【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＡＴＰ結合カセットトランスポーターＡ７（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ａ７、以下ＡＢＣＡ７と称する。）スプライシングバリアントのポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体および該ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドの製造方法、該ポリペプチドを認識する抗体、該ポリヌクレオチドの配列または相補的な配列の一部の配列を有するオリゴヌクレオチドに関する。本発明はまた、該ポリペプチド、該オリゴヌクレオチドおよび該抗体の利用方法、例えば、該ポリペプチド、該オリゴヌクレオチドまたは該抗体を含む医薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＡＴＰ結合カセット（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ）トランスポーター（以下ＡＢＣトランスポーターとする。）ファミリーは、数回細胞膜を貫通する疎水性ドメイン２つと、ファミリー内で保存性の高いＡＴＰと結合するＡＴＰ結合ドメイン２つを有する構造の特徴をもち、細胞における種々の物質のトランスポーターやチャンネルとして機能している蛋白質ファミリーである。
【０００３】
ＡＢＣＡ７は、最近報告されたＡＢＣＡ１と高い相同性を有するＡＢＣトランスポーターである［Ｋａｍｉｎｓｋｉ ＷＥ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２７３， ５３２ （２０００）］。ＡＢＣＡ１が、家族性低密度リポ蛋白欠乏症やタンジェール病の原因遺伝子であり［Ｂｏｄｚｉｏｃｈ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２２， ３４７ （１９９９）；Ｂｒｏｏｋｓ−Ｗｉｌｓｏｎ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２２， ３３６ （１９９９）；Ｒｕｓｔ Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２２， ３５２ （１９９９）］、コレステロールやリン脂質のトランスポーターとして機能していると考えられていること［Ｏｒａｍ Ｊ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５， ３４５０８ （２０００）；Ｗａｎｇ Ｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５， ３３０５３ （２０００）；Ｒｅｐａ ＪＪ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９， １５２４ （２０００）］、マクロファージにアセチル化ＬＤＬを添加するとＡＢＣＡ７の発現量が増加し、ＨＤＬの添加によりその増加がもとに戻ること［Ｋａｍｉｎｓｋｉ ＷＥ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２７３， ５３２ （２０００）］から、ＡＢＣＡ７のコレステロールの輸送への関与も考えられているが、その機能はいまだ不明である。ＡＢＣＡ７のｍＲＮＡレベルでの発現は、胸腺、脾臓、リンパ節、骨髄、末梢白血球などの免疫系の組織に多く、わずかに肺、膵臓、肝臓でも発現していることが報告されている［Ｋａｍｉｎｓｋｉ ＷＥ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２７３， ５３２ （２０００）］。またＡＢＣＡ７遺伝子のゲノム配列も報告されており、ＡＢＣＡ７遺伝子は約３２ｋｂの領域に渡る４６のエキソンからなり、第１９染色体上にあることが報告されている［Ｋａｍｉｎｓｋｉ ＷＥ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２７８， ７８２ （２０００）］。
【０００４】
一方、自己免疫疾患であるシェーグレン病の患者血清と反応する自己抗原のｃＤＮＡとして、ＳＳ−Ｎ ｃＤＮＡ（４７６ｂｐ）が塩基配列データベースＧｅｎＢａｎｋに登録されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＡＦ１４０３４２）が、部分ｃＤＮＡであり、ＳＳ−Ｎ全体の構造は不明だった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、シェーグレン病の自己抗原ＳＳ−Ｎ全体のアミノ酸配列およびそのｃＤＮＡの塩基配列を明らかにし、免疫系に関与する新規なＡＢＣトランスポーターを提供することを解決すべき課題とした。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ＳＳ−Ｎ ｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列がＡＢＣＡ１のＮ末部分と高い相同性を有することを見出し、ＳＳ−Ｎ ｃＤＮＡ全長がコードする新規なＡＢＣトランスポーターのｃＤＮＡを取得した。その結果、得られたｃＤＮＡは、報告されているＡＢＣＡ７ ｃＤＮＡとは同じ遺伝子の産物で配列の異なるオルタナティブ・スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）により生ずるスプライシング・バリアント（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔ）であり、得られたｃＤＮＡがコードするポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端は、報告されているＡＢＣＡ７ポリぺプチドのＮ末端配列とは異なることを見出した。さらに胸腺等の免疫系の組織で主に発現しているのは、報告されているＡＢＣＡ７でなく本発明で得られたスプライシング・バリアントの方であることを見出した。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（２８）の発明に関する。
【０００７】
（１） 配列番号３または６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２） 配列番号３または６に記載のアミノ酸配列に対して、１以上のアミノ酸が欠失、付加、置換および／または挿入したアミノ酸配列からなり、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含み、かつトランスポーター活性を有するポリペプチド。
【０００８】
（３） （１）または（２）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（４） 配列番号１、２、４または５のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（５） 配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、配列番号２または５に記載の塩基配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトランスポーター活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（６） ポリヌクレオチドがＤＮＡである（３）から（５）の何れかに記載のポリヌクレオチド。
【０００９】
（７） （３）から（６）の何れかに記載のポリヌクレオチドをベクターに組み込んで得られる組換えベクター。
（８） （７）に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（９） （８）に記載の形質転換体を培地で培養し、培養物中に（１）または（２）に記載のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、（１）または（２）に記載のポリペプチドの製造方法。
【００１０】
（１０） 配列番号８に記載の塩基配列と相補的な配列の全部または一部からなるポリヌクレオチド断片。
（１１） （１０）に記載のポリヌクレオチド断片を用いて、（３）から（５）の何れかに記載のポリヌクレオチドを検出または定量する方法。
（１２） （３）、（４）または（５）に記載のポリヌクレオチドの塩基配列中または該塩基配列と相補的な配列中の、それぞれ連続した５〜６０塩基の配列と同じ配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその誘導体。
（１３） 配列番号２１または２２に記載の塩基配列からなる（１２）に記載のオリゴヌクレオチドまたはその誘導体。
【００１１】
（１４） （１２）または（１３）に記載のオリゴヌクレオチドまたはその誘導体を用いて、（３）から（５）の何れかに記載のポリヌクレオチドを検出または定量する方法。
（１５） 自己免疫疾患、シェーグレン病、炎症性疾患、脂質代謝の異常疾患、動脈硬化の診断のために行う、（１１）または（１４）に記載の方法。
（１６） （１２）または（１３）に記載のオリゴヌクレオチドまたはその誘導体を用いて、（１）または（２）に記載のポリペプチドの発現を抑制する方法。
【００１２】
（１７） （１）または（２）に記載のポリペプチドを認識する抗体。
（１８） 配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識せず、（１）または（２）に記載のポリペプチドを認識する抗体。
（１９） 抗体が、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する領域を認識する抗体である、（１７）または（１８）に記載の抗体。
（２０） （１）または（２）に記載のポリペプチドのトランスポーター活性を阻害する、（１７）から（１９）の何れかに記載の抗体。
【００１３】
（２１） （１７）から（２０）のいずれかに記載の抗体を用いて（１）または（２）に記載のポリペプチドを検出あるいは定量する方法。
（２２） 細胞内に（１）または（２）に記載のポリペプチドと被験物質とを共存させ、被験物質を共存させない場合よりも共存させた場合に該ポリペプチドのトランスポーター活性が低下する被験物質を選択することを特徴とする、ＡＢＣＡ−ＳＳＮの阻害剤のスクリーニング方法。
（２３） （２２）に記載のスクリーニング方法により得られるＡＢＣＡ−ＳＳＮの阻害剤。
【００１４】
（２４） （１）または（２）に記載のポリペプチドを含有する医薬。
（２５） （１２）または（１３）に記載のオリゴヌクレオチドまたはその誘導体を含有する医薬。
（２６） （１７）から（２０）のいずれかに記載の抗体を含有する医薬。
（２７） 自己免疫疾患、シェーグレン病、炎症性疾患、脂質代謝の異常疾患、動脈硬化の予防または治療薬である（２４）から（２６）のいずれかに記載の医薬。
（２８） 自己免疫疾患、シェーグレン病、炎症性疾患、脂質代謝の異常疾患、動脈硬化の診断薬である（２４）から（２７）のいずれかに記載の医薬。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明のポリペプチドは、下記のいずれかのアミノ酸配列からなることを特徴とする。
（Ａ）配列番号３または６に記載のアミノ酸配列：または
（Ｂ）配列番号３または６に記載のアミノ酸配列に対して、１以上のアミノ酸が欠失、付加、置換および／または挿入したアミノ酸配列からなり、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含み、かつトランスポーター活性を有するポリペプチド。
【００１６】
本発明のポリペプチドの由来は特に限定されず、天然由来のポリペプチドでも、組み換え遺伝子技術を用いて産生した組み換えポリペプチドでも、化学合成したポリペプチドのいずれでもよい。比較的簡単に大量のポリペプチドを入手できるという観点からは、組み換えポリペプチドが好ましい。
配列番号３または６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、本明細書に開示した配列番号３または６に記載のアミノ酸配列の配列情報に基づいて、当業者であれば容易に製造することができる。これらの詳細は、本明細書中の以下の１．および２．に記載されている通りである。
【００１７】
配列番号３または６に記載のアミノ酸配列に対して、１以上のアミノ酸が欠失、付加、置換および／または挿入したアミノ酸配列からなり、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含み、かつトランスポーター活性を有するポリペプチドは、以下に示す方法で該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをまず取得し、本明細書中以下の２．に示す遺伝子組換え技術を利用した方法、すなわち該ポリヌクレオチドを含む発現用ベクターを宿主細胞に導入して得られた形質転換体を培養した培養物より取得することができる。
【００１８】
該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｚｏｌｌｅｒ ＭＪ ＆ Ｓｍｉｔｈ Ｍ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０， ６４８７ （１９８２）、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ Ｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９， ６４０９ （１９８２）、Ｗｅｌｌｓ ＪＡ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ３４， ３１５ （１９８５）、Ｃａｒｔｅｒ Ｐ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３， ４４３１ （１９８５）、Ｋｕｎｋｅｌ ＴＡ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２， ４８８ （１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号３または６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
【００１９】
また目的の変異（欠失、付加、置換および／または挿入）を導入した配列をそれぞれの５’端に持つ１組のプライマーを用いたＰＣＲ［Ｈｏ ＳＮ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ７７， ５１ （１９８９）］によっても、配列番号３または６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに変異を導入することができる。すなわち、まず該ポリヌクレオチドの５’端に対応するセンスプライマーと、５’端に変異の配列と相補的な配列を有する、変異導入部位の直前（５’側）の配列に対応するアンチセンスプライマーで該ポリヌクレオチドを鋳型にしてＰＣＲを行い、該ポリヌクレオチドの５’端から変異導入部位までの断片Ａ（その３’端に変異が導入されている）を増幅する。次いで、５’端に変異の配列を有する、変異導入部位の直後（３’側）の配列に対応するセンスプライマーと、該ポリヌクレオチドの３’端に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、５’端に変異が導入された該ポリヌクレオチドの変異導入部位から３’端までの断片Ｂを増幅する。これらの増幅断片同士精製後、混合して鋳型やプライマーを加えずにＰＣＲを行うと、増幅断片Ａのセンス鎖と増幅断片Ｂのアンチセンス鎖は変異導入部位が共通しているのでハイブリダイズし、プライマー兼鋳型としてＰＣＲの反応が進行し、変異が導入された該ポリヌクレオチドが増幅する。
【００２０】
また欠失変異体の一種である配列番号３または６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分断片をコードするポリヌクレオチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中の作製したい部分断片をコードする領域の５’端の塩基配列と一致する配列を有するオリゴヌクレオチドおよび３’端の塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを鋳型にしたＰＣＲを行うことにより取得できる。
【００２１】
欠失、付加、置換および／または挿入されるアミノ酸の数は特に限定されず、１以上の任意の数であればよいが、上記の部位特異的変異法やＰＣＲ等の周知の方法により欠失、付加、置換および／または挿入できる程度の数であることが好ましく、一般的には１個から１００個程度であり、好ましくは１から数十個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。
【００２２】
また、本発明のポリペプチドがトランスポーター活性を有するためには、配列番号３または６に記載のアミノ酸配列との相同性がＢＬＡＳＴ［Ａｌｔｚｓｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５， ４０３ （１９９０）］やＦＡＳＴＡ［Ｐｅａｒｓｏｎ ＷＲ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８３， ６３ （１９９０）］等の解析プログラムでデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上であることが好ましい。
ただし、本発明のポリペプチドには、公知のポリペプチドは含まれない。
【００２３】
本発明で言う「トランスポーター活性」とは、細胞膜上で特定の物質と結合し、該物質を、細胞の中から外へ輸送し排出する活性をいう。
【００２４】
配列番号３または６のアミノ酸配列に対して、１以上のアミノ酸が欠失、付加、置換および／または挿入したアミノ酸配列からなり、配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチドが、トランスポーター活性を有するかどうかは、例えば、以下の方法により分析することができる。
先ず、後述する方法により組換え遺伝子技術を用いて該ポリペプチドを細胞膜上に発現させた細胞、好ましくは動物細胞を作製する。この細胞に対して、輸送すると考えられる物質、例えばコレステロールやリン脂質を、３Ｈや１４Ｃ等の放射性同位元素で標識したものを１０〜１００ｋＢｑ／ｍＬ程度の濃度で添加して、１６〜２４時間培養することにより、細胞に取り込ませる。培養後、細胞を洗浄し、輸送すると考えられる物質を含まない培地で６〜７２時間培養し、経時的に一定量の細胞および培地を採取し、その放射能を液体シンチレーションカウンター等の放射能測定器で測定する。細胞内に取り込まれた放射能量に対する培地中の放射能量の割合をトランスポーター活性として分析する。
【００２５】
本発明はまた、上記した本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供するものである。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの具体例として、下記の何れかのポリヌクレオチドが挙げられる。
（Ａ）配列番号１、２、４または５のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド：
（Ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、配列番号２または５に記載の塩基配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトランスポーター活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２６】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号２または配列番号５に記載の塩基配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
【００２７】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ａｕｓｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９８７−１９９７）、Ｇｌｏｖｅｒ ＤＭ ａｎｄ Ｈａｍｅｓ ＢＤ， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １： Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２８】
ポリヌクレオチドが配列番号２または５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつトランスポーター活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであるためには、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等の解析プログラムでデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、配列番号２または５に記載の塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドであることが望ましい。
【００２９】
ただし、本発明のポリヌクレオチドには、公知のポリヌクレオチドは含まれない。
本発明のポリヌクレオチドの核酸の種類としてはＤＮＡまたはＲＮＡを挙げることができる。また本発明のポリヌクレオチドは１本鎖でも２本鎖でもよく、両者が含まれる。
【００３０】
以下に本発明の実施方法および利用方法について詳細に説明する
１．本発明のポリヌクレオチドの調製
本発明のポリヌクレオチドとしてＡＢＣＡ−ＳＳＮ 全長ｃＤＮＡをあげることができる。なお、本明細書における全長ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡには、キャップ構造およびポリ（Ａ）鎖を有する完全長ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｍＲＮＡに由来する完全長ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡの他に、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ全体、すなわち配列番号３または６に記載のアミノ酸配列をコードするオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を有するｃＤＮＡを全て含むものとする。全長ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡは以下のようにして調製することができる。
【００３１】
（１）ＡＢＣＡ−ＳＳＮ全長ｃＤＮＡの調製
ＡＢＣＡ−ＳＳＮのｃＤＮＡは塩基配列データベースに対し、ＢＬＡＳＴ等の相同性解析プログラムを用いて、ＳＳ−Ｎ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＡＦ１４０３４２）の塩基配列と一致する配列を有する塩基配列を検索する。塩基配列データベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋ等の公的なデータベースの他、本発明のように、あらかじめｃＤＮＡライブラリーを構築し、各クローンの塩基配列を決定して集積することにより作成した私的なデータベースも利用することができる。このような塩基配列としては、かずさＤＮＡ研究所の保有するヒト長鎖ｃＤＮＡクローンの塩基配列データベースから検索されたｃＤＮＡクローンｈｈ１０２１０の塩基配列、ＡＢＣＡ７の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＦ２５０２３８）をあげることができる。検索の結果得られた塩基配列のもととなったｃＤＮＡクローン、例えばｈｈ１０２１０を入手するか、または配列情報を利用したＰＣＲにより、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡを得ることができる。
【００３２】
以下に、ｃＤＮＡライブラリーの作製法について述べる。ｃＤＮＡライブラリーを作製するために、適切な細胞または組織より全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡを調製する。適切な細胞または組織として、ヒトの胸腺、マクロファージ、脾臓、脳などをあげることができる。全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １５４， ３ （１９８７）］、酸性グアニジンチオシアネート・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法［Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ Ｐ ａｎｄ Ｓａｃｃｉ Ｎ， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １６２， １５６ （１９８７）、実験医学 ９， １９３７ （１９９１）］等を用いることができる。全ＲＮＡからポリ（Ａ）＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法として、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）やオリゴｄＴラテックスを用いる方法等を用いることができる。また、ファースト・トラック・ｍＲＮＡ単離キット［Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製］、クイック・プレップ・ｍＲＮＡ精製キット［Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製］等のキットを用いて組織や細胞から直接ｍＲＮＡを調製することもできる。
【００３３】
得られた全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡを用い、常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリーの作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版やＡｕｓｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９８７−１９９７）、Ｇｌｏｖｅｒ ＤＭ ａｎｄ Ｈａｍｅｓ ＢＤ， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １： Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９５）、Ｏｈａｒａ Ｏ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ Ｒｅｓ． ４， ５３ （１９９７）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばスーパースクリプト・プラスミド・システム・フォー・ｃＤＮＡ・シンセシス・アンド・プラスミド・クローニング［ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製］やザップ−ｃＤＮＡ ・シンセシス・キット〔ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）社製〕を用いる方法等をあげることができる。
【００３４】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。
具体的には、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）［ストラタジーン社製；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ ＭＡ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔ ＪＭ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７， ９４９４ （１９８９）］、Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩ（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［Ｇｌｏｖｅｒ ＤＭ， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， １， ４９ （１９８５）］等を挙げることができる。
【００３５】
宿主微生物としては、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに属する微生物を用いることが好ましい。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（ストラタジーン社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＯＬＲＴＭ（ストラタジーン社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ（ライフ・テクノロジーズ社）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０８８［Ｙｏｕｎｇ ＲＡ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ ＲＷ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２， ７７８ （１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０９０［Ｙｏｕｎｇ ＲＡ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ ＲＷ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２， ７７８ （１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ライフ・テクノロジーズ社）等を用いることができる。
【００３６】
上記方法により作製したｃＤＮＡライブラリーに加え、市販のｃＤＮＡライブラリーも利用することができる。市販のｃＤＮＡライブラリーとしては、クローンテック社、宝酒造株式会社等のヒト胸腺ｃＤＮＡライブラリーをあげることができる。
得られたｃＤＮＡの塩基配列は、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社やアマシャム・ファルマシア・バイオテク社、ライコア（ＬＩ−ＣＯＲ）社製のＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製３７７など）やジデオキシ法［Ｓａｎｇｅｒ Ｆ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７４， ５４６３ （１９７７）］により確認することができる。
【００３７】
また別法として、配列情報を利用したＰＣＲ［Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｔ ａｌ．， ＰＣＲ， Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９１）］によりＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡを得るには、まず、得られた塩基配列情報のもととなったｃＤＮＡクローンが単離された組織や細胞、例えばヒト胸腺、脾臓、脳、マクロファージなどから一本鎖ｃＤＮＡあるいは上記の方法でｃＤＮＡライブラリーを調製する。一本鎖ｃＤＮＡは、上記ｃＤＮＡライブラリーの作製法に記載した方法で全ＲＮＡを調製し、さらに必要に応じて、全ＲＮＡをデオキシリボヌクレアーゼＩ（ライフ・テクノロジーズ社製）で処理し、混入の可能性がある染色体ＤＮＡを分解する。得られた全ＲＮＡに対し、オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはランダムプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ用スーパースクリプト・ファースト・ストランド・システム（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ；ライフ・テクノロジーズ社）等のキットを利用することにより一本鎖ｃＤＮＡを作製する。次いで、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡの塩基配列情報の５’端から１０〜３０塩基の配列を有するオリゴＤＮＡおよび３’端から１０〜３０塩基の配列と相補的な配列を有するオリゴＤＮＡをプライマーにして、該一本鎖ｃＤＮＡあるいは該ｃＤＮＡライブラリーをテンプレートにしたＰＣＲを行うことにより、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡを増幅し単離することができる。オリゴＤＮＡはアプライドバイオシステムズ社のＡＢＩ３９２、ＡＢＩ３９４８等のＤＮＡ合成機で合成できる。また、ジェンセット（ＧＥＮＳＥＴ）社や宝酒造株式会社等に合成を依頼することもできる。
【００３８】
以上のようにして得られたＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡが全長でないと考えられる場合は、上記と同様にして調製したヒト胸腺等のｃＤＮＡライブラリーをテンプレートにし、得られたＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡの５’側の配列と相補的な配列を有するオリゴＤＮＡおよびライブラリーのクローニングサイトよりも５’側の配列を有するオリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行うことにより、最初に得られたｃＤＮＡより５’側のｃＤＮＡ断片を得ることができる。得られたＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡの３’側の配列を有するオリゴＤＮＡおよびライブラリーのクローニングサイトより３’側の配列と相補的な配列を有するオリゴＤＮＡをプライマーとして同様に該ｃＤＮＡライブラリーをテンプレートにしてＰＣＲを行うことにより最初に得られたｃＤＮＡより３’側のｃＤＮＡ断片を得ることができる。あるいはヒト胸腺等よりｃＤＮＡを調製し、そのｃＤＮＡの両端にアダプターオリゴＤＮＡを付加し、このアダプターの塩基配列と最初に得られたｃＤＮＡの塩基配列に基づいたプライマーでＰＣＲを行う５’−ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法および３’−ＲＡＣＥ法［Ｆｒｏｈｍａｎ ＭＡ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５， ８９９８ （１９８８）］によっても、プライマーに用いた配列よりも５’側および３’側のｃＤＮＡ断片を得ることができる。
【００３９】
このようにして得られた５’側あるいは３’側のｃＤＮＡ断片の塩基配列を最初に得られたｃＤＮＡと同様に決定することにより、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ全体をコードするｃＤＮＡの塩基配列を明らかにすることができる。このようにして明らかになったＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡの塩基配列として配列番号１または４に示す配列をあげることができる。これらの配列は、公知のＡＢＣＡ７ ｃＤＮＡの塩基配列に配列番号８に示す塩基配列が挿入されたスプライシング・バリアントである。このようにして明らかになったＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡの塩基配列をアミノ酸に翻訳することにより、該ｃＤＮＡがコードするＡＢＣＡ−ＳＳＮのアミノ酸配列を明らかにすることができる。このようにして明らかになったＡＢＣＡ−ＳＳＮのアミノ酸配列として配列番号３または６に示す配列をあげることができる。また、ＡＢＣＡ−ＳＳＮをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１、２、４または５のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドをあげることができる。なお、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ全体のアミノ酸配列をコードしていれば、ＡＢＣＡ−ＳＳＮをコードしている領域の各コドンの塩基配列はｃＤＮＡで用いられているコドンに限られるものではなく、同じアミノ酸をコードするあらゆるコドンの塩基配列を用いることができる。
【００４０】
上記で得られたｃＤＮＡを適当な制限酵素サイト等を利用してつなぎあわせるか、あるいは明らかになったＡＢＣＡ−ＳＳＮ全長ｃＤＮＡの５’側の配列を有するオリゴＤＮＡおよび３’側の配列塩基配列に基づいたプライマーを用いて、ＡＢＣＡ−ＳＳＮを発現している組織、たとえばヒト胸腺等から調製したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことによりＡＢＣＡ−ＳＳＮ全長ｃＤＮＡを調製することができる。また、このようにして得られたＡＢＣＡ−ＳＳＮ全長ｃＤＮＡを、適当なクローニングベクターにクローン化したＡＢＣＡ−ＳＳＮ全長ｃＤＮＡクローンを用いて大腸菌を形質転換し、該形質転換体大腸菌を培養し、そこからプラスミドＤＮＡを調製することにより、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ全長ｃＤＮＡを調製することができる。
【００４１】
このようにして得られた配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡをベクターｐＣＲ２．１（ストラタジーン社製）に挿入したプラスミドであるｐＡＢＣＡ−ＳＳＮ／ＣＲ２．１は、平成１３年５月１５日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にＦＥＲＭ ＢＰ−７５８７として寄託されている。
あるいは、またＡＢＣＡ−ＳＳＮ全長ｃＤＮＡをその塩基配列に基づいて、上に記載したＤＮＡ合成機で化学合成することもできる。
【００４２】
（２）他の生物のＡＢＣＡ−ＳＳＮをコードするＤＮＡの取得
一般に同じ機能を持つ蛋白質は、生物種が異なった場合、同一ではないが相同性を示すアミノ酸配列を有する場合が多い。したがってその蛋白質をコードするＤＮＡも同様に相同性を示すと考えられる。また、生物の進化に伴い遺伝子の変異も進むため、その生物種が系統的に近いほど、その相同性は高いと考えられる。従って、（１）で得られたヒトＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡあるいはその塩基配列情報を用いることにより、以下に示す方法で、他の哺乳類、例えばマウスのＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡを取得することができる。このｃＤＮＡが全長ｃＤＮＡでない場合は、（１）と同様の方法を用いることにより全長ｃＤＮＡを得ることができる。
【００４３】
（２−１）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ヒト以外の生物のＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡクローンは、該生物における、ヒトＡＢＣＡ−ＳＳＮが発現しているのと同じ組織例えば胸腺、マクロファージ、脾臓、脳等の組織から（１）と同様にしてｃＤＮＡライブラリーを作製するか、そのような組織の市販のｃＤＮＡライブラリーを購入し、当該ｃＤＮＡライブラリーから、ヒトＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡを放射性同位体やジギキシゲニン等で標識したものをプローブにして、ややストリンジェントな条件でコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを行なうことにより、取得することができる。ここでいうややストリンジェントな条件とは、ヒトＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡと該生物のＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡの相同性の程度によって異なるが、制限酵素切断した該生物の染色体ＤＮＡに対してヒトＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡをプローブにして、ストリンジェントな度合いが異なるいくつかのハイブリダイズ条件でサザンブロットハイブリダイゼーションを行い、明確なバンドが見える条件のうち最もストリンジェントな条件を用いる。例えばホルムアミドを含まないハイブリダイズ液の場合、ハイブリダイズ液の組成は塩濃度を１ｍｏｌ／Ｌに固定し、ハイブリダイズ温度を６８℃〜４２℃で段階的に変えたいくつかの条件下でハイブリダイズを行い、ハイブリダイズと同じ温度で０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む２×ＳＳＣで洗浄を行ってみて決める。あるいはホルムアミドを含むハイブリダイズ液の場合、温度４２℃と塩濃度（６×ＳＳＣ）を固定し、ホルムアミド濃度を５０〜０％で段階的に変えたいくつかの条件下でハイブリダイズを行い、５０℃で０．５％ＳＤＳを含む６×ＳＳＣで洗浄を行ってみて決める。
