be easily detected by the method of the present invention.
配列番号３及び４に示した変異部位の２塩基上流部位に人工的にミスマッチをいれ５'末端をビオチンで標識した検出用プライマーと配列番号２で示したリバースプライマーを用いて、白血球より抽出したゲノム核酸をＰＣＲで増幅させた。その後、２ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ、１０μLを加え、２本鎖核酸を1本鎖にし、それを配列番号５で示した捕獲用オリゴヌクレオチドプローブを固定化したマイクロタイタープレートのウエルに移し、ｐＨを約７．５に調製して室温で３０分問反応ハイブリダイズ反応させた。ハイブリダイズ反応後、反応液を除去しリン酸緩衝液でウエルを洗浄した。そのウエルに西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジン溶液１００μLを加え室温で２０分間反応させ、未反応の標識ストレプトアビジンを除去、洗浄した。ペルオキシダーゼの基質である過酸化水素を含むオルトフェニレンジアミン溶液を加えて発色反応を行った。３７℃で１０分間反応させた後、１ｍｏｌ／Ｌの硫酸を１００μL加えて反応を停止させ、波長４９２ｎｍの吸光皮を測定した。その結果を表２に示した。変果型では正常型に比べて明らかに低い吸光度となり本発明の方法により簡便に変異が検出できることがわかった。またこの方法では、予め被検核酸を増幅しておかなくとも、変異検出が可能であることもわかった。 Extraction was performed from leukocytes using a detection primer in which a mismatch was artificially inserted into the 2-base upstream site of the mutation sites shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 and the 5 ′ end was labeled with biotin and a reverse primer shown in SEQ ID NO: 2. Genomic nucleic acid was amplified by PCR. Thereafter, 10 μL of 2 mol / L NaOH is added to make a double-stranded nucleic acid into a single strand, which is transferred to a well of a microtiter plate on which the capture oligonucleotide probe shown in SEQ ID NO: 5 is immobilized, and the pH is reduced to about The mixture was adjusted to 7.5 and allowed to hybridize for 30 minutes at room temperature. After the hybridization reaction, the reaction solution was removed and the wells were washed with a phosphate buffer. 100 μL of a horseradish peroxidase-labeled streptavidin solution was added to the well and reacted at room temperature for 20 minutes to remove and wash unreacted labeled streptavidin. A color reaction was carried out by adding an orthophenylenediamine solution containing hydrogen peroxide as a substrate for peroxidase. After reacting at 37 ° C. for 10 minutes, 100 μL of 1 mol / L sulfuric acid was added to stop the reaction, and the absorption skin having a wavelength of 492 nm was measured. The results are shown in Table 2. It was found that the mutant type had a clearly lower absorbance than the normal type, and that the mutation could be easily detected by the method of the present invention. It was also found that this method can detect a mutation without amplifying a test nucleic acid in advance.
実施例２と同様に操作して、インフォームドコンセントの得られた48例の検体について、本発明の方法を用いてＵＧＴ−１遺伝子のＹ４８６Ｄの変異を調べ、ダイレクトシーケンス法の結果と比較した。その結果、表３に示したように全例ダイレクトシーケンス法と一致し、本発明の有用性が明らかになった。 By operating in the same manner as in Example 2, 48 samples obtained with informed consent were examined for Y486D mutation of UGT-1 gene using the method of the present invention and compared with the results of the direct sequencing method. As a result, as shown in Table 3, it was consistent with the direct sequencing method for all cases, and the usefulness of the present invention was clarified.
実施例２で用いた配列番号２に示したプライマーの５´末端側をビオチン標識しプ
ライマーと配列番号３及び４に示した、人エミスマッチを含む検出用プライマーを
用い、ＰＣＲ反応によりゲノム核酸を増幅した。その後、２ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ、１０μLを加え、２本鎖核酸を1本鎖にし、それを配列番号６で示したプローブを固定化したマイクロタイタープレートのウエルに移し、ｐＨを約７．５に調製して室温で３０分間反応ハイブリダイズ反応させた。ハイブリダイズ反応後、反応液を除去しリン酸緩衝液でウエルを洗浄した。そのウエルに西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジン溶液１００μLを加え室温で２０分間反応させ、未反応の標識アビジンを除去、洗浄した。ペルオキシダーゼの基質である過酸化水素を含むオルトフェニレンジアミン溶液を加えて発色反応を行った。３７℃で１０分問反応させた後、１ｍｏｌ／Ｌの硫酸を１００μL加えて反応を停止させ、波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を表４に示した。変異型では正常型に比べて明らかに低い吸光度となり本発明の方法により簡便に変異が検出できることがわかった。
The 5 'end side of the primer shown in SEQ ID NO: 2 used in Example 2 was labeled with biotin, and the primer and the detection primer containing human mismatch shown in SEQ ID NOS: 3 and 4 were used to detect genomic nucleic acid by PCR reaction. Amplified. Then, 2 mol / L NaOH, 10 μL is added to make double-stranded nucleic acid single-stranded, which is transferred to the well of a microtiter plate on which the probe shown in SEQ ID NO: 6 is immobilized, and the pH is adjusted to about 7.5. Prepared and allowed to react for 30 minutes at room temperature. After the hybridization reaction, the reaction solution was removed and the wells were washed with a phosphate buffer. 100 μL of a horseradish peroxidase-labeled streptavidin solution was added to the well and reacted at room temperature for 20 minutes to remove and wash unreacted labeled avidin. A color reaction was carried out by adding an orthophenylenediamine solution containing hydrogen peroxide as a substrate for peroxidase. After 10 minutes of reaction at 37 ° C., 100 μL of 1 mol / L sulfuric acid was added to stop the reaction, and the absorbance at a wavelength of 492 nm was measured. The results are shown in Table 4. In the mutant type, the absorbance was clearly lower than that in the normal type, and it was found that the mutation could be easily detected by the method of the present invention.
グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ）遺伝子のプロモーター領域のＴＡリピート数は正常型では６個であるが、挿入が起こり７個になっている変異が知られている。この変異を本発明の方法により調べた。まずプロモーター領域の遺伝子の変異部分を含む領域を配列番号７に示したビオチン標識した変異検出用フォワードプライマーと配列番号８に示したリバースプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅した。増幅反応後、２ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ、１０μLを加え、２本鎖核酸を１本鎖にし、それを配列番号９で示した捕獲用プローブを固定化したマイクロタイタープレートのウエルに移し、ｐＨを約７．５に調整して室温で３０分間反応ハイブリダイズ反応させた。ハイブリダイズ反応後、反応液を除去しリン酸緩衝液でウエルを洗浄した。そのウエルに西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジン溶液１００μLを加え室温で２０分間反応させ、未反応の標識アビジンを除去、洗浄した。ペルオキシダーゼの基質である過酸化水素を含むオルトフェニレンジアミン溶液を加えて発色反応を行った。３７℃で１０分問反応させた後、１ｍｏｌ／Ｌの硫酸を１００μL加えて反応を停止させ、波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を表５に示した。変異型では正常型に比べて明らかに低い吸光度となり本発明の方法により簡便にＴＡリピートの挿入による変異が検出できることがわかった。 Although the number of TA repeats in the promoter region of the glucuronyltransferase (UGT) gene is 6 in the normal type, a mutation has been known in which insertion has occurred and has become 7. This mutation was examined by the method of the present invention. First, a region containing a mutated portion of a gene in the promoter region was amplified by PCR using a biotin-labeled forward primer for mutation detection shown in SEQ ID NO: 7 and a reverse primer shown in SEQ ID NO: 8. After the amplification reaction, 2 mol / L NaOH, 10 μL is added to make the double-stranded nucleic acid a single strand, which is transferred to the well of the microtiter plate on which the capture probe shown in SEQ ID NO: 9 is immobilized, and the pH is reduced to about The mixture was adjusted to 7.5 and allowed to react for 30 minutes at room temperature for hybridization. After the hybridization reaction, the reaction solution was removed and the wells were washed with a phosphate buffer. 100 μL of a horseradish peroxidase-labeled streptavidin solution was added to the well and reacted at room temperature for 20 minutes to remove and wash unreacted labeled avidin. A color reaction was carried out by adding an orthophenylenediamine solution containing hydrogen peroxide as a substrate for peroxidase. After 10 minutes of reaction at 37 ° C., 100 μL of 1 mol / L sulfuric acid was added to stop the reaction, and the absorbance at a wavelength of 492 nm was measured. The results are shown in Table 5. In the mutant type, the absorbance was clearly lower than that in the normal type, and it was found that the mutation due to the insertion of TA repeat can be easily detected by the method of the present invention.
本発明は特定の遺伝子配列、とりわけ遺伝子変異の簡便な検査方法を提供するものであり、遺伝子変異の検査試薬、検査装置及び検査キットとして、臨床検査の分野で用いられる。 The present invention provides a simple testing method for a specific gene sequence, particularly a gene mutation, and is used in the field of clinical testing as a testing reagent, testing device, and testing kit for gene mutation.
１、 被検核酸
２、 検査用プライマー
３、 特定の塩基（変異部位）
４、 プライマー用標識物質
５、 プライマー伸長反応部位
６、 プライマー伸長反応部位に相補配列の捕獲用オリゴヌクレオチドプローブ
７、 固相担体
８、 固相担体へ結合させるためのスペーサー
９、 プライマー伸長が起こらないことを表した記号
１０、プライマー伸長により結合した連鎖終止ヌクレオチド
１１、連鎖終止ヌクレオチドの標識物質に対する結合対
１２、２本鎖被検核酸試料
１３、リバースプライマー
１４、インターカレーション物質
１６、着色標識粒子
１７、多孔性担体
１８、検出用プライマーの標識物質に対する特異的結合対
１９、検出ライン
２０、変異型検出ライン
２１、正常型検出ライン
２２、コントロール検出部位
２３、試料注入口及び捕獲用オリゴヌクレオチドプローブ固定化標識粒子
２４、収納ケース
1, test nucleic acid 2, test primer 3, specific base (mutation site)
4. Primer labeling substance 5, primer extension reaction site 6, oligonucleotide probe 7 for capturing a complementary sequence to the primer extension reaction site, solid phase carrier 8, spacer 9 for binding to the solid phase carrier, primer extension does not occur Symbol 10 indicating that, chain termination nucleotide 11 bound by primer extension, binding pair 12 of chain termination nucleotide to labeling substance, double-stranded test nucleic acid sample 13, reverse primer 14, intercalation substance 16, colored labeling particle 17, porous carrier 18, specific binding pair 19 of detection primer to labeling substance, detection line 20, mutation detection line 21, normal detection line 22, control detection site 23, sample inlet and capture oligonucleotide probe Immobilized marker particles 24, storage case
Claims (11)
A test reagent, a test apparatus, or a test kit used in the test method according to claim 1.
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