【００４４】
（２−２）ＥＳＴおよびゲノム塩基配列の利用
（１）で得られたヒトＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡの塩基配列、特に蛋白質をコードしている領域と高い（具体的には８０％以上の）相同性をもつ該生物のＤＮＡの塩基配列をＧｅｎＢａｎｋ等の塩基配列データベースからＢＬＡＳＴ等の相同性プログラムを用いて検索することにより、該生物のＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡ由来と推定されるＥＳＴあるいはＡＢＣＡ−ＳＳＮ遺伝子のエキソン部分を含むゲノムＤＮＡの塩基配列を見出すことができる。このような塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＦ２１３３９５やＢＢ４４６６８８、ＢＢ１２２３７８のマウスＥＳＴや部分ｃＤＮＡ配列をあげることができる。これらの配列のもととなったｃＤＮＡクローンを入手するか、これらの配列に基いたプライマーを作製し、ＡＢＣＡ−ＳＳＮが発現していると考えられる該生物の胸腺、マクロファージ、脾臓、脳等の組織から調製したＲＮＡから（１）と同様のＲＴ−ＰＣＲを行いＤＮＡ断片を増幅することにより、該生物のＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡを得ることができる。またこのｃＤＮＡが全長でなくても、このｃＤＮＡをプローブして非常にストリンジェントな条件（例えば、６×ＳＳＣ−０．５％ＳＤＳ−５×デンハルト溶液を含む溶液中で６５℃でハイブリダイズさせ、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで６５℃で洗浄する条件。）で該生物の胸腺、マクロファージ、脾臓、脳等の組織から調製したｃＤＮＡライブラリーを、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションなどによってスクリーニングすることにより、該生物のＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡクローンを取得することができる。
【００４５】
（３）ＡＢＣＡ−ＳＳＮオリゴヌクレオチドの調製
（１）に記載のＤＮＡ合成機により、本発明のＡＢＣＡ−ＳＳＮポリヌクレオチドの一部の配列を有するオリゴヌクレオチドあるいはこれと相補的な塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（以下、ＡＢＣＡ−ＳＳＮオリゴヌクレオチドと略記する）を調製することができる。
ＡＢＣＡ−ＳＳＮオリゴヌクレオチドとしては、具体的には、配列番号１または４に記載の塩基配列中の連続した１０〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができる。これらのＤＮＡをセンスプライマーまたはアンチセンスプライマーとして用いる場合には、融解温度および塩基数が極端に変わることのないオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００４６】
更に、これらオリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。
該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる［横山和尚， 細胞工学， １６， １４６３ （１９９７）］。
【００４７】
２．ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドの製造法
本発明のポリペプチドであるＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドは、モレキュラー・クローニング第２版、Ｇｌｏｖｅｒ ＤＭ ａｎｄ Ｈａｍｅｓ ＢＤ；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １： Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９５）等に記載された遺伝子組換え法により、１．で調製したＡＢＣＡ−ＳＳＮをコードするポリヌクレオチドを用いて製造することができる。
すなわち、ＡＢＣＡ−ＳＳＮをコードするポリヌクレオチドであるＡＢＣＡ−ＳＳＮをコードするＤＮＡ（以下、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡと略す。）を適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを作製し、該ベクターを宿主細胞に導入することにより、ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを発現する形質転換体を取得し、該形質転換体を培養することにより、本発明のＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを製造することができる。
【００４８】
発現ベクターとしては、宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、宿主細胞中でＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡからｍＲＮＡを転写できるプロモーターを含有しているものが用いられる。
宿主細胞としては、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。また、動物個体や植物個体を用いることができる。
【００４９】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、発現ベクターは宿主原核生物中で自律複製可能であり、リボソーム結合配列を有するプロモーターの下流にＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡが配置されたものを用いる。リボソーム結合配列と開始コドンとの間は適当な距離（例えば、大腸菌宿主のベクターの場合６〜１８塩基）に調節されていることが好ましい。必ずしも必要ではないが、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡの直下に転写終結配列を配置する方が好ましい。また、形質転換体の選択のため、薬剤耐性遺伝子等のマーカーとなる遺伝子を発現する配列を含むようにする。
【００５０】
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば大腸菌を宿主とした場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター等をあげることができる。またｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７ｌａｃプロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。枯草菌を宿主とした場合は、枯草菌のファージであるＳＰＯ１やＳＰＯ２のプロモーター、ＰｅｎＰプロモーター等をあげることができる。
【００５１】
発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＥ２８０［インビトロジェン社製］、ｐＧＥＭＥＸ−１［プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製］、ｐＱＥ−８［キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製］、ｐＫＹＰ２００［Ｎｉｓｈｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ４８， ６６９ （１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ｎｉｓｈｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ５３， ２７７ （１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｓｅｋｉｎｅ Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２， ４３０６ （１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）［ストラタジーン社製）、ｐＫＫ２２３−３（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＥＴ１４［ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製］等を例示することができる。
【００５２】
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｄ−０１１０等をあげることができる。
【００５３】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｄｏｗｅｒ ＷＪ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６， ６１２７ （１９８８）］、カルシウムイオンを用いる方法［Ｃｏｈｅｎ ＳＮ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６９， ２１１０ （１９７２）、Ｒｅｉｄ ＪＤ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ １７， １０７ （１９８２）］、プロトプラスト法［特開昭６３−２４８３９４、Ｃｈａｎ Ｓ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ ＳＮ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １６８， １１１ （１９７９）］等をあげることができる。
【００５４】
酵母を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターとしては、宿主酵母で転写を行なうプロモーター、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡ、転写の終止配列および酵母での形質転換マーカーとなる遺伝子、たとえば薬剤耐性遺伝子やＴＲＰ１、ＨＩＳ３、ＬＵＥ２等のアミノ酸合成系の遺伝子を発現できる配列を含有しているものが用いられる。また、発現ベクターの作製や維持を容易にするため、大腸菌内でも自律複製と遺伝子導入マーカーとなる薬剤耐性遺伝子を発現できるものが好ましい。
【００５５】
プロモーターとしては、酵母中で転写を行なえるものであればいずれのものを用いてもよく、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ＡＤＨ１、ガラクトース代謝系遺伝子ＧＡＬ１やＧＡＬ１０等のプロモーター、酸性フォスファターゼ遺伝子ＰＨＯ５プロモーター、フォスフォグリセレートキナーゼ遺伝子ＰＧＫプロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ＧＡＰプロモーター、ヒートショック蛋白質遺伝子プロモーター、α接合因子遺伝子ＭＦα１プロモーター、銅メタロチオネイン遺伝子ＣＵＰ１プロモーター、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのアルコールオキシダーゼ遺伝子ＡＯＸ１のプロモーター等が用いられる。
【００５６】
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピヒア属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ等をあげることができる。
【００５７】
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｂｅｃｋｅｒ ＤＭ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ Ｌ， Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９４， １８２ （１９９１）］、スフェロプラスト法［Ｓｈｏｒｔｌｅ Ｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１， ４８８９ （１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｉｔｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５３， １６３ （１９８３）］等をあげることができる。
【００５８】
動物細胞を宿主として用いる場合の発現ベクターとしては、宿主動物細胞で転写を行なうプロモーター、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡ、転写の終止と転写物のポリアデニル化のシグナルの配列を含有しているものが用いられる。またベクターの作製や維持を容易にするため、大腸菌内でも自律複製と遺伝子導入マーカーとなる薬剤耐性遺伝子を発現できるものが望ましい。プロモーターとしては、動物細胞中で転写を行なえるものであればいずれも用いることができるが、ＳＶ４０の初期プロモーター、ヒトサイトメガロウイルスのＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー、ラウス肉腫ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、モロニーマウス白血病ウイルス等のレトロウイルスのＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）等のウイルス由来の配列、あるいはメタロチオネイン遺伝子やβ−アクチン遺伝子、伸長因子−１などの動物細胞由来の遺伝子のプロモーター等をあげることができる。またＳＶ４０の初期プロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルスＩのＬＴＲを組み合わせたＳＲαプロモーター等これらのプロモーターを人為的に組み合わせたプロモーターも用いられる。
【００５９】
宿主染色体ＤＮＡにＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡが組み込まれた恒常的なＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチド発現細胞は、Ｇ４１８、ハイグロマイシン等の薬剤に対する耐性遺伝子を発現できる配列を含むＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチド発現ベクターを宿主細胞に導入し、薬剤の存在下で培養することにより選択することができる。また、宿主細胞中でのＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドの生産量を上昇させるために、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を発現できるような配列を含むＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドの恒常的発現ベクターを宿主細胞に導入し、ｄｈｆｒ阻害剤であるメトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）の濃度を段階的に上げながら培養することにより、ｄｆｈｒ遺伝子とともにＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡのコピー数を増幅させることもできる。このｄｈｆｒ遺伝子を用いた遺伝子増幅を行なう場合の宿主細胞としては、ｄｈｆｒ遺伝子が機能していない細胞、例えばＣＨＯ／ｄｈｆｒ−（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−９０９６）などを用いる。
【００６０】
上記のＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチド発現ベクターの作製に用いられる具体的なベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２（クローンテック社製）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９、Ｍｉｙａｊｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３， １３３ （１９９０）］、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８［Ｓｅｅｄ Ｂ， Ｎａｔｕｒｅ ３２９， ８４０ （１９８７）］、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＢＫ−ＲＳＶ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＡＭｏ［Ｓａｓａｋｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８， ２２７８２ （１９９３）］、ｐＣＭＶ６Ｃ［ＡＴＣＣ番号：８７７８２、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６４， ８２２２ （１９８９）］等があげられる。
【００６１】
宿主細胞としては、ヒト細胞であるＨｅＬａ、ナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）、ＨＥＫ２９３（ＣＲＬ−１５７３）、アフリカミドリザル腎臓細胞であるＣＯＳ−１やＣＯＳ−７、ハムスターの細胞であるＣＨＯやＢＨＫ、マウス胎児細胞であるＮＩＨ３Ｔ３、マウス・ミエローマ細胞であるＳＰ２／０やＮＳ０、ラット・ミエローマ細胞であるＹＢ２／０等の細胞株をあげることができる。
【００６２】
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｉｙａｊｉ Ｈ ｅｔ ａｌ， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３， １３３ （１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｆｅｌｇｎｅｒ ＰＬ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４， ７４１３ （１９８７）］等をあげることができる。
【００６３】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合は、バキュロウイルス発現系［Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ＤＲ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９２）、Ｌｕｃｋｏｗ ＶＡ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ ＭＤ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６， ４７ （１９８８）］が用いられる。即ち、トランスファーベクターと呼ばれるベクターにＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡを挿入した後、該ベクターとバキュロウイルスを昆虫細胞に同時に導入し、強力なプロモーターであるポリヘドリン遺伝子プロモーター下にＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡが挿入された組換えバキュロウイルスを相同組換えによって作製した後、この組換えバキュロウイルスを再度昆虫細胞に感染させることにより、ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを発現することができる。
【００６４】
バキュロウイルスとしてはＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ 核多角体病ウイルス、カイコ核多角体病ウイルス等が用いられる。昆虫細胞としてはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞であるＳｆ９およびＳｆ２１［Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ＤＲ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの細胞であるＨｉｇｈ５（インビトロジェン社製）等を用いることができる。また、カイコ幼虫体をそのまま用いることもできる。トランスファーベクターには、ポリヘドリンプロモーターおよび相同組換えを起こさせるためのバキュロウイルス由来の配列、ベクターの維持・増殖や外来遺伝子の組み込み等の遺伝子操作を大腸菌内で行なうための配列（大腸菌での自律複製可能な配列および薬剤耐性遺伝子）が含まれており、具体的にはｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅ４．５（ともにインビトロジェン社製）等があげられる。
【００６５】
動物個体を用いてＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを生産することもできる。例えば、公知の方法［Ｃｏｌｍａｎ Ａ．， Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ． ６３， ６３９Ｓ （１９９６）、Ｒｏｓｅｎ ＪＭ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ．， ６３， ６２７Ｓ （１９９６）、Ｗｒｉｇｈｔ Ｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９， ８３０ （１９９１）］に準じて、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡを導入した動物中にＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを生産することができる。
【００６６】
プロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
【００６７】
植物細胞または植物個体を宿主として用いる場合には、公知の方法［井沢毅， 組織培養， ２０， ６ （１９９４）、橋本隆， 組織培養， ２１， １４ （１９９５）、Ｍｉｅｌｅ Ｌ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５， ４５ （１９９７）］に準じてＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを生産することができる。
【００６８】
ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドの発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。また、プロモーターとＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡとの間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１等を挿入することにより、ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドの発現効率をあげることもできる。
宿主細胞としては、ポテト、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞等をあげることができる。
【００６９】
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エレクトロポレーション法［Ｍｉｙａｊｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ３， １３３ （１９９０）］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法等をあげることができる。
ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡを導入した植物の細胞や器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。また、遺伝子導入した植物細胞を再分化させることにより、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡが導入された植物個体（トランスジェニック植物）を造成することもできる。
【００７０】
ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物よりＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを採取することにより、ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを製造することができる。
動物細胞を宿主とした形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されている動物細胞の培養ができる培地であればいずれも用いることができ、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｊ． Ａｍ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ． １９９， ５１９ （１９６７）］、イーグル（Ｅａｇｌｅ）の最小必須培地［ＭＥＭ；Ｅａｇｌｅ Ｈ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １２２， ５０１ （１９５２）］、ダルベッコ（Ｄａｌｂｅｃｃｏ）改変イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地［ＤＭＥＭ；Ｄａｌｂｅｃｃｏ Ｒ ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ Ｇ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８， ３９６ （１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．， ７３， １ （１９５０）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。必要に応じてペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
【００７１】
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＭＮ−ＦＨ培地［ＢＤファーミンジェン社（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）製］、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地［ライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製］、ＥＸ−ＣＥＬＬ４００、ＥＸ−ＣＥＬＬ４０５［いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ社（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）製］、グレース（Ｇｒａｃｅ）の昆虫培地［Ｇｒａｃｅ ＴＤＣ， Ｎａｔｕｒｅ １９５， ７８８ （１９６２）］等を用いることができる。培養条件は、ｐＨ６〜７、培養温度２５〜３０℃がよく、培養時間は、通常１〜５日間である。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００７２】
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを生成蓄積させ、該動物個体または植物個体よりＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを採取することにより、ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを製造することができる。
【００７３】
すなわち、動物個体の場合、例えば、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該組換え体ＤＮＡのコードするＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中よりＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを採取することにより、ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、卵等をあげることができる。
【００７４】
植物個体の場合、例えば、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを該植物中に生成蓄積させ、該植物中よりＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを採取することにより、ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを製造することができる。
【００７５】
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
【００７６】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【００７７】
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養期間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。必要に応じて、培養期間中にアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００７８】
上記形質転換体の培養物中に蓄積したＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを単離精製するには、以下のような通常のポリペプチドの単離精製法を用いればよい。
ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドが細胞外に分泌される場合には、培地中にＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドが蓄積する。従って培養終了後、遠心分離等の手法により細胞を含まない培地のみを回収する。該培地から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ＤＥＡＥセファロース、ダイヤイオン（ＤＩＡＩＯＮ）ＨＰＡ−７５（三菱化学株式会社製）、Ｍｏｎｏ−Ｑ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、ＳＰセファロース（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子ふるいを用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法や等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００７９】
ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドが、形質転換体の細胞内に蓄積する場合には、培養終了後の培養物から、形質転換体の細胞を遠心分離等の手法により回収し、緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドが細胞内で溶解状態で存在する場合には、該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、上記の培地からの精製単離と同様にして精製標品を得ることができる。また、ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドが細胞膜上や細胞内に不溶体を形成して存在する場合は、該無細胞抽出液を遠心分離後、沈殿画分としてＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドの細胞膜あるいは不溶体を回収する。このＢＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドの細胞膜あるいは不溶体を蛋白質変性剤で可溶化した後、該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈あるいは透析し、ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを正常な立体構造に復元させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【００８０】
また、公知の方法［Ｋｉｇａｗａ Ｔ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． ＮＭＲ， ６， １２９ （１９９８）、Ｓｐｉｒｉｎ Ａ．Ｓ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２， １１６２ （１９８８）、Ｋｉｇａｗａ Ｔ． ＆ Ｙｏｋｏｙａｍａ Ｓ．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １１０， １６６ （１９９１）］に準じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いてＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを生産することができる。すなわち、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡをＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３等のプロモーターの下流につなげ、それぞれのプロモーター特異的なＲＮＡポリメラーゼを反応させることにより大量のＡＢＣＡ−ＳＳＮをコードするＲＮＡをインビトロで合成した後、無細胞系の翻訳系例えばウサギ網状赤血球ライセートやコムギ胚芽抽出液を用いた翻訳系を利用して、ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを生産することができる。
精製したＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドの構造解析は、蛋白質化学で通常用いられる方法、例えば「遺伝子クローニングのための蛋白質構造解析」［平野久， 東京化学同人 （１９９３）］に記載の方法により実施可能である。
【００８１】
３．ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを認識する抗体の調製
ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを認識する抗体としては、ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体をあげることができる。
【００８２】
（１）ポリクローナル抗体の調製
上記２．に記載の方法により取得したＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドの全長または部分断片蛋白質、あるいはペプチド合成機による化学合成法等により製造したＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドの部分ペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
免疫する方法としては、動物の皮下、静脈内または腹腔内に適当なアジュバンドとともに抗原を投与することが好ましい。アジュバンドとしては、フロイントの完全アジュバンド（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）、水酸化アルミニウムと百日咳菌ワクチン等があげられる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜２００μｇが好ましい。
部分ペプチドを抗原として用いる場合は、該部分ペプチドをＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）や牛チログロブリン等のキャリア蛋白に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。
【００８３】
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法［石川栄治， 酵素免疫測定法， 医学書院 （１９７８）、Ｈａｒｌｏｗ Ｅ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｄ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８８）］等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、該血清が充分な抗体価を示した非ヒトほ乳動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
【００８４】
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿［Ｈａｒｌｏｗ Ｅ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｄ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８８）］、またはＤＥＡＥセファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡカラムやプロテインＧカラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
公知のＡＢＣＡ７ポリペプチドを認識せず、本発明のポリペプチドを認識する抗体は、本発明のポリペプチドに特異的なアミノ酸配列、例えば配列番号９に記載のアミノ酸配列中の連続した３個以上のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として上記の方法で動物を免疫することにより作製することができる。
【００８５】
（２）モノクローナル抗体の調製
ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを認識するモノクローナル抗体は、以下のようにして調製することができる。
（２−１）抗体産生細胞の調製
上記（１）において、免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。該脾臓をＭＥＭ中で細断し、ピンセットでほぐし、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、最小必須培地（ＭＥＭ）で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
【００８６】
（２−２）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１［Ｙｅｌｔｏｎ ＤＥ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８１， １ （１９７８）、Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６， ５１１ （１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４［Ｓｈｕｌｍａｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２７６， ２６９ （１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−８６５３［Ｓｅｅｇｅｒ ＲＣ ｅｔａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２３， １５４８ （１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ［Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５ （１９７５）］等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ１６４０培地に１．５ｍｍｏｌ／Ｌ グルタミン、５×１０−５ｍｍｏｌ／Ｌ ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍＬ ゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに１５μｇ／ｍＬ ８−アザグアニンを加えた培地］で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。
【００８７】
（２−３）ハイブリドーマの作製
（２−１）で取得した抗体産生細胞と（２−２）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭまたはＰＢＳ（１．８３ｇ／Ｌ リン酸水素二ナトリウム、０．２１ｇ／Ｌ リン酸二水素カリウム、７．６５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に１０８抗体産生細胞あたりポリエチレングリコール−１０００ ２ｇ、ＭＥＭ ２ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．７ｍＬを混合した溶液を３７℃で０．２〜１ｍＬ攪拌しながら添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ１〜２ｍＬを数回添加する。添加後、ＭＥＭを加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。
【００８８】
得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地［正常培地に１０−４ｍｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン、１．５×１０−５ｍｍｏｌ／Ｌチミジンおよび４×１０−７ｍｍｏｌ／Ｌアミノプテリンを加えた培地］１００ｍＬ中に懸濁する。該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μＬ／穴ずつ分注し、５％ ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとりＨａｒｌｏｗ Ｅ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｄ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８８） Ｃｈａｐｔｅｒ１４等に述べられている酵素免疫測定法により、上記抗体産生細胞を取得するために、免疫に用いた抗原に特異的に反応するハイブリドーマを選択する。酵素免疫測定法の具体的例として、以下の方法をあげることができる。
【００８９】
免疫の際、抗原に用いた本発明の蛋白質の全長または部分断片精製標品あるいは部分ペプチドを適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（２−４）で得られる精製抗体を一次抗体として反応させ、さらに二次抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行ない、本発明の蛋白質に特異的に反応するものを本発明の蛋白質に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものを本発明の蛋白質に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ株として選択する。
【００９０】
（２−４）モノクローナル抗体の調製
プリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ；２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（２−３）で取得したＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞５〜２０×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。得られた上清より、ポリクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
【００９１】
（３）本発明による好ましい抗体
本発明の抗体は上記の（１）および（２）に記載した方法により調製することができる。かくして得られる抗体をさらにスクリーニングすることによって、
配列番号２５のアミノ酸配列（Ｋａｍｉｎｓｋｉ ＷＥ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２７３， ５３２ （２０００）で報告されたＡＢＣＡ７ポリペプチドのアミノ酸配列）からなるポリペプチドを認識せず、本発明のポリペプチドを認識する抗体；
配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する領域を認識する抗体；または
本発明のポリペプチドのトランスポーター活性を阻害する抗体；
を取得することができる。
なお、得られた抗体が、本発明のポリペプチドのトランスポーター活性を阻害するかどうかは、本明細書中上記した方法により分析することができる。
【００９２】
４．ＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡの検出・定量法およびＡＢＣＡ−ＳＳＮの発現量がｍＲＮＡレベルで変動している疾患の診断方法
ＡＢＣＡ−ＳＳＮをコードするポリヌクレオチドの部分断片、例えば配列番号１、２、４、または５のいずれかに記載の塩基配列を有するＤＮＡの部分断片、例えば配列番号１に記載の塩基配列の連続する２００ｂｐ以上の連続した塩基配列を有する断片やＡＢＣＡ−ＳＳＮのオリゴヌクレオチドを用いて、ＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡを検出することができる。
【００９３】
また、ＡＢＣＡ７ ｍＲＮＡと配列番号１または４に示した塩基配列を有するＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｍＲＮＡを区別して検出するには、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｍＲＮＡに特異的な配列、具体的には配列番号８に記載の塩基配列と相補的な配列の全部または１０ｂｐ以上の長さの一部からなるポリヌクレオチドをプローブとして、以下に示すハイブリダイゼーションを行うことにより、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｍＲＮＡだけを検出することができる。このようなポリヌクレオチドとして、配列番号１９および２０に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーでＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡを鋳型にして増幅されるポリヌクレオチド断片をあげることができる。また、下記に示す定量的ＰＣＲ法において、ＡＢＣＡ７ ｃＤＮＡのエキソン５にあたる塩基配列の部分配列と一致する配列を有するフォワードプライマーおよびエキソン６にあたる塩基配列と相補的な配列の部分配列と一致する配列を有するリバースプライマーを用いることにより、増幅断片の長さにより本発明のＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｍＲＮＡとＡＢＣＡ７ ｍＲＮＡを区別してそれぞれ定量することができる。このような定量的ＰＣＲに用いることのできるプライマーとして配列番号２１および２２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをあげることができる
【００９４】
ＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡを検出する方法としては、例えばノーザンブロット法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、定量的ＰＣＲ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ＤＮＡチップ法、リボヌクレアーゼ保護アッセイ法などの方法等があげられる。これらの方法により組織や細胞におけるＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡレベルでの発現量を調べることができる。
これらの方法によって、ＡＢＣＡ−ＳＳＮがどのような組織や細胞で発現しているかという情報や、細胞がどのような刺激を受けたときにその発現量が変化するかという情報を得ることができる。
これらの方法に用いる試料としてはヒトや動物から採取した臓器や生体組織、血液等の生体試料、あるいはこれらの生体試料から樹立した初代培養細胞、細胞株が用いられる。
【００９５】
ノーザンブロット法は、試料から抽出した全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡ（以下「試料由来ＲＮＡ」という）をゲル電気泳動で分離後、ナイロンフィルター等の膜に転写し、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡあるいはその部分配列を有するＤＮＡ、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡの部分配列を有するオリゴヌクレオチドを放射性同位体やジゴキシゲニン、ビオチン等で標識して調製したプローブを用いて、ハイブリダイゼーションならびに洗浄を行い、ＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡを、標識プローブが特異的に結合したバンドとして検出する方法のことでありモレキュラー・クローニング第２版に記載の方法および条件に基づいて行うことができる。バンドの強度すなわち結合した標識プローブの量はＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡの量を反映しているので、組織や病態により発現量がほとんど変化せず、常に構成的に発現しているアクチンやグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）等のｍＲＮＡのバンドを同一のフィルター上で検出し、その強度によって標準化を行うことにより、ＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡレベルでの発現量を定量することができる。また、試料由来ＲＮＡを電気泳動する際に標識したＲＮＡ分子量マーカーを同時に電気泳動し、バンドの泳動位置を分子量マーカーの位置と比較するすることにより、ＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡの長さを測定することができる。
【００９６】
イン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション法は、試料である臓器や生体組織からパラフィン包埋切片あるいはクリオスタット切片を作製し、該切片に対してＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡ、該ＤＮＡの部分配列を有するＤＮＡ、あるいはＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡの部分塩基配列からなるオリゴヌクレオチドより調製した標識プローブとハイブリダイゼーションならびに洗浄の工程を行い、組織内のＡＢＣＡ−ＳＳＮ発現細胞や発現部位を詳細に検出する方法で、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法および条件により行うことができる。
【００９７】
定量的ＰＣＲ法［Ｄｅｌｉｄｏｗ ＢＣ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ａｎａｌ． Ｔｅｃｈ． ６， １２０ （１９８９）］は、試料由来ＲＮＡからオリゴｄＴプライマーと逆転写酵素を用いて合成したｃＤＮＡ（以下「試料由来ｃＤＮＡ」という）を鋳型としてＡＢＣＡ−ＳＳＮのｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡ由来のＤＮＡ断片を特異的に増幅する方法である。該増幅ＤＮＡ断片の量は試料中のＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡの量を反映することから、組織や病態で発現量の変化しないアクチンやＧ３ＰＤＨ等のｃＤＮＡに対するＰＣＲをコントロールとすることでＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡを定量することが可能である。オリゴヌクレオチドプライマーは、プライマー間あるいはプライマー内でのハイブリダイゼーションを起こさないアニーリング温度でＡＢＣＡ−ＳＳＮのｃＤＮＡと特異的に結合して、変性温度ではずれるように設計する。該増幅ＤＮＡ断片の定量は増幅産物が指数関数的に増加しているＰＣＲ回数の内に行うことが必要である。このようなＰＣＲ回数は、一つの試料に関して増幅回数を変えてＰＣＲを行い、各回数ごとに増加する該増幅ＤＮＡ断片の量をゲル電気泳動で分析することで知ることができる。
【００９８】
ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法［Ｌｅｎｎｏｎ ＧＧ ａｎｄ Ｌｅｈｒａｃｈ Ｈ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７， ３１４ （１９９１）］やＤＮＡチップ法［Ｓｈａｌｏｎ Ｄ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６， ６３９ （１９９６）］は、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡ、該ＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、あるいはＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡの部分塩基配列と相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドを固定化させたフィルターあるいはスライドガラスやシリコンなどの基盤に対して、試料由来ＲＮＡからオリゴｄＴプライマーと、標識ｄＮＴＰおよび逆転写酵素を用いて合成した標識ｃＤＮＡをプローブとして、ハイブリダイゼーションならびに洗浄を行うことで、測定の対照となる検体のＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡレベルでの発現量の変動を検出する方法である。いずれの方法もフィルターあるいは基盤上にアクチンやＧ３ＰＤＨのＤＮＡを固定化し内部コントロールとすることにより、測定検体と対照検体の間でのＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡレベルでの発現の差を検出することができる。また測定検体と対照検体から標識ｃＤＮＡプローブを作製する際、両者で異なる標識ｄＮＴＰを用いて作製し、１枚のフィルターあるいは１枚の基盤に二つの標識ｃＤＮＡプローブを同時にハイブリダイズさせることで正確な定量を行うことができる。
【００９９】
リボヌクレアーゼ保護アッセイ［Ｐａｐｅ ＭＥ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔ． Ａｎａｌ． Ｔｅｃｈ． Ａｐｐｌ． ８， ２０６ （１９９１）］では、まずＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡの３’端にＴ７プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどのプロモーター配列を結合し、標識ＮＴＰおよびプロモーター特異的なＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロの転写系により標識したＡＢＣＡ−ＳＳＮのアンチセンスＲＮＡを合成する。該標識アンチセンスＲＮＡを検体から調製した全ＲＮＡまたはｍＲＮＡとハイブリダイゼーションさせ、検体中のＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡとＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成させた後、リボヌクレアーゼで消化し、ハイブリッドの形成によりリボヌクレアーゼによる消化から保護されたバンドをゲル電気泳動で検出する。保護されたバンドを定量することで、ＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡレベルでの発現を定量することができる。
【０１００】
以上のような方法により、被検者およびコントロールとなる健常者から生検等により採取した臓器や生体組織、血液等の生体試料、あるいはこれから培養した初代培養細胞を検体として用い、両者のＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡレベルでの発現の定量を行い比較することにより、ＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡレベルの発現量が健常者と比べて増加あるいは減少している疾患を診断することができる。該疾患としては、例えば自己免疫疾患、シェーグレン病、炎症性疾患、脂質代謝の異常疾患、動脈硬化があげられる。
【０１０１】
５．ＡＢＣＡ−ＳＳＮのトランスポーター活性の阻害
（１）ＡＢＣＡ−ＳＳＮの阻害剤およびそのスクリーニング方法
ＡＢＣＡ−ＳＳＮの阻害剤とは、ＡＢＣＡ−ＳＳＮのトランスポーター活性を阻害する物質である。被験物質とＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを共存させ、ＡＢＣＡ−ＳＳＮのトランスポーター活性を被験物質が存在しない場合のトランスポーター活性と比較し、被験物質を共存させた場合にトランスポーター活性が低下する場合に、該物質がＡＢＣＡ−ＳＳＮのトランスポーター活性を阻害する物質として選択することができる。
【０１０２】
上記スクリーニング法に用いるＡＢＣＡ−ＳＳＮは、ＡＢＣＡ−ＳＳＮを発現している組織、細胞などから精製したポリペプチドを用いてもよいが、ＡＢＣＡ−ＳＳＮをコードするＤＮＡを用いて形質転換された形質転換体を培養し、常法に従って精製することにより、大量に得ることができる。また該ポリペプチドを生産する培養細胞や培養細胞処理物を用いても、本スクリーニングを行うことは可能であるが、細胞をそのまま用いる場合は、該蛋白質を分泌生産する細胞を用いるのが好ましい。ここでいう培養細胞処理物とは、培養液の濃縮物、培養細胞の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる細胞、該細胞の乾燥物、該細胞の凍結乾燥物、該細胞の界面活性剤処理物、該細胞の超音波処理物、該細胞の機械的摩砕処理物、該細胞の溶媒処理物、該細胞の酵素処理物、該細胞の蛋白質分画物、該細胞の固定化物あるいは該細胞より抽出して得られる酵素標品等があげられる。
【０１０３】
（２）ＡＢＣＡ−ＳＳＮの発現を抑制する方法
ＡＢＣＡ−ＳＳＮの発現を抑制する方法としては、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡやアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与あるいはアンチセンスＲＮＡ発現ベクターの投与による、ｍＲＮＡからＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドへの翻訳の抑制、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ遺伝子プロモーターと結合するトリプルヘリックス形成オリゴヌクレオチド投与による転写の阻害、リボザイムの投与によるＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｍＲＮＡの分解、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ遺伝子の転写を特異的に阻害する化合物の投与による転写の阻害をあげることができる。
【０１０４】
６．遺伝子治療用ベクター
ＡＢＣＡ−ＳＳＮの発現量が少ないことが原因の疾患に対しては、 ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドあるいはＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドをヒト生体内で産生する遺伝子治療用ベクターを投与することにより治療を行うことができる。
ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドをヒト生体内で産生する遺伝子治療用ベクターとしてＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを産生する組み換えウイルスベクターをあげることができる。該組み換えウイルスベクターは、１．に記載の方法で取得したＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡ、あるいは必要に応じてＡＢＣＡ−ＳＳＮをコードする領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製し、ウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、造成することができる。該組換えウイルスベクターは、ウイルスのパッケージングに必要な蛋白質をコードする遺伝子例えばマウスモロニー白血病ウイルス等のレトロウイルスの場合はｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ等、ＨＩＶ等のレンチウイルスの場合はｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ等、アデノウイルスの場合はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ等、アデノ随伴ウイルスの場合はＲｅｐ（ｐ５、ｐ１９、ｐ４０）、Ｖｐ（Ｃａｐ）等の遺伝子が欠損している。
【０１０５】
該組換えウイルスベクターを、該組換えウイルスベクターに適合したパッケージング細胞に導入する。パッケージング細胞としては、該組換えウイルスベクターで欠損しているウイルスのパッケジ−ングに必要な蛋白質を補給できる細胞は全て用いることができ、例えばヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３等を用いることができる。
ウイルスベクターとしては上記パッケージング細胞において組換えウイルスが生産でき、標的細胞でＡＢＣＡ−ＳＳＮ遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。プラスミドベクターとしてはＭＦＧ［Ｒｉｖｉｅｒｅ Ｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２， ６７３３ （１９９５）］、ｐＢａｂｅｐｕｒｏ［Ｍｏｒｇｒｎｓｔｅｒｎ ＪＰ ａｎｄ Ｌａｎｄ Ｈ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８， ３５８７ （１９９０）］、ＬＬ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧ［Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２， ８１５０ （１９９８）］、ｐＡｄｅｘ１［Ｋａｎｅｇａｅ Ｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３， ３８１６ （１９９５）］、プロモーターとしては、ヒト組織中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えばサイトメガロウイルスのＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ、メタロチオネインプロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター等をあげることができる。また、サイトメガロウイルスのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【０１０６】
上記パッケージング細胞への上記組換えウイルスベクターの導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法［Ｆｅｌｇｎｅｒ ＰＬ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４， ７４１３ （１９８７）］等をあげることができる。また、ウィルスベクターを用いない遺伝子治療方法としては、所望の組織にＤＮＡを直接輸送する手段として、裸のプラスミドＤＮＡの形態で直接注入される治療用遺伝子トランスフェクション法がある（米国特許公報５５８９４６６号）。すなわち、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ＤＮＡを有する発現ベクターを、治療が必要な組織、例えば大腸癌組織に注射器等を用いて注入することにより、該蛋白質を該癌組織内で発現させることができる。
【０１０７】
７．抗体を用いたＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドの検出および定量方法
ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを認識する抗体を用いてＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを免疫学的に検出する方法としては、免疫組織染色法、免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング法、サンドイッチＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＥＩＡ）や放射性免疫測定法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）などがあり、文献［富山朔二・安東民衛編，単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック （１９８７）、続生化学実験講座５，免疫生化学研究法，東京化学同人（１９８６）、Ｇｏｄｉｎｇ ＪＷ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９６）、Ｈａｒｌｏｗ Ｅ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｄ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８８）］に基いて行うことができる。
【０１０８】
免疫組織化学染色法は、生体組織や細胞を固定化し、ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを認識する抗体を反応させ、さらに蛍光物質、酵素、ビオチン、金コロイド、放射性物質等で標識した抗イムノグロブリン抗体あるいは抗体断片を反応させた後、必要ならば標識抗体の可視化処理を行い、顕微鏡を用いて観察することにより組織や細胞中のＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを検出する方法である。蛍光物質標識には、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン・イソチオシアネート等が用いられ、蛍光顕微鏡によって観察することにより検出する。酵素標識の場合はペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等が用いられ、酵素により発色する基質を添加して発色反応させた後、光学顕微鏡で観察することにより検出できる。ビオチン標識の場合は、ペルオキシダーゼ等の酵素で標識したアビジンを反応させた後、酵素標識抗体と同様の操作を行う。金コロイド標識の場合は、電子顕微鏡で観察することにより検出する。放射性物質標識には１２５Ｉ等が用いられ、感光乳剤をコートして放射線により析出した銀粒子を光学顕微鏡で観察することにより検出できる。
【０１０９】
フローサイトメトリーは、細胞にＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを認識する抗体を反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネートあるいはフィコエリスリンなどの蛍光物質でラベルした抗イムノグロブリン抗体あるいは抗体断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定することにより、細胞でのＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドの発現を検出する方法である。
【０１１０】
ウェスタンブロッティング法は、生体組織や細胞の破砕液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画した後、該ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜あるいはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜にＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを認識する抗体またはその抗体断片を反応させ、さらにペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素や１２５Ｉ等の放射性物質で標識した抗イムノグロブリン抗体あるいは抗体断片を反応させた後、 ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドのバンドを検出する方法である。検出は、酵素標識の場合は、酵素により発色する基質を添加して反応させＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドのバンドを可視化したり、酵素により発光する基質を添加してＸ線フィルムのオートラジオグラフィーにより検出し、放射性物質の場合はＸ線フィルムのオートラジオグラフィーにより検出する。
【０１１１】
酵素免疫測定法の一種であるサンドイッチＥＬＩＳＡでは、抗原認識部位の異なる２種類のＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を用意し、あらかじめ一方のモノクローナル抗体または抗体断片はプレートに吸着させておく。生体組織や細胞から細胞破砕液を調製し、試験サンプルとする。抗体吸着プレートに試験サンプルを反応させ、さらに抗原認識部位の異なるＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを認識するモノクローナル抗体またはその抗体断片を反応させ、さらにペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素で標識した抗イムノグロブリン抗体あるいは抗体断片を反応させる。酵素により発色する基質を添加して発色反応させた後、分光光度計により発色強度を測定することにより、サンプル中のＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドの検出または定量を行う。
【０１１２】
放射性免疫測定法は、酵素でなく１２５Ｉ等の放射性物質で標識した抗体を用いて、酵素免疫測定法と同様の操作を行い、シンチレーションカウンターで放射線を測定することによりサンプル中のＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドの検出または定量を行う方法である。
【０１１３】
また酵素免疫測定法や放射性免疫測定法には、上記のようなサンドイッチ法の他に、抗体でなくＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチド標品を標識し、一定量の標識ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチド標品と試験サンプルとをプレートに固相化したＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドを認識する抗体と反応させ、プレート上の酵素活性や放射線を測定することにより、サンプル中のＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドの検出または定量を行う競合法もある。
【０１１４】
８．医薬組成物
上記ＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチド、ＡＢＣＡ−ＳＳＮオリゴヌクレオチド、ＡＢＣＡ−ＳＳＮを認識する抗体を含有する治療薬は、薬剤として該物質または該中和抗体単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与または、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
【０１１５】
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【０１１６】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該蛋白質そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該蛋白質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該蛋白質および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０１１７】
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。
以下、本発明を実施例を用いて具体的に例示するが、本発明の範囲は実施例によって限定されることはない。
【０１１８】
【実施例】
実施例１：ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡのクローン化と塩基配列解析
ＳＳ−Ｎ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＦ１４０３４２）と一致する塩基配列を有するｃＤＮＡを、インハウスデータベース（かずさＤＮＡ研究所）を用いて探索した結果、ヒト成人脳由来のｃＤＮＡクローンｈｈ１０２１０がＳＳＮ−ｃＤＮＡの配列を含むことを見出した。ｈｈ１０２１０が新規なＡＢＣトランスポーターであるＡＢＣＡ−ＳＳＮをコードしていると考え、そのｃＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号７にｈｈ１０２１０のｃＤＮＡの塩基配列を示した。ｈｈ１０２１０のｃＤＮＡの塩基配列は公知のＡＢＣＡ７ ｃＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＦ２５０２３８）と非常に相同性の高いものであったが、１）ＡＢＣＡ７遺伝子のエキソン５とエキソン６の間の３８４ｂｐのイントロン（配列番号８に該イントロンの塩基配列を示した。）が残っているオルタナティブ・スプライシング体のｃＤＮＡであること、２）エキソン２より上流の５’側、エキソン４０より下流の３’側、およびエキソン３５の一部５４ｂｐが欠失していること、３）エキソン３２中にアミノ酸配列の変異を伴なう２ヶ所（配列番号７の４７６６および４８３２番目）の塩基配列の変異があること（ＡＢＣＡ７の１５０２ＡｒｇがＰｒｏに、１５２４ＰｈｅがＳｅｒに変異する。）がわかった。
【０１１９】
さらにヒト胸腺ｃＤＮＡライブラリー（宝酒造株式会社製）をテンプレートとして、配列番号１２および１３に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた３’−ＲＡＣＥ、あるいは配列番号１２および１４に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲを行い、ｈｈ１０２１０で欠失している３’側の領域を含むｃＤＮＡ断片を増幅しクローン化した。これらの３’側の領域のクローンについて塩基配列をベックマンＣＥＱ２０００ＤＮＡ解析システムを用いて解析した。その結果、ＡＢＣＡ７ ｃＤＮＡの塩基配列の５３７４〜６４１９番目とほぼ一致する配列（配列番号１０）を有するものの他、スプライシングの認識サイトがずれたオルタナティイブ・スプライシング体であると考えられるエキソン４５の開始部分の４５ｂｐが欠失したもの（配列番号１１）や、エキソン４５以降の領域が欠失したものも存在した。
【０１２０】
また、ｈｈ１０２１０のｃＤＮＡにおけるエキソン３２の変異やエキソン３５内の欠失が、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡに普遍的なものかどうかを調べるため、ヒト胸腺ｃＤＮＡライブラリー（宝酒造株式会社製）をテンプレートとして、配列番号１５および１６に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲを行い、エキソン３０〜３８の領域を増幅しクローン化した。これらのクローンについて塩基配列を解析した結果、解析した全てのクローンで、エキソン３２の塩基の変異は２ヶ所とも存在したが、エキソン３５の欠失は見られず、公知のＡＢＣＡ７ ｃＤＮＡの塩基配列と一致した。したがってＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡのエキソン３２は、公知のＡＢＣＡ７ ｃＤＮＡとは異なり、ｈｈ１０２１０のｃＤＮＡと同じ塩基配列であるが、エキソン３５は公知のＡＢＣＡ７ ｃＤＮＡと同一であり欠失はないと考えられた。
【０１２１】
ｈｈ１０２１０のｃＤＮＡの塩基配列、ヒト胸腺ｃＤＮＡライブラリーをテンプレートにしたＰＣＲにより得られたエキソン３９以降の領域（配列番号１０）およびエキソン３０〜３８の領域のｃＤＮＡ断片の塩基配列から得られるＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１に、配列番号１０の代わりにエキソン４５に一部欠失があるオルタナティブ・スプライシング体のｃＤＮＡ断片の塩基配列（配列番号１１）をもとにしたＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号４に示した。配列番号１および４に記載の塩基配列に存在するＡＢＣＡ７のイントロンの配列中にはＡＢＣＡ７の翻訳フレームと同一フレームでストップコドンが２ヶ所存在し、これらのストップコドンの下流に開始コドンが存在するために、これらのｃＤＮＡがコードするＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチドは、ＡＢＣＡ７のＮ末端とは異なる２８アミノ酸の後にＡＢＣＡ７の１６７番目以降のアミノ酸配列がつながった２００８アミノ酸または１９９３アミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。配列番号１中のポリペプチドをコードする領域の塩基配列を配列番号２に、配列番号２に記載の塩基配列がコードするポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３に、配列番号４中のポリペプチドをコードする領域の塩基配列を配列番号５に、配列番号５に記載の塩基配列がコードするポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号６に示した。
【０１２２】
実施例２：ＡＢＣＡ７またはＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡレベルでの発現解析
配列番号１７および１８に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、ＡＢＣＡ７およびＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡに共通する５’端部分のＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片を［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）およびランダムプライマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造株式会社製）を用いて放射能標識したものをプローブにして、ヒトの種々の組織（副腎、膀胱、骨髄、脳、リンパ節、乳腺、前立腺、脊髄、胃、甲状腺、気管、子宮；脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸、末梢白血球）のｍＲＮＡをブロットしたフィルターであるＭＴＮブロット（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ； クローンテック社製）を用いてノーザンハイブリダイゼーションを行うことにより、各ヒト臓器におけるＡＢＣＡ７またはＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡレベルでの発現量を調べた。その結果を図１Ａに示したが、ＡＢＣＡ７またはＡＢＣＡ−ＳＳＮのｍＲＮＡは、８〜９ｋｂの大きさであり、Ｋａｍｉｎｓｋｉらの報告［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． ２７３， ５３２ （２０００）］と同様に、骨髄リンパ系の組織である胸腺、リンパ節、骨髄、末梢白血球、脾臓に高い発現がみられ、特に胸腺では非常に高い発現を示した。また、脳と気管にも発現がみられた。
【０１２３】
ＡＢＣＡ−ＳＳＮタイプのみのｍＲＮＡレベルでの発現を検出するため、配列番号１９および２０に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡにのみ存在するイントロン５中の３２２ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。上記と同様にして、このＤＮＡ断片をプローブにしてＭＴＮブロットを用いてノーザンハイブリダイゼーションを行った。この結果を図１Ｂに示したが、ＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｍＲＮＡの長さは同じく８〜９ｋｂであり、胸腺、リンパ節、骨髄、末梢白血球に高い発現がみられ、特に胸腺で非常に高い発現が見られた。また、脾臓と気管、脳に中レベルの発現がみられた。この発現分布は、上記で調べたＡＢＣＡ７またはＡＢＣＡ−ＳＳＮの発現分布とよく似ていた。したがって、ＡＢＣＡ−ＳＳＮタイプのｃＤＮＡは、たまたまイントロン５が残ってしまった異常なＡＢＣＡ７のｍＲＮＡからできたものではなく、骨髄リンパ系の組織では天然に、ＡＢＣＡ７ゲノム遺伝子［Ｋａｍｉｎｓｋｉ ＷＥ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． ２７８， ７８２ （２０００）］のオルタナティブ・スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）産物として、ＡＢＣＡ−ＳＳＮタイプのｍＲＮＡが存在することがわかった。
【０１２４】
さらに、各組織のＡＢＣＡ−ＳＳＮタイプとＡＢＣＡ７タイプのｍＲＮＡレベルでの発現を区別して解析するため、それぞれのタイプのｃＤＮＡで増幅ＤＮＡ断片の鎖長が異なる以下のようなＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。具体的には、ＡＢＣＡ７またはＡＢＣＡ−ＳＳＮが発現している種々のヒト組織（脳、骨髄、リンパ節、胸腺、脾臓、気管）のポリＡ＋ＲＮＡ（クローンテック社製）からオリゴｄＴプライマーおよびスーパースクリプト・プレアンプリフィケーション・システム（ライフ・テクノロジーズ社製）を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後に、配列番号２１および２２に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ（サイクル数３０回）を行った。このＲＴ−ＰＣＲ解析では、ＡＢＣＡ７タイプのｍＲＮＡからは２６１ｂｐのＤＮＡ断片が、ＡＢＣＡ−ＳＳＮタイプのｍＲＮＡからは６０６ｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ増幅する。その結果を図２に示したが、調べた組織では骨髄を除く全ての組織で、ＡＢＣＡ７タイプではなく、ＡＢＣＡ−ＳＳＮタイプの方が主に発現していることがわかった。
【０１２５】
なお、エキソン４５の欠失の有無を調べるため、配列番号２３および２４に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、上記と同様に各組織についてＲＴ−ＰＣＲ解析を行ったところ、欠失していない場合の２４２ｂｐのＤＮＡ断片のみの増幅がみられ、欠失しているタイプで増幅する短いＤＮＡ断片は検出されなかったことから、大部分のＡＢＣＡ７およびＡＢＣＡ−ＳＳＮ ｃＤＮＡはエキソン４５に欠失がないことが確認された。
【０１２６】
実施例３：ＡＢＣＡ−ＳＳＮおよびＡＢＣＡ７を認識する抗体の作製
（１）抗原ペプチドの作製
（１）−１ 略号について
本発明において使用したアミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）の勧告［Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３８， ９ （１９８４）］に従った。
【０１２７】
以下の略号は、特に断わらない限り対応する下記のアミノ酸を表す。
Ａｌａ：Ｌ−アラニン
Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸
Ａｓｘ：Ｌ−アスパラギン酸またはＬ−アスパラギン
Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン
Ｃｙｓ：Ｌ−システイン
Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン
Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸
Ｇｌｘ：Ｌ−グルタミン酸またはＬ−グルタミン
Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン
Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン
Ｓｅｒ：Ｌ−セリン
Ｔｈｒ：Ｌ−スレオニン
Ｖａｌ：Ｌ−バリン
【０１２８】
以下の略号は、対応する下記のアミノ酸の保護基および側鎖保護アミノ酸を表す。
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ｔＢｕ：ｔ−ブチル
Ｔｒｔ：トリチル
Ｐｍｃ：２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルフォニル
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎｇ−２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル−Ｌ−アルギニン
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸−β−ｔ−ブチルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎε−トリチル−Ｌ−グルタミン
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎｉｍ−トリチル−Ｌ−ヒスチジン
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎε−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−リジン
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−スレオニン
【０１２９】
以下の略号は、対応する下記の反応溶媒、反応試薬等を表す。
ＨＢＴＵ：２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
【０１３０】
以下の実施例において、化合物の理化学的性質は次の方法により測定した。
質量分析は、日本電子ＪＭＳ−ＨＸ１１０Ａを用いＦＡＢ−ＭＳ法により、もしくはブルカー社質量分析装置ＲＥＦＬＥＸを用いＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法により行った。行った。アミノ酸分析は、コーエンらの方法［Ｃｏｈｅｎ ＳＡ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２２， １９ （１９９４）］により行った。加水分解は塩酸蒸気中１１０℃で２０時間行い、加水分解物のアミノ酸組成はウォーターズ・アキュ・タグ（Ｗａｔｅｒｓ ＡｃｃＱ−Ｔａｇ）アミノ酸分析計（ウォーターズ社製）を用い分析した。
【０１３１】
ＡＢＣＡ−ＳＳＮのアミノ酸配列を解析し、親水性の高い部分、Ｎ末端、Ｃ末端、二次構造上ターン構造、ランダムコイル構造を有する部分の中から、抗原として適当と考えられる部分配列としてＣ末端領域を選択し、抗原としてＡＢＣＡ−ＳＳＮのアミノ酸配列の１９８９〜２００８番目のアミノ酸配列のＮ末端にＣｙｓを付加したペプチドである化合物１（ｈＡＢＣＡ７−Ｃ、Ｈ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ）を合成することにした。化合物１のアミノ酸配列を配列番号２６に示した。
【０１３２】
（１）−２ 化合物１（ｈＡＢＣＡ７−Ｃ）の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ １８μｍｏｌが結合した担体樹脂（Ｗａｎｇ樹脂、ノバビオケム社製）３０ｍｇを自動合成機（島津製作所）の反応容器に入れ、６００μＬのＤＭＦを加えて３分間攪拌し溶液を排出した後、島津製作所の合成プログラムに従い次の操作を行った。
（ａ）３０％ピペリジン−ＤＭＦ溶液５００μＬを加えて混合物を４分間攪拌し、該溶液を排出し、この操作をもう１回繰り返した。
（ｂ）担体樹脂を６００μＬのＤＭＦで１分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を５回繰り返した。
（ｃ）Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（１８０μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１８０μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ１水和物（１８０μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（５４０μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．３６ｍｌ）中で３分間攪拌し、得られた溶液を樹脂に加えて混合物を６０分間攪拌し、溶液を排出した。
（ｄ）担体樹脂を６００μＬのＤＭＦで１分間洗浄後溶液を排出し、これを５回繰り返した。
こうして、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ が担体上に合成された。
【０１３３】
次に、（ａ）および（ｂ）の工程の後、（ｃ）の工程でＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを用いて縮合反応を行い、（ｄ）の洗浄工程を経て、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕが担体上に合成された。
以下、工程（ｃ）において、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを順次用いて、（ａ）〜（ｄ）を繰り返した後、（ａ）および（ｂ）の脱保護、洗浄工程を経て、メタノール、ブチルエーテルで順次洗浄し、減圧下１２時間乾燥して、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、ＴＦＡ（８２．５％）、チオアニソール（５％）、水（５％）、エチルメチルスルフィド（３％）、１，２−エタンジチオール（２．５％）およびチオフェノール（２％）からなる混合溶液１ｍＬを加えて室温で８時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約１０ｍＬを加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチドとして６１．３ｍｇを取得した。この粗生成物全量を酢酸水溶液に溶解後、逆相カラム（資生堂製、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ３０ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ）を用いたＨＰＬＣで精製した。０．１％ＴＦＡ水溶液に、ＴＦＡ０．１％を含む９０％アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、２２０ｎｍで検出し、化合物１を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、化合物１を１６．１ｍｇ得た。
【０１３４】
質量分析［ＴＯＦＭＳ］；ｍ／ｚ＝２３７１．５（Ｍ＋Ｈ＋）
アミノ酸分析；Ａｓｘ １．９（２），Ｇｌｘ ３．１（１），Ｓｅｒ １．９（２），Ｈｉｓ １．１（１），Ａｒｇ １．０（１），Ｔｈｒ ２．１（２），Ａｌａ １．０（１），Ｐｒｏ ２．０（２），Ｖａｌ １．９（２），Ｌｅｕ ２．０（２），Ｐｈｅ １．０（１），Ｌｙｓ １．１（１），Ｃｙｓ １．４（１）
【０１３５】
（２）免疫原の調製
実施例１（１）で得られた化合物１は、免疫原性を高める目的で以下の方法でＫＬＨ（カルビオケム社）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、ＫＬＨをＰＢＳに溶解して１０ｍｇ／ｍＬに調整し、１／１０容量の２５ｍｇ／ｍＬ Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミド（ＭＢＳ；ナカライテスク社）を滴下して３０分撹拌反応させた。あらかじめＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ−２５カラムなどのゲルろ過カラムでフリーのＭＢＳを除いて得られたＫＬＨ−ＭＢＳ ２．５ｍｇを０．１Ｍりん酸ナトリウムバッファー（ＰＨ７．０）に溶解した化合物１（１ｍｇ）と混合し、室温で３時間、攪拌反応させた。反応後、ＰＢＳで透析したものを免疫原として用いた。
【０１３６】
（３）動物の免疫、ポリクローナル抗体の作製
実施例１（２）で作製した化合物１−ＫＬＨコンジュゲート２００μｇをフロイントの完全アジュバント（ヤトロン社）とともに日本白色種（ＳＰＦ）２１週令雌ウサギ２匹に投与した。投与２週間後より、化合物１−ＫＬＨコンジュゲート２００μｇをフロインドの完全アジュバントとともに１週間に１回、計５回投与した。該ウサギより部分採血し、その血清抗体価を以下（４）に示す酵素免疫測定法（バインディングＥＬＩＳＡ）で調べ、十分な抗体価を示したウサギから全採血を行い抗血清を得た。
この抗血清からカプリル酸沈殿法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， （１９８８）］によりＩｇＧ画分を精製し、ポリクローナル抗体を得た。
【０１３７】
（４）酵素免疫測定法（バインディングＥＬＩＳＡ）
アッセイ用の抗原には（１）で得られた化合物１をチログロブリン（以下、ＴＨＹと略す。）とコンジュゲートしたものを用いた。作製方法は（２）に記した通りであるが、架橋剤にはＭＢＳの代わりに４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ、シグマ社）を用いた。９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社）に、上記のように調製したコンジュゲートを５μｇ／ｍＬ、５０μＬ／穴で分注し、４度で一晩放置して吸着させた。該プレートを洗浄後、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳを１００μＬ／穴加え、室温で１時間放置し、残っている活性基をブロックした。
【０１３８】
放置後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを捨て、該プレートに一次抗体として被免疫ウサギ抗血清を５０μＬ／穴分注し、２時間放置した。該プレートを０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［（ＩＣＩ社商標Ｔｗｅｅｎ２０相当品：和光純薬社製）］／ＰＢＳ（以下Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記）で洗浄後、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識ブタ抗ウサギイムノグロブリン（ＤＡＫＯ社）を５０μＬ／穴加えて室温、１時間放置した。該プレートをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２．２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾール−６−スルホン酸）アンモニウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＢＴＳ／０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸バッファー（ｐＨ４．２）］を添加し、発色させ４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダー［Ｅｍａｘ、モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）社製］を用いて測定した。
【０１３９】
（５）ポリクローナル抗体の反応性の検討
上記（４）に示したバインディングＥＬＩＳＡにより、（３）で得られたポリクローナル抗体の抗原ペプチドに対する反応性を検討した。一次抗体としてポリクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬから１０倍ずつ段階希釈したもの）を用いた。結果を図３に示した。ポリクローナル抗体は抗原ペプチドと特異的に反応した。
【０１４０】
実施例４：ＡＢＣＡ−ＳＳＮの動物細胞での発現
（１）ｐＡＢＣＡ−ＳＳＮ／ＣＲ２．１の作製
配列番号２に示すＡＢＣＡ−ＳＳＮをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＡＢＣＡ−ＳＳＮ／ＣＲ２．１を以下のようにして作製した（図４、５）。ｈｈ１０２１０は、エキソン４０より下流の３’側、およびエキソン３５の一部５４ｂｐが欠失しているので、ヒト胸腺ｃＤＮＡライブラリー（宝酒造株式会社製）をテンプレートＤＮＡにして、まずＡＢＣＡ−ＳＳＮのＣ末端側の断片を以下のようにして増幅した。反応液［テンプレートＤＮＡ１μｌ、２５ｎｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２ ５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ２．５ｍｍｍｏｌ／ｌの濃度で含む混合物）４μｌ、１０μｍｏｌ／ｌプライマー２７（配列番号２７） ２μｌ、１０μｍｏｌ／ｌプライマー２８（配列番号２８） ２μｌ、滅菌水３５．５μｌ、ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社製）０．５μｌ］を調製し、サーマルサイクラーを用いて、９４℃で３分間加熱後、９４℃で４５秒、６５℃で３０秒、７２℃で１分の反応サイクルを３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分間加熱し、４℃に置いた。このＰＣＲにより配列番号２の４０６０〜６０２４番目の配列の３’側にストップコドン（ＴＧＡ）およびＨｉｎｄＩＩＩサイトが付加された配列を有するＤＮＡ断片が増幅する。該増幅断片をＴＡクローニング法によりｐＣＲ２．１（インビトロジェン社製）に挿入した。得られたプラスミド（ｐＣＲ２．１／ＰＣＲ４）をｐＣＲ２．１上のＮｏｔＩサイトおよび増幅断片中のＢｓｔＺ１７Ｉサイトで切断して、約１．１ｋｂの断片を単離し、ｈｈ１０２１０（ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ（＋））のＮｏｔＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉサイト間に挿入し、ｈｈ１０２１０／ＰＣＲ４を作製した。
【０１４１】
次にＡＢＣＡ−ＳＳＮのエキソン３５の欠失部分を含む断片をＰＣＲにより増幅した。反応液のプライマー２７、プライマー２８のかわりにプライマー２９（配列番号２９）、プライマー３０（配列番号３０）を用いる以外は反応条件は上記と同様にして行った。得られた増幅断片（配列番号２の３０６０〜５０２７番目の配列に相当する）をＴＡクローニングによりｐｃＲ２．１にクローニングした。得られたプラスミド（ｐＣＲ２．１／ＰＣＲ３）を、増幅断片上のＳｐｈＩサイト、ＢｃｌＩサイトで切断して得られた約２４０ｂｐの断片をｈｈｐ１０２１０／ＰＣＲ４のＳｐｈＩ／ＢｃｌＩサイト間に挿入し、ｈｈ１０２１０／ＰＣＲ４＋３を作製した。
【０１４２】
ＡＢＣＡ−ＳＳＮに特異的なＮ末端を含む領域をコードする断片をＰＣＲにより増幅した。反応液のプライマー２７、プライマー２８のかわりにプライマー３１（配列番号３１）、３２（配列番号３２）を用いる以外は反応条件は上記と同様にして行った。このＰＣＲにより配列番号２の１〜９１８番目の配列の５’側にＥｃｏＲＩサイトが付加された配列を有するＤＮＡ断片が増幅する。得られた増幅断片をＴＡクローニングによりｐｃＲ２．１にクローニングした。ＡＢＣＡ−ＳＳＮ上にはＣｌａＩサイトが存在するので、得られたプラスミド（ｐＣＲ２．１／ＰＣＲ２）のＣｌａＩサイト／ＮｏｔＩサイト間にｈｈ１０２１０／ＰＣＲ４＋３のＣｌａＩ−ＮｏｔＩ断片（ＣｌａＩサイトより下流のＡＢＣＡ−ＳＳＮ断片を含む）を挿入することによりｐＡＢＣＡ−ＳＳＮ／ＣＲ２．１を作製した。
【０１４３】
また、ＡＢＣＡ７に特異的なＮ末端を含む領域をコードする断片をＰＣＲにより増幅した。ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社製）をテンプレートＤＮＡにして、反応液［テンプレートＤＮＡ５μｌ、２５ｎｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２ ５μｌ、ｄＮＴＰ混合物４μｌ、１０μｍｏｌ／ｌプライマー３３（配列番号３３） ２μｌ、１０μｍｏｌ／ｌプライマー３２（配列番号３２） ２μｌ、滅菌水３１．５μｌ、ＬＡ Ｔａｑ０．５μｌ］を調製し、サーマルサイクラーを用いて、９４℃で３分間加熱後、９４℃で４５秒、６２℃で３０秒、７２℃で１分の反応サイクルを３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分間加熱して反応を行い、４℃に置いた。このＰＣＲによりＡＢＣＡ７のｃＤＮＡの配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ２５０２３８）の１〜１３３２番目の配列の５’側にＥｃｏＲＩサイトが付加された配列を有するＤＮＡ断片が増幅する。得られた増幅断片をＴＡクローニングによりｐｃＲ２．１にクローニングした。得られたプラスミドのＣｌａＩサイト／ＮｏｔＩサイト間にｈｈ１０２１０／ＰＣＲ４＋３のＣｌａＩ−ＮｏｔＩ断片（ＣｌａＩサイトより下流のＡＢＣＡ−ＳＳＮおよびＡＢＣＡ７に共通の領域を含む）を挿入することによりｐＡＢＣＡ７／ＣＲ２．１を作製した。
【０１４４】
（２）動物細胞発現用ベクターｐＣＭＶ６ｃＡＢＣＡ−ＳＳＮの作製
上記で得られたｐＡＢＣＡ−ＳＳＮ／ＣＲ２．１およびｐＡＢＣＡ７／ＣＲ２．１をそれぞれＥｃｏＲＩで切断して、ＡＢＣＡ−ＳＳＮあるいはＡＢＣＡ７をコードするＤＮＡを含む断片を単離し、動物細胞発現ベクターｐＣＭＶ６ｃ［ＡＴＣＣ番号：８７７８２、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４， ８２２２ （１９８９）］のＥｃｏＲＩサイトに挿入することにより、ｐＣＭＶ６ｃＡＢＣＡ−ＳＳＮおよびｐＣＭＶ６ｃＡＢＣＡ７を作製した（図６）。
【０１４５】
（３）動物細胞への発現ベクターの導入
（２）で作製したｐＣＭＶ６ｃＡＢＣＡ−ＳＳＮおよびｐＣＭＶ６ｃＡＢＣＡ７を含む大腸菌から、それぞれのプラスミドＤＮＡをコンサート核酸精製システム（ＣＯＮＣＥＲＴ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、インビトロジェン社製）により調製した。
【０１４６】
１×１０６個のヒト胎児腎由来の細胞株ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５７３）を１０ｃｍ径培養用シャーレにまき、２４時間後培養したリポフェクトアミン・プラス（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ、インビトロジェン社製、リポフェクトアミンおよびプラス試薬からなる）を用いてリポフェクション法によりＤＮＡを細胞に導入した。リポフェクション法は、以下のようにして行った。まずＤＮＡ５μｇ、リポフェクトアミン２８μｌ、血清を含まないＯＰＴＩ−ＭＥＭ（インビトロジェン社製）７００μｌを室温で１５分インキュベートした。これとは別に、プラス試薬２０μｌと血清を含まないＯＰＴＩ−ＭＥＭ７００μｌを室温で１５分インキュベートした。両者を混ぜさらに室温で１５分インキュベートした。ＨＥＫ２９３細胞をまいて培養したシャーレをＯＰＴＩ−ＭＥＭで洗浄した後、５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを添加し、上記の混合液を添加し、３時間培養した。１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭに培地を交換し、さらに３７℃で４０時間培養した。
【０１４７】
（４）膜画分の調製とウェスタンブロッティングによるポリペプチドの検出
それぞれの発現ベクターを導入した細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、氷冷した懸濁用緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、２５ｍｍｏｌ／ｌショ糖）１ｍｌを加えて細胞を掻き取った。細胞を１０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を除き、沈殿物を２ｍｌのプロテアーゼ阻害剤−懸濁用緩衝液（１００μｇ／ｍｌ ｐＡＰＳＭＦ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、２μｇ／ｌアプロチニンを含む懸濁用緩衝液）に懸濁した。４℃で、コンテスミニボンベ細胞破砕器［キンブル／コンテス（ＫＩＭＢＬＥ／ＫＯＮＴＥＳ）社製］を用いたＮ２キャビテーション（窒素ガスで４０ｋｇ／ｃｍ２の圧力を５分間かけた後、大気圧に戻す。）により細胞破砕を行った。細胞破砕液を４℃で１０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を回収した。上清を４℃で１３０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、上清を除いた。得られた沈殿を５０μｌのプロテアーゼ阻害剤−懸濁用緩衝液に懸濁し、膜画分とした。
膜画分の蛋白質濃度を測定し、蛋白質５μｇ分の膜画分をサンプルとして７％ゲルでＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に、２００ｍＡで１時間電気的にトランスファーした後、１次抗体として２０００倍希釈した抗ＡＢＣＡ７Ｃ末ペプチド抗体、２次抗体として５０００倍希釈したホースラディッシュパーオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ヤギ）［バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製］を反応させ、ＥＣＬ検出試薬（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて、膜画分中のＡＢＣＡ−ＳＳＮおよびＡＢＣＡ７を検出した。図７に示すように、ＡＢＣＡ−ＳＳＮおよびＡＢＣＡ７とも細胞膜上に発現していることがわかった。
【０１４８】
参考例１：ＡＢＣＡ７の部分断片を認識する抗体の作製
ＡＢＣＡ７の細胞外第１ループと考えられる４５〜５４９番目のアミノ酸配列を有する部分断片［以下、ＡＢＣＡ７（４５−５４９）と略記する。］に対する抗体を以下のようにして作製した。
【０１４９】
（１）免疫原の調製
ＰＣＲにより、ＡＢＣＡ７のｃＤＮＡの配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ２５０２３８）の１３５〜１６４７番目の配列の５’側にＥｃｏＲＩサイト、３’側にＳａｌＩサイトが付加された配列を有するＤＮＡ断片を増幅し、ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）のＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩサイト間に挿入し、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末にＡＢＣＡ７（４５−５４９）を融合させた融合蛋白質を発現させるベクターを作製した。
【０１５０】
得られたベクターでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１株（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃で６００ｎｍの光学濃度が０．５になるまで、約２時間培養した。ＩＰＴＧを最終濃度１ｍｍｏｌ／ｌになるように加え、３０℃で３時間培養し、融合蛋白質の発現誘導を行った。
【０１５１】
４℃で５０００ｒｐｍ、５分間で遠心分離することにより集菌し、菌体を１００μｇ／ｍｌのｐＡＰＳＭＳＦを含むＰＢＳ１０ｍｌに懸濁した。超音波破砕機［マイソニックス（ＭＩＳＯＮＩＸ）社製］で、５秒間超音波破砕、５秒間静止を繰り返し、合計２分４０秒間超音波破砕を行った。菌体の破砕液を４℃で９５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して、上清を回収した。上清に５０％スラリーのグルタチオンセファロース４Ｂビーズ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）１００μｌｌおよびトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を最終濃度１％になるように加え、４℃で１時間回転させながらインキュベートし、ビーズに融合蛋白質を結合させた。４℃で３００ｒｐｍ、３分間遠心分離して、ビーズを回収した。１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳでビーズを３回洗浄した後、ビーズと等量の溶出用緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ還元型グルタチオン、５０ｍｍｏｌ／ｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加え、４℃で１時間インキュベートし、ビーズから融合蛋白質を溶出させた。４℃で１２０００ｒｐｍ、５秒間遠心分離し、上清を回収した。この操作は２回繰り返し、完全にビーズを除去した。
【０１５２】
（２）動物の免疫およびポリクローナル抗体の作製
（１）で得られたＧＳＴとＡＢＣＡ７（４５−５４９）の融合蛋白質（分子量約８０ｋＤａ）５０μｇを水酸化アルミニウムアジュバント［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ９９ （１９８８）］２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに４週令雌ＳＤラット３匹に投与した。投与２週間後より、ＧＳＴとＡＢＣＡ７（４５−５４９）の融合蛋白質５０μｇを１週間に１回、計３回投与した。該ラットより部分採血し、その血清抗体価を実施例３（４）と同様の酵素免疫測定法（バインディングＥＬＩＳＡ）で調べ、十分な抗体価を示したラットから全採血を行い抗血清を得た。ただし、アッセイ用の抗原には（１）で得られたＧＳＴとＡＢＣＡ７（４５−５４９）の融合蛋白質、およびＧＳＴを用い、一次抗体としては得られた被免疫ラット抗血清を、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン（ＤＡＫＯ社）を用いた。
この抗血清からカプリル酸沈殿法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， （１９８８）］によりＩｇＧ画分を精製し、ポリクローナル抗体を得た。
【０１５３】
（３）ポリクローナル抗体の反応性の検討
（２）と同様の酵素免疫測定法（バインディングＥＬＩＳＡ）したがって、（１）で得られたポリクローナル抗体の反応性の検討行なった。１次抗体には実施例（２）で得られたポリクローナル抗体を１０μｇ／ｍＬから１０倍希釈で使用した。結果は図８に示した。ポリクローナル抗体はＧＳＴに交差反応を示すものの、抗原であるＧＳＴとＡＢＣＡ７（４５−５４９）の融合蛋白質に強く反応した。
【０１５４】
【発明の効果】
本発明によりＡＢＣＡ−ＳＳＮポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリぺプチドを認識する抗体が提供され、これらを利用することにより自己免疫疾患、シェーグレン病、炎症性疾患、脂質代謝の異常疾患、動脈硬化の診断薬や予防薬、治療薬の開発が可能となる。
【０１５５】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１３−ｐＡＰ３ｎｅｏベクター用のリバースプライマー
配列番号２６−１９８９−２００８番目の残基のＮ末にシステイン残基を付加したＡＢＣＡ−ＳＳＮのＣ末ペプチド
配列番号２８−配列番号２の４０６０−６０２４番目を増幅し、その３’末にストップコドンとＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加するためのリバースプライマー
配列番号３１−配列番号２の１−９１８番目を増幅し、その５’末にＥｃｏＲＩサイトを付加するためのフォワードプライマー
配列番号３３−ＡＢＣＡ７ ｃＤＮＡの１−１３３２番目を増幅し、その５’末にＥｃｏＲＩサイトを付加するためのフォワードプライマー
【０１５６】
【配列表】
【０１５７】
【０１５８】
【０１５９】
【０１６０】
【０１６１】
【０１６２】
【０１６３】
【０１６４】
【０１６５】
【０１６６】
【０１６７】
【０１６８】
【０１６９】
【０１７０】
【０１７１】
【０１７２】
【０１７３】
【０１７４】
【０１７５】
【０１７６】
【０１７７】
【０１７８】
【０１７９】
【０１８０】
【０１８１】
【０１８２】
【０１８３】
【０１８４】
【０１８５】
【０１８６】
【０１８７】
【０１８８】
【０１８９】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、各種ヒト組織におけるｍＲＮＡレベルでのＡＢＣＡ７またはＡＢＣＡ−ＳＳＮの発現を調べたノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。ＡはＡＢＣＡ７タイプ、ＡＢＣＡ−ＳＳＮタイプの両者に共通する配列を含むプローブ、ＢはＡＢＣＡ−ＳＳＮタイプに特異的なプローブ用いた結果である。それぞれ左はヒト１２レーンＭＴＮブロットＩＩ（ｍＲＮＡ源は左より、副腎、膀胱、骨髄、脳、リンパ節、乳腺、前立腺、脊髄、胃、甲状腺、気管、子宮）、右はヒトＭＴＮブロットＩＩ（ｍＲＮＡ源は左より、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸、末梢白血球）での結果を示す。右の数値はｍＲＮＡの鎖長マーカー（ｋｂ）の位置を示す。
【図２】図２は、各種ヒト組織におけるＡＢＣＡ７タイプ、ＡＢＣＡ−ＳＳＮタイプそれぞれのｍＲＮＡに対して同時にしかも断片の大きさで区別して増幅できるプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。左から、ＡＢＣＡ７コントロール、ＡＢＣＡ−ＳＳＮコントロール、脳、骨髄、リンパ節、胸腺、脾臓、気管での結果を示す。
【図３】図３は、ＡＢＣＡ−ＳＳＮおよびＡＢＣＡ７のＣ末端ペプチド（ＡＢＣＡ７−Ｃ、化合物１）を免疫原としたウサギ抗血清の、化合物１に対する反応性を測定するバインディングＥＬＩＳＡの結果を示す図である。横軸は抗体濃度、縦軸は４１５ｎｍでの吸光度を示す。■はＴＨＹ−化合物１をアッセイ抗原とした場合、□はＴＹＨ−コントロールペプチドをアッセイ抗原とした場合の結果を示す。
【図４】図４は、ｐＣＲ２．１／ＰＣＲ１、ｐＣＲ２．１／ＰＣＲ２、ｐＣＲ２．１／ＰＣＲ３、ｐＣＲ２．１／ＰＣＲ４にサブクローニングする、ＡＢＣＡ−ＳＳＮおよびＡＢＣＡ７のｃＤＮＡ断片のＰＣＲによる増幅の位置および制限酵素サイトを示す模式図である。各ボックスは各ｃＤＮＡのＡＢＣＡ−ＳＳＮおよびＡＢＣＡ７をコードする領域を示す。斜線のボックスは、ＡＢＣＡ−ＳＳＮに特異的なＮ末端領域をコードする部分を、点で埋めたボックスはＡＢＣＡ７に特異的なＮ末端領域をコードする部分を示す。矢印はＰＣＲに用いたプライマー、ＰＣＲ１、ＰＣＲ２、ＰＣＲ３、ＰＣＲ４は各プラスミドにサブクローニングした増幅断片を示す。黒いボックスはストップコドンを示す。
【図５】図５は、ｐＡＢＣＡ−ＳＳＮ／ＣＲ２．１、ｐＡＢＣＡ７／ＣＲ２．１の作製工程を示す図である。
【図６】図６は、ｐＣＭＶ６ｃＡＢＣＡ−ＳＳＮの構造を示す図である。ｈＧＨ ｐｏｌｙＡは、ヒト成長ホルモン遺伝子の転写終止およびポリアデニレーションシグナルの領域、ＳＶ４０ ｏｒｉはＳＶ４０の複製開始点および初期遺伝子のエンハンサー配列を含む領域、Ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子、ｆ１ ｏｒｉはｆ１ファージの複製開始点を示す。
【図７】図７は、ＨＥＫ２９３細胞で発現させたＡＢＣＡ−ＳＳＮおよびＡＢＣＡ−７の抗ｈＡＢＣＡ７−Ｃポリクローナル抗体による検出を示す図である。レーン１は発現ベクターを導入していないＨＥＫ２９３細胞、レーン２はＡＢＣＡ−７発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞、レーン３はＡＢＣＡ−ＳＳＮ発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞の膜画分をサンプルとしたウェスタンブロッティングの結果を示す。左の数字は分子量マーカーの位置を示す。
【図８】図８は、ＧＳＴとＡＢＣＡ７（４５−５４９）の融合蛋白質を免疫原としたウサギ抗血清の、融合蛋白質に対する反応性を測定するバインディングＥＬＩＳＡの結果を示す図である。横軸は抗体濃度、縦軸は４１５ｎｍでの吸光度を示す。■は融合蛋白質をアッセイ抗原とした場合、□はＧＳＴをアッセイ抗原とした場合の結果を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention provides an ATP-binding cassette transporter A7 (ATP-binding cassette transporter A7, hereinafter referred to as ABCA7) splicing variant polypeptide, a polynucleotide encoding the polypeptide, a recombinant vector containing the polynucleotide, and the vector. The present invention relates to a transformant obtained by introduction, a method for producing the ABCA-SSN polypeptide, an antibody that recognizes the polypeptide, and an oligonucleotide having a partial sequence of the polynucleotide or a complementary sequence. The present invention also relates to a method of using the polypeptide, the oligonucleotide and the antibody, for example, a medicament containing the polypeptide, the oligonucleotide or the antibody.
[0002]
[Prior art]
The ATP-binding cassette transporter (hereinafter referred to as ABC transporter) family consists of two hydrophobic domains that penetrate the cell membrane several times, and ATP-binding domain 2 that binds to ATP that is highly conserved within the family. It is a family of proteins that have the characteristics of a structure having a function and function as transporters and channels of various substances in cells.
[0003]
ABCA7 is an ABC transporter with high homology to the recently reported ABCA1 [Kaminski WE et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun.273532 (2000)]. ABCA1 is a causative gene for familial low density lipoprotein deficiency and Tanger disease [Bodzioch M et al. , Nat. Genet.22, 347 (1999); Brooks-Wilson A et al. , Nat. Genet.22336 (1999); Rust S et al. , Nat. Genet.22, 352 (1999)], which is considered to function as a transporter of cholesterol and phospholipid [Oram J et al. , J. et al. Biol. Chem.275, 34508 (2000); Wang N et al. , J. et al. Biol. Chem.275, 33053 (2000); Repa JJ et al. , Science289, 1524 (2000)], the expression level of ABCA7 increases when acetylated LDL is added to macrophages, and the increase is restored by the addition of HDL [Kaminski WE et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun.273, 532 (2000)], it is also considered that ABCA7 is involved in cholesterol transport, but its function is still unclear. It is reported that ABCA7 expression at the mRNA level is abundant in tissues of the immune system such as thymus, spleen, lymph node, bone marrow, and peripheral leukocytes, and is slightly expressed in lung, pancreas, and liver [Kaminski WE]. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun.273532 (2000)]. The genomic sequence of the ABCA7 gene has also been reported. The ABCA7 gene consists of 46 exons over a region of about 32 kb, and is reported to be on chromosome 19 [Kaminski WE et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun.278782 (2000)].
[0004]
On the other hand, SS-N cDNA (476 bp) is registered in the base sequence database GenBank (GenBank accession number: AF140342) as a cDNA of an autoantigen that reacts with sera of patients with Sjogren's disease, which is an autoimmune disease. Yes, the overall structure of SS-N was unknown.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The object of the present invention was to clarify the amino acid sequence of the entire Sjogren's disease autoantigen SS-N and the base sequence of its cDNA, and to provide a novel ABC transporter involved in the immune system.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventor found that the amino acid sequence encoded by the SS-N cDNA has high homology with the N-terminal part of ABCA1, and obtained a novel ABC transporter cDNA encoded by the full length SS-N cDNA. As a result, the obtained cDNA is a splicing variant generated by alternative splicing that is the product of the same gene as the reported ABCA7 cDNA and has a different sequence, and the resulting cDNA is encoded by It was found that the N-terminal of the amino acid sequence of the polypeptide differs from the reported N-terminal sequence of ABCA7 polypeptide. Furthermore, it was found that the splicing variant obtained in the present invention was not expressed in ABCA7 which was reported mainly in immune system tissues such as the thymus.
That is, the present invention relates to the following inventions (1) to (28).
[0007]
(1) A polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 6.
(2) consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, substituted and / or inserted into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 6, comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and A polypeptide having transporter activity.
[0008]
(3) A polynucleotide encoding the polypeptide according to (1) or (2).
(4) A polynucleotide comprising the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 4 or 5.
(5) hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 and comprising a sequence complementary to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 5; A polynucleotide encoding a polypeptide having transporter activity.
(6) The polynucleotide according to any one of (3) to (5), wherein the polynucleotide is DNA.
[0009]
(7) A recombinant vector obtained by incorporating the polynucleotide according to any one of (3) to (6) into a vector.
(8) A transformant obtained by introducing the recombinant vector according to (7) into a host cell.
(9) culturing the transformant according to (8) in a medium, producing and accumulating the polypeptide according to (1) or (2) in the culture, and collecting the polypeptide from the culture A method for producing the polypeptide according to (1) or (2), wherein
[0010]
(10) A polynucleotide fragment consisting of all or part of a sequence complementary to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
(11) A method for detecting or quantifying the polynucleotide according to any one of (3) to (5), using the polynucleotide fragment according to (10).
(12) Oligo having the same sequence as the sequence of 5 to 60 bases in the base sequence of the polynucleotide according to (3), (4) or (5) or in a sequence complementary to the base sequence Nucleotides or their derivatives.
(13) The oligonucleotide or derivative thereof according to (12), comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 21 or 22.
[0011]
(14) A method for detecting or quantifying the polynucleotide according to any one of (3) to (5) using the oligonucleotide or the derivative thereof according to (12) or (13).
(15) The method according to (11) or (14), which is carried out for diagnosis of autoimmune disease, Sjogren's disease, inflammatory disease, abnormal lipid metabolism, or arteriosclerosis.
(16) A method for suppressing the expression of the polypeptide according to (1) or (2), using the oligonucleotide or derivative thereof according to (12) or (13).
[0012]
(17) An antibody that recognizes the polypeptide according to (1) or (2).
(18) An antibody that does not recognize the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 but recognizes the polypeptide set forth in (1) or (2).
(19) The antibody according to (17) or (18), wherein the antibody recognizes a region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9.
(20) The antibody according to any one of (17) to (19), which inhibits the transporter activity of the polypeptide according to (1) or (2).
[0013]
(21) A method for detecting or quantifying the polypeptide according to (1) or (2) using the antibody according to any one of (17) to (20).
(22) A test in which the polypeptide described in (1) or (2) and a test substance coexist in a cell and the transporter activity of the polypeptide decreases when the test substance is not coexisted. A method for screening an inhibitor of ABCA-SSN, comprising selecting a substance.
(23) An ABCA-SSN inhibitor obtained by the screening method according to (22).
[0014]
(24) A medicament comprising the polypeptide according to (1) or (2).
(25) A medicament comprising the oligonucleotide or derivative thereof according to (12) or (13).
(26) A medicament comprising the antibody according to any one of (17) to (20).
(27) The medicament according to any one of (24) to (26), which is a prophylactic or therapeutic agent for autoimmune disease, Sjogren's disease, inflammatory disease, abnormal lipid metabolism, arteriosclerosis.
(28) The medicament according to any one of (24) to (27), which is a diagnostic agent for autoimmune diseases, Sjogren's disease, inflammatory diseases, abnormal lipid metabolism, and arteriosclerosis.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The polypeptide of the present invention is characterized by comprising one of the following amino acid sequences.
(A) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 6, or
(B) consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted and / or inserted into the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 or 6, comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9; A polypeptide having transporter activity.
[0016]
The origin of the polypeptide of the present invention is not particularly limited, and may be a naturally occurring polypeptide, a recombinant polypeptide produced using recombinant gene technology, or a chemically synthesized polypeptide. From the viewpoint that a large amount of polypeptide can be obtained relatively easily, a recombinant polypeptide is preferred.
A polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 6 can be easily produced by those skilled in the art based on the sequence information of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 6 disclosed in the present specification. it can. These details are described in the following 1. And 2. As described in.
[0017]
It consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, substituted and / or inserted into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 6, and comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and transporter activity In the present specification, a polypeptide encoding the polypeptide is first obtained by the method shown below. It can be obtained from a method using the gene recombination technique shown in the above, that is, from a culture obtained by culturing a transformant obtained by introducing an expression vector containing the polynucleotide into a host cell.
[0018]
Polynucleotides encoding the polypeptides are described in Zoller MJ & Smith M, Nucleic Acids Res.10, 6487 (1982), Dalbadie-McFarland G et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA79, 6409 (1982), Wells JA et al. , Gene34, 315 (1985), Carter P et al. Nucleic Acids Res.13, 4431 (1985), Kunkel TA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA82, 488 (1985) etc., for example, by introducing a site-specific mutation into a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 6. Can get.
[0019]
PCR [Ho SN et al., Ltd.] using a pair of primers each having a sequence introduced with the target mutation (deletion, addition, substitution and / or insertion) at the 5 'end. , Gene77, 51 (1989)], a mutation can be introduced into a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 6. That is, first, a sense primer corresponding to the 5 ′ end of the polynucleotide and an antisense primer corresponding to the sequence immediately before the mutation introduction site (5 ′ side) having a sequence complementary to the mutation sequence at the 5 ′ end. Then, PCR is carried out using the polynucleotide as a template to amplify a fragment A from the 5 ′ end of the polynucleotide to the mutagenesis site (a mutation is introduced at the 3 ′ end thereof). Next, the DNA is used as a template with a sense primer corresponding to the sequence immediately after the mutation introduction site (3 ′ side) having a mutation sequence at the 5 ′ end and an antisense primer corresponding to the 3 ′ end of the polynucleotide. PCR is performed to amplify the fragment B from the mutation introduction site to the 3 ′ end of the polynucleotide having the mutation introduced at the 5 ′ end. When these amplified fragments are purified and mixed and PCR is performed without adding a template or primer, the sense strand of amplified fragment A and the antisense strand of amplified fragment B have the same mutation introduction site and thus hybridize. The PCR reaction proceeds as a primer and template, and the polynucleotide having the mutation introduced is amplified.
[0020]
A polynucleotide encoding a partial fragment of a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 6, which is a kind of deletion mutant, encodes a partial fragment to be produced in the polynucleotide encoding the polypeptide. A polynucleotide encoding the polypeptide was used as a template, using as an primer an oligonucleotide having a sequence matching the 5 'end base sequence of the region and an oligonucleotide having a sequence complementary to the 3' end base sequence It can be obtained by performing PCR.
[0021]
The number of amino acids to be deleted, added, substituted and / or inserted is not particularly limited, and may be any number of 1 or more, but deleted by a well-known method such as the above-mentioned site-specific mutation method or PCR. The number is preferably such that addition, substitution and / or insertion is possible, generally about 1 to 100, preferably 1 to several tens, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, particularly preferably 1 to 5.
[0022]
In addition, in order for the polypeptide of the present invention to have transporter activity, the homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 6 is BLAST [Altzshul SF et al. , J. et al. Mol. Biol.215, 403 (1990)] and FASTA [Pearson WR, Methods in Enzymology.183, 63 (1990)], etc. using the default (initial setting) parameters, at least 60%, preferably 70%, more preferably 80%, more preferably 90% or more. Particularly preferably, it is 95% or more, and most preferably 98% or more.
However, the polypeptide of the present invention does not include known polypeptides.
[0023]
The “transporter activity” as used in the present invention refers to an activity of binding to a specific substance on the cell membrane, transporting the substance out of the cell, and discharging it.
[0024]
A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, substituted and / or inserted into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 6 and comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 has transporter activity Whether or not can be analyzed by the following method, for example.
First, a cell, preferably an animal cell, in which the polypeptide is expressed on a cell membrane is prepared by a recombinant gene technique by the method described later. Substances that are thought to be transported to these cells, such as cholesterol and phospholipids,3H or14What is labeled with a radioisotope such as C is added at a concentration of about 10 to 100 kBq / mL, and the cells are cultured for 16 to 24 hours to be incorporated into cells. After culturing, the cells are washed and cultured for 6 to 72 hours in a medium that does not contain a substance that is thought to be transported. A certain amount of cells and medium are collected over time, and the radioactivity is measured by a liquid scintillation counter or the like. Measure with a vessel. The ratio of the amount of radioactivity in the medium to the amount of radioactivity incorporated into the cells is analyzed as transporter activity.
[0025]
The present invention also provides a polynucleotide encoding the above-described polypeptide of the present invention. Specific examples of the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention include any of the following polynucleotides.
(A) a polynucleotide comprising the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 4 or 5:
(B) hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, and comprising a sequence complementary to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 5; A polynucleotide encoding a polypeptide having transporter activity.
[0026]
“Polynucleotide hybridizing under stringent conditions” refers to a colony hybridization method, plaque high, using a polynucleotide comprising a sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 5 as a probe. It means a polynucleotide obtained by using a hybridization method or Southern blot hybridization method, specifically, 0.7 to 1.0 mol / L using a filter on which colony or plaque-derived DNA is immobilized. After hybridization at 65 ° C. in the presence of NaCl, 0.1- to 2-fold concentration of SSC (saline-sodium citrate) solution (the composition of 1-fold concentration of SSC solution is 150 mmol / L sodium chloride, 15 mmol / L citric acid Used consisting thorium), can be mentioned polynucleotides can be identified by washing the filter with 65 ° C. conditions.
[0027]
Hybridization is described in Sambrook J et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (hereinafter abbreviated as "Molecular Cloning Second Edition"), Ausbel FM et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1~38, John Wiley & Sons (1987-1997), Glover DM and Hames BD, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995) such as It can be performed according to the method described in the experiment document.
[0028]
In order for the polynucleotide to hybridize with a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 5 under stringent conditions and to encode a polypeptide having transporter activity, BLAST or FASTA When using the default (initial setting) parameters in an analysis program such as, the base sequence described in SEQ ID NO: 2 or 5 is at least 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly A polynucleotide having a base sequence having a homology of 98% or more is desirable.
[0029]
However, the polynucleotide of the present invention does not include a known polynucleotide.
Examples of the nucleic acid of the polynucleotide of the present invention include DNA or RNA. The polynucleotide of the present invention may be single-stranded or double-stranded, and both are included.
[0030]
The implementation method and utilization method of the present invention will be described in detail below.
1. Preparation of the polynucleotide of the present invention
ABCA-SSN full length cDNA can be mentioned as the polynucleotide of the present invention. The full-length ABCA-SSN cDNA in the present specification includes the entire ABCA-SSN, ie, the sequence, in addition to the full-length ABCA-SSN cDNA derived from the full-length ABCA-SSN mRNA having a cap structure and a poly (A) chain. All cDNAs having an open reading frame (ORF) encoding the amino acid sequence of No. 3 or 6 are included. Full-length ABCA-SSN cDNA can be prepared as follows.
[0031]
(1) Preparation of ABCA-SSN full-length cDNA
For ABCA-SSN cDNA, a base sequence database is searched for a base sequence having a sequence that matches the base sequence of SS-N cDNA (GenBank access number: AF140342) using a homology analysis program such as BLAST. As a base sequence database, in addition to a public database such as GenBank, as in the present invention, a private database created by constructing a cDNA library in advance, determining the base sequence of each clone and accumulating it is also available. Can be used. Examples of such a base sequence include the base sequence of cDNA clone hh10210 and the base sequence of ABCA7 (GenBank access number AF250238) searched from the base sequence database of the human long-chain cDNA clone held by Kazusa DNA Laboratory. . ABCCA-SSN cDNA can be obtained by obtaining a cDNA clone based on the base sequence obtained as a result of the search, such as hh10210, or by PCR using sequence information.
[0032]
The method for preparing a cDNA library is described below. To prepare a cDNA library, total RNA or mRNA is prepared from appropriate cells or tissues. Suitable cells or tissues include human thymus, macrophages, spleen, brain and the like. As a method for preparing total RNA, guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymology,154, 3 (1987)], acidic guanidine thiocyanate-phenol-chloroform (AGPC) method [Chomczynski P and Sacci N, Analytical Biochemistry,162, 156 (1987), experimental medicine9, 1937 (1991)]. Poly (A) from total RNA+As a method for preparing mRNA as RNA, an oligo (dT) -immobilized cellulose column method (molecular cloning second edition), a method using oligo dT latex, or the like can be used. In addition, First Track mRNA Isolation Kit [Fast Track mRNA Isolation Kit; manufactured by Invitrogen], Quick Prep mRNA Purification Kit [Quick Prep mRNA Purification Kit; Amersham Pharmacia Biotech It is also possible to prepare mRNA directly from tissues or cells using a kit such as “manufactured”.
[0033]
Using the obtained total RNA or mRNA, a cDNA library is prepared by a conventional method. Methods for preparing a cDNA library include Molecular Cloning 2nd Edition and Ausbel FM et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1~38, John Wiley & Sons (1987-1997), Glover DM and Hames BD, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995), Ohara O et al. , DNA Res.453 (1997), or commercially available kits such as Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning [SUPERSCRIPT Plasmid System for cDNA Cloning and Plasmid Cloning; Life Technologies (Manufactured by Life Technologies) or a method using a Zap-cDNA synthesis kit (ZAP-cDNA Synthesis Kit, manufactured by Stratagene).
[0034]
As a cloning vector for preparing a cDNA library, any phage vector or plasmid vector can be used as long as it can replicate autonomously in Escherichia coli K12.
Specifically, pBluescript II SK (+) [manufactured by Stratagene; Alting-Mees MA and Short JM, Nucleic Acids Res.179494 (1989)], Lambda ZAP II (Stratagene), λgt10, λgt11 [Glover DM, DNA Cloning, A Practical Approach,1, 49 (1985)].
[0035]
As the host microorganism, Escherichia coliEscherichia coliIt is preferable to use microorganisms belonging to. In particular,Escherichia coli XL1-Blue MRF '(manufactured by Stratagene),Escherichia coli SORTM ™ (Stratagene)Escherichia coli DH10B (Life Technologies),Escherichia coli Y1088 [Young RA and Davis RW, Science222, 778 (1983)],Escherichia coli Y1090 [Young RA and Davis RW, Science222, 778 (1983)],Escherichia coli DH5α (Life Technologies) can be used.
[0036]
In addition to the cDNA library prepared by the above method, a commercially available cDNA library can also be used. Examples of commercially available cDNA libraries include human thymus cDNA libraries such as Clontech and Takara Shuzo.
The nucleotide sequence of the obtained cDNA was determined by DNA sequencer (Applied Biosystems 377, etc.) or DNAO method [Sanger] manufactured by Applied Biosystems, Amersham Pharmacia Biotech, or Licore (LI-COR). F et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA,74, 5463 (1977)].
[0037]
Alternatively, PCR using sequence information [M. J. et al. McPherson t al. In order to obtain ABCA-SSN cDNA by PCR, A practical Approach, Oxford University Press (1991)], first, for example, a tissue or cell from which the cDNA clone based on the obtained base sequence information was isolated, for example, A single-stranded cDNA or a cDNA library is prepared from human thymus, spleen, brain, macrophage and the like by the above method. Single-stranded cDNA can be mixed by preparing total RNA by the method described in the above cDNA library preparation method, and further treating the total RNA with deoxyribonuclease I (Life Technologies) as necessary. Decomposes sexual chromosomal DNA. For the total RNA obtained, a superscript first strand system for RT-PCR using an oligo (dT) primer or a random primer (SUPERSCRIPT First-Strand Synthesis System for RT-PCR; Life Technologies) Single-stranded cDNA is prepared by using the kit. Next, oligo DNA having a sequence of 10 to 30 bases from the 5 ′ end of the base sequence information of ABCA-SSN cDNA and an oligo DNA having a sequence complementary to the sequence of 10 to 30 bases from the 3 ′ end are used as primers, ABCA-SSN cDNA can be amplified and isolated by performing PCR using the single-stranded cDNA or the cDNA library as a template. Oligo DNA can be synthesized with a DNA synthesizer such as ABI392 or ABI3948 manufactured by Applied Biosystems. In addition, synthesis can be requested from GENSET or Takara Shuzo Co., Ltd.
[0038]
When the ABCA-SSN cDNA obtained as described above is considered not to be full length, the cDNA library such as human thymus prepared as described above is used as a template, and the ABCA-SSN cDNA obtained on the 5 ′ side By performing PCR using oligo DNA having a sequence complementary to the above sequence and oligo DNA having a sequence 5 'to the cloning site of the library as a primer, a cDNA fragment 5' to the cDNA obtained first Can be obtained. Similarly, using the obtained ABCA-SSN cDNA oligo DNA having a 3 ′ sequence and oligo DNA having a sequence complementary to the 3 ′ sequence from the library cloning site, the cDNA library as a template. By performing PCR, a 3'-side cDNA fragment can be obtained from the cDNA initially obtained. Alternatively, cDNA is prepared from human thymus, etc., adapter oligo DNA is added to both ends of the cDNA, and PCR is performed with primers based on the base sequence of this adapter and the base sequence of the cDNA obtained first 5′-RACE ( rapid amplification of cDNA ends) method and 3′-RACE method [Frohman MA et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85, 8998 (1988)], cDNA fragments on the 5 'side and 3' side of the sequence used for the primer can also be obtained.
[0039]
The nucleotide sequence of the cDNA encoding the entire ABCA-SSN is clarified by determining the nucleotide sequence of the 5 ′ or 3 ′ cDNA fragment thus obtained in the same manner as the cDNA obtained first. be able to. The sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 4 can be given as the base sequence of ABCA-SSN cDNA thus revealed. These sequences are splicing variants in which the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 is inserted into the base sequence of the known ABCA7 cDNA. By translating the nucleotide sequence of ABCA-SSN cDNA thus clarified into amino acids, the amino acid sequence of ABCA-SSN encoded by the cDNA can be clarified. Examples of the amino acid sequence of ABCA-SSN thus clarified include the sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 6. Moreover, as a polynucleotide which codes ABCA-SSN, the polynucleotide which has the base sequence in any one of sequence number 1, 2, 4 or 5 can be mention | raise | lifted. As long as the entire amino acid sequence of ABCA-SSN is encoded, the base sequence of each codon in the region encoding ABCA-SSN is not limited to the codon used in the cDNA, but encodes the same amino acid. Any codon base sequence can be used.
[0040]
The cDNAs obtained above are joined together using an appropriate restriction enzyme site or the like, or the revealed ABCA-SSN full-length cDNA has an oligo DNA having a 5 ′ sequence and a 3 ′ sequence nucleotide sequence. The ABCA-SSN full-length cDNA can be prepared by PCR using a primer based on a cDNA or cDNA library prepared from a tissue expressing ABCA-SSN, for example, human thymus, etc. as a template. Further, the ABCA-SSN full-length cDNA obtained in this way was transformed into E. coli using the ABCA-SSN full-length cDNA clone cloned into an appropriate cloning vector, the transformed E. coli was cultured, ABCA-SSN full-length cDNA can be prepared by preparing plasmid DNA.
[0041]
PABCA-SSN / CR2.1, which is a plasmid obtained by inserting the DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 into the vector pCR2.1 (Stratagene), was obtained on May 15, 2001. It has been deposited as FERM BP-7687 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Microbiology Deposit Center (1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan) on the date.
Alternatively, ABCA-SSN full-length cDNA can also be chemically synthesized with the DNA synthesizer described above based on its base sequence.
[0042]
(2) Acquisition of DNA encoding ABCA-SSN of other organisms
In general, proteins having the same function often have amino acid sequences that are not identical but show homology when the species are different. Therefore, the DNA encoding the protein is considered to show homology as well. In addition, gene mutations progress with the evolution of organisms, so the closer the species, the higher the homology. Therefore, by using the human ABCA-SSN cDNA obtained in (1) or its nucleotide sequence information, ABCA-SSN cDNA of other mammals such as mice can be obtained by the following method. When this cDNA is not full length cDNA, full length cDNA can be obtained by using the same method as in (1).
[0043]
(2-1) Screening of cDNA library
An ABCA-SSN cDNA clone of a non-human organism is obtained from the same tissue in which the human ABCA-SSN is expressed, such as thymus, macrophage, spleen, and brain, in the same manner as in (1). Or a commercially available cDNA library of such tissue is purchased, and human ABCA-SSN cDNA labeled with a radioisotope or digoxigenin is used as a probe from the cDNA library. It can be obtained by performing colony hybridization or plaque hybridization under various conditions. The somewhat stringent conditions referred to here differ depending on the degree of homology between the human ABCA-SSN cDNA and the ABCA-SSN cDNA of the organism, but the human ABCA-SSN cDNA with respect to the chromosomal DNA of the organism cut by the restriction enzyme. As a probe, Southern blot hybridization is carried out under several hybridization conditions with different degrees of stringency, and the most stringent condition is used among the conditions where a clear band can be seen. For example, in the case of a hybridization solution that does not contain formamide, the composition of the hybridization solution is that the salt concentration is fixed at 1 mol / L, and hybridization is performed under several conditions in which the hybridization temperature is changed stepwise from 68 ° C to 42 ° C. And wash with 2 × SSC containing 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS) at the same temperature as hybridization. Alternatively, in the case of a hybridization solution containing formamide, hybridization is performed under several conditions in which the temperature is 42 ° C. and the salt concentration (6 × SSC) is fixed, and the formamide concentration is changed stepwise from 50 to 0%. Determine by washing with 6 × SSC containing 0.5% SDS at 0 ° C.
[0044]
(2-2) Use of EST and genome sequence
The base sequence of the human ABCA-SSN cDNA obtained in (1), in particular the base sequence of the DNA of the organism having high (specifically, 80% or more) homology with the protein-encoding region. By searching using a homologous program such as BLAST from the nucleotide sequence database, the nucleotide sequence of genomic DNA containing the EST or ABCA-SSN gene exon portion presumed to be derived from ABCA-SSN cDNA of the organism is found. Can do. Examples of such base sequences include GenBank access numbers AF213395, BB446688, and BB122378 mouse ESTs and partial cDNA sequences. Obtain cDNA clones based on these sequences, or create primers based on these sequences, such as the thymus, macrophage, spleen, brain, etc. of the organism considered to be expressing ABCA-SSN By performing RT-PCR similar to (1) from RNA prepared from tissue and amplifying a DNA fragment, ABCA-SSN cDNA of the organism can be obtained. Even if this cDNA is not full length, this cDNA is probed and hybridized at 65 ° C. in a solution containing very stringent conditions (for example, a solution containing 6 × SSC-0.5% SDS-5 × Denhardt's solution). And 2 × SSC-0.1% SDS at 65 ° C.). A cDNA library prepared from tissues of the organism such as thymus, macrophage, spleen, and brain is obtained by colony hybridization or plaque hybridization. By screening, an ABCA-SSN cDNA clone of the organism can be obtained.
[0045]
(3) Preparation of ABCA-SSN oligonucleotide
By using the DNA synthesizer described in (1), an oligonucleotide having a partial sequence of the ABCA-SSN polynucleotide of the present invention or an oligonucleotide having a complementary base sequence (hereinafter abbreviated as ABCA-SSN oligonucleotide). Can be prepared.
Specific examples of the ABCA-SSN oligonucleotide include DNA having the same sequence as 10 to 60 bases in the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 4, or DNA having a sequence complementary to the DNA. be able to. When these DNAs are used as a sense primer or an antisense primer, an oligonucleotide in which the melting temperature and the number of bases do not change extremely is preferable.
[0046]
Furthermore, derivatives of these oligonucleotides (hereinafter referred to as oligonucleotide derivatives) can also be used as the oligonucleotide of the present invention.
The oligonucleotide derivative includes an oligonucleotide derivative in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted into a phosphorothioate bond, and a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted into an N3′-P5 ′ phosphoramidate bond. Oligonucleotide derivatives, oligonucleotide derivatives in which the ribose and phosphodiester bonds in the oligonucleotide are converted to peptide nucleic acid bonds, oligonucleotide derivatives in which the uracil in the oligonucleotide is replaced with C-5 propynyluracil, in the oligonucleotide Derivative in which uracil is substituted with C-5 thiazole uracil, oligonucleotide derivative in which cytosine in the oligonucleotide is substituted with C-5 propynylcytosine, oligonucleotide An oligonucleotide derivative in which cytosine is substituted with phenoxazine-modified cytosine, an oligonucleotide derivative in which ribose in the oligonucleotide is substituted with 2′-o-propylribose, or ribose in the oligonucleotide is Examples include oligonucleotide derivatives substituted with 2'-methoxyethoxyribose [Kazutaka Yokoyama, Cell Engineering,16, 1463 (1997)].
[0047]
2. Method for producing ABCA-SSN polypeptide
ABCA-SSN polypeptide which is the polypeptide of the present invention is described in Molecular Cloning 2nd edition, Glover DM and Hames BD; DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford, et al. According to the modified gene recombination method, Can be produced using the polynucleotide encoding ABCA-SSN prepared in (1).
That is, a recombinant vector in which a DNA encoding ABCA-SSN which is a polynucleotide encoding ABCA-SSN (hereinafter abbreviated as ABCA-SSN DNA) is inserted downstream of the promoter of an appropriate expression vector is prepared, By introducing a vector into a host cell, a transformant expressing ABCA-SSN polypeptide is obtained, and the ABCA-SSN polypeptide of the present invention can be produced by culturing the transformant.
[0048]
As the expression vector, a vector that can replicate autonomously in a host cell or can be integrated into a chromosome and contains a promoter capable of transcribing mRNA from ABCA-SSN DNA in the host cell is used.
As the host cell, any prokaryote, yeast, animal cell, insect cell, plant cell or the like can be used as long as it can express the target gene. Moreover, an animal individual or a plant individual can be used.
[0049]
When a prokaryotic organism such as a bacterium is used as a host cell, an expression vector that can replicate autonomously in the host prokaryotic organism and has ABCA-SSN DNA arranged downstream of a promoter having a ribosome binding sequence is used. It is preferable that the distance between the ribosome binding sequence and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases in the case of an E. coli host vector). Although not always necessary, it is preferable to place a transcription termination sequence directly under ABCA-SSN DNA. In addition, for selection of a transformant, a sequence that expresses a gene serving as a marker such as a drug resistance gene is included.
[0050]
Any promoter can be used as long as it can be expressed in the host cell. For example, when E. coli is used as a host,trppromoter,lacPromoter, PLPromoter, T7 promoter, PRExamples of the promoter include promoters derived from E. coli and phages. AlsotrpA promoter in which two promoters are connected in series,tacPromoter, T7lacAn artificially designed and modified promoter such as a promoter and letI promoter can also be used. When Bacillus subtilis is used as a host, SPO1 and SPO2 promoters that are Bacillus subtilis phages, PenP promoters, and the like can be mentioned.
[0051]
Examples of the expression vector include pSE280 [manufactured by Invitrogen], pGEMEX-1 [manufactured by Promega], pQE-8 [manufactured by QIAGEN], pKYP200 [Nishi T et al. , Agric. Biol. Chem.48, 669 (1984)], pLSA1 [Nishi T et al. , Agric. Biol. Chem.53, 277 (1989)], pGEL1 [Sekin S et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA82, 4306 (1985)], pBluescript II SK (-) (manufactured by Stratagene), pKK223-3 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), pGEX-5X-3 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), pET14 [ Novagen] etc. can be exemplified.
[0052]
Host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc.Escherichia coli XL1-Blue,Escherichia coli XL2-Blue,Escherichia coli DH1,Escherichia coli MC1000,Escherichia coli KY3276,Escherichia coli W1485,Escherichia coli JM109,Escherichia coli HB101,Escherichia coli No. 49,Escherichia coli W3110,Escherichia coli NY49,Serratia ficaria,Serratia fonticola,Serratia liquidfaciens,Serratia marcescens,Bacillus subtilis,Bacillus amyloliquefaciens,Brevibacte rium amoniagenes,Brevibacterium immariophilum ATCC 14068,Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066,Corynebacterium glutamicum ATCC 13032,Corynebacterium glutamicum ATCC 14067,Corynebacterium glutamicum ATCC 13869,Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870,Microbacterium amoniaphilum ATCC 15354,Pseudomonas sp. D-0110 etc. can be mentioned.
[0053]
As a method for introducing the recombinant vector, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell. For example, electroporation [Dower WJ et al. Nucleic Acids Res.16, 6127 (1988)], a method using calcium ions [Cohen SN et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA69, 2110 (1972), Reid JD et al. , Gene17, 107 (1982)], protoplast method [Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394, Chan S and Cohen SN, Mol. Gen. Genet.168, 111 (1979)].
[0054]
As an expression vector when yeast is used as a host cell, a promoter for transcription in host yeast, ABCA-SSN DNA, a transcription termination sequence, and a gene serving as a transformation marker in yeast, such as a drug resistance gene, TRP1, HIS3, Those containing sequences capable of expressing amino acid synthesis genes such as LUE2 are used. Moreover, in order to make preparation and maintenance of an expression vector easy, what can express the drug resistance gene used as an autonomous replication and gene transfer marker also in E. coli is preferable.
[0055]
As the promoter, any promoter can be used as long as it can perform transcription in yeast.Saccharomyces cerevisiaeAlcohol dehydrogenase gene ADH1, galactose metabolism gene GAL1 or GAL10 promoter, acid phosphatase gene PHO5 promoter, phosphoglycerate kinase gene PGK promoter, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene GAP promoter, heat shock protein gene promoter, α Mating factor gene MFα1 promoter, copper metallothionein gene CUP1 promoter,Pichia pastorisThe promoter of the alcohol oxidase gene AOX1 is used.
[0056]
Examples of host cells include Saccharomyces genus, Schizosaccharomyces genus, Kluyveromyces genus, Trichosporon genus, Siwaniomyces genus, Pichia genus, etc., specifically,Saccharomyces cerevisiae,Schizosaccharomyces pombe,Kluyveromyces lactis,Trichosporon pullulans,Schwanniomyces alluvius,Pichia pastorisEtc.
[0057]
As a method for introducing the recombinant vector, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast. For example, electroporation [Becker DM and Guarente L, Methods. Enzymol.194, 182 (1991)], spheroplast method [Shortle D et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA81, 4889 (1984)], lithium acetate method [Ito H et al. , J. et al. Bacteriol.153, 163 (1983)].
[0058]
When an animal cell is used as a host, an expression vector containing a promoter for transcription in the host animal cell, ABCA-SSN DNA, and a signal sequence for termination of transcription and polyadenylation of the transcript is used. In order to facilitate the production and maintenance of the vector, those capable of expressing a drug resistance gene serving as an autonomous replication and gene transfer marker in E. coli are desirable. Any promoter can be used as long as it can transcribe in animal cells. The SV40 early promoter, the human cytomegalovirus IE (immediate early) gene promoter and enhancer, Rous sarcoma virus, human Virus-derived sequences such as LTR (long terminal repeat) of retroviruses such as T cell leukemia virus I and Moloney mouse leukemia virus, or promoters of animal cell-derived genes such as metallothionein gene, β-actin gene, elongation factor-1 Etc. In addition, promoters obtained by artificially combining these promoters such as SRα promoter combining SV40 early promoter and human T cell leukemia virus I LTR may also be used.
[0059]
A constitutive ABCA-SSN polypeptide-expressing cell in which ABCA-SSN DNA is incorporated into the host chromosomal DNA is an ABCA-SSN polypeptide expression vector containing a sequence capable of expressing a gene resistant to drugs such as G418 and hygromycin. Can be selected by culturing in the presence of a drug. Further, in order to increase the production amount of ABCA-SSN polypeptide in the host cell, a constant expression vector of ABCA-SSN polypeptide containing a sequence capable of expressing the dihydrofolate reductase (dhfr) gene is used as the host cell. The copy number of ABCA-SSN DNA can be amplified together with the dfhr gene by introducing and culturing while increasing the concentration of methotrexate which is a dhfr inhibitor stepwise. As a host cell for gene amplification using the dhfr gene, a cell in which the dhfr gene does not function, for example, CHO / dhfr−(ATCC: CRL-9096) or the like is used.
[0060]
Specific examples of the vector used for the above-described ABCA-SSN polypeptide expression vector include pEGFP-C2 (manufactured by Clontech), pAGE107 [Japanese Patent Laid-Open No. 3-22979, Miyaji H et al. , Cytotechnol.3133 (1990)], pAS3-3 (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), pCDM8 [Seed B, Nature329, 840 (1987)], pcDNA3.1 (+) (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pBK-RSV (Stratagene), pSVK3 (Amersham Pharmacia Biotech), pAMo [Sasaki] K et al. , J. et al. Biol. Chem.268, 22782 (1993)], pCMV6C [ATCC number: 87782, Andersson S et al. , J. et al. Biol. Chem.H.264, 8222 (1989)].
[0061]
Host cells include human cells HeLa, Namalwa, HEK293 (CRL-1573), African green monkey kidney cells COS-1 and COS-7, hamster cells CHO and BHK, mouse fetal cells. Cell lines such as certain NIH3T3, mouse myeloma cells SP2 / 0 and NS0, rat myeloma cells YB2 / 0, and the like can be mentioned.
[0062]
As a method for introducing a recombinant vector, any method for introducing DNA into animal cells can be used. For example, electroporation [Miyaji H et al, Cytotechnol.3, 133 (1990)], calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 227075), lipofection method [Felner PL et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA84, 7413 (1987)].
[0063]
When insect cells are used as host cells, a baculovirus expression system [O'Reilly DR et al. , Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992), Luckow VA and Summers MD, Bio / Technology6, 47 (1988)]. Specifically, after ABCA-SSN DNA is inserted into a vector called a transfer vector, the vector and baculovirus are simultaneously introduced into insect cells, and ABCA-SSN DNA is inserted under the polyhedrin gene promoter, which is a strong promoter. After producing baculovirus by homologous recombination, ABCA-SSN polypeptide can be expressed by infecting insect cells again with this recombinant baculovirus.
[0064]
As a baculovirusAutographa californica Nuclear polyhedrosis virus, silkworm nuclear polyhedrosis virus and the like are used. As an insect cellSpodoptera frugiperdaCells Sf9 and Sf21 [O'Reilly DR et al. , Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)],Trichoplusia niHigh5 (manufactured by Invitrogen) and the like can be used. Also, silkworm larvae can be used as they are. The transfer vector includes a polyhedrin promoter and a baculovirus-derived sequence for causing homologous recombination, and a sequence for carrying out genetic manipulation such as maintenance and propagation of the vector and incorporation of a foreign gene in E. coli (in E. coli Examples include pVL1392, pVL1393, pBlue4.5 (both manufactured by Invitrogen), and the like.
[0065]
Individual animals can also be used to produce ABCA-SSN polypeptides. For example, a known method [Colman A. et al. , Am. J. et al. Clin. Nutr.63, 639S (1996), Rosen JM et al. , Am. J. et al. Clin. Nutr. ,63, 627S (1996), Wright G et al. , Bio / Technology,9, 830 (1991)], an ABCA-SSN polypeptide can be produced in an animal into which ABCA-SSN DNA has been introduced.
[0066]
Any promoter can be used as long as it can be expressed in animals. For example, α-casein promoter, β-casein promoter, β-lactoglobulin promoter, whey acidic protein promoter, etc., which are specific for mammary cells are suitable. Used for.
[0067]
When plant cells or plant individuals are used as a host, a known method [Akira Izawa, tissue culture,20, 6 (1994), Takashi Hashimoto, Tissue culture,21, 14 (1995), Miele L, Trends Biotechnol.1545 (1997)], an ABCA-SSN polypeptide can be produced.
[0068]
Any promoter can be used as the ABCA-SSN polypeptide expression as long as it can express the gene in plant cells, and examples thereof include cauliflower mosaic virus 35S promoter and rice actin 1 promoter. . Moreover, the expression efficiency of ABCA-SSN polypeptide can also be increased by inserting intron 1 of the corn alcohol dehydrogenase gene between the promoter and ABCA-SSN DNA.
Examples of host cells include plant cells such as potato, tobacco, corn, rice, rape, soybean, tomato, wheat, barley, rye, alfalfa and flax.
[0069]
As a method for introducing a recombinant vector, any method for introducing DNA into plant cells can be used. For example, Agrobacterium (Agrobacterium), Electroporation [Miyaji H et al. , Cytotechnol. ,3133 (1990)], a method using a particle gun (gene gun), and the like.
Plant cells and organs into which ABCA-SSN DNA has been introduced can be cultured in large quantities using a jar fermenter. In addition, a plant individual (transgenic plant) into which ABCA-SSN DNA has been introduced can also be created by redifferentiating the gene-introduced plant cells.
[0070]
A transformant derived from a microorganism, animal cell, or plant cell having a recombinant vector incorporating ABCA-SSN DNA is cultured according to a normal culture method to produce and accumulate ABCA-SSN polypeptide, and the culture. By collecting ABCA-SSN polypeptide more, ABCA-SSN polypeptide can be produced.
Any medium can be used as a medium for culturing a transformant using animal cells as a host, as long as it is a medium that can be used for culturing commonly used animal cells. For example, RPMI1640 medium [J. Am. Med. Assoc.199519 (1967)], Eagle's minimum essential medium [MEM; , Science122, 501 (1952)], Dalbecco's Modified Eagle Medium [DMEM; Dalbecco R and Freeman G, Virology.8, 396 (1959)], 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. ,731 (1950)] or a medium obtained by adding fetal calf serum or the like to these mediums. If necessary, antibiotics such as penicillin and streptomycin may be added to the medium. Culture is usually pH 6-8, 30-40 ° C., 5% CO2Perform for 1-7 days under conditions such as presence.
[0071]
As a medium for culturing a transformant obtained by using insect cells as host cells, a commonly used TMN-FH medium (manufactured by BD Pharmingen), Sf-900 II SFM medium [Life Technologies (Life Technologies)], EX-CELL400, EX-CELL405 [all manufactured by JRH Biosciences, Inc.], Grace's insect medium [Grace TDC, Nature195, 788 (1962)] and the like. The culture conditions are preferably pH 6-7, culture temperature 25-30 ° C., and culture time is usually 1-5 days. Moreover, you may add antibiotics, such as a gentamicin, to a culture medium as needed during culture | cultivation.
[0072]
When the transformant is an animal individual or plant individual, it is reared or cultivated according to a usual method, ABCA-SSN polypeptide is produced and accumulated, and ABCA-SSN polypeptide is collected from the animal individual or plant individual. ABCA-SSN polypeptides can be produced.
[0073]
That is, in the case of an animal individual, for example, a non-human transgenic animal carrying ABCA-SSN DNA is bred, and the ABCA-SSN polypeptide encoded by the recombinant DNA is produced and accumulated in the animal. By collecting ABCA-SSN polypeptide from the inside, ABCA-SSN polypeptide can be produced. Examples of the production / accumulation place in the animal include milk and eggs of the animal.
[0074]
In the case of a plant individual, for example, by cultivating a transgenic plant carrying ABCA-SSN DNA, generating and accumulating ABCA-SSN polypeptide in the plant, and collecting ABCA-SSN polypeptide from the plant, ABCA-SSN polypeptides can be produced.
[0075]
As a medium for culturing a transformant obtained by using a prokaryote such as E. coli or a eukaryote such as yeast as a host, the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and the like that can be assimilated by the organism. Any natural or synthetic medium may be used as long as the medium can efficiently be cultured.
The carbon source may be anything that can be assimilated by the organism, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, ethanol, Alcohols such as propanol can be used.
[0076]
Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids such as ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein A hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented cells, digests thereof, and the like can be used.
As the inorganic salt, dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
[0077]
The culture is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture. The culture temperature is preferably 15 to 40 ° C., and the culture period is usually 16 to 96 hours. During the culture, the pH is maintained at 3.0 to 9.0. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like. If necessary, antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the medium during the culture period.
When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example,lacWhen culturing a microorganism transformed with an expression vector using a promoter, isopropylthiogalactoside (IPTG), etc.,trpWhen culturing a microorganism transformed with an expression vector using a promoter, indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
[0078]
In order to isolate and purify the ABCA-SSN polypeptide accumulated in the culture of the transformant, the following normal polypeptide isolation and purification methods may be used.
When the ABCA-SSN polypeptide is secreted extracellularly, the ABCA-SSN polypeptide accumulates in the medium. Therefore, after completion of the culture, only the medium containing no cells is collected by a technique such as centrifugation. From this medium, the usual protein isolation and purification methods, that is, solvent extraction method, salting out method using ammonium sulfate, desalting method, precipitation method using organic solvent, DEAE Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical) Co., Ltd.), anion exchange chromatography using a resin such as Mono-Q (Amersham Pharmacia Biotech), and cation exchange using a resin such as SP Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech). Chromatographic methods, hydrophobic chromatography methods using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration methods using molecular sieves, affinity chromatography methods, electrophoresis methods such as chromatofocusing methods and isoelectric focusing etc. Using a single method or a combination of methods, It is possible to obtain.
[0079]
When the ABCA-SSN polypeptide accumulates in the cells of the transformant, the cells of the transformant are recovered from the culture after completion of the culture by a technique such as centrifugation, and suspended in a buffer solution. A cell-free extract is obtained by crushing cells with an ultrasonic crusher, French press, or the like. When the ABCA-SSN polypeptide is present in a dissolved state in the cell, a purified standard is obtained from the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract in the same manner as in the purification and isolation from the above medium. Goods can be obtained. In addition, when the ABCA-SSN polypeptide is present in an insoluble form on the cell membrane or in the cell, the cell-free extract is centrifuged, and then the ABCA-SSN polypeptide cell membrane or insoluble matter is used as a precipitate fraction. to recover. After solubilizing the cell membrane or insoluble matter of this BABCA-SSN polypeptide with a protein denaturing agent, the solubilized solution is made into a solution that does not contain the protein denaturing agent or is so diluted that the protein denaturing agent does not denature the protein. After dilution or dialysis to restore the ABCA-SSN polypeptide to a normal three-dimensional structure, a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
[0080]
Moreover, a known method [Kigawa T. et al. J. et al. Biomol. NMR,6, 129 (1998), Spirin A. et al. S. Science,242, 1162 (1988), Kigawa T .; & Yokoyama S. , J. et al. Biochem. ,110, 166 (1991)],in vitroABCA-SSN polypeptides can be produced using transcription / translation systems. That is, ABCA-SSN DNA is ligated downstream of promoters such as SP6, T7, T3, etc., and each promoter-specific RNA polymerase is reacted to synthesize RNA encoding a large amount of ABCA-SSN in vitro. ABCA-SSN polypeptide can be produced using a cell-based translation system such as a translation system using rabbit reticulocyte lysate or wheat germ extract.
The structural analysis of the purified ABCA-SSN polypeptide can be carried out by a method usually used in protein chemistry, for example, the method described in “Protein Structural Analysis for Gene Cloning” [Hisashino Hirano, Tokyo Chemical Dojin (1993)]. is there.
[0081]
3. Preparation of antibodies recognizing ABCA-SSN polypeptide
Examples of the antibody recognizing the ABCA-SSN polypeptide include a polyclonal antibody or a monoclonal antibody that recognizes the ABCA-SSN polypeptide.
[0082]
(1) Preparation of polyclonal antibody
2. A full-length or partial fragment protein of ABCA-SSN polypeptide obtained by the method described in 1. or a partial peptide of ABCA-SSN polypeptide produced by a chemical synthesis method using a peptide synthesizer or the like as an antigen, and administered to an animal. Polyclonal antibodies can be made.
As a method for immunization, it is preferable to administer an antigen together with an appropriate adjuvant, subcutaneously, intravenously or intraperitoneally in an animal. Examples of adjuvants include Complete Freund's Adjuvant, aluminum hydroxide and pertussis vaccine.
Rabbits, goats, rats, mice, hamsters and the like can be used as animals to be administered. The dose of the antigen is preferably 50 to 200 μg per animal.
When a partial peptide is used as an antigen, it is desirable to use the partial peptide covalently bound to a carrier protein such as KLH (keyhole limpet hemocyanin) or bovine thyroglobulin.
[0083]
The antigen is administered 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. On the 3rd to 7th day after each administration, blood was collected from the fundus venous plexus, and the reaction of the serum with the antigen used for immunization was confirmed by enzyme immunoassay [Eiji Ishikawa, enzyme immunoassay, Medical School (1978), Harlow. E and Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
Polyclonal antibodies can be obtained by obtaining serum from a non-human mammal whose serum showed a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization, and separating and purifying the serum.
[0084]
Separation and purification methods include centrifugation, salting out with 40-50% saturated ammonium sulfate, caprylic acid precipitation [Harlow E and Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)], or DEAE And chromatography using an anion exchange column, a protein A column, a protein G column, a gel filtration column, etc., alone or in combination.
An antibody that does not recognize the known ABCA7 polypeptide and recognizes the polypeptide of the present invention is an amino acid sequence specific for the polypeptide of the present invention, such as three or more consecutive amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9. It can be produced by immunizing an animal by the above method using a peptide comprising an amino acid sequence as an antigen.
[0085]
(2) Preparation of monoclonal antibody
A monoclonal antibody that recognizes ABCA-SSN polypeptide can be prepared as follows.
(2-1) Preparation of antibody-producing cells
In (1) above, a rat whose serum showed a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization is used as a source of antibody-producing cells.
The spleen is removed 3 to 7 days after the final administration of the antigenic substance to the rat showing the antibody titer. The spleen is shredded in MEM, loosened with tweezers, centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes, and the supernatant is discarded. The spleen cells of the obtained precipitate fraction were treated with Tris-ammonium chloride buffer (pH 7.65) for 1 to 2 minutes to remove erythrocytes, and then washed 3 times with a minimum essential medium (MEM) to obtain the spleen obtained. Cells are used as antibody producing cells.
[0086]
(2-2) Preparation of myeloma cells
As myeloma cells, cell lines obtained from mice or rats are used. For example, 8-azaguanine resistant mice (from BALB / c) myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 [Yelton DE et al. Curr. Topics Microbiol. Immunol.81, 1 (1978), Kohler G and Milstein C, Eur. J. et al. Immunol.6, 511 (1976)], SP2 / 0-Ag14 [Sulman M et al. , Nature276, 269 (1978)], P3-X63-8653 [Seeger RC et al. , J. et al. Immunol.123, 1548 (1979)], P3-X63-Ag [Kohler G and Milstein C, Nature.256, 495 (1975)]. These cell lines consisted of 8-azaguanine medium [RPMI1640 medium with 1.5 mmol / L glutamine, 5 × 10 5-5subcultured in a medium supplemented with 15 mmol / L 2-mercaptoethanol, 10 μg / mL gentamicin and 10% fetal bovine serum (hereinafter referred to as normal medium) and further 15 μg / mL 8-azaguanine]. Cultivate in normal medium 3-4 days prior to fusion, and for fusion, the cells are 2 × 107Use more than one.
[0087]
(2-3) Production of hybridoma
The antibody-producing cells obtained in (2-1) and the myeloma cells obtained in (2-2) are mixed with MEM or PBS (1.83 g / L disodium hydrogen phosphate, 0.21 g / L potassium dihydrogen phosphate, Wash well with 7.65 g / L sodium chloride, pH 7.2), mix so that the number of cells is antibody-producing cells: myeloma cells = 5 to 10: 1, and centrifuge at 1200 rpm for 5 minutes. Throw away Qing.
Thoroughly loosen the cell group of the obtained precipitate fraction, and add 108A solution prepared by mixing 2 g of polyethylene glycol-1000, 2 mL of MEM and 0.7 mL of dimethyl sulfoxide per antibody-producing cell was added with stirring at 0.2 to 1 mL at 37 ° C., and further 1-2 mL of MEM several times every 1 to 2 minutes. Added. After the addition, MEM is added to prepare a total volume of 50 ml. The preparation is centrifuged at 900 rpm for 5 minutes, and the supernatant is discarded.
[0088]
Loosely loosen the cells of the obtained precipitate fraction, and then gently inhale and blow out with a mespipette.-4mmol / L hypoxanthine, 1.5 × 10-5mmol / L thymidine and 4 × 10-7Medium with mmol / L aminopterin] suspended in 100 mL. The suspension was dispensed at 100 μL / well into a 96-well culture plate, and 5% CO 2 was added.2Incubate at 37 ° C. for 7-14 days in incubator.
After culturing, a part of the culture supernatant is taken to obtain the antibody-producing cells by the enzyme immunoassay described in Harlow E and Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) Chapter 14 etc. Therefore, a hybridoma that specifically reacts with the antigen used for immunization is selected. The following methods can be given as specific examples of the enzyme immunoassay.
[0089]
During immunization, the full length or partial fragment purified preparation or partial peptide of the protein of the present invention used as an antigen is coated on an appropriate plate, and the hybridoma culture supernatant or the purified antibody obtained in (2-4) described below is used as the primary antibody. It reacts as an antibody, and further reacts with an anti-rat immunoglobulin antibody labeled with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance or a radiation compound as a secondary antibody, and then reacts according to the labeling substance, and is specific for the protein of the present invention. Those that react with the above are selected as hybridomas producing a monoclonal antibody against the protein of the present invention.
Cloning was repeated twice by the limiting dilution method using the hybridoma [first time is HT medium (medium obtained by removing aminopterin from HAT medium), second time normal medium is used], stable and strong antibody Those having a recognized valence are selected as a hybridoma strain producing a monoclonal antibody against the protein of the present invention.
[0090]
(2-4) Preparation of monoclonal antibody
ABCA obtained in (2-3) was administered intraperitoneally with 0.5 mL of pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane) and cultured for 2 weeks to 8-10 week old mice or nude mice. A hybridoma cell producing a monoclonal antibody that recognizes the SSN polypeptide 5-20 × 106Cells / animals are injected intraperitoneally. The hybridoma becomes ascites tumor in 10 to 21 days.
Ascites is collected from the mouse with ascites tumor and centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes to remove solids. From the obtained supernatant, a monoclonal antibody can be purified and obtained by the same method as that used for polyclonal. The subclass of the antibody is determined using a mouse monoclonal antibody typing kit or a rat monoclonal antibody typing kit. Protein mass is calculated from the Raleigh method or absorbance at 280 nm.
[0091]
(3) Preferred antibodies according to the present invention
The antibody of the present invention can be prepared by the methods described in (1) and (2) above. By further screening the antibodies thus obtained,
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 (Kaminski WE et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.273, 532 (2000) reported amino acid sequence of ABCA7 polypeptide), and recognizes the polypeptide of the present invention;
An antibody that recognizes a region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9; or
An antibody that inhibits the transporter activity of the polypeptide of the present invention;
Can be obtained.
Whether the obtained antibody inhibits the transporter activity of the polypeptide of the present invention can be analyzed by the method described hereinabove.
[0092]
4). ABCA-SSN mRNA detection / quantification method and ABCA-SSN expression level fluctuating at mRNA level
A partial fragment of a polynucleotide encoding ABCA-SSN, for example, a partial fragment of DNA having the base sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1, 2, 4, or 5, such as a base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 ABCA-SSN mRNA can be detected using a fragment having a continuous base sequence of 200 bp or more and ABCA-SSN oligonucleotide.
[0093]
Further, in order to distinguish and detect ABCA7 mRNA and ABCA-SSN mRNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 4, a sequence specific to ABCA-SSN mRNA, specifically, the base described in SEQ ID NO: 8 is used. Only ABCA-SSN mRNA can be detected by performing the following hybridization using a polynucleotide consisting of the entire sequence complementary to the sequence or a part of a polynucleotide having a length of 10 bp or more as a probe. Examples of such a polynucleotide include a polynucleotide fragment that is amplified using ABCA-SSN DNA as a template with an oligonucleotide primer having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 19 and 20. Further, in the quantitative PCR method shown below, a forward primer having a sequence that matches the partial sequence of the base sequence corresponding to exon 5 of ABCA7 cDNA and a sequence that matches the partial sequence of the sequence complementary to the base sequence corresponding to exon 6 By using the reverse primer, ABCA-SSN mRNA and ABCA7 mRNA of the present invention can be distinguished and quantified based on the length of the amplified fragment. Examples of primers that can be used for such quantitative PCR include oligonucleotides having the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 21 and 22.
[0094]
Examples of methods for detecting ABCA-SSN mRNA include Northern blotting,in situExamples include hybridization methods, quantitative PCR methods, differential hybridization methods, DNA chip methods, ribonuclease protection assay methods, and the like. By these methods, the expression level of ABCA-SSN at the mRNA level in tissues or cells can be examined.
By these methods, it is possible to obtain information on what kind of tissues and cells ABCA-SSN is expressed, and information on what kind of stimulation the cells change when the expression level changes.
Samples used in these methods include biological samples such as organs, biological tissues and blood collected from humans and animals, or primary cultured cells and cell lines established from these biological samples.
[0095]
In Northern blotting, total RNA or mRNA extracted from a sample (hereinafter referred to as “sample-derived RNA”) is separated by gel electrophoresis, transferred to a membrane such as a nylon filter, and ABCA-SSN DNA or DNA having a partial sequence thereof. Then, hybridization and washing were performed using a probe prepared by labeling an oligonucleotide having a partial sequence of ABCA-SSN DNA with a radioisotope, digoxigenin, biotin, etc., and the labeled probe was specific to ABCA-SSN mRNA. This is a method of detecting as a chemically bound band and can be carried out based on the method and conditions described in Molecular Cloning 2nd edition. Since the intensity of the band, that is, the amount of bound labeled probe reflects the amount of ABCA-SSN mRNA, the expression level hardly changes depending on the tissue or disease state, and actin and glyceraldehyde are always expressed constitutively. By detecting a band of mRNA such as 3-phosphate dehydrogenase (G3PDH) on the same filter and performing standardization according to the intensity, the expression level of ABCA-SSN at the mRNA level can be quantified. Also, the length of ABCA-SSN mRNA is measured by simultaneously performing electrophoresis of labeled RNA molecular weight markers when electrophoresis of sample-derived RNA and comparing the band migration position with the position of the molecular weight marker. Can do.
[0096]
In Situ (in situ) In the hybridization method, a paraffin-embedded section or a cryostat section is prepared from a sample organ or living tissue, and ABCA-SSN DNA, DNA having a partial sequence of the DNA, or ABCA-SSN DNA is prepared for the section. This is a method of detecting ABCA-SSN-expressing cells and expression sites in the tissue in detail by performing a hybridization and washing step with a labeled probe prepared from an oligonucleotide consisting of the partial nucleotide sequence of Current Protocols in Molecular. -It can be performed by the method and conditions described in Biology.
[0097]
Quantitative PCR [Delidow BC et al. Gene Anal. Tech.6, 120 (1989)] is an oligo designed based on the base sequence of ABCA-SSN cDNA using cDNA synthesized from sample-derived RNA using oligo dT primer and reverse transcriptase (hereinafter referred to as “sample-derived cDNA”) as a template. In this method, PCR is performed using nucleotide primers to specifically amplify a DNA fragment derived from ABCA-SSN mRNA. Since the amount of the amplified DNA fragment reflects the amount of ABCA-SSN mRNA in the sample, it is possible to control ABCA-SSN by using PCR for cDNAs such as actin and G3PDH whose expression level does not change depending on the tissue or disease state. It is possible to quantify mRNA. The oligonucleotide primer is designed to specifically bind to the ABCA-SSN cDNA at an annealing temperature that does not cause hybridization between primers or within the primer, and to deviate at the denaturation temperature. The quantification of the amplified DNA fragment needs to be performed within the number of PCRs in which the amplification product increases exponentially. The number of PCRs can be determined by performing PCR by changing the number of amplifications for one sample and analyzing the amount of the amplified DNA fragment that increases each time by gel electrophoresis.
[0098]
Differential hybridization method [Lennon GG and Lehrach H, Trends Genet.7, 314 (1991)] and the DNA chip method [Shalon D et al. Genome Res.6639 (1996)] is a filter or slide glass on which an oligonucleotide consisting of ABCA-SSN DNA, DNA having a partial base sequence of the DNA, or a sequence complementary to the partial base sequence of ABCA-SSN DNA is immobilized. Samples that serve as a measurement control by performing hybridization and washing on a substrate such as silicon or silicon using oligo dT primer from sample-derived RNA and labeled cDNA synthesized using labeled dNTP and reverse transcriptase as probes It is the method of detecting the fluctuation | variation of the expression level in the mRNA level of ABCA-SSN. In either method, actin or G3PDH DNA is immobilized on a filter or substrate and used as an internal control, so that a difference in expression at the ABCA-SSN mRNA level between the measurement sample and the control sample can be detected. . In addition, when preparing a labeled cDNA probe from a measurement sample and a control sample, both are prepared using different labeled dNTPs, and two labeled cDNA probes are hybridized simultaneously on one filter or one substrate. Quantification can be performed.
[0099]
Ribonuclease protection assay [Pape ME et al. Genet. Anal. Tech. Appl.8, 206 (1991)], a promoter sequence such as T7 promoter and SP6 promoter was first bound to the 3 ′ end of ABCA-SSN DNA and labeled by an in vitro transcription system using labeled NTP and a promoter-specific RNA polymerase. ABCA-SSN antisense RNA is synthesized. The labeled antisense RNA is hybridized with total RNA or mRNA prepared from the specimen to form an RNA-RNA hybrid with the ABCA-SSN mRNA in the specimen, and then digested with ribonuclease. The band protected from is detected by gel electrophoresis. By quantifying the protected band, the expression of ABCA-SSN at the mRNA level can be quantified.
[0100]
By using the above-described method, a biological sample such as an organ, a biological tissue, blood, or the like collected from a subject and a healthy healthy subject as a control, or a primary cultured cell cultured therefrom as a specimen, both ABCA- By quantifying and comparing the expression at the SSN mRNA level, it is possible to diagnose a disease in which the expression level of the ABCA-SSN mRNA level is increased or decreased compared to that of a healthy subject. Examples of the disease include autoimmune diseases, Sjogren's disease, inflammatory diseases, abnormal diseases of lipid metabolism, and arteriosclerosis.
[0101]
5). Inhibition of ABCA-SSN transporter activity
(1) ABCA-SSN inhibitor and screening method thereof
The inhibitor of ABCA-SSN is a substance that inhibits transporter activity of ABCA-SSN. When the test substance and ABCA-SSN polypeptide coexist, the transporter activity of ABCA-SSN is compared with the transporter activity in the absence of the test substance, and the transporter activity decreases when the test substance coexists , The substance can be selected as a substance that inhibits the transporter activity of ABCA-SSN.
[0102]
ABCA-SSN used in the above screening method may be a polypeptide purified from tissues, cells, etc. expressing ABCA-SSN, but transformed using DNA encoding ABCA-SSN. A large amount can be obtained by culturing the body and purifying it according to a conventional method. In addition, this screening can be carried out using cultured cells that produce the polypeptide or cultured cell processed products. However, when cells are used as they are, it is preferable to use cells that secrete and produce the protein. The cultured cell treated product as used herein refers to a concentrate of a culture solution, a dried product of cultured cells, a cell obtained by centrifuging a culture solution, a dried product of the cell, a freeze-dried product of the cell, and an interface of the cell. Activator treatment product, sonication product of the cell, mechanical grinding treatment product of the cell, solvent treatment product of the cell, enzyme treatment product of the cell, protein fraction of the cell, immobilization product of the cell Or the enzyme preparation etc. which are obtained by extracting from this cell are mention | raise | lifted.
[0103]
(2) Method for suppressing the expression of ABCA-SSN
As a method of suppressing the expression of ABCA-SSN, suppression of translation from mRNA to ABCA-SSN polypeptide by administration of antisense DNA or antisense oligonucleotide to an ABCA-SSN gene or administration of an antisense RNA expression vector, Inhibition of transcription by administration of triple helix-forming oligonucleotides that bind to ABCA-SSN gene promoter, degradation of ABCA-SSN mRNA by administration of ribozyme, inhibition of transcription by administration of compounds that specifically inhibit transcription of ABCA-SSN gene I can give you.
[0104]
6). Gene therapy vector
For diseases caused by low expression of ABCA-SSN, treatment can be performed by administering ABCA-SSN polypeptide or a gene therapy vector that produces ABCA-SSN polypeptide in the human body. it can.
An example of a gene therapy vector for producing an ABCA-SSN polypeptide in vivo is a recombinant viral vector that produces an ABCA-SSN polypeptide. The recombinant viral vector comprises: By preparing ABCA-SSN cDNA obtained by the method described in the above, or a DNA fragment having an appropriate length containing a region encoding ABCA-SSN as necessary, and inserting it downstream of the promoter in the viral vector, Can be created. The recombinant viral vector is a gene encoding a protein necessary for packaging of the virus, for example, gag, pol, env, etc. in the case of a retrovirus such as mouse moloney leukemia virus, gag, pol, Genes such as env, vpr, vpu, vif, tat, rev, nef, E1A, E1B, etc. in adenoviruses, Rep (p5, p19, p40), Vp (Cap) etc. in adeno-associated viruses ing.
[0105]
The recombinant viral vector is introduced into packaging cells compatible with the recombinant viral vector. As the packaging cell, any cell capable of supplying the protein necessary for packaging of the virus deficient in the recombinant virus vector can be used, for example, HEK293 cell derived from human kidney, mouse fibroblast NIH3T3, etc. Can be used.
As the viral vector, a vector containing a promoter at a position where a recombinant virus can be produced in the packaging cell and the ABCA-SSN gene can be transcribed in the target cell is used. As a plasmid vector, MFG [Rivier I et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA92, 6733 (1995)], pBabepuro [Morgansten JP and Land H, Nucleic Acids Res.18, 3587 (1990)], LL-CG, CL-CG, CS-CG, CLG [Miyoshi H et al. , J. et al. Virol.72, 8150 (1998)], pAdex1 [Kanegae Y et al. Nucleic Acids Res.23, 3816 (1995)], and any promoter can be used as long as it can be expressed in human tissues. For example, a promoter of cytomegalovirus IE (immediate early) gene, an early promoter of SV40, a retrovirus promoter Examples include LTR, metallothionein promoter, heat shock protein promoter, and the like. In addition, an enhancer of cytomegalovirus IE gene may be used together with a promoter.
[0106]
Examples of the method for introducing the recombinant viral vector into the packaging cell include calcium phosphate method and lipofection method [Felner PL et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA84, 7413 (1987)]. Further, as a gene therapy method that does not use a viral vector, there is a therapeutic gene transfection method in which DNA is directly injected in the form of naked plasmid DNA as a means for directly transporting DNA to a desired tissue (US Pat. No. 5,589,466). ). That is, the protein can be expressed in the cancer tissue by injecting an expression vector having ABCA-SSN DNA into a tissue in need of treatment, such as a colon cancer tissue, using a syringe or the like.
[0107]
7). Method for detecting and quantifying ABCA-SSN polypeptide using antibody
Methods for immunologically detecting ABCA-SSN polypeptide using an antibody that recognizes ABCA-SSN polypeptide include immunohistochemical staining methods such as immunohistochemical staining and immunocytochemical staining, flow cytometry, Western There are enzyme immunoassay (enzyme immunoassay; EIA) such as blotting and sandwich ELISA, and radioimmunoassay (RIA), etc., and the literature [Toyama Shinji, Ando Civil Defense, Ed. Fick (1987), Secondary Biochemistry Experiment Course 5, Immunobiochemistry Research Method, Tokyo Chemical Doujin (1986), Goding JW, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Third edition, Academic Press (1996), Harlow E and Lane D, Antibodies: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
[0108]
The immunohistochemical staining method is an anti-immunoglobulin antibody immobilized on a biological tissue or cell, reacted with an antibody recognizing ABCA-SSN polypeptide, and further labeled with a fluorescent substance, enzyme, biotin, colloidal gold, radioactive substance or the like. This is a method of detecting ABCA-SSN polypeptide in tissues and cells by reacting antibody fragments, visualizing the labeled antibody if necessary, and observing with a microscope. Fluorescein / isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine / isothiocyanate, or the like is used for fluorescent substance labeling, and it is detected by observing with a fluorescence microscope. In the case of enzyme labeling, peroxidase, alkaline phosphatase, or the like is used, and it can be detected by observing with an optical microscope after adding a substrate that develops color with an enzyme and causing a color reaction. In the case of biotin labeling, an avidin labeled with an enzyme such as peroxidase is reacted, and then the same operation as for the enzyme labeled antibody is performed. In the case of colloidal gold label, it is detected by observing with an electron microscope. For radioactive substance labeling125I or the like is used, and it can be detected by observing with an optical microscope silver particles deposited by radiation after coating a photosensitive emulsion.
[0109]
In flow cytometry, cells are reacted with an antibody recognizing ABCA-SSN polypeptide, and further reacted with an anti-immunoglobulin antibody or antibody fragment labeled with a fluorescent substance such as fluorescein / isothiocyanate or phycoerythrin, followed by fluorescence. This is a method for detecting expression of ABCA-SSN polypeptide in cells by measuring a dye with a flow cytometer.
[0110]
In the Western blotting method, a biological tissue or cell lysate is fractionated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and then the gel is blotted onto a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane or a nitrocellulose membrane, and ABCA-SSN is applied to the membrane. It reacts with an antibody that recognizes a polypeptide or an antibody fragment thereof, and further contains an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase,125This is a method for detecting an ABCA-SSN polypeptide band after reacting with an anti-immunoglobulin antibody or antibody fragment labeled with a radioactive substance such as I. In the case of enzyme labeling, a substrate that develops color by the enzyme is added and reacted to visualize the band of ABCA-SSN polypeptide, or a substrate that emits light by the enzyme is added and detected by autoradiography of X-ray film. In the case of a radioactive substance, it is detected by autoradiography of an X-ray film.
[0111]
In sandwich ELISA, which is a kind of enzyme immunoassay, monoclonal antibodies that recognize two types of ABCA-SSN polypeptides with different antigen recognition sites are prepared, and one of the monoclonal antibodies or antibody fragments is adsorbed on a plate in advance. A cell lysate is prepared from a living tissue or cell and used as a test sample. An anti-immunoglobulin antibody labeled with an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase, or reacted with a monoclonal antibody or antibody fragment thereof that recognizes an ABCA-SSN polypeptide with a different antigen recognition site. The antibody fragment is reacted. After adding a substrate that develops color with an enzyme to cause a color reaction, the color development intensity is measured with a spectrophotometer to detect or quantify the ABCA-SSN polypeptide in the sample.
[0112]
Radioimmunoassay is not an enzyme125This is a method for detecting or quantifying ABCA-SSN polypeptide in a sample by performing the same operation as the enzyme immunoassay using an antibody labeled with a radioactive substance such as I, and measuring radiation with a scintillation counter. .
[0113]
For enzyme immunoassay and radioimmunoassay, in addition to the sandwich method as described above, not an antibody but an ABCA-SSN polypeptide preparation is labeled, and a certain amount of labeled ABCA-SSN polypeptide preparation and test are performed. Competing to detect or quantify ABCA-SSN polypeptide in a sample by reacting the sample with an antibody recognizing ABCA-SSN polypeptide immobilized on a plate and measuring the enzyme activity and radiation on the plate There is also a law.
[0114]
8). Pharmaceutical composition
The therapeutic agent containing the above-mentioned ABCA-SSN polypeptide, ABCA-SSN oligonucleotide, and antibody recognizing ABCA-SSN can be administered as the drug alone or the neutralizing antibody alone, but usually the drug It is desirable to provide a pharmaceutical formulation prepared by any method well known in the pharmaceutical arts, mixed with one or more physically acceptable carriers. It is desirable to use the administration route that is most effective in treatment, and examples include oral administration and parenteral administration such as buccal, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous. Examples of the dosage form include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
[0115]
Suitable formulations for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like. Liquid preparations such as emulsions and syrups include saccharides such as water, sucrose, sorbitol and fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil, p-hydroxybenzoate Preservatives such as acid esters and flavors such as strawberry flavor and peppermint can be used as additives. Capsules, tablets, powders, granules, etc. are excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc, polyvinyl alcohol, hydroxy A binder such as propylcellulose and gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, a plasticizer such as glycerin and the like can be used as additives.
[0116]
Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like. For example, an injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both. Suppositories are prepared using a carrier such as cacao butter, hydrogenated fat or carboxylic acid. The spray is prepared using a carrier that does not irritate the protein itself or the recipient's oral cavity and airway mucosa and that disperses the protein as fine particles to facilitate absorption. Specific examples of the carrier include lactose and glycerin. Depending on the properties of the protein and the carrier used, preparations such as aerosols and dry powders are possible. In these parenteral preparations, the components exemplified as additives for oral preparations can also be added.
[0117]
The dose or frequency of administration varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, weight, etc., but is usually 10 μg / kg to 100 mg / kg per day for an adult.
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is specifically illustrated using an Example, the scope of the present invention is not limited by an Example.
[0118]
【Example】
Example 1: Cloning and nucleotide sequence analysis of ABCA-SSN cDNA
As a result of searching for a cDNA having a base sequence that matches the SS-N cDNA (GenBank accession number AF140342) using an in-house database (Kazusa DNA Research Institute), the human adult brain-derived cDNA clone hh10210 has an SSN-cDNA sequence. It was found to contain. Considering that hh10210 encodes ABCA-SSN, which is a novel ABC transporter, the base sequence of the cDNA was analyzed. SEQ ID NO: 7 shows the nucleotide sequence of hh10210 cDNA. The nucleotide sequence of hh10210 cDNA was very similar to the known ABCA7 cDNA nucleotide sequence (GenBank accession number AF250238). 1) A 384 bp intron between exon 5 and exon 6 of the ABCA7 gene ( The base sequence of the intron is shown in SEQ ID NO: 8. 2) The remaining alternative spliced cDNA is 2) 5 'upstream from exon 2, 3' downstream from exon 40, and exon A partial 54 bp deletion of 35, and 3) there are mutations in the nucleotide sequence at two locations (positions 4766 and 4832 in SEQ ID NO: 7) with a mutation in the amino acid sequence in exon 32 (in ABCA7)1502Arg becomes Pro1524Phe is mutated to Ser. )
[0119]
Furthermore, 3′-RACE using a human thymus cDNA library (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and an oligonucleotide primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 12 and 13, or the oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 12 and 14 PCR was performed using primers, and a cDNA fragment containing the 3 ′ region deleted in hh10210 was amplified and cloned. The base sequences of these 3 'region clones were analyzed using the Beckman CEQ2000 DNA analysis system. As a result, exon 45 which is considered to be an alternative splicing body in which the splicing recognition site is deviated in addition to the one having the sequence (SEQ ID NO: 10) almost coincident with the 5374-6419th nucleotide sequence of ABCA7 cDNA There were some in which a portion of 45 bp was deleted (SEQ ID NO: 11) and in which the region after exon 45 was deleted.
[0120]
In addition, in order to investigate whether the mutation of exon 32 in the cDNA of hh10210 or the deletion in exon 35 is universal in ABCA-SSN cDNA, using human thymus cDNA library (Takara Shuzo Co., Ltd.) as a template, PCR was performed using oligonucleotide primers having the nucleotide sequences shown in Nos. 15 and 16, and the region of exons 30 to 38 was amplified and cloned. As a result of analyzing the nucleotide sequences of these clones, exon 32 was found to have two base mutations in all the analyzed clones, but exon 35 was not deleted, and the known ABCA7 cDNA nucleotide sequence Matched. Therefore, exon 32 of ABCA-SSN cDNA is different from the known ABCA7 cDNA and has the same base sequence as hh10210 cDNA, but exon 35 was considered to be identical to the known ABCA7 cDNA and not deleted.
[0121]
ABCA-SSN obtained from the nucleotide sequence of cDNA of hh10210, the region after exon 39 (SEQ ID NO: 10) obtained by PCR using a human thymus cDNA library as a template, and the region of exons 30 to 38 The sequence of the ABCA-SSN cDNA based on the base sequence (SEQ ID NO: 11) of the cDNA fragment of the alternative spliced form in which the base sequence of the cDNA is SEQ ID NO: 1 and a part of exon 45 is deleted instead of SEQ ID NO: 10. The base sequence is shown in SEQ ID NO: 4. There are two stop codons in the ABCA7 translation frame in the ABCA7 intron sequence in the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 4, and there are start codons downstream of these stop codons. In addition, ABCA-SSN polypeptides encoded by these cDNAs have an amino acid sequence consisting of 2008 amino acids or 1993 amino acids in which the amino acid sequence of the 167th and subsequent amino acids of ABCA7 is connected to 28 amino acids different from the N-terminus of ABCA7. The base sequence of the region encoding the polypeptide in SEQ ID NO: 1 is shown in SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is shown in SEQ ID NO: 3, and the polypeptide in SEQ ID NO: 4 is The base sequence of the coding region is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 is shown in SEQ ID NO: 6.
[0122]
Example 2: Analysis of expression of ABCA7 or ABCA-SSN at the mRNA level
DNA fragments at the 5 'end common to ABCA7 and ABCA-SSN cDNA were amplified by RT-PCR using oligonucleotide primers having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 17 and 18. This DNA fragment was [α-32P] Radioactive labeling using dCTP (Amersham Pharmacia Biotech) and random primer DNA labeling kit (Takara Shuzo) was used as a probe, and various human tissues (adrenal gland, bladder, bone marrow, brain) MTN blot (Multiple Tissue North Blot), a filter that blots mRNA of lymph nodes, breast, prostate, spinal cord, stomach, thyroid, trachea, uterus; spleen, thymus, prostate, testis, ovary, small intestine, large intestine, peripheral leukocytes) Northern hybridization using Clontech) was used to examine the expression level of ABCA7 or ABCA-SSN in each human organ at the mRNA level. The results are shown in FIG. 1A. ABCA7 or ABCA-SSN mRNA is 8-9 kb in size, and is reported by Kaminski et al. [Biochem. Biophys. Res. Commun.273, 532 (2000)], high expression was observed in the thymus, lymph nodes, bone marrow, peripheral leukocytes, and spleen, which are bone marrow lymphoid tissues, and particularly in the thymus. It was also expressed in the brain and trachea.
[0123]
In order to detect expression at the mRNA level of ABCA-SSN type alone, a 322 bp DNA fragment in intron 5 present only in ABCA-SSN cDNA was amplified using oligonucleotide primers of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 19 and 20 did. In the same manner as described above, Northern hybridization was performed using this DNA fragment as a probe using an MTN blot. The results are shown in FIG. 1B. The length of ABCA-SSN mRNA is also 8-9 kb, and high expression is observed in the thymus, lymph node, bone marrow, and peripheral leukocytes, especially in the thymus. It was. In addition, medium level expression was observed in the spleen, trachea and brain. This expression distribution was very similar to the expression distribution of ABCA7 or ABCA-SSN examined above. Therefore, ABCA-SSN type cDNA does not consist of abnormal ABCA7 mRNA in which intron 5 is left unintentionally, and naturally occurs in bone marrow lymphoid tissues, ABCA7 genomic gene [Kaminski WE et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun.278, 782 (2000)], it was found that ABCA-SSN type mRNA exists as an alternative splicing product.
[0124]
Furthermore, in order to distinguish and analyze the expression of ABCA-SSN type and ABCA7 type mRNA in each tissue, the following RT-PCR analysis was performed in which the length of the amplified DNA fragment was different for each type of cDNA. . Specifically, poly A of various human tissues (brain, bone marrow, lymph node, thymus, spleen, trachea) in which ABCA7 or ABCA-SSN is expressed+After synthesizing single-stranded cDNA from RNA (manufactured by Clontech) using an oligo dT primer and a superscript preamplification system (manufactured by Life Technologies), the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 21 and 22 were synthesized. PCR (30 cycles) was performed using oligonucleotide primers. In this RT-PCR analysis, a 261 bp DNA fragment is amplified from ABCA7 type mRNA and a 606 bp DNA fragment is amplified from ABCA-SSN type mRNA. The results are shown in FIG. 2, and it was found that ABCA-SSN type, not ABCA7 type, was mainly expressed in all tissues except bone marrow.
[0125]
In order to examine the presence or absence of deletion of exon 45, RT-PCR analysis was performed on each tissue in the same manner as described above using oligonucleotide primers having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 23 and 24. In the absence, only the 242 bp DNA fragment was amplified, and no short DNA fragment was detected in the deleted type, so most ABCA7 and ABCA-SSN cDNAs were deleted in exon 45. Not confirmed.
[0126]
Example 3: Production of antibodies recognizing ABCA-SSN and ABCA7
(1) Preparation of antigenic peptide
(1) -1 About abbreviations
Abbreviations for amino acids and their protecting groups used in the present invention are the recommendations of the IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature for biochemical nomenclature [Eur. J. et al. Biochem.138, 9 (1984)].
[0127]
The following abbreviations represent the corresponding amino acids below unless otherwise specified.
Ala: L-alanine
Asp: L-aspartic acid
Asx: L-aspartic acid or L-asparagine
Arg: L-arginine
Cys: L-cysteine
Gln: L-glutamine
Glu: L-glutamic acid
Glx: L-glutamic acid or L-glutamine
His: L-histidine
Leu: L-leucine
Lys: L-lysine
Phe: L-phenylalanine
Pro: L-proline
Ser: L-serine
Thr: L-threonine
Val: L-valine
[0128]
The following abbreviations represent the following amino acid protecting groups and side chain protected amino acids.
Fmoc: 9-fluorenylmethyloxycarbonyl
Boc: t-butyloxycarbonyl
tBu: t-butyl
Trt: Trityl
Pmc: 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl
Fmoc-Arg (Pmc) -OH: Nα-9-fluorenylmethyloxycarbonyl-Ng-2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl-L-arginine
Fmoc-Asp (OtBu) -OH: Nα-9-fluorenylmethyloxycarbonyl-L-aspartic acid-β-t-butyl ester
Fmoc-Cys (Trt) -OH: Nα-9-fluorenylmethyloxycarbonyl-S-trityl-L-cysteine
Fmoc-Gln (Trt) -OH: Nα-9-fluorenylmethyloxycarbonyl-Nε-trityl-L-glutamine
Fmoc-Glu (OtBu) -OH: Nα-9-fluorenylmethyloxycarbonyl-L-glutamic acid-γ-t-butyl ester
Fmoc-His (Trt) -OH: Nα-9-fluorenylmethyloxycarbonyl-Nim-trityl-L-histidine
Fmoc-Lys (Boc) -OH: Nα-9-fluorenylmethyloxycarbonyl-Nε-t-butyloxycarbonyl-L-lysine
Fmoc-Ser (tBu) -OH: Nα-9-fluorenylmethyloxycarbonyl-Ot-butyl-L-serine
Fmoc-Thr (tBu) -OH: Nα-9-fluorenylmethyloxycarbonyl-Ot-butyl-L-threonine
[0129]
The following abbreviations represent the following reaction solvents, reaction reagents, and the like.
HBTU: 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate
HOBt: N-hydroxybenzotriazole
DIEA: Diisopropylethylamine
DMF: N, N-dimethylformamide
TFA: trifluoroacetic acid
[0130]
In the following examples, the physicochemical properties of the compounds were measured by the following methods.
Mass spectrometry was performed by FAB-MS method using JEOL JMS-HX110A, or by MALDI-TOFMS method using Bruker mass spectrometer REFLEX. went. Amino acid analysis was performed by the method of Cohen et al. [Cohen SA et al. , Anal. Biochem.222, 19 (1994)]. Hydrolysis was carried out at 110 ° C. for 20 hours in hydrochloric acid vapor, and the amino acid composition of the hydrolyzate was analyzed using a Waters AccQ-Tag amino acid analyzer (manufactured by Waters).
[0131]
Analyzing the amino acid sequence of ABCA-SSN, from the highly hydrophilic part, N-terminal, C-terminal, secondary structure turn structure, part having random coil structure, C-terminal as a partial sequence considered to be suitable as an antigen Compound 1 (hABCA7-C, H-Cys-Gln-His-Pro-Lys, which is a peptide in which a region is selected and Cys is added to the N-terminus of the amino acid sequence of 1989-2008 of the amino acid sequence of ABCA-SSN as an antigen -Arg-Val-Ser-Gln-Phe-Leu-Asp-Asp-Pro-Ser-Thr-Ala-Glu-Thr-Val-Leu-OH). The amino acid sequence of Compound 1 is shown in SEQ ID NO: 26.
[0132]
(1) -2 Synthesis of Compound 1 (hABCA7-C)
After adding 30 mg of carrier resin (Wang resin, manufactured by Novabiochem) to which 18 μmol of Fmoc-Leu was bound, put it in a reaction vessel of an automatic synthesizer (Shimadzu Corporation), added 600 μL of DMF, stirred for 3 minutes, and discharged the solution. The following operation was performed according to the synthesis program.
(A) 500 μL of 30% piperidine-DMF solution was added, the mixture was stirred for 4 minutes, the solution was discharged, and this operation was repeated once more.
(B) The carrier resin was washed with 600 μL of DMF for 1 minute, the solution was discharged, and this operation was repeated 5 times.
(C) Fmoc-Val-OH (180 μmol), HBTU (180 μmol), HOBt monohydrate (180 μmol) and DIEA (540 μmol) were stirred in DMF (0.36 ml) for 3 minutes, and the resulting solution was used as a resin. In addition, the mixture was stirred for 60 minutes and the solution was drained.
(D) After washing the carrier resin with 600 μL of DMF for 1 minute, the solution was discharged, and this was repeated 5 times.
In this way, Fmoc-Val-Leu was synthesized on the support.
[0133]
Next, after the steps (a) and (b), a condensation reaction is performed using Fmoc-Thr (tBu) -OH in the step (c), and after the washing step (d), Fmoc-Thr ( tBu) -Val-Leu was synthesized on the support.
Hereinafter, in step (c), Fmoc-Glu (OtBu) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Val-OH , Fmoc-Arg (Pmc) -OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-His (Trt) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Cys (Trt)- After repeating (a) to (d) using OH sequentially, the deprotection and washing steps of (a) and (b) were performed. Methanol, successively washed with ether, and dried under reduced pressure for 12 hours to obtain the bound carrier resin in side-chain protected peptide. This includes TFA (82.5%), thioanisole (5%), water (5%), ethyl methyl sulfide (3%), 1,2-ethanedithiol (2.5%) and thiophenol (2% 1 mL of a mixed solution consisting of 2) was added and allowed to stand at room temperature for 8 hours to remove the side chain protecting group and cut out the peptide from the resin. After filtration of the resin, about 10 mL of ether was added to the resulting solution, and the resulting precipitate was collected by centrifugation and decantation to obtain 61.3 mg as a crude peptide. The total amount of this crude product was dissolved in an acetic acid aqueous solution, and then purified by HPLC using a reverse phase column (manufactured by Shiseido, CAPCELL PAK C18 30 mm ID × 250 mm). Elution was performed by a linear concentration gradient method in which 90% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA was added to 0.1% TFA aqueous solution, and detection was performed at 220 nm to obtain a fraction containing Compound 1. This fraction was lyophilized to obtain 16.1 mg of Compound 1.
[0134]
Mass spectrometry [TOFMS]; m / z = 2371.5 (M + H +)
Amino acid analysis; Asx 1.9 (2), Glx 3.1 (1), Ser 1.9 (2), His 1.1 (1), Arg 1.0 (1), Thr 2.1 (2) , Ala 1.0 (1), Pro 2.0 (2), Val 1.9 (2), Leu 2.0 (2), Phe 1.0 (1), Lys 1.1 (1), Cys 1.4 (1)
[0135]
(2) Preparation of immunogen
Compound 1 obtained in Example 1 (1) was used as an immunogen by preparing a conjugate with KLH (Calbiochem) by the following method for the purpose of enhancing immunogenicity. That is, KLH was dissolved in PBS to adjust to 10 mg / mL, and 1/10 volume of 25 mg / mL N- (m-maleimidobenzoyloxy) succinimide (MBS; Nacalai Tesque) was dropped and reacted for 30 minutes. It was. Compound obtained by dissolving 2.5 mg of KLH-MBS obtained by removing free MBS in a gel filtration column such as Sephadex G-25 column previously equilibrated with PBS in 0.1 M sodium phosphate buffer (PH 7.0) 1 (1 mg) and stirred at room temperature for 3 hours. After the reaction, dialyzed with PBS was used as an immunogen.
[0136]
(3) Animal immunization, polyclonal antibody production
200 μg of the compound 1-KLH conjugate prepared in Example 1 (2) was administered to two Japanese white breed (SPF) 21-week-old female rabbits together with Freund's complete adjuvant (Yatron). From 2 weeks after administration, 200 μg of Compound 1-KLH conjugate was administered once a week together with Freund's complete adjuvant for a total of 5 times. Partial blood was collected from the rabbit, and the serum antibody titer was examined by enzyme immunoassay (binding ELISA) shown in (4) below, and whole blood was collected from a rabbit showing a sufficient antibody titer to obtain antiserum.
From this antiserum, the IgG fraction was purified by the caprylic acid precipitation method [Antibodies- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)] to obtain a polyclonal antibody.
[0137]
(4) Enzyme immunoassay (binding ELISA)
As an antigen for assay, a compound obtained by conjugating Compound 1 obtained in (1) with thyroglobulin (hereinafter abbreviated as THY) was used. The preparation method is as described in (2), but 4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester (SMCC, Sigma) is used instead of MBS as the crosslinking agent. It was. The conjugate prepared as described above was dispensed into a 96-well EIA plate (Greiner) at 5 μg / mL and 50 μL / hole and allowed to stand overnight at 4 degrees for adsorption. After washing the plate, 1% bovine serum albumin (BSA) / PBS was added at 100 μL / well and left at room temperature for 1 hour to block remaining active groups.
[0138]
After standing, 1% BSA / PBS was discarded, and 50 μL / well of immunized rabbit antiserum was dispensed to the plate as a primary antibody and left for 2 hours. The plate was washed with 0.05% polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [(ICI trademark Tween 20 equivalent: manufactured by Wako Pure Chemical Industries)] / PBS (hereinafter referred to as Tween-PBS), and then the secondary antibody. Peroxidase-labeled porcine anti-rabbit immunoglobulin (DAKO) was added at 50 μL / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After the plate was washed with Tween-PBS, ABTS substrate solution [2.2-azinobis (3-ethylbenzothiazole-6-sulfonate) ammonium, 1 mmol / L ABTS / 0.1 mol / L citrate buffer (pH 4.2) )] Was added, the color was developed, and the absorbance at 415 nm was measured using a plate reader [Emax, manufactured by Molecular Devices].
[0139]
(5) Examination of reactivity of polyclonal antibody
The reactivity of the polyclonal antibody obtained in (3) to the antigen peptide was examined by the binding ELISA shown in (4) above. A polyclonal antibody (10 μg / mL serially diluted 10-fold) was used as the primary antibody. The results are shown in FIG. The polyclonal antibody reacted specifically with the antigenic peptide.
[0140]
Example 4: Expression of ABCA-SSN in animal cells
(1) Preparation of pABCA-SSN / CR2.1
A plasmid pABCA-SSN / CR2.1 containing DNA encoding ABCA-SSN shown in SEQ ID NO: 2 was prepared as follows (FIGS. 4 and 5). Since hh10210 lacks 3 bp downstream from exon 40 and part 54 bp of exon 35, a human thymus cDNA library (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was used as the template DNA, and ABCC-SSN C The terminal fragment was amplified as follows. Reaction solution [template DNA 1 μl, 25 nmol / l MgCl2 5 μl, dNTP mixture (mixture containing dATP, dGTP, dCTP, dTTP at a concentration of 2.5 mmol / l) 4 μl, 10 μmol / l primer 27 (SEQ ID NO: 27) 2 μl, 10 μmol / l primer 28 (SEQ ID NO: 28) 2 μl , 35.5 μl of sterilized water, 0.5 μl of LA Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.)], heated for 3 minutes at 94 ° C. using a thermal cycler, 45 seconds at 94 ° C., 30 seconds at 65 ° C., 72 ° C. The 1 minute reaction cycle at 30 was repeated 30 cycles, finally heated at 72 ° C. for 10 minutes and placed at 4 ° C. By this PCR, a stop codon (TGA) on the 3 'side of the 4060-6024th sequence of SEQ ID NO: 2 andHinA DNA fragment having a sequence to which a dIII site is added is amplified. The amplified fragment was inserted into pCR2.1 (Invitrogen) by the TA cloning method. The resulting plasmid (pCR2.1 / PCR4) was transferred to pCR2.1NotIn the I site and amplified fragmentsBstBy cutting at the Z17I site, an approximately 1.1 kb fragment was isolated and hh10210 (vector pBluescript SKII (+))NotI andBstHh10210 / PCR4 was prepared by inserting between Z17I sites.
[0141]
Next, a fragment containing the deletion part of exon 35 of ABCA-SSN was amplified by PCR. The reaction conditions were the same as above except that primer 29 (SEQ ID NO: 29) and primer 30 (SEQ ID NO: 30) were used instead of primer 27 and primer 28 in the reaction solution. The obtained amplified fragment (corresponding to the 3060-5027th sequence of SEQ ID NO: 2) was cloned into pcR2.1 by TA cloning. The resulting plasmid (pCR2.1 / PCR3) was transferred onto the amplified fragment.SphI site,BclA fragment of about 240 bp obtained by cleaving at the I site was converted into hhp10210 / PCR4.SphI /BclIt inserted between I sites and produced hh10210 / PCR4 + 3.
[0142]
A fragment encoding a region containing an N-terminus specific for ABCA-SSN was amplified by PCR. The reaction conditions were the same as above except that primers 31 (SEQ ID NO: 31) and 32 (SEQ ID NO: 32) were used instead of primer 27 and primer 28 in the reaction solution. By this PCR, on the 5 'side of the 1st to 918th sequences of SEQ ID NO: 2.EcoA DNA fragment having a sequence to which an RI site is added is amplified. The resulting amplified fragment was cloned into pcR2.1 by TA cloning. Since there is a ClaI site on ABCA-SSN, the resulting plasmid (pCR2.1 / PCR2)ClaI site /NotHh10210 / PCR4 + 3 between I sitesClaI-NotI fragment (ClaPABCA-SSN / CR2.1 was prepared by inserting an ABCA-SSN fragment downstream from the I site.
[0143]
In addition, a fragment encoding a region containing an N-terminus specific to ABCA7 was amplified by PCR. Using human placenta cDNA library (Clontech) as template DNA, the reaction solution [template DNA 5 μl, 25 nmol / l MgCl2 5 μl, 4 μl of dNTP mixture, 10 μmol / l primer 33 (SEQ ID NO: 33) 2 μl, 10 μmol / l primer 32 (SEQ ID NO: 32) 2 μl, sterile water 31.5 μl, LA Taq 0.5 μl] were prepared using a thermal cycler. After heating at 94 ° C. for 3 minutes, a reaction cycle of 94 ° C. for 45 seconds, 62 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 1 minute is repeated 30 cycles, and finally, the reaction is performed by heating at 72 ° C. for 10 minutes. Put it on. By this PCR, the sequence of the ABCA7 cDNA sequence (GenBank accession number: AF250238) is located 5 'to the 1st to 1332rd sequence.EcoA DNA fragment having a sequence to which an RI site is added is amplified. The resulting amplified fragment was cloned into pcR2.1 by TA cloning. Of the resulting plasmidClaI site /NotHh10210 / PCR4 + 3 between I sitesClaI-NotI fragment (ClaPABCA7 / CR2.1 was prepared by inserting a region common to ABCA-SSN and ABCA7 downstream from the I site.
[0144]
(2) Preparation of animal cell expression vector pCMV6cABCA-SSN
PABCA-SSN / CR2.1 and pABCA7 / CR2.1 obtained above were respectivelyEcoAfter cutting with RI, a fragment containing DNA encoding ABCA-SSN or ABCA7 was isolated, and the animal cell expression vector pCMV6c [ATCC No: 87782, Andersson S et al. , J. et al. Biol. Chem.H.264, 8222 (1989)]EcoPCMV6cABCA-SSN and pCMV6cABCA7 were prepared by inserting into the RI site (FIG. 6).
[0145]
(3) Introduction of expression vector into animal cells
Each plasmid DNA was prepared from E. coli containing pCMV6cABCA-SSN and pCMV6cABCA7 prepared in (2) using a concert nucleic acid purification system (CANCERT Nucleic Acid Purification System, manufactured by Invitrogen).
[0146]
1 × 106One human fetal kidney-derived cell line HEK293 (ATCC number: CRL-1573) was seeded in a petri dish for 10 cm diameter culture and cultured 24 hours later. DNA was introduced into the cells by the lipofection method. The lipofection method was performed as follows. First, 5 μg of DNA, 28 μl of lipofectamine, and 700 μl of OPTI-MEM (manufactured by Invitrogen) without serum were incubated at room temperature for 15 minutes. Separately, 20 μl of plus reagent and 700 μl of OPTI-MEM without serum were incubated at room temperature for 15 minutes. Both were mixed and further incubated at room temperature for 15 minutes. A petri dish in which HEK293 cells were dispersed was washed with OPTI-MEM, 5 ml of OPTI-MEM was added, the above mixture was added, and the mixture was cultured for 3 hours. The medium was changed to DMEM containing 10% fetal bovine serum, and the cells were further cultured at 37 ° C. for 40 hours.
[0147]
(4) Preparation of membrane fraction and detection of polypeptide by Western blotting
Cells into which each expression vector was introduced were washed with ice-cold PBS, and ice-cold suspension buffer (10 mmol / l Tris-HCl (pH 7.5), 1 mmol / l EDTA, 25 mmol / l sucrose) 1 ml To scrape the cells. The cells are centrifuged at 1000 rpm, 4 ° C. for 5 minutes, the supernatant is removed, and the precipitate is suspended in 2 ml of protease inhibitor-suspension buffer (100 μg / ml pAPSMF, 10 μg / ml leupeptin, 2 μg / l aprotinin) Suspension). N at 4 ° C. using a Contes mini bomb cell disrupter (Kimble / Kontes)2Cavitation (40kg / cm with nitrogen gas)2Is applied for 5 minutes and then returned to atmospheric pressure. ) Cell disruption. The cell lysate was centrifuged at 4 ° C. and 1000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected. The supernatant was centrifuged at 13000 rpm for 30 minutes at 4 ° C., and the supernatant was removed. The obtained precipitate was suspended in 50 μl of protease inhibitor-suspension buffer to obtain a membrane fraction.
The protein concentration of the membrane fraction was measured, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed with 7% gel using the membrane fraction of 5 μg of protein as a sample. After electrically transferring to PVDF membrane (Millipore) at 200 mA for 1 hour, anti-ABCA7C end peptide antibody diluted 2000 times as the primary antibody, horseradish peroxidase-labeled anti-rabbit IgG diluted 5000 times as the secondary antibody The antibody (goat) [manufactured by Bio-Rad] was reacted, and ABCA-SSN and ABCA7 in the membrane fraction were detected using an ECL detection reagent (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). As shown in FIG. 7, it was found that ABCA-SSN and ABCA7 were also expressed on the cell membrane.
[0148]
Reference Example 1: Production of an antibody that recognizes a partial fragment of ABCA7
Partial fragment having the amino acid sequence of 45 to 549 considered to be the extracellular first loop of ABCA7 [hereinafter abbreviated as ABCA7 (45-549). ] Was prepared as follows.
[0149]
(1) Preparation of immunogen
By PCR, on the 5 'side of the 135th to 1647th sequence of ABCA7 cDNA sequence (GenBank accession number: AF250238)EcoRI site, 3 'sideSalA DNA fragment having a sequence to which an I site was added was amplified, and the vector pGEX-4T-3 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech)EcoRI,SalA vector was prepared that was inserted between the I sites and expressed a fusion protein in which ABCA7 (45-549) was fused to the C terminus of glutathione-S-transferase (GST).
[0150]
With the resulting vectorEscherichia coli BL21 strain (Amersham Pharmacia Biotech) was transformed and cultured in LB medium containing 50 μg / ml ampicillin at 37 ° C. until the optical density at 600 nm reached 0.5, for about 2 hours. IPTG was added to a final concentration of 1 mmol / l and cultured at 30 ° C. for 3 hours to induce expression of the fusion protein.
[0151]
The cells were collected by centrifugation at 5000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the cells were suspended in 10 ml of PBS containing 100 μg / ml of pAPSMSF. With an ultrasonic crusher [made by MISONIX], ultrasonic crushing for 5 seconds was repeated for 5 seconds, and ultrasonic crushing was performed for 2 minutes and 40 seconds in total. The disrupted cell suspension was centrifuged at 9500 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected. Add 100 μl of 50% slurry of Glutathione Sepharose 4B beads (Amersham Pharmacia Biotech) and Triton X-100 to a final concentration of 1% and incubate at 4 ° C. with rotation for 1 hour. The fusion protein was bound to the beads. The beads were collected by centrifuging at 300 rpm for 3 minutes at 4 ° C. After washing the beads three times with PBS containing 1% Triton X-100, an equal amount of elution buffer (10 mmol / l reduced glutathione, 50 mmol / l Tris-HCl (pH 8.0)) was added to the beads, and 4 ° C. The fusion protein was eluted from the beads by incubating for 1 hour, centrifuged at 12000 rpm for 5 seconds at 4 ° C., and the supernatant was collected, and this operation was repeated twice to completely remove the beads.
[0152]
(2) Immunization of animals and production of polyclonal antibodies
50 mg of GST and ABCA7 (45-549) fusion protein (molecular weight about 80 kDa) obtained in (1) was added with 2 mg of aluminum hydroxide adjuvant [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 99 (1988)] and pertussis vaccine. (Chiba Prefectural Serum Research Institute) 1 × 109Three 4-week-old female SD rats were administered together with the cells. From 2 weeks after administration, 50 μg of GST-ABCA7 (45-549) fusion protein was administered once a week for a total of 3 times. Blood was partially collected from the rat, and its serum antibody titer was examined by the same enzyme immunoassay (binding ELISA) as in Example 3 (4). Whole blood was collected from a rat showing sufficient antibody titer to obtain antiserum. . However, as an antigen for assay, the GST and ABCA7 (45-549) fusion protein obtained in (1) and GST were used, and the immunized rat antiserum obtained as the primary antibody was used as the secondary antibody. Peroxidase-labeled rabbit anti-rat immunoglobulin (DAKO) was used.
From this antiserum, the IgG fraction was purified by the caprylic acid precipitation method [Antibodies- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)] to obtain a polyclonal antibody.
[0153]
(3) Examination of reactivity of polyclonal antibody
Enzyme immunoassay (binding ELISA) similar to (2) Therefore, the reactivity of the polyclonal antibody obtained in (1) was examined. As the primary antibody, the polyclonal antibody obtained in Example (2) was used at a 10-fold dilution from 10 μg / mL. The results are shown in FIG. Although the polyclonal antibody showed a cross reaction with GST, it reacted strongly with the fusion protein of GST and ABCA7 (45-549), which are antigens.
[0154]
【The invention's effect】
According to the present invention, ABCA-SSN polypeptide, polynucleotide encoding the polypeptide, and antibody recognizing the polypeptide are provided. By using these, autoimmune disease, Sjogren's disease, inflammatory disease, lipid metabolism Development of diagnostics, preventives, and therapeutics for abnormal diseases and arteriosclerosis is possible
[0155]
[Sequence Listing Free Text]
SEQ ID NO: 13-reverse primer for pAP3neo vector
ABCA-SSN C-terminal peptide in which a cysteine residue is added to the N-terminal of SEQ ID NOs: 26-1989-2008
A reverse primer for amplifying the 4060-6024th position of SEQ ID NO: 28-SEQ ID NO: 2 and adding a stop codon and HindIII site at the 3 'end
A forward primer for amplifying the 1-918th position of SEQ ID NO: 31-SEQ ID NO: 2 and adding an EcoRI site at the 5 'end
SEQ ID NO: 33-ABC7 forward primer for amplifying the 1-133rd cDNA and adding an EcoRI site to its 5 'end
[0156]
[Sequence Listing]
[0157]
[0158]
[0159]
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[0188]
[0189]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the results of Northern hybridization in which expression of ABCA7 or ABCA-SSN at the mRNA level in various human tissues was examined. A is a result of using a probe containing a sequence common to both ABCA7 type and ABCA-SSN type, and B is a result of using a probe specific to ABCA-SSN type. Left is human 12 lane MTN blot II (mRNA source from left, adrenal gland, bladder, bone marrow, brain, lymph node, mammary gland, prostate, spinal cord, stomach, thyroid, trachea, uterus), right is human MTN blot II (mRNA From the left, the source shows the results in the spleen, thymus, prostate, testis, ovary, small intestine, large intestine, peripheral leukocytes). The value on the right indicates the position of the mRNA chain length marker (kb).
FIG. 2 is a diagram showing the results of RT-PCR using primers capable of amplifying the mRNAs of ABCA7 type and ABCA-SSN type in various human tissues at the same time by distinguishing them according to their fragment sizes. . From left, ABCA7 control, ABCA-SSN control, brain, bone marrow, lymph node, thymus, spleen, and trachea are shown.
FIG. 3 is a diagram showing the results of a binding ELISA for measuring the reactivity of a rabbit antiserum using an ABCA-SSN and ABCA7 C-terminal peptide (ABCA7-C, Compound 1) as an immunogen to Compound 1. It is. The horizontal axis represents antibody concentration, and the vertical axis represents absorbance at 415 nm. (2) shows the results when THY-compound 1 is used as the assay antigen, and (□) shows the results when TYH-control peptide is used as the assay antigen.
FIG. 4 shows the location of PCR amplification of ABCA-SSN and ABCA7 cDNA fragments subcloned into pCR2.1 / PCR1, pCR2.1 / PCR2, pCR2.1 / PCR3, pCR2.1 / PCR4. It is a schematic diagram which shows a restriction enzyme site. Each box indicates the region encoding ABCA-SSN and ABCA7 of each cDNA. The hatched box indicates the portion encoding the N-terminal region specific to ABCA-SSN, and the box filled with dots indicates the portion encoding the N-terminal region specific to ABCA7. Arrows indicate primers used for PCR, and PCR1, PCR2, PCR3, and PCR4 indicate amplified fragments subcloned into each plasmid. Black box indicates a stop codon.
FIG. 5 is a diagram showing production steps of pABCA-SSN / CR2.1 and pABCA7 / CR2.1.
FIG. 6 shows the structure of pCMV6cABCA-SSN. hGH polyA is the transcription termination and polyadenylation signal region of the human growth hormone gene, SV40 ori is the region containing the SV40 origin of replication and the early gene enhancer sequence, Amp is the ampicillin resistance gene, f1 ori is the f1 phage replication Indicates the starting point.
FIG. 7 shows detection of ABCA-SSN and ABCA-7 expressed in HEK293 cells using an anti-hABCA7-C polyclonal antibody. Lane 1 is HEK293 cells into which no expression vector has been introduced, Lane 2 is HEK293 cells into which an ABCA-7 expression vector has been introduced, Lane 3 is Western blotting using a membrane fraction of HEK293 cells into which an ABCA-SSN expression vector has been introduced as a sample. The results are shown. The number on the left indicates the position of the molecular weight marker.
FIG. 8 shows the results of a binding ELISA for measuring the reactivity of a rabbit antiserum using a fusion protein of GST and ABCA7 (45-549) as an immunogen to the fusion protein. The horizontal axis represents antibody concentration, and the vertical axis represents absorbance at 415 nm. (2) shows the results when the fusion protein was used as the assay antigen, and (2) shows the results when GST was used as the assay antigen.